Mitobuilding: exercitar a mitocôndria

Mitobuilding: exercitar a
mitocôndria
O efeito do Resveratrol na actividade mitocondrial
Ana Rita Costa Afonso
Maria Salomé de Basso Temudo
1
Muitas patologias humanas, tais como o envelhecimento ou a diabetes ,
estão associadas à diminuição da função mitocondrial. Compostos que que
estimulam a mitocôndria podem ser usados como terapia.
O Resveratrol é um composto que tem efeitos benéficos no tratamento
da doença cardiovascular, tem actividade anti-tumoral e estimula a mitocôndria.
2
Mitocôndria
3
1. Isolamento de Mitocôndrias:
4
Centrifuga
5
6
2. Quantificação de proteínas
Espectrofotómetro
7
3. Ensaios de consumo de oxigénio e potencial:
Eléctrodo de TPP+
Eléctrodo de oxigénio
8
Estudos Preliminares- Potencial
Controlo
Resveratrol
9
Estudos Preliminares- Potencial
Potencial inicial (succinato)mV
224
222
220
218
216
Potencial inicial
(succinato)mV
214
212
210
208
Controlo
Resveratrol
Lag Phase
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Lag Phase
Controlo
Resveratrol
10
Estudos Preliminares- consumo de O2
Controlo
Resveratrol
11
Estudos Preliminares- consumo de O2
250
200
150
Controlo
Resveratrol
100
70
60
50
50
40
0
Estado 3
V FCCP
Estado 4
30
V oligomicina
20
8
10
7
0
6
Controlo
Resveratrol
5
I.C.R.
4
ADP\O
3
2
1
0
Controlo
Resveratrol
12
4. Electroforese e transferência (western Blot)
Electroforese em gel de
poliacrilamida
VersaDoc
Transferência para membrana
de PVDF
13
5. Análise da expressão genética;:
5. 1Extrair RNA( tecido de fígado)
Máquina de PCR
14
5. Análise da expressão genética;:
5.2 Quantificar e analisar RNA
Electroforese de RNA
Padrão
15
5. Análise da expressão genética;:
5.4 Sintetizar cDNA
5.5 qPCR
16
Cultura de células:
17
7. Ensaios células ROS\potencial
Ensaios potencial:
3000
2500
2000
CTL
HFFAS
1500
HFFAS
+RESV
1000
500
0
1
3
5
7
9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29
180
160
140
120
100
Série1
80
60
40
20
18
0
CTL
HFFAS
HFFAS+RESV
RESV
Ensaios ROS:
Leitor de placas
19
8. Dinâmica mitocondrial
20