CARACTERIZAÇÃO DE ACESSOS DO BANCO

CARACTERIZAÇÃO DE ACESSOS DO BANCO ATIVO DO GERMPOPLASMA DE ALGODÃO DA
EPAMIG EMPREGANDO MICROSATÉLITE
Taciana de Carvalho Coutinho (UFRN), Walter Fabrício Silva Martins (UFPE), Fábia Suelly Lima Pinto
(Embrapa Algodão), Wagner Alexandre Lucena (Embrapa Algodão), Marcia Soares Vidal (Embrapa
Algodão)
RESUMO - Marcadores microsatélites ou SSR (Seqüências simples repetitivas) são seqüências de
pequenas repetições em pares de bases distribuídos ao longo do genoma. A identificação genotípica a
partir de marcadores pode diagnosticar marcas polimórficas existentes no genoma, que poderão
auxiliar na seleção de genes envolvidos com características agronômicas. O presente trabalho teve por
objetivo avaliar a diversidade genética entre 32 acessos pertencentes ao banco ativo de germoplasma
da EPAMIG através de microsatélites. Dos 17 loci de microsatélite estudados, o número de alelos por
locus variou de 2 a 6, com uma média de 3 alelos por locus. A maior taxa de heterozigosidade
esperada foi de 0,20 e a observada de 0,41 para o acesso Dendera, enquanto que, a menor taxa foi de
heterozigosidade esperada foi de 0,11 e a observada de 0,23 para 24 acessos. A árvore filogenética
gerada com dados de microsatélites apresentou sete grupos, enquanto que, para as características
morfológicas já estudadas formaram 10 grupos diferentes.
Palavras chaves: Gossypium spp., microsatélites, diversidade genética
CHARACTERIZATION OF EPAMIG COTTON GERMPLASM COLLECTION ACCESSIONS
MICROSSATELLITE
ABSTRACT - Microsatelite markers or SSR (Simple Sequence Repeat) are short base pairs repeated
sequences spreaded in the entire genome. Genotypic identification using genetic markers can to light
out the polymorphism that exists through the genome, which will help to select important genes for
specific agronomic characteristics. The objective of this work was to analyse the genetic diversity of 32
accesses from the EPAMIG’s GAB using microsatellite. The number of alleles per locus varied between
2 and 6, with a medium of 3 alleles per locus, from a total of 17 loci studied. The expected and
observed values of heterozygosity ranged from 0.11 to 0.20 and 0.23 to 0.44, respectively. The
dendrogram constructed based on molecular markers demonstrated seven groups, which were
compared to another dendrogram constructed based on morphological characters in order to correlate
the two markers.
Key Words: Gossypium ssp., microsatellite, genetic diversity
INTRODUÇÃO
O genoma do algodão (Gossypium hirsutum L.) apresenta uma grande quantidade de DNA
repetitivo, classificados de acordo com o número de nucleotídeos e complexidade da seqüência que os
compõem. Dentro destas regiões repetidas, encontra-se os marcadores moleculares denominados de
microsatélites que, segundo Ferreira e Grattapaglia (1998), consistem de pequenas seqüências com 1
a 4 nucleotídeos de comprimento, repetidas em “tandem”, distribuídos ao acaso o qual constitui um
loco genético altamente variável, multialélico e de expressão co-dominante.
O melhoramento genético do algodão visa à obtenção de novas variedades que apresentem
características que atendam as demandas em termos do aumento do rendimento de fibra, maturação
precoce, adaptação à colheita mecanizada, resistência a pragas e doenças e, alto rendimento de fibra.
Os trabalhos de melhoramento do algodão estão ligados a várias instituições que conduzem
anualmente uma série de ensaios, avaliando linhagens em diversas localidades. Estes estudos avaliam
a diversidade genética entre grupos de genitores para a identificação de combinações híbridas de
maior heterozigosidade que possam ser utilizados na recuperação de genótipos superiores nas
gerações segregantes em espécies cultivadas de algodão (CARVALHO, 2003).
A partir do desenvolvimento dos marcadores moleculares, os quais detectam polimorfismo
genético, diversos trabalhos têm avaliado a variabilidade genética de indivíduos dentro e entre
populações, principalmente para análises de bancos ativos de germoplasma. Os marcadores
moleculares nestes programas de melhoramento são utilizados como um sistema diagnóstico onde
pode segregar conjuntamente com os genes de interesse agronômico, resultando na seleção indireta
do gene. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a diversidade genética entre 32 acessos
pertencentes ao banco ativo de germoplasma da EPAMIG através de microsatélites.
MATERIAL E MÉTODOS
O material vegetal em estudo pertence ao Banco ativo de germoplasma da EPAMIG, composto
por 221 acessos, dos quais estão classificados em 10 grupos a partir das análises de similaridade
morfológica e de fibra. Para o presente estudo, 32 acessos dos 221 foram selecionados com base no
agrupamento já realizado. Estes acessos foram plantados em casa de vegetação da Embrapa Algodão
em vasos contendo uma mistura de massame, esterco e solo, nas proporções de 30%, 30% e 40%
respectivamente. Após quatro a cinco semanas de desenvolvimento folhas jovens foram coletadas em
nitrogênio líquido para posterior extrações de DNA, seguindo o protocolo de extração de DNA
genômico de Ferreira e Grattapaglia (1999). DNAs obtidos foram quantificados em géis de agarose e
espectrofotômetro. As reações de amplificação para os 32 acessos foram realizadas em solução total
de 20 µL contendo: 10 ng de DNA genômico de algodão; 1 µL de Taq sintetizada no Laboratório de
Biotecnologia da Embrapa Algodão; 10X Tampão da Taq DNA polimerase; 0,2 mM de dNTP; 3 e 2 mM
de MgCl2; 3 µL de oligonucleotídeo. A ciclagem foi obtida em termocicladores (Eppendorf-Mastercycher
Gradient), onde inicialmente o DNA foi desnaturado a 95°C por 12 minutos. Seguiram-se 47 ciclos de
desnaturação – anelamento - extensão. Nos primeiros 11 ciclos de amplificação, a desnaturação foi
feita a 94°C por 15 segundos; a temperatura de anelamento, no primeiro ciclo de 65°C por 30
segundos, e diminuiu um grau a cada ciclo (touch down), chegando a 55°C no décimo primeiro ciclo; a
extensão foi de 72°C por 1 minuto. Os trinta e seis ciclos restantes foram de 94°C por 15 segundos;
55°C por 30 segundos e 72°C por 1 minuto. Seguiu-se extensão final a 72°C por 6 minutos. Os
fragmentos amplificados foram separados em eletroforese vertical em gel de poliacrilamida
desnaturante, corados conforme Creste et al., 2001. Para a análise da distância genética foi utilizado o
programa Genetix (Belkhir, et al, falta ano), a matriz de distância obtida foi utilizada para a construção
do dendograma através do programa MEGA 3 (KUMAR et al., 2004) pelo método da UPGMA
(Unweitghted pair-group method with arithmetical averages).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O trabalho de Carvalho et al (2003) avaliou a diversidade genética entre os acessos do banco
ativo de germoplasma da EPAMIG levando-se em consideração as características morfológicas, tais
como: Porcentagem de fibra, índice de fibra, comprimento de fibra, resistência de fibra, finura da fibra,
índice de uniformidade de fibra, altura da planta, precocidade de maturação, altura do primeiro ramo
frutífero, números de ramos frutíferos e número de ramos reprodutivos. Para os 221 acessos
analisados obteve-se a formação de 10 grupos dos quais 36 acessos foram utilisados para a
construção da árvore filogenêtica com os dados das características morfológicas. Dos 36 acessos
utilizados, 32 foram avaliados para marcadores de microsatélites, onde 17 loci foram polimórficos,
como mostrado na Tabela 1.
Tabela I. Loci de microsatélites analisados para os 32 acessos.
Tamanho estimado
Nº de
Locus
Locus
do alelos
alelos
BNL 1064
145/153
2
BNL 3646
BNL 3255
232/210
3
BNL 2553
BNL 3599-1
193/179
4
BNL 3627
BNL 3599-2
216/212
2
BNL 3034
BNL 3649
183/193
2
BNL 1679
BNL 169
198/214
6
BNL 3955
BNL 3653
_
3
BNL 2590
BNL 3065
192/182
3
BNL 1414
BNL 3279
126/108
4
Tamanho estimado
do alelos
166/155
196/200
184/176
158/174
164/190
171/195
190/206
138/128
Nº de
alelos
2
2
3
3
3
3
4
2
O número de alelos por locus variou de 2 a 6, com média de 3 alelos por locus, distribuídos
entre os 32 acessos. A taxa de heterozigosidade esperada e observada foi calculada adotando-se o
critério de polimorfismo de 0,95. A maior taxa de polimorfismo observada foi para o acesso Dendera
que teve 0,20 de heterozigosidade esperada e 0,41 de heterozigosidade observada. A menor taxa de
polimorfismo foi de 0,11 para heterozigosidade esperada e 0,23 de heterozigosidade observada para
os acessos em negrito da Tabela 2.
Tabela 2. Taxa de heterogosidade esperada e observada entre os 32 acessos gerados pelos 17 loci de
microsatélite
ACESSOS
Hexp.
Hobs.
ACESSOS
Hexp.
Hobs.
4S 180
0,08
0,17
T-7044
0,11
0,23
ACALA 4-42
0,11
0,23
TAMCOT 788
0,14
0,29
AUBURN FG 277
0,11
0,23
TAMCOT SP
0,11
0,23
BJ 3129
0,11
0,23
THORPE
0,11
0,23
C25-6-79
0,11
0,23
TX CABUCS
0,11
0,23
DENDERA
0,20
0,41
TXCACES 1-81
0,11
0,23
DES 24-8
0,11
0,23
TX CDPS 177
0,14
0,29
PEE DEE 6
0,11
0,23
V 79-098
0,11
0,23
GIZA 80
0,17
0,35
V 79-109
0,11
0,23
SL 22-6113
0,11
0,23
T-295
0,11
0,23
SL 24-8288
0.11
0,23
COKER-310
0,11
0,23
SL 5(3-5600)
0,11
0,23
STONEVILLE 213
0,11
0,23
SU 0450-8909
0,11
0,23
STONEVILLE-7
0,11
0,23
T 277-13-2
0,11
0,23
EMPIRE GRANDLESS
0,11
0,23
T 295-1-1
0,11
0,23
BJ 3137
0,14
0,29
T 295-6-2
0,14
0,29
T-277-2-6
0,12
0,25
A árvore filogenêtica obtida com os dados genéticos gerou 7 grupos para os 32 acessos
estudados, onde se verificou que os acessos do grupo 9 do trabalho de Carvalho et al (2003) quando
analisados por marcadores de microsatélite formaram dois grupos divergentes localisados nas
extremidades da árvore, inferindo que características morfológicas diferentes possam estar separando
este grupo, quando analisados por microsatélites. Os acessos pertencentes aos grupos 7, 8 e 10 como
classificados no trabalho de Carvalho et al (2003), foram classificados em um único grupo quando
gerados com dados de microsatélites, onde a similaridade foi alta. Os 4 grupos restantes da análise
genética apresentou acessos pertencentes a vários grupos diferentes da classificação morfológica,
onde implica-se que marcas polimorficas não estejam relacionadas a caracteres de interesse
agronômico.
BJ3129
T-277-2-6
SL5(3-5600)
C25-6-79
SL22-61131
T7044
TXCACES1-81
TXCDPS-177
STONEVILLE-213
EMPIREGRANDLESS
BJ-3137
4S180
STONEVILLE-7
TXCABUCS181
AUBURNFG-277
TAMCOT788
PEEDEE695
COKER-310
THORPE
TAMCOTSP37
SL24-82885
T-295
SU0450-8909
T295-1-1
DES24-8
ACALA4-42-A
T277-13-2
V79-098
V79-109
T295-6-2
DENDERA
GIZA80
Figura 1. Árvore filogenêtica gerada para os 32 acessos a partir dos 17 loci de microsatélites.
CONCLUSÃO
Para os 32 acessos analisados por marcadores moleculares SSR foi verificado que o número
de loci não foi suficiente para separar os grupos analisados, pois houve uma redução no número de
grupos formados quando comparados com a árvore gerada com os dados de características
morfológicas. Como perspectivas pretende-se avaliar um maior número de loci de microsatélite para a
separação dos grupos availados.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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WindowsTM pour la génétique des populations. Laboratoire Géome, population, interactions: CNRS
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p.1149-1155, 2003.
FERREIRA, M. E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em análise
genética. 3 ed. Brasília: Brasília: Embrapa Cenargem, 1998. 220 p.
KUMAR, S.; TAMURA, K.; NEI, M. MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics
Analysis and sequence alignment. Briefings in Bioinformatics, v. 5, p. 150-163. 2004.