Cláudia Grigolo Pinto EFEITO DO RESVERATROL COMPLEXADO
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Cláudia Grigolo Pinto EFEITO DO RESVERATROL COMPLEXADO À HIDROXIPROPIL-βCICLODEXTRINA SOBRE PARÂMETROS DO ESTRESSE OXIDATIVO EM RATOS NORMAIS E HIPERGLICÊMICOS Santa Maria, RS 2014 Claudia Grigolo Pinto EFEITO DO RESVERATROL COMPLEXADO À HIDROXIPROPIL-βCICLODEXTRINA SOBRE PARÂMETROS DO ESTRESSE OXIDATIVO EM RATOS NORMAIS E HIPERGLICÊMICOS Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Nanociências do Centro Universitário Franciscano, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Nanociências. Orientadora: Liana da Silva Fernandes Coorientadora: Virginia Cielo Rech Santa Maria, RS 2014 Dedico este trabalho para minha família. AGRADECIMENTOS Existem pessoas na nossa vida só para nos dar paz. Outras nos empurram para o melhor de nós, outras nos orientam pelo melhor caminho, outras caminham ao nosso lado. Há pessoas que dão suporte quando parece faltar chão. Outras ainda nos motivam a superar limites. Esse conjunto só pode ser chamado família e vai muito além dos laços genéticos. Essas pessoas encontrei em casa, nas salas de aula, nos laboratórios do Centro Universitário Franciscano e da UFRGS, nos corredores, na cantina, na biblioteca e nas salas de estudo. Para essas pessoas, minha gratidão. RESUMO O emprego de nanopartículas como carreadores de fármacos vem sendo vastamente estudado. Entre elas, estão as ciclodextrinas (CDs), que são oligossacarídeos cíclicos que permitem a formação de complexos de inclusão com substâncias lipofílicas, como o resveratrol (RSV). O RSV é um polifenol com características antioxidantes; quando consumido, há uma grande parte excretada, enquanto o restante é rapidamente metabolizado no organismo. As propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias e preventivas de doenças metabólicas, como o diabetes, estimulam a complexação do RSV à hidróxi-propil-beta-ciclodextrina (HP--CD), possibilitando, dessa forma, o aumento da biodisponibilidade do RSV por via oral. A hiperglicemia, marcador por meio do qual se diagnostica o diabetes, promove aumento na produção de espécies reativas de oxigênio por diversas rotas, que levam a lesões celulares e potencialmente à morte celular. Os parâmetros de estresse oxidativo podem ser determinados através de diversas técnicas. A redução da quantidade ou da atividade das defesas antioxidantes endógenas é indicativa de lesão oxidante, podendo, portanto, ser considerada como excelente marcador de estresse oxidativo. Nesse contexto, a nanotecnologia pode contribuir para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para diversas doenças, entre elas o diabetes. O objetivo deste trabalho é investigar o efeito in vivo do resveratrol livre e complexado à HP-β-CD sobre parâmetros do estresse oxidativo, com base nas medidas de Glutationa reduzida (GSH), espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), conteúdo total de carbonilas, atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e dosagem de proteínas totais, no córtex cerebral, no fígado, nos rins e no coração de ratos normais e hiperglicêmicos. Para este trabalho, foram utilizados 70 ratos Wistar machos, provenientes do biotério da Universidade Federal de Santa Maria, separados aleatoriamente em cinco grupos diabéticos, induzidos por estreptozotocina (STZ) e cinco grupos não diabéticos, com sete animais por grupo. Os grupos normoglicêmicos e hiperglicêmicos receberam diariamente, por gavagem intragástrica, as seguintes substâncias: grupos controles receberam água, os grupos RSV receberam 1mg/kg de massa corporal, os grupos HP-β-CD receberam concentração de HP-β-CD equivalente àquela presente no complexo, os grupos complexo (RCD) receberam 1mg/kg e os grupos etanol (E) receberam solução de etanol a 15%. Os animais foram mortos, após dois meses de tratamento e com 12 horas em jejum, por decapitação, sem anestesia. De acordo com os dados obtidos, concluiu-se que o tratamento com HP-β-CD provocou uma queda das moléculas antioxidantes endógenas. Quando complexada ao RSV, tal queda foi menor, indicando uma proteção exercida pelo RSV ao dano causado pelo veículo, neste caso a HP-β-CD. Nas medidas de TBARS, observou-se que ocorreu uma queda nos grupos RSV e HP-β-CD o que indica um comportamento de proteção à lipoperoxidação. Palavras chave: Nanotecnologia. Ciclodextrinas. Resveratrol. Estresse oxidativo. ABSTRACT The use of nanoparticles as carriers of drugs has been widely studied. These include cyclodextrins (CDs), cyclic oligosaccharides that allow the formation of inclusion complexes with lipohilic substances such as resveratrol (RSV). RSV is a polyphenol with antioxidant characteristics; when consumed, a great part is excreted, while the remainder is quickly metabolized in the body. The anti-inflammatory, antioxidant and preventive of metabolic diseased properties such as diabetes, stimulate the complexation of RSV to the hydroxypropyl-beta-cyclodextrin (HP--CD), thus enabling the increase of the bioavailability of an orally RSV. Hyperglycemia, a marker by which diabetes is diagnosed, promotes increased production of species reactive to oxygen by various routes that lead to cell damage and potentially to cell death. The oxidative stress parameters can be determined through certain techniques. The reduction in the amount or in the activity of endogenous antioxidant defenses is and indicative of oxidant injury and may, therefore, is considered as an excellent marker of oxidative stress. In this context, nanotechnology can contribute to the development of new therapeutic approaches for various diseases, including diabetes. The objective of this study is to investigate the in vivo effects of free and complex resveratrol to HP--CD on parameters of oxidative stress, based on the measurements of GSH, TBARS, total content of carbonyls, activity of SOD, CAT and GPx enzymes and determination of total protein in the cerebral cortex, liver, kidney and heart of normal and hyperglycemic rats. For this study, 70 male Wistar rats were used, form the vivarium of the Federal University of Santa Maria, randomly divided into five diabetic groups induced by streptozotocin (STZ), and five nondiabetic groups with seven animals per group. The hyperglycemic and normoglycemic groups daily received, through intragastric gavage, the following substances: water (control groups), free RSV in concentration of 1mg/kg (RSV groups), concentration of HP--CD equivalent to that present in complex (HP--CD groups), RSV complexed to the cyclodextrin at a concentration of 1 mg/kg body weight (complex groups) and a solution of 15% ethanol (ethanol group). After two months of treatment and 12 hours fasting, the animals were killed by decapitation. According to the data obtained, it was found that treatment with HP--CD caused a decrease of endogenous antioxidant molecules. When complexed to RSV, this decrease was lower; indicating a protective effect by RSV to the damage caused by the medium, in this case HP--CD. In the measurements of TBARS it was observed that there was a decrease in the RSV group and HP--CD, indicating a protective behavior to lipid peroxidation. Keywords: nanotechnology, ciclodextrins, resveratrol, oxidative stress LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Representação esquemática da regulação da glicemia por ação dos hormônios insulina e glucagon. .................................................................................................................. 17 Figura 2 - Estrutura do trans-RSV com os anéis B e A. ........................................................... 21 Figura 3 - Representação esquemática da complexação do RSV e HP-β-CD.......................... 22 Figura 4 - Mecanismos de produção de EROs e estratégias de ação enzimática antioxidante. 24 Figura 5 - Representação do processo de lipoperoxidação das membranas celulares. ............. 28 Figura 6 - Representação esquemática dos grupos de tratamento crônico. .............................. 32 Figura 7 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas de TBARS no coração. .................. 38 Figura 8 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas das carbonilas no coração. ............. 39 Figura 9 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas de GSH no coração. ....................... 39 Figura 10 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas de DCFH-DA no coração. ............. 40 Figura 11 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas da CAT no coração. ....................... 41 Figura 12 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas de GPx no coração. ........................ 42 Figura 13 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas da SOD totais no coração. ............. 42 Figura 14 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas de TBARS no fígado. .................... 43 Figura 15 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas das carbonilas. ............................... 44 Figura 16 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas de GSH no fígado. ......................... 44 Figura 17 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas de DCFH-DA no fígado. ............... 45 Figura 18 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas da catalase no fígado. .................... 46 Figura 19 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas de GPx no fígado. .......................... 46 Figura 20 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas da atividade da SOD no fígado. ..... 47 Figura 21 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas TBARS no córtex cerebral. Os dados representam as médias ± desvio padrão para até sete animais em cada grupo. ........................ 47 Figura 22 - Efeito da administraçãode resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre a medida das Carbonilas no córtex cerebral. 48 Figura 23 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre a medida de GSH no córtex cerebral. .......... 48 Figura 24 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas de DCFH-DA no córtex cerebral. .. 49 Figura 25 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas da atividade da CAT no córtex cerebral. .................................................................................................................................... 49 Figura 26 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas da atividade de GPx no córtex cerebral. .................................................................................................................................... 50 Figura 27 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre a medida da atividade da SOD no córtex cerebral. .................................................................................................................................... 50 Figura 28 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas de TBARS nos rins. ....................... 51 Figura 29 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas das carbonilas nos rins. .................. 51 Figura 30 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas de GSH nos rins. ............................ 52 Figura 31 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas de DCFH-DA nos rins. .................. 52 Figura 32 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas da CAT nos rins. ............................ 53 Figura 33 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas de GPx nos rins. ............................. 53 Figura 34 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas da SOD nos rins.. ........................... 54 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Presença de glutationa reduzida (GSH) e enzimas em diferentes tecidos em ratos e humanos .................................................................................................................................... 25 Tabela 2 - Níveis séricos de glicose e frutosamina em ratos induzidos ao diabetes por estreptozotocina e tratados com resveratrol e complexo. ......................................................... 37 LISTA DE QUADROS Quadro 1 - Fontes celulares de EROs. ...................................................................................... 23 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AGEs - produtos finais de glicação avançada C - grupo controle CAT - catalase CDs - ciclodextrinas DA - doença de Alzheimer DAF- diclorofluorcisteína DCFH-DA - diclorodihidrofluoresceínadiacetato DM1 - diabetes mellitus tipo 1 DNA - ácido desoxirribonucleico DNPH - dinitrofenil hidrazina DTNB - ditio-bis-nitrobenzóico E - grupo etanol ERN - espécies reativas de nitrogênio EROs - espécies reativas de oxigênio GPx - glutationa peroxidase GSH - glutationa reduzida GSSG - glutationa oxidada H2O2 - peróxido de hidrogênio HP-β-CD - hidróxipropil-beta-ciclodextrina i.p.- intraperitoneal KCl - cloreto de potássio MDA - ácido malondialdeído NADH - nicotinamida adenina dinucleotídeo R- grupo resvetratrol RCD - grupo complexo RL - radicais livres RSV - resveratrol SH - sulfidrilas SOD - superóxido dismutase STZ - estreptozotocina TBA - ácido tiobarbitúrico TBARS - espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico UFRGS - Universidade Federal do Rio Grande do Sul UFSM - Universidade Federal de Santa Maria SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 14 1.1 OBJETIVOS ....................................................................................................................... 15 1.2 JUSTIFICATIVA ............................................................................................................... 16 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .............................................................................................. 16 2.1 DIABETES ......................................................................................................................... 16 2.2 NANOTECNOLOGIA E NANOCIÊNCIA ....................................................................... 18 2.3 ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO (EROs) ............................................................. 22 2.4 DEFESA ANTIOXIDANTE .............................................................................................. 23 2.5 ESTRESSE OXIDATIVO E SEUS INDICADORES ....................................................... 26 2.6 ESTRESSE OXIDATIVO E DIABETES .......................................................................... 29 3 METODOLOGIA.................................................................................................................. 30 3.1 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS ................................................................................... 30 3.2 ANIMAIS ........................................................................................................................... 31 3.3 PREPARO DOS TECIDOS PARA AS MEDIDAS DAS ATIVIDADES ENZIMÁTICAS E DOS PARÂMETROS DO ESTRESSE OXIDATIVO ........................................................ 33 3.4 DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS DO ESTRESSE OXIDATIVO ..................... 33 3.5 PREPARAÇÃO DO COMPLEXO DE INCLUSÃO ENTRE HP-Β-CD E TRANS-RSV 35 3.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................................. 35 4 RESULTADOS ..................................................................................................................... 37 4.1 CORAÇÃO......................................................................................................................... 38 4.2 FÍGADO ............................................................................................................................. 43 4.3 CÓRTEX CEREBRAL ...................................................................................................... 47 4.4 RINS ................................................................................................................................... 51 5 DISCUSSÃO DOS RESULTADOS ..................................................................................... 55 6 CONCLUSÕES ..................................................................................................................... 60 7 PERSPECTIVAS FUTURAS ............................................................................................... 62 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................................... 64 14 1 INTRODUÇÃO O número de pessoas com diabetes é preocupante. Estudos recentes estimam que 346 milhões de pessoas no mundo estejam diabéticas (SCULLY, 2012), o que pode ser caracterizado como uma epidemia global. O diabetes mellitus tipo 1 (DM1) é uma desordem autoimune causada pela destruição das células -pancreáticas produtoras de insulina. A deficiência desse hormônio leva ao desenvolvimento da hiperglicemia (RHEE; PLUTZKY, 2012). A hiperglicemia crônica está associada ao aumento de produtos finais de glicação avançada (AGEs), gerados pela glicação não enzimática e pela oxidação de proteínas, lipídeos e ácidos nucleicos (HEGAB; GIBBONS; NEYSES, 2012). O excesso de glicose captada por tecidos independentes de insulina durante o processo oxidativo contribui para a elevação de espécies reativas de oxigênio (EROs), as quais também alteram as estruturas biomoleculares (KASZNICKI, 2012). Os danos causados por EROs podem ser prevenidos ou revertidos por meio de substâncias antioxidantes, como o resveratrol (RSV), que é uma fitoalexina presente em muitas plantas e abundante nas uvas e no vinho tinto. O RSV está relacionado a uma variedade de atividades biológicas benéficas à saúde, incluindo a sua atividade hipoglicemiante e seu o efeito protetor contra várias complicações diabéticas (KUMAR; NEGI; SHARMA, 2013). Porém, quando administrado por via oral, sua excreção é elevada (aproximadamente 75%) e a quantidade absorvida pelo organismo é metabolizada rapidamente em seus conjugados no sangue (WENZEL; SOMOZA, 2005). A baixa solubilidade do RSV em água limita sua utilização em trabalhos de pesquisa in vivo. Uma forma de melhorar sua biodisponiblidade é complexá-lo a ciclodextrinas (CDs), que são oligossacarídeos cíclicos compostos por resíduos de glicose com uma cavidade hidrofóbica e uma superfície externa hidrofílica, o que permite a formação de complexos de inclusão com substâncias hidrofóbicas, aumentando, assim, sua solubilidade em água. Estas estruturas nanométricas, as CDs, são utilizadas no desenvolvimento de sistemas de liberação de fármacos, porque, além de aumentar a solubilidade em água, protegem os fármacos contra a hidrólise, a oxidação e a fotodecomposição, aumentando sua estabilidade e biodisponibilidade (LOFTSSON; DUCHENE, 2007). 15 Ao complexar o RSV à hidróxipropil-beta-ciclodextrina (HP-β-CD) e administrá-lo por via oral em ratos, este trabalho se propõe a avaliar se é possível controlar o estresse oxidativo induzido pelo DM1 em tecidos envolvidos na doença, como rins, coração, fígado e córtex cerebral. Para esta análise, é necessário realizar medidas de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), ao diclorodihidrofluoresceínadiacetato (DCFH), a carbonilas proteicas, à glutationa peroxidase (GPx), à catalase (CAT) e ao superóxido dismutase (SOD). Assim, será possível fornecer orientações para o desenvolvimento de novas terapias ou combiná-la a terapias existentes. 1.1 OBJETIVOS 1.1.1 Objetivo Geral Investigar o efeito in vivo do resveratrol livre e complexado a CDs sobre parâmetros do estresse oxidativo de ratos induzidos ao diabetes por estreptozotocina (STZ). 1.1.2 Objetivos Específicos Realizar diferentes testes e medidas, em diferentes órgãos/tecidos, como córtex cerebral, coração, rins e fígado, dos ratos tratados, avaliando os efeitos do tratamento crônico e algumas medidas bioquímicas e marcadores de estresse oxidativo. - avaliação glicêmica por teste de glicemia plasmática de jejum; - determinação da peroxidação lipídica através da medida de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS); (OHKAWA; OHISHI; YAGI, 1979). - análise do dano a proteínas pelo conteúdo total de carbonilas proteicas (REZNICK; PACKER, 1994); - verificação da produção de espécies reativas do oxigênio pelo teste do DCFH-DA; (LEBEL; ISCHIROPOULOS; BONDY, 1992). - mensuração da atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD) (BANNISTER; CALABRESE, 1987); catalase (CAT) (MAEHLY E CHANCE, 1954) e glutationa peroxidase (GPx) (WENDEL, 1981). 16 - medida da molécula antioxidante glutationa reduzida (GSH) (WENDEL, 1981). 1.2 JUSTIFICATIVA Diante da necessidade de novas abordagens, este trabalho pode contribuir no desenvolvimento de alternativas para o controle e tratamento do diabetes mellitus 1, através dos recursos da nanotecnologia, considerando a utilização de antioxidantes naturais, com propriedades alteradas para o alívio dos sintomas e o controle de doenças relacionadas ao estresse oxidativo que é de grande relevância diante dos possíveis benefícios que eles podem trazer. 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 DIABETES O diabetes mellitus (DM) é um grupo de doenças metabólicas caracterizadas por hiperglicemia, resultante de defeitos na secreção e/ou na ação de insulina. O diabetes desenvolve-se quando, no organismo, o pâncreas não produz insulina suficiente ou quando suas células não respondem à insulina de forma adequada. Existem três tipos de diabetes: o diabetes tipo 1, o diabetes tipo 2 e o diabetes gestacional. Diabetes insulina dependente (DM1) e insulina independente (DM2) são caracterizados pelo aumento anormal no nível de glicose no sangue. A hiperglicemia é decorrente de uma relativa ou absoluta deficiência de insulina e, embora possa ser revertida temporariamente por transplante do pâncreas ou de células beta das ilhotas na veia porta do fígado, há vários efeitos colaterais decorrentes desse transplante (PORTHA; TOURREL-CUZIN; MOVASSAT, 2011). O estresse oxidativo pode causar a destruição das células pancreáticas, determinando o comprometimento da secreção de insulina e defeitos em sua ação. Na ilustração a seguir (Figura 1), pode-se observar esquematicamente a regulação hormonal da glicemia. 17 Figura 1 - Representação esquemática da regulação da glicemia por ação dos hormônios insulina e glucagon. Fonte: adaptado de Halliwell (2009). Os casos de diabetes podem ser agrupados basicamente em duas categorias etiopatogenéticas amplas: o DM1, cuja causa é uma deficiência absoluta da secreção de insulina; e o DM2, causado por uma combinação de resistência à ação da insulina e uma resposta inadequada à secreção compensatória de insulina. Na forma autoimune (DM1), há um processo de insulite e estão presentes autoanticorpos circulantes (anticorpos antidescarboxilase do ácido glutâmico, anti-ilhotas e anti-insulina). O pico de incidência do diabetes insulina dependente ocorre dos 10 aos 14 anos de idade (SCHUSTER; DUVUURI, 2002). Mede-se a glicemia através da confirmação dos sinais e sintomas clássicos da glicemia em jejum (exame de sangue em que são verificadas as taxas de glicose) e do teste padronizado de tolerância à glicose (TTG) (AMERICAN DIABETES ASSOCIATION, 2004). As categorias utilizadas para diagnóstico, baseadas nas recomendações da comunidade médicocientífica atual, são as seguintes: a) normal – abaixo de 110 mg/dL; b) intolerância à glicose – de 111 a 125 mg/dL em jejum e de 141 a 199 mg/dL em 2 horas após a ingestão de 75 g de glicose; 18 c) Diabetes melitus – maior que 126 mg/dL em jejum e maior que 200 mg/dL após a ingestão de 75 g de glicose. O diabetes está intimamente ligado ao aumento da geração de espécies reativas e/ou à redução da capacidade antioxidante, o que relaciona os compostos oxidantes com o início, a progressão e as consequências patológicas do diabetes (ROLO; PALMEIRA, 2006). Os órgãos mais afetados pela doença são o cérebro, o coração, os rins e os olhos. As consequências do diabete são o aumento significativo do risco de acidente cardiovascular cerebral (AVC), enfarte, insuficiência renal e perda de visão. Outras complicações do diabetes são retinopatia hipertensão, anginas, obstrução de vasos e artérias e nefropatia (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2001). A hiperglicemia lesa as paredes dos vasos capilares, mesmo em níveis de glicemia entre 150 a 200 mg/dL, que ainda não caracterizam o diabetes tipo 1. Na retinopatia diabética (uma das causas mais frequentes de cegueira), por exemplo, os capilares da retina tornam-se fracos e tendem a dilatar e se romper, provocando hemorragias que, após cicatrizarem, inativam a região onde ocorreram e deslocam as regiões vizinhas normais da retina. Já o efeito mais comum do diabetes nos rins é a nefropatia diabética, que envolve inúmeros fatores que interagem com distúrbios metabólicos e fatores genéticos. Os nervos são também lesados, ao longo do tempo, pela hiperglicemia. A lesão pode tornar-se mais grave ao atingir nervos responsáveis pela regulação das funções de órgãos internos no organismo (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2001). 2.2 NANOTECNOLOGIA E NANOCIÊNCIA Os termos nanotecnologia e nanociência derivam do prefixo “nano”, que em grego significa “anão”, e designam a ciência da manipulação dos átomos que modifica a estrutura da matéria (GUTERRES; DOS SANTOS; SCHMALTZ, 2005). A nanociência e a nanotecnologia surgem como um rápido avanço científico-tecnológico, abrindo inúmeras possibilidades que afetam o cenário da biotecnologia com perspectivas de avanços praticamente irreversíveis e ilimitados para toda a sociedade. Podem ser definidas, ainda, como o estudo e desenvolvimento tecnológico em nível macromolecular, molecular e atômico. Estas áreas visam oferecer a criação e o uso de estruturas, dispositivos e sistemas 19 que contenham funções e propriedades físicas, químicas e biológicas diferenciadas devido ao seu tamanho minimizado, além de proporcionar o entendimento de fenômenos e materiais na escala nano (DURAN; MATTOSO; MORAIS, 2006). A nanociência tem caráter interdisciplinar e uma das suas aplicações está concentrada na área biomédica, pois proporciona vantagens exclusivas na entrega de fármacos ao local de destino, maximizando o potencial terapêutico, minimizando os efeitos colaterais, melhorando a concentração do fármaco (ativo) e melhorando a sua biodisponibilidade devido à maior permanência neste local (TORCHILIN, 2007). Verifica-se, claramente, a diferenciação entre nanotecnologia e nanociência: a ciência é o conjunto de conhecimentos adquiridos ou produzidos que visam compreender e orientar a natureza e as atividades humanas, enquanto a tecnologia é o conjunto de conhecimentos, especialmente, princípios científicos, que se aplicam a um determinado ramo de atividade, geralmente, com fins industriais, isto é, a aplicação do conhecimento científico adquirido de forma prática, técnica e economicamente viável (DURAN; MATTOSO; MORAIS, 2006). Os sistemas nanoestruturados são uma alternativa promissora. Algumas das principais razões do uso de sistemas de entrega de fármacos são as melhorias na concentração do ativo no local de ação devido à maior permanência neste local (TORCHILIN, 2007). Além de todas essas qualidades, as nanocápsulas podem ser produzidas por método simples, rápido, eficiente e de baixo custo. De acordo com Torchilin (2007), a eficiência destes sistemas está diretamente relacionada à capacidade de proteção do fármaco contra degradação enzimática, química ou imunológica; o transporte do fármaco para o alvo desejado, evitando efeitos colaterais; à facilitação da penetração do fármaco nas células-alvo; e à promoção da sua liberação de maneira controlada, prolongando sua ação. 2.2.1 Os complexos de inclusão nanoestruturados com ciclodextrinas A inclusão de moléculas de interesse dentro da cavidade das ciclodextrinas pode ser utilizada para protegê-las do meio externo, aumentar sua estabilidade e a sua solubilidade em solventes aquosos (DAVIES; WANG; TUCKER, 1997). As ciclodextrinas são aplicadas grandemente na indústria farmacêutica por apresentar as seguintes características: capacidade de aumentar a solubilidade e a estabilidade do fármaco contra hidrólise, oxidação e fotólise; ampliação da biodisponibilidade e liberação controlada do fármaco; a correção do sabor e 20 odor desagradáveis dos fármacos; e prevenção das interações fármaco/fármaco e ou fármaco/excipientes fármaco (LOFTSSON; DUCHENE, 2007). As ciclodextrinas também são usadas em farmacologia como um excipiente em alguns fármacos comercializados. Elas são formadas por seis a oito unidades de glicose e a sua estrutura espacial cônica confere uma orientação dos grupos hidroxílicos para o exterior, determinando características físico-químicas específicas, como a capacidade de solubilizar-se em água e, ao mesmo tempo, de promover o encapsulamento em sua cavidade hidrofóbica de alguns fármacos. Contribuem, portanto, incrementando a solubilidade, a estabilidade e a biodisponibilidade do fármaco (LOFTSSON; DUCHENE, 2007). É reconhecido que as ciclodextrinas atuam como verdadeiros carreadores, mantendo as moléculas do fármaco hidrofóbico em solução e liberando-o na membrana biológica. A membrana relativamente lipofílica tem baixa afinidade por moléculas de ciclodextrinas hidrofílicas e, por isso, elas permanecem no exterior aquoso das membranas (MÁSSON et al., 1999). Sabe-se, ainda, que substâncias com baixa solubilidade em água, como corticoides, podem formar complexos de inclusão por meio de ligação não covalente com ciclodextrinas (FORGO; VINCZE; KÓVER, 2003). 2.2.2 O resveratrol (RSV) O resveratrol (RSV) foi identificado pela primeira vez em 1976, em videiras (Vitis vinifera) (LANGCAKE; PRYCE, 1976). O RSV (3,5,4′-trihidroxiestilbeno) é uma fitoalexina polifenólica produzida naturalmente por uma grande variedade de espécies de plantas, incluindo as uvas, as bagas e os amendoins, como forma de resposta ao estresse, podendo atuar como um mecanismo de defesa contra ataques fúngicos, virais, bacterianos e contra danos decorrentes de exposição à radiação ultravioleta (LANGCAKE; PRYCE, 1976; SIGNORELLI; GHIDONI, 2005). O RSV apresenta dois isômeros estruturais, cis e trans, sendo a forma trans a mais comum e que possui maior atividade biológica. As concentrações sob a forma dos isômeros trans e cis de aglicona e glucósidos são submetidos a inúmeras variáveis. No vinho tinto, a concentração do isômero trans (Figura 2), que é a forma principal, geralmente varia entre 0,1 e 15 mg/L. Como composto fenólico, o resveratrol contribui para o potencial antioxidante do 21 vinho tinto e, assim, este pode desempenhar um papel na prevenção de doenças cardiovasculares humanas. A hidrofobicidade elevada de RSV e sua sensibilidade a agentes externos, tais como ar, luz e enzimas oxidativas, podem constituir um problema sério para a sua biodisponibilidade, formulação e manipulação (LUCAS-ABELLÁN et al., 2007). HO H2 H H 3 H5 H6 B 1 A HO H 2 H OH 4 H5 H 6 Figura 2 - Estrutura do trans-RSV com os anéis B e A. Fonte: Nishihira (2013). 2.2.3 Complexo entre HP-β-CD e RSV Os complexos de inclusão são compostos moleculares com a estrutura característica de um adutor, em que um composto (designado de hospedeiro) encerra no seu interior outro (o hóspede). O requisito mínimo para que se forme o complexo é a compatibilidade de tamanhos e geometrias entre a cavidade da ciclodextrina (CD) e o hóspede. O complexo de inclusão entre HP-β-CD e trans-RSV utilizado neste trabalho foi produzido por tecnologias úmidas e sem o uso de evaporação rotativa devido à instabilidade do RSV (MATTIVI; LEBENSN, 1993). O protocolo utilizado para a obtenção do complexo de inclusão mencionado anteriormente foi adaptado de Bertacche e colaboradores (2006) e Lu e colaboradores (2009). 22 A caracterização do RSV livre e complexado à HP-β-CD foi feita por meio de técnicas de RMN 1H, da técnica espectroscópica na região do infravermelho e de espectrofotometria UV/VIS. A atribuição dos sinais de RMN 1H ocorreu com base nos trabalhos publicados por Lu e colaboradores (2009) e Bertacche e colaboradores (2006). De acordo com o espectro de RMN de hidrogênio, observa-se que a complexação entre o RSV e a HP-β-CD ocorreu de modo que o anel B do RSV encontra-se incluído na cavidade da HP-β-CD, enquanto que o anel A está direcionado para fora, conforme pode ser observado na figura 3. Figura 3- Representação esquemática da complexação do RSV e HP-β-CD. Fonte: adaptado de Nishihira (2013). 2.3 ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO (EROs) As espécies reativas de oxigênio (EROs) são encontradas em praticamente todos os sistemas biológicos (Quadro 1). No metabolismo aeróbico, o oxigênio (O2) sofre redução tetravalente, formando reativos intermediários, como o superóxido (O2.-), a hidroxila (OH.) e o peróxido de hidrogênio (H2O2) (HALLIWELL, 2007). As EROs podem ser mediadoras de doenças, embora nem sempre sua formação seja prejudicial, pois podem induzir a defesa dos organismos. A formação de radicais livres in vivo ocorre via ação catalítica de enzimas, durante os processos de transferência de elétrons que acontecem no metabolismo celular normal, como na reação inflamatória, por exemplo. Contudo, a concentração desses radicais pode aumentar devido à maior geração intracelular ou à deficiência dos mecanismos antioxidantes. O desequilíbrio entre moléculas oxidantes e antioxidantes, característico do estresse oxidativo, é responsável pela indução a danos celulares. 23 Neste contexto, surgem os biomarcadores, utilizados a fim de avaliar o balanço redox para análise dos danos causados pelo estresse oxidativo e com a finalidade de avaliar a deficiência das defesas antioxidantes. Os principais biomarcadores de estresse oxidativo são: espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) (avaliam os danos em componentes celulares e estruturas lipídicas), compostos carbonílicos e sulfidrílicos (mensuram o dano nas proteínas), atividade das enzimas antioxidantes como a superóxido dismutase (SOD), a catalase (CAT) e a glutationa peroxidase (GPx), medida de glutationa reduzida (GSH) e métodos fluorescentes como o diclorodihidrofluoresceínadiacetato (DCFH-DA). FONTES CELULARES DE PRODUÇÃO DE EROS Endógenas Mitocôndria . OH O2·- , H2O2 Citocromo P-450 Peroxissomos O2·-, H2O2 H2O2 Metais . OH Radiação . OH Exógenas Quadro 1 - Fontes celulares de EROs. Fonte: adaptado de Halliwell (2000). 2.4 DEFESA ANTIOXIDANTE O equilíbrio entre agentes oxirredutores e o sistema de defesa antioxidante é essencial. Os antioxidantes são substâncias que, quando presentes em baixa concentração comparada à concentração do substrato, têm a capacidade de regenerar ou prevenir oxidação (HALLIWELL, 2000). Para proteger-se, a célula pode atuar como detoxificante ou como reparadora das lesões ocorridas em resposta ao desequilíbrio. A ação detoxificadora ocorre por meio da glutationa reduzida (GSH), do superóxido dismutase (SOD), da catalase, da glutationa peroxidase (GSH-px) e da vitamina E. A reparação das lesões acontece por meio do ácido ascórbico, da glutationa redutase (GSH-Rd) e da GSH-Px, entre outros. A maioria desses compostos, com exceção do ácido ascórbico, que é um antioxidante estrutural, é encontrada no meio intracelular (LEHNINGER et al., 2002 )A seguir, pode-se observar na Figura 4, de forma esquemática, a relação entre os mecanismos de produção de EROs e as estratégias de ação enzimática antioxidante. 24 Figura 4 - Mecanismos de produção de EROs e estratégias de ação enzimática antioxidante. Fonte: HALLIWELL (1990). A GSH é um tripeptídeo formado por glutamato, cisteína e glicina e possui atividade química através do seu grupo SH (sulfidrila). É considerada a primeira linha de defesa do organismo contra as EROs, de modo que sua redução está ligada diretamente ao aumento do estresse oxidativo. Possui importantes funções no organismo, pois mantém o funcionamento do sistema imune, é antioxidante e scavenger de radicais livres, atua na reparação de proteínas e lipídios e no transporte transmembrana (sua ação mais importante ocorre nas mitocôndrias). Além disso, é extremamente relevante em órgãos que são expostos a toxinas, como pulmão, intestino, rins e especialmente fígado. A sua síntese é feita nos hepatócitos e sua maior reserva encontra-se no parênquima do fígado saudável. É uma molécula essencialmente antioxidante e destoxificante, mas está envolvida no transporte de aminoácidos, na proteção contra radiações solares e em muitos processos metabólicos, incluindo a apoptose. Sua depleção ou redução implica danos celulares, que são diretamente proporcionais a sua quantidade e viabilidade celular (FORMAN RINNA; ZANNG, 2009). O aumento da concentração de GSH nos tecidos promove a prevenção aos dados do estresse oxidativo, enquanto que a deficiência de GSH está relacionada a uma grande vulnerabilidade do organismo aos danos provocados pelo estresse oxidativo, resultando, por exemplo, na falta de equilíbrio e coordenação motora, 25 em distúrbios mentais e em tremores característicos de lesões no sistema nervoso central (SNC) (BALLATORI, 2009). A GSH é encontrada em todos os órgãos, principalmente nos intestinos e no fígado, auxiliando na neutralização de compostos prejudiciais. No interior das células, atinge concentração na ordem de mM, sendo muito reduzida no exterior das células. A tabela a seguir (Tabela 1) apresenta a relação existente entre a presença de GSH e enzimas em diferentes tecidos em ratos e humanos, de forma esquemática. Tabela 1 - Presença de GSH e enzimas em diferentes tecidos em ratos e humanos Sistema GSH GSH/GSSG GPx GRd Tecidos de ratos Fígado 7-8 mM >10/1 Alta Alta Eritrócitos 2 mM >10/1 Moderada Moderada Pulmão 2 mM >10/1 Moderada Moderada Rim 4 mM >10/1 Moderada Moderada Tecidos de humanos Fígado 4 μmol/g peso seco >10/1 Alta Alta Rim 2 μmol/g >10/1 Alta Alta Eritrócitos 240 μmol/g >10/1 Moderada Moderada Sangue total -1 mM >10/1 Alta Alta Plasma sanguíneo 1-3 μM variável baixa Ausente Fonte: adaptado de Halliwell e Gutteridge (1999). A SOD é uma metaloenzima e contém cobre e zinco (Cu-Zn-SOD). Ela está relacionada à capacidade de interceptar o ânion superóxido gerado pelo metabolismo celular ou por fontes externas, atuando sobre aminoácidos, lipídios e bases de ácido desoxirribonucleico (DNA), a fim de impedir a formação de lesões. Encontrada no citosol de praticamente todas as células eucariontes, sua ação é importante para o funcionamento do metabolismo, a reprodução, a diferenciação celular e a defesa imunológica, entre outros (GOODSEL, 2007) e pode ser representada pela seguinte equação: 2 O2 + 2 H sod O2 + H2O2 26 A GPx é responsável pela detoxificação de peróxidos orgânicos e inorgânicos. Sua ação é dependente da GSH, que é oxidada em GSSG. Os níveis de GSH são mantidos por meio da oxidação do NADPH resultante do ciclo das pentoses. Ela é encontrada no citosol e nas mitocôndrias, representando um importante papel na defesa antioxidante, pois reduz os hidroperóxidos pelo selênio presente em sua composição. A hiperglicemia diminui a atividade da GPx no endotélio vascular, nas células dos rins e nas mitocôndrias do cérebro (BALLATORI, 2009), o qual é muito sensível à queda da atividade da GPx. Sua ação principal pode ser representada pela seguinte equação: LOOH + 2 GSH GPx LOH + H2O + GSSG A catalase (CAT) é uma enzima que degrada o peróxido de hidrogênio em água e oxigênio livre de forma extremamente rápida. Está presente em animais, vegetais e em algumas bactérias. Nos mamíferos, sua maior concentração encontra-se principalmente nos peroxissomos e mitocôndrias, embora seja produzida no retículo endoplasmático rugoso. A atividade da CAT, nos tecidos humanos, é maior no fígado, no rim, no pulmão e no músculo, respectivamente (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1999). Os órgãos que não possuem peroxissomos estão mais expostos aos danos celulares provocados por EROs, entre eles o coração, os pulmões e o cérebro. Sua ação pode ser representada pela seguinte equação: 2 H2O2 Cat 2 H2O + O2 2.5 ESTRESSE OXIDATIVO E SEUS INDICADORES No final do século XIX, já eram conhecidos alguns efeitos tóxicos do oxigênio, resultantes da oxidação de componentes celulares, como tióis, cofatores enzimáticos, proteínas, nucleotídeos, lipídios e principalmente ácidos graxos poli-insaturados, mediada por espécies reativas de oxigênio (EROs) e espécies reativas de nitrogênio (ERNs), conhecidas genericamente por radicais livres (RL) (GILLER; SIGLER, 1995; ROMERO et al., 1998). O estresse oxidativo pode ser descrito como o desequilíbrio entre a formação de EROs e sua remoção do organismo, decorrente da geração excessiva de espécies reativas de 27 oxigênio e/ou diminuição de antioxidantes endógenos. A ocorrência de um estresse oxidativo moderado, frequentemente, é acompanhada do aumento das defesas antioxidantes enzimáticas, mas a produção de uma grande quantidade de radicais livres pode causar danos e morte celular (ANDERSON; THOMAS; WILKINSON, 1996). Entre os principais danos celulares causados por esses radicais, está a oxidação dos lipídios das membranas celulares, levando à perda da fluidez, e o aumento da permeabilidade das membranas, com liberação de nutrientes e substâncias tóxicas à célula no espaço extracelular, e até mesmo sua ruptura (FERREIRA; MATSUBARA, 1997; DAMASCENO, 2002). A peroxidação lipídica é o processo iniciado pela reação de um radical livre com um ácido graxo insaturado (da membrana) e propagado por radicais peroxilas, resultando na formação de hidroperóxidos lipídicos e aldeídicos, tais como o malondialdeído (MDA), os quais podem ser detectados em amostras biológicas e serem utilizados como marcadores de estresse oxidativo (figura 5). A condensação do MDA com o ácido tiobarbitúrico (TBA) forma produtos que podem ser detectados por absorção na zona do visível (532 nm) ou por fluorescência. O teste padrão consiste na medida do cromógeno róseo formado pela reação do MDA com duas moléculas do ácido tiobarbitúrico, em meio ácido e em alta temperatura, reação conhecida pelo nome de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). As TBARS são um dos principais marcadores biológicos deste tipo de lesão em membranas celulares (DRAPER; HADLEY, 1990). Desse modo, o MDA é utilizado há muitos anos como indicador da oxidação lipídica e ataque a proteínas (LIMA; ABDALLA, 2001). 28 Figura 5 - Representação do processo de lipoperoxidação das membranas celulares. Fonte: adaptado de Halliwell e Gutteridge (1999). Todos os seres vivos sofrem com o dano oxidativo, no entanto, o cérebro é o órgão mais sensível, devido ao grande consumo de glicose, oxigênio e energia, à peroxidação de ácidos graxos e à pequena produção de antioxidantes, ocorrendo neste órgão grande peroxidação das membranas (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1999). Devido à grande sensibilidade dos métodos fluorescentes para avaliar a produção de EROs em células de diversos tecidos (KOJIMA, 1998), a técnica conhecida por 2,7- diclorodihidrofluoresceínadiacetato (DCFH-DA) é utilizada como marcador oxidativo no meio intra e extracelular. O grupo diacetato é hidrolisado, deixando livres as moléculas de DCFH que são excelentes substratos para o peróxido de hidrogênio (H2O2), e permitindo a análise quantitativa dessas moléculas (ZHU; BANNENBERG; MOLDEUS, 1994). A medida da oxidação das proteínas pode ser utilizada como marcador da extensão do dano oxidativo. O conteúdo total de proteína carbonil é aumentado em várias doenças humanas, incluindo o diabetes mellitus, a doença de Alzeimer (DA), a artrite reumatoide e os processos inflamatórios. 29 2.6 ESTRESSE OXIDATIVO E DIABETES Desde 1991, Bast já indica relação entre o estresse oxidativo e várias doenças (BAST, 1991). Há evidências que as EROs possam estar envolvidas em mais de 50 doenças, entre estas o diabetes. O diabetes está associado ao aumento da geração de espécies reativas e à redução da capacidade de defesa antioxidante (PALMEIRA, 2006). A glicose sofre uma autooxidação, produzindo um radical enediol que transfere seu elétron não pareado para uma molécula de O2, gerando um ânion superóxido e uma dicarbonila, que liga duas cadeias proteicas, inativando-as (HALLIWELL, 2003). Nesse contexto, a utilização de antioxidantes naturais, como o resveratrol, e sintéticos para o alívio dos sintomas e o controle de doenças relacionadas ao estresse oxidativo vem crescendo, o que torna de grande relevância os estudos sobre os possíveis benefícios que eles podem trazer. 30 3 METODOLOGIA 3.1 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Os materiais e equipamentos utilizados neste estudo foram: Trans-RSV; Hidróxipropil-beta-ciclodextrina (HP-β-CD); álcool etílico absoluto; KBr; estreptozotocina (STZ); sacarose; Tris-HCl; fosfato de sódio; cloreto de potássio (KCl); MgCl2; glicose; copos de Bécker; pipetas, ponteiras; balões volumétricos; tubos de ensaio; microtubos; termômetro; seringa para gavagem; placas de Elisa; agitador; espectrofotômetro no UV visível; centrífuga refrigerada; refrigerador; freezer (-20ºC e -80ºC); incubadora; 31 medidor de glicose; Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISA). 3.2 ANIMAIS Foram utilizados 70 ratos Wistar provenientes do biotério da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM). Durante o tratamento, os animais foram mantidos no biotério do Centro Universitário Franciscano. O projeto acerca deste estudo foi aceito pela Comissão de Ética em Pesquisa com Animais do Centro Universitário Franciscano (CEUA/UNIFRA), com o número de parecer 014/2012. 3.2.1 Tratamento crônico Os animais foram separados aleatoriamente em 10 grupos (Figura 6), com sete animais por grupo: a) grupo controle (C) – recebeu água por gavagem intragástrica em volume equivalente aos demais grupos; b) grupo CD (CD) – recebeu solução de ciclodextrinas (CDs) na mesma concentração da HP-β-CD complexada ao resveratrol (RSV), por via intragástrica; c) grupo resveratrol (R) – recebeu 1 mg RSV/kg/dia, por via intragástrica; d) grupo diabético controle (Cd) – recebeu água, por via intragástrica, em volume equivalente aos demais grupos; e) grupo resveratrol complexado (RCD) – recebeu o equivalente a 1 mg RCD/kg/dia, por via intragástrica; f) grupo diabético + resveratrol (DR) – recebeu 1 mg RSV/kg/dia, por via intragástrica; h) grupo diabético + resveratrol complexado (RCD) – recebeu o equivalente a 1 mg RCD/kg/dia, por via intragástrica; i) grupo álcool (etanol) (E) – recebeu apenas a solução com caráter alcóolico utilizada para a dissolução do RSV, porém sem RSV. j) grupo diabético + álcool – recebeu apenas a solução com caráter alcóolico utilizada para a dissolução do RSV, porém sem RSV. 32 l) grupo diabético + CD – recebeu solução de CDs na mesma concentração da HP-βCD complexada ao RSV, por via intragástrica. Figura 6 - Representação esquemática dos grupos de tratamento crônico. Para este trabalho, o modelo animal de diabetes tipo 1 foi produzido por meio da injeção intraperitoneal (i.p.) de STZ na dosagem de 60 mg/kg de massa corporal de cada animal (GAJDOSÍK, 1999). A STZ, uma droga diabetogênica, é uma toxina que induz a uma rápida e irreversível apoptose das células -pancreáticas devido a um exacerbado aumento das espécies reativas de oxigênio (EROs) nestas células após sua administração. Substâncias antioxidantes, como o RSV, protegem contra a diabetogênese causada pela STZ (KU et al., 2011). Os animais que, após cinco dias, apresentaram dosagem glicêmica superior a 200 mg de glicose/decilitro de sangue foram considerados diabéticos (hiperglicêmicos) e foram utilizados para o tratamento crônico. Todos os animais foram tratados diariamente por meio de gavagem intragástrica, recebendo ração padrão e água à vontade. Após dois meses de tratamento e em jejum de 12 horas, os animais foram mortos por decapitação sem anestesia e 33 os tecidos de interesse foram imediatamente retirados e preparados para determinação dos parâmetros bioquímicos enzimáticos e não enzimáticos. 3.3 PREPARO DOS TECIDOS PARA AS MEDIDAS DAS ATIVIDADES ENZIMÁTICAS E DOS PARÂMETROS DO ESTRESSE OXIDATIVO As amostras usadas para investigar os parâmetros do estresse oxidativo foram homogeneizadas em tampão refrigerado (20 mmol/L fosfato de sódio e 140 mmol/L KCl, pH 7,4) e centrifugadas a 800 g por 10 min a 4 °C. O sobrenadante foi coletado para determinação dos níveis de TBARS, de oxidação do DCFH e do conteúdo de carbonilas proteicas. As amostras de tecidos foram armazenadas a -80ºC por trinta dias. 3.4 DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS DO ESTRESSE OXIDATIVO As medidas de estresse oxidativo foram determinadas de acordo com os seguintes descritos a seguir: 3.4.1 Medida de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) A técnica de TBARS consiste na reação dos produtos finais da lipoperoxidação com o ácido tiobarbitúrico. Nessa técnica, a leitura dos resultados é realizada com o auxílio de um espectrofotômetro a 532 nm e expressos como equivalentes de malondialdeído (MDA) (nmol/mg de proteína) (OHKAWA; OHISHI; YAGI, 1979). 3.4.2 Medida da oxidação de DCFH A produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e nitrogênio (ERN) é medida usando 2’,7’-dihidrodiclorofluoresceínadiacetato (DCF-DA). Espécies reativas são as principais responsáveies pela oxidação não enzimática do DCFH. O DCFH foi preparado em 20 mmol/L de tampão fosfato de sódio (pH 7,4), contendo 140 mmol/L de KCl, e a solução 34 foi incubada com 100 L de sobrenadante por 30 min a 37 ºC. O DCF-DA é hidrolizado enzimaticamente por esterases intracelulares para formar DCFH não fluorescente, o qual é rapidamente oxidado e forma 2’,7’-diclorofluoresceína (DCF), altamente fluorescente na presença de espécies reativas. A intensidade da fluorescência do DCF é proporcional à quantidade de espécies reativas formadas. A fluorescência foi medida usando comprimentos de onda de excitação e emissão a 480 e 535 nm, respectivamente. A calibração da curva foi construída usando padrão de DCF (0,25-10 mol) e os níveis de espécies reativas, calculados como pmol de DCF formado por mg de proteína (LEBEL; ISCHIROPOULOS; BONDY, 1992). 3.4.3 Determinação de carbonilas Foram utilizados, para a determinação das proteínas modificadas oxidativamente, o ensaio de determinação das carbonilas, que se baseia na reação das proteínas oxidadas do tecido com 2,4-dinitrofenil hidrazina (DNPH) em meio ácido, seguida de sucessivas lavagens com ácidos e solventes orgânicos e incubação final com guanidina. As leituras de absorbância foram medidas em um espectrofotômetro a 360 nm e os resultados foram expressos em nmols por mg de proteína (REZNICK; PACKER, 1994). 3.4.4 Superóxido dismutase (SOD) A atividade enzimática da SOD foi determinada pela inibição da auto-oxidação da adrenalina, medida espectrofotometricamente (480 nn) (BANNISTER; CALABRESE, 1987). 3.4.5 Catalase (CAT) A determinação da catalase foi realizada segundo o método descrito por Maehly e Chance (1954). Uma unidade de catalase decompõe 1μmol de H2O2 por mg de proteína em um minuto em pH 7,4. Os resultados foram expressos em μmol/mg de proteínas/min. 35 3.4.6 Dosagem de proteínas A quantidade de proteína contida no material analisado foi dosada pelo método de Lowry e colaboradores (1951). Todas as determinações foram expressas em unidades por mg de proteína. As medidas plasmáticas foram expressas em mg por mL. 3.4.7 Glutationa reduzida (GSH) e glutationa peroxidase (GPx) Os testes para avaliar a medida da glutationa reduzida (GSH) e a atividade enzimática da glutationa peroxidade (GPx) foram realizados de acordo com o método descrito por Wendel (1981). 3.5 PREPARAÇÃO DO COMPLEXO DE INCLUSÃO ENTRE HP-β-CD E TRANS-RSV Os complexos de inclusão entre HP-β-CD e trans-RSV foram preparados utilizando tecnologias úmidas e sem o uso de evaporação rotativa, devido à instabilidade do RSV a este processo (MATTIVI; LEBENSN, 1993). A HP-β-CD (0,1 mM) foi preparada em uma suspensão fina de água (8 mL) a 40 °C com agitação vigorosa no Ultra-Turrax® (3200 RPM) e uma quantidade equimolar de RSV (0,1 mM) foi adicionada por meio de um funil diretamente à suspensão. O RSV foi previamente suspendido em etanol absoluto (2 mL), após a suspensão foi agitada por um minuto e em seguida passou por um filtro de acetato de celulose de 0,45 µm, para separar as partículas não dissolvidas. O solvente foi removido no rotaevaporador a 40 °C durante 10 minutos e a umidade foi removida com o auxílio de bomba de vácuo (Nishihira, 2013). Este protocolo foi adaptado de Bertacche e colaboradores (2006) e Lu e colaboradores (2009). 3.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA Neste experimento, foram utilizados 10 grupos (n = 7 animais/grupo). Acima de dois grupos, o modelo estatístico escolhido para avaliar os dados obtidos em cada parâmetro foi análise de variância (ANOVA) de uma via (One way ANOVA). Para determinar a variabilidade dentro de cada amostra, bem como a variabilidade que existe entre as médias das amostras, foi gerada a estatística F, cuja equação é a seguinte: 36 F= V ariância da população estimada a partir d as médias das amostras , V ariância da população estimada como a média das variâncias d as amostras Assim, quanto maior a razão F, maior será a variação entre os grupos em relação à variação dentro dos grupos. Para que fosse possível identificar quais os grupos que, tomados dois a dois, diferiam significativamente entre si, foi utilizado o teste de Tukey, com um nível de significância de 0,05 (p < 0,05). Foram utilizados, para tratamento dos dados estatísticos, os softwares IBM SSPS STATISTIC 20 Editor de dados e GRAPH PAD PRISM versão 5.0. 37 4 RESULTADOS Neste estudo, foi investigado se a administração oral de resveratrol (RSV) e de resveratrol complexado a HP-β-CD em ratos hiperglicêmicos poderia reverter sinais do estresse oxidativo, normalmente referenciados no diabetes mellitus tipo 1 (DM1), e qual seria o efeito destas substâncias nos animais normoglicêmicos. Cinco dias após a indução ao diabetes com estreptozotocina (STZ), os ratos apresentaram uma elevação nos níveis glicêmicos em até três vezes a média aproximada (resultados não demonstrados). Após dois meses de tratamento, os níveis glicêmicos aumentaram em até cinco vezes nos grupos diabéticos, quando comparados aos grupos normoglicêmicos (p<0,001), e a hiperglicemia não foi reduzida pelos tratamentos realizados, o que pode ser confirmado com base nos níveis de frutosamina apresentados na Tabela 2. Tabela 2 - Níveis séricos de glicose e frutosamina em ratos induzidos ao diabetes por estreptozotocina. O tratamento crônico com resveratrol e complexo teve a duração de 60 dias. Grupos Glicose (mg/dL) Frutosamina (mg/dL) Controle - C 109 ± 16 151 ± 36 Etanol - E 106 ± 14 158 ± 27 Resveratrol - R 105 ± 15 149 ± 13 Complexo - RCD 101 ± 14 149 ± 30 HP-β-CD - CD 107 ± 8 158 ± 17 D+Controle - Cd 443 ± 30*** 374 ± 70*** D+Etanol - Ed 573 ± 61***## 348 ± 80*** D+Resveratrol - Rd 480 ± 58*** 313 ± 50*** D+Complexo - RCDd 481 ± 18*** 307 ± 100*** D+HP-β-CD - CDd 552 ± 46***# 416 ± 78*** Os resultados estão apresentados como média ± DP para sete experimentos independentes, que foram realizados em triplicata. ***p < 0,001 comparados ao controle normoglicêmico (teste de Tukey) e p < 0,05; ##p < 0,01; comparados ao controle diabético (teste de Tukey). O efeito das administrações de etanol (E), resveratrol (RSV), complexo (RCD), e HPβ-CD (CD) em animais normoglicêmicos e hiperglicêmicos foi observado pelos seguintes parâmetros: nível de glutationa reduzida (GSH), formação de carbonilas, lipoperoxidação, oxidação do DCFH e atividade das enzimas glutationa peroxidase (GPx), superóxido 38 dismutase (SOD) e catalase (CAT) sobre os tecidos cardíaco, hepático, renal e no córtex cerebral. 4.1 CORAÇÃO 4.1.1 No coração, o índice de peroxidação lipídica aumentou para o grupo diabético, porém os demais grupos tratados não diferiram significativamente dos controles normo- e hiperglicêmicos nos níveis de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). Apesar de não se diferenciarem do próprio controle diabético, os grupos hiperglicêmicos tratados não diferiram do controle normoglicêmico, indicando certa proteção por todos os tratamentos [F(9,49) = 15,86; p < 0,001], (Figura 7); Figura 7 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas de TBARS no coração. Os dados representam as médias ± desvio padrão para até sete animais em cada grupo. A unidade para TBARS está em nmol TBA/mg de proteína. ***p<0,001 comparado ao grupo controle não diabético (ANOVA seguido do teste de Tukey). 4.1.2 Como mostra a figura 8, nenhum tratamento, incluindo o resveratrol e o complexo afetaram os níveis de carbonilas proteicas dos animais normoglicêmicos, porém este parâmetro foi reduzido nos animais diabéticos quando comparados ao controle diabéticos, sem diferir do controle normoglicêmico [F(9,57) = 4,77; p < 0,001], (Figura 8); 39 Figura 8 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas das carbonilas no coração. Os dados representam as médias ± desvio padrão para até sete animais em cada grupo. A unidade para carbonilas está em nmol carbonilas/mg de proteína. #p<0,05 comparado ao grupo controle não diabético (ANOVA seguido do teste de Tukey). 4.1.3 Os níveis do antioxidante endógeno GSH não apresentaram diferenças significativas entre si [F(9,56) = 1,79; p > 0,05], (Figura 9); Figura 9 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas de GSH no coração. Os dados representam as médias ± desvio padrão para até sete animais em cada grupo. A unidade para GSH está em nmolGSH/mg de proteína. *p<0.05 comparado ao grupo controle não diabético (ANOVA seguido do teste de Tukey). 40 4.1.4 As medidas da oxidação do DCFH foram reduzidas por todos os tratamentos nos animais diabéticos quando comparados ao controle normoglicêmico [F(9,54) = 9,34; p < 0,001], (Figura 10); Figura 10 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas de DCFH-DA no coração. Os dados representam as médias ± desvio padrão para até sete animais em cada grupo. A unidade para DCFH está em μmolDCF/mg de proteína. *p<0,05,**p< 0,01,***p<0,001 comparado ao grupo controle não diabético (ANOVA seguido do teste de Tukey). 4.1.5 A atividade da enzima antioxidante CAT não foi alterada por nenhum dos tratamentos nos ratos normoglicêmicos, assim como não foi alterada pela hiperglicemia, porém a administração de CD em animais diabéticos apresentou diferença significativa quando comparada ao controle normoglicêmico [F(9,42) = 5,93; p< 0,001] (Figura11); 41 Figura 11- Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas da CAT no coração. Os dados representam as médias ± desvio padrão para até sete animais em cada grupo. A unidade para catalase está em UCAT/mg de proteína. *p<0,05 comparado ao grupo controle não diabético (ANOVA seguido do teste de Tukey). 4.1.6 A glutationa peroxidade (GPx), reduz hidroperóxidos a álcoois e peróxido de hidrogênio e água, utilizando GSH como agente redutor (doador final de elétrons que permite a regeneração da enzima), protegendo o organismo do dano oxidativo. Os tratamentos não afetaram os animais normoglicêmicos, inclusive o controle diabético quando comparado ao controle não diabético. Porém, quando administrados nos animais diabéticos, a atividade da enzima GPx praticamente dobrou nos grupos diabéticos quando comparados ao controle diabético, e somente o grupo CD diabético não foi diferente do controle normoglicêmico [F(9,43) = 9,75; p < 0,001], (Figura 12); 42 Figura 12 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas de GPx no coração. Os dados representam as médias ± desvio padrão para até sete animais em cada grupo. A unidade para GPx está em UGPx/mg de proteína. *p<0,05,**p<0,01 comparado ao grupo controle não diabético,###p<0,001;##p< 0,01 comparado ao controle diabético (ANOVA seguido do teste de Tukey). 4.1.7 A atividade da enzima SOD não demonstrou diferenças significativas entre os tratamentos e os controles [F(9,59) = 1,74; p>0,05] (Figura 13); Não Diabéticos USO D/mg prote ína 15 Diabéticos 10 5 0 C E R RCD CD C E R RCD CD Figura 13 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas da SOD totais no coração. Os dados representam as médias ± desvio padrão para até sete animais em cada grupo. A unidade para SOD está em USOD/mg de proteína. (ANOVA seguido do teste de Tukey). 43 4.2 FÍGADO 4.2.1 A administração de resveratrol livre (R) provocou redução significativa do nível de peroxidação lipídica (TBARS) para o grupo normoglicêmico comparado ao seu controle. O complexo RCD, não causou aumento nos níveis de peroxidação hepática em nenhuma das administrações. Pelo contrário, assim como o resveratrol (R), mostrou uma tendência à queda, porém não significativa, quando comparada aos controles [F(9,46) = 2,66; p<0,05] (Figura 14); Figura 14 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas de TBARS no fígado. Os dados representam as médias ± desvio padrão para até sete animais em cada grupo. A unidade para TABARS está em nmolTBA/mg de proteína. *p<0,05 comparado ao grupo controle não diabético (ANOVA seguido do teste de Tukey). 4.2.2 O R e o RCD não afetaram os índices de oxidação às proteínas (carbonilas) dos animais normoglicêmicos. Nos animais diabéticos, o R não reverteu o expressivo aumento neste parâmetro no fígado, porém a administração do RCD e do etanol reverteram este quadro quando comparados ao seu controle [F(9,51) = 4,16; p<0,0001](Figura 15); 44 Figura 15 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas das carbonilas. Os dados representam as médias ± desvio padrão para até sete animais em cada grupo. A unidade para carbonilas está em nmol carbonilas/mg de proteína. *p<0,05, **p<0,01 e *** p<0,001, comparado ao grupo controle não diabético,#p<0,05;###p<0,001 comparado ao controle diabético (ANOVA seguido do teste de Tukey). 4.2.3 Os níveis do antioxidante endógeno, glutationa reduzida, não foram alterados, tanto pelo R quanto pelo RCD e pelo veículo utilizado para o complexo, para os animais normo- ou hiperglicêmicos comparados aos seus controles [F(9,47) = 4,16; p<0,01](Figura 16). No entanto, a significância encontrada, foi entre o controle diabético e o grupo RDC normoglicêmico, comparações realizadas com o uso de ANOVA, porém não relatadas. Figura 16 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas de GSH no fígado. Os dados representam as médias ± desvio padrão para até sete animais em cada grupo. A unidade para GSH está em nmol GSH/mg de proteína. *p<0,05 comparado ao grupo controle (ANOVA seguido do teste de Tukey). 45 4.2.4 A administração do complexo (RCD) aumentou significativamente a formação de espécies reativas no fígado dos animais normoglicêmicos, avaliados pela oxidação do DCFH. O mesmo não ocorreu com os diabéticos que já estavam com índices elevados pela própria hiperglicemia [F(9,41) = 9,70; p<0,001] (Figura 17); Figura 17 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas de DCFH-DA no fígado. Os dados representam as médias ± desvio padrão para até sete animais em cada grupo. A unidade para DCFH-DA está em nmol DCF/mg de proteína. p<0,05, **p<0,01 e *** p<0,001, comparado ao grupo controle não diabético (ANOVA seguido do teste de Tukey). 4.2.5 A hiperglicemia elevou a atividade da enzima CAT no grupo diabético e a administração de CD, não reverteu o quadro, porém, o resveratrol livre (R) e o complexo (RCD) parecem ter efetuado uma reversão parcial, já que não são diferentes nem do controle normo- ou do controle hiperglicêmico [F(9,41) = 11,38; p<0,001] (Figura 18); 46 Figura 18 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas da catalase no fígado. Os dados representam as médias ± desvio padrão para até sete animais em cada grupo. A unidade para catalase está em UCAT/mg de proteína. *p<0,05, **p<0,01 e *** p<0,001, comparado ao grupo controle (ANOVA seguido do teste de Tukey). 4.2.6 Os tratamentos realizados com R e RCD não afetaram a atividade da enzima GPx tanto normo- quanto hiperglicêmicos. Porém ocorreu um significativo aumento pela administração de CD no grupo diabético comparado ao controle diabético, mas este aumento não foi diferente do controle não diabético [F(9,42) = 4,14; p<0,05] (Figura 19); Figura 19 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas de GPx no fígado. Os dados representam as médias ± desvio padrão para até sete animais em cada grupo. A unidade para GPx está em UGPx/mg de proteína. *p< 0,05,**p<0,01, comparado ao grupo controle não diabético, ##p<0,01 comparado ao controle normoglicêmico (ANOVA seguido do teste de Tukey). 47 4.2.7 A hiperglicemia e os tratamentos aplicados não causaram diferenças significativas sobre a atividade da SOD [F(9,43) = 1,02; p>0,05] (Figura 20); Figura 20 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas da atividade da SOD no fígado. Os dados representam as médias ± desvio padrão para até sete animais em cada grupo. A unidade para SOD está em USOD/mg de proteína. (ANOVA seguido do teste de Tukey). 4.3 CÓRTEX CEREBRAL 4.3.1 O dano lipídico foi avaliado pelos níveis de TBARS. A administração de resveratrol (R) e da HP-β-CD (CD) reduziu a lipoperoxidação quando comparados ao controle normoglicêmico [F(9,47) = 9,32; p<0,001] (Figura 21). Porém, nem o etanol (E) nem o complexo (RCD) afetaram esta medida, o Etanol está presente na mesma proporção que no grupo R e, RCD contém resveratrol de forma complexada. Figura 21 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas TBARS no córtex cerebral. Os dados representam as médias ± desvio padrão para até sete animais em cada grupo. A unidade para TBARS está em nmol TBARS/mg de proteína. 48 **p<0,01 comparado ao grupo controle não diabético (ANOVA seguido do teste de Tukey). 4.3.2 A hiperglicemia, e os tratamentos realizados, não afetaram os índices de oxidação às proteínas (carbonilas) [F(9,56) =3,58; p> 0,05], (Figura 22); Figura 22 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre a medida das carbonilas no córtex cerebral. Os dados representam as médias ± desvio padrão para até sete animais em cada grupo (ANOVA seguido do teste de Tukey). A unidade para formação de carbonilas esta em nmol carbonila/mg de proteína. 4.3.3 No córtex cerebral, ANOVA de uma via mostrou que não há diferenças estatísticas significativas para as medidas de GSH [F(9,54) = 2,21; p>0,05] (Figura 23); Figura 23 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre a medida de GSH no córtex cerebral. Os dados representam as médias ± desvio padrão para até sete animais em cada grupo. A unidade para GSH está expressa em nmol GSH/mg de proteína. 49 4.3.4 A oxidação do DCFH [F(9,58) = 2,35; p>0,05] (Figura 24); não apresentou diferenças resultantes dos tratamentos com relação aos seus respectivos controles normo- e hiperglicêmicos. Figura 24 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas de DCFH-DA no córtex cerebral. Os dados representam as médias ± desvio padrão para até sete animais em cada grupo (ANOVA seguido do teste de Tukey). A unidade para DCFH está em μmol DCF/mg de proteína. 4.3.5 Para a atividade da enzima CAT [F(9,48) = 1,40; p>0,05], (Figura 25); não foram observadas diferenças significativas entre os diferentes tratamentos. Figura 25 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas da atividade da CAT no córtex cerebral. Os dados representam as médias ± desvio padrão para até sete animais em cada grupo (ANOVA seguido do teste de Tukey). A unidade para CAT está em UCAT/mg de proteína. 50 4.3.6 Com relação às medidas de GPx [F(9,54) = 1,37; p>0,05] (Figura 26), não houve diferenças significativas resultantes dos tratamentos com relação aos seus controles. Figura 16 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas da atividade de GPx no córtex cerebral. Os dados representam as médias ± desvio padrão para até sete animais em cada grupo (ANOVA seguido do teste de Tukey). A unidade para GPx está em UGPx/mg de proteína. 4.3.7 A atividade da enzima SOD não sofreu alterações com a administração dos tratamentos quando comparados aos seus respectivos controles [F(9,54) = 3,74; p<0,05] (Figura 27); Figura 27 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre a medida da atividade da SOD no córtex cerebral. Os dados representam as médias ± desvio padrão para até sete animais em cada grupo (ANOVA seguido do teste de Tukey). A unidade da SOD esta em USOD/mg de proteína. 51 4.4 RINS 4.4.1 Como se observa na figura 28, a hiperglicemia elevou expressivamente a peroxidação lipídica (TBARS) neste tecido, cujos níveis foram revertidos pelas administrações de R, RCD e CD [F(9,57); p<0,001]. Figura 28 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas de TBARS nos rins. Os dados representam as médias ± desvio padrão para até sete animais em cada grupo. A unidade para TBARS está em nmol TBA/mg de proteína. ***p<0,001;*p<0,05 quando comparados ao controle normoglicêmico; #p<0,05 e ###p<0,001 quando comparado ao grupo controle diabético (ANOVA seguido do teste de Tukey). 4.4.2 As administrações de R, RCD e CD não alteraram as médias da oxidação às proteínas (carbonilas) nos animais normoglicêmicos. A hiperglicemia também não elevou o valor nos rins, mas a administração de R reduziu os níveis de carbonilas nos diabéticos quando comparados ao próprio controle [F(9,54) = 2,73; p<0,01] (Figura 29); Figura 29 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas das carbonilas nos rins. Os dados representam as médias ± desvio padrão para até sete animais em cada grupo. A unidade para carbonilas está em nmol carbonilas/mg de proteína. #p<0,05 comparado ao grupo controle diabético (ANOVA seguido do teste de Tukey). 52 4.4.3 Os tratamentos aplicados e a hiperglicemia, ou ambos não afetaram significativamente as medidas da atividade da enzima GSH [F(9,56) = 0,78; p>0,05] (Figura 30); Figura 30 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas de GSH nos rins. Os dados representam as médias ± desvio padrão para até sete animais em cada grupo. A unidade para GSH está em nmolGSH/mg de proteína.(ANOVA seguido do teste de Tukey). 4.4.4 Os tratamentos aplicados e/ou a hiperglicemia não provocaram diferenças significativas para as medidas de DCFH [F(9,58) = 1,75; p>0,05] (Figura 31); Figura 31 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas de DCFH-DA nos rins. Os dados representam as médias ± desvio padrão para até sete animais em cada grupo. A unidade para DCFH-DA está em μmolDCF/mg de proteína. (ANOVA seguido do teste de Tukey). 53 4.4.5 A hiperglicemia e os tratamentos aplicados, não afetaram as medidas da atividade da enzima CAT nos rins [F(9,54) = 1,66; p>0,05] (Figura 32); Figura 32 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas da CAT nos rins. Os dados representam as médias ± desvio padrão para até sete animais em cada grupo. A unidade para catalase está em UCAT/mg de proteína. (ANOVA seguido do teste de Tukey). 4.4.6 A atividade da enzima GPx não foi alterada pelos tratamentos nos animais normoglicêmicos, porém o diabetes causou uma expressiva queda na atividade da GPx, a qual foi revertida pela administração de R aos animais hiperglicêmicos. Observa-se reversão parcial pelos demais tratamentos, já que os grupos E, RCD e CD não são diferentes significativamente do controle normoglicêmico [F(9,53) = 4,76; p<0,001] pelo tratamento com resveratrol (R) (Figura 33); Figura 33 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre medidas de GPx nos rins. Os dados representam as médias ± desvio padrão para até sete animais em cada grupo. A unidade para GPx está em UGPx/mg de proteína. *p<0,05 comparado ao grupo controle não diabético; #p<0,05 comparado ao controle diabético (ANOVA seguido do teste de Tukey). 54 4.4.7 A administração do complexo (RCD) e seu veículo (CD) reduziram as medidas da atividade da enzima SOD tanto nos animais normo- quanto nos hiperglicêmicos [F(9,50) = 5,05; p<0,001] (Figura 34); Figura 34 - Efeito da administração de resveratrol (R), do complexo (RCD) e HP-β-CD (CD) em ratos Wistar normo e hiperglicêmicos sobre a atividade da SOD renal. Os dados representam as médias ± desvio padrão para até sete animais em cada grupo. A unidade para SOD está em USOD/mg de proteína. *p<0,05;***p<0,001 comparado ao grupo controle não diabético e #p<0,05 quando comparado ao grupo controle diabético (ANOVA seguido do teste de Tukey). 55 5 DISCUSSÃO DOS RESULTADOS A principal manifestação clínica do diabetes, a hiperglicemia, vem sendo cada vez mais correlacionada com o aumento de espécies reativas e consequentes complicações como mudanças na homeostasia redox e estresse oxidativo (TARR et al., 2013). E é relatado que a exposição prolongada das células endoteliais à alta concentração de glicose pode ter efeitos consideráveis nas propriedades da célula (MARRAZZO et al., 2014). Um componente do vinho tinto, o resveratrol, é um antioxidante que de acordo com a literatura, melhora o controle glicêmico em humanos e causa um efeito semelhante em animais porque ou aumenta a secreção de insulina ou melhora a sensibilidade a este hormônio e por isto é apontado como uma substância antidiabética (XIE et al., 2013). Assim, complexálo à HP-β-CD, poderia produzir resultados mais eficazes do que utilizá-lo livre sobre os parâmetros do estresse oxidativo avaliados e durante este período de tratamento. Os modelos animais não são completamente similares aos humanos; logo, a manifestação das doenças, bem como suas características e formas de tratamento, diferem entre esses organismos. Porém, modelos químicos têm sido amplamente utilizados porque apresentam a vantagem de permitir o estudo de muitas substâncias que se acumulam nas doenças humanas e que não possibilitam um controle adequado. Neste trabalho, utilizamos a estreptozotocina (STZ) para produzir a hiperglicemia característica do DM1. Portanto, os modelos animais são importantes na investigação de mecanismos fisiopatológicos das doenças, cuja compreensão permite sugerir medidas preventivas e novas drogas para seu tratamento (FRANCESCHI et al., 2013). O modelo foi efetivamente reproduzido, pois a glicemia aumentou aproximadamente cinco vezes com relação às médias dos animais normoglicêmicos após oito semanas de tratamento (conforme mostrado anteriormente naTabela 2). O coração é um órgão que utiliza grande quantidade de ácidos graxos, além de glicose como substratos energéticos (MARKS, 2007). A oxidação final destes combustíveis ocorre na mitocôndria por mecanismos aeróbicos, o que justifica a suscetibilidade deste tecido ao estresse oxidativo. Existem diversas cardiopatias associadas ao estresse oxidativo, como por exemplo, a arteriosclerose (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1999. Pacientes diabéticos apresentam maior risco para doenças cardiovasculares o que eleva ainda mais a taxa de mortalidade (THIYAGARAJAN et al., 2012). 56 Neste estudo, os tratamentos não afetaram os níveis de lipoperoxidação nos animais normoglicêmicos, o que indica que a nova estrutura testada, o RCD, não alterou este parâmetro de estresse. A hiperglicemia elevou expressivamente os níveis de TBARS, mas os tratamentos reverteram parcialmente esta elevação, indicando que etanol, R, RCD e CD livre, inclusive, protegem o coração dos danos aos lipídeos. A enzima antioxidante superóxido dismutase (SOD) transforma o radical ânion superóxido (O2·-) em peróxido de hidrogênio (H2O2), o que diminui os efeitos tóxicos causados pelo radical livre (KUMAR et al., 2014). A SOD é uma das principais enzimas utilizadas no combate ao dano oxidativo causado pelas EROs (COGO et al., 2009). Apesar de relatos de aumento na atividade da SOD (KAKKAR et al.,1995), e também sua redução (GODIN et al., 1988) para grupos diabéticos, neste trabalho, a atividade da SOD cardíaca não foi afetada nem pela hiperglicemia e nem pelos tratamentos realizados. Resultado semelhante a este foi encontrado por Sampaio e colaboradores (2014), cujo tratamento durou 3 semanas. Estes pesquisadores também relataram que os níveis de GSH, um importante protetor endógeno, não apresentaram diferenças significativas, assim como os resultados obtidos pelo nosso estudo para o tecido cardíaco. Estes dados sugerem que a hiperglicemia e os tratamentos parecem não ter provocado uma variação nos níveis do radical ânion superóxido ou de GSH. Somado a isto, as administrações de etanol, resveratrol livre, complexo de resveratrol e HP-β-CD e HP-β-CD na forma livre, reduziram a oxidação do 2′,7′-diclorofluorescina-diacetato (DCFH-DA), dos animais hiperglicêmicos, indicando que junto à glicemia elevada, os tratamentos parecem reduzir as espécies reativas de oxigênio no coração. A enzima catalase, converte H2O2 em H2O e O2 e, a glutationa peroxidase também transforma H2O2 em H2O, oxidando GSH durante o processo (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 2007). Os tratamentos não afetaram as atividades da CAT e GPx dos animais normoglicêmicos e diabéticos. Porém, os tratamentos junto à hiperglicemia aumentaram a atividade da GPx e somente a administração de CD elevou a atividade da CAT nos animais diabéticos. Muitas espécies reativas oxidam resíduos de aminoácidos de proteínas para formar produtos com grupo carbonila que são medidos através da reação com DNPH. Os níveis de carbonilas estão elevados em muitas doenças (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 2007). O dano oxidativo às proteínas plasmáticas têm sido reportado no DM1 e o acúmulo relacionado a muitas complicações crônicas nesta doença (JALEEL et al., 2010), porém, assim como para 57 o grupo de Sampaio e colaboradores (2014), os níveis de oxidação às carbonilas não foram alterados pelos tratamentos ou pela hiperglicemia. As administrações de RCD e CD reduziram os níveis nos animais diabéticos. O fígado é o principal local do metabolismo de glicose e lipídeos e mantem o nível de lipídeos da circulação através do metabolismo das lipoproteínas. A oxidação aumentada de ácidos graxos livres, pelo fígado, pode gerar EROs e levar ao processo de peroxidação lipídica, alterações estruturais e funcionais na célula (MANI et al., 2014). Lucchesi e colaboradores (2013) utilizaram aloxano como substância diabetogênica e relataram que houve elevação de TBARS neste tecido e que as enzimas antioxidantes CAT, SOD E GPx tiveram suas atividades reduzidas nos animais diabéticos. Neste trabalho, com STZ, e oito semanas de tratamento, não houve elevação nos níveis de TBARS e à administração de resveratrol nos animais normoglicêmicos causou uma redução significativa nesta medida. Os níveis de GSH hepático também não foram alterados nem pelos tratamentos ou pela hiperglicemia. Assim como a atividade da enzima SOD neste órgão. A enzima antioxidante, GPx tem alta atividade no fígado, moderada atividade no coração, pulmão e cérebro e baixa atividade nos músculos (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1999). Para o grupo de LUCCHESI (2013), houve uma redução na atividade da enzima para o grupo diabético, revertida pelos tratamentos empregados. A atividade da catalase aumentou no grupo diabético e CD do diabético, mas foi revertida por etanol, resveratrol e complexo, sugerindo um mecanismo compensatório entre GPx e CAT no fígado. O complexo (RCD) aumentou expressivamente a oxidação do DCFH nos animais normoglicêmicos indicando que a administração desta nanopartícula estimulou a produção de EROs no tecido hepático. Ocorreu aumento, também, no controle, R e RCD de animais diabéticos. A oxidação às proteínas, através da medida de carbonilas, foi elevada para o controle, resveratrol e CD diabéticos. Este aumento foi revertido pelas administrações do etanol e complexo nos animais hiperglicêmicos. Estudos prévios relatam que o cérebro é o órgão mais sensível do corpo humano, devido ao alto consumo de oxigênio e glicose (HALLIWELL, 1992). Segundo Gupta, Afaq e Mukhtar (2001), o cérebro obtém sua energia produzindo ATP a partir da fosforilação oxidativa mitocondrial. Neste processo, são geradas muitas espécies reativas de oxigênio, como o radical hidroxila e o peróxido de hidrogênio. A exposição prolongada a altos níveis de 58 glicose, característicos no diabetes, promove a redução nos níveis de glutationa reduzida (GSH). Porém, as medidas de carbonilas, GSH, DCF, CAT, GPx e SOD não foram alteradas pelos tratamentos nem para os animais normoglicêmicos, como para os hiperglicêmicos. Somente a administração de resveratrol e CD, reduziram os níveis de TBARS nos animais normoglicêmicos. Considerando-se que os rins apresentam grande atividade metabólica, com altos níveis de proteínas do grupo HEME e ferritina, promovendo a formação de radicais livres, entendese que a consequente lipoperoxidação provoca disfunções renais (KALE et al., 1999). A exposição prolongada a hiperglicemia provoca queda na atividade da GPx nas células dos rins (BALLATORI, 2009). Estes relatos também ocorreram neste trabalho, onde o aumento nos níveis de TBARS nos animais diabéticos foi revertido pelas administrações de resveratrol, complexo e HP-β-CD. Também ocorreu a queda na atividade da enzima GPx revertida pela administração de cada tratamento nos animais hiperglicêmicos. A atividade da enzima CAT não foi diferente por nenhum dos tratamentos nos animais normo- e hiperglicêmicos. Já a atividade da SOD foi reduzida pelas administrações de RCD e CD nos animais normoglicêmicos e também hiperglicêmicos. Diferente do grupo de Godin et al. (1988) que relatou queda na atividade da SOD e CAT para os animais diabéticos. Compostos fenólicos são conhecidos como antioxidantes, mas algumas substâncias fenólicas podem exercer atividade pró-oxidante em certas condições, como na presença de íons de metais de transição (KOBASYASHI et al., 2004). Entretanto, o RSV, é bem conhecido por possuir uma vasta gama de atividades biológicas e farmacológicas, atuando como antioxidante, anti-inflamatório e anti-hiperglicimiante (LANGCAKE; PRYCE, 1976; SIGNORELLI; GHIDONI, 2005). Os resultados deste estudo sugerem que o RSV pode ser um composto terapêutico potente contra as doenças relacionadas ao DM1. Para o tecido dos rins, os resultados mostram que e os níveis de TBARS foram aumentados pelo tratamento com HP-β-CD (CD). A atividade da SOD foi reduzida nos animais tratados com o complexo (RCD) e HP-β-CD (CD). Os resultados também sugerem que o resveratrol livre ocasiona aumento de atividade da GPx. Verificou-se, ainda, que o tratamento com RSV e HP-β-CD (CD) em animais tratados com etanol (E) produz redução das medidas de DCFH, porém sem diferenças estatísticas significativas. 59 A entrega de polifenóis naturais por nanopartículas potencializa a utilização deste polifenol para o estresse oxidativo. A nanotecnologia tem um grande potencial na prestação de serviços nesta área. Desse modo, os resultados obtidos neste trabalho sugerem que o complexo de inclusão do RSV em HP-β-CD é um sistema de transporte que apresentou efeitos adequados na proteção contra danos do estresse oxidativo causado pelo diabetes. 60 6 CONCLUSÕES Neste estudo, foram investigados importantes parâmetros do estresse oxidativo no tecido cardíaco, hepático, do córtex cerebral e renal de ratos induzidos ao diabetes por STZ, um modelo válido de indução à hiperglicemia, principal característica do diabetes, pois todos os animais induzidos ao DM1 apresentaram elevados níveis glicêmicos no quinto dia após a indução e no final do tratamento de dois meses. O resveratrol (RSV) foi escolhido como forma de tratamento para o DM1 por ser um antioxidante muito estudado e relatado principalmente como hipoglicemiante. Porém, além de ter baixa absorção no epitélio intestinal, o RSV, para ser utilizado nas pesquisas com modelos animais precisa ser dissolvido em substâncias orgânicas, como, por exemplo, o etanol, o qual foi utilizado neste trabalho. A presença do solvente pode interferir nos resultados ou mesmo impedir administrações de concentrações mais elevadas em meio biológico. Uma forma de proteger, melhor dissolver e aumentar a sua biodisponibilidade encontrada neste estudo foi associar o RSV à uma nanopartícula, a hidroxipropil-betaciclodextrina (HP-β-CD). A hipótese inicial foi que o complexo formado (entre RSV e HP-βCD) poderia reforçar as propriedades já conhecidas do RSV e, assim, ser utilizado como uma forma de tratamento com menos efeitos colaterais para os indivíduos com DM1. A análise dos dados obtidos permite concluir que: a) O diabetes altera alguns parâmetros de estresse oxidativo. b) Apesar da exposição cerebral a grandes concentrações de glicose, o córtex cerebral foi a estrutura que melhor respondeu à hiperglicemia e aos tratamentos avaliados, pois dos sete parâmetros testados apenas a medida de TBARS foi reduzida pelo resveratrol e seu complexo nos animais normoglicêmicos. c) 1 mg de resveratrol livre ou no complexo corresponde a aproximadamente 4 cálices de vinho. Os resultados sobre a hiperglicemia nos surpreenderam, pois nem o resveratrol livre ou seu complexo reverteram os altos níveis glicêmicos característicos no DM1 e correlacionado a muitas desordens na doença. d) Há relatos na literatura de que os níveis de GSH diminuem em vários tecidos de pacientes diabéticos, divergente das respostas encontradas neste trabalho, pois as medidas de GSH em todos os tecidos e grupos testados não sofreram alteração, sugerindo que esta defesa 61 antioxidante e endógena foi preservada durante um tratamento com oito semanas de duração e cujos níveis glicêmicos eram bastante elevados. e) O complexo mostrou propriedades diferentes do RSV, o que foi positivo mostrando que realmente se trata de uma estrutura distinta. f) No coração, os níveis de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) nos animais diabéticos foi maior em relação aos animais não diabéticos. Animais tratados com etanol apresentaram redução da atividade da catalase (CAT) quando comparados ao controle não diabético. g) A atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx) não foi alterada no coração após o tratamento, se comparada com o grupo controle não diabético. h) Nos rins, as medidas de glutationa reduzida (GSH) sofreram redução nos animais diabéticos em relação ao controle não diabético. Os tratamentos com grupo complexo (RDC) e HP-β-CD livre provocaram redução da medida de SOD em ratos diabéticos quando comparados com o controle não diabético. i) A atividade da enzima GPx foi reduzida em animais do grupo controle diabéticos e recuperada nos tratamentos de ratos diabéticos com grupo resvetratrol (R), e RCD, sugerindo uma ação protetiva neste órgão. j) No fígado, a administração de resvetratrol (R) ocasionou queda dos níveis de TBARS em ratos não diabéticos quando comparado ao próprio grupo controle e não alterou esses níveis nos demais tratamentos. As carbonilas tiveram aumento significativo em ratos diabéticos do grupo controle e em ratos diabéticos dos grupos tratados com R e CD, porém o tratamento com o complexo RCD não apresentou diferenças significativas em relação ao controle não diabético, sugerindo uma possível ação protetora do complexo neste órgão. k) No córtex cerebral, o tratamento com o complexo formado por RSV livre e HP-β-CD, identificado por complexo RDC, não promoveu diferenças significativas, no que diz respeito a parâmetros de estresse oxidativo em animais diabéticos, quando comparados com o controle não diabético. Entretanto, os dados sugerem que o tratamento com RSV e HP-β-CD nas suas formas livres provoca redução dos níveis de TBARS em animais não diabéticos comparados com o grupo controle normoglicêmico. l) As complicações do diabetes correlacionadas com a extensão e o período de tempo da 62 hiperglicemia, geralmente são consideradas a principal causa de lesão tecidual. Assim, comparar na literatura tecidos com tempo de duração diferente também pode levar a resultados diferentes utilizando o mesmo modelo diabetogênico. 63 PERSPECTIVAS A possibilidade do complexo de inclusão formado por resveratrol (RSV) e hidroxipropil-β-ciclodextrina (HP-β-CD) alterar os parâmetros de estresse oxidativo nos diversos órgãos analisados neste trabalho oferece a perspectiva de avaliar os tratamentos com doses superiores àquelas que foram utilizadas, e determinar a dose ideal para administração eficaz. As alterações observadas nos grupos tratados com HP-β-CD, usada como veículo para o RSV, sugerem a perspectiva de estudos relativos à sua toxicidade. Outra perspectiva é o tratamento ser realizado com períodos de tempo diversos a fim de determinar o tempo ideal para o tratamento com a resposta esperada. 64 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANDERSON, J. G.; THOMAS, T. H.; WILKINSON, R. Increased susceptibility to membrane lipid peroxidation in renal failure. 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