Débora Laís Justo Jacomini

UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS
FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DO AMAZONAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA
TIPO 1 (HIV-1) EM PACIENTES ATENDIDOS NA FUNDAÇÃO DE MEDICINA
TROPICAL DO AMAZONAS FMTAM
DÉBORA LAÍS JUSTO JACOMINI
MANAUS
2007
ii
DÉBORA LAÍS JUSTO JACOMINI
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA
TIPO 1 (HIV-1) EM PACIENTES ATENDIDOS NA FUNDAÇÃO DE MEDICINA
TROPICAL DO AMAZONAS FMTAM
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Medicina Tropical da
Universidade do Estado do Amazonas em
Convênio com a Fundação de Medicina
Tropical do Amazonas, para obtenção do grau
de Mestre em Doenças Tropicais e
Infecciosas.
Orientador (a): Prof° Dr. Sinésio Talhari
Co-orientador (a): Prof° Dr. Felipe Gomes Naveca
MANAUS
2007
iii
FICHA CATALOGRÁFICA
JACOMINI, Débora Laís Justo
Caracterização Molecular do Vírus da Imunodeficiência Humana Tipo 1 (HIV-1) em pacientes
atendidos na Fundação de Medicina Tropical do Amazonas/Débora Laís Justo Jacomini, Manaus-AM:
Universidade do Estado do Amazonas, Fundação de Medicina Tropical do Amazonas/2007.
56p.il.
Dissertação de Mestrado (Doenças Tropicais e Infecciosas)
1. HIV
2. Resistência Primária
3. Subtipos HIV-1
iv
DEDICATÓRIA
Ao meu esposo Márcio, pelo apoio
incondicional que me deu; a minha mãe Laura,
que tornou possível essa realização; e em
especial ao meu filho João Paulo,
simplesmente por sua existência em minha
vida, dedico-lhes essa conquista com gratidão.
v
AGRADECIMENTOS
Agradeço a ajuda do Diretor Presidente da Fundação de Medicina Tropical do
Amazonas,
meu
orientador,
o
Prof.
Dr.
Sinésio Talhari,
pela
paciência,
disponibilidade e principalmente por ter acreditado na realização deste trabalho.
Ao meu co-orientador, o Dr. Felipe Gomes Naveca, pela paciência,
disponibilidade, dedicação e principalmente pelo incentivo em prosseguir mesmo
após as diversas dificuldades.
À Profa. Dra. Maria das Graças Barbosa, coordenadora do curso de Pós
Graduação em Medicina Tropical, por seu incentivo efetivo para essa conquista.
À Conceição Tufic, secretária da coordenação de Pós Graduação, sempre
nos socorrendo nos momentos difíceis dessa trajetória.
À todos os colaboradores da Gerência de Virologia da Fundação de Medicina
Tropical do Amazonas, que me receberam de forma grandiosa para realização
desse estudo.
Aos médicos e funcionários do LAC e ambulatório da Gerência de
Dermatologia da FMT-AM, que me receberam e colaboraram de forma efetiva para o
atendimento dos pacientes.
Aos colegas da turma do curso de mestrado, mesmo com pouca freqüência
hoje em nos encontrar, ficaram as boas recordações de momentos vividos no
decorrer do cumprimento de nossos créditos.
A todos os pacientes HIV positivos que participaram deste estudo, dando seu
consentimento para realização do mesmo.
A Universidade Federal do Amazonas, pela abertura de sua estrutura no
campo técnico cientifico, solucionando alguns de nossos resultados.
vi
A Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, Universidade do Estado do
Amazonas, Fundação Muraki e Superintendência da Zona Franca de Manaus, pelos
recursos disponibilizados à aquisição do material usado para execução do estudo.
Agradeço os meus irmãos, Janaina e Ulisses, em apostarem sempre que
somos capazes de realizar qualquer coisa na vida, se quisermos.
Ao Sr. Wilson, Carmen e Alessandro Jacomini, por muitos dos conselhos e
experiência disponibilizadas em muitos momentos, devido as suas formações.
E à Deus, por ter me dado saúde e o privilégio de alcançar este objetivo em
minha vida.
vii
RESUMO
Entre Dezembro de 2005 a Junho de 2006, um total de 110 pacientes recémdiagnosticados ou crônicos, virgens de tratamento antiretroviral com infecção para o
Vírus da Imunodeficiência Humana Tipo 1 (HIV-1), foram convidados a participar
desse estudo. Todos receberam as informações necessárias e assinaram um Termo
de Consentimento Livre Esclarecido. Dentre o total de pacientes, 85 (77,3%)
colheram sangue para a análise molecular. Após extração de RNA pelo método de
Trizol, foi realizada imediatamente a síntese do DNA complementar (cDNA), pela
reação da transcrição reversa. Pela técnica de PCR foi amplificada uma parte do
gene da transcriptase reversa (RT) do HIV em 82 amostras, dessas 52 foram
purificadas e seqüenciadas nos sentidos senso e anti-senso. Os cromatogramas
foram primeiramente visualizados no programa BioEdit 7.0.5.3, sendo as seqüências
montadas no programa DNASTAR/SeqManII. A genotipagem e as interpretações
das mutações no gene da RT, que conferem resistência aos antiretrovirais foram
avaliadas através do uso de ferramentas de bioinformática disponíveis na internet.
Os resultados de genotipagem demonstraram que 48 amostras (92,4%) foram
classificadas como subtipo B, 2 (3,8%) como subtipo F1 e 2 (3,8%) para o subtipo C.
Essas análises evidenciaram também que uma das amostras inicialmente
classificada como subtipo B é possivelmente uma forma recombinante circulante
(CRF) B/C. Até o presente momento o subtipo C do HIV-1 não havia sido detectado
no Estado do Amazonas. Das 52 amostras analisadas, 12 (23,0%) apresentaram
mutações relacionadas à resistência aos antiretrovirais NRTI e NNRTI. Uma dessas
amostras apresentou mutações: K101E, V108I e G190A capazes de gerar um alto
nível de resistência para efavirenz e neviparine, dois antiretrovirais da classe dos
NNRTI. Os dados obtidos nesse trabalho demonstram amostras de pacientes com
mutações relacionadas à resistência primária entre aqueles atendidos na FMT-AM.
Outro dado preocupante foi a constatação que um novo subtipo emerge no Estado
do Amazonas e indica que mais enfermos devem ser avaliados, inclusive em relação
a resistência secundária.
Palavras-chave: HIV-1, Resistência Primária, Genotipagem, Subtipos, AmazonasBrasil.
viii
ABSTRACT
Between December 2005 and June 2006, a total of 110 recently-diagnosed or
chronically untreated HIV-1-infected individuals were invited to participate in this
study; received essential information and signed a consent form. Eighty-five of them
(77.3%) returned to have their blood collected. Viral RNA was extracted from plasma
samples with Trizol and a fragment of the HIV reverse transcriptase (RT) gene was
amplified by RT-PCR in 82 samples. Fifty-two of those PCR amplified samples were
purified and sequenced with forward and reverse primers. Chromatogram files were
first analyzed with BioEdit 7.0.5.3 and subsequently, contigs were assembled with
the DNASTAR/SeqManII software. All sequences were also analyzed with
bioinformatics tools available on internet for genotyping and interpretation of
resistance mutations. HIV-1 subtype B was detected in 48 (92.4%) individuals,
whereas subtypes F1 and C were detected in two (3.8%) individuals each. To our
knowledge, this is the first detection of subtype C in Amazonas. Those results
evidenced that one of those samples previously labeled as subtype B, it’s possibly a
circulating recombinant form (CRF) B/C. Among the 52 RT sequences analyzed, 12
(23%) were found to have potential resistance mutations related to NRTI or NNRTI.
One of those samples showed three mutations: K101E, V108I, and G190A,
associated to high-level resistance to efavirenz and nevirapine, two NNTRI
antiretroviral (ARV) drugs. Our results have demonstrated HIV-1 infected individuals
carrying primary resistance to ARV among those attempted at FMT-AM and the
emergence of a new subtype in Amazonas. This result also indicated that more HIV
infected individuals should be tested, including those related to secondary resistance.
Keywords: HIV, primary resistance, genotyping, subtypes, Amazonas-Brazil.
ix
LISTA DE TABELAS
TABELA 1.
Iniciadores descritos na literatura por STUYVER et al, 1997;
17
BRINDEIRO et al, 1999 ; JANINI et al, 1996; TANURI et al,
1999.
TABELA 2.
Distribuição dos pacientes HIV positivos, segundo a idade.
23
TABELA 3.
Distribuição dos pacientes HIV positivos, segundo o número de
23
parceiros sexuais.
TABELA 4.
Total das 52 genotipagens realizadas para os NRTIs, mutações
25
de resistência de acordo com os subtipos caracterizados.
TABELA 5.
Total das 52 genotipagens realizadas para os NNRTIs,
mutações
de
resistência
de
acordo
com
os
27
subtipos
caracterizados.
TABELA 6.
Distribuição dos pacientes segundo a identificação dos
subtipos virais e mutações de resistência encontradas na
análise genotipica, para o gene da Transcriptase Reversa (RT).
31
x
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1.
Gel de Agarose: Gene RT 647pb, marcador 1Kb.
19
FIGURA 2.
Distribuição dos pacientes crônicos e recém-dignosticados,
22
segundo as categorias.
FIGURA 3.
Distribuição dos pacientes HIV positivos, segundo os subtipos
24
de vírus encontrados.
FIGURA 4.
Freqüências de mutações para os NRTIs em 52 pacientes
25
virgens de tratamento.
FIGURA 5.
Freqüências de mutações para os NNRTIs em 52 pacientes
26
virgens de tratamento.
FIGURA 6.
Alinhamento das seqüências de transcriptase reversa das
28
amostras de HIV obtidas nesse estudo. São mostradas
posições entre os nucleotídeos 271 e 360 referentes à amostra
AM01RT.
FIGURA 7.
Árvore filogenética das seqüências caracterizadas no estudo. A
29
confiabilidade foi obtida através da análise de bootstrap (100
réplicas).
FIGURA 8.
Alinhamento
da
amostra
AM25RT
frente
às
amostras
referências para os subtipos B e C. Sombreado verde indica
região com maior similaridade com o subtipo C; o sombreado
marrom indica região com maior similaridade com o subtipo B.
30
xi
LISTA DE ABREVIATURAS
AIDS
Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
ABC
Abacavir
ARV
Antiretroviral
AZT
Zidovudina
CDC
Centers for Disease Control
cDNA
DNA complementar
CRFs
Formas Recombinantes Circulantes
d4T
Stavudine
ddI
Didanosine
DLV
Delavirdine
EFV
Efavirenz
TMC125
Etravirine
HIV
Vírus da Imunodeficiência Humana
3TC
Lamivudina
NRTI
Inibidores de Transcriptase Reversa
NNRTI
Inibdores de Transcriptase Reversa Não Nucleosídeos
NVP
Neviparine
PI
Inibidores de Protease
RT
Transcriptase Reversa
TDF
Tenofovir Disoproxil Fumarate e Emtricitabine
UDI
Usuário de Drogras Injetáveis
xii
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO
1.1 Histórico
1.2 Epidemiologia
1.2.1 Epidemiologia no Mundo
1.2.2 Epidemiologia no Brasil
1.2.3 Epidemiologia no Estado do Amazonas
1.3 História Natural da Infecção
1.3.1 Vias de Transmissão
1.4 Organização Genômica do HIV-1
1.5 Subtipos do HIV-1 e CRFs
1.6 Resistência aos antiretrovirais
2 OBJETIVOS
2.1 Geral
2.2 Específicos
3 METODOLOGIA
3.1 Modelo de estudo
3.2 Local do estudo
3.3 População do estudo
3.3.1 Critérios laboratoriais
3.3.2 Critérios clínicos
3.4 Tamanho da amostra
3.5 Fontes de informações
3.6 Aspectos éticos
3.7 Procedimentos
3.7.1 Procedimentos para coleta e armazenamento das amostras
3.7.2 Ensaios imunoenzimáticos
3.7.3 Imunofluorescência
3.7.4 Quantificação da Carga Viral
3.7.5 Contagem de Linfócitos T-CD4+/CD8
3.8 Ensaios Biomoleculares
3.8.1 Protocolo de extração do RNA do HIV-1
3.8.2 Protocolo para síntese do cDNA
3.8.3 Protocolo para reação de PCR
3.8.4 Protocolo de purificação, precipitação e seqüenciamento
1
1
1
1
2
2
3
4
4
4
6
10
10
10
11
11
11
11
11
12
12
12
13
13
13
13
14
14
14
15
15
15
16
19
4 RESULTADOS
22
5 DISCUSSÃO
33
6 CONCLUSÃO
39
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
40
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 Histórico
Em 1983, Barre-Sinoussi, Chermann e Montagnier, no Instituto Pasteur de
Paris, isolaram um retrovírus a partir de linfonodo de paciente com linfodenomegalia.
Este retrovírus, após outros nomes, recebeu a denominação de Vírus da
Imunodeficiência Humana (HIV) (COFIN et al., 1986), sendo reconhecido como
responsável pela Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS).
Em 1986, um novo vírus, muito semelhante ao HIV, foi descoberto em
humanos. Com isso, a AIDS passou, também ser ocasionada por outro tipo de HIV,
o que levou à redefinição da nomenclatura, sendo denominado HIV-1, o primeiro
isolado, e HIV-2, o segundo. Estes dois vírus, apesar de relacionados, apresentam
diferenças importantes em sua estrutura genômica e patogência (CLAVEL et al.,
1986).
O HIV-1 é o principal responsável pela atual epidemia da AIDS, estando os
casos de infecção pelo HIV-2 restritos a certas áreas geográficas ou casos isolados,
em regiões específicas, tais como África Ocidental e algumas regiões da Europa
(CLAVEL et al., 1986, PIANIAZEK et al., 1991).
Aproximadamente, 90% das pessoas contaminadas com HIV/Aids, são de
países localizados na Ásia, África, América Latina e Caribe. Em média, a cada dia,
16.000 pessoas são contaminadas (RUSSOMANO, et al., 2001).
1.2 Epidemiologia
1.2.1 Epidemiologia no Mundo
A prevalência e incidência de HIV/Aids variam consideravelmente de
continente para continente, de país para país e de região para região. A epidemia da
AIDS vem crescendo significativamente durante os anos. Apesar de programas bem
implementados na prevenção e tratamento, o que se vê é o aumento do número de
2
casos
novos.
Ao
todo
estavam
registrados
39,5
milhões
em
2006;
aproximadamente, 2,6 milhões de casos a mais, desde 2004 (UNAIDS, 2006).
O número de pessoas que convivem com HIV/Aids na América Latina
aumentou de 1,4 milhões de infectados em 2000 para 2,4 milhões em 2005
(UNAIDS, 2006).
1.2.2 Epidemiologia no Brasil
No Brasil, o primeiro caso de AIDS foi notificado na cidade de São Paulo, em
1980 (BRASIL, 1999). Os primeiros casos ficaram inicialmente restritos às grandes
metrópoles, como Rio de Janeiro e São Paulo. As categorias de exposição
preponderantes eram os homens que faziam sexo com outros homens, hemofílicos
e outros pacientes que receberam sangue e hemoderivados (BASTOS et al., 1990).
A partir da década de 80, outro segmento populacional, os usuários de drogas
injetáveis (UDI), passaram a ocupar posição de destaque, com 20% dos casos
acumulados no Brasil (FONSECA, 1997; CASTILHO, 1997).
No Brasil, de 1980 a 2006 foram registrados 433 mil casos de AIDS, entre
estes, 80% concentram-se nas Regiões Sudeste e Sul. O Sudeste é a região mais
atingida desde o início da epidemia e, apesar da alta taxa de incidência, mantém-se
num processo de estabilização (BRASIL, 2006).
1.2.3 Epidemiologia no Estado do Amazonas
Em 1986 foi notificado, oficialmente, o primeiro caso de HIV/Aids em ManausAM. Verificou-se a expansão a partir da década de 90, e a interiorização, com o
registro do primeiro caso em Manaquiri, em 1991; progressivamente vêm-se
observado casos nos demais municípios (BARBOSA, 2002).
O Estado do Amazonas tem contribuído significativamente com o número de
casos na região norte (AMAZONAS-AM, 2004).
3
De 1986 a 2005, foram registrados 3.045 casos em maiores de 13 anos. A
epidemia, no Estado do Amazonas, tende ao crescimento. A cidade de Manaus
concentra a maioria dos casos (AMAZONAS-AM, 2005).
1.3 História Natural da Infecção
O vírus HIV tem tropismo específico por células com antígeno de superfície
CD4, representados pelos linfócitos T auxiliares e células do sistema macrofágicomonocitário. Além da molécula de superfície CD4, a CXCR4 e CCR5 são receptores
para o vírus (ORTIGÃO-DE-SAMPAIO, et al., 1997).
Na fase aguda do HIV-1, verifica-se a queda na contagem de linfócitos
T CD4⁺, aumento de linfócitos CD8⁺ e um aumento na produção do RNA viral. Após
a fase aguda ocorre a produção de anticorpos específicos, com equilíbrio entre a
replicação viral e a resposta imune, sem manifestação clínica durante vários anos
(SCOTT, et al., 2006).
O período de latência pode durar 10 anos, ou mais. As células T-CD4⁺ se
mantém em número estável, porém com tendência à queda. Durante todo o período
assintomático, o organismo adquire equilíbrio dinâmico entre a resposta imune ao
patógeno e a proliferação do vírus nas células T. Progressivamente, observa-se a
queda das células T-CD4⁺ e elevação significativa do RNA viral plasmático, com
surgimento
do
dermatológicas,
período
sintomático,
hematológicas,
caracterizados
neurológicas,
entre
por
manifestações
outras. Este
quadro
é
classificado nas categorias A e B pelo Centers for Disease Control and Prevention CDC, 1986.
Os testes usados para a detecção dos anticorpos anti-HIV, são as
imunoenzimáticas (ELISA), e Western Blot (WB). O método de ELISA, é o teste
padrão de triagem, com sensibilidade de 100% e especificidade de 99,43%. Os
resultados positivos devem ser confirmados pela técnica de Western Blot (WB), que
apresenta sensibilidade e especificidade de 100% (MELO, et al., 2003).
4
1.3.1 Vias de Transmissão
O
HIV
é
transmitido
principalmente
através
das
relações
sexuais
desprotegidas; compartilhamento de agulhas e seringas contaminadas; transfusão
de sangue infectado; vertical, de mãe para filho, e ocupacional (SCOTT et al., 2006).
1.4 Organização Genômica do HIV-1
O HIV-1 é um vírus membro da família lentiviridae; é formado por envelope
lipoprotéico, com duas proteínas principais, a GP120 e GP41, formadas a partir de
um precursor, a GP160, com cápsula interna de proteínas e lipídios, dentro da qual
se encontra o RNA genômico (HOFFMANN, et al., 2006).
Outras cinco proteínas são componentes essenciais do HIV-1: a transcriptase
reversa, a REV, a TAT, a integrase e a protease. Estas proteinas participam do
processo de conversão do RNA viral para o DNA complementar (cDNA), que se une
ao DNA celular. Em ambas as extremidades do genoma encontram-se as LTR (Long
Terminal Repeat), ‘5 .LTR-gag-pol-env-LTR 3’, com função na integração entre o
genoma celular e viral, durante o processo replicativo do vírus (VAISHNAV, 1991;
WONG-STALL, 1991). Dentre estas proteínas, a transcriptase reversa desempenha
papel essencial para que o HIV realize o processo de infecção.
1.5 Subtipos do HIV-1 e Formas Recombinantes Circulantes
A dinâmica da epidemia do vírus da imunodeficiência humana (HIV) é
influenciada por diversos fatores, tais como o momento da introdução, a população
envolvida, a densidade demográfica e os aspectos socioculturais (AIDSCAP, 1996).
O HIV-1 é um vírus com alta freqüência de mutações, sendo dividido em
diferentes grupos: M (Major), N (New) e O (Out-group) (MYERS et al., 1994;
ARNOLD et al., 1995). A linhagem do grupo M é a principal responsável pela
pandemia. O grupo N, relaciona-se a não-pandêmica. O grupo M é composto por
nove subtipos filogeneticamente distintos. Subtipos A, B, C, D, F, G, H, J e K. Dentro
do grupo M, vírus pertencentes ao mesmo subtipo genético divergem entre si na
5
proporção de 3-23%. Estes vírus representam seqüências com características
filogenéticas diferentes, sendo identificados em diferentes regiões do mundo; a
maioria das seqüências analisadas pertence ao grupo M (ROBERTSON et al.,
2000). As variantes dos subtipos A e F são ainda classificadas como A1, A2, F1 e
F2, respectivamente (PINTO ME; STRUCHINER CJ, 2006).
Os vírus do grupo O representam variantes com grande divergência. Ocorrem
na República dos Camarões, Gabão (DE LEYS et al., 1990; GURTLER et al., 1994),
Europa e Estados Unidos, constituindo importante problema, porque pode não ser
identificado pelos testes sorológicos convencionais. Os vírus do grupo O e M ao
nível das seqüências de aminoácidos da proteína de envelope, divergem entre si em
torno de 47% (LOUSSERT-AJAKA et al., 1994; RAYFIELD et al., 1996).
O subtipo B é o principal subtipo que circula nos países desenvolvidos
(Europa e EUA). Os subtipos A e D são mais prevalentes na África; o C e E são mais
comuns na Índia, Brasil e sudeste Asiático; B e F ocorrem no Brasil e Romênia. O
subtipo mais prevalente no Brasil é o B. O subtipo F é o principal não-B, ocorrendo
em todas as regiões do país, sendo responsável por 15 a 20% das infecções. O
subtipo C é o principal não-B; é encontrado no Sul do país (TANURI et al., 1999).
Os subtipos do HIV-1 que circulam no Brasil são, principalmente, o subtipo B,
F e subtipo C, os quais são distribuídos em regiões distintas. No Nordeste, São
Paulo e Rio de Janeiro, 80% dos pacientes apresentam o subtipo B; o subtipo C,
com manifestações mais agressivas, aumenta no Sul, ocorrendo em 67% dos
infectados. Nas demais regiões brasileiras o subtipo F, corresponde a 30% dos
casos (DIAZ, et al., 2003). O predomínio do subtipo B no Brasil, é semelhante ao que acontece
em toda a América Latina, Europa Ocidental e Estados Unidos. (PINTO, 2007).
Além destes subtipos, formas recombinantes circulantes (CRF, do inglês
circulating recombinant forms) já foram identificados em diversos países. Estas
formas constituem vírus mosaicos, formados por dois ou mais diferentes subtipos,
com importante capacidade de dispersão (ROBERTSON et al., 2000).
6
A determinação dos subtipos e CRF, em determinada área geográfica é
essencial para a adequação de futuras vacinas e esquemas de tratamento. Até o
momento, dezesseis CRF foram descritos. Áreas onde circulam dois ou mais
subtipos do vírus são locais potenciais para a identificação de novas formas virais
(ROBERTSON et al., 2000). As mais comumente encontradas são as CRF02_AG e
CRF01_AE (OSMANOV, et al., 2000).
Existem alguns estudos que indicam diferenças quanto à transmissibilidade,
dos subtipos B, C e o recombinante CRF01_AE. O subtipo B está associado a uso
de drogas injetáveis (UDI), e os vírus CRF01_AE, são encontrados em indivíduos
infectados por contato sexual (HARMELEN, et al., 1997). Atualmente, estão
descritos CRFs que resultam da recombinação entre HIV-1 do subtipo A e E
(CRF_AE), A e G (CFR_AG), A e B (CFR- AB) e A, G, K e U. Também já foram
descritos na literatura recombinação entre os vírus do grupo M e do grupo O
(TAVEIRA, et al., 2001).
1.6 Resistência aos antiretrovirais (ARV)
Desde 1996, o Ministério da Saúde do Brasil, através do Programa Nacional
em DST/AIds, oferece gratuitamente terapia antiretroviral (ARV), para os pacientes.
O tratamento da AIDS com os ARVs, proporcionou aos pacientes melhor perspectiva
de vida, modificando a doença, que apresentava alta taxa de mortalidade, para
enfermidade crônica, como tantos outros (LEMES, 1998).
A terapia ARV leva o aumento significativo dos linfócitos T-CD4⁺ e queda da
carga viral de pelo menos 1 log nos primeiros meses de tratamento. No entanto,
mesmo sob tratamento regular, muitos pacientes voltam a ter aumento da carga viral
(VIEIRA et al., 2000).
Entre as várias dificuldades no tratamento da AIDS, temos o aparecimento de
cepas virais resistentes. O HIV, assim como outros vírus RNA, replicam como
formas complexas e dinâmicas, genômicas mutantes, surgindo as denominadas
quasispécies virais. Essas quasispécies virais constituem-se num obstáculo
importante ao desenvolvimento de vacinas e tratamento. Um exemplo clássico deste
7
fato foi o surgimento de variantes do HIV-1, resistentes a análogos nucleosídeos,
tais como: o AZT (Zidovudina) e 3TC (Lamivudina) (VIEIRA et al., 2000).
Com o crescente uso de drogas antiretrovirais no tratamento da infecção pelo
HIV-1, a transmissão de cepas resistentes tem sido motivo de grande preocupação e
empecilho ao controle da epidemia. A resistência pode ser primária, ou seja, aquelas
decorrentes da transmissão de cepas resistentes de um indivíduo ao outro,
resultante das mutações que ocorrem sem o uso de ARV, ou secundárias,
caracterizadas pela falha terapêutica, em pacientes submetidos a tratamento
(MACHADO, 1999).
Um dos primeiros estudos realizados pelo Programa de Pesquisa de Infecção
Aguda (AIEDRP), no Departamento de Medicina da Universidade da Califórnia, com
377 pacientes, com infecção recente e virgens de tratamento, demonstrou a
resistência em um paciente aos Inibidores de Transcriptase Reversa (NRTIs),
nenhuma resistência para os Inibidores de Protease (PI) (LITTLE, 1999).
Outro estudo, realizado com 571 pacientes, com amostras da América do
Norte, América Latina e Europa, evidenciou em 91,4 (16%), resistências aos
Inibidores de Transcriptase Reversa Nucleosídeos (NRTI) e Inibidores de
Transcriptase Reversa Não Nucleosídeos (NNRTI) – na maioria para stavurdine
(BORROTO-ESODA, 2004).
Em Recife, no estudo de 101 pacientes, verificou-se em 6 (7,1%) resistência
primária aos NRTI e em 67 (79,8%) para os Inibidores de Protease (PI). Houve
predominância dos subtipos B (72,6%), F (22,6%), B/F (3,6%) e C (1,2%)
(MEDEIROS, et al., 2006).
Através da análise genotípica, em 100 pacientes no Espírito Santo, recémdiagnosticados e virgens de tratamento, encontrou-se: 73 subtipo B (75,25%), 9
subtipo F (3,1%), 6 subtipo C (6,2%) e recombinação entre os subtipos F/B (12,4%),
sem avaliação da resistência primária nestes pacientes (CABRAL, et al., 2006).
8
Os antiretrovirais agem diretamente no processo de multiplicação do HIV. Os
ARVs distribuidos no Brasil dois tipos de Inibidores de transcriptase reversa
nucleosídeos e não nucleosídeos: AZT ou Zidovudine; ddI ou Didanosine; ddC ou
Zalcitabina; 3TC ou Lamivudine; d4T ou Stavudine; o NVP ou Nevirapine; DLV ou
Delavirdine e EFV ou Efavirenz. Os Inibidores de Protease são: Saquinavir,
Indinavir, Ritonavir e Nelfinavir (BRASIL, 2005).
Quando se implantou no Brasil, a política de acesso universal aos
antiretrovirais, surgiram opiniões sobre possíveis surgimentos “descontrolado” de
cepas resistentes (REMIEN RH, et al., 2003). Depois de 10 anos da introdução de
terapia ARV potente (Highly Active Anti-Viral Therapy - HAART) em nosso país,
conseguiu-se monitorar e avaliar a qualidade da terapia. As taxas de resistência são
comparáveis àquelas observadas nos países desenvolvidos (BASTOS, et al., 2006).
Em 1998, a resistência primária nos Estados Unidos era de 3,5% do total de
casos registrados; em 2000 havia 14%. No Brasil aumentou de 3,5%, em 1997, para
7%, em 2000. Ao mesmo tempo, aumenta a probabilidade de quem se infectar
adquirir HIV já com mutação de resistência (DIAZ, et al., 2003).
Na maioria dos pacientes não se sabe a atual prevalência da resistência
primária. No estudo de 361 pacientes, recém-diagnosticados e sem uso de terapia
ARV, na cidade de Nova Iorque, verificou-se aumento da resistência de 13,2% para
24,1%, durante os períodos de 1995 a 1998, e 2003 a 2004, com aumento
significativo para os NNRTIs (SHET, et al., 2006).
Em 1997, com o objetivo de estudar a composição genética do HIV circulante
no Amazonas, foram estudados 31 pacientes procedentes da cidade de Manaus.
Verificou-se que a proporção entre os subtipos B e F eram idênticas (1:1), diferindo
dos padrões encontrados nas grandes cidades do sudeste do Brasil. Além disso,
observou-se alta freqüência de estruturas mosaicas entre os subtipos B e F, e
recombinação entre estes variantes (VICENTE, et al., 1999).
Nos anos de 1993, 1994, 1996 e 1997, foi realizado um estudo com
amostras de diferentes cidades brasileiras do Estado de São Paulo (Hospital Albert
9
Einstein), Rio de Janeiro (Hospital da Universidade Federal do Rio de Janeiro), Pará
(Hospital Evandro Chagas) e Amazonas (Instituto de Medicina Tropical do
Amazonas). Verificou-se: susceptibilidade aos inibidores de protease (IPs) entre os
subtipos B e F dessas regiões (TANURI et al., 1999).
No Estado do Rio de Janeiro, no período de 2002 a 2003, em 547 pacientes,
verificou-se que 445 (91,2%) eram do subtipo B, 24 (4,9%) subtipo F e 16 (3,3%)
apresentaram formas recombinantes entre os subtipos B e F (COUTO-FERNANDEZ
et al., 2004).
No Laboratório Central de Saúde Pública, de São Paulo (Lacen-SP), no
período de dezembro de 2001 a maio de 2003, foram analisadas 306 amostras de
pacientes HIV positivos com falha terapêutica, observou-se que 214 (70%) foram
agrupados geneticamente no subtipo B, e 37 (12%) pertenciam ao subtipo F
(RODRIGUES et al., 2005).
Em 2002, no Laboratório de Saúde Pública do Distrito Federal (Lacen-DF),
foram selecionados 45 indivíduos HIV-1 positivos, recém-diagnosticados. Através da
análise filogenética verificou-se que 43 (96%) das amostras caracterizavam-se pelo
subtipo B e 2 (4%) com o subtipo F, para o HIV-1 (CERQUEIRA et al., 2004).
O surgimento de cepas HIV resistentes aos ARVs, coloca em evidência o
importante papel dos testes de genotipagem, com a finalidade de se conhecer
melhor o perfil de resistência do vírus e possibilitar melhor tratamento. Neste
contexto, são necessários estudos para a caracterização molecular das cepas
existentes em todas as áreas endêmicas. No presente estudo, fizemos a
caracterização genética de diferentes subtipos de vírus em pacientes HIV/Aids da
população do Estado do Amazonas. Realizamos, pela primeira vez no Estado,
investigação relativa à resistência primária em pacientes HIV positivos. Também foi
realizado o mapeamento dos subtipos do HIV-1 na região.
10
2 OBJETIVOS
2.1 Geral
Identificar os subtipos do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1), e
avaliação da resistência primária nos pacientes atendidos na Fundação de Medicina
Tropical do Amazonas FMTAM.
2.2 Específicos
-
Caracterizar, através de técnicas moleculares, os subtipos do HIV-1
responsáveis pela epidemia de HIV/Aids no Estado do Amazonas;
-
Através da genotipagem, investigar a prevalência dos subtipos de HIV-1 em
pacientes recém-diagnosticados ou crônicos, sem uso de antiretrovirais;
-
Associar os genótipos com a Carga Viral, Contagem de Linfócitos TCD4⁺/CD8⁺ e o estágio clínico dos pacientes;
-
Caracterizar possíveis mutações (resistência primária), nos vírus de
portadores de HIV/Aids.
11
3 METODOLOGIA
3.1 Modelo de Estudo:
Estudo descritivo, de uma série de casos, prospectivo (período Dezembro de
2005 a Junho de 2006) de pacientes que convivem com HIV/Aids, recémdiagnosticados e crônicos, sem uso de antiretrovirais, procedentes do Estado do
Amazonas, atendidos na Fundação de Medicina Tropical do Amazonas FMTAM,
referência no atendimento e tratamento desses pacientes no Estado.
3.2 Local do Estudo:
A Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, oferece serviço de
atendimento e tratamento para pacientes HIV positivos. Portanto, o estudo teve
realização nas Gerências de Dermatologia DST/Aids e Virologia da FMTAM.
3.3 População do Estudo‫׃‬
A população estudada foi composta de pacientes da demanda do serviço de
atendimento do ambulatório especializado da Gerência de Dermatologia da FMTAM,
cadastrados na Coordenação Estadual de DST e Aids, independentemente do sexo
ou idade, que realizam de rotina, exames de quantificação da Carga Viral e
Contagem de Linfócitos T-CD4⁺/CD8⁺. Os pacientes foram incluídos no estudo de
acordo com os critérios descritos abaixo‫׃‬
3.3.1 Critérios Laboratoriais
Pacientes infectados com HIV: indivíduos com sorologia positiva para o Vírus
da Imunodeficiência Humana (HIV), de acordo com os critérios adotados pelo
Ministério da Saúde (Programa Nacional de DST e Aids), inserido pela FMTAM,
onde, deve-se obter de cada paciente, 2 testes ELISA, positivos, e 1
Imunofluorescência, positiva, para serem diagnosticados como HIV positivo.
12
3.3.2 Critérios Clínicos
--- Pacientes que tenham todos os testes laboratoriais positivos para HIV/Aids;
--- Recém-diagnosticados ou crônicos;
--- Portador sintomático ou assintomático;
--- Pacientes sem uso de antiretrovirais, virgens de tratamento;
--- Pacientes HIV positivos, e que façam, de rotina, exames de Quantificação da
Carga Viral e Contagem de Linfócitos T-CD4⁺/CD8⁺.
3.4 Tamanho da amostra:
Estimou-se que, mensalmente, 20 novos casos de HIV são diagnosticados
clínica e laboratorialmente, e encaminhados ao ambulatório de DST e Aids, da
FMTAM, a unidade de referência para o atendimento da capital e municípios
limítrofes. Portanto, pode-se conseguir amostra significativa, de 110 enfermos no
período de dezembro de 2005 a junho de 2006.
3.5 Fontes de informações:
--- Os pacientes foram informados sobre os objetivos e métodos da pesquisa,
sendo pedido o consentimento formal e individual, constante no TCLE;
--- Os pacientes foram entrevistados, tendo como instrumento um
questionário com perguntas estruturadas para obtenção dos dados: clínicos,
epidemiológicos, laboratoriais e hábitos sócio-culturais;
--- A complementação das informações necessárias ao preenchimento do
questionário, bem como a verificação das informações relatadas no momento da
entrevista, foram obtidas do prontuário médico, tais como: dados relativos aos
exames laboratoriais, estágio clínico e cadastro do mesmo.
13
3.6 Aspectos Éticos
O projeto foi encaminhado ao Comitê de Ética em Pesquisa da FMTAM, as
amostras de sangue somente foram coletadas após a expedição do Termo de
Aprovação do Comitê.
Os pacientes foram convidados a participar do estudo voluntariamente,
informados em que consistia sua participação, relacionando os riscos e benefícios,
e, a intermédio dessas informações foi solicitado de forma individual a ciência de sua
participação, mediante o TCLE, firmado pelo voluntário e pesquisador, de acordo
com a Resolução 196/96.
3.7 Procedimentos
3.7.1 Procedimentos para coleta e armazenamento das amostras:
As atividades incluídas neste estudo não abordaram os aspectos clínicos e
seguimento do paciente. Fez-se somente a revisão dos prontuários para posterior
concordância de alguns dados obtidos na pesquisa, através do questionário aplicado
ao paciente. A participação dos pacientes incluídos consistiu em fazer a coleta da
amostra de sangue de 5,0mL, que excedeu aquela obtida no momento da coleta dos
exames de rotina solicitados pelo médico assistente. O sangue foi colhido através da
punção venosa, pelo sistema vacutainer, com EDTA (K3). Essas amostras foram em
seguida centrifugadas, e o plasma aliquotado em cinco tubos estéreis de 1,0mL,
com 300µl em cada tubo, sendo devidamente identificados com número de
prontuário e inicial do nome; em seguida foram vedados com filmeplast e
conservados a -80ºC para posterior análise molecular.
3.7.2 Ensaios Imunoenzimáticos (ELISA)
Os testes sorológicos para detecção dos marcadores sorológicos para o HIV1/2, foram determinados pelo método imunoenzimático (ELISA, do inglês Enzyme
Linked Immunosorbent Assay), através de conjuntos de regentes comerciais (BIORAD, DIASORIN, respectivamente), seguindo as instruções de procedimento do
14
fabricante. Estes testes são realizados na rotina do Laboratório de Análises Clínicas
(LAC).
3.7.3 Imunofluorescência
O diagnóstico confirmatório para HIV-1 é realizado através da pesquisa de
anticorpos para HIV, pela imunofluorescência indireta (IFI), através de conjuntos
comerciais fornecidos pelo Ministério da Saúde, seguindo as instruções de
procedimento do fabricante. Estes testes são realizados de rotina no LAC da
FMTAM.
3.7.4 Quantificação da Carga Viral do HIV-1
Determinou-se a carga viral do HIV-1, por meio de conjuntos de reagentes
comerciais HIV-1 RNA QT, (BioMérieux, Boxtel, EU), em sistema semiautomatizado, utilizando a tecnologia NASBA (do inglês, Nucleic Acid Sequence
Based Amplification), seguindo-se as especificações e procedimentos do fabricante.
3.7.5 Contagem de Linfócitos T-CD4⁺/CD8⁺
A contagem absoluta de linfócitos T-CD3⁺/CD4⁺ e CD3⁺/CD8⁺ foi realizada
pelo sistema automatizado FACSCount (Becton & Dickinson Immunocytometry
Systems, Califórnia-USA), com conjuntos de ensaios comerciais, de acordo com os
procedimentos e instruções do fabricante.
Os exames de Quantificação da Carga Viral do HIV-1 e Contagem de
Linfócitos T-CD4⁺/CD8⁺, são realizados na rotina na FMTAM.
15
3.8 Ensaios Biomoleculares
3.8.1 Protocolo de extração do RNA do HIV-1
Adotamos o protocolo utilizado por Tanuri, et al., 1996 para extração do RNA
e preparação do cDNA, com algumas adequações:
O RNA foi extraído de amostras de plasma, pelo método de Trizol, iniciandose com uma alíquota de 300µl, e concentração final 50µl do plasma. Essa alíquota
foi centrifugada a 14.000g a 4ºC, por 90 minutos. Em seguida, desprezou-se 250µl
do sobrenadante, dando-se início à extração com Trizol, com 50µl restantes, ou seja,
um precipitado de células, com as seguintes etapas de extração: ao pellet (50µl de
plasma), foi adicionado 150µl de Trizol® (GIBCO-BRL), homogeneizando várias
vezes. A seguir incubou-se por 5min à temperatura ambiente, e adicionou-se 40µl de
clorofórmio, fazendo-se homogeneização invertendo o tubo por 20 vezes. Depois
incubou-se por 10min à temperatura ambiente, centrifugando-se durante 15min a
14.000g a 4ºC. Durante à centrifugação foram preparados tubos contendo 100µl de
Isopropanol gelado, com 30µl de solução de Dextran T500 a 1µg/µl, mantendo-se
em banho de gelo. Transferiu-se a fase aquosa (superior) para estes tubos, que
continham a solução de Isopropanol e Dextran, homogeneizando-se novamente
invertendo os tubos por várias vezes. Depois centrifugou-se por 20min a 14.000g a
4ºC, removendo-se por completo o sobrenadante. Adicionou-se 300µl de etanol 70%
gelado a -20ºC ao precipitado e centrifugou-se novamente a 14.000g por 5min,
removendo totalmente o sobrenadante. Para não descartar o precipitado, secou-se
em termobloco a 65ºC, por 3minutos e dissolveu-se em 10µl de Água DEPC,
ressuspendendo por várias vezes.
3.8.2 Protocolo para a síntese do cDNA
Após a extração do RNA pelo método de Trizol, utilizou-se o RNA para
síntese do DNA complementar (cDNA), pela reação da transcrição reversa,
composta de: 10µl de RNA, ao qual foram adicionados 2,0µl de Randon Primer PN6
a 150ng/µl (Invitrogen) e incubado a 80ºC, por 10 min, para desnaturação do RNA. A
16
seguir resfriou-se a solução em gelo por aproximadamente 2minutos e preparou-se
mix contendo os seguintes reagentes:
Reagente
Volume
5X Tampão SIII RT
..........................
4,0µl
25mM dNTP mix
..........................
0,4µl
Inibidor de RNAse
..........................
2,5µl
Superscript III RT
..........................
1,0µl
0,1 M DTT
..........................
1,0µl
8,9µl
Após a adição do mix no RNA, incubou-se o material em banho seco,
devidamente programado para as seguintes temperaturas e tempo:
25ºC
37ºC
50ºC
70ºC
↓
↓
↓
↓
05min
30min
30min
15min
A soma do mix com o RNA, totalizou um volume final de reação de cDNA de
20,9µl (12µl RNA desnaturado e 8,9µl mix com enzimas e tampão). Nas reações de
cDNA realizadas não se adicionou água.
A extração de RNA pelo método de Trizol e síntese do cDNA foram realizadas
no mesmo dia, com amostras preparadas em intervalos de 12 em 12, e 20 em 20
amostras.
3.8.3 Protocolo para reação de PCR para amplificação das regiões alvo
Com base no Protocolo de Tanuri, 1999, adotamos a reação em cadeia de
polimerase (PCR), para amplificação das regiões genômicas do HIV-1 que
compreende o gene da transcriptase reversa (RT). Esta amplificação foi realizada
em duas etapas, com iniciadores específicos, previamente descritos na literatura
(Tabela 1):
17
Tabela 1. Relação dos iniciadores, descritos na literatura por STUYVER et al, 1997;
BRINDEIRO et al, 1999 ; JANINI et al, 1996; TANURI et al, 1999.
Região do
Utilização do
Nome do
Região de
Genoma
Inicador
Iniciador
do HIV-1
1º PCR
Pol RT
2º PCR
Seqüência do Iniciador (5’-3’)
Tamanho
Tamanho
Hibridização
do
do produto
no genoma
Iniciador
RT-9 (F)
2485-2513
5´ GTACAGTATTAGTAGGACCTACACCTGTC 3´
29 mer
RT-12 (R)
3249-3275
5´ ATCAGGATGGAGTTCATAACCCATCCA 3´
27 mer
RT-1 (F)
2619-2647
5´ CCAAAAGTTAAACAATGGCCATTGACAGA 3´
29 mer
RT-4 (R)
3246-3265
5´ AGTTCATAACCCATCCAAAG 3´
20 mer
791 pb
647 pb
Para a reação da PCR fez-se um sistema com componentes, podendo ser
modificado quanto a variação da quantidade de cDNA adicionado. Todas as reações
realizadas neste estudo foram feitas com enzima termoestável (Taq DNA
Polimerase) e na presença de oligonucleotídeos iniciadores (primers) senso e antisenso, para RT. Esta região, em ambos os lados do gene foi ampliada com dois
fragmentos sobrepondo, usando os pares de iniciadores descritos acima, com
volume de 50µl finais, para 5,0µl de cDNA na 1ª Reação, e na 2ª Reação (nested)
2,0µl da 1ª Reação, assim compostos:
MIX da 1ª Reação:
Reagente
Volume
Tampão 10X
..........................
5,0µl
25mM dNTP
..........................
0,4µl
50mM MgCl2
..........................
2,5µl
Primer F RT-9 (25pmol/µl)
..........................
0,5µl
Primer R RT-12 (25pmol/µl)
..........................
0,5µl
Taq Pol (5UI/µl)
..........................
0,25µl
Amostra cDNA
..........................
5,0µl
dH2O q.s.p.
..........................
50 µl
MIX da 2ª Reação:
Reagente
Tampão 10X
Volume
..........................
5,0µl
18
25mM dNTP
..........................
0,4µl
50mM MgCl2
..........................
2,5µl
Primer F RT-1(25pmol/µl)
..........................
0,5µl
Primer R RT-4(25pmol/µl)
..........................
0,5µl
Taq Pol (5UI/µl)
..........................
0,25µl
Amostra 1ª Reação
..........................
2,0µl
dH2O q.s.p.
..........................
50 µl
Para cada ensaio foi incluído um tubo denominado “branco”, visando controle
de possíveis reações contaminantes. As condições de temperatura e tempo para os
ciclos da PCR, também foram às mesmas empregadas para a primeira e segunda
reação do gene da RT. Para esse processo utilizou-se termociclador, com
programação, descrita no quadro abaixo:
PRÉ PCR
Desnaturação
95ºC
3 min.
PCR: 35 ciclos
Desnaturação
95ºC
1 min.
Hibridização
55ºC
1 min.
Extensão
72ºC
1 min.
EXTENSÃO FINAL
72ºC
10 min.
4 ºC ∞
Os amplicons foram analisados por eletroforese, em gel de agarose a 1%.
Para tanto, uma alíquota de cada 10µl do produto amplificado na reação de nestedPCR foi adicionada a 3,0µl de tampão de amostra (0,5% azul de bromo fenol e 20%
de glicerol), incluindo o controle ”branco” e um marcador de peso molecular de 1Kb
(Invitrogen), corado com brometo de etídeo (5 µg/ml). Colocou-se o gel submerso
em cuba horizontal de eletroforese, com tampão TBE 1X, sob tensão elétrica de 100
Volts, aproximadamente por 40 minutos, até que o marcador chegasse ao final do
gel, visualizado sob a luz ultravioleta (UV) e fotografado para documentação (Figura
19
1). Os resultados esperados para o fragmento do gene da RT e peso molecular são
de 600pb.
1kb
600pb
Figura 1. Gel de Agarose: Gene RT 600bp, marcador 1Kb
3.8.4 Protocolo de Purificação, Precipitação e Seqüenciamento
Para análise do produto da PCR e seqüenciamento, os fragmentos
amplificados foram purificados para a eliminação de substâncias não incorporadas
durante a reação de amplificação. Para isso, utiliza o mix de enzimas EXO-SAP
(Exonuclease-Fosfatase Alcalina de Camarão, GE Healthcare Life Sciences), e
precipitação para o modelo de Seqüenciador Automático “MEGA BACE 1000”
(Amershan Pharmacia Biotech). Esses procedimentos são baseados no método
original de Sanger et al.(1977), de acordo com o protocolo:
1 Purificação
ENZIMA PURIFICAÇÃO
TERMOCICLADOR
0,34µL de EXO (3,3U)
→
30min:37ºC
0,66µL de SAP (0,66U)
→
15min:80ºC
→
Para 6,0 µL do produto de PCR
20
Obs: Após a purificação, o produto fica pronto para reação de seqüenciamento.
2 Reação de Seqüenciamento
Para o seqüenciamento, utilizamos as seguintes condições de reação: 3050ng de DNA, com a adição de um dos iniciadores para seqüenciamento (senso,
anti-senso), em concentração de 5,0 pmoles/µL, para um volume final de 10,0µL, de
acordo com o modelo abaixo:
Reagentes
Quantidade Quantidade para 01 placa
H2O Mili-Q
4,0µL
X 105 =420,00
Pré-mix
2,0µL
X 105 =210,00
Primer (5pmol/uL)
1,0µL
X 105 =105,00
DNA (PCR)
3,0µL
------
Volume final
10 µL
Para esse processo utilizou-se um termociclador, com programação, descrita
nas condições: 95º C/25 seg; 95ºC/15 seg; 55ºC/20 seg; 60ºC/1:20 min. 35 ciclos;
4ºC ∞.
3 Precipitação da Reação de Seqüenciamento
Para 10,0µl da reação utiliza 1,0 µL de acetato de amônia, com 27,5 µL de
etanol absoluto.
A esta precipitação com acetato de amônio, adiciona de 1,0µL de acetato de
amônio, centrifugando rapidamente. A seguir, adicionou-se 27,5µL de etanol
absoluto, selando-se a placa e homogeneizando-se vigorosamente por 1min. Depois
incubando-se por 20min, à temperatura ambiente, com proteção da luz; em seguida,
centrifugou-se por mais 40min, a 4.000g/4o C. A seguir virou-se a placa de uma vez;
adicionou-se 120,0µL de etanol 70% em cada poço, a placa foi selada e
homogeneizada por alguns segundos; depois centrifugou-se novamente por 10 min,
21
14.000g/4oC, virou-se novamente a placa e centrifugando novamente, num pulso de
alguns segundos, com a placa invertida (não superior 700g de rotação).
Por fim, deve-se deixar secar, até evaporamento total do etanol (15 minutos),
adicionando 10µl de tampão da amostra, homogeneizando e selando a placa.
Centrifugou-se em pulso de alguns segundos (máximo de 700g). Após essa
precipitação, ressuspende o precipitado em tampão 1X, conforme instruções do
fabricante do kit de seqüenciamento, inserindo-se a placa ao Seqüenciador
Automático “MEGA BACE 1000” (Amershan Pharmacia Biotech).
As seqüências de DNA do HIV-1 foram visualisadas primeiramente no
programa BioEdit 7.0.5.3, com os contigs ajustados no software DNAStar/SeqManII
(DNAStar, Madison,Wisconsin, USA). A genotipagem e as interpretações das
mutações no gene da RT, que conferem resistência aos antiretrovirais foram
submetidas
por
meio
eletrônico
para
a
base
de
dados
Stanford
(http://hivdb.stanford.edu/). As mutações foram reunidas de acordo com o consenso
firmado na International AIDS Society–USA. As seqüências genéticas do HIV-1,
obtidas neste estudo serão submetidas ao depósito na base de dados do GenBank.
22
4 RESULTADOS
Para o estudo foram selecionados 110 pacientes, recém diagnosticados ou
crônicos, virgens de tratamento. Dentre os pacientes, 85 (77,3%) colheram sangue
para a análise molecular; os outros 25 (22,7%) casos não compareceram para a
coleta.
Em relação à análise molecular e seqüenciamento das amostras, tivemos 82
(96,5%) amplificadas, 52 (61,2%) seqüenciadas, onde: 8 (15,4%) eram crônicos, e
44 (84,6%) recém-diagnosticados, virgens de tratamento (Figura 2).
44 (85%)
recém-diagnosticados
8 (15%)
crônicos
Figura 2. Distribuição dos pacientes crônicos e recém-diagnosticados, segundo as
categorias.
A idade dos pacientes variou de 22 a 61 anos, sendo a média de idade, 34,9
anos, e a mediana, de 34 anos. A maioria dos pacientes, 23 (44,2%) tinha 22 a 30
anos de idade (Tabela 2).
23
Tabela 2. Distribuição dos pacientes HIV positivos, segundo a idade.
Idade (anos)
N
%
22---- 30
23
44,2
30---- 40
12
23,1
40---- 50
14
26,9
50---- 61
3
5,8
Total
52
100,0
O número de parceiros sexuais dos pacientes HIV positivos que participaram
do estudo, variou de 1 a 200 parceiros, sendo que alguns não se lembravam da
quantidade. Estes números estão relacionados ao último ano do presente
atendimento ambulatorial sendo que 17 (32,7%) tiveram entre 2 e 6 parceiros; 14
(26,9%) apenas um parceiro; 6 (11,5%) entre 6 e 12 parceiros; 5 (9,6%) entre 12 e
30 parceiros; 3 (5,8%) entre 30 e 200 parceiros. Os que não se lembravam do total
de parceiros correspondia a 7 (13,5%) (Tabela 3).
Tabela 3. Distribuição dos pacientes HIV positivos, segundo o número de parceiros
sexuais.
Número de parceiros sexuais
N
%
1
14
26,9
2---- 6
17
32,7
6---- 12
6
11,5
12---- 30
5
9,6
30---- 200
3
5,8
Não Lembra
7
13,5
Total
52
100,0
Em relação à categoria de exposição e uso de drogas injetáveis, nenhum
deles era usuário, nem tinham feito transfusão sangüínea. Desses 52 pacientes, 18
24
(34,6%) eram do sexo feminino, e 34 (65,4%) do sexo masculino, com proporção
entre homens e mulheres de 2:1. Dentre os 52 pacientes, 40 (76,9%) eram
heterossexuais e 12 (23,1%) eram homossexuais.
Através da genotipagem para o HIV-1, o gene da transcriptase reversa na
posição 5’ 3’ (primer RT 1-RT 4) das 52 amostras amplificadas, revelou: 48 (92,4%)
para o subtipo B, 2 (3,8%) para o subtipo F e 2 (3,8%), para o subtipo C. Até o
presente momento, o subtipo C do HIV-1 não tinha sido detectado no Estado do
Amazonas (Figura 3).
2 C (4% )
2 F 1 (4% )
48 B (92% )
F ig ura 3. S ubtipos HIV-1 no E s tado do Amaz onas , B ras il
A pesquisa da resistência primária aos Inibidores de Transcriptase Reversa
Nucleosídeos (NRTIs) (zidovudine, didanosine, lamivudine, abacavir, stavudine,
tenofovir disoproxil fumarate e emtricitabine) demonstrou: que 6 (11,5%) dos 52
pacientes apresentaram mutações de resistência, todos recém-diagnosticados;
sendo quatro dessas seis mutações de resistência susceptíveis a todos NRTIs
(Figura 3).
Os outros dois pacientes apresentaram potencial resistência de baixo nível ao
ABC, AZT, d4T e ddI da classe dos NRTIs, distribuídos de acordo com a mutação na
posição F77L.
25
Freqüência de Mutações de Resistência NRTIs
1
Q151R
1
K70S
2
V118I
2
F77L
46
não
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Figura 4. Freqüências de mutações para os NRTIs em 52 pacientes virgens de
tratamento.
Dessas mutações de resistência apresentadas após seqüenciamento
genotípico para os NRTIs, verificamos que todas foram do subtipo B, não foram
caracterizada mutações de resistência para os subtipo C e F (Tabela 4).
Tabela 4. Total das 52 genotipagens realizadas para os NRTIs, mutações de
resistência de acordo com os subtipos caracterizados.
NRTI
B
C
F
Total geral
F77L
2
-
-
2
K70S
1
-
-
1
V118I
2
-
-
2
Q151R
1
-
-
1
Não
46
-
-
46
26
Total geral
52
A pesquisa da resistência primária aos Inibidores de Transcriptase Reversa
Não Nucleosídoes (NNRTIs) (nevirapine, delavirdine, efavirenz e o etravirine
TMC125), evidenciou: 6 (11,5%) pacientes com mutações de resistência; dois
desses seis pacientes eram susceptíveis a todos ARVs da classe dos NNRTIs; três
apresentaram resistências potenciais de nível baixo a intermediário para todos os
ARVs NNRTIs; sendo uma das mutações caracterizadas para um paciente crônico,
com alta resistência para efavirenz e nevirapine, o qual apresentou três mutações
nas posições K101E, V108I, G190A (Figura 5).
Freqüência de Mutações de Resistência NNRTIs
1
E138D
1
K103R, E138K
1
K103R
1
V108I
1
V179D
1
K101E, V108I, G190A
46
não
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Figura 5. Freqüências de mutações para os NNRTIs em 52 pacientes virgens de
tratamento.
27
Dessas mutações de resistência apresentadas após seqüenciamento
genotípico para os NNRTIs, verificamos que todas foram do subtipo B, não foram
caracterizada mutações de resistência para os subtipo C e F (Tabela 6).
Tabela 5. Total das 52 genotipagens realizadas para os NNRTIs, mutações de
resistência de acordo com os subtipos caracterizados.
NNRTI
B
C
F
Total geral
V179D
1
-
-
1
K101E, V108I, G190A
1
-
-
1
V108I
1
-
-
1
K103R
1
-
-
1
K103R, E138K
1
-
-
1
E138D
1
-
-
1
Não
46
-
-
46
Total geral
52
Em resumo, caracterizamos um total de 12 (23,0%) (95% CI: 12,5 – 36,8)
mutações de resistência nas amostras dos 52 pacientes analisados, pois aqueles
que apresentaram mutações para a classe NRTIs, não foram os mesmos para os
NNRTIs.
Todos os subtipos caracterizados, foram identificados, segundo protótipo
universal do vírus HIV-1, do genoma isolado “HXB2” (GenBank accession number
KO3455). Para o genotipo foram utilizados as seqüências referência depositadas, no
HIV sequence database (http://www.hiv.lanl.gov/content/hiv-db/PEPTGEN/Gag_Con)
do grupo M, Con_B, Con_A, Con_C, Con_D, Con_F1, Con_F2, Con_G, Con_H,
Con_J, Con_K, Con_O. As mutações de resistência foram comparadas ao banco de
dados do portal da Universidade de Stanford (http://hivdb.stanford.edu).
Para comparação das seqüências obtidas foi realizado um alinhamento
nucleotídico no programa BioEdit (HALL, 1999), utilizando o algoritmo Clustal W
(Figura 6). Também foi efetuada uma análise filogenética no programa MEGA
28
(KUMAR, et al., 2004), comparando a outras seqüências referências dos subtipos do
HIV-1 disponíveis no GenBank (Figura 7).
330
340
350
360
310
320
280
290
300
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AM01RT
AM02RT
AM03RT
AM04RT
AM05RT
AM06RT
AM07RT
AM08RT
AM09RT
AM10RT
AM11RT
AM12RT
AM13RT
AM14RT
AM15RT
AM16RT
AM17RT
AM18RT
AM19RT
AM20RT
AM21RT
AM22RT
AM23RT
AM24RT
AM25RT
AM26RT
AM27RT
AM28RT
AM29RT
AM30RT
AM31RT
AM32RT
AM33RT
AM34RT
AM35RT
AM36RT
AM37RT
AM38RT
AM39RT
AM40RT
AM41RT
AM42RT
AM43RT
AM44RT
AM45RT
AM46RT
AM47RT
AM48RT
AM49RT
AM50RT
AM51RT
AM52RT
GGGTGATGCATATTTTTCAGTTCCCTTAGATGAAGACTTTAGAAAGTATACTGCATTTACCATACCTAGCACAAACAATGAGACACCAGG
...............................A.G..A..C..G..A.......................T.T..................
A.........................................G.....C....................T...........A........
............................A..........C..G..........................T....................
...............................A.......C..G..........................T....................
............................A..........C..G..........................T....................
.......................................C..G..........................T....................
...............................A.......C..G..........................T...........A........
.........C.........A.............G..A..C..G.................A........T.T...T..............
...............................A.......C..G..........................T.....T..............
............C...........A......A.......C...........A.................T.T.........A........
...G.................C...........G..T.....G.....C........C...........TGTC.................
............................C..........C..G...........T..............TGT..................
.T..........C..................A.......C..G..A.....G.................T.T.........A........
...........................GA..A....TC.C..................T..........T...........A........
................................C......C..G..............C...........T....................
.......................................C..G..A...........C...........T.T..................
.........C..................C....G.....C..G..........................T...........A........
...G.................A.............G......G..A.....A.....C...........T...........A........
.......................................C..............G....................T..............
...............................A....A..C..G...............................................
...................A...........A.......C..G.....C....................T.....T..............
...A...................................C..G..........................T....................
........................T......A.......C..G..........................T.T..................
...G.................A............AG......G..A...........C...........T.T.........A........
...A...................................C..G..........................T.G..................
...G.................C.........A....G.....G.....C........C...........TCTC........A........
...G.......................G..CA....A..C..G..........................T....................
...G.................A..T.................G..............C...........T...........A........
............................TG.........C..G..A.......................T.T..................
.....................G.........A.......C..G..........................T....................
.....................C.................C..G.......................G..T.T.........A........
.....................A..T......A....A..C..G.................T.....C..T.T...............T..
A.............................CA.G.....C..G..............C.............T..................
...............................AG......C..G.......................C..T....................
.......................................C..G..........................T.T..................
.....................G.........A.......C..G..............C...........T....................
...............................A....A..C..G..........................T.....T..............
...............................A.......C..G..........................T.T......C...........
...............................AG......C..G..............C...........T....................
........................A......A.......C..G..A.......................T.T..................
...............................A.......C..G..........................T.T..................
............................C..........C..G..........................T.T...T.....A........
...............................A....T..C..G..........................T.T........C.........
........................T..............C..G..........................T....................
...............................A.......C..G..........................T...........A........
A..............C........A.....CA.......C..G..............C................................
.......................................C..G..........................T.T.......A..........
...A...........................A.......C..G..........................T....................
...............................A....A..C..G..A.......................T.T.........C........
.......................................C..G.......................G..T.T...............G..
...............................AG......C..G..A.....G.................T...........A........
Figura 6. Alinhamento das seqüências de transcriptase reversa das amostras de
HIV obtidas nesse estudo. São mostradas posições entre os nucleotídeos 271 e 360
referentes à amostra AM01RT.
29
AM19RT
B/C ?
AM25RT
C
92BR025
AM29RT
F2
MP255
MP411
F
F1
AM12RT
AM27RT
AM26RT
AM23RT
AM49RT
HXB2
AM13RT
AM17RT
AM36RT
AM48RT
AM01RT
AM20RT
AM34RT
AM47RT
AM02RT
AM41RT
AM50RT
AM08RT
AM46RT
AM11RT
AM14RT
AM52RT
B HIV-1
AM03RT
AM07RT
AM04RT
AM06RT
AM31RT
AM37RT
AM05RT
AM16RT
AM35RT
AM40RT
AM09RT
AM18RT
AM30RT
AM43RT
AM15RT
AM10RT
AM22RT
AM38RT
AM21RT
AM28RT
AM24RT
AM33RT
AM42RT
AM45RT
AM32RT
AM51RT
AM39RT
AM44RT
SIV
MM239
0.05
Figura 7. Árvore filogenética das seqüências caracterizadas no estudo. A
confiabilidade foi obtida através da análise de bootstrap (100 réplicas).
30
A partir dos resultados da análise filogenética foi observado uma possível
recombinação entre os subtipos B e C, na amostra AM25RT. Essa amostra havia
sido classificada como subtipo B pela análise no servidor da Universidade de
Stanford, porém foi agrupada junto as amostras do subtipo C na análise filogenética
(Figura 7). Devido a este fato foi realizado novo alinhamento da amostra AM25RT
frente a duas seqüências referências, a amostras HXB2 para o subtipo B e 92BR025
para o subtipo C (Figura 8).
10
20
30
40
50
60
70
80
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
HXB2 (B)
92BR025 (C)
AM25RT
tatttgccataaagaaaaaagacagtactaaatggagaaaattagtagatttcagagaacttaataagagaactcaagac
.............a..g..g...........g.............................c.....a......t.....
.............a..g..g.....c.....g.......................g.....a.....a............
90
100
110
120
130
140
150
160
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
HXB2 (B)
92BR025 (C)
AM25RT
ttctgggaagttcaattaggaataccacatcccgcagggttaaaaaagaaaaaatcagtaacagtactggatgtgggtga
..t.................g........c..a..........................g.................a..
..t.................g........c..a..........................g.................g..
170
180
190
200
210
220
230
240
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
HXB2 (B)
92BR025 (C)
AM25RT
tgcatatttttcagttcccttagatgaagacttcaggaagtatactgcatttaccatacctagtataaacaatgagacac
...............a..t..........g...t.....a...........c.......................a....
...............a............ag...t.....a...........c.......................a....
250
260
270
280
290
300
310
320
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
HXB2 (B)
92BR025 (C)
AM25RT
cagggattagatatcagtacaatgtgcttccacagggatggaaaggatcaccagcaatattccaaagtagcatgacaaaa
................a..t.................................t..........g.....t.c.......
................................................................................
330
340
350
360
370
380
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|...
HXB2 (B)
92BR025 (C)
AM25RT
atcttagagccttttagaaaacaaaatccagacatagttatctatcaatacatggatgatttgtatgt
...........c.....ggc............a...a.............t........c........
........t...........................................................
Figura 8. Alinhamento da amostra AM25RT frente às amostras referências para os
subtipos B e C. Sombreado verde indica região com maior similaridade com o
subtipo C; o sombreado marrom indica região com maior similaridade com o subtipo
B.
Destes, 52 amostras de pacientes foram utilizadas para análise molecular. Uma
parte desses pacientes, 19 (36,5%) já haviam apresentado uma ou mais
doenças/condições associadas a HIV/Aids, tais como: a diarréia, caquexia ou perda
de peso maior que 10% do peso; anemia, tuberculose pulmonar, tuberculose
ganglionar, pneumonia e herpes zoster. De acordo com o CDC, 1985 foram
classificados no grupo IV e subgrupos A, B, C, D e E (Tabela 6).
31
Tabela 6. Distribuição dos pacientes segundo a identificação dos subtipos virais e
mutações de resistência encontradas na análise genotipica, para o gene da
Transcriptase Reversa (RT).
ID
Estado Clínico
Carga Viral
CD4
Subtipo
Mutações
Mutações
CDC, EUA, 1987
(cópias/mL)
(Células/mm3)
HIV-1/AM
NRTI
NNRTI
AM01
A
140.000 cópias/mL
66 cel/mm3
B
-
-
AM02
A
180.000 cópias/mL
107 cel/mm3
B
F77L
-
AM03
-
18.000 cópias/mL
-
B
-
-
AM04
-
60.000 cópias/mL
-
B
-
-
AM05
-
35.000 cópias/mL
-
B
-
-
AM06
-
350.000 cópias/mL
-
B
-
-
AM07
-
230.000 cópias/mL
-
B
-
-
AM08
-
> Lim. Máx.
-
B
K70S
-
AM09
-
58.000 cópias/mL
-
B
V118I
-
AM10
-
97.000 cópias/mL
-
B
-
V179D
AM11
-
50.000 cópias/mL
-
B
-
-
AM12
-
59.000 cópias/mL
AM13
A
65.000 cópias/mL
AM14
-
17.000 cópias/mL
AM15
A
12.000 cópias/mL
80 cel/mm3
AM16
A
12.000 cópias/mL
AM17
A
3.100 cópias/mL
AM18
-
5.400 cópias/mL
-
AM19
-
97.000 cópias/mL
AM20
-
4.800 cópias/mL
AM21
-
AM22
-
AM23
C
17.000 cópias/mL
AM24
A
54.000 cópias/mL
AM25
-
10.000 cópias/mL
AM26
-
AM27
-
AM28
AM29
-
F
-
-
B
-
-
B
-
-
B
-
-
102 cel/mm3
B
-
-
120 cel/mm3
B
-
-
B
-
-
-
C
-
-
-
B
-
-
110.000 cópias/mL
-
B
-
-
5.400 cópias/mL
-
B
V118I
-
189 ce/mm3
B
-
-
90 cel/mm3
B
-
-
-
B/C ?
-
-
14.000 cópias/mL
-
B
-
-
53.000 cópias/mL
-
F
-
-
-
10.000 cópias/mL
-
B
-
-
-
270 cópias/mL
-
C
-
-
AM30
A
3.100 cópias/mL
553 cel/mm3
B
-
K101E, V108I, G190A
AM31
C
< Lim. Min.
115 cel/mm3
B
-
-
AM32
-
1.200 cópias/mL
-
B
-
-
AM33
-
100 cópias/mL
-
B
-
-
AM34
-
840 cópias/mL
-
B
-
-
AM35
-
29.000 cópias/mL
-
B
-
-
AM36
C
< Lim. Min.
B
F77L
-
69 cel/mm3
-
53 cel/mm3
AM37
-
390 cópias/mL
B
-
-
AM38
A
5.800 cópias/mL
110 cel/mm3
-
B
-
-
AM39
A
170 cópias/mL
308 cel/mm3
B
-
-
AM40
A
< Lim. Min.
25 cel/mm3
B
-
-
AM41
A
68.000 cópias/mL
575 cel/mm3
B
-
-
AM42
A
< Lim. Min.
386 cel/mm3
B
-
-
32
AM43
-
18.000 cópias/mL
B
-
V108I
AM44
C
65.000 cópias/mL
332 cel/mm3
-
B
-
-
AM45
A
920 cópias/mL
317 cel/mm3
B
-
-
AM46
-
11.500 cópias/mL
-
B
-
-
AM47
-
< Lim. Min.
-
B
-
K103R
-
B
-
K103R, E138K
B
-
-
AM48
-
5.400 cópias/mL
AM49
A
67.000 cópias/mL
AM50
-
150.000 cópias/mL
-
B
-
E138D
AM51
-
17.000 cópias/mL
-
B
Q151R
-
AM52
-
50.000 cópias/mL
-
B
-
-
84 cel/mm3
Algumas associações entre as manifestações clínicas encontradas, sugere o
início de tratamento, principalmente aqueles pacientes que estiveram com
resultados de Contagem de Linfócitos T-CD4+ entre 500 e 350 células/mm3.
Encontramos dois pacientes que apresentaram manifestações associadas ao
resultado laboratorial de monitorização limite para iniciamento de tratamento. Um
desses pacientes (AM30), além dessas manifestações, apresentou resistência
primária, a partir de três mutações com alto nível de resistência aos NNRTIs.
33
5 DISCUSSÃO
Neste estudo foram avaliados os aspectos moleculares e a possibilidade de
resistência aos antiretrovirais do Vírus da Imunodeficiência Humana Tipo 1 (HIV-1),
em 52 pacientes crônicos ou recém-diagnosticados, virgens de tratamento. Todos os
enfermos foram diagnosticados e atendidos na Fundação de Medicina Tropical do
Amazonas FMT-AM.
Os subtipos encontrados através da genotipagem para HIV, corresposnde ao
gene da RT; em sua maioria era do subtipo B (48/52): duas para o subtipo F1 (2/52)
e duas para o subtipo C (2/52). O subtipo C ainda não havia sido encontrado no
Estado do Amazonas. Vicente, et al. em 1999, nesta mesma região, verificou que a
proporção entre os subtipos B e F eram idênticas (1:1), diferindo dos padrões
encontrados nas grandes cidades do sudeste do Brasil. Chama atenção, a grande
variabilidade genética que o HIV-1 sofreu no decorrer dos anos.
Tanuri, et al., em 1999, em estudo para avaliar a variabilidade e
susceptibilidade genética aos Inibidores de Protease, em 66 pacientes sem
tratamento antiretroviral prévio, distribuídos em diversas regiões do País, verificaram
44 subtipo B e 17 subtipo F, correspondente a mutações de resistência nas posições
82V, 88N, e 90L para os PIs (nelfinavir, ritonavir, indinavir e saquinavir), todas para o
subtipo B. Em nossa investigação, verificamos mutações de resistência aos NRTIs e
NNRTIs, com 12 mutações para o subtipo B, nenhuma para os subtipos C e F.
Quando se analisa a susceptibilidade frente esses subtipos encontrados no Brasil, a
maioria é para o subtipo B, o mais prevalente no País.
Proietti, et al., em 1999, verificou a variação genética em 11 pacientes
procedentes de Minas Gerais: 10 isolados pertenciam ao subtipo B, e uma
recombinação entre os subtipos B/F. Em nosso estudo havia 48 subtipos B, 2
subtipos F1 e 2 subtipos C. Ainda verificamos em nossos resultados a possibilidade
de uma CRF entre os subtipos B e C. Sabe-se que em regiões onde circulam mais
de um subtipo, a probabilidade de se encontrar essas CRFs é bastante significante.
34
Brites, et al., em 2001, no estudo de 46 pacientes HIV positivos, na Bahia,
verificou que 13/40 (33%) desses doentes apresentavam uma mutação de
resistência para o AZT – estes ainda não haviam iniciado o tratamento; outros 6/40
(13%) pacientes sob tratamento ARV, não apresentaram nenhuma mutação. Além
da resistência ao AZT, verificamos em nosso estudo a presença da resistência
primária para ABC, d4T e ddI entre os NRTIs.
Soares, et al., em 2004, avaliou 41 pacientes que ainda não haviam iniciado
terapia ARV, em diferentes períodos e regiões distintas do Rio de Janeiro. Todas as
amostras eram do subtipo B (1987-1994, 1998, 2001, 2000-2002), e quando
analisadas para as mutações de resistência aos NRTIs, NNRTIs e PIs, em
comparação aos pacientes que já haviam iniciado tratamento ARV, verificaram que
66% das resistências eram para pacientes em regime ARV; aos PIs, houve
porcentagem de mutação baixa em relação as primárias adquiridas, de baixo nível
potencial de resistência tanto para NRTIs, NNRTIs e PIs. Em nosso estudo
verificamos a presença de três mutações de alta resistência aos NNRTIs (K101E,
V108I, G190A) em um de nossos pacientes virgens de tratamento, com o subtipo B,
sugerindo que este caso havia se infectado com cepas resistentes.
Cerqueira, et al., em 2004, em 19 pacientes, distribuídos entre virgens de
tratamento e que haviam iniciado terapia ARV, observaram 17 (89,5%) subtipos B e
2 (10,5%) subtipos F1 com seis mutações de resistência para PI, 2 primárias e 4
secundárias, num total de 8 mutações relacionadas aos inibidores de transcriptase
reversa. Nossos resultados são similares em relação ao subtipo B (92,4%) e F1
(3,8%), diferencian dos casos de subtipo C encontrados. Também resultamos em
12 mutações de resistência aos NRTIs e NNRTIs.
Em outro estudo, feito também por Cerqueira, et al., 2004, Brasília, com 45
pacientes sem terapia ARV, todos tinham o subtipo B, com 39 (84%) mutações de
resistência para PI e RT, com prevalência dessas mutações de 16 (36%) pacientes
para NRTI e 14 (31%) pacientes para NNRTI. Em relação ao subtipo mapeado
nossos resultados são similares, quanto as mutações de resistência apresentadas,
tivemos nas posições K70S e V118I aos NRTIs, e K103R e G190A aos NNRTIs nos
casos avaliados. Além disso, com a associação das mutações K101E, V108I,
35
G190A, acarretou alto nível de resistência para DLV, NVP e EFV em um de nossos
pacientes.
Soares EA, et al., em 2005, com 85 pacientes HIV positivos procedentes do
Rio Grande do Sul, verificaram aumento do subtipo C naquele Estado: 38 (45%)
eram subtipo C e 35 (42%) subtipo B; com uma mutação de resistência
caracterizada. Em nossos pacientes parece haver início de disseminação do subtipo
C, pois encontramos dois pacientes que apresentaram esse subtipo.
Barreto CC, et al., em 2006, no Estado de São Paulo, com 341 (64%) HIV
positivos, entre estes haviam candidatos a doadores de sangue, observaram: 277
(81,2%) subtipo B, 25 (7,3%) subtipo F e 13 (3,8%) subtipo C, com porcentagem de
12,7% de resistência aos inibidores de NRTI, NNRTI e PI. Quando comparamos com
nossos dados, verificamos semelhança entre os subtipos encontrados, na sua
maioria B, seguidos de F e C. Em relação à resistência aos ARVs, nossos achados
revelaram uma porcentagem de 12 (23%) pacientes com resistência aos inibidores
NRTI e NNRTI.
Cabral, et al., 2006, em 97 amostras de pacientes virgens de tratamento no
Espírito Santo, observaram 73 (75,3%) subtipo B, 9 subtipo F (9,3%), 3 subtipo C
(3,1%), e 6 (12,4%) recombinações entre os subtipos B/F e F/C; nesta população
não foi visto as mutações relacionadas a resistência primária. Nossos dados em
relação à avaliação resistência primária e subtipos encontrados entre os pacientes
são similares aos encontrados por Cabral. Além disso, verificamos após análise
filogenética uma possível CRF entre os subtipos B e C, em uma das amostras.
Medeiros, et al., em 2006, Pernambuco, com 84 pacientes virgens de
tratamento, observou: 3 mutações de resistência para os NRTIs; 2 (2,4%) M41L e 1
(1,2%) K219E. Não houve mutação de resistência para NNRTIs e PIs. Encontrados:
61 subtipos B (72,6%), 19 F (22,6%), 1 subtipo C (1,2%) e três recombinações entre
os subtipos B/F (3,6%). Em relação as CRFs não houve comparação em nossos
achados. As mutações de resistência encontradas aos NRTIs, foram nas posições
F77L, K70S, V118I e Q151R. Existindo, ainda, em um de nossos pacientes a
resistência de potencial nível a intermediária a ABC, AZT, d4T e ddI, com mutação
36
na posição F77L. Ressaltando que essa mutação F77L na ausência de Q151M, não
compromete o tratamento ARV aos NRTIs.
Queiroz, et al., 2007, em Santa Catarina, verificou que a prevalência do
subtipo C tem aumentado no Brasil. O Estado de Santa Catarina tem uma das
incidências mais alta do país. Este estudo revelou que 48% eram subtipo C, e 23%
subtipo B. Possíveis formas recombinantes foram caracterizadas para B/C (23%) e
B/F (6%). No Estado do Amazonas, tivemos o predomínio do subtipo B (48/52), 2
subtipos F e C, respectivamente, mostra a disseminação e variabilidade genética do
HIV-1 em nosso meio. O subtipo C é um subtipo virulento em relação aos demais do
grupo M. Também podemos comparar a CRF entre os subtipos B/C, o qual foi
encontrado para um de nossos pacientes.
Ao término do alinhamento de nossas seqüências feito com as três
referenciadas para os subtipos B, C e F, verificamos que a amostra AM25RT, antes
classificada para o subtipo B após análise no servidor da Universidade de Stanford;
que, quando feita análise filogenética, essa amostra teve maior proximidade para o
subtipo C. Dessa forma tivemos que utilizar de outra ferramenta a viral genotyping
tool
(http://www.ncbi.nlm.nhi.gov/projects/genotyping/formpage.cgia)
para
confirmação deste achado, resultando o subtipo C; por esta razão sugerimos a CRF
entre os subtipos B/C. Santos, et al., 2006, realizou um estudo de recombinações
entre os subtipos, e também após análise filogenética, mostra resultados entre os
subtipos B/C. Utilizamos uma amostra desse estudo, subtipo C (92BR025) para
comparar com a AM25RT, e verificamos a similaridade dessa mesma amostra para
os subtipos B e C, reafirmando nossos achados (Figura 8).
Varella RB, et al., 2007, no Estado do Rio de Janeiro, em 71 amostras de
casos HIV/Aids, virgens de tratamento ARV, observaram após análise genotipica,
20
pacientes
recém-diagnosticados,
subtipo
B,
sem
nenhuma
resistência
medicamentosa. Nos outros 51, crônicos, 40 (78,4%) subtipo B, 7 (13,7%) subtipo F,
e 2 (3,9%) subtipo C,. Somente uma mutação de resistência foi encontrada (1,4%)
na posição M184V, demonstrando alta presença de polimorfismo, com relação as
baixas resistências primárias aos ARVs nesse grupo. Comparados esses resultados
37
aos de nosso estudo, verificamos um índice maior de resistência primária no Estado
do Amazonas, com 12 (23,0%) mutacões de resistência para os NRTIs e NNRTIs.
Sá-Ferreira JA, et al. 2007, em 74 amostras de pacientes do Estado do Rio de
Janeiro, 21,6% eram amostras de candidatos a doadores de sangue recémdiagnosticados, verificando que o subtipo B, correspondia a 83,8%, o subtipo F a
2,7%, e mosaicos entre B/F 11%; uma amostra evidenciou mutação com alto níivel
de resistência para NRTI (M41L e T215S). Para os NNRTIs e PIs nenhuma mutação
de resistência foi encontrada. Nossos resultados, revelaram três mutações (K101E,
V108I, G190A) em amostra de um paciente crônico, virgem de tratamento,
ocasionando um nível de alta resistência ao EFV e NVP para a classe dos ARVs
NNRTIs.
Bello G., et al. 2007, do Instituto Oswaldo Cruz-RJ, fizeram um levantamento
da história demográfica dos subtipos B e F do vírus HIV-1 no Brasil. Até o momento,
a maior parte dos pacientes apresenta infecção pelo subtipo B. Já foram também
detectados os subtipos C, D e F, assim distribuídos por região: o subtipo C é
encontrado no Pará, Goiás, Rio Grande do Sul, Santa Catarina, São Paulo, Bahia,
Alagoas e Rio de Janeiro; o subtipo F, no Amazonas, Pará, Alagoas, Bahia, Minas
Gerais, Goiás, Rio de Janeiro, São Paulo e Santa Catarina; o subtipo D, no Rio de
Janeiro, Bahia, Pernambuco e Pará. Neste contexto novamente gostaríamos de o
subtipo C, identificado pela primeira vez no Estado do Amazonas, modificando,
assim, a distribuição dos subtipos de HIV-1 em nosso país.
A resistência primária em 12 (23%) pacientes de nosso estudo, é outro
aspecto que julgamos importante ressaltar, pois, os percentuais de resistência no
Brasil eram de 7% no ano de 2000 (DIAZ, et al, 2003).
Nosso trabalho, apesar de a amostra ser relativamente pequena em relação
ao total de doentes em registro ativo no Estado, indica que fatos novos estão
ocorrendo. O diagnóstico de subtipos C, pela primeira vez ,é preocupante, face à
sua virulência, principalmente naqueles pacientes que ainda não iniciaram
tratamento. A resistência aos antiretrovirais, também aponta para que sejam
redobrados os cuidados na aderência dos pacientes sob tratamento.
38
Sugerimos, também, a continuidade de estudos, que possibilitem melhor
avaliação dos principais subtipos de vírus e resistência medicamentosa, pois são
essenciais para que o Programa de Controle de DST/Aids, possa dar propostas
adequadas aos clínicos que diagnosticam casos novos, e acompanham pacientes a
longo prazo.
39
6 CONCLUSÃO
1) Quando associamos os genótipos encontrados com o estágio clínico dos
pacientes que ainda não haviam iniciado terapia antiretroviral, verificamos que
somente um caso, subtipo B, apresentou um nível alto de resistência aos
antretrovirais NNRTIs, bem como o resultado de contagem de linfócitos T-CD4+,
sugestivo de tratamento. Os demais ficaram associados a infecções agudas para o
HIV, devido ao resultado de contagem dos linfócitos T-CD4+ não ultrapassarem 500350 células/mm3, limite baseado para início de tratamento.
2) A caracterização das mutações de resistência (resistência primária) encontrada foi
alta em relação a outros estudos brasileiros; pois, além das 12 (23%) resistências
encontradas em 52 pacientes, verificamos, alta resistência aos ARVs NNRTIs em
um desses pacientes, virgem de tratamento – este paciente tem sido internado
varias vezes em decorrência de intecorrências relacionadas à AIDS.
3) Em relação à genotipagem, caracterizamos as formas circulantes para o grupo M
do HIV-1, os subtipos B, F1 e C. Esta é a primeira vez, que se identifica o subtipo C
em pacientes procedentes do Estado do Amazonas. Além, da possível CRF B/C
encontrada em um de nossos pacientes.
4) Apesar do número limitado de pacientes, os dados de resistência primária em 12
(23%) pacientes é preocupante, indicando que mais enfermos devam ser avaliados,
para que se tenham dados mais robustos, inclusive em relação a resistência
secundária.
5) Através deste trabalho, foi dado início a implantação da genotipagem e avaliação
da resistência primária aos antiretrovirais na FMT-AM. Este fato, para nós, é
importante, pois, até o momento todas as amostras de sangue para genotipagem
são enviadas para fora do Estado, com demora de vários meses e conseqüentes
prejuízos para o tratamento adequado dos pacientes.
40
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