karen crisanto de oliveira influência dos odores de gato e de cobra
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KAREN CRISANTO DE OLIVEIRA INFLUÊNCIA DOS ODORES DE GATO E DE COBRA NO COMPORTAMENTO DEFENSIVO E EXPRESSÃO DE FOS DO SISTEMA HIPOTALÂMICO DE DEFESA DE CAMUNDONGO. Dissertação apresentada à Universidade Federal do Rio Grande do Norte, para obtenção do Psicobiologia. NATAL 2015 título de Mestre em KAREN CRISANTO DE OLIVEIRA INFLUÊNCIA DOS ODORES DE GATO E DE COBRA NO COMPORTAMENTO DEFENSIVO E EXPRESSÃO DE FOS DO SISTEMA HIPOTALÂMICO DE DEFESA DE CAMUNDONGO. Dissertação apresentada à Universidade Federal do Rio Grande do Norte, para obtenção do título de Mestre em Psicobiologia. Orientador: Prof. Dr. Expedito Silva do Nascimento Júnior NATAL 2015 Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de Biociências Oliveira, Karen Crisanto de. Influência dos odores de gato e de cobra no comportamento defensivo e expressão de fos do sistema hipotalâmico de defesa de camundongo. / Karen Crisanto de Oliveira. – Natal, RN, 2015. 57 f.: il. Orientador: Prof. Dr. Expedito Silva do Nascimento Júnior. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia. 1. Camundongo. – Dissertação. 2. Comportamento defensivo. – Dissertação. 3. Estímulos odoríferos. – Dissertação. I. Nascimento Júnior, Expedito Silva do. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título. RN/UF/BSE-CB CDU 599.323 Título: Influência dos odores de gato e de cobra no comportamento defensivo e expressão de Fos do Sistema Hipotalâmico de Defesa de camundongo. Autor: Karen Crisanto de Oliveira Data da defesa: 08 de maio de 2015 Banca Examinadora: ___________________________________ Prof. Dr. Francisco Gilberto Oliveira Universidade Regional do Cariri, CE ___________________________________ Prof. Dr. Judney Cley Cavalcante Universidade Federal do Rio Grande do Norte, RN ___________________________________ Prof. Dr. Expedito Silva do Nascimento Junior Universidade Federal do Rio Grande do Norte, RN À mainha, uma fortaleza, Régia Morais. Qualquer trabalho que não lhe exija superação, não lhe proporcionará crescimento. Qualquer trabalho que não lhe desafie, não lhe proporcionará crescimento. Qualquer trabalho que não lhe faça sentir vontade de desistir em alguns momentos, não lhe proporcionará crescimento. Qualquer trabalho que seja confortável 100% do tempo e lhe exija poucas horas por dia, não lhe proporcionará crescimento. Qualquer trabalho que não lhe proporcione crescimento, simplesmente não serve. (Flávio Augusto da Silva) AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus, que me segurou inúmeras vezes. Agradeço aos amigos do LabNeuro, aos da UFRN, e aos da vida, pela paciência, compreensão, apoio, troca de conhecimentos e pelas amenidades durante esse tempo. Não cito nomes, pois minha memória costuma falhar e minha gratidão não deixa ninguém de fora. Aos meus professores, desde o início da minha formação até agora, por proporcionarem, antes de tudo, inspiração! Especialmente aos professores Expedito e Judney, pelas orientações, pelo tempo dedicado, pelo conhecimento e sabedoria compartilhados comigo, meu imenso obrigada! Agradeço a banca examinadora, pela disponibilidade e enriquecimento do trabalho! A minha família - irmãs, sobrinhos, padrasto, avós, tias(os), primos(as) - e, especialmente, a minha mãe, à quem dedico esse trabalho! RESUMO Estudos com traçador neuronal em rato tem demonstrado que os núcleos anterior do hipotálamo, divisão dorsomedial do núcleo ventromedial do hipotálamo e pré-mamilar dorsal são altamente conectados. Quando o rato é exposto ao predador ou seu odor estes núcleos apresentam alta expressão de Fos e a lesão deles reduz o comportamento defensivo contra predador. A este conjunto de núcleos foi dado o nome de Sistema Hipotalâmico de Defesa. No entanto, pouco se sabe sobre a resposta deste sistema ao odor de diferentes predadores ou seu papel em camundongos. Neste trabalho, expusemos camundongos Swiss aos odores de dois predadores (gato e cobra) para verificar a expressão de Fos no Sistema Hipotalâmico de Defesa, assim como os comportamentos defensivos exibidos. A análise mostrou que a exposição do camundongo ao odor de gato provocou um aumento na expressão da proteína Fos comparado ao controle, enquanto que o odor de cobra não teve o mesmo efeito, o que foi corroborado pelos dados comportamentais. Nossos resultados indicam que esse distinto circuito em camundongo parece agir diferencialmente aos estímulos odoríferos de diferentes predadores, provocando reações comportamentais distintas, sendo que o odor de cobra parece não ser percebido como um estímulo ameaçador pelos camundongos Swiss. Palavras-chaves: camundongo, estímulos odoríferos, Sistema Hipotalâmico de Defesa, Fos, comportamento defensivo. ABSTRACT Studies using neuronal tract-tracer in rat have shown that the anterior hypothalamic nucleus, dorsomedial division of the ventromedial nucleus of the hypothalamus and dorsal premammillary nucleus are highly connected. When the rat is exposed to predator or its odor these nuclei have shown a expression of Fos and their lesion reduces defensive behavior against predator. This set of nuclei was named the Hypothalamic Defense System. However, little is known about the response of this system to the odor of different predators or its role in mice. In this work, we exposed Swiss mice to two different predators odor (cat and snake) to verify the Fos expression in the Hypothalamic Defense System, as well as the defensive behaviors displayed. The analysis showed that the mice exposure to cat odor had an increased expression of Fos protein compared to control, while those exposed to snake odor showed no rise in Fos expression, which was corroborated by the behavioral data. Our results indicate that this distinct circuit in mice seems to act differentially to odorous stimuli of different predators, causing distinct behavioral responses of mice and that the odor of snake seems not to be perceived by Swiss mice as a threatening stimulus. Key-words: mice, odorous stimuli, hypothalamic defensive system, Fos, defensive behavior. LISTA DE ABREVIAÇÕES AHN – núcleo hipotalâmico anterior AMv – porção ventral do núcleo anteromedial do tálamo BMAp – porção posterior do núcleo basomedial da amígdala LA – Núcleo lateral da amígdala LHAsf – região subfornical da área hipotalâmica lateral LPO – área pré-óptica lateral LS – Septo lateral MEApv – porção posteroventral no núcleo medial da amígdala PAG – substância cinzenta periaquedutal PAGd – região dorsal da substância cinzenta periaquedutal PAGdl – porção dorsolateral da substância cinzenta periaquedutal PHA-L – leucoaglutinina do Phaseolus vulgaris PMd – núcleo pré-mamilar dorsal PMDvl – porção ventrolateral do núcleo pré-mamilar dorsal VMH – núcleo ventromedial hipotalâmico VMHdm – porção dorsomedial do núcleo ventromedial hipotalâmico LISTA DE FIGURAS E TABELAS Figura 1 – Diagrama esquemático do sistema neural envolvido no processamento de ameaças predatórias bem como na organização das respostas comportamentais incondicionadas.........................................................................................................................21 Figura 2 – Esquema do aparato experimental utilizado...........................................................28 Figura 3 – Esquema representando o aparato experimental utilizado, mostrando como foi dividido para análise espacial do comportamento....................................................................29 Figura 4 – Fotomicrografias dos núcleos analisados, mostrando a citoarquitetura através da técnica de Coloração de Nissl e os resultados das imunoistoquímicas realizadas no Grupo controle, no Grupo Odor de cobra e no Grupo Odor de gato....................................................32 Figura 5 – Gráficos de comparações entre os grupos experimentais da expressão de Fos nos núcleos hipotalâmicos analisados.............................................................................................33 Figura 6 – Gráficos de comparações entre os grupos experimentais com relação aos parâmetros espaço-temporal.....................................................................................................36 Figura 7 – Gráficos de comparações entre os grupos experimentais com relação aos comportamentos defensivos apresentados................................................................................37 Figura 8 - Gráficos de ocupância representando um compilado dos percursos feitos por todos os animais de cada grupo no aparato comportamental. O tempo de permanência é demonstrado de acordo com as cores, quanto mais intensa a cor, maior o tempo de permanência no local. A, Grupo controle; B, Grupo odor de gato; C, Grupo odor de cobra...46 Tabela 1 – Comparação da expressão de Fos nos núcleos hipotalâmicos analisados entre os grupos experimentais................................................................................................................34 Tabela 2 – Comparação de respostas defensivas entre os grupos experimentais....................38 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 13 1.1 ODOR COMO ESTÍMULO AMEAÇADOR ............................................................ 13 1.2 COMPORTAMENTO DEFENSIVO A UMA AMEAÇA PREDATÓRIA ............. 14 1.3 NEUROBIOLOGIA DO COMPORTAMENTO DEFENSIVO ............................... 16 1.3.1 O HIPOTÁLAMO ................................................................................................. 17 1.3.2 O SISTEMA HIPOTALÂMICO DE DEFESA .................................................... 19 2. OBJETIVOS ............................................................................................................... 23 2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..................................................................................... 23 3. MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................................... 24 3.1 ANIMAIS ................................................................................................................... 24 3.2 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS .................................................................. 24 3.2.1 EXPERIMENTO 1 ................................................................................................. 24 3.2.1.1 EXPOSIÇÃO .......................................................................................................... 24 3.2.1.2 PERFUSÃO ............................................................................................................ 25 3.2.1.3 PROCEDIMENTOS HISTOLÓGICOS ................................................................ 25 3.2.1.4 ANÁLISE E QUANTIFICAÇÃO DOS DADOS .................................................. 27 3.2.2 EXPERIMENTO 2 ................................................................................................. 28 3.2.2.1 APARATO EXPERIMENTAL.............................................................................. 28 3.2.2.2 ANÁLISE COMPORTAMENTAL ....................................................................... 28 4. RESULTADOS ........................................................................................................... 31 4.1 EXPERIMENTO 1 ..................................................................................................... 31 4.2 EXPERIMENTO 2 ..................................................................................................... 34 5. DISCUSSÃO ............................................................................................................... 39 5.1 PROTEÍNA FOS COMO MARCADOR DE ATIVIDADE NEURONAL ............. 39 5.2 O SISTEMA HIPOTALÂMICO DE DEFESA NA INTERAÇÃO PRESA vs. PREDADOR. ............................................................................................................. 39 5.3 ODOR DE COBRA COMO ESTÍMULO PREDATÓRIO.......................................43 5.4 CAMUNDONGO E COMPORTAMENTO DEFENSIVO.......................................44 6. CONCLUSÃO.............................................................................................................47 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 48 13 1. INTRODUÇÃO É difícil transmitir seus genes quando você está morto. Não é de se surpreender, dessa forma, que a maioria dos animais faça o melhor possível para viver tempo suficiente para reproduzir. No entanto, sobreviver pode ser um desafio na maior parte dos ambientes, em que há predadores. Em função de serem tão competentes na localização de alimento, estes submetem as presas a pressões seletivas intensas (Alcock, 2011). Durante a evolução, esperase que a seleção natural aumente a eficiência com que predadores detectam e capturam presas. Por outro lado, também se espera que a seleção melhore a capacidade da presa evitar a captura e escapar. As complexas adaptações e contra-adaptações que vemos entre predadores e suas presas são testemunhas de sua longa coexistência e reflete o resultado de uma corrida armamentista através do tempo evolutivo (Krebs & Davies, 1996). Assim, a função primária do comportamento defensivo é reduzir a magnitude da ameaça, ou a vulnerabilidade do animal. Uma defesa inadequada pode gerar injúria ou até a morte (Yang et al., 2004). Os riscos a que animais estão constantemente expostos incluem predadores, coespecíficos, parasitas, infecções, toxinas, e outros fatores ameaçadores no ambiente animal. Dentre eles, o mais estudado é a ameaça predatória, com as presas exibindo uma variedade de adaptações para evitar a captura (Kavaliers & Choleris, 2001). Se a ameaça vem de um coespecífico ou de um predador, iniciam-se respostas agressivas ou de medo, aumentando as chances de sobrevivência do indivíduo (Stowers et al., 2013). 1.1 ODOR COMO ESTÍMULO AMEAÇADOR É bem conhecido que roedores são muito sensíveis a pistas olfativas e que a exposição a odor de predador pode eliciar vigorosos comportamentos defensivos (Blanchard et al., 1990; Dielenberg & McGregor, 1999). O camundongo detecta odorantes especializados emitidos por coespecíficos (feromônios) e heteroespecíficos (cairomônios), que são suficientes para 14 desencadear comportamentos de medo e agressividade (Stowers et al., 2013). Pistas quimiossensórias ou odor de predador é, por vezes, a única informação disponível para a presa que está escondida em abrigo ou incapaz de detectar visualmente a fonte da ameaça (Takahashi, 2014). Além disso, as pistas quimiossensórias ficam no ambiente por um tempo, informando à presa que o predador esteve ali. Assim, olfação pode ser experimentalmente utilizada para controle, manipulação e investigação dos circuitos neurais e mecanismos que promovem o comportamento defensivo inato (Stowers et al., 2013). 1.2 COMPORTAMENTO DEFENSIVO A UMA AMEAÇA PREDATÓRIA Predadores, ataques por coespecíficos e características perigosas do ambiente representam três classes de estímulos ameaçadores que são encontrados em praticamente qualquer ambiente natural (Blanchard & Blanchard, 2008). A melhor forma de evitar a predação é evitar o predador (Apfelbach et al, 2005). Prever perigo permite aos animais a própria defesa contra danos e é crucial para a sobrevivência (Sah & Westbrook, 2008). Reações defensivas são, provavelmente, os mais prevalentes e comuns padrões de comportamento utilizados pela maioria das espécies animais (Blanchard et al., 1990). A habilidade inata de executar comportamentos antipredatórios constitui uma parte do repertório comportamental essencial para a sobrevivência, principalmente quando se trata de ambientes ameaçadores. Portanto, comportamento defensivo é hierarquicamente elevado. Isto quer dizer que em um ambiente ou situação ameaçadora a presa suprime qualquer comportamento em detrimento de sua defesa. Muito do comportamento defensivo pode ser considerado como produto de uma forte pressão seletiva, afetando não somente a forma e magnitude da defesa, como também a relação entre o comportamento defensivo e o estímulo ou situação que elicia esta ação (Blanchard & Blanchard, 1989). 15 Comportamento defensivo contra um predador é um grupo ou padrões de respostas eliciadas por ameaça. Para os animais da vasta maioria das espécies este comportamento responsivo a ameaça não depende de experiência prévia, sendo um comportamento inato, ou seja, é um conjunto de respostas adaptativas a estímulos de ameaça e situações que são comuns na história evolutiva das espécies que os exibem. Estas respostas evoluíram através da sobrevivência diferencial/sucesso reprodutivo que foram propiciados aos indivíduos que apresentaram o comportamento adequadamente (Blanchard & Blanchard, 2008). De forma geral, as espécies evoluíram de um conjunto de adaptações comportamentais antipredatórias que envolvem compensações e custos (Kavaliers & Choleris, 2001). Para maximizar sua aptidão, presas podem responder adaptativamente a ameaças de predação por avaliação do seu próprio nível de risco associado a cada ameaça (Ferrari et al., 2006). Um elemento crucial para análise da defesa é qual defesa particular precisa ser efetivada contra o tipo de ameaça que está sendo experimentada (Blanchard & Blanchard, 2008). Comportamentos de fuga coordenada e descoordenada, evitação, congelamento motor (freezing), ameaça defensiva, ataque defensivo e avaliação de risco têm sido caracterizados em uma variedade de espécies de mamíferos como forma de defesa contra predadores (Blanchard et al., 1998). Algumas defesas podem oferecer vantagem sobre outras e pode evoluir com base nisto (Blanchard & Blanchard, 2008). A execução de uma estratégia em particular leva em conta vários fatores, como as características do ambiente (presença ou ausência de rota de fuga, por exemplo), distância e tipo do estímulo ameaçador e experiência prévia com o estímulo e o ambiente. Uma simples interação presa-predador pode afetar a aptidão da presa – um erro, e a presa pode ser morta. Sendo assim, a evitação ao predador e a avaliação do risco predatório são altamente favoráveis à seleção natural (Kavaliers & Choleris, 2001). A distância entre a presa e o predador influencia fortemente o tipo de defesa realizada, com a maior distância do predador 16 propiciando a fuga e a proximidade eliciando o freezing. Na fuga o animal se mantém longe da ameaça, enquanto que a resposta de freezing reduz a probabilidade de ataque por duas razões: se o predador ainda não descobriu a presa, esta é mais difícil de ser detectada quando imóvel, e mesmo quando a presa é detectada, é menos susceptível de ser atacado se mantendo imóvel (Fanselow & Lester, 1987). Ameaça defensiva, seguida de ataque defensivo, se orientam para a pista ameaçadora e podem ocorrer quando o contato com o predador torna-se iminente (Blanchard et al., 1998; Blanchard & Blanchard, 2008). A partir da perspectiva da presa, a detecção precoce de perigo é extremamente útil e qualquer comportamento ou meio que permita a ela determinar a presença de perigo é adaptativo. Isso envolve a inibição de atividades normais, como comer, higienização e cuidado a prole, em favor de um padrão de “varredura” do ambiente, focando a visão, a audição e olfação, por sinais de perigo. Esse é o comportamento rotulado de avaliação de risco, que em roedores é tipicamente medido pelo animal assumir uma postura esticada orientada para a ameaça ou para o ambiente em que a ameaça foi detectada previamente (Blanchard & Blanchard, 1989). Esses comportamentos são similares entre as espécies, o que sugere mecanismos neurais conservados evolutivamente (Stowers et al., 2013). 1.3 NEUROBIOLOGIA DO COMPORTAMENTO DEFENSIVO Neurocientistas tem dado grande importância aos substratos neurobiológicos das respostas defensivas e utilizado experimentos com exposição a predadores como meio de desvendar fatores ameaçadores e estressores na atividade e plasticidade de regiões cerebrais, bem como examinar o funcionamento de vários sistemas neuromodulatórios (Kavaliers & Choleris, 2001). 17 Trabalhos de Bard (1928) e Hess & Brugger (1943) trouxeram o conhecimento de que o hipotálamo desempenha um importante papel na expressão bem coordenada dos comportamentos defensivos. Em uma série de experimentos com gatos decorticados, Bard (1928) identificou como uma área mais crítica para a expressão de respostas defensivas a metade caudal do hipotálamo. Hess & Brugger (1943), com estimulações elétricas em vários pontos do diencéfalo, identificaram a região perifornical da área hipotalâmica lateral como um sítio chave para eliciar integração das respostas defensivas. Isto foi confirmado e estendido por Hunsperger (1956) e Fernandez De Molina & Hunsperger (1962), mostrando que estimulações elétricas ao longo de um caminho contínuo incluindo a amígdala, a estria terminal, o núcleo intersticial da estria terminal, a região perifornical da área hipotalâmica lateral e a substância cinzenta periaquedutal eliciam comportamento defensivo. Além disso, eles fornecem forte evidência indicando que este circuito é organizado hierarquicamente. Por exemplo, respostas para estimulação amigdalar ou hipotalâmica são abolidas por lesões na substância cinzenta periaquedutal, porém respostas ainda podem ser eliciadas estimulando animais com lesão na região perifornical ou amígdala (Canteras et al., 2012). Entre as estruturas classicamente envolvidas nas respostas de medo, temos distritos diferenciados da zona medial do hipotálamo; setores específicos da amígdala e do sistema septohipocampal, envolvidos no processamento de pistas relacionadas à presença de predador e na análise contextual do ambiente, respectivamente; e setores da substância cinzenta periaquedutal, envolvida na expressão das respostas comportamentais (Canteras, 2003). 1.3.1 O HIPOTÁLAMO O hipotálamo está situado no diencéfalo, ocupando sua porção ventral, logo abaixo do tálamo, ao longo das paredes do terceiro ventrículo. Visto pela base do encéfalo, engloba o quiasma óptico e a região coberta por ele, e se estende para trás até a borda do mesencéfalo. 18 Logo atrás do quiasma emerge o infundíbulo, que conecta o hipotálamo com a hipófise, e atrás do infundíbulo ficam o túber cinéreo e os corpos mamilares (Bear et al., 2002). Ocupa um volume relativamente pequeno, mas possui um grande numero de agrupamentos neuronais distintos, podendo ser subdividido em três zonas longitudinais em cada antímero. A que fica mais próxima ao plano mediano é a zona periventricular, margeando o terceiro ventrículo, seguindo-se sucessivamente pela zona medial e pela zona lateral (Bear et al., 2002). A zona periventricular contém a maioria dos neurônios motores neuroendócrinos e também envia importantes eferências para o sistema motor autônomo (Swanson, 1987). Além disso, ela também contém uma complexa rede neural composta de um número de núcleos hipotalâmicos, incluindo o pré-óptico mediano, o anteroventral periventricular, o pré-óptico anterodorsal, o pré-óptico anteroventral, o paraestrial, o supraquiasmático, e o núcleo préóptico dorsomedial. Por analogia com o sistema motor, acredita-se que a maioria dos núcleos da zona periventricular representa elementos pré-motores (talvez agindo como “motores” geradores de padrão) para aferências neuroendócrinas e autonômicas (Swanson, 2000). A zona medial do hipotálamo possui uma série de núcleos que coletivamente desempenham papel chave na iniciação de comportamentos motivados, tais como reprodutivo, agressivo e apetitivo (Swanson, 1987). Uma análise das projeções axonais da zona medial hipotalâmica indicou que o núcleo hipotalâmico anterior, a porção dorsomedial do núcleo ventromedial e o núcleo pré-mamilar dorsal são altamente interconectados, e segregados de outro circuito nesta zona, que inclui o núcleo pré-óptico medial, a porção ventrolateral do núcleo ventromedial, o núcleo tuberal e o núcleo pré-mamilar ventral (Simerly & Swanson, 1988; Canteras & Swanson, 1992; Canteras et al., 1994; Risold et al., 1994). O primeiro circuito está envolvido na integração de respostas defensivas inatas às ameaças ambientais e o último faz parte de um sistema sexualmente dimórfico que medeia 19 comportamento reprodutivo e agonístico social (Canteras et al., 1997). A zona lateral está envolvida na ativação cortical, termorregulação e nos comportamentos consumatórios de fome (Lent, 2005; Swanson, 1987). Pode-se também subdividir o hipotálamo na dimensão rostro-caudal, surgindo então quatro áreas, sendo a mais rostral a área pré-óptica, quase no mesmo plano do quiasma óptico, seguindo-se a região anterior, depois a região tuberal, e mais caudalmente a região mamilar (Lent, 2005). Embora perfaça menos de 1% da massa encefálica, a influência do hipotálamo na fisiologia do corpo é enorme, integrando respostas somáticas e viscerais de acordo com as necessidades do encéfalo (Bear et al., 2002). Neste contexto, não é de surpreender que sistemas hipotalâmicos também estejam envolvidos na integração de respostas defensivas para proteção do animal de ameaças predatórias (Martinez et al., 2008). 1.3.2 O SISTEMA HIPOTALÂMICO DE DEFESA A zona medial do hipotálamo contém uma série de núcleos bem definidos dispostos longitudinalmente que desempenham um papel crítico na expressão do comportamento defensivo, reprodutivo e social agonístico (Comoli et al., 2000). Regiões hipotalâmicas a partir das quais o comportamento defensivo pode ser eliciado foram expandidas para incluir a zona medial, a partir de uma série de estudos que mostram que estimulações elétricas nesta região induzem um padrão de respostas somatomotora e autonômica semelhante ao comportamento de animais frente a ameaças naturais (Canteras, 2002). A reação de defesa induzida por essas estimulações é caracterizada por locomoções rápidas, coordenadas e intercaladas com tentativas de fuga bem dirigidas (Canteras, 2002). Com o intuito de delinear a circuitaria hipotalâmica envolvida na integração das respostas defensivas, foram feitas análises da imunorreatividade a Fos, uma proteína indicadora de atividade neuronal, no hipotálamo de rato que demonstrou comportamento de 20 defesa durante exposição a um predador natural (Canteras et al., 1997). Estes estudos mostraram que ratos expostos a gato ou a odor de gato tem aumento da expressão de Fos na zona hipotalâmica medial, especificamente no núcleo hipotalâmico anterior (AHN), na porção dorsomedial do núcleo ventromedial (VMHdm) e no núcleo pré-mamilar dorsal (PMd) (Canteras, 2002; Canteras et al., 1997; Dielenberg et al., 2001). Estudos utilizando a injeção estereotáxica da leucoaglutinina do Phaseolus vulgaris (PHA-L) analisaram as projeções axonais da zona medial do hipotálamo e revelaram que o AHN, o VMHdm e o PMd são altamente interconectados (Canteras & Swanson, 1992; Canteras et al., 1994; Risold et al., 1994). Estimulação elétrica e administração de agonista de glutamato e antagonista de GABA no hipotálamo medial induzem comportamento de escape e respostas autonômicas semelhantes ao que é apresentado por animais frente a ameaças naturais (Freitas et al., 2009; Silva et al., 2011). Estimulações elétricas ou químicas na região dorsal da substância cinzenta periaquedutal (PAGd), que provocam freezing e escape, mostra uma expressão de Fos em núcleos do hipotálamo medial, como VMH e PMd (Vianna et al., 2003), caracterizando uma provável circuitaria relacionada ao sistema defensivo. Assim, unindo descobertas anatômicas e funcionais foi possível pôr em foco um distinto subsistema hipotalâmico, denominado Sistema Hipotalâmico de Defesa, formado por esses três núcleos citados, onde o PMd parece exercer um papel crítico para a expressão das respostas coordenadas de medo em um ambiente ameaçador. A mobilização desses núcleos parece ocorrer sempre que o animal está frente a estressores psicológicos que induzem medo (Canteras et al., 2001). De acordo com Comoli e colaboradores (2000), o PMd parece ser substancialmente inervado por uma variedade de sítios diencefálicos, incluindo partes específicas da região perifornical, a região retinoceptiva da área hipotalâmica lateral, o AHN e o VMHdm. O AHN e o VMHdm recebem projeções de determinadas áreas telencefálicas, como a região pré-frontal, núcleo septal lateral e o núcleo amigdalar medial (Canteras et al., 21 1997). O AHN integra informação a partir do sistema septohipocampal e também, em menor escala, a partir da área cortical pré-frontal. Sendo assim, o AHN pode transmitir ao PMd informações de retorno relacionadas com os resultados das respostas do medo inato. O VMHdm é outra importante fonte de aferências do PMd (Canteras et al., 1994; Comoli et al., 2000). Este integra principalmente informações críticas para a percepção do predador a partir da amígdala, provenientes da porção posteroventral do núcleo medial (MEApv) e da porção posterior do núcleo basomedial (BMAp) (Canteras et al., 1995, 2001; Petrovich et al., 1996). O MEApv tem seu papel no processamento feromonal do odor do predador e o BMAp responde a totalidade dos estímulos predatórios, não somente ao odor (Canteras et al., 2001) (Figura 1). Figura 1 – Diagrama esquemático do sistema neural envolvido no processamento de ameaças predatórias bem como na organização das respostas comportamentais incondicionadas. Imagem extraída e modificada de Gross & Canteras, 2012. Abreviações: AHN, núcleo hipotalâmico anterior; BLA, amígdala basolateral; CEA, amígdala central; dlPAG, porção dorsolateral da substância cinzenta periaquedutal; dmVMH, porção dorsomedial do núcleo ventromedial hipotalâmico; LA, amígdala lateral; pBMA, porção posterior do núcleo basomedial da amígdala; pvMEA, porção posteroventral no núcleo medial da amígdala; vlPMD, porção ventrolateral do núcleo pré-mamilar dorsal. Em roedores, o PMd representa a mais sensível região cerebral em resposta ao predador ou suas pistas (Canteras et al., 2012). Estudos mostram que ratos com lesão química 22 do PMd apresentam redução significativa de freezing e aumento na atividade de avaliação de risco durante exposição ao gato (Blanchard et al., 2003; Cezario et al., 2008). O VMHdm e o AHN fornece um tipo único de projeção para o PMd, com densas projeções bilaterais (Canteras et al., 1994; Risold et al., 1994), sendo esse tipo de arranjo sináptico o que permite ao PMd atuar como um amplificador no processamento neural hipotalâmico das pistas relacionadas à predação (Cezario et al., 2008). De uma forma resumida, podemos dizer que o VMHdm informa ao PMd sobre aspectos sensoriais e o AHN leva ao PMd uma contextualização baseada em experiências passadas. Então o PMd processa, amplifica estas informações e repassa para áreas relacionadas a execução do comportamento e formação de nova memória ou reforço da mesma. A maioria das pesquisas relacionadas ao sistema defensivo é realizada em ratos, utilizando odor ou a presença do predador, e até mesmo de TMT (2,4,5-trimethylthiazoline), um odor aversivo artificial obtido através das fezes de raposa. Pouco se sabe sobre a neurobiologia do medo e defesa em camundongos, especialmente utilizando e comparando o efeito dos odores de diferentes predadores em potencial, sabendo que roedores são animais que se utilizam especialmente do apurado sistema olfatório para obter informações do ambiente. As informações fornecidas pelos núcleos já classicamente envolvidos – em ratos – nas respostas de medo, aliadas aos dados comportamentais, nos darão um direcionamento se estes são também responsáveis pelas mesmas funções em camundongos. Estudos utilizando pistas de diferentes predadores podem nos indicar diferentes características do Sistema Hipotalâmico de Defesa, como características biológicas particulares da espécie. 23 2. OBJETIVOS Analisar o Sistema Hipotalâmico de Defesa e o comportamento defensivo do camundongo quando este é exposto a odor de diferentes predadores. 2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Analisar e comparar a ativação neuronal em camundongos, através da expressão de Fos, nos núcleos hipotalâmicos que formam o Sistema Hipotalâmico de Defesa, em resposta à exposição aguda a odor de gato ou de cobra; Analisar diferenças comportamentais em camundongos submetidos ao odor de cobra ou de gato. 24 3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 ANIMAIS Para realização deste trabalho foram utilizados 37 camundongos Swiss, machos jovens, com peso médio de 36 gramas. Estes animais foram mantidos em condições constantes de temperatura (22ºC), com água e ração ad libitum, sob ciclo claro-escuro 12:12, sendo as luzes acesas às 6:00h. Foram obtidos no Biotério do Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, e lá permaneceram até os procedimentos experimentais. Todos os procedimentos estão de acordo com as normas para uso de animais experimentais estabelecidos pela Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (1996) e pelo Comitê de Ética para Usos Animal da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CEUA-UFRN), sendo aprovado pelo mesmo (protocolo 018/2009). 3.2 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS 3.2.1 3.2.1.1 EXPERIMENTO 1 EXPOSIÇÃO Nesta etapa dos experimentos, foram utilizados 21 camundongos. Os animais foram mantidos juntos, por grupo, em gaiolas de plástico (41 x 34 x 16 cm) com tampa aramada para apoiar o bebedouro e a ração, até o início do período de habituação, em que eram colocados individualmente em gaiolas de plástico menores (30 x 20 x 13 cm), também com tampas aramadas. Os camundongos foram divididos em três grupos: um grupo controle (CT, n=7); um grupo exposto a odor de gato (OG, n=7); e um grupo exposto a odor de cobra (OC, n=7). Todos os dias, no mesmo horário (às 16:00h), os animais tinham suas gaiolas trocadas por outras limpas, para que o animal se habituasse ao manuseio no dia do experimento. No 5º dia 25 de troca os animais CT tiveram novamente suas gaiolas trocadas por outra limpa, os OG tiveram suas gaiolas trocadas por outra com o fundo coberto com uma toalha da mesma cor da maravalha que foi esfregado nos pelos de um gato doméstico adulto por 1 minuto, e os OC tiveram suas gaiolas trocadas por outra com maravalha em que uma cobra (Boa constrictor) permaneceu por 05 dias, incluindo a presença de pedaços de pele recém-trocadas de cobra. 3.2.1.2 PERFUSÃO Cerca de 90 minutos após o estímulo, os animais foram anestesiados com Cetamina 10% (0,2mg/10g) e Xilazina 2% (0,02mg/10g) e passaram por perfusão transcardíaca. Neste procedimento, os animais sofreram toracotomia com exposição da cavidade torácica, seguida de incisão da cânula no ventrículo esquerdo, e incisão do átrio direito para saída do sangue e das soluções circulantes. A perfusão iniciou-se com solução salina 0,9% (50mL) para lavagem do sistema seguido de solução fixadora composta de formaldeído a 4% (250mL). Após a fixação, os encéfalos foram removidos, colocados em solução de pós-fixação, com o mesmo fixador, durante 2 horas, e em seguida colocados em tampão sacarose 30% para crioproteção, permanecendo nesta solução até serem microtomizados. 3.2.1.3 PROCEDIMENTOS HISTOLÓGICOS Os encéfalos foram congelados em gelo seco e cortados em micrótomo de deslizamento (Leica), no plano frontal, na espessura de 30µm e divididos em 4 séries de cortes alternados. Estas foram armazenadas em solução anticongelante até o início dos procedimentos histológicos. Para análise da presença de células imunorreativas a Fos, utilizamos como técnica de imunoistoquímica a imunoperoxidase pelo método ABC, seguindo o seguinte protocolo: uma série de cortes do encéfalo de cada animal foi lavada em tampão fosfato (NaPBS), 4 vezes de 26 10 minutos, e pré-tratadas por 30 minutos em uma solução de peróxido de hidrogênio 0,3% em tampão Triton X-100 (TXPB) para inativação de peroxidase endógena. Em seguida, foram lavados em NaPBS até não haverem mais bolhas (5 minutos cada lavagem) e incubados em outra solução contendo TXPB e soro normal de jumento (SNJ, Jackson Laboratories) durante 40 minutos para bloqueio de sítios inespecíficos. Após isto, foi adicionado à solução o anticorpo primário anti-Fos feito em coelho (Jackson Laboratories) a concentração de 1:10.000 e o tecido foi mantido incubando, em rotor, por aproximadamente 18 horas, a temperatura ambiente. Em seguida, o tecido foi lavado em NaPBS (3 vezes de 10 minutos) e incubado em anticorpo secundário anti-coelho feito em jumento (Jackson Laboratories) a concentração de 1:1.000 diluído em TXPB por 2 horas. Os cortes passaram novamente por 3 lavagens de 10 minutos cada para serem, então, incubados no complexo avidina-biotinaperoxidase (Kit ABC, Vector) na concentração de 1:333 diluído, com 30 minutos de antecedência, em NaPBS por 2 horas. Os cortes foram lavados em NaPBS (3 vezes de 10 minutos) e transferidos para uma solução contendo NaPBS, diaminobenzidina (DAB 0,05%) e sulfato de amônia e zinco (NAS 0,05%) como cromógenos, adicionado de peróxido de hidrogênio 0,01%, onde permaneceram por aproximadamente 5 minutos. A reação foi parada com 2 lavagens de 10 minutos cada em NaPBS, os cortes foram montados em lâminas de vidro, e secaram por aproximadamente 3 dias. Após isto, os cortes foram desidratados em concentrações crescentes de alcoóis etílicos (70% - 95% - 2 vezes 100%; 5 minutos cada) e deslipidificados em xilol (2 vezes de 5 minutos cada). Em seguida, foram cobertos com lamínulas utilizando Entellan como meio de montagem. Para o estudo da citoarquitetura dos núcleos, utilizamos a coloração pelo método de Nissl, com a tionina como corante. Para isso, os cortes de uma série adjacente foram lavados em NaPBS 0,1M pH 7,4, montados em lâminas gelatinizadas e deixados secar por aproximadamente 3 dias. Em seguida, foram submetidos à coloração de Nissl, passando 27 inicialmente por uma desidratação dos cortes em concentrações crescentes de alcoóis etílicos (70% - 2 vezes 95% - 2 vezes 100%; 3 minutos cada) sendo posteriormente deslipidificados em xilol (1 vez de 3 minutos e 1 vez de 30 minutos). Os cortes, então, foram reidratados em concentrações decrescentes de alcoóis etílicos por 2 minutos cada, chegando a tionina onde ficou por 40 segundos, mergulhados 15 vezes em água destilada e novamente desidratados e deslipidificados, sendo, ao final, cobertos com lamínula utilizando como meio de montagem o Entellan. 3.2.1.4 ANÁLISE E QUANTIFICAÇÃO DOS DADOS Utilizando como base anatômica os cortes corados com tionina de cada animal, o atlas estereotáxico de encéfalo de camundongo (Franklin e Paxinos, 2008) e com base em Martinez et al. (2008), foi feita a contagem de células que expressaram Fos dentro dos limites do AHN (em dois níveis; figuras 38 e 40 de Franklin e Paxinos, 2008), da região subfornical da área hipotalâmica lateral (LHAsf) (nível da figura 40 de Franklin e Paxinos, 2008), do VHMdm (em dois níveis; figuras 43 e 46 de Franklin e Paxinos, 2008), e do PMd (nível da figura 52 de Franklin e Paxinos, 2008). Para isto, uma fotomicrografia unilateral de cada um desses núcleos foi feita usando uma máquina fotográfica digital (Nikon DMX1200) acoplada a um microscópio (Olympus BX41), utilizando o programa ACT1 (Nikon). A contagem foi feita por três pesquisadores cegos aos grupos do experimento, utilizando o programa ImageJ (NIH) e utilizamos a média aritmética das contagens destes 3 observadores como número final. Os dados foram analisados estatisticamente através do programa SPSS Statistics 21, aplicando o teste de Kruskal Wallis e teste U de Mann-Whitney, com margem de erro de 5% (p ≤ 0,05) e apresentados na forma de gráfico com a média ± S.E.M. 28 Os esquemas sobre as microfotografias foram feitos utilizando o programa Canvas 12. Os gráficos foram produzidos utilizando o programa SPSS Statistics 21. As tabelas foram elaboradas utilizando a Microsoft Office Excel. 3.2.2 3.2.2.1 EXPERIMENTO 2 APARATO EXPERIMENTAL O aparato utilizado, com base em Yang et al. 2004, consiste em uma caixa de acrílico formada por quatro compartimentos: uma caixa de iniciação (12cm x 7cm x 7cm), ligada a uma área maior por um túnel (13cm x 4,4cm), sendo esta área (46cm x 24cm x 21cm) divida em duas metades iguais por uma grade removível (Figura 2). Nas paredes e no fundo do aparato foi colada película preta, para evitar que estímulos visuais viessem a influenciar no comportamento e tomada de decisão dos camundongos. Figura 2 – Esquema do aparato experimental utilizado. Retirado de Campos et al. 2013. 3.2.2.2 ANÁLISE COMPORTAMENTAL Foram utilizados 16 camundongos machos adultos. Estes, após passarem pelo experimento controle, foram divididos em dois grupos, grupo odor de gato (n=8) e grupo odor de cobra (n=8). Todos foram expostos ao mesmo aparato experimental, sob as mesmas condições de luz, manuseio, horário, local e pesquisador. 29 Do aparato, foram consideradas três zonas: Zona 1, Zona Neutra e Zona Aversiva, como representado na Figura 3. Figura 3 – Esquema representando o aparato experimental utilizado, mostrando como foi dividido para análise espacial do comportamento. O experimento ocorreu durante 05 dias seguidos, sempre às 16h, com 10 minutos diários de duração. Os três primeiros dias foram para habituação dos animais tanto ao manuseio quanto ao aparato/ambiente. Nesses dias foi colocada a grade para evitar o acesso à Zona aversiva. No dia 04 (dia controle), os camundongos foram colocados no aparato com o pano limpo na Zona aversiva, porém sem a grade, para que fosse possível a exploração completa do ambiente. Nesse dia realizamos a gravação dos 10 minutos para posterior análise dos comportamentos. No dia 05 (dia teste), o aparato estava da mesma forma do dia 04, porém o pano apresentava o odor de gato ou de cobra. O odor de gato foi obtido friccionando o pano por 1 minuto nos pelos de um gato adulto. O odor de cobra foi obtido através da maravalha que permaneceu durante 5 dias como assoalho do aquário de uma jiboia (Boa constrictor), e após a retirada do aquário era colocada em um saco plástico junto ao pano durante 1 dia. Também foram filmados por 10 minutos para posterior análise dos comportamentos. Os vídeos foram analisados utilizando o programa Any-Maze e os seguintes parâmetros foram avaliados: tempo de permanência em cada Zona, latência de saída da Zona 1, entradas na Zona aversiva. Os comportamentos avaliados foram: distância percorrida (locomoção), freezing (que consiste de permanência imóvel), grooming (limpeza feita em si 30 mesmo) e avaliação de risco (esticar a porção anterior do corpo, permanecendo com as patas traseiras fixas). Para análise estatísticas dos dados foi usado o programa SPSS Statistics 21, utilizando Análise de Variância one way e Teste t pareado para distribuições normais e homogêneas, aplicando como post hoc o teste de Tukey, e teste de Kruskal Wallis e teste U de MannWhitney para dados não normalmente distribuídos, com margem de erro de 5% (p≤0,05) e apresentados na forma de tabela e gráfico com a média ± S.E.M. Os gráficos foram produzidos utilizando o programa SPSS Statistics 21. As tabelas foram elaboradas utilizando o Microsoft Office Excel. 31 4. RESULTADOS 4.1 EXPERIMENTO 1 Houve diferença significativa na expressão de Fos, comparando as médias dos núcleos AHN (H(2) = 7,279; p = 0,026), VMHdm (H(2) = 9,92, p = 0,007) e PMD (H(2) = 8,137; p = 0,017) entre os grupos controle, odor de gato e odor de cobra. O AHN mostrou forte expressão de Fos nos animais OG (52,50 ± 14,29), com maior quantidade de células que CT (9,29 ± 2,68; U = 6,5; p = 0,017) e OC (13,14 ± 4,6; U = 6,5; p = 0,017). Os OG também apresentaram significativamente maior número de células imunorreativas a Fos no VMHdm (39,14 ± 12,61) que os CT (2,0 ± 1,09; U = 4,5; p = 0,007) e os OC (1,71 ± 0,89; U = 3; p = 0,004), assim como no PMD (38 ± 11,78) em relação aos CT (3,14 ± 1,9; U = 4,5; p = 0,01). A quantidade de células imunorreativas a Fos em animais expostos ao odor de gato foi bem mais acentuada. Os grupos controle e odor de cobra tiveram uma expressão geral menor, não havendo diferença significativa entre eles. Fotomicrografias de cortes coronais dos núcleos analisados são mostradas na Figura 4. Os dados estão representados em forma de gráficos na Figura 5 e descritos na Tabela 1. 32 Figura 4 – Expressão de Fos nos núcleos hipotalâmicos. Fotomicrografias de campo claro de cortes frontais dos núcleos analisados, mostrando a citoarquitetura através da técnica de Coloração de Nissl (A, B e C) e neurônios imunorreativos a Fos (D - M) realizadas no Grupo controle (D, E e F), no Grupo Odor de cobra (G, H e I) e no Grupo Odor de gato (J, L e M). Barra de escala: 100 µm. 33 Figura 5 – Gráficos de comparações entre os grupos experimentais da expressão de Fos nos núcleos hipotalâmicos analisados. Valores expressos com média ± S.E.M. (* p≤0,05; ** p≤0,01; *** p≤0,001 em relação ao grupo controle. # p≤0,05; ## p≤0,01; ### p≤0,001 em relação ao grupo odor de gato). Abreviações: AHN, núcleo hipotalâmico anterior; LHAsf, região subfornical da área hipotalâmica lateral; PMd, núcleo pré-mamilar dorsal; VMHdm, porção dorsomedial do núcleo ventromedial. 34 Tabela 1 – Comparação da expressão de Fos nos núcleos hipotalâmicos analisados entre os grupos experimentais. Valores expressos com média ± S.E.M. (*p≤0,05; **p≤0,01; ***p≤0,001 em relação ao grupo controle. # p≤0,05; ## p≤0,01; ### p≤0,001 em relação ao grupo odor de gato). 4.2 EXPERIMENTO 2 Com relação aos parâmetros espaço-temporal, observamos diferenças significativas comparando entre os grupos as médias do tempo de permanência na Zona 1 (H(2) = 16,52; p < 0,0001), latência de saída da Zona 1 (H(2) = 8,11; p = 0,017), tempo de permanência na Zona Neutra (H(2) = 16,80; p < 0,0001), tempo de permanência na Zona Aversiva (H(2) = 16,10; p < 0,0001) e da quantidade de entradas na Zona Aversiva (H(2) = 15,27; p < 0,0001). Os animais OG permaneceram significativamente mais tempo na Zona 1 (534,50 ± 19,86) que os CT (214,05 ± 45,03; U = 9; p < 0,0001) e que os OC (77,97 ± 11,90; U = 0; p < 0,0001), e consequentemente menos tempo na Zona Neutra (34,80 ± 7,93) quando comparado tanto aos CT (139,18 ± 18,07; U = 9; p < 0,0001) e aos OC (199,93 ± 20,49; U = 0; p < 0,0001) e na Zona Aversiva (30,71 ± 13,55), também tanto em relação aos CT (246,75 ± 30,70; U = 10; p < 0,0001) e aos OC (322,07 ± 15,77; U = 0; p < 0,0001). 35 Com relação aos parâmetros comportamentais, observamos diferenças significativas comparando entre os grupos as médias da distância total percorrida (F(2, 29) = 12,93; p < 0,0001), da frequência de avaliação de risco (H(2) = 8,88; p = 0,012), do tempo de grooming (H(2) = 11,71; p = 0,003) e da frequência de grooming (H(2) = 8,11; p = 0,017). Os animais OG apresentaram significativamente maior duração de grooming (147,65 ± 39,35) que os animais OC (7,78 ± 5,37; U = 6,5; p = 0,005). O OC apresentou maior comportamento exploratório (24,01 ± 1,29) que o OG (6,53 ± 1,47; F(14) = 0,008; p < 0,0001), e uma menor frequência de avaliação de risco (5,63 ± 0,82) que o OG (12,63 ± 2,15; U = 5,5; p = 0,003) e o CT (10,44 ± 1,19; U = 25,5; p = 0,016). Os resultados estão representados nas Figuras 6 e 7, e descritos na Tabela 2. 36 Figura 6 – Gráficos de comparações entre os grupos experimentais com relação aos parâmetros espaço-temporal. Valores expressos com média ± S.E.M. (* p≤0,05; ** p≤0,01; *** p≤0,001 em relação ao grupo controle. # p≤0,05; ## p≤0,01; ### p≤0,001 em relação ao grupo odor de gato). 37 Figura 7 – Gráficos de comparações entre os grupos experimentais com relação aos comportamentos defensivos apresentados. Valores expressos com média ± S.E.M. (* p≤0,05; ** p≤0,01; *** p≤0,001 em relação ao grupo controle. # p≤0,05; ## p≤0,01; ### p≤0,001 em relação ao grupo odor de gato). 38 Tabela 2 – Comparação de respostas defensivas entre os grupos experimentais Valores expressos com média ± S.E.M. (* p≤0,05; ** p≤0,01; *** p≤0,001 em relação ao grupo controle. # p≤0,05; ## p≤0,01; ### p≤0,001 em relação ao grupo odor de gato). 39 5. DISCUSSÃO 5.1 PROTEÍNA FOS COMO MARCADOR DE ATIVIDADE NEURONAL A utilização da proteína Fos como marcador de atividade neuronal ajudou a mapear um grupo de núcleos que se tornava ativado em resposta a presença do predador ou de pistas predatórias. Em meados da década de 80, a descoberta de neurônios que expressam transitoriamente um gene de ativação imediata c-fos quando estimulados adicionou uma nova dimensão ao conceito de neuroanatomia funcional (Hoffman & Lyo, 2002). Desde as primeiras aplicações neurobiológicas, a proteína Fos (produto do gene c-fos) tornou-se o marcador de ativação neuronal mais utilizado em estudos funcionais do sistema nervoso central por várias razões: (i) apresenta níveis basais muito baixos no sistema nervoso; (ii) é induzido em resposta a diversos sinais extracelulares, incluindo íons, neurotransmissores, fatores de crescimento; (iii) a resposta é relativamente rápida e transitória; (iv) a expressão de Fos é facilmente detectável; e (v) pode ser facilmente combinado com outros marcadores, incluindo neuropeptídeos, mRNAs, proteínas, traçadores retrógrados e outros marcadores de atividade (Kovács, 2008). A ativação dessa proteína se dá pelos mais diversos estímulos, como, por exemplo, estresse, epilepsia e estímulo nociceptivo, podendo estar envolvida em vários processos fisiológicos (Prado & Del Bel, 1998). A sensação de medo é um fator causador de estresse psicológico e, como será discutido mais adiante, Fos tem sido muito utilizado como marcador de atividade neuronal em resposta ao medo inato. 5.2 O SISTEMA HIPOTALÂMICO DE DEFESA NA INTERAÇÃO PRESA vs. PREDADOR. Os nossos estudos mostram que o camundongo responde ao estímulo de odor de gato como uma ameaça, exibindo assim respostas de medo inato, tendo em vista que são animais de laboratório e, até o experimento, nunca haviam tido contato com pistas relacionadas a esse 40 animal. Não há documentado resultados de camundongo exposto a gato ou ao seu odor na investigação do Sistema Hipotalâmico de Defesa, sendo assim, tomamos como base alguns resultados obtidos em ratos como presa. Semelhantes ao presente trabalho, Canteras e colaboradores (1997) expuseram ratos Wistar à presença de gato e como resultados obtiveram que esses animais demonstraram tanto o repertório comportamental defensivo quanto um claro aumento na expressão de Fos em sítios hipotalâmicos: o AHN, o VMHdm e, especialmente, o PMd. Seguindo esta linha, Dielenberg e colaboradores (2001) examinaram a quantidade de células imunorreativas a Fos após exposição de ratos Wistar ao odor de gato. Como resultados, obtiveram forte expressão de Fos nos três núcleos do Sistema Hipotalâmico de Defesa. Resultado também semelhante ocorreu no trabalho de Cezario e colaboradores (2008), em que realizaram um estudo demonstrando o padrão de ativação hipotalâmico, realizando contagem de células, após exposição de ratos ao predador (gato) e a um aparato associado à presença deste predador. Novamente, os núcleos do Sistema Hipotalâmico de Defesa se destacaram dos demais na expressão de Fos. Todos esses dados se assemelham ao encontrado no presente trabalho, mostrando o importante papel dos núcleos que compõem a circuitaria de defesa. O trabalho de Martinez e colaboradores (2008) feito em camundongos mostrou que, quando na presença de ratos, esses apresentam uma grande ativação no AHN, VMHdm e PMd. O número de células imunorreativas a Fos no trabalho supracitado destoa bastante da quantidade encontrada no presente trabalho, porém temos que levar em consideração que (1) a contagem realizada por Martinez e colaboradores (2008) foi bilateral, (2) os camundongos foram expostos à presença do predador, aumentando assim os estímulos percebidos por eles, e (3) os autores apresentaram a contagem de células Fos por área, o que pode ter causado um extrapolamento do número real de células imunorreativas. 41 Funcionalmente, o AHN está relacionado com comportamento agonístico. Estimulação elétrica ou química neste núcleo, em ratos, provoca ataque a coespecífico; e a lesão, por sua vez, elimina esse comportamento (Fuchs et al., 1985; Adams et al., 1993; Adams, 2006). Injeção de muscimol no AHN provoca redução do comportamento de burying (comportamento caracterizado por enterrar objetos), que denota ansiedade no animal (Schwerdtfeger & Menard, 2008). O VMH, apesar de estar relacionado com comportamento sexual na fêmea, comportamento alimentar, função cardiovascular e sensibilidade a dor (McClellan et al., 2006), está também envolvido com o medo condicionado, suprimindo comportamentos de defesa se lesionado (Colpaert & Wiepkema, 1974), e tem sua porção dorsomedial relacionada com a organização do comportamento defensivo inato (Canteras et al., 1994; Canteras, 2002; Blanchard et al., 2005; Gross & Canteras, 2012). O PMd tem sido envolvido principalmente com o comportamento defensivo. Canteras e colaboradores (1997) lesionaram quimicamente o PMd de um grupo de ratos Wistar e expuseram estes animais a presença de gato. Como resultado, os ratos apresentaram uma drástica redução nos comportamentos de freezing e/ou fuga. Em 2003, Blanchard e colaboradores realizaram um trabalho semelhante, porém com lesão eletrolítica no PMd de ratos Long-Evans, expondo-os a odor e a presença do gato. Como resultado, foi visto que os ratos expostos ao odor de gato demonstraram significativa redução nos comportamentos de freezing, evitação e avaliação de risco, enquanto os expostos ao gato apresentavam diminuição no freezing, com grande atividade e evidente avaliação de risco. Nesta mesma linha, em 2004, Markham e colaboradores também através de lesão eletrolítica no PMd de ratos Long-Evans, expuseram estes animais a presença de gato ou apenas ao odor de gato, e confirmaram que o PMd tem um papel muito importante no comportamento de defesa contra predadores. Já em 2008, Cezario e colaboradores relataram que lesão com citotoxina no PMd de ratos Wistar influenciava nos padrões de respostas comportamentais após exposição destes animais a gato. 42 Assim, vê-se que já é bem documentado que o AHN, o VMHdm e o PMd estão relacionados com comportamentos de ansiedade e defensivos em roedores. Analisando os dados obtidos no presente trabalho, temos que os animais exibiram um significativo aumento na expressão de Fos nos núcleos estudados quando expostos ao odor de gato, sendo relativamente maior no PMd, pois o mesmo foi contado em apenas um nível. O gato é um animal já bastante utilizado em experimentos para estudo do medo em ratos e comprovado seu papel como predador a partir do comportamento de defesa expressado. Apesar disso, o presente trabalho é o primeiro a utilizar este estímulo neste paradigma utilizando camundongo como presa. O aparato por nós utilizado foi aplicado na exposição do camundongo à presença do rato, porém vimos que o mesmo é eficiente quando o estímulo aplicado é o odor do predador. Acreditamos que o camundongo também considera o gato como um predador, como é de senso comum, e a expressão de Fos nos núcleos de interesse em resposta ao odor de gato nos fornece um forte indício disto, e os dados comportamentais corroboram com esse resultado. Acreditamos que no camundongo, assim como no rato, o PMd age como um modulador, recebendo informações das pistas olfativas através do VMHdm, amplificando-a, e enviando para a PAGdl, que, dependendo do grau de ativação, comanda o tipo de comportamento apresentado. Se a PAGdl está muito ativada, gera comportamentos como freezing ou fuga, se menos ativada, gera comportamentos como avaliação de risco. Estes graus de ativação dependem do PMd (Canteras et al., 2012). Como não foi apresentado freezing, supomos que a ativação não foi suficiente, ou necessitaria de um estímulo mais incisivo, como a presença do predador. No entanto, não analisamos a expressão de Fos na PAGdl. Realizamos também a contagem de células imunorreativas a Fos na região subfornical da área hipotalâmica lateral (LHAsf), pois é um núcleo que vem sendo incluído no Sistema de Defesa Hipotalâmico como fonte de projeções visuais, por receber uma quantidade 43 substancial de terminais do trato retinohipotalâmico lateral e projeta para os núcleos do Sistema de Defesa Hipotalâmico na zona medial (Canteras et al., 2011). Nossos resultados apresentam uma baixa expressão de Fos no LHAsf e nenhuma diferença entre os grupos, o que era esperado pois o estímulo predatório não foi visual. 5.3 ODOR DE COBRA COMO ESTÍMULO PREDATÓRIO O presente trabalho apresenta uma abordagem diferenciada dos estudos publicados até o momento, que é a investigação da resposta da presa ao odor de diferentes possíveis predadores. Para isto lançamos mão do odor de jiboia (Boa constrictor). É senso comum que cobras são predadores de camundongos, no entanto trabalhos experimentais nem sempre apresentam dados conclusivos sobre a reação de camundongo frente à cobra. Weldon e colaboradores (1987) analisaram a reação de camundongos frente a odor de cobra (Elaphe spp.) e viram que as fêmeas excretaram significativamente mais bolo fecal (sinal de ansiedade) que os machos em um dos testes realizados, em que os animais tinham contato com papéis utilizados como assoalho de um tanque com cobras. Não houve nenhuma diferença significativa entre outros comportamentos, como o tempo que o camundongo passava em cada lado do aparato (distância do estímulo) e a locomoção pelo aparato. Em outro teste realizado em que um grupo tinha ração com extrato de pele de cobras e outro com ração somente com solvente, foi visto que as fêmeas se alimentaram bem menos da ração com extrato de pele de cobra. Assim, de acordo com os parâmetros analisados por esses pesquisadores, concluiu-se que somente as fêmeas de camundongos reagem ao odor de cobras. É conhecido que pistas de predador provoca marcada analgesia em roedores (Grau et al., 1981). Se utilizando disto, Dell’Omo & Alleva (1992) avaliaram a analgesia de camundongos após a exposição ao odor de cobra em diferentes tempos. Como resultados, 44 obtiveram que não houve analgesia, porém houve a expressão de comportamentos associados a respostas de medo, como cheirar, grooming e escavação. Já em 1999, Carere e colaboradores realizaram experimentos com rato espinhoso, uma espécie de roedor de regiões semiáridas e rochosas, conhecidos por reagir a estímulos vindos de predadores reptilianos. Neste, eles expuseram os ratos a odor de cobra, analisando posteriormente os comportamentos expostos e a analgesia. Novamente, foi visto que o odor de cobra não reflete alteração na analgesia do roedor, porém também demonstraram respostas relacionadas ao comportamento de medo, como grooming, cheirar o objeto de estímulo e frequência de saltos. Os nossos resultados corroboram com alguns desses dados. Apesar da diferença em alguns objetivos, metodologia e aparato experimental, a locomoção (distância percorrida) e o tempo em cada zona foram medidos, não sendo constatada diferença significativa entre o grupo odor de cobra e o grupo controle assim como na expressão de Fos nos núcleos de interesse. Já nos parâmetros comportamentais, foram constatados baixo grooming e avaliação de risco em relação ao controle. Unindo os dados comportamentais aos morfológicos, podemos especular que, possivelmente, o camundongo Swiss não identifique a cobra como uma ameaça predatória. Outra hipótese seria que o estímulo odorante de cobra não é suficiente para a percepção do risco, e consequente ativação das áreas envolvidas no medo. Esta última suposição provavelmente não é verdadeira, tendo em vista que a maravalha a que os animais foram expostos continha pedaços de pele e bolos fecais da cobra. Assim, podemos pensar que a cobra é considerada um estímulo novo, que estimula o camundongo a explorar o ambiente, porém não ameaçador. 5.4 CAMUNDONGO E COMPORTAMENTO DEFENSIVO O grupo odor de gato permaneceu a maior parte do tempo na Zona 1, tendo consequentemente um menor número de entradas na Zona Aversiva, e também demonstrou 45 uma considerável duração de avaliação de risco. Isso demonstra a percepção pelo camundongo do risco promovido pelo odor do gato. A Zona 1 é a área de maior segurança para o animal, por ser a mais distante da fonte do estímulo odorífero, e a sensação de medo faz com que o animal busque o ambiente mais protegido possível, evitando assim a zona de risco. Para essa detecção, o animal realiza a avaliação de risco, comportamento em que ele se aproxima gradativa e comedidamente da fonte da ameaça, permitindo a identificação e consequente evitação daquela área. Os animais expostos a gato apresentaram alta frequência e duração de grooming. O grooming não é um comportamento prioritário. Ele é apresentado geralmente no intervalo entre outros comportamentos mais frequentes e primários (Spruijt et al., 1992). Pode ser um estado de excitação após o contato com um estressor, ocorrendo como uma recuperação, ou uma entrada gradual em um estado de quietude (van Erp et al., 1994). O grupo odor de cobra apresentou, tanto em frequência quanto em duração, uma menor média de grooming e de avaliação de risco. Em contrapartida, exibiu consideravelmente maior comportamento exploratório (distância total percorrida), principalmente comparado ao grupo odor de gato. Pode-se ver a representação desse comportamento na Figura 8, que representa o aparato ao qual os camundongos foram submetidos, mostrando um compilado do caminho percorrido por todos os animais do grupo. Supõe-se que o odor de cobra seja considerado pelo camundongo como um estímulo novo, estimulando o animal a buscá-lo e identificá-lo. 46 Figura 8 - Gráficos de ocupância representando um compilado dos percursos feitos por todos os animais de cada grupo no aparato comportamental. O tempo de permanência é demonstrado de acordo com as cores, quanto mais intensa a cor, maior o tempo de permanência no local. A, Grupo controle; B, Grupo odor de gato; C, Grupo odor de cobra. Na Figura 8 podemos também visualizar, de uma forma geral, o tempo de permanência em cada Zona. Vemos que os animais do grupo odor de cobra permanecem um considerável tempo na Zona Aversiva, ou seja, possivelmente não identificaram o estímulo como ameaça predatória. O grupo controle exibiu o comportamento normal de exploração. 47 6. CONCLUSÃO O camundongo Swiss se mostrou um bom modelo no estudo do medo, tanto na questão neuromorfológica quanto comportamental, com exibição clara de comportamentos. O aparato, utilizado nesse paradigma, também se mostrou eficiente em esclarecer os objetivos comportamentais do trabalho. Os dados do presente trabalho juntamente com dados da literatura nos leva a concluir que o Sistema Hipotalâmico de Defesa de camundongo deve ter um papel semelhante ao já bem estudado sistema em rato, ou seja, sendo responsável por receber impulsos sensoriais (visuais, olfativos e contextuais), modulá-los e re-transmiti-los para áreas responsáveis pelo comportamento defensivo e contextualização (memória). No entanto, este sistema responde diferencialmente mediante pistas olfativas de diferentes predadores, sendo o odor de gato indicador de uma ameaça, mas não o de cobra. 48 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Adams, D.B. 2006. Brain mechanisms of aggressive behavior: an updated review. Neuroscience and Biobehavioral Reviews, 30, 304-18. Adams, D.B., Boudreau, W., Cowan, C.W., Kokonowski, C., Oberteuffer, K. & Yohay, K. 1993. Offense produced by chemical stimulation of the anterior hypothalamus of the rat. Physiology & Behavior, 53, 1127-32. Alcock, J. 2011. 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