Instrumentação em Microscopia de Força Atômica de Alto

Instrumentação em Microscopia de Força Atômica
de Alto Desempenho - Aplicações em Biologia
Geraldo Antônio Guerrera Cidade
IBCCF/UFRJ
Laboratório de Física Biológica - IBCCF/UFRJ
Hansmalab, Departamento de Física - Universidade da Califórnia de Santa Barbara (UCSB)
AFM em Nanobiotecnologia
Caracterização de superfícies biológicas a partir de
• Imagens tridimensionais;
• Espectroscopia de força.
Vantagens
• Fácil e rápida preparação da amostra;
• Capaz de utilizar amostras vivas, em
seu meio natural, mantendo suas
propriedades biológicas;
• Permite a medição em 3 dimensões.
Principal Limitação
• Velocidade de varredura, durante a aquisição
de imagens.
Microscopia de Varredura por Sonda
(“Scanning Probe Microscopy - SPM”)
Microscopia de Varredura por Tunelamento
(“Scanning Tunneling Microscopy - STM”)
1981-2
Campo Próximo
(“Scanning Near Field Optical
Microscopy - SNOM”)
Foto-tunelamento
(“Photon Scanning Tunneling
Microscopy - PSTM”)
Microscopia de Força Atômica
(“Atomic Force Microscopy - AFM”)
1986
Microscopia de Força Magnética
(“Magnetic Force Microscopy - MFM”)
Microscopia de Força Eletrostática
(“Electrostatic Force Microscopy - EFM”)
Condutância Iônica
(“Scanning Ion Conductance
Microscopy - SICM”)
Capacitância
(“Scanning Capacitance
Microscopy - SCM”)
Potencial Químico
(“Scanning Chemical
Potential Microscopy SCPM”)
Térmica
(“Scanning Thermal
Microscopy - SThM”)
Microscopia de Varredura por Força
(“Scanning Force Microscopy - SFM”)
Divisor
Fotodetetor
Espelho
A
Diodo
Laser
+
B
z
Cantilever
Vset
amostra
y
x
Integrador
PP
Vsaída
Cantilever (haste) e tip
200 µm
800x
65x
0.06
0.32
5000x
0.58
0.12
Tipos de haste
Graus de liberdade de uma haste simples
eigenfrequency
Alcance das Forças de Interação
Modos de Operação
Modo Contato
Altura Constante
Modo Contato
Força Constante
Modo Contato
Força Lateral
Alcance: forças repulsivas
Alcance: forças repulsivas
Alcance: forças repulsivas
Modo Não-contato
Modo Intermitente
(“tapping”)
Contraste de Fase
Alcance: forças repulsivas
e atrativas
Alcance: forças repulsivas
e atrativas
Alcance: forças atrativas
Curva Força x Distância
Espectroscopia de Força
Medida 1
Medida 2
AFM do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho – 1996
Projeto conjunto com a Universidade Técnica de Munique
Asylum MFP-3D-SA
Trypanosoma Cruzi – modo contato
microtúbulos
flagelo
Imagem cedida pelo doutorando Gustavo Miranda Rocha, orientado pelos Profs. Wanderley de Souza (Lab de
Ultraestrutura Celular Herta Meyer – IBCCF/UFRJ) e Gilberto Weissmüller (Lab de Física Biológica – IBCCF-UFRJ).
Visão Tridimensional
Imagem cedida pelo doutorando Gustavo Miranda Rocha, orientado pelos Profs. Wanderley de Souza (Lab de
Ultraestrutura Celular Herta Meyer – IBCCF/UFRJ) e Gilberto Weissmüller (Lab de Física Biológica – IBCCF-UFRJ).
Trypanosoma Cruzi – modo “tapping”
Imagem cedida pelo doutorando Gustavo Miranda Rocha, orientado pelos Profs. Wanderley de Souza (Lab de
Ultraestrutura Celular Herta Meyer – IBCCF/UFRJ) e Gilberto Weissmüller (Lab de Física Biológica – IBCCF-UFRJ).
Trypanosoma Cruzi – contraste de fase
Imagem cedida pelo doutorando Gustavo Miranda Rocha, orientado pelos Profs. Wanderley de Souza (Lab de
Ultraestrutura Celular Herta Meyer – IBCCF/UFRJ) e Gilberto Weissmüller (Lab de Física Biológica – IBCCF-UFRJ).
Visão Tridimensional
Imagem cedida pelo doutorando Gustavo Miranda Rocha, orientado pelos Profs. Wanderley de Souza (Lab de
Ultraestrutura Celular Herta Meyer – IBCCF/UFRJ) e Gilberto Weissmüller (Lab de Física Biológica – IBCCF-UFRJ).
Imagem cedida pelo doutorando Gustavo Miranda Rocha, orientado pelos Profs. Wanderley de Souza (Lab de
Ultraestrutura Celular Herta Meyer – IBCCF/UFRJ) e Gilberto Weissmüller (Lab de Física Biológica – IBCCF-UFRJ).
Imagem cedida pelo doutorando Gustavo Miranda Rocha, orientado pelos Profs. Wanderley de Souza (Lab de
Ultraestrutura Celular Herta Meyer – IBCCF/UFRJ) e Gilberto Weissmüller (Lab de Física Biológica – IBCCF-UFRJ).
Imagem cedida pelo doutorando Gustavo Miranda Rocha, orientado pelos Profs. Wanderley de Souza (Lab de
Ultraestrutura Celular Herta Meyer – IBCCF/UFRJ) e Gilberto Weissmüller (Lab de Física Biológica – IBCCF-UFRJ).
Medidas em AFM
distances:
58 + 1.1 nm
92nm
Height
88
84
80
0
100
200
300
nm
Figura cedida pelo doutorando Gustavo Miranda Rocha, orientado pelos Profs. Wanderley de Souza (Lab de
Ultraestrutura Celular Herta Meyer – IBCCF/UFRJ) e Gilberto Weissmüller (Lab de Física Biológica – IBCCF-UFRJ).
400
Fast Scanning - protótipo
AFM CONVENCIONAL
AFM DE ALTO DESEMPENHO
NOVA CONCEPÇÃO DE PIEZOSCANNER PARA AQUISIÇÃO DE
IMAGENS EM REGIME DE ALTA VELOCIDADE DE VARREDURA
NOVA CONCEPÇÃO DE PIEZOSCANNER PARA AQUISIÇÃO DE
IMAGENS EM REGIME DE ALTA VELOCIDADE DE VARREDURA
NOVA CONCEPÇÃO DE PIEZOSCANNER PARA AQUISIÇÃO DE
IMAGENS EM REGIME DE ALTA VELOCIDADE DE VARREDURA
8 µm
piezo
a
strain-gauges
ranhura
Y
X
Z
X
8 µm
Y
Piezo
complementar
b
amostra
Z
piezo
Zc
contra-piezo
AMPLIFICADOR DE ALTA VOLTAGEM EM BANDA LARGA PARA
EXCITAR OS EIXOS DE VARREDURA X e Y ….
…. ADAPTADO A CONTROLADORA DE UM NANOSCOPE III ®
DA DIGITAL INSTRUMENTS
AVALIAÇÃO DINÂMICA DO PIEZO Z UTILIZANDO UM SENSOR FOTÔNICO
MTI-2000 FOTONIC SENSOR
HP-AGILENT 4395A
SCANNER
HP 6010A
150V
MTI-2000
HP-AGILENT 4395A
MEDIDAS DE CROSSTALK UTILIZANDO SENSOR FOTÔNICO
MEDIDAS DE CROSSTALK UTILIZANDO SENSOR FOTÔNICO
AVALIAÇÃO DA RESPOSTA GLOBAL DO CONJUNTO
PIEZO-FOTODETETOR UTILIZANDO O CANTILEVER COMO SENSOR
4
CORREÇÃO DA NÃO-LINEARIDADE DO SCANNER
ATRAVÉS DO USO DE STRAIN-GAUGES
Correção da não-linearidade
Efeitos da não-linearidade
Não-Linearizada
Linearizada
a
c
b
d
Células de Mastócito
6 µm
Small Cantilevers
Advantages: higher ressonant frequencies (180 KHz in liquid –
factor of 30), keeping the same spring constant (0.064 N/m), for
better high S/N ratio high speed AFM applications in biology.
Johannes H. Kindt, Jackie Cutroni, Thomas Gutsmann, Paul K. Hansma,
New Atomic Force Microscopes (AFM) for the Study of Enzymatic Properties and Processes
Bone Research
http://hansmalab.physics.ucsb.edu
Human Bone
Bone Crusher Prototype (1st Version)
Bone Crusher Prototype (2nd Version)
Bone Crusher Prototype (2nd Version)
plunger
Pulling Experiments
Movie of a Chick Brain Myosin V Molecule on Mica,
in Aqueous Solution.
This movie is reconstructed from 20 successive images taken at 80
msec intervals. These images are ringed as 1,2,- -19,20,19,18,- - -2,1.
The first image is marked with "1". One Cycle is 3 sec. Each image
consists of 100x100 pixels. The frame rate is 12.5/sec. The scan size is 270 nm.
This AFM Movie was Taken by N. Kodera and T. Ando.
The Myosin V Sample was Prepared by T. Sakamoto and T. Kinoshita
Kanasawa University, Japan
http://www.s.kanazawa-u.ac.jp/phys/biophys/
AFM IMAGE RESTORATION
5µm x 5µm
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
4µm x 4µm