RODRIGO ECHEVERRIA FLORES NÍVEIS SÉRICOS DE

i
RODRIGO ECHEVERRIA FLORES
NÍVEIS SÉRICOS DE INTERLEUCINA – 12 E FATOR
DE NECROSE TUMORAL-a EM DIFERENTES
APRESENTAÇÕES CLÍNICAS DE TOXOPLASMOSE
Dissertação apresentada como requisito para a
obtenção do grau de Mestre, pelo Programa de
Pós – Graduação da Faculdade de Medicina da
Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande
do Sul.
Orientadora: Dra Denise Cantarelli Machado
PORTO ALEGRE, RS
2005
ii
F634n Flores, Rodrigo Echeverria
Níveis séricos de interleucina – 12 e fator de necrose tumoral-? em
diferentes apresentações clínicas de toxoplasmose / Rodrigo Echeverria
Flores; orient. Denise Cantarelli Machado. Porto Alegre: PUCRS, 2005.
37f.: gráf. tab.
Dissertação (Mestrado) – Pontifícia Universidade Católica do Rio
Grande do Sul. Faculdade de Medicina. Programa de Pós-Graduação em
Medicina e Ciências da Saúde.
1. TOXOPLASMOSE. 2. INTERLEUCINA –
TUMORAL. 4. ESTUDOS TRANSVERSAIS.
12/sangue. 3. FATOR DE NECROSE
I. Machado, Denise Cantarelli. II.
Título.
C.D.D. 616.96
C.D.U. 616.993:577.27(043.3)
N.L.M. WC 725
Rosária Maria Lúcia Prenna Geremia/Bibliotecária
CRB10/l96
iii
AGRADECIMENTOS
Ao professor e incentivador Dr. Cláudio Silveira, cujo apoio e ajuda foram
essenciais em todas as etapas da realização desse trabalho.
À professora orientadora Dra. Denise C. Machado, pela disponibilidade e
paciência na orientação.
Ao professor Dr. Mário Wagner pelas valiosas informações estatísticas e
epidemiológicas.
À Regina Polito, Christian Viezzer e Gustavo Barbosa, do laboratório de
Pneumologia do IPB – PUC – RS, pelo auxílio na execução da técnica de ELISA.
iv
LISTA DE ABREVIATURAS
AIDS – Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
CD4 – Marcador de superfície da célula T auxiliar
CD8 – Marcador de superfície da célula T citotóxica
CMV – Citomegalovírus
ELISA – Ensaio imunoenzimático
IC – Intervalo de confiança
IFN-? - Interferon gama
IgG – Imunoglobulina G
IgM – Imunoglobulina M
IL – Interleucina
LPS – Lipopolissacárides
MEIA? - Ensaio imunoenzimático de micropartículas
NK – Célula “Natural Killer”
NO – Monóxido de Nitrogênio
PCR – Proteína C Reativa
PCR-RT – Reação em Cadeia da Polimerase com Transcrição Reversa
STAT-1 – Fator de Transcrição Nuclear
Th – Célula T auxiliar
v
RESUMO
A Toxoplasmose é uma zoonose universal, transmitida tanto através de
contaminação oral, quanto de maneira congênita. O protozoário causador,
Toxoplasma gondii, provoca no organismo uma forte resposta imune celular, padrão
Th1, que não resolve a infecção mas que leva a maioria das pessoas a um estágio
crônico assintomático. Em algumas regiões do sul do país, há uma elevada
prevalência de lesões oculares, causadas por toxoplasmose, a maioria delas
adquiridas. Nesse estudo determinou-se a variabilidade dos níveis séricos de duas
citocinas importantes na resposta imune ao Toxoplasma, a Interleucina 12 (IL-12 ) e
o Fator de Necrose Tumoral-a (TNF-a). Foram analisados soros de 106 pacientes
com diferentes apresentações clínicas da doença (lesão ocular cicatrizada, lesão
ocular recidivante, doença recente e toxoplasmose crônica assintomática) e de 31
controles sadios, obtendo-se valores significativamente mais elevados de IL-12 nos
indivíduos que apresentavam lesões oculares cicatrizadas, quando comparados com
todos os outros grupos de pacientes e controles (p<0,005). Os valores de TNF-a não
apresentaram diferenças entre os grupos. Os resultados apontam para a viabilidade
de novos estudos, visando a uma possível aplicação da determinação de IL-12
sérica na prática clínica, como teste prognóstico nos casos de toxoplasmose ocular.
Palavras chave: Toxoplasmose, Citocinas séricas, IL-12, TNF- a.
vi
ABSTRACT
Toxoplasmosis is an universal zoonosis, transmitted so much through oral
contamination, as well by congenital route. The protozoan, Toxoplasma gondii,
provokes a strong cellular immune response, pattern Th1, that do not overcome the
infection but that takes most of the patients to an asymptomatic chronic stage. In
some areas of the south of the country, there is a high prevalence of ocular lesions,
caused by toxoplasmosis, most of them acquired cases. In this study was determined
the variability of the seric levels of two important citokynes in the immune response to
the Toxoplasma, Interleukin 12 (IL-12) and Tumor Necrosis Factor- a (TNF-a). The
analisis were performed in 106 patients' sera with different clinical forms of the
disease (scarred ocular lesion, lesion ocular reactivated, recent disease and chronic
toxoplasmosis) and in 31 healthy controls. Significantly higher levels of IL-12 were
observed in individuals with scarred ocular lesions, when compared with all groups of
pacients and controls (p<0,005). There was no significant diference in the TNF-a
seric levels beetwen the groups. The results shows the viability of new studies, in
order to obtain a possible application of the seric determination of IL-12 in medical
routine, as a prognostic test, mainly in the cases of ocular toxoplasmosis.
Key Words: Toxoplasmosis, Serum cytokines, IL-12, TNF-a.
vii
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 01
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................. 03
2.1 Epidemiologia ................................................................................................. 03
2.2 Resposta Imune .............................................................................................. 05
2.3 Quantificação de Citocinas .............................................................................
2.3.1 Ensaios biológicos para citocinas ..........................................................
2.3.2 Imunoensaios ........................................................................................
2.3.3 Citometria de fluxo e técnicas moleculares ...........................................
08
10
11
12
2.4 Quantificações Séricas de Citocinas .............................................................. 12
3 OBJETIVOS ...................................................................................................... 16
4 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................. 17
4.1 Amostras ......................................................................................................... 17
4.2 Testes Sorológicos ......................................................................................... 18
4.3 Quantificação de IL-12 e TNF-? ...................................................................... 18
4.4 Análise Estatística ........................................................................................... 18
5 RESULTADOS .................................................................................................. 19
5.1 Descrição da Amostra..................................................................................... 19
5.2 Quantificação das Citocinas nos Grupos Estudados ...................................... 20
6 DISCUSSÃO ...................................................................................................... 23
7 CONCLUSÕES .................................................................................................. 26
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 27
1
1 INTRODUÇÃO
A toxoplasmose é uma zoonose causada pelo parasita intracelular
Toxoplasma gondii. A forma adquirida da doença geralmente passa desapercebida,
embora possa causar linfadenopatia e febre baixa, num quadro similar à
mononucleose. Nos pacientes imunocompetentes, a doença progride para um
estágio crônico, assintomático. Formas graves e na maioria das vezes fatais,
entretanto, são observadas nos imunocomprometidos, notadamente nos paciente
com AIDS. Lesões oculares são as mais freqüentes apresentações clínicas da
toxoplasmose congênita. Esta forma da doença apresenta uma prevalência muito
alta no Brasil, de 1/3.000 nascidos vivos, quando comparada a outros países (1).
Curiosamente, em algumas regiões, como no Noroeste do Rio Grande do Sul,
observam-se altas taxas (21%) de lesões oculares (retinocoroidites) nos indivíduos
infectados, a maioria delas devidas a infecções adquiridas após o nascimento, o que
mostra a capacidade do parasita em causar doença mesmo em indivíduos
imunocompetentes (2,3).
A resposta imune apresentada pelo organismo em resposta ao Toxoplasma
gondii tem sido intensivamente estudada, produzindo maiores esclarecimentos a
respeito desta infecção. Revisões de pesquisadores importantes, compilaram as
principais descobertas nessa área, baseadas principalmente em modelos animais.
Parece evidente que o principal mecanismo de resistência ao parasita é a imunidade
mediada pelas células T, tanto da linhagem CD4+, quanto da CD8+ (4, 5).
Contribuições relevantes foram igualmente obtidas por pesquisadores
brasileiros, da Universidade de São Paulo, trabalhando com amostras de pacientes
de Erechim-RS, em ensaios de proliferação celular. Os autores chegaram a
conclusões em relação à toxoplasmose ocular, mostrando a diferença na resposta
imune nas lesões congênitas e adquiridas e o papel protetor do interferon-? (IFN-?) e
da interleucina 12 (IL-12) no desenvolvimento destas lesões (6, 7).
O presente trabalho visou descrever os níveis séricos das citocinas IL-12 e
TNF–a em diferentes apresentações clínicas de toxoplasmose e em indivíduos
assintomáticos com e sem contato prévio com o parasita, buscando similaridades
2
em trabalhos anteriores e discutindo uma possível aplicação clínica para esses
testes.
3
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Epidemiologia
A toxoplasmose é adquirida tanto pela ingestão de cistos, através do
consumo de carne contaminada, quanto de oocistos, forma sexuada de reprodução,
eliminados exclusivamente pelos felídeos, através das fezes, que contaminam
jardins, caixas de areia e, mais raramente, reservatórios de água potável.
A soroprevalência da doença varia muito nas diferentes regiões do globo,
conforme fatores sociais e econômicos das populações. É maior nas áreas tropicais
do que nas regiões quentes e áridas ou frias. No Brasil, diversos inquéritos
sorológicos, realizados em épocas e regiões distintas, encontraram prevalências de
anticorpos anti-Toxoplasma entre 42 e 87,6% (8).
Um estudo multicêntrico europeu, que estudou 252 gestantes infectadas e
708 grávidas soronegativas, apontou o consumo de carne inadequadamente cozida
ou curada como o principal fator de risco para a infecção. As carnes que
apresentaram maior risco foram as de porco e carneiro e nesse estudo não foi
demonstrado o papel do contato com gatos na aquisição da doença (9).
Num estudo de prevalência realizado em gestantes no Hospital Nossa
Senhora da Conceição, em Porto Alegre – RS, a escolaridade foi fator de proteção
para a toxoplasmose, com taxas de soropositividade significativamente menores em
mulheres que tinham mais de nove anos de escola, quando comparadas com as
demais (10).
Na região de Erechim – RS, um estudo realizado em 1990, mostrou
associação positiva entre toxoplasmose e a etnia italiana, relacionada com seus
hábitos alimentares, que incluem a ingestão de carne suína em forma de embutidos,
consumidos por vezes logo após a preparação (8).
Outro estudo, publicado recentemente, realizado com gestantes do AltoUruguai gaúcho, região de Erechim, avaliou o contato com o solo como o fator de
4
maior associação positiva com a toxoplasmose, além da moradia em zona rural e a
idade (11).
A forma congênita de transmissão da doença é a mais grave. Além da
manifestação ocular, seqüelas neurológicas podem advir de uma infecção adquirida
no útero. Tanto a eficácia do tratamento na redução da transmissão congênita
quanto a validade da implantação de programas de triagem sorológica em gestantes
permanecem sem conclusões definitivas (12). Os dados de prevalência obtidos em
gestantes variam desde 10 a 55% na Europa (9) até 59,8 a 74,5% no sul do Brasil
(10,11). As taxas de infecção congênita no Brasil variam de 3,3 a 8/10.000 nascidos
vivos (1, 13, 14), estando entre as maiores do mundo. A maioria dos bebês é
assintomática ao nascer e a doença ocular é a forma mais comum de manifestação
da doença congênita. Embora a idade gestacional seja reconhecidamente um fator
que influencia na gravidade da doença congênita, o aparecimento de sinais não
oculares no momento do nascimento, como calcificações intracranianas, também
são
fatores
de
risco
para
o
aparecimento
posterior
das
manifestações
oftalmológicas, por vezes tardias (15).
Embora seja freqüente na forma congênita, as lesões oculares são também
importantes manifestações clínicas da toxoplasmose adquirida. Em Erechim (RS),
dados pouco usuais foram levantados, desde 1990. Na ocasião, ao examinar uma
amostra aleatória de mais de 1000 pessoas da zona rural, um grupo de
pesquisadores encontrou uma prevalência de retinocoroidite toxoplásmica de 21,3%
nos adultos daquela população. Como os relatos de infecção congênita na região
não fogem dos apresentados no resto do país, fica clara a evidência de que trata-se
de doença adquirida após o nascimento, na maioria das vezes (16). Uma parte
dessa população estudada em 1990 que era soronegativa na época (130 pessoas)
foi investigada em 1997 novamente, e uma taxa de soroconversão de 19,3% foi
encontrada, com o aparecimento de lesões em 2 indivíduos (9,5%), outro achado
que suporta essa teoria (3). Em 2001, em novos exames da mesma coorte, obtevese uma taxa de soroconversão de 17%, com lesões oculares em 18% desses
pacientes. A freqüência de soroconversão e aparecimento de lesões foi maior nas
pessoas abaixo de 17 e acima de 50 anos. Ainda não há maneira eficiente de
diferenciar, dentre os que são soropositivos, quem irá desenvolver lesões ou não (8).
5
2.2 Resposta Imune
Seguindo-se à infecção oral por Toxoplasma inicia-se uma resposta imune,
inicialmente inespecífica, seguida de uma forte resposta celular Th1, além da
produção de imunoglobulinas anti-Toxoplasma. Na maioria das vezes, esta resposta
obriga o parasita a encistar-se nos tecidos, passando para um estágio de latência ou
cronicidade, no qual é vigiado pelo sistema imunológico. Diversas situações
imunosupressoras, como a AIDS, podem levar à reativação desses cistos e à
recidiva da doença. O papel das células CD4+ e CD8+ no controle da infecção é
inequívoco. Cepas não virulentas de Toxoplasma produzem doença quando
inoculadas em animais com deficiências de linfócitos T. Bem demonstrado,
igualmente, está o papel das citocinas no controle da toxoplasmose aguda e na
vigilância
do
estágio
de
latência.
Gazzinelli
e
colaboradores,
em
1994,
demonstraram o papel protetor do Fator de Necrose Tumoral-a (TNF-a) e do
interferon-? (IFN-?), através do tratamento de ratos infectados com anticorpos
neutralizadores anti-TNF-? e anti-IFN-? (17). Além deste, outros estudos (18, 19, 20,
21) comprovaram o papel central, principalmente do interferon gama, no controle
das infecções por Toxoplasma gondii.
A secreção de citocinas inicia-se muito cedo na resposta ao parasita, e as
células da imunidade inata como as células dendríticas e principalmente as Natural
Killers (NKs) atuam como a fonte inicial de Interleucina-12 (IL-12) e IFN-? (4). A IL-12
é uma citocina estimuladora, capaz de induzir a produção de IFN-? pelas NKs e
linfócitos T, sendo, portanto, requisito importante para a resistência ao parasita (22).
Esta citocina igualmente influencia fortemente o caráter Th1 da resposta imune
subseqüente. Um estudo recente, mostrou também a capacidade da Interleucina-18
(IL-18) de aumentar a resistência ao Toxoplasma, mediante sua habilidade de
estimular a produção de IL-12 (23). Esta cascata de citocinas (IL-18/IL-12/IFN-?) é,
sem dúvida, vital para o estabelecimento de uma resposta imune adequada, com o
conseqüente controle da infecção.
O protozoário é capaz de ativar inespecificamente macrófagos e células NK,
imediatamente após o primeiro encontro entre ele e o hospedeiro. Em ratos, a
ativação dos macrófagos pelo IFN-?, na presença de sinais acessórios, como o TNF
6
- ? ou LPS, é necessária para o início da atividade citotóxica dos macrófagos (24). A
destruição do Toxoplasma se dá através de vários mecanismos efetores, oxidativos
ou não, incluindo a produção de monóxido de nitrogênio (NO), a limitação da
disponibilidade do ferro intracelular e a produção da enzima 2,3–dioxigenase
indolamina, sintetizada por macrófagos ativados, responsável pela quebra do
triptofano intracelular, privando, dessa forma, o parasita de um aminoácido essencial
(25). Um mecanismo dependente de oxigênio é também é a maneira pela qual as
células dendríticas também exercem papel efetor durante a resposta imune
inespecífica ao Toxoplasma (20). A citocina IL-12 parece ser o mediador central da
síntese inicial de IFN-? pelas células NKs, o que acaba levando a ativação
microbicida dos macrófagos (4). Na fase inicial da infecção, a resistência do
organismo é, portanto, devida ao papel sinérgico dos macrófagos e das células NKs,
sendo a citocina IFN - ? seu mediador mais importante.
A intensidade da resposta inata pode ser influenciada pelo gênero. Estudos
mostraram uma maior rapidez na produção de IFN-? e TNF-? em ratos machos
infectados, em comparação com fêmeas da mesma espécie (26). Em relação ao
impacto deste achado na epidemiologia da toxoplasmose ocular, foco deste
trabalho, não há relato dessa associação nos trabalhos de um importante
pesquisador brasileiro do tema, Dr. Cláudio Silveira (8).
A resposta inata também é a responsável pelo início da resposta específica,
com a conversão de macrófagos em células apresentadoras de antígenos. Há uma
forte migração dos linfócitos CD4+ para um padrão de resposta imune dito Th1, que
acaba levando a mais produção de IFN-?, além disso, as células CD8+, ativadas
pela IL-2, exercem efeito citolítico contra os taquizoitos, formas de reprodução rápida
do protozoário, encontradas nos tecidos durante a infecção aguda, ou contra células
infectadas (4, 5, 24).
O estudo das citocinas produzidas durante a resposta imune ao Toxoplasma
também desperta muito interesse e revela dados interessantes. Pesquisadores da
Universidade de São Paulo (USP), realizaram estudos com amostras de pacientes
de Erechim, descobrindo diferenças no perfil de citocinas secretadas por células
mononucleares de 177 pacientes, após estímulo com antígenos de Toxoplasma.
Esses indivíduos estavam divididos em grupos diferentes, conforme seu perfil
7
sorológico ou a existência de lesões oculares, adquiridas ou congênitas. Os
resultados mostraram que nos soropositivos sem lesão, há maior produção de IL-12
e IFN - ? do que nos pacientes com lesão, além de demonstrar que nos pacientes
que adquiriram a toxoplasmose após o nascimento e desenvolveram lesões
oculares, há maior produção de IL-10 do que nos indivíduos com lesões adquiridas
de forma congênita. Em ambas as formas de lesão havia mais secreção de IL-1 e
TNF-? do que nos assintomáticos, revelando que essas citocinas podem estar
envolvidas na patogênese da lesão (6, 7). Esses resultados estimulam novos
estudos no sentido de tentar utilizar essas diferentes citocinas no acompanhamento
ou no prognóstico dos pacientes com lesão ocular toxoplásmica.
Embora o papel protetor da IL-12 e do IFN-? esteja bem determinado, a
participação do TNF-? na infecção permanece controverso. Estudos em modelos
animais revelaram resultados conflitantes. Esta citocina pró-inflamatória é um
potente ativador de macrófagos, mas a sua atividade principal na toxoplasmose
parece ser a de potencializar os efeitos da IL-12 nas células NK (4). Quando células
infectadas por Toxoplasma são cultivadas na presença de IFN-? e TNF-? , ocorrem
efeitos opostos, com a primeira citocina inibindo a proliferação do protozoário e a
segunda aumentando essa multiplicação. Como a secreção de TNF-? parece
permanecer constante em situações de imunossupressão, como a AIDS, enquanto
os níveis de IFN-? caem, esse pode ser um mecanismo envolvido na reativação dos
cistos na infecção latente (27).
Os mecanismo imunológicos que estão por trás da manutenção da vigilância
sobre os cistos teciduais e a eventual reativação dos mesmos, interessam
particularmente
a
nosso
estudo,
já
que
as
manifestações
oculares
são
freqüentemente decorrentes de uma reativação de infecções crônicas. Estudos em
ratos mostraram que a depleção das células CD4+, e a neutralização tanto do IFN-?
quanto do TNF-? são capazes de aumentar a severidade das infecções oculares
(17). Estudos posteriores demonstraram que as duas citocinas em questão podem
induzir a produção de NO, sendo esse último o responsável pelo controle da
infecção ocular (28).
8
O papel da IL-12 parece ser importante na manutenção das infecções
crônicas de toxoplasmose sob vigilância. Em ratos infectados, deficientes dessa
citocina, que estavam recebendo doses exógenas da mesma, a retirada da IL-12
levou à morte dos mesmos por encefalite, devido a reativação de cistos cerebrais. A
produção constante dessa citocina parece ser fundamental na manutenção da
resposta Th1 montada contra o patógeno (29, 30).
Uma estratégia utilizada pelo Toxoplasma para confundir o sistema imune e
manter-se encistado envolve a mudança na expressão de seus antígenos de
superfície. Assim, taquizoítos, formas de reprodução rápida e bradizoítos, formas de
reprodução lenta do protozoário, contidas nos cistos, exibem proteínas de superfície
parecidas mas antigenicamente distintas, o que favorece sua persistência no
organismo do hospedeiro (31).
É interessante considerar, igualmente, que quando os macrófagos tornamse infectados pelo protozoário, perdem a capacidade de produzir TNF-? e ocorre um
atraso na síntese de IL-12, graças ao bloqueio de fatores nucleares de transcrição,
como o STAT-1. Esta subversão na função do macrófago parece vital para uma
expansão inicial dos taquizoítos do parasita, assegurando a posterior formação de
cistos, e a conseqüente cronificação. Sem dúvida, o protozoário desenvolveu uma
habilidade de convivência em equilíbrio com os hospedeiros. O equilíbrio entre a
supressão da resposta imune e a sua ativação correlaciona-se com a presença de
milhões de pessoas assintomáticas e cronicamente infectadas pela toxoplasmose no
mundo (32).
Embora se conheça a resposta imunológica contra o Toxoplasma gondii com
razoável profundidade, não se sabe ainda até que ponto poderá ser usado este
conhecimento
na
abordagem
diagnóstica
e/ou
prognóstica
aos
pacientes
acometidos pelas várias formas da doença.
2.3 Quantificação de Citocinas
Importantes mediadores da resposta imune, as citocinas e seus receptores,
têm sido muito estudadas nos últimos anos. Métodos laboratoriais desenvolveram-se
9
para a quantificação de muitas delas, e muito conhecimento científico tem se
acumulado sobre o assunto. Embora já se use rotineiramente em algumas
instituições, a validade da dosagem de citocinas está longe de ser unanimidade.
As citocinas podem ser definidas como uma grande família de proteínas
solúveis de baixo peso molecular, envolvidas na regulação da atividade celular,
particularmente, mas não exclusivamente, dentro do sistema imune (33). Elas
funcionam como mensageiros químicos, de maneira bastante similar aos hormônios.
Embora
responsáveis
por
efeitos
biológicos
muito
distintos,
as
citocinas
compartilham uma série de características comuns: todas elas são pleotrópicas, isto
é, tem a habilidade de agir contra variados alvos celulares, usualmente através de
seus receptores; são redundantes, de modo que muitos efeitos biológicos
característicos de uma podem ser executados por várias outras; são capazes de
regular sua própria produção, de maneira autócrina ou parácrina, em resposta a
estímulos do meio e exercem seus efeitos rapidamente depois de liberadas pelas
células, possuindo meia-vidas curtas. Embora muitas atuem mais localmente no seu
sítio de liberação, algumas alcançam a corrente circulatória, podendo atuar num
modelo tipicamente endócrino (34). As citocinas classificam-se em três grandes
grupos funcionais:
?? Citocinas que regulam a resposta imune inata;
?? Citocinas que regulam a resposta imune adaptativa;
?? Citocinas que estimulam a hematopoiese.
Embora a classificação acima tenha aplicação didática, clinicamente o que
mais interessa é relacionar as citocinas com os dois principais tipos de linfócitos T
CD4: Th1 e Th2. Como este tem sido o foco da maioria dos trabalhos conduzidos
nesta área, optaremos por classificar a citocina baseado no perfil a que pertence e
não na função que exerce.
De fato, a migração da célula T auxiliar (Th) CD4 de um estágio inicial (Th0)
para um perfil Th1 ou Th2 tem um impacto muito grande na resposta imune
subseqüente e existe uma secreção de citocinas características de cada um desses
fenótipos. Assim, inclui-se entre as citocinas de perfil Th1: Interferon-? (IFN-?), Fator
10
de Necrose Tumoral–ß(TNF-? ) e Interleucina–2 (IL-2), e as características do tipo
Th2 são: Interleucinas 4, 5, 6, 10 e 13 (IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13) (35). Ambos
fenótipos podem produzir Interleucina-3 (IL-3) (34). Funcionalmente, os linfócitos
Th1 estão associados à imunidade celular e os Th2 à imunidade humoral. Convém
ressaltar que o desvio da célula T auxiliar para um dos dois tipos depende de muitos
fatores, entre os quais, a sua interação com a célula apresentadora de antígenos,
também ela uma secretora de citocinas. Ocorre, portanto, uma cascata anterior, proinflamatória ou inespecífica, que igualmente está mais associada a um dos dois
fenótipos de linfócitos Th.
A detecção da presença de citocinas em fluidos biológicos ou em tecidos,
monitorando as mudanças dos perfis durante a doença aumentou a capacidade de
entendimento do papel destas moléculas. Em situações normais, as citocinas não
são normalmente detectáveis nos fluidos biológicos ou nos tecidos, embora seus
receptores estejam geralmente presentes. O encontro e a quantificação destas
proteínas em situações patológicas podem ajudar a definir estágios das doenças ou
representar um alvo para modulação terapêutica (36). Vários métodos têm sido
propostos para a quantificação das diversas citocinas. Dentre eles destacam-se a
detecção direta das proteínas por imunoensaios, os bioensaios e, mais
recentemente, as técnicas moleculares e de citometria de fluxo.
2.3.1 Ensaios biológicos para citocinas
Os chamados bioensaios são considerados o padrão-ouro para detecção e
quantificação das citocinas (36). Como tratam-se de técnicas complexas e
demoradas, há dificuldade em sua implantação na rotina dos laboratórios. Baseados
na detecção da atividade biológica gerada pela citocina são ensaios extremamente
sensíveis, embora com baixa especificidade, devido à redundância, propriedade que
caracteriza a capacidade que várias citocinas tem de gerar o mesmo efeito biológico.
Os
bioensaios
freqüentemente
são
realizados
com
linhagens
de
células
imortalizadas. Outros pesquisadores ou fornecedores especializados são as fontes
destas linhagens celulares e é necessário o preparo do laboratório para trabalhar
com cultura de tecidos, o que requer investimento razoável com equipamentos (36).
11
Os ensaios que detectam proliferação são os mais versáteis para a maioria
das citocinas. Nestes ensaios estimam-se os níveis de citocina pela capacidade de
estimular ou inibir a proliferação celular, medida usualmente pela incorporação de
timidina radioativa no DNA (37).
2.3.2 Imunoensaios
A rapidez e a facilidade dos imunoensaios os tornam mais aplicáveis na
rotina do que os bioensaios. Eles podem também distinguir citocinas de efeitos
biológicos semelhantes, como os Fatores de Necrose Tumoral (TNFs) ? e ? (37). Os
mais largamente utilizados são os ensaios imunoenzimáticos (ELISAs). Anticorpos
anti-citocinas estão sensibilizando placas de poliestireno capturam as citocinas
presentes nas amostras e, após lavagem, um segundo anticorpo marcado com
enzima (conjugado) liga-se, formando um “sanduíche’, revelado e quantificado pela
adição de um substrato apropriado, que se torna corado pela ação da enzima. A
inclusão de biotina e avidina podem contribuir para aumentar a sensibilidade dos
ensaios (37). Desta forma, citocinas específicas podem ser quantificadas, tanto
diretamente no soro, quanto em sobrenadante de células, método freqüentemente
usado no estudo dos perfis de citocinas em doenças infecciosas.
O maior problema dos imunoensaios é que eles podem detectar citocinas
biologicamente inativas ou apenas fragmentos delas. Este fato pode ser relevante
em amostras biologicamente complexas como o soro, dificultando a correlação da
atividade biológica detectada nos bioensaios com a quantificação estimada por
imunoensaios (37). Além disso, o fato das citocinas muitas vezes circularem ligadas
a receptores solúveis ou proteínas carreadoras, pode inibir a ação dos anticorpos
utilizados como reagentes nos imunoensaios, capazes apenas de detectar a fração
livre das moléculas (38). Comparações entre os métodos de quantificação direta no
soro com métodos baseados na demonstração celular das mesmas citocinas
demonstraram a fraca correlação entre os níveis séricos e celulares, fato que deve
ser considerado quando está se interpretando o resultado de uma quantificação
sérica de uma determinada citocina (39). Em uma situação ideal, a utilização de
métodos distintos pode ser necessária para confirmar o envolvimento da citocina em
12
um determinado processo (37). As principais vantagens da determinação sérica são
a facilidade da obtenção da amostra e a rapidez dos ensaios.
2.3.3 Citometria de fluxo e técnicas moleculares
São as técnicas mais recentemente desenvolvidas para a quantificação de
citocinas. A citometria de fluxo baseia-se na detecção direta de citocinas
intracelulares graças à incorporação de um anticorpo marcado com fluorocromo,
após períodos curtos de ativação ou estímulos variados (36). A técnica leva em
conta o fato de que leucócitos não estimulados freqüentemente não expressam
citocinas. A quantificação do RNA mensageiro (mRNA) específico, a chamada
expressão gênica, é outra alternativa recente disponível. A adaptação de técnicas de
PCR com transcrição reversa (PCR-RT) para este fim torna possível a detecção de
uma única molécula do RNAm, graças à amplificação exponencial proporcionada
pelo método. A detecção pode se dar em culturas de células mononucleares
purificados, estimulados com antígenos específicos ou em amostras de sangue total.
Ambas técnicas são altamente sensíveis, o que pode levar a dificuldades em
suas interpretações, já que pode haver dificuldade em valorizar clinicamente
resultados extremamente baixos na expressão celular de determinadas citocinas.
2.4 Quantificações Séricas de Citocinas
Não há dúvida de que a determinação dos níveis de citocinas diretamente
no soro e/ou plasma dos pacientes é a forma mais rápida e prática de avaliação
laboratorial dessas moléculas. Embora com as ressalvas já relatadas em relação à
possível falta de correlação sérica/celular, revisamos a seguir diversos trabalhos que
propuseram algum tipo de aplicação clínica para a quantificação sérica de citocinas,
relatando suas conclusões e apontando tendências observadas em cada um dos
sub-grupos a seguir:
Talvez uma das associações clínicas mais fortemente estabelecida em
relação às citocinas seja a correlação entre a IL-6 e a sepse, principalmente a
13
neonatal. Uma recente revisão sobre o tema, a aponta como um dos mais
promissores entre os novos marcadores estudados (40). Embora alguns problemas,
como a flutuação dos valores no período pós-natal, que ocasionou discordância
entre valores de “cut-off” em vários trabalhos citados nesta revisão, os autores
acreditam tratar-se de um teste prognóstico útil, principalmente no seguimento de
complicações no período perinatal. Em um trabalho experimental sobre tema
semelhante, a IL-6 sérica foi quantificada em 115 pacientes com infecções agudas
diversas na admissão de um hospital sueco (41). O teste demonstrou, neste estudo,
um Valor Preditivo Positivo (VPP) de 100%, na diferenciação entre infecções
bacterianas e virais. Em outro estudo prospectivo, soros de 71 gestantes com
ruptura prematura de membranas foram avaliados na busca de um preditor precoce
de infecção neonatal. A IL-6, num “cutt-off” de 11,0 pg/ml demonstrou uma
sensibilidade de 81% e especificidade de 76%, valores melhores do que a Proteína
C Reativa (PCR), tradicional marcador inflamatório, que obteve 56% e 76%,
respectivamente (42).
Em casos de doenças infecciosas crônicas, como a doença de Chagas, a
correlação parece ser menor. Pesquisadores brasileiros (43) estudaram níveis
séricos de IL-2, IFN-? e TNF-? em 91 pacientes com diversas formas da doença. Os
resultados obtidos não diferiram estatisticamente dos obtidos no grupo controle,
embora níveis significativamente mais elevados de IL-2 tenham sido encontrados em
pacientes não controlados, em relação aos compensados.
Em pacientes transplantados, a determinação sérica de citocinas pode
auxiliar como preditor de infecção por Citomegalovirus (CMV). Em um trabalho
prospectivo com 75 transplantados de medula óssea, Humar e colaboradores,
obtiveram um “odds ratio” de 1,7 para cada 100 pg/ml de aumento na IL-6 sérica dos
pacientes, levando-os a sugerir o ensaio como uma ferramenta de diagnóstico
precoce das infecções por CMV neste tipo de paciente (44).
Estudando 28 crianças com Doença Celíaca, com ou sem tratamento, em
comparação com um grupo de 26 controles sadios, pesquisadores da USP,
relataram níveis significativamente mais elevados tanto de IL-6 quanto do receptor
solúvel de IL-2 no soro das crianças não tratadas, quando comparados com o grupo
tratado e com o controle (45). A quantificação dessas moléculas poderia servir,
14
então, como marcadores não invasivos da atividade da doença e da resposta ao
tratamento.
Na doença de Graves, o perfil sérico das citocinas têm sido objeto de estudo
de diversos centros. Em um estudo recente com 84 pacientes, Salvi e colaboradores
descreveram aumento significativo de IL-6 e seu receptor solúvel nos pacientes com
oftalmopatia, fato também descrito em outro trabalho, que estudou 62 pacientes com
doença ocular e 62 controles sadios (46, 47).
Em um estudo realizado em Hong Kong, níveis séricos da citocina proinflamatória IL-18 estavam significativamente elevados em pacientes lúpicas com
doença renal em relação a pacientes sem comprometimento renal e controles sadios
pareados por gênero e idade. Os valores da citocina correlacionavam, igualmente,
com os de Monóxido de Nitrogênio (NO) plasmático nos mesmos pacientes, levando
os autores a sugerir que este possa ser um alvo potencial para futuros tratamentos
da doença (48).
Estudando
a
etiologia
da
caquexia
nos
pacientes
com
câncer,
pesquisadores italianos, encontraram correlação negativa entre níveis séricos de IL6 e TNF-? e leptina, hormônio que age no controle da ingesta alimentar, podendo
constituir-se em marcadores do estado nutricional dos pacientes (49). Em pacientes
com adenocarcinoma de pulmão, a determinação sérica de citocinas que definissem
grupos Th1 e Th2, mostrou-se útil no seguimento dos pacientes, já que aqueles com
níveis elevados de IL-4 (Th2), tiveram menor número de recorrências, num período
de dois anos de acompanhamento, podendo demonstrar a existência de uma
resposta imune humoral anti-tumor (50).
Na toxoplasmose em particular, a maioria dos estudos que demonstraram o
papel protetor das citocinas foram realizados utilizando-se estudos de proliferação
celular (6,7). Um trabalho interessante detectou altos níveis de IFN-?. no soro de
pacientes imunocompetentes com a forma linfadenopática da doença, mas não em
pacientes HIV positivos com encefalite toxoplásmica, revelando o potencial da
investigação sérica das citocinas durante os episódios agudos da doença (51).
Embora muito tenha se estudado nos últimos anos, não há consensos
fortemente estabelecidos quanto às reais possibilidades de aplicação clínica dos
15
testes séricos de citocinas. Embora certamente a quantificação sérica não seja a
melhor maneira de determinar o papel das citocinas nas diversas patologias
estudadas, o fato de utilizar-se de uma amostra de fácil obtenção e
uma
metodologia rápida e acessível como o ELISA, é muito tentador buscar aplicações
clínicas para os ensaios séricos, já que as demais maneiras de quantificação de
citocinas, como os bioensaios ou os testes moleculares, são acessíveis a um
número limitado de laboratórios. Sem dúvida, trata-se de um campo promissor da
imunologia, que pode evoluir, tanto com novos estudos, quanto com a melhoria nos
próprios testes, para que a padronização possa trazer reprodutibilidade e maior
correlação entre os níveis séricos e celulares das citocinas.
16
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Descrever a variabilidade dos níveis séricos das citocinas interleucina 12 (IL12) e Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-? ) em diferentes formas de apresentação
da toxoplasmose e em suas recidivas;
3.2 Objetivo Específico
Comparar esses níveis entre os grupos de pacientes (toxoplasmose recente,
lesão ocular cicatrizada, lesão ocular recidivante, toxoplasmose crônica) e os
controles soronegativos;
17
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Amostras
Foram analisadas amostras de soro, obtidas através de punção venosa de
pacientes, oriundos da Clínica Oftalmológica Silveira de Erechim-RS e do
Laboratório Analic Ltda em Concórdia – SC, que foram classificados nos seguintes
grupos:
??Toxoplasmose Recente: Pacientes com resultados sorológicos que
demonstrem infecção ativa (Anticorpos IgM com títulos iguais ou superiores a 4,0 no
método imunoenzimático de micropartículas (MEIA? ), com ou sem apresentação
clínica clássica (linfadenopatia cervical, fadiga, com ou sem febre).
??Toxoplasmose
Ocular
Cicatrizada:
Pacientes
apresentando
lesão
cicatrizada sugestiva, mais sorologia positiva para anticorpos anti-Toxoplasma em
qualquer título, excluindo-se diagnósticos diferenciais.
??Toxoplasmose Ocular recidivante: Pacientes que apresentem lesões
oculares recidivantes, com a coleta realizada no momento da reativação das lesões.
??Toxoplasmose “crônica”: Indivíduos que apresentem-se assintomáticos,
porém
com
resultados
sorológicos
(presença apenas de anticorpos IgG)
característicos de contato anterior com o parasita.
??Grupo Controle: Indivíduos assintomáticos e com resultados negativos
para a sorologia anti-Toxoplasma, indicando ausência de contato com o protozoário.
A seleção dos três primeiros grupos, baseada nos critérios descritos, foi
realizada pelo Dr. Cláudio Silveira, médico oftalmologista, colaborador deste projeto.
As amostras dos dois últimos grupos, foram oriundas do Laboratório Analic
Ltda, de Concórdia-SC.
As amostras foram congeladas e transportadas até o local de realização dos
ensaios em caixas térmicas com gelo.
18
4.2 Testes Sorológicos
Os resultados da sorologia para toxoplasmose destes indivíduos foram
obtidos pelo método imunoenzimático de micropartículas (MEIA®), utilizado na rotina
do laboratório, que tem o pesquisador como seu responsável técnico. Foi
considerado critério de exclusão para qualquer grupo a presença de anticorpos antiHIV, exame que foi realizado através da metodologia MEIA®, igualmente no
Laboratório Analic Ltda.
4.3 Quantificação de IL-12 e TNF-?
As citocinas foram quantificadas através da técnica de ELISA utilizando-se
para tanto os kits: optEIA Human IL-12 p70 set cat. n°55183 e optEIA Human TNF-?
set cat. n°555212 (Pharmingen, San Diego, Ca, USA), seguindo as recomendações
do fabricante, no laboratório de Pneumologia do Instituto de Pesquisas Biomédicas
da PUC – RS.
4.4 Análise Estatística
Foram analisados os dados obtidos nos grupos casos e controles, a um
nível de significância ? de 0,05,
através dos testes estatísticos de análise de
variância, com teste de post hoc de Tukey para variáveis quantitativas e teste do chiquadrado para variáveis qualitativas. Em casos de assimetria foram usadas
transformações logarítmicas dos valores antes de proceder as análises, realizadas
através do programa SPSS ® versão 12.
19
5 RESULTADOS
5.1 Descrição da Amostra
Foram obtidas 137 amostras de soro de pacientes com diversas
apresentações clínicas de toxoplasmose e de controles soronegativos. 69 desses
eram do gênero feminino (50,4%) e 68 (49,6%) do gênero masculino. A idade média
dos participantes desse estudo foi de 27,95 anos, com desvio padrão de 12,63. As
idades variaram de 3 a 77 anos. Nenhum indivíduo foi reagente para HIV, não
havendo exclusão por este critério, o único que foi estabelecido para o trabalho. Na
Tabela 1, uma descrição da amostra, já com a divisão dos grupos estudados.
Tabela 1 - Descrição dos grupos, com gênero e faixas etária
Grupo
Número de
amostras
Gênero
Idade (anos) média
(d.p)
Toxoplasmose
recente
14
42,9% Masculino
27,3 (15,3)
Lesão ocular
cicatrizada
30
56,7% Masculino
27,5 (14,5)
Lesão ocular
recidivante
30
53,3% Masculino
29 (14,7)
Toxoplasmose
crônica
32
40,6% Masculino
30,2 (10,3)
Controle
31
51,6% Masculino
25,3 (9,1)
0,72
0,62
Valor de p
Como consideramos as variáveis idade e gênero como fatores de confusão,
procuramos obter grupos homogêneos para esses dois critérios, como ficou
demonstrado acima.
20
5.2 Quantificação das Citocinas nos Grupos Estudados
Em relação aos níveis séricos de IL-12 e TNF-a, observamos que muitos
dos indivíduos estudados apresentaram níveis inferiores a sensibilidade dos kits
utilizados (7,8 pg/ml). Foram 109 pacientes, no caso do TNF-a e 85 no caso da IL12. Para efeitos dos cálculos estatísticos, esses níveis inferiores foram considerados
como 3,9, sendo esse o menor valor numérico atribuído às duas variáveis. O valor
máximo obtido no estudo foi de 1913 pg/ml para a IL-12 e de 1448 pg/ml para o
TNF-a. Nos dois casos, os pacientes pertenciam ao grupo da lesão ocular
cicatrizada. Em virtude dessa grande variabilidade observada nos níveis das
citocinas, as distribuições dessas variáveis dentro dos grupos ficou assimétrica,
sendo necessário o uso da mediana e da amplitude interquartis para a descrição das
variáveis e da transformação logaritmica dos dados antes da análise de variância. A
Tabela 2 descreve o comportamento dos níveis séricos das duas citocinas
estudadas dentro dos grupos e o resultado da análise estatística.
Tabela 2 - Descrição dos resultados das duas citocinas estudadas, IL-12 e TNF–a
em todos os grupos estudados
Grupos
IL-12 (pg/ml) mediana e
amplitude interquartis
25-75
TNF-a (pg/ml) mediana e
amplitude interquartis 25-75
Toxoplasmose
recente
3,9 (3,9 a 9,075)a
3,9 (3,9 a 3,9)a
Lesão ocular
cicatrizada
15,6 (8,3 a 97,2)b
3,9 (3,9 a 7,8)a
Lesão ocular
recidiva
3,9 (3,9 a 14,5)a
3,9 (3,9 a 3,9)a
Toxoplasmose
crônica
3,9 (3,9 a 3,9)a
3,9 (3,9 a 47,85)a
Controle
3,9 (3,9 a 3,9)a
3,9 (3,9 a 3,9)a
ab
Letras índice não coincidentes representam diferenças estatisticamente
significativas (p<0,005).
21
O grupo de pacientes com lesões oculares cicatrizadas apresentou níveis de
IL-12 maiores do que todos os outros grupos, a um nível de significância estatística
a abaixo de 0,05. A grande variabilidade obtida nos resultados aponta para uma
dificuldade no emprego desses testes na rotina laboratorial, principalmente para fins
diagnósticos. Para fins de visualização, optamos por apresentar, nas Figuras 1 e 2, a
representação gráfica das médias dos grupos após transformação logarítmica.
Embora não sejam os valores absolutos das variáveis, é a melhor maneira de
demonstrar a diferença obtida no grupo de pacientes com lesão ocular cicatrizada.
Figura 1 – Logaritmo das médias de IL-12 (IC95%) nos grupos estudados
Logarítmo TNF-? IC95%
22
Figura 2 – Logaritmo das médias de TNF-? (IC95%) nos grupos estudados
Como apresentado na Figura 2, as concentrações séricas de TNF-? não
tiveram comportamentos estatisticamente diferentes nos grupos de pacientes
estudados, revelando uma falta de correlação dos níveis séricos desta citocina com
as diferentes apresentações clínicas de toxoplasmose incluídas nesse estudo.
23
6 DISCUSSÃO
Nossos resultados demonstraram níveis séricos de IL-12 significativamente
mais altos nos pacientes que tinham lesão ocular cicatrizada, quando comparados
com todas as outras formas de apresentação da toxoplasmose estudadas (recente,
recidivas oculares e crônica) e com os controles soronegativos. Esse achado não
confirma os resultados de trabalhos anteriores, que mediram o perfil de citocinas em
sobrenadantes de culturas de mononucleares, em que pacientes soropositivos sem
lesão (toxoplasmose crônica) apresentaram valores maiores de IL-12 que os
pacientes com lesão ocular (6, 7). A diferença entre as metodologias empregadas
pode ser uma das explicações para essa discordância. Sabidamente, uma das
limitações dos ensaios séricos de citocinas é a dificuldade de reproduzir na
circulação os eventos celulares que estão acontecendo no local da lesão (39). Por
outro lado esse achado, se confirmado em outras ocasiões e com outra casuística,
abre uma perspectiva interessante para futuras aplicações clínicas. Caso os níveis
séricos de IL-12 sejam realmente maiores em pacientes que tem a lesão cicatrizada,
quando comparadas com os que estão tendo recidivas, a determinação sérica dessa
citocina poderia servir como um marcador prognóstico. Para isso, temos que
responder à questão: no momento da primeira lesão, os pacientes que terão
recidivas têm níveis de IL-12 menores do que os que resolverão a lesão sem novos
episódios futuros?
A manutenção de níveis suficientes de IL-12 é necessária para a vigilância
do sistema imune contra os cistos de toxoplasmose (29). A demonstração de que os
níveis de IL-12 podem ser medidos diretamente no soro dos pacientes, sem a
necessidade de ensaios mais elaborados e inacessíveis aos laboratórios de rotina, é
um achado interessante desse estudo. Esses
resultados incentivam trabalhos
adicionais, preferencialmente estudos de coorte, para que, acompanhando a cinética
da variação sérica da IL-12 possamos ter mais clareza sobre a possível aplicação
clínica do ensaio, como teste prognóstico. Nossos achados confirmam conclusões
de revisões realizadas sobre a aplicabilidade clínica das determinações séricas de
citocinas, que sugerem que apenas em situações de cronicidade poderia haver
24
níveis demonstráveis desses mediadores no soro dos pacientes (37). Embora os
pacientes crônicos sem lesão ocular não tenham apresentado níveis séricos
elevados das citocinas estudadas, a necessidade de manter a lesão ocular sob
vigilância, com uma secreção constante de IL-12 no microambiente celular, pode
estar relacionada com o aparecimento de níveis séricos mais elevados dessa
citocina nos pacientes com lesões oculares cicatrizadas.
Por outro lado, os resultados obtidos com o TNF-a nos permitem dizer que a
determinação sérica dessa citocina
parece apresentar pouca utilidade na
toxoplasmose. A maioria dos pacientes estudados não teve níveis detectáveis dessa
citocina, ficando com valores abaixo do limiar de sensibilidade do kit utilizado. Como
não separamos os pacientes com lesão adquirida da congênita, talvez diminuímos a
possibilidade de obter alguma diferença entre os grupos. Nos estudos de
proliferação celular o TNF-a mostrou-se como uma espécie de marcador da lesão
adquirida (6,7).
Tanto nas determinações de IL-12 quanto nas de TNF-a chamou-nos a
atenção a grande amplitude dos dados. A assimetria das distribuições dessas
variáveis, além de dificultar a análise estatística, aponta para uma possível limitação
de um futuro uso na rotina clínica: todo o analito que possui uma grande variação
inter-individual tem uma aplicação prática limitada, principalmente para
uso
diagnóstico. Como a possível aplicação da determinação sérica da IL-12 seja
prognóstico, seria útil determinar, em estudos futuros, de coorte, a variabilidade
intra-individual dessa citocina.
Uma outra limitação do estudo e da própria utilização prática das citocinas é
a falta de especificidade. A resposta imune celular é dirigida contra um grande
número de patógenos e em diversas situações biológicas. Para evitar que esse
fosse um fator de confusão de nossos resultados, procuramos parear nossos grupos
nas variáveis gênero e idade. Por serem indivíduos jovens, acreditamos que seja
pequena a influência de infecções crônicas simultâneas, mas nenhum critério de
exclusão específico foi aplicado e os resultados estão sujeitos a essas variações não
específicas.
25
Assim, concluímos que há possibilidade de utilização do ensaio de
determinação sérica da IL-12 nos pacientes com toxoplasmose, embora os
resultados obtidos podem não correlacionar com os conseguidos por metodologias
que medem citocinas em sobrenadantes celulares após estímulo antigênico. Em
nosso estudo, os indivíduos com lesão ocular cicatrizada apresentaram níveis
significativamente mais elevados de IL-12, quando comparados aos pacientes de
outros grupos e aos controles sadios. Esse achado pode refletir a necessidade
biológica de manutenção de produção dessa citocina para vigilância dos cistos
teciduais do Toxoplasma. Por outro lado, os resultados ora apresentados podem
apontar para uma futura aplicação da quantificação sérica da citocina como um teste
prognóstico, possível marcador de recidivas de lesões oculares. Essas questões
somente estudos posteriores poderão responder. Tais estudos devem ser
delineados de maneira a possibilitar o acompanhamento da cinética da IL-12 sérica
em diferentes momentos da evolução da doença ocular.
26
7 CONCLUSÕES
Os níveis séricos das citocinas IL-12 e TNF-a apresentam grande
variabilidade nas diferentes apresentações clínicas de toxoplasmose estudadas:
lesão
ocular
adquirida,
toxoplasmose
crônica,
lesão
ocular
cicatrizada
e
toxoplasmose recente. Embora a maioria dos indivíduos estudados tenha
apresentado níveis inferiores a 7,8 pg/ml (limiar de sensibilidade dos kits utilizados),
nos dois casos foi observado uma grande dispersão dos dados, o que caracterizou
distribuições assimétricas. Todos os grupos estudados apresentaram medianas de
3,9 pg/ml para as duas citocinas estudadas, com exceção do grupo de pacientes
com lesão ocular adquirida, no qual foi obtido uma mediana de 15,6 pg/ml, para a IL12 sérica.
Os níveis séricos de IL-12 foram significativamente maiores nos pacientes
com lesão toxoplásmica ocular cicatrizada do que em pacientes pertencentes aos
outros grupos estudados e do que nos controles soronegativos.
Os dados obtidos com a quantificação sérica de IL-12 e TNF-a não podem
ser comparados com aqueles obtidos por ensaios que medem as mesmas citocinas
em sobrenadantes de células mononucleares, pois apresentam perfis diferentes em
situações clínicas semelhantes;
A IL-12 pode ser medida diretamente no soro de pacientes com lesão ocular
toxoplásmica cicatrizada, sem a necessidade de ensaios mais elaborados e
inacessíveis aos laboratórios de rotina.
27
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PONTIFICIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE MEDICINA
PÓS GRADUAÇÃO EM CLÍNICA MÉDICA E CIÊNCIAS DA SAÚDE
NÍVEIS SÉRICOS DE INTERLEUCINA – 12 E FATOR
DE NECROSE TUMORAL – a EM DIFERENTES
APRESENTAÇÕES CLÍNICAS DE TOXOPLASMOSE
RODRIGO ECHEVERRIA FLORES
PORTO ALEGRE, RS
2005