universidade federal da bahia escola de medicina
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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA ESCOLA DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL NOS TRÓPICOS MESTRADO AVALIAÇÃO DO INFILTRADO MACROFÁGICO NOS CARCINOMAS MAMÁRIOS DE CADELAS E SUA CORRELAÇÃO COM A TAXA DE SOBREVIDA. CARLOS HUMBERTO DA COSTA VIEIRA FILHO SALVADOR – BAHIA MARÇO/2015 II UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL NOS TRÓPICOS AVALIAÇÃO DO INFILTRADO MACROFÁGICO NOS CARCINOMAS MAMÁRIOS DE CADELAS E SUA CORRELAÇÃO COM A TAXA DE SOBREVIDA. CARLOS HUMBERTO DA COSTA VIEIRA FILHO Medicina Veterinária SALVADOR – BAHIA MARÇO – 2015 III CARLOS HUMBERTO DA COSTA VIEIRA FILHO AVALIAÇÃO DO INFILTRADO MACROFÁGICO NOS CARCINOMAS MAMÁRIOS DE CADELAS E SUA CORRELAÇÃO COM A TAXA DE SOBREVIDA. Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciência Animal nos Trópicos, da Universidade Federal da Bahia, como requisito para a obtenção do título de Mestre em Ciência Animal nos Trópicos. Orientador: Profa. Dra. Alessandra Estrela Lima Co-orientadora: Prof. Dra. Stella Maria Barrouin Melo SALVADOR-BA MARÇO/2015 IV “Nossas dúvidas são traidoras e nos fazem perder o que, com freqüência, poderíamos ganhar, por simples medo de arriscar.” Willian Shaekspeare “Vim, vi e venci”. Júlio César V Agradeço a minha querida família, minha mãe e meu pai, por me permitirem buscar meus sonhos e alcançar meus objetivos, e por me oferecerem apoio sempre. VI AGRADECIMENTOS A Deus, por me proteger e me guiar durante todos esses anos. A minha mãe, ao meu pai, minha irmã e familiares por tudo, carinho, apoio e dedicação. Ao meu avô Argone (in memorian), que sei estar feliz por esta minha realização e me guiando da melhor forma possível. Aos meus orientadores, pais e amigos de estágio, iniciação científica, monografia, residência e mestrado durante esses 08 anos de Patologia Prof. Eduardo Luiz Trindade Moreira e Profa. Alessandra Estrela Lima, que acreditaram em meu potencial e me proporcionaram a oportunidade de expandir meus conhecimentos e concluir mais esta etapa na minha vida. A Suélen, pelo carinho e compreensão nesses anos em que estamos juntos. Te amo! A Karine e Lorena, eternas irmãs patológicas, pelo apoio e auxílio no desenvolvimento deste trabalho mesmo distantes. Ao Prof. Tiago Peixoto, que apesar de pouco tempo em contato como residente me passou muito conhecimento e sempre está a disposição para discussão de casos interessantes. A todos os companheiros de pós-graduação (Mario Jorge, Keidy, Michelle, Dani, Muller, Aline e Ariane) que me ajudaram no desenvolvimento deste projeto, em especial a Marília por todo apoio e companheirismo durante essa jornada. As residentes Nara, Soraya (Soy), Adriana, Viviane e Virginia pela disposição e ajuda para a conclusão desse trabalho. VII As bolsistas PIBIC – Sheila e Ludmilla que ajudaram no desenvolvimento do projeto. Aos técnicos do LPV – Eva, Altemar, Williane, Zacarias e Washington pela disponibilidade para ajudar sempre que necessário nas atividades do laboratório. Aos estagiários do LPV – Ludmilla, Sheila, Thanielle, Jamile, Ane, Gilmar, Estela, Viviane, Virginia, Marcela. Gilmar e Simone pela disposição sempre que necessitei de ajuda. Aos Setores de Cirurgia e Clínica de Pequenos Animais do HOSPMEV/UFBA pelo apoio e disponibilização da sua estrutura para a realização do projeto. Aos meus amigos do bairro (Ednei, Edcarlos, Alexandre “Sapuia”, Alisson e Silvano) pelas horas de descontração para descansar a “cabeça” e voltar aos estudos, entendendo também meus momentos de ausência. A Profa. Stella Maria Barrouin pela co-orientação e apoio no desenvolvimento deste trabalho. A Emanoel (Guga) pela paciência, disponibilidade e grande ajuda na realização das análises estatísticas. As Instituições e Laboratórios parceiros no desenvolvimento do Projeto de neoplasias mamárias em cadelas – Centro de Pesquisa Reneé Rachou, LIVE-HOSPMEV/UFBA e LPC-UFMG. Aos professores e funcionários do Setor de Anatomia Veterinária da EMEVZ/UFBA por entenderem a minha necessidade de realizar o mestrado. A Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal da Bahia que me deu condições para realização desse trabalho. VIII LISTA DE FIGURAS Página Figura 1 Modelo da função das células na resposta imune inata e adquirida associadas ao câncer. 23 Figura 2 Migração de monócitos circulantes para o microambiente tumoral. 25 Figura 3 Papel protetor do receptor de progesterona na mama ao inibir a ativação do NF-κB. 30 Figura 4 Animais divididos em grupos a partir da presença ou ausência de metástase e em subgrupos pela utilização ou não de tratamento quimioterápico com a Carboplatina. 35 Figura 5 Clínica, cirurgia e tratamento quimioterápico. 37 Figura 6 Metástases de necroscópico. Figura 7 Avaliação macroscópica da cadeia mamária. 41 Figura 8 Critérios utilizados na graduação de tumores mamários de cadelas conforme o grau de malignidade. 42 Figura 9 Análise quantitativa do infiltrado inflamatório associado ao tumor. 44 Figura 10 Análise da imunomarcação com as proteínas SOCS1 e SOCS3 no infiltrado inflamatório macrofágico associado ao tumor. 46 Figura 11 Carcinoma em Tumor Misto Benigno (CaTMB) com metástase para linfonodo e análise morfológica e quantitaiva do infiltrado inflamatório associado a neoplasia. 51 Figura 12 Composição do infiltrado inflamatório associado ao CaTMB. 54 Figura 13 Caracterização da expressão das proteínas SOCS1 e SOCS3 no infiltrado macrofágico associado ao CaTMB em cadelas. 55 Figura 14 Expressão das moléculas MHCI e MHCII nos monócitos e densidade de macrófagos intratumorais no carcinoma em tumor misto. 59 Figura 15 Taxas de sobrevida dos animais com CaTMB. 60 CaTMB observadas durante exame 37 IX LISTA DE TABELAS Página Tabela 1 Intervalo de intensidade dos tipos celulares nos carcinomas mamários (ESTRELA-LIMA, 2011). 44 Tabela 2 Dados referentes aos anticorpos utilizados. 45 Tabela 3 Análise morfológica e quantitativa do infiltrado inflamatório macrofágico peri e intratumoral, associado com a presença ou ausência de metástase e tratamento. 50 Tabela 4 Associação entre parâmetros clinico- patológicos com intervalos distintos de macrófagos <400 ou ≥400. 53 Tabela 5 Análises univariada e multivariada dos parâmetros clínicopatológicos associados com o maior intervalo macrofágico (≥400). 61 X LISTA DE ANEXOS Página Anexo 1 Certificado de aprovação na CEUA (EMEVZ/UFBA) 72 Anexo 2 Ficha oncológica específica. 73 Anexo 3 Termo de doação para realização da necropsia. 75 Anexo 4 Tabela com os resultados da análise hematológica. 76 XI LISTA DE ABREVIATURAS BSA Albumina bovina sérica CaTMB Carcinoma em Tumor Misto Benigno cm Centímetro CD Cluster de diferenciação CEUA Comitê de Ética e Experimentação Animal CD4 Marcador de superfície celular da subpopulação de linfócitos T auxiliares COX-2 Ciclo-oxigenase 2 EDTA Ácido Etileno Diamino Tetracético EMEVZ Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia FACS Fluorecence Acitivated Cell Sorter FITC Isotiocianato de fluoresceína FL1 Fluorescência tipo 1 FL2 Fluorescência tipo 2 FL3 Fluorescência tipo 3 FSC Forward scatter (Tamanho celular) G Grama HE Hematoxilina-Eosina HER-2 Receptor de Fator de Crescimento Epidérmico 2 HOSPMEV Hospital de Medicina Veterinária XII ICB IMF LIVE LLD LLE MHCI Instituto de Ciências Biológicas Intensidade média de fluorescência Laboratório de Infectologia Veterinária Látero-lateral direita Látero-lateral esquerda Complexo Maior de Histocompatibilidade classe I MHCII Complexo Maior de Histocompatibilidade classe II Mg Miligramas mL Mililitro mm Milímetro m2 Metro quadrado OMS Organização Mundial de Saúde OSH Ovariossalpingohisterectomia PBS Salina tamponada com fosfato PE-Cy-5 Ficoeritrina conjugada com cianina pg Picograma R-PE Ficoeritrina rpm Rotações por minuto SOCS Supressor de sinalização de citocinas SSC Side Angle Light Scatter (Granulosidade celular) TMB Tetrametilbenzidina XIII UFBA Universidade Federal da Bahia UFMG Universidade Federal de Minas Gerais VD Ventro-dorsal μg Micrograma μL Microlitro μm Micrômetro n= Número de casos XIV SUMÁRIO Página Resumo Abstract 1. Introdução ................................................................................................... 17 2. Revisão de literatura .................................................................................. 19 2.1 Neoplasias mamárias em cadelas............................................................. 19 2.2 Inflamação e o câncer......................................... ..................................... 22 2.3 Macrófagos e neoplasias mamárias................... ...................................... 28 3. Hipóteses....................................................................................................... 32 4. Objetivos ...................................................................................................... 32 4.1 Objetivo geral .......................................................................................... 32 4.2 Objetivos específicos ............................................................................... 32 5. Materiais e Métodos ..................................................................................... 34 5.1 Seleção de animais e grupos experimentais............................................. 34 5.2 Avaliação clínica e mastectomia ............................................................. 35 5.3 Acompanhamento e sobrevida................................................................. 36 5.4 Imunofenotipagem do sangue periférico no contexto ex vivo................. 38 5.5 Biópsia excisional e histopatológico....................... ................................ 40 5.6 Caracterização da neoplasia............................ ........................................ 40 5.6.1 Classificação histopatológica................................. ................................. 40 5.6.2 Graduação histopatológica................................................................ 42 5.6.3 Análise morfológica e quantitativa do infiltrado inflamatório tumoral........................................... .................................................................. 43 5.7 Avaliação Imunoistoquímica......... ...................................................... 45 5.8 Tratamento quimioterápico ..................................................................... 47 5.9 Análise estatística..................... .............................................................. 48 6. Resultados e Discussão ................................................................................ 49 7. Conclusões ................................................................................................... 62 8. Referências ....................... ........................................................................... 63 9. Anexos ........................................................................................................ 72 XV Avaliação do infiltrado macrofágico nos carcinomas mamários de cadelas e sua correlação com a taxa de sobrevida. Resumo O infiltrado inflamatório no microambiente tumoral, em especial nos tumores mamários, tem despertado grande interesse na oncologia, por desempenhar diferentes funções na progressão ou regressão tumoral a depender dos tipos e subtipos celulares envolvidos. O presente estudo objetivou avaliar (1) a presença e intensidade de infiltrado macrofágico no microambiente tumoral; (2) a expressão das proteínas SOCS1 e SOCS3 nos macrófagos; e (3) a possível relação destes parâmetros com a evolução tumoral e a sobrevida, como um possível fator prognóstico em cadelas portadoras de carcinomas mamários. Foram estudadas 22 cadelas com diagnóstico histopatológico de carcinoma em tumor misto benigno de mama (CaTMB), divididas em dois grupos, sendo G1 constituído por cadelas sem metástase (11) e G2 com metástase (11); em G1 e G2 os animais foram subclassificados de acordo com a utilização ou não do tratamento quimioterápico. As cadelas foram submetidas a análise clínico-patológica (tamanho do tumor; presença de metástase em linfonodo; estadiamento clínico; graduação histológica; distribuição e intensidade do infiltrado inflamatório; quantificação e verificação do estado de ativação de macrófagos no infiltrado por análise imunoistoquímica da expressão de SOCS1 e SOCS3), imunofenotipagem de leucócitos do sangue periférico por citometria de fluxo com marcadores celulares CD14, MHCI e MHCII, e avaliação da taxa de sobrevida. A morfometria do infiltrado inflamatório associado ao tumor revelou, em todos os grupos, predominância da distribuição multifocal e intensidade moderada. A maior proporção de macrófagos no infiltrado inflamatório (≥400) foi associada a uma maior taxa de sobrevida. A imunomarcação revelou maiores proporções de macrófagos SOCS3 positivos nas cadelas que não apresentavam metástases para linfonodo, enquanto que os macrófagos SOCS1 positivos predominaram nas cadelas com metástase (p<0,05). Adicionalmente, a análise multivariada revelou associações entre estadiamento clínico, graduação histológica, sobrevida, tratamento quimioterápico e expressão de moléculas MHCI em monócitos circulantes. Os resultados das análises quantitativa e qualitativa dos macrófagos no infiltrado inflamatório indicam que o estado de ativação, sugerido pela maior expressão das proteínas SOCS3 e 1, define a relação do infiltrado macrofágico com a resposta imune antitumoral ou com a progressão tumoral associada ao desenvolvimento de metástases, respectivamente. Palavra-chave: Tumor de mama, cadela, sistema imune, monócitos. 16 Macrophage infiltration evaluation in mammary carcinomas in female dogs and their correlation with survival rate. Abstract The inflammatory infiltrate in the tumor microenvironment, particularly in breast tumors, has aroused great interest in oncology due to their different roles in tumor progression or regression depending on the types and cell subsets involved. The objective of this study was to evaluate the presence and intensity of macrophage infiltrate in the tumor microenvironment; the expression of SOCS1 and SOCS3 proteins in these macrophages; and the relation of the former parameters to tumor development and survival, as possible prognostic factors of breast carcinomas evolution in female dogs. Were studied 22 female dogs with histopathological diagnosis of carcinoma in benign mixed tumor (CaTMB), divided into two groups consisting of animals without metastasis (G1=11) and animals with metastasis (G2=11); in G1 and G2, the dogs were graded according with the use or not of chemotherapy. All animals underwent clinicopathological analysis (tumor size, lymph node metastasis, clinical stage, histological grade, distribution and intensity of the inflammatory infiltrate, especially macrophages, as well as their possible activation state by immunohistochemical analysis anti-SOCS1 and anti-SOCS3) immunophenotyping by flow cytometry of PBMC for cell markers CD14, MHCI and MHCII, and assessment of survival rate. The morphology of the inflammatory infiltrate associated with tumor showed, in all groups, prevalence of multifocal distribution and moderate intensity. The higher intensity of the macrophage infiltrate (≥400) was associated with a higher survival rate. The immunostaining revealed a higher proportion of positive macrophages for SOCS3 in dogs who had no metastasis to lymph node, while the positive SOCS1 macrophages predominated in animals with metastases (p <0.05). In addition, the multivariate analysis revealed associations between clinical staging, graduation, survival, chemotherapy and expression of MHCI molecules in circulating monocytes. The results obtained in the present study indicated that the activation state, suggested by expression of SOCS3 and 1 proteins, defines the relationship of the macrophage infiltration with antitumor or immune response to tumor progression associated with the development of metastasis, respectively. Keyword: tumor mammary gland, female dog, immune system, monocytes. 17 1. INTRODUÇÃO A avaliação do infiltrado inflamatório presente no microambiente tumoral, em especial nos tumores mamários, tem despertado grande interesse na oncologia humana e atualmente também na veterinária. Acredita-se que a depender dos tipos e subtipos celulares envolvidos e da intensidade da inflamação, observam-se diferentes funções na progressão ou regressão tumoral, na resposta ao tratamento, bem como, nas taxas de sobrevida (ESTRELA-LIMA et al., 2010; HEYS et al., 2012; KIM et al., 2012; SAEKI et al., 2012). Dentre as células inflamatórias, os macrófagos são as primeiras células a responder ao estímulo neoplásico e representa o segundo tipo celular mais frequente nos infiltrados inflamatórios associados aos carcinomas mamários em cadelas, superados apenas pelos linfócitos (ESTRELA-LIMA et al., 2010). Alguns estudos prévios, realizados in vivo e in vitro, vêm demonstrando haver diferenças na resposta frente ao tumor a depender do estado de ativação dos macrófagos, determinados pelos produtos (citocinas e quimiocinas) liberados no microambiente tumoral. Estes estudos ainda sugerem que as células do sistema fagocítico mononuclear, em especial os macrófagos na sua forma de ativação M1, possam ser importantes na imunidade antitumoral por estarem relacionados com um melhor prognóstico, Enquanto, os macrófagos M2 estariam correlacionados a presença de tumores de pior prognóstico, progressão tumoral e ao desenvolvimento de metástases (MANTOVANI et al., 2002; ONO, 2008; HEYS et al., 2012; SHAN DENG et al., 2012; JOSHI et al., 2014). Nos carcinomas mamários das mulheres o infiltrado inflamatório relacionado a uma melhor resposta a quimioterapia apresentava infiltrado macrofágico do tipo próinflamatório. Enquanto que, a pior sobrevida esteve relacionada ao infiltrado de macrófagos anti-inflamatórios (MANTOVANI et al., 2002;HEYS et al., 2012; SHAN DENG et al., 2012). Tendo em vista, que a cadela é considerada modelo de estudos para carcinogênese mamária (QUEIROGA et al., 2011), torna-se imprescindível a 18 determinação do estado de ativação macrofágica nos carcinomas mamários desta espécie. Neste contexto, tendo em vista a necessidade de entendimento da dinâmica interação entre a inflamação e o desenvolvimento tumoral, com a realização deste trabalho objetivou-se avaliar o infiltrado macrofágico no microambiente tumoral, sua intensidade e possível estado de ativação, bem como verificar se existe correlação entre os resultados obtidos e a progressão tumoral, resposta ao tratamento e sobrevida, atuando como um possível fator prognóstico e preditivo em cadelas portadoras de carcinomas mamários. 19 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Neoplasias mamárias em cadelas As neoplasias mamárias são os tumores mais frequentes em cadelas (PELETEIRO, 1994; CASSALI, 2000; DOBSON et al., 2002; MISDORP, 2002; ESTRELA-LIMA, 2011) e mulheres (HENDERSON; FEIGELSON, 2000). A etiologia dos tumores mamários é considerada multifatorial, com participação de fatores ambientais, genéticos, nutricionais e especialmente hormonais (ALENZA et al., 2000; HENDERSON; FEIGELSON, 2000; SILVA et al., 2004; CLEARY et al., 2010; QUEIROGA et al., 2011; MISRA et al., 2012). Os principais hormônios que estimulam a proliferação celular, promovendo as alterações genéticas que darão origem à célula neoplásica mamária em cães e humanos são o estrógeno, a prolactina, progesterona, os andrógenos, o hormônio do crescimento e os hormônios tireoidianos (NOGUEIRA; BRENTANI, 1996; ALENZA et al., 2000; SILVA et al. 2004; QUEIROGA et al., 2011). Aparentemente não existe predisposição racial para o acometimento por tumores mamários na espécie canina (CAVALCANTI; CASSALI, 2006; EZERSKYTE et al., 2011). Entretanto, estudos realizados no Brasil revelam maior frequência em cães sem raça definida e mestiços de poodle (LAVALLE et al, 2009; RIBEIRO, 2012). A frequência do tumor de mama em cadelas aumenta significativamente com a idade, tendo uma maior susceptibilidade animais na faixa etária entre cinco e doze anos de idade, com rara ocorrência em animais jovens (MOULTON, 1990; MISDORP, 2002). O uso de progestágenos para o controle do estro, a pseudociese, a obesidade e dietas ricas em gorduras, bem como, a avaliação de biomarcadores de estresse oxidativo e inflamação tem sido citados como fatores de risco associados ao câncer de mama (PELETEIRO, 1994; ALENZA et al., 2000; ZUCCARI et al., 2008; CLEARY et al., 2010; YEON et al., 2011). 20 A incidência das neoplasias mamárias na cadela aumenta com a maior expectativa de vida e com o uso de progestágenos para o controle do cio, sendo menor quando as cadelas são ovariectomizados ainda jovens (SCHNEIDER et al., 1969; LANA et al., 2007). Contudo, para Sorenmo et al. (2000) maior taxa de sobrevida esta relacionada à castração quando realizada até 24 meses antes da exérese do nódulo primário ou quando associada a mastectomia. A avaliação clínica do paciente é importante para determinar o tempo de evolução da neoplasia, fornecendo melhor entendimento sobre o seu comportamento biológico e informações para determinação do diagnóstico, prognóstico e tratamento (De NARDI et al., 2008; LAVALLE et al., 2009). Essa avaliação faz parte da construção do diagnóstico, que tem início com a anamnese geral e específica do sistema reprodutivo do animal, realização de exame físico detalhado, exames complementares e de imagem, além da verificação de sinais clínicos que indiquem possível envolvimento metastático (LAVALLE et al., 2009; ALEXANDER et al., 2012; PEÑA et al., 2012). O tratamento de eleição para a neoplasia mamária na cadela é a mastectomia, que quando realizada na fase inicial da doença possibilita a cura, excetuando-se os casos de carcinoma inflamatório, tumor extremamente agressivo, em que o procedimento cirúrgico é contra indicado devido à liberação de fatores que afetam a hemostasia, resultando em choque hipovolêmico. (De NARDI et al., 2008; PAOLONI; KHANNA, 2008; LAVALLE et al., 2009; RIBEIRO et al., 2015). Nos casos de estadiamento clínico avançado o tratamento adjuvante com o uso de quimioterápicos anti-neoplásicos, em especial a carboplatina, e o uso de anti-inflamatórios não esteroidais COX-2 seletivos, juntamente com a mastectomia tem trazido benefícios para as pacientes (LAVALLE et al., 2012). Macroscopicamente as neoplasias mamárias na cadela apresentam-se, na maioria das vezes, como nódulos circunscritos detectáveis clinicamente à inspeção e/ou palpação, com dimensões, consistência e mobilidade à pele e musculatura variáveis, podendo estar associados à ulceração cutânea com contaminação bacteriana secundária e reações inflamatórias locais. Frequentemente observam-se múltiplos tumores em uma 21 mesma mama ou envolvendo simultaneamente várias mamas (tumores multicêntricos), os quais podem apresentar diferentes tipos histológicos, no qual o tumor de pior prognóstico determinará a evolução clínica do paciente (MISDORP, 2002; SORENMO et al., 2011; CASSALI et al., 2014). As glândulas inguinais e abdominais caudais são os sítios mais frequentes de desenvolvimento tumoral, possivelmente por apresentarem uma maior quantidade de parênquima mamário e maior resposta proliferativa à ação de hormônios (MISDORP, 2002; SANTOS et al., 2010; EZERSKYTE et al., 2011; SORENMO et al., 2011). Na rotina dos laboratórios de patologia veterinária, a frequência de tumores mamários de caráter benigno e maligno pode variar bastante devido à existência de diferentes métodos de classificação histopatológica e ausência de critérios homogêneos na diferenciação dos tipos tumorais (GOLDSCHMIDT et al., 2011; CASSALI et al., 2014). A classificação histopatológica e a graduação dos tumores mamários são de suma importância por predizerem o comportamento biológico da neoplasia (BOSTOCK, 1986; GOLDSCHMIDT et al., 2011; PEÑA et al., 2012; CASSALI et al., 2014). Dentre os tumores malignos mais frequentes, observam-se os carcinomas, e dentre estes, o Carcinoma em Tumor Misto Benigno (CaTMB) é o subtipo mais comumente observado (CASSALI, 2000; MARTINS et al., 2002; RIBEIRO et al., 2009; ESTRELA-LIMA et al., 2010; DAMASCENO, 2012). A exemplo da graduação e da classificação histopatológicas, o estadiamento clínico e a análise imunoistoquímica das neoplasias mamárias, vêm sendo utilizados como importantes fatores prognósticos e preditivos e para definição do padrão imunofenotipico das neoplasias, respectivamente (MULAS et al., 2005; ZUCCARI et al., 2008; HORTA et al., 2012; TANAKA et al., 2013). Os fatores prognósticos são aqueles que preveem o risco de morte e/ou recidiva devido ao carcinoma mamário, independente da utilização de tratamento. Enquanto que, os fatores preditivos são aqueles que diferenciam os pacientes entre os que responderão a um tipo de tratamento específico (CAVALCANTI; CASSALI, 2006). 22 2.2 Inflamação e o câncer O sistema imune é formado por diferentes tipos celulares e uma complexa rede de sinais químicos capazes de responder a alterações na homeostase do organismo (ONO, 2008). Uma das suas funções primordiais é reconhecer e combater clones de células com alterações no DNA antes que formações neoplásicas se iniciem. Porém, tem-se demonstrado que essa efetividade antitumoral do sistema imune varia de acordo com tipo tumoral envolvido e a capacidade da neoplasia em superar os mecanismos de defesa do organismo (COUSSENS; WERB, 2002). Parte da resposta imune inata antitumoral se dá a partir da ação das células natural killers (células NK). Enquanto que na resposta imune adquirida os linfócitos T, em especial os T CD8⁺, são os principais mediadores da resposta adquirida (Figura 1). Porém, existem poucas evidências na efetividade contra o desenvolvimento neoplásico (VISSER et al., 2006). Em 1863, Virchow criou a hipótese que o processo neoplásico se iniciava em locais acometidos por um processo inflamatório crônico usando como base o conhecimento que alguns irritantes levam a lesão tecidual e posterior inflamação, com a liberação de fatores de crescimento e quimiocinas que estimulam a proliferação celular (BALKWILL; MANTOVANI, 2001). Atualmente, crescentes evidências associam a progressão tumoral com processos inflamatórios e a atividade desregulada das diversas células do sistema imune, estimulados pela liberação, a partir das células neoplásicas e inflamatórias, de mediadores cruciais para o desenvolvimento tumoral (UENO et al., 2000; CHOW et al., 2014). 23 Figura 1. Modelo da função das células na resposta imune inata e adquirida associadas ao câncer. Os antígenos neoplásicos primeiros são transportados para os órgãos linfoides pelas células dendríticas (CD) que ativam a resposta imune adaptativa, resultando em promotores tumorais e anti-tumorais. A ativação dos linfócitos B e da resposta imune humoral resulta na ativação crônica das células imunes inatas nos tecidos neoplásicos. Estas células ativadas, como mastócitos, granulócitos e macrófagos, promovem o desenvolvimento tumoral pela liberação de moléculas solúveis que modulam a expressão genética em células neoplásicas iniciadas, resultando na alteração da progressão do ciclo celular e aumento da sobrevida. As células inflamatórias promovem a remodelação do estroma e a angiogênese pela produção de mediadores pró-angiogênicos e proteases extracelulares. Em contraste, a ativação da resposta imune adaptativa provoca respostas anti-tumorais mediadas pela citotoxicidade das células T (por indução de FAS, perforina e/ou vias de citocinas), pela citotoxicidade celular mediada por anticorpo e lise mediada pelo complemento induzida por anticorpo (modificado de VISSER et al., 2006). 24 O processo inflamatório tem sido incriminado como um componente crítico no microambiente tumoral, podendo retardar ou contribuir para a proliferação, sobrevivência e disseminação das células neoplásicas. Estimulando a invasão, a migração e o desenvolvimento de metástases devido à produção de citocinas, quimiocinas e fatores angiogênicos (EIRÓ; VIZOSO, 2012; HEYS et al., 2012). A influência das células inflamatórias no desenvolvimento neoplásico, em especial os macrófagos, vem sendo relatada em estudos com neoplasias mamárias, tumores sólidos de pulmão em ratos, melanoma e mesotelioma em humanos (COUSSENS; WERB, 2002; MURAMATSU et al., 2010; HEYS et al., 2012). Fortes associações têm sido encontradas entre a inflamação crônica, constituída principalmente por linfócitos e macrófagos, e o desenvolvimento de câncer em humanos, a exemplo da relação entre as neoplasias malignas do cólon e a colite ulcerativa crônica; paratuberculose e a esquistossomose; o carcinoma hepato-celular e a infecção pelo vírus da hepatite C, e os carcinomas gástricos com o Helicobacter pylori. No entanto, o recrutamento destas células inflamatórias também podem representar uma resposta por parte do hospedeiro contra a neoplasia (COUSSENS; WERB, 2002; EIRÓ; VIZOSO, 2012). O microambiente tumoral mamário é infiltrado por uma população heterogênea de células inflamatórias, composta por linfócitos, macrófagos e polimorfonucleares, em especial os neutrófilos quando o tumor apresenta área de ulceração e necrose. Estudos realizados em cadelas e mulheres revelam ser os linfócitos o tipo celular predominante nos infiltrados inflamatórios dos carcinomas mamários, com células T CD4+ (T auxiliares) correlacionadas ao desenvolvimento de metástases e pior sobrevida (ESTRELA-LIMA et al., 2010; TAN et al., 2011; RUFFELL et al., 2012). Os macrófagos são células do sistema fagocitário mononuclear, originadas na medula óssea, onde recebem o nome de monócitos, maturadas e ativadas por estímulos externos nos diferentes tecidos e órgãos, cuja função primordial é a fagocitose e apresentação de antígenos para os linfócitos T CD4⁺ durante a resposta imunológica 25 celular. Desta forma, são importantes células efetoras nas respostas imunes natural e adquirida (CORTEZ-RETAMOZO et al., 2012). Os monócitos circulantes são recrutados para o sítio tumoral pela proteína quimioatraente de monócitos (MCP-1) e o fator de crescimento de colônias-1 (CSF-1) produzidos pelas células tumorais e liberadas no microambiente neoplásico. Ocorre a diferenciação em macrófagos e expressão do fator de crescimento de endotélio vascular (VEGF), uma citocina quimioatraente para macrófagos, aumentando, desta forma, o aporte deste tipo celular para o tumor (LEEK et al., 1996; ZHANG et al., 1997; QIAN et al., 2009) (Figura 2). Figura 2. Migração de monócitos circulantes para o microambiente tumoral. Os monócitos circulantes são recrutados para o sítio tumoral pela MCP-1 e o CSF-1, ambos produzidos pelas células tumorais e liberadas no microambiente neoplásico, onde se diferenciam em macrófagos que expressam o VEGF, citocina quimioatraente para macrófagos. Aumentando, desta forma, o aporte deste tipo celular para o microambiente tumoral. 26 Klimp et al., (2002) sugere que a função dos macrófagos na destruição ou na progressão das células tumorais vai depender do seu estado de ativação, da sua concentração no ambiente tumoral, bem como, no grau de desenvolvimento da neoplasia. Segundo Normann (1985) a densidade populacional dos macrófagos no microambiente tumoral é caracterizada em quatro fases, nas quais se destacam a fase inicial e final. Na fase inicial os macrófagos estão em número elevado e distribuídos de forma homogênea por toda massa neoplásica, duas fases intermediárias onde a população permanece constante, e a fase final, quando ocorre a depleção do seu contingente apesar do contínuo crescimento da neoplasia. A ativação dos macrófagos é regulada por diversos fatores no microambiente tumoral, fazendo com que estes sofram polarização. Os macrófagos classicamente ativados denominados M1 ou pró-inflamatórios, são potentes células efetores no combate a patógenos e aos tumores, ao contrário os macrófagos ativados alternativamente (M2 ou anti-inflamatórios) promovem a cicatrização, o reparo e a progressão tumoral a partir da produção de fatores de crescimento, produção de citocinas de caráter anti-inflamatório e imunomoduladores sobre células Treg (MANTOVANI, 2007; QIAN; POLLARD, 2010; OHARA et al., 2013; MARTINEZ; GORDON, 2014). Os principais estímulos para a ativação dos macrófagos na sua forma clássica são o IFN-γ produzido principalmente pelos linfócitos Th1, componentes e produtos de microrganismos (lipopolissacarídeos-LPS e peptideoglicanos), TNF-α, IL-6 e o fator estimulante de colônias granulócitos-macrófagos (GM-CSF) (ADAMS; HAMILTON, 1992; YAGISAWA et al., 1999; KLIMP et al., 2002; JOHNSTON; O´SHEA, 2003; MARTINEZ; GORDON, 2014). Enquanto que, para a ativação alternativa os fatores envolvidos são a IL-4 produzida pelas células Th2, eosinófilos, basófilos e pelos próprios macrófagos, a IL-13, a IL-10, glicocorticoides, complexos antígeno-anticorpo e o fator estimulante de colônias de macrófagos (M-CSF) (ADAMS; HAMILTON, 1992; LEVANO et al., 2011; MARTINEZ; GORDON, 2014). 27 Os macrófagos M1 são capazes de reconhecer, ligar-se e subsequentemente destruir as células tumorais de forma específica a partir de diferenças na composição da membrana celular, como alterações na quantidade de fosfatidilserina, carboidratos estruturais e expressão de antígenos tumorais (UTSUGI et al., 1991; KLIMP et al., 2002). Entretanto, os tumores podem evadir as respostas imunes a partir da menor expressão de moléculas do MHC II inibindo a resposta as células T efetoras, diminuição ou ausência da expressão de antígenos tumorais e a produção de substâncias imunossupressoras, como o TGF-β, que inibe a função de células efetoras (RODRIGUEZ-LECOMPTE et al., 2004). A tentativa de determinação do estado de ativação dos macrófagos vem sendo realizada a partir da expressão de diversas proteínas (ITALIANI; BORASCHI, 2014), dentre elas as proteínas SOCS (supressoras da sinalização de citocinas), essas são reguladoras do feed back negativo na sinalização das citocinas pela via JAK-STAT. Em mamíferos a família SOCS é constituisa por 08 membros (CIS e SOCS1-7), todos compostos estruturalmente por um domínio SH2 central, uma região variável na extremidade N-terminal e outra região com 40 aminoácidos homóloga a C-terminal, denominada de SOCS box. As proteínas SOCS 1 e 3 são as mais estudadas pelo seu elevado potencial de ação e função na inflamação e no desenvolvimento neoplásico (STARR; HILTON, 1998). As proteínas SOCS tem se demonstrado como reguladores na polarização dos macrófagos, sendo SOCS3 necessária para a sua ativação na forma clássica e SOCS1 para a ativação alternativa (JOHNSTON; O´SHEA, 2003; BAETZ et al., 2004; OHARA et al., 2013), a partir da regulação da sensibilidade dos macrófagos a IL-6 e ao IFN-γ, respectivamente (QIN et al., 2012). As proteínas da família SOCS também são expressas pelas células neoplásicas, bloqueando assim, o estímulo à proliferação celular por fatores produzidos pelas células inflamatórias e estromais, e liberados no microambiente tumoral (ROTTAPEL et al., 2002; SASI et al., 2010). 28 2.3 Macrófagos e neoplasias mamárias Need e colaboradores (2014) demonstraram que a população de macrófagos na glândula mamária de ratas varia ao longo do ciclo estral, atingindo seu pico nas fases de metaestro e diestro, quando a concentração de progesterona é mais alta, e menores números no proestro e estro quando esta concentração diminui. Estas células participam da regressão da glândula mamária, a partir da fagocitose das células epiteliais em apoptose. Assim, condições anti-inflamatórias em resposta à diminuição da progesterona e aumento do estrógeno pode criar um ambiente favorável para a iniciação tumoral devido à diminuição da resposta imune celular mediada pelos macrófagos. A sinalização química de curto alcance realizada pelos macrófagos está relacionada ao desenvolvimento de metástases, devido à liberação do fator de crescimento epidérmico (EGF) e resposta ao fator de crescimento de colônias-1 (CSF1). Além do contato direto entre macrófagos, células endoteliais e tumorais (KNÚTSDÓTTIR et al., 2014; ROHAN et al., 2014). Estudos in vitro utilizando culturas de células de carcinoma mamário e macrófagos vêm demonstrando que esses últimos se infiltram no tumor usando as células mesenquimais e a sua capacidade de migração ameboide, aumentando também a migração e a invasão das células tumorais (GUIET et al., 2011). Esse aumento potencial da malignidade se dá a partir da remodelação do estroma (GUIET et al., 2011), após liberação de metaloproteinases, colagenases, elastases e lipases (MANTOVANI, 2007) e produção de citocinas e quimiocinas (CCL2, CCL3, VEGF) que induzem a aquisição do fenótipo macrofágico pelas células tumorais, como antígenos específicos (CSF-1R) (KROL et al., 2012). Ueno e colaboradores (2000) investigaram a expressão local de citocinas, quimiocinas e fatores angiogênicos (IL-1/-4/-6/-8/-10/-12, TNF-α, IFN-γ, MCP-1 e VEFG) no câncer de mama de mulheres em associação com a avaliação do infiltrado macrofágico intratumoral. Os resultados demonstraram que as concentrações da proteína quimioatrante de monócitos-1 (MCP-1) e de fatores de crescimento endotelial 29 (VEGF) estavam associados a maior densidade de macrófagos no microambiente tumoral, representando um significativo indicador de recidiva precoce, sendo um possível fator prognóstico. Estudo realizado com ratos obesos portadores de carcinoma mamário e alimentados com uma dieta rica em gordura demonstrou concentrações elevados da MCP- 1 no sangue, em conjunto com um significativo infiltrado macrofágico e aumento na formação de microvasos no estroma tumoral, sugerindo desta forma que a dieta rica em lipídeos promova no microambiente uma resposta inflamatória favorável a progressão da neoplasia mamária (NGAN et al., 2013). Foi demonstrado que as células neoplásicas de carcinomas mamários secretam microvesículas, chamadas de exossomos, que são internalizadas pelos macrófagos, estimulando-os a secretar citocinas (TNF-α), se diferenciar em M1 e exercer sua função pró-inflamatória durante a progressão tumoral (CHOW et al., 2014), utilizando mecanismos como a liberação de enzimas lisossomais, intermediários reativos do oxigênio, óxido nítrico, TNF-α ou a fagocitose para a destruição das células tumorais (DAEMEN et al., 1989; KLIMP et al., 2002). Os exosomos liberados a partir das células neoplásicas e de células da medula óssea também vêm sendo incriminados no estimulo a progressão tumoral e desenvolvimento de metástases (PEINADO et al., 2011; NIKITINA et al., 2013). O estudo realizado com ratos portadores de câncer de mama e deficientes do receptor de quimiocina CXCR3, demonstrou um aumento na produção da IL-4 e polarização de macrófagos M2 no microambiente tumoral, contribuindo para promoção do crescimento tumoral (OGHUMU et al., 2014). Em contrapartida outro estudo, também realizado em ratos portadores de neoplasia mamária, foi observado à redução nas metástases pulmonares e de macrófagos M2 intra-tumorais nos animais que tiveram a inibição da ciclo-oxigenase-2 (COX-2) com o etodolac (bloqueador da COX2), sugerindo que o bloqueio da COX-2 pode auxiliar no controle da progressão dos tumores mamários, suprimindo a diferenciação dos macrófagos na sua forma M2 e 30 consequentemente a liberação de fatores de crescimento endotelial e metaloproteinases, além de, estimular a resposta imune anti-tumoral (NA et al., 2013). O infiltrado inflamatório rico em macrófagos no câncer de mama humano está associado a uma elevada produção de citocinas, a ativação do NF-κB e aumento da expressão de COX-2. O aumento dos níveis de prostaglandinas dentro do estroma tumoral regula positivamente a expressão dos genes que codificam aromatase e HER2/neu (receptor do fator de crescimento epidermal humano). As concentrações elevadas de estrógeno produzido no interior da neoplasia e pelas células estromais, age juntamente com o aumento das prostaglandinas e do HER-2/neu para aumentar ainda mais a resposta inflamatória macrofágica e a proliferação das células tumorais, o que leva à progressão do tumor. A presença de receptores de progesterona nas células tumorais inibe a ativação do fator de transcrição nuclear NF-κB interrompendo o ciclo e inibindo a progressão tumoral (MENDELSON; HARDY, 2006) (Figura3). Figura 3. Papel protetor do receptor de progesterona na mama ao inibir a ativação do NFκB. O câncer de mama humano negativo para receptor de progesterona está associado a uma resposta inflamatória, com o aumento de macrófagos, aumento da produção de citocinas, NF-κB e aumento da expressão de COX-2. O aumento da produção de prostaglandinas regula a expressão dos genes que codificam a aromatase e HER-2/neu. A elevada concentração de estrógeno formado no tumor e nas células estromais, age em conjunto com o aumento das prostaglandinas e HER2/neu aumentando ainda mais a resposta inflamatória e a proliferação neoplásica. A presença do receptor de progesterona inibe a ativação do NF-κB interrompendo o ciclo (modificado de MENDELSON; HARDY, 2006). 31 Nos carcinomas mamários das mulheres os infiltrados inflamatórios relacionados a uma melhor resposta a quimioterapia e pior sobrevida apresentavam infiltrados macrofágicos pró-inflamatórios (SOCS3 – M1) e anti-inflamatórios (SOCS1 – M2), respectivamente (HEYS et al., 2012). Os tratamentos quimioterápicos a radioterápicos possuem influência na polarização da resposta macrofágica, podendo estimular a quimio-resistência ou a destruição do tumor (MANTOVANI e ALLAVENA, 2015). Tendo em vista, que a cadela é considerada modelo de estudos para carcinogênese mamária (QUEIROGA et al., 2011), torna-se imprescindível a determinação do estado de ativação macrofágico nos carcinomas mamários desta espécie para um melhor entendimento das relações no microambiente tumoral. Neste contexto, o estudo da intensidade e dos tipos celulares envolvidos na resposta inflamatória tumoral, é importante para determinação de biomarcadores prognósticos e preditivos, podendo ser utilizado para o desenvolvimento de novas terapêuticas imunológicas, a partir da manipulação dos macrófagos e do seu estado de ativação (SOLINAS et al., 2009; ESTRELA-LIMA et al 2010; HEYS et al., 2012; KIM et al., 2012; KAZI et al., 2014; KEKLIKOGLOU; De PALMA, 2014). 32 3. HIPÓTESES O infiltrado inflamatório macrofágico intratumoral (TAM) associado aos carcinomas mamários em cadelas promove o desenvolvimento ou retardo tumoral a depender da distribuição, intensidade e o predomínio da expressão das proteínas SOCS1 e SOCS3; Diferenças na intensidade do TAM e a expressão das proteínas SOCS (pró e anti-inflamatório) contribuem para o aumento nas taxas de sobrevida e na resposta ao tratamento quimioterápico. 4. OBJETIVO 4.1 Objetivo Geral Caracterizar o infiltrado macrofágico associado ao Carcinoma em Tumor Misto Benigno da Mama de cadela (CaTMB) correlacionando os resultados com fatores prognósticos, a resposta à quimioterapia e com a taxa de sobrevida. 4.2 Objetivos específicos Caracterizar os tipos celulares, a intensidade, a distribuição e localização predominantemente (peri e intratumoral) dos focos inflamatórios associados aos carcinomas mamários de cadelas; Identificar por imunomarcação os macrófagos na massa tumoral identificando a expressão das proteínas SOCS1 e SOCS3; 33 Associar os dados encontrados com os fatores sabidamente prognósticos (estadiamento, graduação, tamanho) no câncer de mama da cadela, visando analisar possíveis fatores determinantes da resposta imune no desenvolvimento neoplásico e tratamento quimioterápico, particularmente os associados às condições de susceptibilidade; Identificar a partir da imunofenotipagem do sangue periférico a expressão de moléculas MHCI e MHCII nos monócitos circulantes, comparando com a densidade do TAM; Identificar a sobrevida das cadelas a partir de acompanhamentos trimestrais no mínimo até 12 meses após o procedimento cirúrgico. 34 5. MATERIAIS E MÉTODOS A pesquisa foi desenvolvida no Hospital de Medicina Veterinária Professor Renato Medeiros Neto (HOSPMEV/UFBA), na cidade de Salvador, Bahia e envolveu os seguintes setores: Laboratório de Patologia Veterinária, Clínica e Cirurgia de Pequenos Animais, Diagnóstico por Imagem, Laboratório de Análises Clínicas, Laboratório de Infectologia Veterinária (LIVE) e Laboratório de Diagnóstico das Parasitoses dos Animais. Como instituições parceiras, participaram da pesquisa o Centro de Pesquisas René Rachou - Fundação Oswaldo Cruz (Belo Horizonte, Minas Gerais) e o Laboratório de Patologia Comparada do Departamento de Patologia Geral (ICB - UFMG). 5.1 Seleção de animais e Grupos experimentais Foram estudadas 22 cadelas com diagnóstico histopatológico de Carcinoma em Tumor Misto Benigno de mama (CaTMB), atendidas no Hospital Veterinário da UFBA (Bahia-Brasil) no período de março de 2013 a fevereiro de 2015. Todos os proprietários foram previamente informados sobre a realização do projeto de pesquisa que possui aprovação da Comissão de Ética e no Uso de Animais (CEUA – nº 011/13) (Anexo 1). Nenhum dos animais fez uso prévio (mínimo de trinta dias) de fármacos antineoplásicos ou antiinflamatórios, sendo esse aspecto um critério definitivo para a inclusão dos animais na pesquisa. Os animais selecionados foram divididos em dois grupos, o primeiro constituído por animais sem metástase (11) e o segundo composto de animais com metástase (11), diagnosticada a partir da realização de exames de imagem e histopatológico. Dentro de cada grupo os animais foram subclassificados de acordo com a utilização ou não do tratamento quimioterápico (Figura 4). 35 Figura 4. Animais divididos em grupos a partir da presença ou ausência de metástase e em subgrupos pela utilização ou não de tratamento quimioterápico com a Carboplatina. Legenda: CaTMB = Carcinoma em Tumor Misto Benigno; S/metástase = Animais sem metástase regional; C/metástase = Animais com metástase regional ;S/ quimioterapia = Animais não submetidos ao tratamento quimioterápico; C/ quimioterapia = Animais submetidos ao tratamento quimioterápico. 5.2 Avaliação Clínica e Mastectomia Inicialmente, todos os animais com lesão mamária foram submetidos ao exame clínico completo (anamnese geral e específica do sistema reprodutivo, aferição de parâmetros fisiológicos – temperatura, frequência cardíaca, frequência respiratória, tempo de perfusão capilar, auscultação cardiorrespiratória), sendo os dados transcritos em uma ficha oncológica específica (Anexo 2). O estadiamento clínico foi realizado com base no tamanho do tumor (T), envolvimento neoplásico de linfonodos regionais (N) e presença de metástases à distância (M), de acordo com o sistema TNM (modificado de OWEN, 1980) (Figura 5A). Foram avaliados tumores de tamanho igual ou superior a 3,0 cm. A avaliação macroscópica dos linfonodos inguinais e axilares foi realizada pela palpação dos mesmos e a presença ou não de envolvimento neoplásico determinado pela a análise macroscópica e o exame histopatológico após a exérese cirúrgica da mama envolvida. Ao final do exame ambulatorial, foi realizada a colheita 36 de sangue periférico para hemograma e bioquímica sérica (ureia, creatinina, FA e ALT) para a avaliação do estado geral da paciente e como exames pré-cirúrgicos, além disso, os animais foram encaminhados para realização de radiografia simples de tórax em três incidências: látero-lateral direita (LLD), látero-lateral esquerda (LLE) e ventro-dorsal (VD) para pesquisa de metástase pulmonar e ultrassonografia de abdômen total. A abordagem cirúrgica foi determinada pelo tamanho do tumor, sua localização e drenagem linfática, considerando-se também margens de segurança (Figura 5B). As cadelas foram monitoradas durante o período pós-cirúrgico com utilização de bandagem compressiva por 48 horas. 5.3 Acompanhamento e Sobrevida Os exames radiológicos foram realizados trimestralmente, os exames laboratoriais (hemograma e bioquímico – ureia, creatinina, ALT e FA) e clínicos mensalmente no mínimo até nove meses após a cirurgia, período de acompanhamento, no qual foram coletados dados sobre a sobrevida livre da doença e a sobrevida global. O tempo de sobrevida global foi definida (em dias) como sendo o período entre a exérese cirúrgica do tumor primário e a data de óbito pela doença. Os animais que vieram a óbito foram necropsiados no Setor de Patologia Veterinária/HOSPMEVUFBA para determinação da causa mortis e detecção de possíveis metástases. Este procedimento foi realizado após autorização dos proprietários por escrito em formulário específico (Anexo 3) (Figura 6). 37 Figura 5. Clínica, cirurgia e tratamento quimioterápico. A) Anamnese- transcrição dos dados em ficha oncológica específica. B) Realização da mastectomia determinada pelo tamanho do tumor, sua localização e drenagem linfática. C) Cadela portadora de CaTMB com metástase submetida ao tratamento anti-neoplásico com a Carboplatina. Figura 6. Metástases de CaTMB observadas durante exame necroscópico. A) Pulmão com nódulos metastáticos distribuídos multifocalmente em todos os lobos pulmonares. B) Nódulo metastático único na superfície renal. 38 5.4 Imunofenotipagem de sangue periférico no contexto ex vivo Para avaliação da resposta imune celular, foram colhidos 4 mL de sangue de todos os animais, imediatamente antes do procedimento cirúrgico (30 minutos antes da mastectomia). O sangue foi colhido em seringas descartáveis estéreis de 5 mL, através de venopunção da jugular, e em seguida transferido para tubos estéreis contendo EDTA, que foram mantidos a temperatura ambiente. Os parâmetros hematológicos e imunofenotípicos foram avaliados por um analisador automático de células do sangue (ADVIA ® 60, Bayer HealthCare, Tarrytown, NY, EUA) e um citômetro de fluxo (FACScalibur, Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA), respectivamente. Os anticorpos monoclonais utilizados (anti-CD14 Cy-5, anti-MHCI FITC e anti-MHCII R-PE, todos Serotec LTD – Oxford, England) foram diluídos em PBS-W [solução salina tamponada com fosfato-PBS = 0,15M, 8g/l de NaCl, 2g/l de KCl, 2g/l de KH2PO4 e 1,15g/l de Na2HPO4, pH 7,2 com 0,5% de albumina bovina sérica (BSA) e 0,1% de azida sódica] na diluição previamente estabelecida (ESTRELALIMA et al., 2012). Em um tubo cônico de poliestireno medindo 12x75 milímetros (FALCON® – BECTON DICKINSON) contendo 40μL de sangue total contendo EDTA e 1μL de anti-MHCI (FITC) + 2μL anti-MHCII (R-PE) + 1μL anti-CD14 (Cy-5). A amostra de sangue periférico foi homogeneizada cuidadosamente e incubada em temperatura ambiente, durante 30 minutos, ao abrigo da luz. Em seguida, as hemácias foram lisadas adicionando-se 3mL de solução de lise (FACS LISYNG SOLUTION – BECTON DICKINSON), sob agitação no vórtex. A suspensão celular permaneceu em repouso por 10 minutos a temperatura ambiente, ao abrigo da luz; após esse período a mesma foi centrifugada a 400 x g por sete minutos, a temperatura ambiente. Após a centrifugação, o sobrenadante foi desprezado vertendo-se o tubo e as células foram então, homogeneizadas no vórtex a baixa velocidade. Foram adicionados 3mL de PBSW e a suspensão celular foi submetida novamente a centrifugação a 400 x g, por sete minutos a temperatura ambiente, sendo novamente desprezado o sobrenadante e, o sedimento ressuspenso e homogeneizado cuidadosamente; essa última lavagem foi repetida mais uma vez. As células foram fixadas com 100μL de solução fixadora para 39 citometria – MaxFacsFix (MFF) (10,0g/l de paraformaldeído, 10,2g/l de cacodilato de sódio e 6,65g/l de cloreto de sódio, pH 7,2) e submetidas à leitura no citômetro de fluxo onde foram avaliados 10 mil eventos. Os controles negativos foram anticorpos obtidos da empresa correspondente apresentando mesmo isotipo e produzidos na mesma espécie. Após todo o procedimento de marcação da fenotipagem, a amostra foi enviada ao Centro de Pesquisas René Rachou - Fundação Oswaldo Cruz (Belo Horizonte, Minas Gerais), local onde foi analisada no citômetro FACScalibur (BECTON DICKINSON, San Jose, CA, EUA), acoplado a um sistema de computador com programa específico (CELL QUEST®). A caracterização fenotípica, por citometria de fluxo, inclui a análise básica de três parâmetros celulares: tamanho (determinado pela difração frontal do raio laser – “Forward scatter” - FSC), granulosidade ou complexidade interna (determinada pela refração e reflexão lateral do raio laser – “Side Scatter” - SSC), e intensidade relativa de cada fluorescência. A obtenção dos dados por citometria teve início com a identificação da população celular de interesse (R1), após ajustes de ganho de tamanho (FSC) e granulosidade (SSC) e/ou fluorescências (FL1, FL2 e FL3). Com a seleção da região de interesse (R1), foi feita a análise dos aspectos fenotípicos considerando duas abordagens distintas: a primeira, a partir do percentual de células positivas expressas em gráficos de dispersão pontual de fluorescência, equivalente à população positiva para o marcador avaliado; e a segunda, avaliando a intensidade média de fluorescência (IMF) equivalente à densidade de expressão de um determinado marcador fenotípico, em gráficos do tipo histograma em escala logarítmica. A primeira abordagem foi empregada para quantificar fenótipos celulares que apresentam distribuição bimodal, ou seja, caracterizadas por apresentarem populações positivas e negativas para o referido marcador fenotípico. Na segunda abordagem foi utilizada uma análise semi-quantitativa da expressão do marcador fenotípico que possui distribuição unimodal, ou seja, toda a população celular de interesse expressa constitutivamente o referido marcador fenotípico. Nessas situações, alterações na densidade de expressão podem ocorrer, o que irá promover o deslocamento da 40 população celular ao longo do eixo da intensidade de fluorescência. Em todo o experimento foi analisado para cada amostra os controles das reações, que são importantes para avaliação da qualidade do perfil celular e detecções de eventual ocorrência de fluorescências inespecíficas. 5.5 Biópsia Excisional e Histopatológico Imediatamente após a cirurgia, as cadeias mamárias foram analisadas macroscopicamente e colhidos fragmentos da(s) mama(s) afetada(s), incluindo pele e tecido subcutâneo além dos linfonodos regionais (Figura 7) para realização do exame histopatológico tendo por objetivo determinar o diagnóstico histopatológico da neoplasia mamária. Na presença de tumores múltiplos em uma mesma cadeia, no momento da exérese cirúrgica, a colheita dos fragmentos foi realizada separadamente e os frascos identificados com a glândula afetada e fixados em formol neutro e tamponado com fosfato a 10% e processados pela técnica rotineira de inclusão em parafina. As secções histológicas de 4µm foram coradas por Hematoxilina-Eosina (LUNA, 1968; ESTRELA-LIMA et al., 2010). 5.6 Caracterização da Neoplasia 5.6.1 Classificação Histológica Todos os exames histopatológicos foram realizados no Laboratório de Patologia Veterinária HOSPMEV/UFBA e para todos os casos foram confeccionadas duplicatas das lâminas, visando à análise por dois patologistas veterinários (LPV/UFBA e LPC/UFMG). A identificação do tipo histológico seguiu a classificação da Organização Mundial de Saúde (OMS) (MISDORP et al., 1999) e padronização do Consensus for the Diagnosis, Prognosis and Treatment of Canine Mammary Tumors (CASSALI et al., 2014). 41 Figura 7. Avaliação macroscópica da cadeia mamária. A) Mensuração de toda a cadeia mamária, localização e caracterização dos nódulos. B) Secção evidenciando a superfície de corte da neoplasia mamária com aspecto multilobular. C) Dissecação da gordura inguinal para localização do linfonodo regional (em destaque). 42 5.6.2 Graduação Histológica Foi utilizado o grau histológico de Nottingham que inclui: percentual de diferenciação tubular; avaliação do pleomorfismo nuclear e índice mitótico (ELSTON; ELLIS, 1993; CASSALI et al., 2014) (Figura 8). Características Pontuação Formação tubular 75% do tumor 1 10 a 75% do tumor 2 < 10% do tumor 3 Pleomorfismo nuclear Tamanho nuclear semelhante á célula normal 1 Moderado aumento e variabilidade 2 Grande variação 3 Índice mitótico 0 a 8 mitoses 1 9 a 16 mitoses 2 17 ou mais mitoses 3 Alocação do grau tumoral Total de escore Grau de malignidade 3–5 6–7 8–9 I II III Figura 8. Critérios utilizados na graduação de tumores mamários de cadela conforme o grau de malignidade. (FONTE: CAVALVANTI, 2006, modificado de ELSTON; ELLIS, 1993; CASSALI et al., 2014) 43 5.6.3 Análise Morfológica e Quantitativa do Infiltrado inflamatório Tumoral A análise morfológica da reação inflamatória associada ao tumor, quanto a sua distribuição e intensidade, foi realizada nos oito campos mais representativos (“hotspots”), com auxilio de um microscópio Olympus BX-41 (ocular 10Χ e objetiva de 40Χ), nas secções histológicas de 4μm coradas pelo HE, segundo protocolo estabelecido por Estrela-Lima et al. (2010). A distribuição do infiltrado inflamatório foi classificada nas áreas periféricas e intra-tumorais em: i) focal: presença de 1-3 focos inflamatórios; ii) multifocal: presença de mais de três focos inflamatórios e iii) difusa: presença de células inflamatórias uniformemente distribuídas na secção de tumor. A intensidade da reação inflamatória foi categorizada em três subgrupos (discreta, moderada ou intensa) com base na análise morfométrica do infiltrado inflamatório total. Para a análise quantitativa após a identificação e marcação dos oito campos, foi realizada a captura de imagens em câmera digital Zeiss Axiocam/cc5 adaptada a um Microscópio Carl Zeiss Scope.A1, utilizando-se o software de captura Versão Zen 2012 (Blue Edition – Service Pack 1)® e o software Corel DRAW® versão X7 para análise das imagens. Linfócitos, macrófagos, plasmócitos, neutrófilos e eosinófilos foram identificados com base nas suas características morfológicas e quantificados nas imagens capturadas de secções coradas pela HE. O número total de células foi obtido pela soma dos oito campos analisados, sendo a média utilizada para determinar os intervalos de intensidade. O infiltrado inflamatório foi classificado em: i) discreto; ii) moderado: e iii) intenso (Figura9/Tabela 1). 44 Figura 9. Análise quantitativa do infiltrado inflamatório associado ao tumor. A) Células inflamatórias mistas peritumorais. HE. 200X. B) Infiltrado inflamatório misto intratumoral. HE. 400X. Linfócitos-vermelhos, macrófagos-amarelos, plasmócitosverdes. C) Infiltrado inflamatório predominantemente macrofágico. Imunomarcação citoplasmática. CD68. 400X. D) Infiltrado inflamatório misto peritumoral. Cromotrope 2R. 400X. Tabela 1. Intervalo de intensidade dos tipos celulares nos carcinomas mamários (ESTRELALIMA, 2011). Tipo celular Linfócito Macrófago Plasmócito Neutrófilo Eosinófilo Total Discreta X<300 X<200 X<200 X<200 X<50 X<500 Intensidade Moderada 300≤ X <600 200≤ X <400 200≤ X <400 200≤ X <400 50≤ X <100 500≤ X <1000 Intensa x ≥600 x ≥400 x ≥400 x ≥400 x≥100 x ≥1000 45 5.7 Avaliação Imunoistoquímica Esta técnica foi realizada no Laboratório de Patologia Comparada do Departamento de Patologia Geral (ICB - UFMG), sendo utilizadas secções de 4µm obtidas de cada caso e coletadas sobre lâminas gelatinizadas. As lâminas foram desparafinizadas, reidratadas em uma série de álcoois progressivamente diluídos, e submetidas à recuperação antigênica em calor-úmido (banho-maria a 95° por 20 minutos) tampão citrato (Target Retrieval Solution) (SOCS 1 e SOCS 3), pH 6.0, exceto as lâminas destinadas a marcação de CD68. Nestas foi realizado tratamento enzimático por meio de proteinase K e incubadas em câmara úmida durante 5 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente todas as lâminas foram incubadas em peróxido de hidrogênio 3% em metanol para o bloqueio da atividade da peroxidase endógena por 15 minutos. Após o resfriamento, as lâminas foram cobertas com soro bloqueio (Lab Vision™ Ultra V Block - Thermo Scientific) por 15 minutos. Os dados dos anticorpos utilizados estão descritos na tabela 2. As secções histológicas foram incubadas com o anticorpo primário por 1 hora a 25°C e na sequência aplicado o método de revelação polimérica (ADVANCE HRP– ready to use–DakoCytomation). Por último, as secções foram expostas ao cromógeno 3,3 – diaminobenzidina e contra-coradas com hematoxilina de Mayer’s. Controles negativos foram obtidos pela substituição do anticorpo primário por PBS (DAMASCENO et al., 2014). Tabela 2. Dados referentes aos anticorpos utilizados. Anticorpo Origem Clone Diluição Localização CD68 ABD Serotec MCA5709 1:60 Citoplasmática SOCS1 Santa Cruz SC-9021 1:60 Citoplasmática SOCS3 Santa Cruz SC-9023 1:80 Citoplasmática 46 Para a análise da imunomarcação dos anticorpos CD68, SOCS1 e SOCS3 (macrófagos e a expressão das proteínas SOCS, sugerindo o seus subtipos de ativação, respectivamente) após a identificação e marcação dos oito campos mais representativos da resposta inflamatória (“hotspots”) em cada caso, foi realizada a captura de imagens em câmera digital Zeiss Axiocam/cc5 adaptada a um Microscópio Carl Zeiss Scope.A1, utilizando-se o software de captura Versão Zen 2012 (Blue Edition – Service Pack 1)® e o software Corel DRAW® versão X7 para análise das imagens. Somente a marcação presente no citoplasma foi considerada, independente da intensidade da mesma (Figura 10). Figura 10. Análise da imunomarcação com as proteínas SOCS1 e SOCS3 no infiltrado inflamatório macrofágico associado ao tumor. A/B) Anticorpo anti-SOCS1 – infiltrado inflamatório macrofágico discreto associado ao processo neoplásico em animais portadores de metástase. 200X/400X. C/D) Expressão da proteína SOCS3 no denso infiltrado macrofágico sem metástase para linfonodo. 200X/400X. 47 5.8 Tratamento Quimioterápico As cadelas foram submetidas primeiramente à mastectomia e após a recuperação cirúrgica, com completa cicatrização por primeira intenção e retirada dos pontos, em média 10 dias após a exérese da cadeia mamária, foi iniciado o tratamento quimioterápico em 05 animais de cada grupo (Figura 5C). Foram realizadas o mínimo de uma sessão e o máximo de seis sessões com intervalos de 21 dias, utilizando a carboplatina, endovenosa, na dosagem de 300mg/m2, com tempo de infusão de 5 minutos. Os animais foram mantidos em fluidoterapia com solução fisiológica quatro horas antes e quatro horas após a administração do quimioterápico, sendo aplicado ainda, por via subcutânea, metoclopramida (0,5 mg/kg), ranitidina (1mg/kg), prometazina (0,1 mg/kg) e citrato de Maropitant - Cerenia® (1ml/10kg). Os mesmos medicamentos, com exceção do Cerenia®, cuja via exclusiva de administração é subcutânea, ainda foram prescritos, via oral, por três dias consecutivos. Foram realizados ainda hemograma e bioquímica sérica (uréia, creatinica, FA e ALT) um dia antes da aplicação do medicamento, 48 horas, sete e 11 dias após a administração, durante todos os ciclos para avaliação do estado geral do paciente durante o período do nadir da droga. A quimioterapia foi realizada em uma sala exclusiva, sendo o fármaco previamente manipulado em uma capela de exaustão para a individualização da dose por paciente e administrado por um Médico Veterinário devidamente paramentado (máscara, luva, gorro e avental descartável). Os resíduos foram devidamente identificados e descartados separadamente, de acordo com o padrão preconizado para produtos contaminados com agente anti-neoplásicos. 48 5.9 Análise Estatística Inicialmente, para avaliação da normalidade da distribuição, os dados foram submetidos a teste de Kolmogorov-Smirnov. Para os dados paramétricos e não paramétricos foram utilizados o teste t de Student /Mann-Whitney U (comparação de dois grupos), ou ANOVA / Teste de Kruskal-Wallis (mais de dois grupos), respectivamente. Da mesma forma possiveis correlações foram investigadas pelos testes de Pearson ou Spearman (SAMPAIO, 2002). As curvas de sobrevida foram estimadas pelo metódo de Kaplan-Meier e comparadas pelo teste de Log-rank (Mantel-Cox) ou Cox na análise univariada ou multivariada, respectivamente, correlacionando a intensidade do infiltrado macrofágico com as respostas clínico-patológicas. Os dados foram agrupados da seguinte forma: diagnóstico histológico (CaTMB); metástase para linfonodos (sim ou não); estadiamento clínico (II, III, IV ou V); graduação histológica (I, II ou III); distribuição inflamatória (focal, multifocal ou difusa), utilização da quimioterapia com carboplatina (sim ou não) intensidade inflamatória (discreta,moderada ou intensa), intensidade do infiltrado macrofágico (<400 ou ≥ 400), percentual de macrófagos ativados (anti-inflamatórios SOCS1 – M2 ≥ 50% e pró-inflamatórios SOCS3 – M1≥ 50%) e a taxa de sobrevida (baixa- menor ou igual a 6 meses; e alta - maior que 6 meses). Em todos os casos, o valor de p <0,05 foi considerado estatisticamente significativo. As análises foram realizadas utilizando o softwares Prism 5.0 (GraphPad, San Diego, CA, EUA) e SPSS 17 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). 49 6. Resultados e Discussão A função dos macrófagos infiltrantes nos carcinomas mamários caninos ainda não está totalmente estabelecida. Portanto, a existência de relação entre características imunofenotípicas predominantes do infiltrado macrofágico e fatores prognósticos clássicos pode indicar uma importante associação entre a resposta imune do hospedeiro e a evolução da doença. Características clínicas e patológicas Dentre os animais estudados (22), os cães da raça Poodle (10/45,45%) foram os mais acometidos seguida dos sem raça definida (7/31,80%) com a idade média de 12 anos (faixa etária de 08 - 15 anos). As mamas inguinais (8/18,20%), independente da lateralidade, foram as mais acometidas por tumores, em sua maioria, maiores que 5 cm (17/77,27%) assim como descrito na literatura por MISDORP, 2002; EZERSKYTE et al., 2011; SORENMO et al., 2011. O estadiamento clínico III foi predominante (14/63,6%), bem como, o grau histopatológico II (21/95,46%). Nenhum dos animais avaliados apresentava metástase a distância, contudo, 11 animais (50%) apresentaram metástase para linfonodo regional. Como em outros estudos realizados anteriormente em Salvador e em outras unidades da federação, os resultados do presente estudo não demonstraram uma predisposição racial, mas sim uma maior freqüência em animais da raça Poodle e sem raça definida (LAVALLE et al, 2009; ESTRELA-LIMA, 2010; RIBEIRO, 2012; TORÍBIO et al., 2012). Porém, essa maior frequência provavelmente é um viés resultante da moda de se criar cães dessas raças no início dos anos 2000. Quando se tratou da idade, as cadelas acometidas se apresentavam dentro da faixa etária citada na literatura, em que as cadelas mais acometidas apresentam idade avançada (MOULTON, 1990; PELETEIRO, 1994; De NARDI et al., 2008; EZERSKYTE et al., 2011). Na maioria dos animais foram observados tumores multicêntricos, cerca de 72,72% (16/22), com diferentes tipos histológicos. Nestes casos segundo CASSALI et al., 2014 o tumor de pior prognóstico determinará a evolução clínica do paciente. 50 A avaliação dos parâmetros hematológicos antes do procedimento cirúrgico não apresentaram diferenças nos animais estudados, independente da presença ou ausência de metástases. O que os tornavam aptos ao procedimento cirúrgico (Anexo 4). Análise quantitativa, da distribuição e imunomarcação do infiltrado macrofágico A avaliação morfológica do infiltrado inflamatório, independente dos grupos, revelou predominância da distribuição multifocal e intensidade moderada (Tabela 3 /Figura 11). A análise morfológica e morfométrica comparativa entre o infiltrado inflamatório macrofágico peri (áreas circunvizinhas a neoplasia) e intratumoral (estroma tumoral) não demonstrou diferença significativa (Tabela 3). Tabela 3. Análise morfológica e quantitativa do infiltrado inflamatório macrofágico peri e intratumoral, associado com a presença ou ausência de metástase e tratamento. CaTMB (-) Trat (-) CaTMB (-) Trat(+) CaTMB (+) Trat(-) CaTMB (+) Trat(+) PERI INTRA PERI INTRA PERI INTRA PERI INTRA 0%(0/5) 0%(0/5) 20%(1/5) 20%(1/5) 16,66%(1/6) 0%(0/6) 16,66%(1/6) 0%(0/6) 100%(5/5) 60%(3/5) 80%(4/5) 80%(4/5) 83,33%(5/6) 66,66%(4/6) 83,33%(5/6) 100%(6/6) 0%(0/5) 40%(2/5) 0%(0/5) 0%(0/5) 0%(0/6) 33,33%(2/5) 0%(0/6) 0%(0/6) Distribuição Focal Multifocal Difuso CaTMB (-) Trat (-) CaTMB (-) Trat(+) CaTMB (+) Trat(-) CaTMB (+) Trat(+) PERI INTRA PERI INTRA PERI INTRA PERI INTRA Discreto 20%(1/5) 40%(2/5) 60%(3/5) 0%(0/5) 33,33%(2/6) 33,33%(2/6) 50%(3/6) 0%(0/6) Moderado 80%(4/5) 60%(3/5) 40%(2/5) 100%(5/5) 66,66%(4/6) 50%(3/6) 16,66%(1/6) 83,33%(5/6) Intenso 0%(0/5) 0%(0/5) 0%(0/5) 0%(0/5) 0%(0/6) 16,66%(1/6) 33,33%(2/6) 16,66%(1/6) Intensidade 51 Figura 11.Carcinoma em Tumor Misto Benigno (CaTMB) com metástase para linfonodo e análise morfológica e quantitativa do infiltrado inflamatório associado a neoplasia. A) CaTMB – proliferação epitelial com crescimento infiltrativo associada a reatividade de células mioepiteliais produtoras de matriz mixoide. HE – 200X. B) Metástase para linfonodo com células neoplásicas no seio subcapsular (cabeça de seta) e vaso linfático (seta). HE – 100X. C) CaTMB – Intenso infiltrado inflamatório macrofágico peritumoral (seta) e discreto infiltrado inflamatório mononuclear intratumoral (cabeça de seta). HE – 100X. D) Detalhe do infiltrado macrofágico peritumoral observado na figura D. HE – 400X. 52 A morfometria do infiltrado inflamatório associado ao tumor revelou ser os linfócitos a população celular predominante, seguido dos macrófagos (confirmação realizada pela análise quantitativa em lâminas coradas em HE pela sua morfologia e imunomarcação com anticorpo CD68), exceto no grupo dos animais sem metástase e que receberam o tratamento quimioterápico (CaTMB (-) Trat(+)), em que a densidade dos macrófagos foi significativamente maior (Figura 12). Confirmando os resultados observados na literatura humana e veterinária, em que dentre as células do sistema imune, o linfócito é o tipo mais observado seguido dos macrófagos nos carcinomas mamários (DAMASCENO, 2009; ESTRELA-LIMA et al., 2010; HEYS et al., 2012). O infiltrado macrofágico com intervalo ≥ 400 teve associação significativa com o alto grau histológico e tratamento quimioterápico (tabela 4). Semelhante ao descrito por Heys e colaboradores (2012) que observaram, em um estudo realizado com mulheres portadoras de carcinomas mamários, uma maior densidade do infiltrado macrofágico naqueles tumores com grau histológico avançado e resposta a quimioterapia. O que pode ser explicado, mais uma vez pelo estado de ativação dos macrófagos, em se tratando da graduação, pela predominância do infiltrado macrofágico na sua forma anti-inflamatória e na resposta a quimioterapia pela predominância do infiltrado macrofágico na sua forma pró-inflamatória. A avaliação das secções histológicas imunomarcadas com os anticorpos antiSOCS1 e anti-SOCS3 para caracterização do infiltrado macrofágico associado ao carcinoma em tumor misto de cadelas, neste estudo, revelou que a maior expressão das proteínas SOCS predominante nos macrófagos associados a neoplasias com metástase para linfonodo era do tipo SOCS1 positivo. Enquanto que os tumores sem desenvolvimento de metástase local apresentava como população predominante, os macrófagos SOCS3 positivos (Figura 13). O estudo realizado por Estrela-Lima e colaboradores (2010), além de definir o linfócito como principal tipo celular, seguido dos macrófagos, também revelou ser os linfócitos T CD4⁺ predominantes nos carcinomas e carcinoma em tumor misto com metástase, e as células T CD8⁺ relacionadas aos carcinomas em tumores mistos sem metástases, ou seja T CD4⁺ relacionado a evolução neoplásica enquanto T CD8⁺ ao 53 combate tumoral. Os resultados obtidos nesse estudo demonstram que assim como os subtipos de linfócitos o estado de ativação dos macrófagos, aparentemente definirá seu papel como um potente efetor contra o câncer ou estimulador do desenvolvimento tumoral. Tabela 4. Associação entre parâmetros clinico - patológicos com intervalos distintos de macrófagos <400 ou ≥400. Intervalo de macrófagos Parâmetros <400 ≥400 p-valor Condição Sobrevida Metástase Graduação Tamanho Quimioterapia Distribuição Intervalo Total Vivo 5 (22 73%) 6 (27,27%) Morto 5 (22,73%) 6 (27,27%) <180 dias 1 (4,55%) 4(18,18%) >180 dias 9 (40,91%) 8(36,36%) Não 5 (22,73%) 5 (22,73%) Sim 5 (22,73%) 7 (31, 1%) 1 4 (18,18%) 0 (0,00%) 2 6 (27,27%) 12 (54,55%)* 3-5cm 4 (18,18%) 1 (4,55%) >5cm 6 (27,27%) 11 (50,00%) Não 9 (40,91%) 2 (9,10%)* Sim 1 (4,55%) 10 (45,45%) Peri 4 (18,18%) 1 (4,55%) Intra 6 (27,27%) 11 (55,00%) Discreto 1 (4,55%) 0 (0,00%) Moderado 4 (18,18%) 4 (18,18%) Intenso 5 (22,73%) 8 (36,36%) 0, 65 0 097 0,696 0,029* 0,105 0,001* 0,105 0,467 Diferença significativa p<0.05. Existe uma complexa interação entre linfócitos, em especial os linfócitos T CD4⁺ e macrófagos no microambiente tumoral. Durante o seu processo de ativação os linfócitos T CD4⁺ se diferenciam nas formas Th1 e Th2, responsáveis pela ativação dos 54 macrófagos na sua forma clássica e alternativa respectivamente (MARTINEZ; GORDON, 2014). A diferenciação dos linfócitos no fenótipo Th1 é induzida principalmente pela IL-12 e o IFN-γ, este último secretado pelas células NK no combate as células neoplásica, age sobre macrófagos e células dendríticas resultando na maior produção da IL-12. O fenótipo Th2 ocorre devido à exposição gradual dos linfócitos CD4⁺ a IL-4 produzida pelos mastócitos e por elas mesmas em pequenas quantidades quando estimuladas por antígenos (ROMAGNANI, 1997; ROMAGNANI et al., 1998). Figura 12. Composição do infiltrado inflamatório associado ao CaTMB. População dos leucócitos infiltrados no CaTMB, subcategorizados de acordo com a ausência (-) ou presença (+) de metástase em linfonodo e a realização do tratamento quimioterápico. As células inflamatórias foram caracterizadas por análise de imagens, tal como descrito em Materiais e Métodos. L=linfócitos; M=macrófagos; P=plasmócitos; N=neutrófilos; E=eosinófilos. 55 A polarização dos macrófagos para a sua forma de ativação alternativa (M2) tem sido relacionada a linhagens de células de tumor de mama com aumento na produção da IL-4 por parte das células Th2, granulócitos e pelos próprios macrófagos (OGHUMU et al., 2014). Enquanto que, a ativação clássica dos macrófagos na imunidade antitumoral acontece principalmente a partir da liberação do IFN-γ por parte dos linfócitos Th1 (MARTINEZ; GORDON, 2014). Os resultados aqui observados corroboram os resultados da literatura que relatam o infiltrado macrofágico na sua forma M2 (se utilizarmos como base a expressão da proteína SOCS1 para diferenciação do tipo macrofágico, como utilizado por Heys et al., 2012), associado a neoplasias de pior prognóstico, por promover o seu crescimento, progressão e desenvolvimento de metástases através da produção e liberação de fatores de crescimento (NF-κB), citocinas imunomoduladoras (IL-10, TGFβ), estimular a angiogênese, a remodelação do estroma tumoral (metaloproteinases) e inibição da resposta imune anti-tumoral (MANTOVANI et al., 2002; MANTOVANI, 2007; SHAN DENG et al., 2012). Figura 13. Caracterização da expressão das proteínas SOCS1 e SOCS3 no infiltrado macrofágico associado ao CaTMB em cadelas. A) Grupo de animais sem metástase apresentando maior número de TAM SOCS3 positivos – p-valor 0,014 (SOCS1 - 128±103,5 / SOCS3 - 343±124,75). B) Grupo de animais com metástase apresentando maior número de TAM SOCS1 positivos – p valor 0,0097 (SOCS1 161±33,1 / SOCS3 - 124±25). 56 Na e colaboradores (2013) relataram em um estudo realizado com ratos portadores de neoplasia mamária, que os animais submetidos ao bloqueio da COX-2 apresentavam uma redução do número de casos metástases associado ao aumento do TNF-α, que sabidamente é um dos principais estímulos para a ativação dos macrófagos na sua forma clássica (MARTINEZ; GORDON, 2014). Os infiltrados macrofágicos tumorais com predomínio do tipo M1 são relacionados ao combate as células tumorais por sua ação citotóxica direta ou sensibilização de linfócitos T CD8⁺ (MANTOVANI, 2007). Imunofenotipagem no sangue periférico no contexto ex vivo – IMF CD14+ MHCI e MHCII A imunofenotipagem do sangue periférico, por citometria de fluxo, não demonstrou diferenças significativas na expressão das moléculas MHCI e MHC II em monócitos CD14+ nos diferentes grupos (Figura 14). Contudo, de forma interessante, observa-se a mesma distribuição na concentração nos grupos, quando comparamos a expressão do MHC II em monócitos CD14+ e a densidade de macrófagos infiltrados no tumor (Figura 14). Na resposta imune as moléculas do MHC são necessárias para apresentar os antígenos aos linfócitos T. As moléculas da classe II são, em geral, encontradas somente nas células dendríticas, nos linfócitos B e nos macrófagos. A sua expressão é regulada por várias citocinas, em especial o IFN-γ que é o principal estimulador da expressão das moléculas da classe II nos macrófagos, principalmente em resposta a estímulos inflamatórios e imunológicos. No presente estudo a expressão das moléculas MHCII nos monócitos circulantes acompanhou o padrão de distribuição da densidade do infiltrado macrófagico tumoral nos diferentes grupos. Este achado pode resultar da liberação da proteína quimioatraente de monócitos-1 no microambiente tumoral pelas células neoplásicas atraindo os monócitos do sangue periférico das cadelas portadoras de carcinoma em tumor misto para o sítio tumoral. Contudo, a sua complexa interação com as outras células inflamatórias no microambiente, em especial os linfócitos T CD4⁺, irá determinar o seu estado de ativação, o que aparentemente definirá seu papel 57 como um potente efetor contra o câncer ou estimulador do desenvolvimento tumoral (ZHANG et al., 1997; QIAN et al., 2009). Comparação das curvas de sobrevida Para avaliação da curva de sobrevida, inicialmente foi realizada a estratificação com base nos grupos experimentais, presença ou ausência de metástase, realização do tratamento quimioterápico com a Carboplatina e a densidade do infiltrado inflamatório. Dos 22 animais 15 vieram a óbito durante o período de acompanhamento, sendo que destes, 12 foram necropsiados e identificadas metástases à distância em pele (3/12), fígado (3/12), rins (2/12) e pulmão (9/12)). Também foi identificada síndrome paraneoplásica e choque hipovolêmico como a causa mortis mais frequente, principalmente nos grupos dos animais tratados. Em estudo realizado com ratos por Siddik e colaboradores (1987) para avaliar a toxicidade de carboplatina, foi observado que na dose máxima recomendada (5 mL/Kg - IV), os animais apresentaram principalmente durante o nadir da droga (9-14 dias), emagrecimento, anemia grave (devido aumento da fragilidade osmótica e secundária a trombocitopenia), leucopenia e trombocitopenia. Os resultados demonstraram haver diferença significativa apenas quando avaliamos os grupos de animais com metástase submetidos ou não ao tratamento quimioterápico. A sobrevida mínima após a cirurgia foi de 60 dias e o maior período, dentro do intervalo de estudo, foi 695 dias, esses permanecendo ainda vivos e em acompanhamento (Figura 15). Na comparação das curvas de sobrevida, quando estratificada baseada no intervalo do infiltrado de macrófagos (<400 ou ≥400), os animais com infiltrado macrofágico tumoral ≥ 400 (Média = 364 dias) apresentam visualmente uma taxa de sobrevida maior, contudo, sem diferença estatística significativa (Figura 15). Esta tendência de maior sobrevida dos animais com maior densidade de macrófagos associados ao tumor corrobora com os resultados de Damasceno, 2009, mas contrasta 58 com os resultados apresentados por Heys e colaboradores (2012) que correlacionaram uma maior sobrevida com a menor densidade do infiltrado macrofágico. Alguns resultados avaliados separadamente, podem ser considerados bastante controversos, a exemplo, da tendência a uma maior sobrevida em pacientes com maior densidade de infiltrado macrofágico associado ao tumor e da constatação da maior densidade de macrófagos no grupo com metástase (CaTMB+ (Q)), sabidamente de pior prognóstico. Entretanto, deve-se atentar para a predominância neste mesmo grupo da maior expressão da proteína SOCS1. Desta forma, nota-se que além da densidade, a expressão das proteínas SOCS e o possível estado de ativação dos macrófagos é determinante para sua função no microambiente tumoral. 59 Figura 14. Expressão das moléculas MHCI e MHCII nos monócitos circulantes e densidade de macrófagos intratumorais no carcinoma em tumor misto. Topo do quadro) Expressão de MHCI e MHCII em monócitos CD14+ nos diferentes grupos experimentais, segregados pela presença ou ausência de metástase para linfonodo, seguido da subcategorização baseada na realização ou não do tratamento quimioterápico com Carboplatina. As populações dos monócitos foram identificadas por citometria de fluxo como descrito em Materiais e Métodos. Os dados foram expressos como percentagem de células positivas dentro dos monócitos capturados. Quadro inferior) Densidade do infiltrado macrofágico nos diferentes grupos experimentais. Diferenças significativas para p<0.05 foi destacado por asterisco. 60 Figura 15. Taxas de sobrevida dos animais com CaTMB. Curvas de sobrevida Kaplan-Meier dos animais com base no intervalos de macrófagos <400 (MAC<400) ou ≥400 (MAC≥400) (topo do quadro) e dos grupos experimentais subcatergorizados de acordo com a ausência (-) ou presença (+) de metástase em linfonodo e a realização (T) ou não do tratamento quimioterápico (parte inferior do quadro). Os animais foram submetidos a acompanhamento trimestral após a cirurgia e as taxas de sobrevida (%) expressas em dias, tal como descrito em Materiais e Métodos. As curvas de sobrevida foram estimadas pelo método de Kaplan-Meier, seguido pelo teste de Log-rank. Diferenças significativas para p<0.05 foi destacado por asterisco. 61 Análise univariada e multivariada A análise univariada correlacionando os parâmetros clinico-patológicos relacionados à maior densidade do infiltrado macrofágico (≥400) foram o estadiamento clínico, a graduação histopatológica, o tamanho da neoplasia, o tratamento quimioterápico e a expressão de moléculas MHCI em monócitos circulantes. Resultado semelhante foi observado na análise multivariada, em que apresentaram diferença significativa em relação ao estadiamento clínico, graduação, sobrevida, tratamento quimioterápico e a expressão de moléculas MHCI em monócitos circulantes (Tabela 5). Estes resultados indicam que maiores infiltrados macrofágicos tenha como predominante a expressão da proteína SOCS1 estimulando desta forma o crescimento e a progressão tumoral. Tabela 5. Análises univariada e multivariada dos parâmetros clínico-patológicos associados com o maior intervalo macrofágico (≥400). Parâmetros Análises (pvalor) Univariada Multivariada Estadio Clinico 0,006* 0,025* Graduação 0,015* 0,007* Tamanho 0,011* 0,078 Metastase 0,696 0,572 Sobrevida 0,084 0,045* Quimioterapia 0,001* 0,001* Ativação 0,696 0,721 0,335 0,944 IMF CD14 MHC I 0,001* 0,018* Peri.0/Intra.1 0,072 0,078 Infiltrado Total 0,303 0,140 IMF CD14+MHC II+ + + *Selecionado pelas análises uni e multivariada. Para a análise univariada foi utilizada a Correlação de Sperman para verificação entre variáveis. Análise multivariada – regressão logística. Diferenças significativas para p<0.05 foi destacado por asterisco. 62 7. CONCLUSÕES Os resultados obtidos nesse estudo, nas condições metodológicas empregadas, permitiram concluir: A partir da análise morfométrica das respostas inflamatórias associada aos carcinomas em tumores mistos de cadelas foi observado que o macrófago é o segundo tipo celular predominante, em um infiltrado inflamatório predominantemente moderado e com distribuição multifocal; A imunomarcação dos macrófagos infiltrantes revelou maior porcentagem de macrófagos SOCS3 positivos no grupo de animais sem metástase, sugerindo o efeito antitumoral destas células, enquanto que os macrófagos SOCS1 positivos foram predominantes nos animais portadores de metástase, contribuindo desta forma para a progressão tumoral e o desenvolvimento de metástases; As maiores taxas de sobrevida estiveram relacionadas à maior densidade do infiltrado macrofágico com predomínio da expressão da proteína SOCS3. 63 8. REFERÊNCIAS ADAMS, O. D.; HAMILTON, T. A. Molecular basis of macrophage activation and its origins. 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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA ESCOLA DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA HOSPITAL DE MEDICINA VETERINÁRIA TERMO DE DOAÇÃO Pelo presente termo, eu ___________________________________________________, RG ______________________________, CPF________________________________, endereço ______________________________________________________________ ______________________________________________________________________, faço a doação do corpo a este Hospital Veterinário do animal da espécie ___________________, raça ________________________, sexo __________, pelagem _________________, nome _______________, idade __________, para que esta instituição utilize-o para realização da necropsia em aulas práticas ou projetos de pesquisa. Salvador, ____ de ______________ de ______ ____________________________________________________ Assinatura do doador Obs: Anexar a Ficha Histórico/Laudo Técnico emitida pelo Médico Veterinário ______________________________________________________________________ Av. Adhemar de Barros, 500 – Ondina Tel: (71) 3283-6738 Email: [email protected] 76 Anexo 4: Tabela com os resultados da análise hematológica. Parâmetros hematológicos em cadelas com CaTMB segregadas quanto a presença ou ausência de metástase. Leucócitos Parâmetros hematológicos Hemácias Plaquetas Total Neutrófilos Eosinófilos Monócitos Linfócitos Basófilo CaTMB (-) CaTMB (+) 6,55 ±0,99 408000 ±132125 12,600 ±6050 7097 ±721 405,5 ±721 373,5 ±721 1337 ±721 0 6,35 ±0,85 420000 ±101750 13950 ±3538 11029 ±178,2 577,5 ±178,15 507 ±178,15 1482 ±178,5 0 a Hemácias são expressadas como número x 106/mm3 de sangue. b Plaquetas são expressadas como número x 103/mm3 de sangue. c Subpopulações de células sanguíneas brancas são expressadas como número x 103/mm3 de sangue.
