Imunologia
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Total de Trabalhos: 00010 VII Reunião Regional da FeSBE – Regional 2012 Resumo: 11.001 ESTUDO COMPARATIVO ENTRE MACHOS E FÊMAS ADULTAS COM RELAÇÃO ATIVIDADE TÓXICA PROVOCADA PELA PEÇONHA DA ARRAIA Potamotrygon cf. henlei. 1 Autores SANTOS, J. M. D. 2, BRUNI, F. M. 1, SEIBERT, C. S. 2, FERREIRA, M. L. 1, MARQUES, E. E. 1 Biologia - UFT, 2 Centro de Toxinologia Aplicada - CAT/CEPID Apoio Financeiro: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico/ CNPq e Secretaria de Ciência e Tecnologia do Tocantins / SECT-TO. Resumo Objetivos As arraias de água doce são animais bentônicos, com comportamento quase sempre passivo, que habitam preferencialmente águas rasas. Na sua cauda há uma estrutura rígida e serrilhada, que é recoberta por um epitélio, onde estão localizadas as glândulas de veneno. Os envenenamentos ocasionados por estes animais decorrem da introdução do ferrão, com inoculação da peçonha no membro afetado, sendo os pés a região mais atingida. Os sintomas locais do envenenamento incluem sangramento, dor intensa e edema. No estado do Tocantins, o gênero mais recorrente é o Potamotrygon, popularmente conhecido como arraia de fogo devido à sua estrutura epitelial. A alta incidência de acidentes com estes animais durante o período de estiagem (junho a setembro), juntamente com os poucos relatos epidemiológicos, dificultam o tratamento dos pacientes envenenados. Por isso, objetivamos avaliar a toxicidade da peçonha de arraias adultas Potamotrygon cf. henlei. com relação ao sexo, para verificar se esta condição pode interferir no grau de envenenamento gerado pelo grupo. Metodos Para este estudo as arraias foram coletadas com rede de arrasto a montante da Hidrelétrica de Lajeado, situada no Estado do Tocantins, Brasil. No campo as coletas foram autorizadas pela licença do IBAMA (019/2008 - NUFAU, processo 02029.00019/2006-98). Os exemplares de ambas as espécies foram em seguida transferidos para o laboratório para obtenção das medidas dos dados biométricos este procedimento foi feito para identificação da estrutura etária dos animais, o sexo foi identificado através de observações externas do aparelho reprodutor de cada animal. Logo após, foi removido à peçonha (Pç) por meio de raspagem do tecido que recobre o ferrão. Foram utilizados para os testes in vivo camundongos Swiss machos (18-22g). Todos os procedimentos envolvendo camundongos foram realizados de acordo com a aprovação do comitê de ética no uso de animais do Instituto Butantan, processo nº 877/11. O estudo da atividade edematogênico foi determinado injetando 30 μL da peçonha na concentração (100 μg de proteína). O resultado foi expresso pelo aumento de espessura entre a pata experimental em relação à pata controle, com o emprego de um paquímetro nos tempos de 0.5, 2, 4 e 24 horas após a injeção. Para avaliação da atividade nociceptiva, foram aplicados 30 μL da peçonha na concentração (100 μg de proteína) na pata posterior direita dos camundongos Swiss. Durante 30 minutos o comportamento dos animais foi avaliado, sendo cronometrado o tempo que cada animal fica lambendo ou mordendo a pata experimental. Foi utilizado o teste de variância (ANOVA), usando o teste de Dunnets para determinar as diferenças entre os grupos. As diferenças foram consideradas significativas para p < 0,05. O pacote estatístico empregado foi SPSS (Release 8.0, Standard Version, 1997). Resultados Os resultados demonstraram que na atividade edematogênica todos os grupos divergiram significativamente do grupo controle não ocorrendo diferença entre macho e fêmea. Houve uma atividade nociceptiva significativa com relação ao Pool para machos e fêmeas. Entre os grupos não ocorreu diferença significativa. Conclusão Dessa forma pode-se concluir que não houve variação no grau de toxicidade da peçonha da arraia Potamotrygon cf. henlei entre machos e fêmeas adultas. Evidenciando que o sexo de indivíduos adultos não é um fator que influencia na potencia da peçonha. Palavras-chaves: Arraia, Potamotrygon, Peçonha, Toxicidade QuebraPagina Resumo: 11.002 INFLUÊNCIA DAS CÉLULAS T DE MEMÓRIA NA DIFERENCIAÇÃO DE CÉLULAS B DE MEMÓRIA GERADAS NA RESPOSTA CRÔNICA AO VENENO DE Thalassophryne nattereri 1 Autores GRUND, L. Z. 1, LOPES-FERREIRA, M. 1,2, LIMA, C. 1, LIMA, C. 1 Unidade de Imunoregulação do Laboratório Especial de Toxinologia Aplicada, LETA - IBU Apoio Financeiro: FAPESP e CNPQ Resumo Objetivos Células B de memória produtoras de anticorpos de longa vida (antibody-secreting cells – ASC) representam um componente central de proteção imunológica e desenvolvimento de novas estratégias vacinais. Há indícios de que na ausência de células T CD4 de memória, a geração destas células seja prejudicada, porém os mecanismos de diferenciação e longevidade ainda não estão totalmente esclarecidos. Recentemente, verificamos que o veneno do peixe T. nattereri promove a diferenciação de ASC e tal efeito é dependente das citocinas IL-5 e IL-17A produzidas por células T. Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi analisar se a resposta humoral de memória induzida pelo veneno de T. nattereri é mediada por linfócitos T de memória. Metodos Camundongos BALB/c (machos, 18-22 g, 7-8 semanas) foram imunizados pela via intraperitoneal com veneno (10 &mug) adsorvido em hidróxido de alumínio e receberam duas doses de reforço. Os animais foram mortos 15, 49 ou 121 dias da primeira imunização para obtenção das suspensões celulares do peritônio, do baço e da medula óssea femoral e fenotipagem de células por citometria de fluxo. As diferenças estatísticas foram feitas por análise de variância (One-Way ANOVA), seguido do teste paramétrico Bonferroni.Os métodos foram aprovados pelas comissões de Ética do Instituto Butantan/666-09 e do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo/025. Resultados Observamos que o veneno induziu a expansão de células T CD4 de memória (CD4+CD44high) na cavidade peritoneal (1.36% vs 2.4%) e no baço (15% vs 26.0%), permanecendo neste último compartimento por até 49 dias da imunização. Ao contrário, na medula óssea a geração de células de memória teve um inicio tardio (49d – 5.7% vs 16.8%) e permaneceu até o período crônico da resposta (121d- 6.2 vs 33,4%). Os altos níveis de expressão de CD40L e Ly6C sugerem a presença de células de memória do subtipo efetor (TeM) e central (TcM) na cavidade peritoneal dos animais imunizados durante todo o período da resposta. No baço, os linfócitos T de memória expressaram CD40L apenas no inicio da resposta e Ly6C por até 49 dias. Já os linfócitos T de memória do compartimento medular expressam níveis altos da molécula Ly6C a partir de 49 dias que se mantiveram elevados na fase crônica da resposta. Quando analisamos a produção intracelular de citocinas pelos linfócitos T de memória verificamos que os linfócitos T de memória peritoneais produziram 3 vezes mais IL-4, IL-5, IL-17A e IFN-gama que células de animais controle, e ainda, os linfócitos T de memória esplênicos e medulares produziram somente IL-5 (quase 2 vezes) em relação ao grupo-controle. Conclusão Os resultados demonstram a participação de linfócitos T de memória efetores (TeM) CD4+CD44highCD40LposLy6Cpos no peritônio produtores de IL-4, IL-5, IL-17A e IFN-gama e por linfócitos T de memória central (TcM) CD4+CD44high CD40LnegLy6Cpos no baço e na medula óssea produtores de IL-5 na manutenção de ASC induzidas pelo veneno. O entendimento das células e fatores envolvidos na diferenciação e sobrevivência de ASC é determinante para melhorias das estratégias vacinais. Palavras-chaves: Memória Imunológica, Linfócitos T, Linfócitos B, Veneno, Thalassophryne nattereri QuebraPagina Resumo: 11.003 A SUPRESSÃO DA EAE PELO TNP, UM PEPTÍDEO INÉDITO DERIVADO DO VENENO DE Thalassophryne nattereri DEPENDE DA AÇÃO EM CÉLULAS DENDRÍTICAS 1 KOMEGAE, E. N. 2, SILVA, R. N. D. 2, MELO, R. L. D. 1, LOPES-FERREIRA, M. 1, LIMA, C. 1,2, Autores LIMA, C. 1 Unidade de Imunorregulação do Laboratório Especial de Toxinologia Aplicada - IBU, 2 Unidade de Proteômica Funcional do Laboratório Especial de Toxinologia Aplicada - IBU Apoio Financeiro: FAPESP e CNPq Resumo Objetivos A Esclerose Múltipla (EM) é uma doença multifatorial complexa, autoimune, crônica e demielinizante que afeta o sistema nervoso central (SNC) e atinge cerca de um milhão de pessoas no mundo. Esta doença tem sido extensivamente estudada usando modelos murinos de encefalomielite autoimune experimental (EAE) caracterizada pela ativação de células dendríticas (DC) apresentadoras de peptideos gerados da mielina, diferenciação de linfócitos Th1, Th17 e ativação de macrófagos e da microglia. Peptídeos de origem animal têm sido usados como protótipos farmacológicos para o desenvolvimento de novas drogas. Neste trabalho investigamos o efeito do TNp, um peptídeo inédito derivado do veneno do peixe peçonhento Thalassophryne nattereri na EAE. Metodos Utilizamos o modelo de EAE induzida ativamente pela imunização de camundongos C57BL/6 fêmeas (18-22 g, 6 a 10 semanas) com o MOG35-55, um peptídeo imunodominante da mielina. O efeito do peptídeo TNp (0,66 mg/mL) foi avaliado durante o tratamento profilático (0-10 dias) através de análise dos sinais clínicos, histologia, zimografia e citometria de fluxo em diferentes fases da doença, isto é, durante a fase de indução (7 dia) nos órgãos linfóides secundários e durante a fase efetora (17 dia) e crônica (30 dia) no SNC. Os métodos foram aprovados pelas comissões de ética do Instituto Butantan (nº 747/10) e do ICB da USP (nº 74 nas fls. 89 do livro 02) e as diferenças estatísticas foram feitas por análise de variância (One-way ANOVA), seguido do teste paramétrico Bonferroni. Resultados O TNp conseguiu reduzir em 50% os sinais clínicos da doença, minimizando os sinais agudos (do 12º ao 17º dia) e retardando o pico e a sua progressão (do 17º para o 22º dia). O TNp suprimiu a função ativadora de DC, diminuindo a expressão das moléculas MHC de classe II (19%), CD40 (14%) e CD80 (30%) e ao mesmo tempo induziu características supressoras pelo aumento na expressão de CD273 (de 3,4% para 4,14%) e CD274 (de 4,8% para 6,56%). Ainda, o TNp inibiu o infiltrado de linfócitos T efetores Th1 e Th17 produtores de INF-gama e IL-17A e de macrófagos para o SNC; e, ao contrário, induziu o recrutamento de linfócitos T e B reguladores com diminuição da ativação da microglia, resultando assim em uma menor degradação da mielina. Conclusão A diminuição do infiltrado inflamatório no SNC e o controle da demielinização em animais com EAE pelo TNp pode estar relacionada à sua capacidade de alterar o estado funcional das DC e gerar células reguladoras. Palavras-chaves: Células dendríticas, EAE, Peptídeo, Thalassophryne nattereri QuebraPagina Resumo: 11.004 IDENTIFICAÇÃO DE CÉLULAS B REGULADORAS PRODUTORAS DE IL-10 GERADAS NA RESPOSTA DE MEMÓRIA AO VENENO DE Thalassophryne nattereri. 1 COUTINHO, E. M. M. 1, GRUND, L. Z. 1, Lopes-Ferreira, M. 1, LIMA, C. 1, LIMA, C. 1 Unidade de Autores Imunorregulação do Laboratório de Toxinologia Aplicada- LETA - IBU Apoio Financeiro: FAPESP e CNPq Resumo Objetivos Células B reguladoras estão envolvidas na regulação de respostas inflamatórias devido à produção de IL-10. Elas são classificadas em B1 (B1a e B1b) e B2. Estudos realizados em modelos murinos, mostram que o veneno de Thalassophryne nattereri é capaz de promover uma resposta imune de memória dependente das citocinas IL-17A e IL-5 e induzir a produção de altos níveis de anticorpos específicos IgG1 e IgG2a e níveis persistentes de IL-10 no compartimento esplênico e na medula óssea. Podemos assim inferir que a produção de IL-10 induzida pelo veneno pode ser decorrente de células B reguladoras. O objetivo deste trabalho é a identificação de células B reguladoras produtoras de IL-10 geradas na resposta de memória ao veneno de T. nattereri. Metodos Animais machos C57BL/6 wild-type, pesando entre 18 e 22 g com idade de 7-8 semanas (Comitê de ética:N°787/11) foram imunizados no dia 0 pela via intraperitoneal com o veneno (10 μg) (IBAMA, Licença Permanente para Coleta de Material Zoológico N°14693-1) adsorvido em hidróxido de alumínio (1,6 mg) em um volume final de 500 μL de salina estéril por animal. No 14º dia, os animais receberam novamente a mesma quantidade de veneno sem adjuvante. Animais controle receberam apenas o adjuvante. Ambos os grupos foram mortos no 21º dia para obtenção das suspensões celulares do peritônio, do baço e da medula-óssea femoral para identificação de linfócitos B produtores de IL-10 por citometria de fluxo usando os seguintes anticorpos com os fluorocromos (PE, FITC, PerCP-CY5.5, APC, PE-Cy5): anti-mouse CD45R/B220, anti-mouse CD23, anti-mouse CD5, anti-mouse CD19, anti-mouse CD4 e APC anti-mouse IL-10, PerCP-CY5.5 Rat IgG2ak anti-mouse FOXP3 e CD1d anti-mouse IgG. As diferenças estatísticas entre os grupos experimentais foram detectadas após análise de variância (One-Way ANOVA), seguido do teste paramétrico Bonferroni. Todas as análises estatísticas foram realizadas no programa Prisma (Graph Pad Software) e as diferenças entre os grupos foram consideradas significativas para valores de p < 0,05. Resultados Inicialmente verificamos a presença de células B produtoras de IL-10 (B10) como as B1a (B220lowCD5pos) e B2 (B220highCD23pos) em todos os compartimentos e B1b (B220lowCD5neg) no peritônio e na medula, sendo o peritonio o local de maior número destas células. Quando verificamos se as células B produtoras de IL-10 são Breg (CD1dpos) observamos B1a e B2 nos 3 compartimento e B1b somente no peritônio e no baço, e ao contrário o baço é o maior reservatório destas células. Ainda observamos que as células Breg representam um pequeno pool das células B10, principalmente no peritônio (0,06%). Conclusão A resposta humoral crônica induzida pelo veneno de T. nattereri é mantida ou controlada negativamente por um mecanismo dependente de células B10 (B2>B1a>>B1b), dentre as quais somente um pequeno pool é formado por células B reguladoras (Breg), positivas para a molécula CD1d, sendo B2>B1b>>B1a. As células Breg representam 0,06% das células B10 no peritônio, 44% das células B10 no baço e 2,5% das células B10 na medula. Ainda, o compartimento peritoneal é o maior reservatório de células B10 e o compartimento esplênico é o maior reservatório de células Breg. Palavras-chaves: Células B reguladoras, Veneno, Interleucina IL-10 QuebraPagina Resumo: 11.005 O CONTROLE DA SEPSE EM CAMUNDONGOS PELAS NATTERINAS É DEPENDENTE DA SINALIZAÇÃO TLR/MYD88, PI3K E DE SERINO/TREONINA FOSFATASES 1 Autores FERREIRA, M. J. 1, LIMA, C. 1, LOPES-FERREIRA, M. 1, LOPES-FERREIRA, M. 1 Unidade Imunorregulação do Laboratório Especial de Toxinologia Aplicada - IBU Apoio Financeiro: FAPESP e CNPq Resumo Objetivos As Natterinas (NTR), uma família de proteases presentes no veneno do peixe Thalassophryne nattereri inibem o rolamento de leucócitos induzido pelo LPS nas vênulas pós-capilares de camundongos. Portanto, neste trabalho avaliamos o efeito inibitório das NTR no controle da septicemia induzida pelo LPS e as vias de sinalização utilizadas neste mecanismo. Metodos Para induzir septicemia, camundongos Swiss machos (7-8 semanas e 18-22 g) foram tratados com NTR (0,06 mg/mL, s.b.) por 6 horas, seguida da aplicação de LPS (dose baixa 1,5 mg/Kg ou dose alta 30 mg/Kg - i.p.). Após 4 ou 48 horas, os animais foram mortos e a cavidade peritoneal foi lavada para a coleta da suspensão celular e contagem total e diferencial de células. Nos estudos de microscopia intravital, camundongos Swiss machos foram tratados por 30 minutos com Wortmannin (0,005 uM - inibidor de PI3K) ou IPP-1 (10 uM - inibidor de serina/treonina fosfatase-1). Camundongos C57BL/6 (WT), TLR2 KO, C3H/Hepas (WT), C3H/Hej (mutante de TLR4), MyD88 KO e Swiss tratados com Wortmannin ou IPP-1 foram tratados por via intraescrotal com as NTR (0,02 ug/mL) 6 horas antes e tiveram o músculo cremaster exposto para a indução do rolamento de leucócitos com LPS (E coli 055:B5, 0,02 ug/mL) tendo a observação durado 30 minutos. Os métodos foram aprovados pelas comissões de Ética do Instituto Butantan 723/10 e do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo 72/10 e as diferenças estatísticas foram feitas por análise de variância (One-Way ANOVA), seguido do teste paramétrico Bonferroni. Resultados A indução de sepse em dose baixa não causou a morte dos animais, embora eles tenham apresentado sinais clínicos. O tratamento destes animais com as NTR inibiu o recrutamento peritoneal de leucócitos totais (16.06 ± 1.02, n=3) e de neutrófilos (2.97 ± 1.07, n=3) comparado ao grupo LPS (26.90 ± 6.72, n=4 e 8.51 ± 2.66, n=4). A indução da sepse em dose alta também não causou a morte dos animais, mas induziu sintomas clínicos mais agudos, e nos animais tratados com as NTR a contagem peritoneal de leucócitos totais (21.80 ± 3.30, n=3) e de neutrófilos (6.86 ± 1.38, n=3) também sofreu redução comparada ao grupo LPS (41.80 ± 2.82 e 18.69 ± 1.87, n=3). A análise por microscopia intravital mostrou que nos animais C57BL/6 (WT) tratados com as NTR o rolamento de leucócitos induzido pelo LPS foi reduzido (T10: 42.00 ± 6.16, T20: 30.90 ± 2.42, T30: 25,90 ± 3,90, n=6) comparado ao grupo LPS (T10: 125.00 ± 7.68, T20: 73.90 ± 7.47, T30: 65.10 ± 6.77, n=6) enquanto que nos animais TLR2 KO, mutante de TLR4 e MyD88 KO tratados com as NTR não houve redução do rolamento em relação ao controle, indicando que os sinais mediados por TLR2-TLR4/MyD88 são importantes para a ação inibitória das NTR. O tratamento dos animais com wortmannin (T10: 100.25 ± 4.33, T20: 95.12 ± 11.30, T30: 116.50 ± 15.05, n=6) ou IPP-1 (T10: 82.50 ± 11.47, T20: 74.00 ± 8.94, T30: 61.00 ± 10.02, n=6) reverteu o efeito inibitório das NTR (T10: 19.40 ± 3.91, T20: 19.50 ± 1.29, T30: 15.33 ± 4.04, n=6) sobre o rolamento de leucócitos induzido pelo LPS indicando a participação de PI3K e de fosfatases na inibição pelas NTR. Conclusão As NTR podem controlar a migração de células na sepse induzida por LPS através de um mecanismo dependente da sinalização TLR2-TLR4/MyD88 e dependente de PI3K e proteínas fosfatases. Apoio: FAPESP e CNPq. Palavras-chaves: Fosfatases, LPS, Natterinas, Sepse, TLR QuebraPagina Resumo: 11.006 ANÁLISE DA OCORRÊNCIA DE REATIVIDADE CRUZADA ENTRE ANTICORPOS ANTILEISHMANIA sp. E PROTEÍNA N RECOMBINANTE DO HANTAVÍRUS ARARAQUARA EM TESTE IMUNOENZIMÁTICO. 1 SANTOS, F. M. D. 1, SANTOS JÚNIOR, J. A. 1, BARROS, P. A. 1, FEITOSA, R. C. S. 1, SILVA, J. M. 1, MELO, D. M. 2, LIMA, M. C. 3, PEDROSA, C. M. S. 4, FIGUEIREDO, L. T. M. 1, BORGES, A. Autores A. 1 LAPEVI - UFAL, 2 Virologia - LACEN-AL, 3 Infectologia - HEHA-AL, 4 Laboratório de Imunologia - USP Apoio Financeiro: CNPq, CAPES, FAPEAL Resumo Objetivos A pesquisa de anticorpos contra hantavírus é amplamente utilizada no diagnóstico das infecções humanas por estes agentes. Um componente da estrutura dos hantavírus, a proteína N, é altamente imunogênica e a sua forma recombinante tem sido utilizada na padronização de ensaios imunoenzimáticos (ELISA) para a detecção de anticorpos anti-hantavírus. Todavia, o uso de tais testes em populações provenientes de regiões do Brasil onde predominam endemias como a leishmaniose visceral pode ter limitações, uma vez que tais doenças podem evoluir com ativação policlonal de linfócitos e formação de anticorpos de reatividade cruzada. Por isso, investigou-se a ocorrência de reações cruzadas entre anticorpos presentes no soro de pacientes com leishmaniose visceral no Estado de Alagoas e proteína N recombinante do hantavírus Araraquara (rN ARAV). Metodos A investigação faz parte do projeto de pesquisa aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Universidade Federal de Alagoas, sob o protocolo nº 23065.009350/2010-62. Amostras séricas de 12 pacientes com leishmaniose visceral, encaminhadas pelo LACEN-AL ou coletadas de pacientes internados no HEHA, foram analisadas por ELISA caseiro previamente padronizado, utilizando-se como antígeno a proteína N recombinante do hantavírus Araraquara ( rN ARAV). Resultados Nenhum dos soros analisados apresentou IgG reagente para hantavírus. Não obstante, um (8,33%) soro apresentou reação positiva para IgM frente à rN ARAV, sem tratar-se, contudo, de caso de hantavirose aguda. A reatividade, porém, deteve-se apenas à diluição do soro de 1:100, desaparecendo em maiores diluições da amostra, utilizadas no ensaio quantitativo. Desse modo, descartando-se possíveis resultados falso-positivos. Conclusão Os resultados demonstram que o teste de ELISA utilizando rN ARAV é específico para o diagnóstico da hantavirose, mesmo em pacientes com leishmaniose visceral. Palavras-chaves: Hantavirus, Leishmaniose visceral, Anticorpos, Reação cruzada, ELISA QuebraPagina Resumo: 11.007 EFEITO IN VITRO DO FATOR DE CRESCIMENTO SEMELHANTE À INSULINA (IGF-1) NA INTERAÇÃO CÉLULA ENDOTELIAL VERSUS TIMÓCITOS. 1 Autores LINS, M. P. 1, VIANA, I. M. M. N. 1, SMANIOTTO, S. 1 Laboratório de Biologia Celular - ICBS UFAL Apoio Financeiro: CNPq e FAPEAL Resumo Objetivos Dados da literatura mostram que o hormônio do crescimento (GH) modula uma variedade de funções tímicas, incluindo a migração de timócitos e o exporte de células T maduras para órgãos linfóides periféricos. Muitos dos seus efeitos podem ser mediados pelo fator-1 de crescimento semelhante à insulina (IGF-1). O objetivo deste estudo foi avaliar funcionalmente a capacidade de adesão e migração transendotelial de timócitos, sob a ação do IGF-1. Metodos Os estudos foram realizados com a linhagem de células endoteliais tímicas (tEnd.1) tratadas ou não com IGF-1 na concentração de 100 ng/mL e com timócitos frescos, obtidos de camundongos C57BL/6. Para demonstrar a expressão do receptor para IGF-1, o IGF-1R, na superfície de tEnd.1, foi utilizada a citometria de fluxo. Para análise morfológica, células endoteliais tímicas (tEnd.1) foram plaqueadas sobre lamínulas redondas em placa de 24 poços com meio RPMI completo. Após 16 horas de adesão, as células foram tratadas ou não com IGF-1 por 8 horas. Então, as células foram fixadas, coradas com Giemsa e analisadas por microscopia de luz. Para o ensaio de adesão, 8 x 10 4 tEnd.1 foram plaqueadas em frascos de 25 cm 2 e tratadas ou não com IGF-1 por 8 horas. Em seguida, foi realizada uma co-cultura com timócitos frescos, obtidos de camundongos C57BL/6, na proporção de 50 timócitos por tEnd.1 durante 1 hora. As co-culturas foram fixadas e coradas com Giemsa e, em outros ensaios, os timócitos aderentes foram analisados por citometria de fluxo, quanto ao fenótipo CD4/CD8. Por fim, o ensaio de transmigração foi realizado em câmaras de transwell (membrana com poro de 8,0 &mum) onde foram plaqueadas 2 x 10 5 tEnd.1 por inserto, sendo tratadas ou não com IGF-1. Após 48 horas, foram adicionados na câmara superior 2 x 10 6 timócitos frescos sobre a monocamada celular de tEnd.1, desenvolvendose a migração por 18 horas. Os timócitos migrantes foram recolhidos, contados e analisados por citometria de fluxo. Os resultados foram representados como média ± erro padrão da média (EPM), e avaliados estatisticamente através do teste t de Student com significância quando p < 0,05. Todos os procedimentos foram aprovados pelo comitê de ética institucional da UFAL, sob o número de protocolo 028370/2009-07. Resultados Através da análise citofluorométrica, foi constatado que as células tEnd.1 apresentam uma alta expressão do receptor para IGF-1, o IGF-1R (92.91 ± 0.48). A análise morfológica revelou que as células tratadas com IGF-1 apresentam projeções citoplasmáticas mais alongadas e não-ramificadas, quando comparadas às células controle. O ensaio de adesão indicou que o IGF-1 aumenta significativamente o número total de timócitos aderidos (8,97x10 4 ± 4,87 x 10 3 ) quando comparado ao controle (3,90 x 10 4 ± 2,30 x 10 3 ). Este aumento também foi observado em todas as subpopulações definidas pelo fenótipo CD4/CD8. Entretanto, na migração transendotelial, o IGF-1 não foi capaz de modular o número de timócitos migrantes (1,67 x 10 4 ± 0,90 x 10 3 ) quando comparado ao controle (1,73x10 4 ± 1,14 x 10 3 ). Conclusão Nossos dados in vitro sugerem que o fator-1 de crescimento semelhante à insulina age sobre as células endoteliais tímicas, alterando sua morfologia e promovendo a adesão de timócitos, mas não interferindo na transmigração. Palavras-chaves: IGF-1, célula endotelial tímica, timócito QuebraPagina Resumo: 11.008 ESTUDO DOS NÍVEIS DE INTERFERON BETA EM AMOSTRAS DE SORO DE PACIENTES COM DIFERENTES FORMAS CLÍNICAS DA DENGUE. 1 SILVA, M. M. C. 1, OLIVEIRA, R. A. S. 2, Calzavara-Silva, C. E. 1, Marques, E.T.A. 1, GIL, L. H. V. Autores G. 1, GIL, L. H. V. G. 1 Virologia e Terapia Experimental - CPqAM, 2 Laboratório de Imunologia Celular e Molecular - CPqRR Apoio Financeiro: FACEPE Resumo Objetivos A febre da dengue (FD) e a febre hemorrágica da dengue (FHD) têm emergido como as mais importantes doenças causadas por arbovírus em áreas tropicais. Dado o fato de a intensidade de replicação do vírus durante os momentos iniciais da infecção determinar os desfechos clínicos da doença, é importante compreender o impacto da infecção da dengue na imunidade inata. Durante esta fase crítica, os mecanismos inatos antivirais mediados por interferon do tipo I (IFN-I/IFNalfa-beta) são potencialmente as mais importantes vias de defesa do hospedeiro. No presente estudo, analisamos os níveis de IFN beta no soro de pacientes infectados com o vírus da dengue (DENV) através do ensaio imunoenzimático ELISA (Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay) e correlacionamos essa análise com os resultados obtidos num estudo anterior que avaliou os níveis de expressão dos genes que codificam o IFN-I, desses mesmos pacientes, por PCR em tempo real (qPCR). Metodos Os níveis de IFN beta nos soros de 46 indivíduos infectados pelo DENV, sendo 25 pacientes FD e 21 FHD, coletados na fase aguda da doença (entre 3 a 5 dias de febre), foram quantificados através do kit ELISA Human IFN beta (Invitrogen), de acordo com instruções dos fabricantes. Resumidamente, foram adicionados à placa sensibilizada os soros de cada paciente e o anticorpo conjugado à enzima. Utilizou-se uma diluição seriada do padrão IFN beta humano e, em seguida, a placa foi incubada por 2 horas a temperatura ambiente (TA). Após a incubação, a placa foi lavada 3 vezes com tampão de lavagem. Adicionou-se solução substrato e a placa foi incubada a TA por 30 minutos sob a proteção da luz. Em seguida, a solução sto p < /i> foi adicionada a cada poço e realizada a leitura da absorbância através do Benchmark Plus microplate spectrophotometer (BIO-RAD). Resultados Na análise dos níveis de IFN beta, pode-se observar que nos pacientes com FHD os níveis dessa proteína foram maiores comparado aos pacientes FD. Esse resultado corrobora com o do estudo anterior, onde também foram encontrados níveis maiores de expressão do gene IFN beta nos pacientes FHD em comparação aos FD. Conclusão Correlacionando o presente estudo com um estudo anterior sobre os níveis de expressão do IFN-I foi possível concluir que os níveis de IFN beta são maiores nos pacientes FHD. Palavras-chaves: Dengue, Interferon beta, ELISA QuebraPagina Resumo: 11.009 AVALIAÇÃO IN VIVO DOS EFEITOS DO HORMÔNIO DO CRESCIMENTO NA ADESÃO DE MACRÓFAGOS. 1 Autores SANTOS, Y. M. O. D. 1, REIS, M. D. D. S. 2, VIANA, I. M. M. N. 2, MELO, R. R. S. 2, VIEIRA, L. F. D. A. 4, SMANIOTTO, S. 4 LABORATÓRIO DE BIOLOGIA CELULAR - UFAL Apoio Financeiro: CNPq e FAPEAL. Resumo Objetivos O hormônio do crescimento (GH) é um polipeptídio com propriedades imunomoduladoras. Dentres as células alvos desse hormônio estão os macrófagos, que apresentam diversas funções e participam da primeira linha de defesa imunológica fagocitando patógenos, para tal, envolve a adesão e a migração pelos diversos tecidos do organismo. Assim, o objetivo deste trabalho foi verificar in vivo o potencial do GH na adesão de macrófagos peritoneais residentes. Metodos Foram utilizados camundongos machos, de 6-8 semanas, da linhagem Swiss, tratados por via intraperitonial, com GH nas doses de 20 ou 200 &mug/kg, por 7 dias consecutivos. O grupo controle recebeu apenas salina. Após o tratamento os animais foram eutanasiados e os macrófagos peritoneais foram recolhidos. Os ensaios de adesão foram desenvolvidos por uma hora em superfícies revestidas com laminina ou fibronectina e a adesão foi quantificada pela medida da absorbância no comprimento de onda de 540 nm. A expressão dos receptores CD11b, CD49e e CD49f na superfície dos macrófagos foram analisados por citometria de fluxo. Os resultados foram representados como média ± desvio padrão (SD) e analisados utilizando o teste t de Student (n=3). Os valores obtidos foram considerados significativos quando p < 0,05. Todos os procedimentos foram aprovados pelo comitê de ética institucional da UFAL, sob o número de protocolo 028370/2009-07. Resultados O tratamento com GH foi capaz de diminuir significativamente a adesão dos macrófagos à laminina, em ambas as doses estudadas (0.076 ± 0.001 e 0.076 ± 0.002, doses de 20 e 200 &mug/kg, respectivamente) quando comparadas ao respectivo controle (0.086 ± 0.002). Na adesão à fibronectina foi observada uma redução das células obtidas dos animais tratados com GH, na dose de 20 &mug/kg (0.085 ± 0.001) quando comparado ao seu respectivo controle (0.0980 ± 0.003). O tratamento com GH na dose de 20 &mug/kg aumentou o percentual de células que expressão o receptor CD11b (52.33 ± 0.3) quando comparado ao controle (48.37 ± 0.03). Entretanto, o GH na dose de 200 &mug/kg foi capaz de diminuir a expressão do receptor para fibronectina, o CD49e (18.14 ± 2.05) quando comparados ao grupo controle (24.91 ± 0.36). Em relação a integrina CD49f, receptor para laminina, foi observado que o GH, nas doses de 200 &mug/kg reduziu sua expressão (63.03 ± 0.2) quando comparado ao grupo controle (69.76 ± 0.8). Conclusão Os dados apresentados neste trabalho sugerem que o GH possui efeitos sobre os macrófagos modulando a expressão de integrinas e a adesão frente a moléculas de matriz extracelular. Palavras-chaves: Adesão celular, Hormônio de crescimento, Macrófagos QuebraPagina Resumo: 11.010 MODIFICAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA EM CÉLULAS EPITELIAIS TÍMICAS CULTIVADAS COM SOBRENADANTE DE LINFÓCITOS T INFECTADOS PELO HTLV-1. 1 MOREIRA-RAMOS, K. 2, CASTRO, F. M. M. D. 3, LACERDA, L. L. 3, SAVINO, W. 1 Núcleo de Autores Ciências Biológicas - UNCISAL, 2 Laboratório de Biologia Molecular de Parasitas e Vetores - Fiocruz, 3 Laboratório de Pesquisas sobre o Timo - Fiocruz Apoio Financeiro: UNCISAL, FAPEAL, INCa/FAPERJ, Fiocruz (RJ) Resumo Objetivos A infecção pelo vírus linfotrópico de células T humanas tipo 1 (HTLV-1) causa majoritariamente duas patologias distintas: a Mielopatia Associada ao HTLV-1/Paraparesia Espástica Tropical (HAM/TSP) - uma doença neuroinflamatória - e a Leucemia/Linfoma de Células T do Adulto (ATL), caracterizada por uma linfoproliferação de células T maduras, particularmente células T CD4+CD25+. Sabendo-se que células epiteliais tímicas (TEC) expressam constitutivamente alguns dos receptores recentemente definidos para o vírus, nos pareceu possível que elas pudessem ser alvo de infecção pelo HTLV-1. Um trabalho de nosso grupo publicado recentemente (Mem. Inst. Oswaldo Cruz 106(6): 759, 2011) mostra, através de um modelo in vitro de co-cultivo entre linhagens de linfócitos T CD4+ infectados pelo HTLV-1 e uma linhagem de TEC humanas, que os linfócitos infectados são capazes de aderir ao epitélio tímico, induzir a formação de sincícios, e que, após 24 horas de co-cultivo, as proteínas virais gp46 e p19 foram encontradas nas TEC. Além disso, após a incubação dessas células com sobrenadante de cultura de linfócitos HTLV-1+, foi detectada a proteína viral gp46 na membrana das TEC e há fortes evidências da presença do gene para a proteína Tax do HTLV-1 no genoma destas células. Para dar sequência a estes resultados já publicados, traçamos o objetivo de verificar se há modificação de expressão gênica nas TEC após sua incubação com sobrenadante de linfócitos infectados. Metodos A metodologia utilizada foi o cultivo das TEC com sobrenadante de linfócitos T infectados ou não com o HTLV-1, seguido da extração de RNA para experimentos de microarranjos de DNA utilizando-se o kit Agilent Whole Human Gene Microarray (G4112F, Agilent Technologies), utilizando-se como estatística o teste hipergeométrico para a obtenção do p valor. Foram realizados três experimentos independentes. Resultados Nossos resultados indicaram que TEC submetidas ao sobrenadante de cultivos de linfócitos infectados apresentam expressão diferencial de vários genes envolvidos no desenvolvimento de ATL (como genes reguladores negativos de morte celular/anti-apoptóticos) e HAM/TSP, e a maioria dos genes com expressão significativamente modificada é de genes envolvidos na resposta inflamatória, principalmente relacionados à expressão de citocinas/quimiocinas. Conclusão Esses resultados indicam que a expressão gênica das TEC pode ser modulada por seu contato - e provável infecção - com o HTLV-1, e que os genes modificados de forma mais significativa estão relacionados às principais características da HAM/TSP e da ATL. Nesse momento, iremos iniciar estudos para confirmar a produção de algumas destas moléculas pelas TEC. Palavras-chaves: Células epiteliais tímicas, HTLV-1, Expressão gênica QuebraPagina
