iPSCs Bruna Paulsen
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23/07/12 Tipos de Células-Tronco I Curso Teórico-­‐Prá0co em Células-­‐Tronco Pluripotentes Aplicações das Células-Tronco Pluripotentes Células-­‐Tronco de Pluripotência Induzida iPSCs células-tronco pluripotentes! BRUNA PAULSEN 18 JULHO 2012 Células-Tronco Embrionárias como alternativa de célula-tronco pluripotente Reprogramação Celular como alternativa de célula-tronco pluripotente Resumo 1) Reprogramação celular 2) Geração de iPSCs 3) Entendendo o processo de reprogramação 4) Limitações da utilização de iPSCs célula! somática! célula-tronco pluripotente! 5) Vantagens da utilização de iPSCs 6) iPSCs e Esquizofrenia (LaNCE) Algumas Limitações 1. Nem todas as doenças podem ser diagnosticadas em blastocistos;! 2. Escassez de embriões.! Principal Limitação Isso é possível?! (já resolvida) Estratégias de Reprogramação Celular célula! somática! célula-tronco pluripotente! Estratégias de Reprogramação Celular célula! somática! célula-tronco pluripotente! Limitações Reprogramação Celular Fusão celular Fusão celular • Evento muito raro; ! • Ocorre naturalmente;! • Pode ser induzido.! • Evento muito raro; ! • Ocorre naturalmente;! • Pode ser induzido.! Só ocorre quando há fusão de núcleos.! 1 23/07/12 Estratégias de Reprogramação Celular célula! somática! célula-tronco pluripotente! Estratégias de Reprogramação Celular célula! somática! célula-tronco pluripotente! Estratégias de Reprogramação Celular célula! somática! célula-tronco pluripotente! Limitações Fusão celular óvulo! Transferência nuclear (clonagem terapêutica) célula! somática! Fusão celular óvulo! Não funcionou com a Transferência nuclear remoção dos cromossomos;! (clonagem terapêutica) ! célula! somática! célula! somática! Células-Tronco de Pluripotência Induzida Transferência nuclear (clonagem terapêutica) Fusão celular Gerou células triplóides;! ! Dificuldades técnicas;! ! Limitações éticas e legais.! Utilização de fatores definidos célula-tronco de pluripotência induzida! Células-Tronco de Pluripotência Induzida iPS naka! Shinya Yama Shinya Yamanak a! Geração de iPSCs Mas, que genes utilizar?! Células-Tronco de Pluripotência Induzida Células-Tronco de Pluripotência Induzida Células-Tronco de Pluripotência Induzida 24 genes candidatos (envolvidos com pluripotencialidade e proliferação) • • • • • • • • • • • • 1 Ecat1! 2 Dppa5(Esg1)! 3 Fbxo15! 4 Nanog! 5 ERas! 6 Dnmt3l! 7 Ecat8! 8 Gdf3! 9 Sox15! 10 Dppa4! 11 Dppa2! 12 Fthl17! • • • • • • • • • • • • 13 Sall4! 14 Oct3/4 (Pou5f1)! 15 Sox2! 16 Rex1(Zfp42)! 17 Utf1! 18 Tcl1! 19 Dppa3(Stella)! 20 Klf4! 21 β-catenin! 22 c-Myc! 23 Stat3! 24 Grb2! 2 23/07/12 Estratégias para a reprogramação celular - iPS Células-Tronco de Pluripotência Induzida Estratégias para a reprogramação celular - iPS Células-Tronco de Pluripotência Induzida Testes para confirmar reprogramação Seleção de 4 fatores c-Myc Klf4 Oct4 Seleção de 10 fatores Klf4 Oct4 Estratégias para a reprogramação celular - iPS Células-Tronco de Pluripotência Induzida Sox2 Seleção de 24 fatores Sox2 Células-Tronco de Pluripotência Induzida Células-Tronco de Pluripotência Induzida “Quarteto fantástico” Critérios Oct-4, Sox2, Klf4 e c-Myc! Morfológico Molecular Padrão de expressão gênica;! ! Padrão de metilação.! ! camundongo humano Funcional Diferenciação nos 3 folhetos (in vitro);! ! Formação de teratomas;! ! Formação de quimeras;! ! Complementação tetraplóide.! Células-Tronco de Pluripotência Induzida Fatores de transcrição Endendendo o processo de reprogramação iPSCs de camundongo 2006: INDUCTION OF PLURIPOTENT STEM CELLS FROM MOUSE EMBRYONIC AND ADULT FIBROBLAST CULTURES BY DEFINED FACTORS (Takahashi and Yamanaka, 2006) 2007: INDUCTION OF PLURIPOTENT STEM iPSCs humana CELLS FROM ADULT HUMAN FIBROBLASTS BY DEFINED FACTORS (Takahashi et al., 2007) 2007: INDUCED PLURIPOTENT STEM CELL LINES DERIVED FROM HUMAN SOMATIC CELLS (Yu et al., 2007) DNA Entendendo o processo de reprogramação Genes acessíveis Genes inacessíveis 3 23/07/12 Endendendo o processo de reprogramação Endendendo o processo de reprogramação Célula Somática Célula-Tronco Pluripotente cromatina! cromatina! (Plath e Lowry; Nature Reviews, 2011) genes somáticos! sem telomerase! e X inativado ! características ! mesenquimais! Alterações transcricionais Alterações na croma<na características ! epiteliais! Empacotamento de células Alterações feno7picas Mudança do ciclo celular CaracterísTcas de células epiteliais Aparência pequena e arredondada genes de pluripotencialidade! tem telomerase! e X ativo! (Plath e Lowry; Nature Reviews, 2011) Aumento da proliferação Alterações feno7picas Endendendo o processo de reprogramação CaracterísTcas de CTE Down-­‐regulaTon de genes somáTcos Up-­‐regulaTon de genes embrionários relacionados à proliferação e caracterísTcas epiteliais das CTE Alterações transcricionais Up-­‐regulaTon de genes de proliferação e replicação do DNA Alterações de expressão gênica restrita à regiões de eucromaTna Alterações na croma<na Alteração epigenéTca de genes de pluripotencialidade sem que haja alteração na expressão gênica Endendendo o processo de reprogramação Endendendo o processo de reprogramação Endendendo o processo de reprogramação Colônias de células são óbvias Nível de Expressão Nível de Expressão (Plath e Lowry; Nature Reviews, 2011) Alterações feno7picas Nível de Expressão Silenciamento dos genes exógenos Up-­‐regulaTon de genes-­‐ chave e reguladores do estado de pluripotência Alterações transcricionais ReaTvação do Xi Alterações na croma<na fatores exógenos" fatores endógenos" total" Perda da caracterísTca de cromaTna repressiva em diversos genes de pluripotencialidade Endendendo o processo de reprogramação Endendendo o processo de reprogramação Como os fatores de transcrição induzem a reprogramação? Como os fatores de transcrição induzem a reprogramação? fatores exógenos! fatores exógenos! Células somá<cas fatores endógenos! genes somáticos! Senescência X Morte celular Barricada de supressores de tumor Barricada de supressores de tumor Estágios intermediários fatores endógenos! fatores endógenos! Transformação Diferenciação Parede da epigenéTca iPSCs 4 23/07/12 Limitações do processo de reprogramação 1) Alterações características do processo de reprogramação; Limitações do processo de reprogramação Alterações características do processo de reprogramação Exemplos 2) Variabilidade nos protocolos de geração de hiPSCs; 3) Protocolos de diferenciação pouco eficientes; Aberrações cromossomiais 4) Desafios na modelagem de algumas desordens; Limitações da utilização de iPSCS 5) Processo caro, laborioso, lento e pouco eficiente. Limitações do processo de reprogramação Limitações do processo de reprogramação Limitações do processo de reprogramação Variabilidade nos protocolos de geração de hiPSCs Alterações características do processo de reprogramação Alterações características do processo de reprogramação Exemplos Exemplos Aberrações cromossomiais Reprogramação epigenética incompleta Aberrações cromossomiais Reprogramação epigenética incompleta Inativação incompleta do cromossomo X Ben-­‐David et al., 2011 Limitações do processo de reprogramação Limitações do processo de reprogramação Variabilidade nos protocolos de geração de hiPSCs Variabilidade nos protocolos de geração de hiPSCs 100% 100% Limitações do processo de reprogramação 1) Alterações características do processo de reprogramação; 2) Variabilidade nos protocolos de geração de hiPSCs; 50% 3) Protocolos de diferenciação pouco eficientes; Células-­‐tronco pluripotentes (massa celular interna blastocisto) 50% 50% 50% 50% 50% Células somáTcas 4) Desafios na modelagem de algumas desordens; 5) Processo caro, laborioso, lento e pouco eficiente. 5 23/07/12 Limitações do processo de reprogramação Limitações do processo de reprogramação Variabilidade nos protocolos de geração de hiPSCs Variabilidade nos protocolos de geração de hiPSCs Integração de fatores externos no genoma da célula Não integração de fatores externos no genoma da célula Integração aleatória de fatores no genoma! Eficiência reduzida! Limitações do processo de reprogramação 1) Alterações características do processo de reprogramação; 2) Variabilidade nos protocolos de geração de hiPSCs; 3) Protocolos de diferenciação pouco eficientes; 4) Desafios na modelagem de algumas desordens; Diferentes protocolos de cultivo das células podem aumentar a variabiliadade entre as linhagens de células-tronco pluripotentes.! 5) Processo caro, laborioso, lento e pouco eficiente. (Plath e Lowry; Nature Reviews, 2011) Limitações do processo de reprogramação Limitações do processo de reprogramação Limitações do processo de reprogramação Protocolos de diferenciação pouco eficientes Protocolos de diferenciação pouco eficientes Protocolos de diferenciação pouco eficientes Neurônios derivados a par<r de células-­‐tronco pluripotentes Limitações do processo de reprogramação Limitações do processo de reprogramação Protocolos de diferenciação pouco eficientes Protocolos de diferenciação pouco eficientes Limitações do processo de reprogramação 1) Alterações características do processo de reprogramação; Qual a estratégia ideal?! 2) Variabilidade nos protocolos de geração de hiPSCs; 3) Protocolos de diferenciação pouco eficientes; 4) Desafios na modelagem de algumas desordens; Cultura pura Cultura não pura 5) Processo caro, laborioso, lento e pouco eficiente. O melhor ainda é comparar com neurônios no cérebro de pacientes!! 6 23/07/12 Limitações do processo de reprogramação Limitações do processo de reprogramação Limitações do processo de reprogramação Desafios na modelagem de algumas desordens Desafios na modelagem de algumas desordens Desafios na modelagem de algumas desordens ! ! Modelagem de doenças relacionadas ao envelhecimento, como Doença de Parkinson e Alzheimer, in vitro;! ! ! Modelagem de doenças complexas, como algumas desordens mentais, in vitro e in vivo;! ! ! Modelagem de doenças complexas com componentes epigenéticos, já que espera-se que o processo de reprogramação remova todas as alterações desse tipo.! Modelagem de doenças relacionadas ao envelhecimento, como Doença de Parkinson e Alzheimer, in vitro;! ! ! Modelagem de doenças complexas, como algumas desordens mentais, in vitro e in vivo;! ! ! Modelagem de doenças complexas com componentes epigenéticos, já que espera-se que o processo de reprogramação remova todas as alterações desse tipo.! (Saha e Jaenish, 2009) Limitações do processo de reprogramação Limitações do processo de reprogramação Desafios na modelagem de algumas desordens Desafios na modelagem de algumas desordens ! Limitações do processo de reprogramação 1) Alterações características do processo de reprogramação; Esclerose Lateral Aminiotrófica, ! Modelagem de doenças relacionadas ao envelhecimento, como Doença de Parkinson e Alzheimer, in vitro;! ! ! Modelagem de doenças complexas, como algumas desordens mentais, in vitro e in vivo;! ! ! Modelagem de doenças complexas com componentes epigenéticos, já que espera-se que o processo de reprogramação remova todas as alterações desse tipo.! Atrofia Muscular Espinhal, ! Síndrome do X Frágil, ! Doença de Alzheimer, ! Doença de Parkinson, ! Síndrome de Rett, ! ! Limitações do processo de reprogramação Limitações do processo de reprogramação Processo caro, laborioso, lento e pouco eficiente Para gerar muitos pacientes ainda falta muita automaTzação 20-60 dias +! 15-30 dias! Valores considerando todo o processo: ~ R$45.000,00 (1 indivíduo) ~ 4 - 8 meses 4) Desafios na modelagem de algumas desordens; Esquizofrenia.! Processo caro, laborioso, lento e pouco eficiente 30-60 dias +! 15-30 dias! 3) Protocolos de diferenciação pouco eficientes; Síndrome de Timothy, ! 5) Processo caro, laborioso, lento e pouco eficiente. Identificação e reversão do fenótipo (comparação controles e pacientes) 15-30 dias! 2) Variabilidade nos protocolos de geração de hiPSCs; Disautonomia Familiar, ! Estratégia Tipo Celular Eficiência Transdução Retroviral Quatro fatores (Oct4, Sox2, Klf4, c-­‐Myc) Fibroblasto Embrionário Murino Três fatores (Oct4, Sox2, Klf4) Fibroblasto Embrionário Murino 0,01% Três fatores (Oct4, Sox2, Klf4) Fibroblasto Humano 0,001% Três fatores (Oct4, Sox2, Klf4) + VPA Fibroblasto Humano 0,1% 1% Dois fatores (Oct4, Sox2) Fibroblasto Humano 0% Dois fatores (Oct4, Sox2) + VPA Fibroblasto Humano 0,001% Transdução Adenoviral Quatro fatores (Oct4, Sox2, Klf4, c-­‐Myc) Fibroblasto Pós-­‐Natal Murino 0% Quatro fatores (Oct4, Sox2, Klf4, c-­‐Myc) Hepatócito Murino 0,0006% Tranfecção Plasmidial Um plasmídio com Oct4-­‐2A-­‐Klf4-­‐2A-­‐Sox2-­‐ + um plasmídio com c-­‐Myc Fibroblasto Embrionário Murino 0,0015% Referência: William E Lowry & Kathrin Plath Nature Biotechnology 26, 1246 -­‐ 1248 (2008) Vantagens da utilização de iPSCS 7 23/07/12 Vantagens da utilização de hiPSCs na modelagem de doenças Vantagens da utilização de hiPSCs na modelagem de doenças Vantagens da utilização de hiPSCs na modelagem de doenças ü Possibilidade de se acompanhar e detectar fenótipos alterados durante o processo de diferenciação; ü Possibilidade de se acompanhar e detectar fenótipos alterados durante o processo de diferenciação; ü Possibilidade de se acompanhar e detectar fenótipos alterados durante o processo de diferenciação; ü Variedade de tipos celulares gerados, garantindo uma melhor previsão da resposta terapêutica e toxicológica; ü Variedade de tipos celulares gerados, garantindo uma melhor previsão da resposta terapêutica e toxicológica; ü Variedade de tipos celulares gerados, garantindo uma melhor previsão da resposta terapêutica e toxicológica; ü Variedade de linhagens para uma mesma doença humana fornecendo informações sobre a variação genética e potencialmente epigenética de um amplo setor da população; ü Variedade de linhagens para uma mesma doença humana fornecendo informações sobre a variação genética e potencialmente epigenética de um amplo setor da população; ü Variedade de linhagens para uma mesma doença humana fornecendo informações sobre a variação genética e potencialmente epigenética de um amplo setor da população; ü Testes farmacológicos de forma paciente-específica, através da medicina personalizada. ü Testes farmacológicos de forma paciente-específica, através da medicina personalizada. ü Testes farmacológicos de forma paciente-específica, através da medicina personalizada. Vantagens da utilização de hiPSCs na modelagem de doenças ü Possibilidade de se acompanhar e detectar fenótipos alterados durante o processo de diferenciação; ü Variedade de tipos celulares gerados, garantindo uma melhor previsão da resposta terapêutica e toxicológica; Vantagens da utilização de hiPSCs na modelagem de doenças ü Variedade de linhagens para uma mesma doença humana fornecendo informações sobre a variação genética e potencialmente epigenética de um amplo setor da população; ü Testes farmacológicos de forma paciente-específica, através da medicina personalizada. Vantagens da utilização de hiPSCs na modelagem de doenças Genera0on of a model for the study of neural development in schizophrenia using human induced pluripotent stem cells (iPS) iPSCs e Esquizofrenia 8 23/07/12 Modelos experimentais Modelos experimentais Stevens Rehen POS-­‐DOUTORADO Renata Maciel DOUTORANDOS Bruna Paulsen Cleide Souza Mariana Acquarone GRADUAÇÃO Ernesto Pozzaqo Hannah Drummond PESQUISADORES ASSOCIADOS Hamilton Silva MarTn Bonamino (INCa) Paulo Belmonte de Abreu (UFRGS) PROFESSORES COLABORADORES Antonio Galina (IBqM -­‐ UFRJ) Mariana Silveira (IBCCF -­‐ UFRJ) Helena Brentani (USP) Newton Castro (ICB -­‐ UFRJ) OUTROS COLABORADORES Leonardo Chicaybam (INCa) Raffael Massuda (UFRGS) Pedro Perdigão (UFRJ) Estudo das bases biológicas de doenças mentais Representação do estágio final da doença Cérebros post-­‐mortem Até que ponto podem ser comparados a neurônios? Como induzir o transtorno? Que sintomas avaliar? Amostras de tecidos não neurais Animais Pacientes Simulações matemáticas Cultura de células Animais Pacientes Simulações matemáticas Cultura de células Esquizofrenia Esquizofrenia Etiologia Gêmeos idênticos são diferentes! Sintomas Negativos Sintomas Positivos éticos Fatores Gen Fatores Ambienta is Modelos animais Déficits Cognitivos 1 em cada 100 pessoas Estudo das bases biológicas da esquizofrenia Estresse Oxida<vo e Esquizofrenia Fatores genéTcos neurodesenvo lvimento Esquizofrenia e Estresse Oxida<vo Fatores ambientais Estresse oxida<vo Amostras de tecidos não neurais Cérebros post-­‐mortem HipoaTvidade de receptores NMDA Alterações em neurônios PV Disfunção mitocondrial Alterações epigenéTcas Alteração de respostas inflamatórias Anomalias oligodendrocíTcas Defesas an<oxidantes ROS Esquizofrenia Modelos animais Células iPS (Adaptado de Bitanihirwe e Woo, 2011) 9 23/07/12 Esquizofrenia e Estresse Oxida<vo Controle Paciente EZQ Estabelecimento e expansão de fibroblastos fibroblastos Def an<ox esas idan tes ROS Controle Paciente EZQ fibroblastos Células iPS Células iPS Precursores neurais NPC Precursores neurais NPC Tratamento de NPC Tratamento de NPC ROS Estabelecimento e expansão de culturas de fibroblastos de pacientes esquizofrênicos Estabelecimento e expansão de culturas de fibroblastos de controles e pacientes esquizofrênicos Estabelecimento e expansão de culturas de fibroblastos de controles e pacientes esquizofrênicos Pacientes com esquizofrenia biópsia transporte da biópsia processamento das amostras expansão das células Reprogramação de fibroblastos de paciente esquizofrênico e controle Controle Reprogramação de fibroblastos de paciente esquizofrênico e controle Paciente EZQ fibroblastos Reprogramação Células iPS Precursores neurais NPC Tratamento de NPC Fibroblastos EZQ07 antes da transdução Fibroblastos EZQ07 depois da transdução 10 23/07/12 Reprogramação de fibroblastos de paciente esquizofrênico e controle Fibroblastos EZQ07 transduzidos sobre MEF Reprogramação de fibroblastos de paciente esquizofrênico e controle Fibroblastos EZQ07 transduzidos sobre MEF Reprogramação de fibroblastos de paciente esquizofrênico e controle Colônia iPS EZQ07 selecionada Reprogramação de fibroblastos de paciente esquizofrênico e controle Controle Paciente EZQ Caracterização morfológica de células iPS geradas a parTr de fibroblastos de paciente com esquizofrenia e controle fibroblastos Caracterização das células iPS Células iPS Precursores neurais NPC Tratamento de NPC ü Células iPS têm morfologia semelhante a células-tronco embrionárias Alta razão núcleo:citoplasma Paulsen e cols., Cell TransplantaFon, 2011 Expressão de marcadores de pluripotencialidade em células iPS de controle e de paciente com esquizofrenia iPS Controle Diferenciação de células iPS de controle e de paciente com esquizofrenia nos três folhetos embrionários Diferenciação de células iPS em neurônios dopaminérgicos iPS EZQ Co-­‐cul<vo com células PA6 ü Células iPS expressam marcadores de pluripotencialidade Paulsen e cols., Cell TransplantaFon, 2011 ü iPS se diferenciam em células dos 3 folhetos embrionários Paulsen e cols., Cell TransplantaFon, 2011 ü Diferenciação neuronal gera células TH+ a partir de células iPS Paulsen e cols., Cell TransplantaFon, 2011 11 23/07/12 Corpos pulsantes a par<r de iPS Diferenciação de células iPS em neurônios funcionais Controle Paciente EZQ fibroblastos Células iPS Diferenciação neural em NPCs ü Diferenciação gera neurônios funcionais a partir de células iPS Precursores neurais NPC Tratamento de NPC Paulsen e cols., Cell TransplantaFon, 2011 Paulsen e cols., Cell TransplantaFon, 2011 Diferenciação direta de células iPS em precursores neurais (NPC) Controle Paciente EZQ NPCs de paciente com esquizofrenia apresentam níveis de ROS mais elevados fibroblastos Células iPS Iden<ficação do fenó<po alterado 51,9 ± 4,3% 53,7 ± 2,8% Precursores neurais NPC Tratamento de NPC ü Após diferenciação, população enriquecida em progenitores neurais Paulsen e cols., Cell TransplantaFon, 2011 Paulsen e cols., Cell TransplantaFon, 2011 Nível elevado de ROS no NPC do paciente é reverTdo por ácido valpróico Controle Paciente EZQ fibroblastos Ácido Valpróico Estabilizador de humor Células iPS Precursores neurais NPC Reversão do fenó<po alterado Tratamento de NPC VPA Regula a ex pressão de proteínas mitocondri ais; Aumenta a ex glutationa pressão de -S-transfera se Paulsen e cols., Cell TransplantaFon, 2011 12 23/07/12 Conclusão neurodesenvo lvimento Amostras de tecidos não neurais Cérebros post-­‐mortem www.lance-­‐ufrj.org Modelos animais Células iPS bruna.paulsen@lance-­‐ufrj.org 13
