formação de uma bacterioteca de linhagens de

FORMAÇÃO DE UMA BACTERIOTECA DE LINHAGENS DE BACTÉRIAS
LÁTICAS ISOLADAS DE AMOSTRAS DE LEITE ORDENHADO DE VACAS E
CABRAS CRIADAS NA REGIÃO DO SEMI-ÁRIDO BAIANO.
Formation of a bacterioteca strains of lactic acid bacteria isolated from milk samples
milked cows and goats raised in the semi-arid region.
Danielza Souza da Silva de JESUS1; Elinalva Maciel PAULO2.
1
Graduanda do curso de Engenharia de Alimentos – UEFS, *.
Docente do Departamento de Ciências Biológicas - Universidade Estadual de Feira de Santana - UEFS.
2
PALAVRAS-CHAVES: Bactérias láticas, isolamento bacteriano, semi-árido.
INTRODUÇÃO
O semi-árido baiano é considerado um ambiente extremófilo, contendo uma vasta
biodiversidade de micro-organismos pertencentes ao grupo de bactérias láticas, porém ainda
não explorados. As bactérias láticas (BAL) segundo o Manual Bergey's que trata da
sistemática bacteriana (Holtet al., 1989), define-se como sendo bactérias Gram-positivas, não
esporuladas, catalase negativa, desprovidas de citocromos, crescimento em condições de
aerobiose, microaerofilia ou anaerobiose facultativa, com temperatura variando entre 35°C a
40°C.
A microbiota predominante no leite cru geralmente inclui espécies de bactérias do
ácido lático e leveduras (LAFARGE et al, 2004). Atualmente, tem surgido uma tendência
para selecionar linhagens selvagens de produtos tradicionais, a fim de que elas sejam usadas
como culturas "starters" em processos de fermentação. As cepas isoladas a partir da
fermentação tradicional e de ambientes considerados extremófilos são bem adaptadas para o
crescimento no substrato de forma rápida e eficiente, garantindo assim, uma cultura "starter"
bem selecionada.
O objetivo do presente trabalho foi isolar bactérias láticas do leite de cabra e de vaca
proveniente da região do semi-árido baiano para formação de uma bacterioteca.
MATERIAL E MÉTODO
Amostras
As amostras de leite de cabra e de leite de vaca foram coletadas assepticamente
durante a ordenha de animais criados em uma propriedade situada em Feira de Santana, BA e
imediatamente conduzida ao laboratório de Microbiologia Aplicado a Saúde Pública –
LAMASP, para o processamento imediato das amostras.
Isolamento (PAULO, 2012)
Foram preparadas diluições seriadas de 10-1até 10-7 em solução tampão fosfato, pH
7,2. Todas as amostras diluídas foram semeadas em triplicatas pelo método de esgotamento
de inoculo no meio All Purpose Tween 80 Media (APT, 2011) e no meio desenvolvido por
Rogosa (DE MAN, ROGOS and SHARPE, 1960). Cada placa proveniente da triplicata foi
incubada em diferentes temperaturas/tempos (15º C/15 dias, 35º C/48h e 45o C/24h). A
incubação foi realizada em condições de microaerofilia em uma jarra de anaerobiose. Após o
tempo de incubação, 5 colônias bem isoladas crescida em cada placa foram semeadas em 2
mL do caldo DE MAN, ROGOSA e SHARPE - MRS (1960), incubadas nas respectivas
temperaturas de origem do isolamento e purificadas no meio MRS pelo método de semeadura
em estria composta com esgotamento de inoculo.
Testes preliminares para bactérias láticas (AXELSSON, 1993)
Foram realizados o teste de catalase (mistura da colônia em uma gota de peróxido de
oxigênio 3%) e coloração de Gram. Isolados que apresentarem catalase negativa e na
coloração de Gram morfologia de cocos, bacilos ou cocobacilos de coloração roxa (positiva)
foram preservados em Leite desnatado reconstituído 20% (LDR) e acondicionados
imediatamente na ultra freezer (-80º C) para análises posteriores.
Identificação fenotípica (CHAVES, 1990)
Foram realizados testes de identificação dos gêneros das linhagens de bactérias láticas
isoladas realizando os seguintes testes: produção de gás a partir da glicose, capacidade em
coagular o leite a 15 e 45oC, redução do Litmus milk, crescimento em 4 e 8% de cloreto de
sódio, hidrólise da arginina, redução do nitrato e fermentação de diferentes carboidratos.
Caracterização (PAULO, 2012)
Foram realizados os teste da lactofermentação, produção de ácido lático, condições
ótimas de crescimento, tolerância a acidez.
Preservação das linhagens
As linhagens de bactérias láticas foram conservadas pelo método do congelamento
(ultra-freezer - 80º C).
RESULTADO
Foram isoladas 4 colônias do leite de cabra (LC6, LC7, LC8 e LC12) e 10 colônias do
leite de vaca (LV1, LV2, LV3, LV4, LV5, LV6, LV7, LV8, LV10 e LV11). No teste de
produção de gás, 100% destes isolados não produziram gás, sendo denominados como
homolático ou homofermentativos.
Tabela 1. Morfologia e teste de lactofermentação em diferentes temperaturas.
ISOLADOS
LC6
LC7
LC8
LC12
LV1
LV2
LV3
LV4
LV5
MORFOLOGIA
Cocos
Cocos
Cocos
Cocos
Cocos
Cocos
Cocos
Cocos
Cocos
15 °C
+
+
+
+
+
+
-
LACTOFERMENTAÇÃO
35°C
+
+
+
+
+
+
+
+
+
45°C
+
-
LV6
LV7
LV8
LV10
LV11
Cocos
Bacilos
Bacilos
Cocos
Cocos
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
Para estas bactérias isoladas também foi avaliado seu crescimento em NaCl:
Tabela 2. Características fisiológicas dos isolados de BAL isoladas do leite de cabra.
HALOTOLERÂNCIA
PRODUÇÃO
DE GÁS
4%
6%
8%
LC6
++
++
+
LC7
++
++
+
LC8
++
++
+
LC12
++
++
+
LV1
++
++
+
LV2
++
++
LV3
++
++
LV4
++
+
LV5
++
+
+
LV6
++
+
+
LV7
+++
+++
++
LV8
+++
+++
++
LV10
++
++
LV11
++
++
+
+ Pouco crescimento, ++ Médio crescimento, +++ Grande crescimento, -Resultados negativos
ISOLADOS
Foi realizado em cada isolado o teste redução do nitrato a nitrito. As culturas ativas
destes isolados foram inoculados no meio Nitrato acrescido de meio MRS e incubados a 35º
C/24h. Sendo depois adicionados os reagentes alfa-naftol e ácido sufanílico para visualizar a
reação. Observou-se resultado negativo para todos, visto que não houve alteração na cor do
meio.
A produção da amônia, a partir da arginina, foi observada, inoculando culturas ativas
no caldo descarboxilado FALKOW. Incubando por 48 horas a 37°C, obtendo resultado
positivo para as amostras LC6, LC7, LC12, LV1, LV2, LV4, LV5, LV6, observado pela
permanecia da cor violeta e negativa para as amostras LC8, LV3, LV7, LV8, LV10, LV11,
observada pela coloração amarela.
Para o teste da fermentação de carboidratos preparou-se uma suspensão dos isolados,
inoculando 5 µL em uma placa de microdiluição, adicionada de 100 µL de caldo MRS
modificado e 10 µL do açúcar teste. Incubados a 35°C durante 48h.
Tabela 3. Teste de fermentação de açúcares.
Açúcar C6 C7 C8 C12 V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 V10 V11
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
A
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
B
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
C
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
D
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
E
+
+
+
+
+
+
+
F
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
G
+
+
H
LEGENDA: A=MANITOL, B = ARGININA, C = TREALOSE, D = ARABINOSE,
E = LACTOSE, F = SORBITOL, G = ESCULINA, H = AMIDO
+
+
+
-
As 15 cepas isoladas de bactérias láticas do leite de cabra foram classificadas como
sendo do gênero em Streptococcus e Lactobacillus. Estas cepas possuem características
favoráveis ao seu uso como Culturas “starter”. A elevada resistência a diferentes
concentrações de NaCl, e o crescimento a diferentes temperaturas (15ºC, 35ºC, 45ºC) é
indicativo de capacidade de sobrevivência a estas condições e da sua facilidade de adaptação
ao meio e possibilidade de serem usadas em processos fermentativos de alimentos que
impliquem variações térmicas.
REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
AXELSSON, L. Lactic acid bacteria: classification and physiology. In: SALMINEN, S.;
VONWRIGHT, A. Lactic acid bacteria . New York: Marcel Dekker, p.1 -63, 1993..
CHAVES, A. H. et al. Isolamento de Lactobacillusacidophilus a Partir de Fezes de Bezerros.
Rev. bras. zootec., v.28,n.5, p.1086-1092, 1999.
LAFARGE, V. et al. Raw Cow Milk Bacterial Population Shifts Attributable to
Refrigeration.Applied Environmental. Microbiology, v. 70, n. 9, p. 5644-5650, 2004.
DE MAN, J.C.; ROGOSA, M.; SHARPE, M.E.A medium for cultivation of lactobacilli.J.
Appl. Bacteriol., 23,130-135, 1960.
GONÇALVES, S. L. M. et al. Identificação e caracterização de bactérias do ácido láctico
isoladas de um produto cárneo fermentado tradicional e do ambiente fabril. 2009. Tese de
Mestrado em Segurança Alimentar. Universidade Técnica de Lisboa, 2009.
HOLT, J.Get al. 1989. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Baltimore: Willians and
Wilkins, v. 4, 1989.
PAULO, E.P. Isolamento, caracterização e seleção de lactobacilos acidophilus de fezes de
suíno visando o seu uso como probiótico. 1991. Tese de Mestrado em Microbiologia
Agrícola. Universidade Federal de Viçosa, 1991.
PAULO, E. P. Produção de exopolissacarídeos (EPS) por bactérias láticas visando
microencapsulação de Lactobacillusacidophilus La-5 pelo processo de Spray drying. 2010.
Tese 212f. (Doutorado em Biotecnologia), Departamento de Ciências Biológicas,
Universidade Estadual de Feira de Santana, Feira de Santana, 2010.