Fernanda Cristina Stenger

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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
FERNANDA CRISTINA STENGER
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA
ANALÍTICA POR CLAE INDICATIVA DE ESTABILIDADE DO
CLORIDRATO DE METFORMINA EM COMPRIMIDOS E
ESTUDO DE CITOTOXICIDADE DOS PRODUTOS DE
DEGRADAÇÃO
Itajaí
2011
1
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
FERNANDA CRISTINA STENGER
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA
ANALÍTICA POR CLAE INDICATIVA DE ESTABILIDADE DO
CLORIDRATO DE METFORMINA EM COMPRIMIDOS E
ESTUDO DE CITOTOXICIDADE DOS PRODUTOS DE
DEGRADAÇÃO
Dissertação submetida à Universidade do Vale do
Itajaí como requisito para a obtenção do grau de
Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Orientadora: Profa. Dra. Tania Mari Bellé Bresolin
Co-Orientador: Prof. Dr. Rogério Corrêa
Itajaí, Fevereiro de 2011
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DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA
ANALÍTICA POR CLAE INDICATIVA DE ESTABILIDADE DO
CLORIDRATO DE METFORMINA EM COMPRIMIDOS E
ESTUDO DE CITOTOXICIDADE DOS PRODUTOS DE
DEGRADAÇÃO
FERNANDA CRISTINA STENGER
‘Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em
Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Produtos Naturais e Substâncias
Bioativas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências
Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.’
____________________________________
Tania Mari Bellé Bresolin, Dra.
Orientador
__________________________________________________________
Tania Mari Bellé Bresolin, Dra.
Coordenador do Programa Mestrado em Ciências Farmacêuticas
Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores:
______________________________________
Profa. Dra. Tania Mari Bellé Bresolin (UNIVALI)
Presidente
______________________________________
Prof. Dr. Rogério Corrêa (UNIVALI)
Co-orientador
______________________________________
Prof. Dr. Rivaldo Niero (UNIVALI)
Membro
______________________________________
Profa. Dra. Simone Gonçalves Cardoso (UFSC)
Membro
Itajaí (SC), 28 de fevereiro de 2011
3
AGRADECIMENTOS
Agradecimento especial aos meus pais Ediles Vedana Stenger e Nilton
Moraes Stenger, por todo apoio financeiro e emocional, a meus irmãos Marina
Stenger e Felipe Stenger, ao amigo e namorado Rafael N. Moura por todo apoio
emocional.
Aos meus professores, Tania Mari Bellé Bresolin, pela orientação, toda
ajuda e tempo incansavelmente dedicados, e Prof. Rogério Corrêa pela coorientação e auxilio prestado.
Aos professores Rivaldo Niero por toda ajuda e acompanhamento em meu
trabalho, ao Prof. Rilton Alves de Freitas por toda ajuda nos ensaios celulares e
pela grande contribuição. Ao Prof. Theodoro Wagner pelas análises de GC-MS
realizadas. Ao Prof. Clóvis Antonio Rodrigues pelo incentivo e colaboração.
À farmacêutica do LAPAM, Luciana Cátia Block, por todo tempo dedicado a
ensinar e auxilio prestados nas análises, à auxiliar Eliziane Ribas pela colaboração
nas análises por CLAE e também à colega Talita G. Cesca pelo auxilio.
À auxiliar de laboratório Sheila Linsmeyer pelo auxilio prestado nas análises
de citotoxicidade e a Bruna Fenner pelo auxílio no laboratório de síntese orgânica.
Ao auxiliar de laboratório Pedro Araldi de Mattos da central analítica, pelo
auxilio nas análises por CLAE e ao Pedro Pablo Perez Netto da Central de RMN,
pelas análises realizadas.
Às minhas amigas, Agda Nascimento, Thais Tomio, Elisa Muller e
Jaqueline Góes pelo companheirismo e apoio nesta caminhada.
Às minhas colegas da Farmácia Marcelli Henriques, Beatris Kuffel e
Daiane P. de Oliveira por todo apoio e incentivo.
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DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA ANALÍTICA
POR CLAE INDICATIVA DE ESTABILIDADE DO CLORIDRATO DE
METFORMINA EM COMPRIMIDOS E ESTUDO DE CITOTOXICIDADE
DOS PRODUTOS DE DEGRADAÇÃO
FERNANDA CRISTINA STENGER
Fevereiro de 2011
Orientadora: Profa. Dra. Tania Mari Bellé Bresolin
Co-orientador: Prof. Dr. Rogério Corrêa
Área de Concentração: Produtos naturais e substâncias sintéticas bioativas.
Número de páginas: 123
O cloridrato de metformina é um dos fármacos mais amplamente utilizados no
tratamento do diabetes, fazendo parte da Relação Nacional de Medicamentos
(RENAME). O perfil de degradação do fármaco nas especialidades farmacêuticas
pode apresentar diferença e não existem informações disponíveis sobre o grau de
toxicidade dos produtos de degradação. Portanto, o objetivo deste trabalho foi
desenvolver e validar métodos de doseamento do cloridrato de metformina por
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) verificando se as metodologias são
indicativas da estabilidade do fármaco, a fim de comparar o perfil de degradação do
fármaco isolado e em comprimidos (medicamento de referência, similar e genérico) e
qualificar os produtos de degradação analisando a citotoxicidade. Um método
farmacopeico (BRITISH PHARMACOPEIA, 2008) foi adaptado com modificação na
composição da fase móvel e, após testes de degradação forçada empregando
hidrólise ácida (HCl 1M, 6 h em refluxo), alcalina (NaOH 0,1 M, 24 h), neutra (39 h
refluxo), oxidante (H2O2 32 %, 48 h) e fotolítica (254 nm, 3,5 h de exposição) a fim
de proporcionar ao menos 10 % de degradação. O método alternativo utilizando par
iônico foi desenvolvido com coluna C18, fase móvel composta de heptanosulfonato
de sódio 10 mM, pH 3,0:acetonitrila:metanol (75:8:17), fluxo de 1 mL/min, 30°C e
detecção em 210 nm, o qual foi validado de acordo com a ANVISA. Observou-se, o
aparecimento de produtos de degradação do cloridrato de metformina com boa
resolução cromatográfica em ambos os métodos, mostrando serem seletivos e
indicativos da estabilidade do fármaco. O método de par iônico foi validado com
sucesso, apresentando linearidade na faixa de 5 - 50 µg/mL, com boa precisão (CV
< 3,0% intra-dia e interdias), exatidão (recuperação de 100 ± 2,0%) sensibilidade (LD
e LQ de 1,47 e 4,90 µg/mL, respectivamente) e robusto frente a pequenas variações
de temperatura (29-31°C). Os medicamentos genéricos , similar e de referência
apresentaram perfil de degradação semelhante entre si, porém, com menor
intensidade do que o fármaco isolado. No estudo de citotoxicidade do fármaco
degradado nas diferentes condições selecionadas, empregando células L929, não
foi observada citoxicidade, tampouco das especialidades farmacêuticas degradadas
por hidrólise ácida.
Palavras – chave: Cloridrato de metformina, CLAE, Validação analítica, Produtos de
degradação, citotoxicidade.
5
DEVELOPMENT AND ANALYTICAL VALIDATION OF HPLC
STABILITY INDICATING METHODS FOR METFORMIN
HYDROCHLORIDE IN TABLETS AND CYTOTOXICITY OF THEIR
DEGRADATION PRODUCTS
FERNANDA CRISTINA STENGER
February 2011
Supervisor: Professor. Dr. Tania Mari Bellé Bresolin
Co-supervisor: Prof. Dr. Rogério Corrêa
Area of Concentration: Natural and synthetic bioactive substances.
Number of pages: 123
Metformin hydrochloride is one of the most widely used drugs for the treatment
of diabetes, and is part of the National List of Pharmaceuticals (RENAME). The drug
degradation profile in pharmaceuticals may be different, and there is no information
available on the degree of toxicity of all their degradation products. Therefore, the
objective of this work was to develop and validate methods for determining metformin
hydrochloride by high performance liquid chromatography (HPLC), verifying whether
the methods are indicative of drug stability, in order to compare the degradation
profile of the isolated drug and the tablet form (reference, generic and similar) and
qualify the degradation products by analyzing their cytotoxicity. The pharmacopeial
method was adapted with changes in mobile phase composition, following forced
drug degradation tests using acid (1 M HCl, 6 h reflux), alkali (0.1 M NaOH, 24 h)
neutral (39 h reflux), oxidant (32 % H2O2 48 h) and photolytic (254 nm, 3.5 h of
exposure) hydrolysis to provide at least 10% of drug degradation. An alternative
method was developed using ion pair with C18 column, mobile phase containing 10
mM sodium heptanosulfonato, pH 3.0: acetonitrile: methanol (75:8:17), flow 1
mL/min, 30°C and detection at 210 nm, which was val idated according to ANVISA.
Various degradation products of metformin hydrochloride were observed, with good
chromatographic resolution for both methods, showing that they are selective, and
indicative of drug stability. The ion pair method was successfully validated, showing
linearity in the range 50 to 50 µg/mL with good precision (CV < 3.0% intra-day and
interday), accuracy (recovery 100 ± 2.0 %) sensitivity (LD and LQ of 1.47 and 4.9
mg/mL, respectively) and robustness to small variations in temperature (29 - 31 °C).
The degradation profile of the reference, generic and similar medicines were very
similar to each other, but with less intensity than the drug alone. In the study of
cytotoxicity of the degraded drug, under different forced conditions, using L929 cells,
no cytotoxicity was observed, and the same was true for the medicines degraded by
acid hydrolysis.
Key words: Metformin hydrochloride, HPLC, Analytical validation, degradation
products, cytotoxicity
6
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Fluxograma para realização de estudos de estresse para
degradação em condições oxidativas (BRASIL, 2009)......................................
31
Figura 2 - Fluxograma para realização de estudos de estresse para
degradação em condições neutras (BRASIL, 2009)..........................................
32
Figura 3 - Fluxograma para realização de estudos de estresse para
degradação em condições ácidas ou alcalinas (BRASIL, 2009)........................
32
Figura 4 - Figura esquemática do processo envolvendo agente formador de
pareamento iônico de característica aniônica e amostra ionizada catiônica em
37
CLAE..................................................................................................................
Figura 5 – Estrutura molecular do Cloridrato de metformina.............................
47
Figura 6 - Estrutura molecular das impurezas especificadas do Cloridrato de
metformina..........................................................................................................
49
Figura 7 – Cromatogramas relativos ao ensaio de doseamento: (a) cloridrato
de metformina 25 µg/mL (b) mistura de cloridrato de metformina,
cianoguanidina e melamina, em 25 µg/mL empregando coluna Luna SCX ®,
tampão fosfato de potássio 150 mM pH 3,0:metanol 95:05, fluxo de 1 mL/min,
a 30 °C, com detecção em 218 nm.................... ................................................
73
Figura 8 - Cromatograma de Análise de degradação do fármaco a 25 µg/mL
em água: (a) cloridrato de metformina 20 µg/mL; (b) degradação ácida; (c)
degradação básica; (d) degradação neutra, (e) degradação oxidativa e (f)
degradação por fotólise. Condições cromatográficas conforme Figura 7..........
75
Figura 9 – Cromatograma de degradação do Glifage ®: (a) amostra sem
degradação, (b) degradação ácida, (c) básica, (d) neutra, (e) oxidativa e (f)
80
fotólise. Condições cromatográficas conforme Figura 7.....................................
Figura 10 – Cromatogramas de degradação do Glucoformin ®: (a) amostra
sem degradação, (b) degradação ácida, (c) básica, (d) neutra, (e) oxidativa e
82
(f) fotólise. Condições cromatográficas conforme Figura 7................................
Figura 11 – Cromatogramas de degradação do Genérico ®: (a) amostra sem
degradação, (b) degradação ácida, (c) básica, (d) neutra, (e) oxidativa e (f)
fotólise. Condições cromatográficas conforme Figura 7.....................................
83
7
Figura 12 – Desenho esquemático das placas de CCD utilizando: fase móvel
CH3Cl:MeOH:Ac.
Acético
nas
proporções:
(a)
63,63:31,80:5,45;
(b)
50:42,5:75; (c) 64,81:32,40:2,77. M = metformina padrão; D = diciandiamida;
Me = melamina; A = amostra degradada por hidrólise ácida;N = amostra
degradada por hidrólise neutra; O = amostra degradada por oxidação.............
86
Figura 13 – Desenho esquemático das placas de cromatografia em camada
delgada da amostra ácida utilizando como fase móvel (a) CH3Cl:MeOH:Ac.
Acético
63,63:31,80:5,45
(b)
CH3Cl:MeOH:Ac.
Acético
50:50
(c)
diclorometano:MeOH 50:50 e revelador ninhidrina 5%......................................
87
Figura 14 – (a) Desenho representativo da CCP do cloridrato de metformina
degradado em meio ácido; (b) desenho representativo da recromatografia em
CCD
das
bandas
encontradas
em
(a)
usando
fase
móvel
diclorometano:metanol 50:50 e revelador ninhidrina 5%....................................
88
Figura 15 – Desenho representativo da CCD obtida com as frações eluídas
da
coluna
flash
na
qual
foi
aplicada
a
fração
5.
Fase
móvel
88
Diclorometano:metanol 50:50, revelador ninhidrina 5%.....................................
Figura 16 – Espectro de RMN1 da fração 6 da CCP.........................................
89
Figura 17 - Espectro de RMN1 da subfração 3 da fração 5 da CCP................
90
Figura 18 – Desenho representativo da CCD obtida com a fração 6 eluída da
CCP, solvente hex:act etila 30:70, reveladas em câmara UV, 254nm...............
Figura 19 -
91
Cromatogramas da amostra Glifage® a 20 µg/mL após
degradação ácida, detecção em 204 nm, a 30°C , 1 mL/min, fase móvel
composta de heptanossulfonato de sódio 10 mM pH 3,0 (A), como agente de
pareamento iônico, com acetonitrila (B) e metanol (C): a) A:B:C (75:05:20) b)
A:B:C (75:10:15); c) A:B:C (75:15:10)................................................................
93
Figura 20 - Cromatogramas da amostra Glifage® a 20 µg/mL após
degradação ácida, detecção em 204 nm, a 35°C , 1 mL/min, fase móvel
composta de heptanossulfonato de sódio 10 mM pH 3,0 (A), como agente de
pareamento iônico, com acetonitrila (B) e metanol (C): a) A:B:C (75:05:20) b)
A:B:C (75:10:15); c) A:B:C (75:15:10)................................................................
Figura 21 -
Cromatogramas da amostra Glifage® a 20 µg/mL após
degradação ácida, detecção em 204 nm, a 40°C , 1 mL/min, fase móvel
94
8
composta de heptanossulfonato de sódio 10 mM pH 3,0 (A), como agente de
pareamento iônico, com acetonitrila (B) e metanol (C): a) A:B:C (75:05:20) b)
95
A:B:C (75:10:15); c) A:B:C (75:15:10)................................................................
Figura 22 – Cromatograma da amostra Glifage® após degradação ácida (20
µg/mL)
na
fase
móvel
heptanossulfonato
de
sódio
10
mM
pH
3,0:acetonitrila:metanol (75:10:15 v/v), 1 mL/min fluxo e 30 ºC temperatura,
detecção em 210 nm, coluna C18 (Luna®, Phenomenex), no cromatógrafo
Water..................................................................................................................
97
Figura 23 – Cromatograma da amostra Glifage® após degradação ácida (20
µg/mL)
na
fase
móvel
heptanossulfonato
de
sódio
10
mM
pH
3,0:acetonitrila:metanol (75:10:15 v/v), 0,8 mL/min fluxo e 30 ºC temperatura,
detecção em 210 nm, coluna C18 (Luna®, Phenomenex), no cromatógrafo
Waters................................................................................................................
97
Figura 24 – Cromatograma da amostra Glifage® após degradação ácida (20
µg/mL)
na
fase
móvel
heptanossulfonato
de
sódio
10
mM
pH
3,0:acetonitrila:metanol (75:8:17 v/v), 1 mL/min fluxo e 30º C temperatura,
detecção em 210 nm, coluna C18 (Luna®, Phenomenex), no cromatógrafo
Waters................................................................................................................
98
Figura 25 – Cromatogramas de análise diciandiamida (Di), melamina (Me) e
cloridrato de metformina (CM) (20 µg/mL) nas condições cromatográficas 99
citadas na Figura 24.............................................................................................
Figura 26 - Cromatogramas de análise do Cloridrato de metformina e das
especialidades farmacêuticas submetidas a hidólise ácida (HCl 1 M 6 h
refluxo), a 25 µg/mL: (a) Cloridrato de metformina (cromatógrafo Shimadzu);
(b) Glifage®, (c) Glucoformin®, (d) Genérico, nas condições cromatográficas
citadas na Figura 18, no cromatógrafo Waters................................................... 100
Figura 27 - Cromatogramas de análise do Cloridrato de metformina e das
especialidades farmacêuticas submetidas a hidólise básica (NaOH 0,1 M 24
h T.A.), a 25 µg/mL: (a) Cloridrato de metformina; (b) Glifage®, (c)
Glucoformin®, (d) Genérico, nas condições cromatográficas citadas na Figura
24, no cromatógrafo Waters...............................................................................
Figura 28 - Cromatogramas de análise das especialidades farmacêuticas
submetidas a hidólise neutra (39 h refluxo), a 25 µg/mL: (a) Glifage®, (b)
101
9
Glucoformin®, (c) Genérico, nas condições cromatográficas citadas na Figura 102
24, no cromatógrafo Waters...............................................................................
Figura 29 - Cromatogramas de análise do Cloridrato de metformina e das
especialidades farmacêuticas submetidos a oxidação (H2O2 48 h T. A.), a 25
µg/mL: (a) Cloridrato de metformina; (b) Glifage®, (c) Glucoformin®, (d)
Genérico,nas
condições
cromatográficas
citadas
na
Figura
24,
no
cromatógrafo Waters..........................................................................................
103
Figura 30 - Cromatogramas de análise da comprimidos submetidos à
Fotólise (3,5 h exposição a luz UV), a 25 µg/mL: (a) Glifage®, (b)
Glucoformin®, (d) Genérico, nas condições cromatográficas citadas na Figura
24, no cromatógrafo Waters...............................................................................
104
Figura 31 - Gráfico de linearidade do cloridrato de metformina por CLAE em
pareamento iônico com fase móvel heptanossulfonato de sódio 10 mM pH
3,0:acetonitrila:metanol (75:8:17 v/v), 1 mL/min fluxo e 30 ºC temperatura,
detecção em 210 nm, coluna C18 (Luna®, Phenomenex), no cromatógrafo
Waters................................................................................................................
107
Figura 32- Análise microscópica celular. a - células coradas com brometo de
etídio e diacetato de fluorisceína. b - células sem corante. c - células coradas
com corante Giemsa. 1 - condição ácida, 2 - condição básica, 3 - condição
neutra, 4 - condição oxidante, 5 - Fotólise, 6 – Metformina padrão, 7 –
Controle positivo (Triton X100®), 8 - Controle negativo (tampão PBS)............. 112
Figura 33 – a) Gráfico de viabilidade celular na análise de citotoxicidade dos
produtos de degradação das especialidades farmacêuticas submetida a
degradação ácida; b) Análise microcópica ds células coradas com diacetato
de fluorisceina e brometo de etídio 1:100, onde: A) Glifage® degradada em
meio ácido, B) Glucoformin® degradada em meio ácido, C) Genérico
degradada em meio ácido, D) Controle negativo tampao PBS e E) controle
positivo Triton X 100®........................................................................................
113
10
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Limites permitidos para impurezas.....................................................
30
Tabela 2 - Resultado do doseamento dos medicamentos Glifage ®,
Glucoformin ® e genérico Medley........................................................................
74
Tabela 3 – Porcentagens de degradação do cloridrato de metformina nas
diferentes condições de degradação selecionadas (ácida, base, oxidante,
77
neutra e fotolítica).................................................................................................
Tabela 4 - Porcentagens de degradação do fármaco e comprimidos................
84
Tabela 5 – Parâmetros cromatográficos da análise por CLAE em pareamento
iônico do cloridrato de metformina após degradação ácida, nas diferentes
temperaturas testadas..........................................................................................
96
Tabela 6 - Comparação dos percentuais de degradação do cloridrato de
metformina e especialidades farmacêuticas e entre os métodos por
CLAE....................................................................................................................
105
Tabela 7 - Ensaio de exatidão do método por CLAE de pareamento iônico, por
análise de recuperação do padrão cloridrato de metformina...............................
Tabela 8 -
108
Ensaio de Precisão do método por CLAE de pareamento
iônico....................................................................................................................
109
Tabela 9 - Ensaio de Robustez com variação e temperatura e fluxo da fase
móvel....................................................................................................................
110
Tabela 10 – Viabilidade celular em L929 do cloridrato de metformina antes e
após sofrer diferentes condições de degradação................................................
112
11
LISTA DE QUADRO
Quadro 1 - Condições de estresse sugeridas para medicamentos genéricos
ou similares por ocasião da solicitação de registro, pós-registro ou renovação
33
de registro junto à ANVISA..................................................................................
Quadro 2 - Limites de notificação para impurezas..............................................
34
Quadro 3 - Limites de identificação para impureza............................................
34
Quadro 4 - Limites de qualificação para impurezas............................................
34
Quadro 5 - Ensaios necessários para a validação do método analítico,
segundo sua finalidade........................................................................................
38
Quadro 6 - Limites porcentuais do teor do analito que devem estar contidos
no intervalo de linearidade para alguns métodos analíticos................................
40
Quadro 7 - Fatores que devem ser considerados na determinação da
robustez do método analítico...............................................................................
44
Quadro 8 - Métodos analíticos para o doseamento da metformina por CLAE...
54
Quadro 9 – Condições cromatográficas testadas durante desenvolvimento da
metodologia de análise do cloridrato de metformina e seus produtos de
64
degradação..........................................................................................................
Quadro 10 - Análise fatorial da variação entre temperatura, e proporção de
fase móvel orgânica no método por CLAE de pareamento iônico.......................
66
Quadro 11 – Ensaio de Exatidão por recuperação do padrão............................
68
12
LISTA DE ABREVIATURA
ACN = acetonitrila
Act = acetato
ANVISA = Agência Nacional de Vigilância Sanitária
CCD = cromatografia em camada delgada
CCP= cromatografia em camada preparativa
CG = Cromatografia gasosa
CG-MS = Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas
CLAE = Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CH3Cl = clorofórmio
CV = coeficiente de variação
DMSO = dimetil sulfóxido
DP = desvio padrão
DPR = desvio padrão relativo
EMEA = European Medicines Agency
FDA = Food and Drug Administration
Hex = hexano
HILIC= Cromatografia Líquida de Interação Hidrofílica
ICH = International Comission on Harmonization
LAPAM = Laboratório de Produção e Análise de Medicamentos
LD = Limite de detecção
LQ = Limite de quantificação
MeOH = Metanol
MIE= Métodos indicadores de estabilidade
MS = Espectrometria de massas
MTT = Brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil )-2,5-difenil-2H-tetrazólio
PBS = tampão fosfato de sódio
Rf = fator de retenção
RMN = ressonância magnética nuclear
T. A. = temperatura ambiente
USP = United States Pharmacopoeia
UV = ultravioleta
TDI= Ingestão Diária Total
13
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO..................................................................................................
16
2 OBJETIVOS......................................................................................................
18
2.1 Objetivo geral.................................................................................................
18
2.2 Objetivos específicos.....................................................................................
18
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .............................................................................
19
3.1 Estabilidade de fármacos e medicamentos....................................................
19
3.1.1
Fatores
que
influenciam
a
estabilidade
de
Fármacos
e
medicamentos......................................................................................................
22
3.2 Estudo de estabilidade..................................................................................
26
3.3 Método Indicativo de Estabilidade..................................................................
28
3.4 Impurezas e produtos de degradação............................................................
29
3.4.1 Solventes residuais.....................................................................................
29
3.4.2 Impureza inorgânica....................................................................................
29
3.4.3 Impureza orgânica ......................................................................................
29
3.5 Técnicas analíticas para análise de impurezas orgânicas.............................
34
3.5.1 Técnica de pareamento iônico por CLAE....................................................
36
3.6 Validação de metodologia analítica................................................................
37
3.6.1 Seletividade ................................................................................................
39
3.6.2 Linearidade..................................................................................................
39
3.6.3 Intervalo.......................................................................................................
40
3.6.4 Precisão......................................................................................................
41
3.6.5 Limite de detecção......................................................................................
41
3.6.6 Limite de quantificação................................................................................
42
3.6.7 Exatidão......................................................................................................
42
3.6.8 Robustez.....................................................................................................
43
3.7 Diabetes Mellitus............................................................................................
44
3.7.1 Cloridrato de metformina.............................................................................
47
3.7.2 Métodos por CLAE para análise do cloridrato de metformina.....................
49
4 MATERIAIS E MÉTODOS...............................................................................
56
4.1 Materiais.........................................................................................................
56
4.2 Equipamentos ...............................................................................................
57
4.3
Doseamento
do
cloridrato
de
metformina
nas
especialidades
14
farmacêuticas.......................................................................................................
58
4.4 Estabelecimento das condições de degradação do cloridrato de
metformina ..........................................................................................................
60
4.4.1 Hidrólise ácida.............................................................................................
60
4.4.2 Hidrólise básica...........................................................................................
60
4.4.3 Degradação Neutra ....................................................................................
61
4.4.4 Degradação oxidante..................................................................................
61
4.4.5 Fotólise........................................................................................................
61
4.5 Caracterização do produtos de degradação..................................................
62
4.5.1 Cromatografia em camada delgada (CCD).................................................
62
4.5.2 Cromatografia em camada delgada preparativa (CCP)..............................
63
4.5.3 Ressonancia magnética nuclear (RMN)......................................................
63
4.5.4 Coluna Flash...............................................................................................
63
4.5.5 Espectroscopia de massas (MS).................................................................
63
4.6 Desenvolvimento de método alternativa para análise dos produtos de
degradação por CLAE..........................................................................................
64
4.7 Validação analítica.........................................................................................
66
4.7.1 Linearidade e intervalo................................................................................
67
4.7.2 Exatidão......................................................................................................
67
4.7.3 Seletividade.................................................................................................
68
4.7.4 Precisão......................................................................................................
69
4.7.4.1 Repetibilidade...........................................................................................
69
4.7.4.2 Precisão intermediária..............................................................................
69
4.7.5 Limite de detecção e quantificação.............................................................
70
4.7.6 Robustez ....................................................................................................
70
4.8 Ensaios de citotoxicidade...............................................................................
70
4.9 Análise estatística..........................................................................................
71
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................
73
5.1 Doseamento das Especialidades Farmacêuticas..........................................
74
5.2 Teste de degradação forçada........................................................................
74
5.3 Caracterização dos produtos de degradação................................................
85
5.4 Desenvolvimento de Método alternativo para Doseamento do fármaco e
análise dos produtos de degradação por CLAE...................................................
91
15
5.5 Validação do método de pareamento iônico por CLAE.................................
106
5.6 Citotoxicidade................................................................................................. 111
6 CONCLUSÃO...................................................................................................
115
REFERÊNCIAS.................................................................................................... 117
16
1 INTRODUÇÃO
Um dos requisitos básicos para a obtenção do registro de um medicamento
perante o Ministério da Saúde é a realização do estudo de estabilidade, visto que a
estabilidade é inerente ao produto e, em determinadas condições climáticas, pode
sofrer algumas modificações (BRASIL, 2004; EMEA, 2004; KOPP, 2006). O estudo
de estabilidade tem por objetivo determinar o prazo de validade dos medicamentos
bem
como
acompanhar
suas
características
físico-químicas
durante
seu
armazenamento.
Alguns fatores podem delimitar a estabilidade dos fármacos, bem como ser a
causa principal da perda de atividade terapêutica, como umidade, calor, pH e
luminosidade, os quais também podem acelerar o processo de degradação dos
mesmos (ENEIDA, 2005; EMEA, 2004; FLORENCE; ATTWOOD, 2003).
A instabilidade dos produtos farmacêuticos pode dar origem aos produtos de
degradação. Estes devem ser notificados, identificados e/ou qualificados quanto ao
grau de toxicidade, por ocasião do registro, pós-registro e renovação de registro de
medicamentos junto à Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), segundo
o Informe Técnico n° 1, de 15 de julho de 2008 (BRA SIL, 2008).
O estudo de estabilidade requer o emprego de metodologias analíticas
validadas que sejam indicadoras de estabilidade (Métodos Indicadores de
Estabilidade-MIE) do analito em estudo. Testes de degradação forçada do analito
podem auxiliar no estabelecimento das vias de degradação, na identificação dos
produtos de degradação e na avaliação da estabilidade intrínseca da molécula além
de validar a capacidade do método analítico de ser indicativo da estabilidade da
amostra em estudo. A natureza dos testes de degradação forçada ou de estresse irá
depender das características individuais do fármaco e do tipo de forma farmacêutica
envolvida (ICH, 2006).
A fim de contribuir para o conhecimento da estabilidade do cloridrato de
metformina, um dos fármacos mais prescritos mundialmente para o tratamento do
Diabetes Tipo II e constante da Relação Nacional de Medicamentos (RENAME)
(BRASIL, 2010a), este trabalho visou desenvolver e adaptar o método analítico por
CLAE descrito na Farmacopeia Britânica (BRITISH PHARMACOPEIA, 2008),
verificando se o mesmo é indicativo da estabilidade do fármaco, além de
17
desenvolver e validar um método alternativo, empregando coluna C18 e pareamento
iônico.
Em ambos os métodos foi comparado o perfil cromatográfico após a
degradação forçada, em diferentes condições, do cloridrato de metformina (fármaco)
e de diferentes especialidades farmacêuticas (referência: Glifage®, similar:
Glucoformin® e genérico: Cloridrato de metformina, Medley), na forma de
comprimidos de 500 mg. Além de qualificar seus produtos de degradação,
analisando a citotoxicidade em células L929.
18
2 OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
Desenvolver e validar metodologias analíticas por CLAE, indicativas da
estabilidade do cloridrato de metformina, por meio de estudos de degradação
forçada e comparar o perfil de degradação bem como a citotoxicidade dos produtos
de degradação formados.
2.2. Objetivos Específicos
• Selecionar as condições de degradação forçada do cloridrato de metformina;
• Desenvolver e validar métodos analíticos por CLAE indicativos de estabilidade
do cloridrato de metformina;
• Analisar e comparar o perfil de degradação do fármaco isolado e das
especialidades farmacêuticas (comprimidos de 500 mg: referência, genérico e
similar), nas diferentes condições de estresse, por CLAE e CCD;
• Comparar a citotoxicidade do cloridrato de metformina degradado nas
diferentes condições de estresse e das especialidades farmacêuticas usando
células L929.
19
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Estabilidade de fármacos e medicamentos
Estabilidade de um produto farmacêutico é definida como a capacidade do
mesmo em manter as mesmas características de quando fabricado, durante seu
prazo de validade (ANSEL; LOYD; POPOVICH, 2005).
Os fabricantes são os responsáveis por garantir que os medicamentos
permaneçam inalterados e que os mesmos sejam seguros e eficazes. Para isso,
realizam-se os testes de estabilidade, pois estes são uma maneira de conhecer o
comportamento do fármaco ou medicamento durante seu tempo de utilização
(EMEA, 2004), determinar o prazo de validade dos mesmos, e ainda determinar as
condições ideais de armazenamento (EMEA, 2004; KOPP, 2006);
Dependendo das condições climáticas às quais o produto é exposto, pode
haver a formação de produtos de degradação, que necessitam ser analisados por
métodos analíticos adequados para que possam ser identificados, quantificados e
qualificados (KOPP, 2006).
Além dos produtos de degradação, o fármaco pode apresentar outras
impurezas, como as misturas racêmicas que podem ser geradas durante a sua
síntese. Neste aspecto, é de suma importância a identificação e qualificação destas
impurezas, que podem causar efeitos tóxicos, podendo colocar em risco a vida
humana. Como exemplo de uma mistura racêmica muito conhecida pode-se citar a
talidomida, gerada durante a síntese sem adequado monitoramento (SILVEIRA et
al., 2001).
A talidomida, fármaco sintetizado na Alemanha para tratamento de alergias,
apresentou efeito sedativo e hipnótico, não apresentando efeitos colaterais nos
estudos clínicos preliminares realizados.
Os testes realizados em animais não
demonstravam efeitos tóxicos, e os testes acerca de teratogenicidade, naquela
época,
restringiam-se
a
produtos
como
antineoplásicos,
antimetabólicos,
anabolizantes e sais de metais pesados (SILVEIRA et al., 2001).
Este medicamento chegou a ser o mais vendido da década de 60, e era
utilizado em gestantes como antiemético. Porém, com o tempo observou-se que os
fetos apresentavam anomalias, como ausência de membros inferiores e superiores,
20
denominados focomelia e amelia. Sugeriu-se que um dos seus efeitos teratogênicos
fosse devido à inibição da angiogênese, dificultando o perfeito desenvolvimento do
feto (SILVEIRA et al., 2001).
Depois de muitas investigações foi constatado que estes efeitos deviam-se à
mistura racêmica gerada durante a síntese da talidomida, sendo que apenas um de
seus isômeros era responsável pelos efeitos apresentados, a forma S. Porém,
atualmente, sabe-se que ambos os isômeros (S e R) são capazes de gerar os
efeitos teratogênicos, devido à capacidade de isomerização in vivo do centro quiral
(BARREIRO; FERREIRA; COSTA, 1997).
O termo isomerização refere-se à conversão do fármaco em seu isômero
óptico ou geométrico, que geralmente apresenta atividades diferentes, e pode ser
considerada uma forma de degradação, resultando na perda da atividade
terapêutica. Nesta condição, pode-se citar a adrenalina que em soluções com baixo
pH, tende a racemizar e formar o isômero menos ativo, a tetraciclina, que é
isomerizada em 4-epi-tetraciclina, com atividade reduzida. A pilocarpina sofre
catálise básica através da epimerização. Alguns fármacos como os ésteres de
cefalosporinas, sofrem epimerização reversível (FLORENCE; ATTWOOD, 2003).
Em alguns casos a mistura racêmica não necessariamente é considerada um
risco aos seres humanos, como o caso do rabeprazol, que é comercializado na
forma racêmica e não apresenta problemas. Mesmo assim é importante a
identificação e quantificação, o qual somente é possível através da técnica de
cromatografia quiral (GARCIA et al., 2008).
Outro problema de estabilidade em fármacos que
apresentam
em
sua
estrutura grupos amina é a reação de Maillard. A reação ocorre entre o grupamento
amina, com o grupo carbonila presente na sacarose ou em demais adjuvantes
farmacotécnicos. Como exemplo cita-se o xarope de cloridrato de metoclopramida,
onde foi evidenciada uma perda gradual no teor, com decomposição do fármaco
(FREITAS; MAGALHÃES, 2005).
Outro tipo de instabilidade farmacêutica é o aparecimento de impurezas, as
quais podem ser geradas durante a produção, devido às incompatibilidades
farmacotécnicas, armazenamento inadequado ou até mesmo presença de resíduo
de produtos de limpeza, como no caso do antiretroviral mesilato de nelfinavir
produzido pelo laboratório farmacêutico Roche, em que a matéria-prima produzida
foi contaminada pelo produto de limpeza utilizado nos equipamentos. Análises
21
químicas detalhadas demonstraram a presença de ácido etil éster metasulfônico.
Com isso, o medicamento foi retirado do mercado prejudicando a terapia de alguns
pacientes que faziam o uso do mesmo (SIMÃO; SILVEIRA, 2007).
Excipientes utilizados nas formulações podem também influenciar na
degradação dos fármacos, seja por incompatibilidade farmacotécnica no momento
da fabricação, seja por tempo de exposição. Pode ocorrer oxidação do fármaco
causando a alteração da coloração do comprimido, ou até mesmo pode ocorrer à
alteração irreversível do princípio ativo, como o caso da lactose que é incompatível
com a neomicina e polimixina (BRANDÃO, 2007). A presença de íons ferro na
formulação contendo ácido ascórbico o transforma em ascorbato de ferro, o qual é
inativo, bem como o próprio ácido ascórbico, por ser um agente oxidante, está
sujeito à redução estrutural (MACHADO, 2007).
A preocupação com a estabilidade de fármacos e medicamentos é crescente,
e os órgãos regulatórios vêm ampliando suas exigências na concessão do registro
de medicamentos para comercialização nos diferentes países (ICH,1996a; 2006;
BRASIL, 2004; 2008).
O estabelecimento de normas regulatórias quanto à impurezas em novos
fármacos tem sido constantemente discutido e atualizado por meio de guias
internacionais, pelo ICH (International Conference on Harmonization of Technical
Requirements) (EMEA 2004; ICH, 2006). No Brasil, a ANVISA publicou
recentemente um Regulamento Técnico (BRASIL, 2008) exigindo a notificação,
identificação e quantificação dos produtos de degradação para o registro e
renovação de registros de todos os tipos de medicamentos (referência, genérico e
similares), mesmo os já tradicionais. Este documento sugere as condições de teste
de estresse aos quais os produtos devem ser submetidos, bem como determina os
limites de identificação, quantificação e qualificação das impurezas para cada faixa
de dose diária ingerida de fármaco.
Neste documento a ANVISA colocou prazo até 31/05/2009 para que as
empresas que não possuíssem método analítico validado para identificação e
quantificação de produtos de degradação empregados em estudos de estabilidade
apresentassem estes estudos para o registro, pós-registro e renovação de registro.
As empresas deveriam apresentar relatório do estudo de estresse, acompanhado de
sua análise crítica e ainda um cronograma de estudo que deveria contemplar o
desenho do estudo de degradação e metodologia analítica que corresponda à
22
avaliação completa. Já para registros posteriores a 01/06/2009 somente seriam
aceitos estudos de estabilidade contemplando este parâmetro, com estudo, relatório
e conclusões completos (BRASIL, 2008).
Diferente das exigências brasileiras, as normas internacionais exigem a
quantificação e identificação dos produtos de degradação apenas para novas
substâncias,
excluindo
ainda
substâncias
semi-sintéticas,
peptídeos,
oligonucleotídeos, material vegetal, animal e radiofármacos (FDA, 2003; EMEA
2004; ICH 2006).
3.1.1 Fatores que influenciam a estabilidade de fármacos e medicamentos
A estabilidade pode ser dividida em cinco diferentes tipos: química, física,
microbiológica, terapêutica e toxicológica (ANSEL; LOYD; POPOVICH, 2005).
A estabilidade química é definida como a capacidade de manter integridade
química (teor e produtos de degradação), indicados na embalagem. A física, de
manter
as
características
organolépticas
e
farmacotécnicas
intactas.
A
microbiológica, de manter o produto livre de contaminação microbiana, e preservar a
ação antimicrobiana quando existente. A terapêutica, de manter o efeito terapêutico
inalterado e a toxicológica, de assegurar que não haja aumento da toxicidade
(ANSEL; LOYD; POPOVICH, 2005).
Alguns fatores podem afetar diretamente a estabilidade de fármacos e
medicamentos, como a temperatura, umidade, luminosidade, gases atmosféricos, os
quais são fatores extrínsecos ao produto. Já hidrólise, oxidação e fotólise, são
fatores intrínsecos. E ainda há fatores inerentes à formulação, como polimorfismo,
incompatibilidade, pH, tamanho da partícula, vaporização, processo de fabricação,
material de embalagem e transporte (ENEIDA, 2005; EMEA, 2004; FLORENCE;
ATTWOOD, 2003).
A temperatura pode acelerar a velocidade de degradação dos produtos
farmacêuticos, sendo o fator mais importante por não existir material de embalagem
primário que proteja o produto de elevadas temperaturas. Toma-se cuidado com o
local de armazenamento, que deve ser de acordo com as exigências do produto, por
exemplo, acondicionar em temperatura ambiente, sob refrigeração ou congelamento
(ENEIDA, 2005, KOMMANABOYINA; RHODES, 1999).
De acordo com as condições climáticas as quais o produto é exposto, este
pode apresentar um comportamento diferente, e ainda causar efeitos tóxicos devido
23
a possíveis produtos de degradação, que podem ser gerados durante a sua síntese
ou armazenamento (KOPP, 2006).
Estudos de degradação forçada com aumento de temperatura realizados com
meropenem demonstraram uma drástica modificação na estrutura do seu anel βlactâmico, sendo explicado pela descarboxilação e aromatização do anel pirrolidona
resultando num anel pirrólico, o que torna a molécula inespecífica diante do seu
receptor (MENDEZ et al., 2008).
Já a umidade, presente no ar, pode afetar a cinética de degradação dos
produtos farmacêuticos, principalmente se associada à temperaturas elevadas.
Como exemplos de substâncias susceptíveis à umidade citam-se o ácido retinóico, o
ácido ascórbico, o ácido acetilsalicílico e o cloridrato de ranitidina (ENEIDA, 2005).
A hidrólise pode ser gerada pelo simples contato do fármaco ou da
formulação com umidade, ou mesmo com variações no pH da formulação. Muitos
fármacos susceptíveis à hidrólise como os derivados de ácido carboxílico, ou éster,
amida, lactona, lactama, imida ou carbamato (FLORENCE; ATTWOOD, 2003;
YOSHIOKA; ESTELLA, 2000).
A hidrólise de ésteres se dá pela reação bimolecular que envolve a quebra
acil-oxigênio, como exemplo, a procaína, ácido acetilsalicílico, cocaína, fisostigmina,
tetracaína e metildopa. Na hidrólise de amidas ocorre a quebra da ligação amida,
como exemplo nos fármacos:
cinchocaína,
ergometrina, benzilpenicilina
e
clorafenicol. No anel lactama, considerada a decomposição do nitrazepam e
clordiazepóxido, inclui penicilinas e cefalosporinas, como conseqüência a perda do
efeito farmacológico (FLORENCE; ATTWOOD, 2003).
O pH é um fator de influência direta nas formulações, sendo capaz de
aumentar ou diminuir a velocidade das reações, como hidrólise e oxidação, pois
ambas podem ser catalisadas por ácidos e/ou bases. Como exemplo, a buspirona
não sobre efeito do ar e nem de da umidade, mas degrada-se em meio básico,
formando vários produtos de degradação (YOSHIOKA; ESTELA, 2000).
Em estudos de degradação forçada em meio alcalino utilizando o meropenem
como fármaco, foi demonstrado a formação de apenas uma única impureza,
provavelmente porque em meio alcalino os nucleófilos ataquem as ligações
lactâmicas, desestabilizando o anel. Posteriormente estudos de citotoxicidade in
vitro demonstraram que este produto de degradação apresentou-se tóxico reduzindo
24
a viabilidade celular em torno de 41,17 %, confirmando a importância de se
conhecer, identificar e quantificar estes mesmos produtos (MENDEZ et al., 2008).
Como exemplo de degradação em meio ácido tem-se o rabeprazol, por isso
os comprimidos exigem um tipo de revestimento gastroresistente que os torne mais
protegidos. O rabeprazol é instável e forma produtos de degradação quando exposto
também à luz, ao aumento de temperatura e à condições oxidativas (GARCIA,
2008).
Outro fator importante é a luminosidade, que em determinado comprimento de
onda pode fornecer a energia necessária para que reações como oxidação e
redução se iniciem. Ainda pode gerar outras instabilidades farmacêuticas como
polimerização, rearranjo de anéis, ruptura de ligações, isomerização e racemização
que podem tornar o fármaco não seguro para uso terapêutico (ENEIDA, 2005).
Quando o fármaco é exposto à luz o fenômeno conhecido como fotólise pode
ocorrer, devido à capacidade da molécula de absorver radiação, a qual pode atuar
como
principal
reagente
da
reação
fotoquímica
e
ou
fotossensibilizador.
Praticamente, todas as substâncias ativas (fármacos) são capazes de absorver luz
UV e/ou luz visível (LACHMAN; LIEBERMEN; KANIG, 2001; MORIWAKI et al, 2001),
devido à presença de grupos cromóforos nas estruturas químicas.
Estudos como os de fotodegradação, onde se emprega a exposição do
produto à determinada luminosidade por um determinado tempo são importantes e
parte integrante dos estudos de estabilidade, pois podem permitir avaliar a perda da
potência do fármaco e ainda geram efeitos adversos, mesmo com mínimas
quantidade de produto tóxico formado (BREIER et al., 2008).
Muitos produtos farmacêuticos são sensíveis à luz, como hidrocortisona,
prednisolona, riboflavina, ácido ascórbico, tiazídicos e ácido fólico. O mecanismo é
ainda desconhecido, mas sabe-se que em alguns casos vem acompanhado de
despigmentação ou formação de pigmento tanto no próprio fármaco, como na
solução em que este se encontra (FLORENCE; ATTWOOD, 2003).
Outro fármaco susceptível ao processo de fotodegradação é a fexofenadina,
anti-histamínico de segunda geração, análogo da histamina (BREIER; STEPPE;
SCHAPOVAL, 2006). Quando submetido ao teste de fotoestabilidade apresentou
dois principais produtos de degradação, identificados como um derivado isopropil e
um derivado benzofenona (BREIER et al., 2008).
25
A degradação por exposição à luz pode levar à polimerização, que não é
apenas gerada pela exposição á luz, mas também espontaneamente entre dois
fármacos durante a estocagem, e pode desencadear processos alérgicos, como
ocorre em soluções que contém ampicilina e penicilina (FLORENCE; ATTWOOD,
2003; NETO, 2006).
Outra causa muito comum de degradação de fármacos é a oxidação. Sob
influência do oxigênio atmosférico, as moléculas podem sofrer transformações, com
o surgimento de grupos funcionais diferentes, fenômeno conhecido como autooxidação, gerando substâncias muitas vezes inativas ou tóxicas (ENEIDA, 2005).
O processo de oxidação envolve a remoção do átomo eletropositivo
(hidrogênio), radical elétron, ou adição de um átomo eletronegativo (oxigênio) ou
radical. A maioria das reações de oxidação ocorre lentamente sob ação do oxigênio
molecular, e irá continuar até que o radical livre seja destruído ou por uma reação
secundária, que pode quebrar a cadeia (FLORENCE; ATTWOOD, 2003; SKOOG et
al, 2006).
As aminas, por exemplo, são compostos oxidáveis, por uma variedade de
agentes oxidantes, inclusive pela ação do oxigênio do ar. Quando cíclicas são
facilmente oxidadas, pelo fato do grupamento amino ser doador de elétrons,
formando misturas complexas (SOLOMONS; 1996).
Como exemplos de fármacos que sofrem ação oxidativa, têm-se a morfina,
fenilefrina, e também as classes como catecolaminas, esteróides, antibióticos,
vitaminas,
óleos
vegetais,
compostos
fenólicos
e
gorduras
(FLORENCE;
ATTWOOD, 2003).
Como o oxigênio é o principal responsável pela reação de oxidação, uma
alternativa para evitar o processo é o preenchimento total dos recipientes, ou a
substituição de oxigênio por outro gás como o nitrogênio ou dióxido de carbono.
Como o processo é um tanto complicado, tem-se a possibilidade de utilizar
adjuvantes farmacotécnicos como antioxidantes, que irão estabilizar os radicais
impedindo a degradação do fármaco. Pode-se utilizar como antioxidantes tocoferóis,
hidroxianisol, butilado butil hidroxitolueno e galatos (FIGUEIREDO; LAPORTA, 2003;
FLORENCE; ATTWOOD, 2003).
Durante a etapa de desenvolvimento dos produtos é importante fazer um
estudo prévio sobre o comportamento dos constituintes da formulação, para evitar
que ocorram incompatibilidades farmacotécnicas, as quais são comuns de ocorrer
26
entre dois fármacos de uma mesma formulação, entre excipientes e entre
excipientes e fármacos, comprometendo a estabilidade e qualidade da formulação.
(YOSHIOKA; ESTELLA, 2000; KOPP, 2006).
Além disso, algumas etapas durante o processo de fabricação também
podem influenciar na degradação do fármaco, como por exemplo, a trituração, onde
alguns fármacos podem liberar moléculas de água do seu interior e assim formar
grumos, inviabilizando a utilização (ENEIDA, 2005).
Uma
das
etapas
mais
importantes
é
a
seleção
do
material
de
acondicionamento, que deve ser feita com muita atenção, pois as embalagens
geralmente são fabricadas com plástico, e podem ter interação com muitos
medicamentos, principalmente as formas farmacêuticas líquidas. As embalagens
devem também ser bem fechadas para impermeabilizar o produto contra umidade,
ar e ainda devem proteger da luz (ENEIDA, 2005).
3.2 Estudo de estabilidade
Para a avaliação das condições de preservação de um medicamento faz-se
necessário um estudo de estabilidade, que tem por objetivo acompanhar um produto
durante todo o seu prazo de validade, analisando as mudanças ocorridas por
exposição aos fatores intrínsecos e extrínsecos, como luminosidade, umidade,
gases atmosféricos, composição e dosagem, incompatibilidade farmacotécnica,
possível interação com material de embalagem, como também analisar se as
condições de armazenamento estão adequadas (BRASIL, 2005).
O estudo se aplica para prever, determinar ou acompanhar o prazo de
validade de quaisquer produtos farmacêuticos que contenham fármacos bem
conhecidos (BRASIL, 2005). Todos os produtos farmacêuticos (novos ou apenas
diferentes) devem passar por testes de estabilidade para poderem ser registrados
nos órgãos competentes que no caso do Brasil é a ANVISA.
Entende-se por diferentes produtos farmacêuticos aqueles cuja substância
ativa seja a mesma já existente, porém em concentrações, vias de administração,
formas farmacêuticas e/ou com sistemas de liberação diferentes (ICH, 1996a;
CANADA, 1998).
27
O estudo de estabilidade oficial divide-se em acelerado, de longa duração e
de acompanhamento. No estudo de estabilidade acelerado, tem-se por objetivo
acelerar a degradação química ou mudanças físicas de um produto em condições
forçadas de armazenamento. Como a exposição deste produto a temperaturas de 40
ºC ± 2 ºC e umidade relativa de 75 % ± 5 % por um período de 6 meses. Com base
neste estudo poderá ser concedido um prazo de validade provisório de 24 meses. O
prazo de validade deverá ser confirmado com o estudo de longa duração, o qual
deve ser realizado a 30 ºC ± 2 ºC e umidade relativa de 75 % ± 5 %, durante 12
meses ao menos para medicamentos no estado sólido (BRASIL, 2005).
Ao mesmo tempo, o estudo de estabilidade de longa duração foi projetado
para avaliar as características físicas, químicas e microbiológicas do produto durante
seu prazo de validade. Os resultados confirmam o prazo de validade, que variam
para cada classe referida e ainda estabelecem as condições ideais de
armazenamento (BRASIL, 2005).
Adicionalmente, há o estudo de estabilidade de acompanhamento, que auxilia
na avaliação das características físicas, químicas, biológicas e microbiológicas
conforme os resultados obtidos nos estudos de longa duração (ICH, 2003, BRASIL,
2005). O estudo deve ser realizado utilizando as mesmas condições testadas nos
estudos de longa duração, somente pode ser realizado se o produto não sofrer
nenhuma alteração durante os estudos de longa duração. A amostragem
preconizada são dois lotes anuais para indústrias que fabricam mais de quinze lotes
por ano e um lote anual para as que produzem menos de quinze lotes por ano.
Estes lotes recolhidos devem ser submetidos a todas as análises estipuladas no
estudo de estabilidade (BRASIL, 2005).
Em relação à frequência que os testes são realizados, no estudo de
estabilidade acelerado, devem ser realizados todos os testes descritos nos
compêndios oficiais, e a periodicidade deve ser de 0, 1, 2, 3 e 6 meses. O estudo de
longa duração deve ser realizado em 0, 3, 6, 9, 12, 18 e 24 meses, e anualmente
para estudo de acompanhamento e prazos de validade estendidos para mais de 24
meses (BRASIL, 2005; FDA, 2003).
O estudo de estabilidade deve ser executado com o produto na sua
embalagem final, ou se for a granel, os estudos devem demonstrar que as
especificações do produto estão mantidas. Se a embalagem final apresenta barreira
28
para vapor, como ampola, seringa de vidro preenchida, tubo de alumínio fechado
mecanicamente, não há necessidade de controle de umidade (BRASIL, 2005).
3.3 Método Indicativo de Estabilidade
A fim de monitorar os estudos de estabilidade, é imprescindível empregar
métodos indicadores de estabilidade (MIE), ou seja, métodos analíticos validados
que sejam capazes de detectar alterações nas propriedades do fármaco e do
produto farmacêutico, medindo os analitos sem interferência de produtos de
degradação, impurezas do processo, excipientes ou outras impurezas potenciais
(FDA, 2000). Desta forma pode-se evitar que produtos sejam erroneamente
aprovados nos estudos, mesmo apresentando degradações não detectadas nem
quantificadas pelo método, devido à problemas de sensibilidade e seletividade do
mesmo.
Como parte integrante tem o estudo de degradação forçada, regulamentado
pelo ICH (2003), este estudo apresenta extrema importância, pois com ele tem-se a
formação das impurezas, as quais auxiliam no desenvolvimento de um método que
seja seletivo ao fármaco em estudo.
Para desenvolver um método indicativo de estabilidade, requer primeiramente
ter um conhecimento das características físico-químicas do fármaco, indicando a
maneira como o método será conduzido, fase móvel à ser utilizada, pH, fase
estacionária e definir as rotas de degradação deste fármaco. Se o fármaco não é
conhecido parte se do inicio, fazendo os teste preliminares para selecionar as
melhores condições de análise com base em tentativas (BAKSHI, SINGH, 2002).
Com o método desenvolvido, as amostras degradadas e as impurezas
isoladas, dá-se inicio a identificação destes produtos, que pode ser através de
detectores acoplados ao próprio sistema de CLAE, como exemplo CLAE-MS, onde
com base na massa molecular dos resíduos gerados durante a análise, deduz-se a
estrutura molecular da impureza, ou a amostra degradada sofre um pré tratamento
de maneira a separar a impureza, utilizando a técnica mais adequada de
identificação e com base nisso define-se um padrão para esta impureza que será
utilizada nas análises posteriores. E por fim faz-se a validação deste método.
Portanto o uso de MIE aumenta a confiabilidade dos estudos de estabilidade, pois
assegura a seletividade do método (BAKSHI, SINGH, 2002).
29
3.4 Impurezas e produtos de degradação
Os produtos de degradação podem ser gerados durante síntese, produção ou
armazenamento e são considerados impurezas (BRASIL, 2008).
Segundo a International Conference on Harmonization of Technical
Requirements for Registration of Pharmaceutical for Human Use (ICH), as impurezas
que habitualmente podem acompanhar uma substância ativa dividem-se em 3
grupos: solventes residuais, impurezas inorgânicas e impurezas orgânicas (ICH,
2006).
3.4.1 Solventes Residuais
Consiste em solventes orgânicos voláteis e são definidos como solventes
utilizados
para
síntese
de matérias
primas,
excipientes e
especialidades
farmacêuticas (ICH, 1997).
A escolha do solvente é decisiva, podendo influenciar na rota sintética e no
rendimento da substância, mas nem sempre se consegue remover completamente
estes solventes pelas técnicas de produção (ICH, 1997).
Os solventes são classificados conforme sua toxicidade. Dá-se preferência
por utilizar os de classe 3, pois são os menos tóxicos, porém a utilização de
solventes mais tóxicos (classe 1 e 2) se justifica avaliando o risco-benefício (ICH,
1997).
A
análise
destes
solventes
residuais
é
feita
através
de
técnicas
cromatográficas, principalmente cromatografia gasosa (JACQ; DADIV; SANDRA,
2008)
3.4.2 Impurezas inorgânicas
Resultam do processo de síntese dos fármacos e incluem reagentes, ligantes
e catalisadores, metais pesados ou resíduos de outros metais e sais inorgânicos
(COSTA, 2005; BRASIL, 2009).
3.4.3 Impurezas orgânicas
São formadas durante a síntese, estocagem do produto ou durante o
processo de fabricação da forma farmacêutica. Podem ser identificáveis ou não
30
identificáveis, voláteis ou não voláteis incluindo, matérias primas (de partida),
produtos relacionados, produtos intermediários, produtos de degradação, reagentes
ligantes e catalisadores (COSTA, 2005; ICH, 2006; BRASIL, 2009).
No caso de novos fármacos, os estudos de impurezas devem ser conduzidos
para caracterizar a estrutura das mesmas quando estas estiverem em níveis
superiores aos limites de identificação (Tabela 1). Tais limites são calculados com
base no fator resposta do detector (área) do produto de degradação em relação ao
fator resposta do analito. Além disso, qualquer impureza que surja no estudo de
estabilidade nas condições de estocagem recomendadas, em níveis superiores aos
limites de identificação citados acima, também devem ser caracterizados. Quando a
identificação da impureza não é possível deve ser apresentado um relatório
demonstrando as tentativas experimentais realizadas, sem sucesso, por ocasião do
registro do fármaco junto aos órgãos regulatórios. Se as impurezas estiverem em
níveis iguais ou inferiores ao limite de identificação sua caracterização não é exigida
(ICH, 2006).
Tabela 1 - Limites permitidos para impurezas
Dose máxima
Limite reportado
Diária
≥ 2 g/dia
0,05 %
Limite para
Limite para
identificação
qualificação
0,10 % ou 1 mg
0,15 % ou1 mg dia
por dia
<2 g/dia
0,03 %
0,05 %
0,05 %
Fonte: ICH (2006).
Segundo o ICH (2006) a qualificação consiste em determinar a segurança
biológica de uma impureza individual ou de um conjunto de impurezas no nível
especificado. Os níveis de impurezas presentes em um fármaco que já tenha sido
adequadamente testado em estudos de segurança e/ou estudos clínicos podem ser
considerados qualificados. Impurezas que sejam também metabólitos presentes em
estudos em humanos e/ou animais, são geralmente consideradas qualificadas. As
impurezas podem ser qualificadas juntas ou separadamente. A qualificação pode ser
especialmente importante quando há evidências de que tais impurezas em certos
fármacos ou classes terapêuticas tenham sido previamente associadas com reações
31
adversas em pacientes. No Brasil, é exigido das empresas fabricantes ou
importadores de insumos farmacêuticos ativos (IFA), dentro do relatório do processo
de fabricação, o perfil das impurezas orgânicas, inorgânicas e solventes residuais,
além do relatório de estudo de estabilidade e fotoestabilidade, entre outros
documentos,
para
o
devido
registro
do
IFA
no
país
(BRASIL,
2009).
Recentemente foi publicada uma consulta pública pela ANVISA (BRASIL,
2010b) que dispõe sobre o estudo de estabilidade de IFAs na qual são previstos
testes de degradação forçada a fim de auxiliar na identificação dos prováveis
produtos de degradação e os procedimentos analíticos a serem adotados nos
estudos de estabilidade. Este documento postula que os métodos analíticos devem
ser validados e indicadores da estabilidade do fármaco (MIE). Entre os testes de
degradação forçada, devem ser incluídos os efeitos da temperatura, da umidade, da
oxidação e da luz no IFA. Os testes devem também avaliar sua susceptibilidade à
hidrólise em ampla faixa de valores de pH, principalmente se o insumo for utilizado
em uma suspensão ou solução aquosa. São sugeridos fluxogramas para a tomada
de decisão quanto às condições dos testes, conforme exposto nas Figuras 1, 2 e 3.
Porém, não são estabelecidos os percentuais de degradação a serem alcançados
nos testes, limitando-se ao termo “degradação suficiente”.
Figura 1 - Fluxograma para realização de estudos de estresse para
degradação em condições oxidativas (BRASIL, 2010b).
32
Figura 2 - Fluxograma para realização de estudos de estresse para degradação em
condições neutras (BRASIL, 2010b).
.
Figura 3 - Fluxograma para realização de estudos de estresse para
degradação em condições ácidas ou alcalinas (BRASIL, 2010b).
33
No informe técnico nº 1 de 15 de julho de 2008 (BRASIL, 2008), o anexo do
Guia para Realização de Estudo de Estabilidade (BRASIL, 2005), exige-se a
apresentação dos estudos de estabilidade incluídos os testes de estresse de
medicamentos genéricos ou similares por ocasião do registro, pós-registro e
renovação de registro, acompanhado da análise crítica, desenho do estudo e
metodologia analítica desenvolvida e validada indicativa de estabilidade, cujo Limite
de Quantificação (LQ) seja menor do que a quantidade mínima de impureza
encontrada.
A normativa acima estabelece que, junto ao processo de solicitação de
registro, o fabricante deve apresentar o resultado de identificação e quantificação de
produtos de degradação, para os estudos de estabilidade acelerada e de longa
duração, referente a 3 lotes. Nesta documentação, a empresa deve apresentar
estudos iniciais, realizados com a forma farmacêutica, submetida à condições de
estresse (Quadro 1), com o objetivo de promover 10 – 30 % de degradação. Na
ausência total de degradação do composto, após 10 dias, o fármaco é considerado
estável. Se a degradação for < 10 %, deve-se aumentar as condições de estresse.
Quadro 1 - Condições de estresse sugeridas para medicamentos genéricos ou
similares por ocasião da solicitação de registro, pós-registro ou renovação de
registro junto à ANVISA
Parâmetro
Condição
Aquecimento
60 °C
Umidade
75 % UR ou mais
Solução ácida
HCl 0,1 M
Solução básica
NaOH 0,1 M
Solução oxidativa
H2O2 3 %
Fotólica
UV-B fluorescente
Íons metálicos (opcional)
Fe2+ ou Cu2+ 0,05 M
FONTE: BRASIL, 2008.
Já a análise crítica dos resultados dos testes deve ser realizado, conforme detalhado
nos quadros 2 a 4, baseando-se na quantidade encontrada em relação à dose
34
máxima diária, se devem apenas ser notificadas, identificadas ou necessitam
também serem qualificadas.
Quadro 2 - Limites de notificação para impurezas
Dose máxima Diária
Limites
=1g
0,1 %
< 2 g/dia
0,05 %
FONTE: BRASIL (2008).
Quadro 3 - Limites de identificação para impurezas
Dose máxima Diária
Limites
<1 mg
1,0 % ou 5 µg TDI (o que for menor)
1 mg – 10 mg
0,5% ou 20 µg TDI (o que for menor)
> 10 mg – 2 g
0,2 % ou 3 mg TDI (o que for menor)
>2g
0,10 %
TDI= Ingestão Total Diária
FONTE: BRASIL (2008)
Quadro 4 - Limites de qualificação para impurezas
Dose máxima Diária
Limites
<10 mg
1,0 % ou 50 µg TDI (o que for menor)
10 mg – 100 mg
0,5 % ou 200 µg TDI (o que for menor)
> 100 mg – 2 g
0,2 % ou 3 mg TDI (o que for menor)
>2g
0,15 %
TDI= Ingestão Total Diária
FONTE: BRASIL (2008)
3.5 Técnicas analíticas para análise de impurezas orgânicas
Entre os métodos mais utilizados, cita-se a cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE), a cromatografia gasosa (CG) e a eletroforese capilar, acopladas a
diferentes detectores (COSTA, 2005).
35
Para impurezas orgânicas, deve-se comparar sempre a um padrão de
referência, porém, em muitos casos, as impurezas são desconhecidas, necessitando
de degradação forçada do ativo para pré supor os produtos possivelmente formados.
(COSTA, 2005).
Os
valores
de
impurezas
quantificadas
devem
ser
representados
numericamente. Caso sejam menores que 1%, devem ser apresentadas em duas
casas decimais, e caso sejam maiores que 1%, apresentar em uma casa decimal.
Todas as impurezas que estiverem abaixo do LQ devem ser expressas em
impurezas totais (ICH, 2006).
Um critério de aceitação para limite de impurezas deve ser estabelecido de
acordo com a segurança apresentada, que seja compatível com o processo de
fabricação e com o LQ do método analítico (ICH, 2006).
Os métodos analíticos são um meio de garantir a qualidade dos produtos
comercializados, pois com eles é possível conhecer o comportamento do fármaco
em tecidos biológicos, as concentrações atingidas deste no organismo, dosear o
fármaco na forma farmacêutica produzida, ou uma associação de fármacos no
mesmo medicamento, conhecer os seus produtos de degradação e até mesmo
avaliar os efeitos que estes podem causar no organismo (RAFFIN et al., 2007;
SILVA et al., 2006).
Muitas vezes, essas metodologias são padronizadas e estão descritas em
compêndios oficiais, como as farmacopeias, mas nem sempre são completos, ou
não se adéquam às necessidades de um laboratório farmacêutico. Por exemplo,
muitos medicamentos são comercializados na forma de associação, e, nos
compêndios o doseamento de cada fármaco é indicado isoladamente, o que não é
viável economicamente. Nestes casos, faz-se necessário o desenvolvimento de um
método analítico para dosear os fármacos em uma única análise (RAFFIN et al.,
2007; CAZEDEY et al., 2007; SILVA et al., 2006). A CLAE é uma das técnicas mais
utilizadas para o estudo de múltiplos analitos em uma mesma amostra. O uso do
detector DAD (photo diode array detector) é muito útil para comparar os perfis de
absorção no UV e para estimar a pureza espectral dos picos cromatográficos
(SNYDER; KIRKLAND; GLAJCH, 1997).
36
3.5.1 Técnica de pareamento iônico por CLAE
Dentro
do
desenvolvimento
de
metodologias
por
CLAE,
utilizando
cromatografia de fase reversa para análise de fármacos, conta-se com o auxílio de
técnicas como o pareamento iônico.
Essa técnica é bastante similar às demais técnicas de cromatografia por
CLAE, diferindo na fase móvel onde é utilizado um agente formador de par-iônico,
que contenha um contra íon em relação à substância de interesse. A técnica é mais
utilizada em análise de substâncias ionizáveis e altamente solúveis em água, as
quais terão pouca interação com a fase reversa da coluna cromatográfica
(DONATO; ZANOTTO; BERGOLD, 2004).
Apesar de ter semelhança entre as demais técnicas utilizadas, é um pouco
mais complexa devido ao equilíbrio entre o surfactante, analito e fase estacionária
ser mais lento, além da técnica ser mais sensível a mudanças como pH da fase
móvel, temperatura e concentração do surfactante (BASTOS, 2008).
O efeito do pH pode influenciar diretamente na separação da amostra.
Amostras básicas em baixo pH tendem a se ionizar mais, tendo uma retenção maior
com o surfactante da fase móvel de carga oposta. Por outro lado, em amostras
ácidas o pH mais alto propicia uma melhor separação pois encontra-se na forma
dissociadas e interagem melhor com os surfactantes catiônicos (SNYDER;
KIRKLAND; GLAJCH, 1997).
Para substâncias catiônicas normalmente utilizam-se agentes surfactantes
aniônicos, como sulfonatos de cadeias médias (hexano, heptano, octano), onde a
parte da cadeia apolar vai interagir com a cadeia C18 da sílica, e a parte aniônica vai
interagir com a parte ionizada da amostra em questão (Figura 4). Em amostras cujo
analito seja de característica aniônica pode ser utilizado, como agente formador de
par iônico, o tetrabutilamônio, tendo o mesmo principio de interação fase reversa e
par iônico (JARDIM; COLLINS; GUIMARÃES, 2006).
37
Figura 4 – Representa o processo envolvendo o agente formador de pareamento
iônico de característica aniônica e amostra ionizada catiônica em CLAE.
Fonte: JARDIM; COLLINS; GUIMARÃES, 2006.
Em amostras como ácidos e bases orgânicos, os quais são substâncias com
tendência a se ionizar, recomenda-se a utilização desta técnica. Além de poderem
ser utilizados como próprios reagentes de pareamento iônico por ter a capacidade
de interagir formando complexos com o analito (DONATO; ZANOTTO; BERGOLD,
2004).
O pareamento iônico apresenta a vantagem de separar uma mistura de
compostos devido à diferença no grau de ionização de cada um, além de possibilitar
a separação de substâncias altamente solúveis em água. Como exemplo de
compostos separados pela técnica de pareamento iônico em cromatografia de fase
reversa tem-se paracetamol, cloridrato de fenilefrina e maleato de carbinoxamina em
formulação de comprimidos, vitaminas hidrossolúveis, como pantotenato de cálcio e
nicotinamida dentre outras (BASTOS, 2008; DONG, 1988). Outro exemplo de
utilização foi a quantificação de componentes de gentamicina em medicamentos de
uso veterinário (PIETRO; CASS, 2007), e rivastigmina (RAO et al., 2005).
3.6 Validação de metodologia analítica
A validação de uma metodologia é necessária para garantir que o método é
apropriado à finalidade pretendida, ou seja, a determinação de modo qualitativo,
38
semi-quantitativo e quantitativo, tanto para fármacos isolados como para o produto
farmacêutico que o contém (BRASIL, 2003; NBR ISO 9000, 2000).
A validação se aplica a técnicas que utilizem CG e CLAE, métodos não
cromatográficos, porém de doseamento, como titulometria, espectrofotometria UV, e
ainda para testes imunológicos e microbiológicos (RIBANI et al., 2004).
Para que a validação possa garantir que o método atenda às exigências
analíticas e que apresente resultados confiáveis, ele deve apresentar especificidade,
linearidade, intervalo, precisão, sensibilidade, limite de quantificação e identificação
exatidão adequados à análise. A substância de referência deve ser oficializada pela
farmacopeia, mas na ausência, admite-se o uso de padrões internos ou padrões de
trabalho que tenham identidade e teor devidamente identificados (BRASIL, 2003;
INMETRO, 2003). Para realização de testes de validação, os equipamentos devem
todos estar calibrados e os analistas treinados.
Os testes utilizados para validação analítica são divididos em 4 categorias,
diferindo entre si por finalidade a que se destina: categoria I, testes quantitativos
para determinação do princípio ativo em produtos farmacêuticos ou matérias-primas;
categoria II, teste quantitativos ou ensaio limite para determinação de impurezas e
produtos de degradação em produtos farmacêuticos e matérias-primas; categoria III,
teste de performance (dissolução, liberação do ativo, dentre outros); categoria IV,
teste de identificação (BRASIL, 2003).
Ainda para cada categoria será exigido a realização dos parâmetros
relacionados no Quadro 5.
Quadro 5 - Ensaios necessários para a validação do método analítico, segundo sua
finalidade
Parâmetro
Categoria I
Categoria II
Categoria
Quantitativo
Ensaio limite
III
Categoria IV
Especificidade
Sim
Sim
Sim
*
Sim
Linearidade
Sim
Sim
Não
*
Não
Intervalo
Sim
Sim
*
*
Não
Repetibilidade
Sim
Sim
Não
Sim
Não
Intermediária
**
**
Não
**
Não
Limite de detecção
Não
Não
Sim
*
Não
Limite de quantificação
Não
Sim
Não
*
Não
Exatidão
Sim
Sim
*
*
Não
Precisão
39
Continuação Quadro 5
Robustez
Sim
Sim
Sim
Não
Não
Onde: * pode ser necessário dependendo a natureza do teste especificado.
** se houver confirmação da reprodutibilidade não é necessário a confirmação da
precisão intermediária (BRASIL, 2003).
3.6.1 Seletividade
O método é considerado seletivo se ele é capaz de detectar o fármaco em
presença de outras substâncias como impurezas, produtos de degradação e
excipientes (INMETRO, 2003). Esta é uma das características imprescindíveis para
métodos que sejam utilizados em estudos de estabilidade. Tais métodos devem
demonstrar serem do tipo MIE para os fármacos estudados.
No caso de testes de identificação (qualitativos), o teste deve ter a
capacidade de distinguir o fármaco de demais compostos com estruturas parecidas,
comparando o fármaco com um padrão, e os demais componentes com estrutura
relacionada, comparados aos seus padrões de substâncias relacionadas (BRUCE;
MINKKINEN; RIEKKOLA, 1998).
Em análises quantitativas como teor de impurezas, o resultado pode ser
obtido adicionando certa quantidade de impureza ao fármaco, demonstrando que
não sofre interferência nos resultados quando comparado com amostras não
contaminadas. Na ausência de tais impurezas estas comparações devem incluir
amostras armazenadas sob condições de estresse, como oxidação, luz, calor,
umidade e hidrolise ácido/base em comparação com amostras não degradadas
(BRASIL, 2003).
Outro detalhe importante é que deve garantir a pureza dos picos
cromatográficos (quando se tratarem de técnicas cromatográficas), acoplando ao
sistema um tipo de detector que seja possível identificar que o pico pertence a
apenas um composto, como o detector tipo DAD ou de espectrometria de massas
(MS). A utilização da análise de pureza do pico torna-se interessante de maneira a
demonstrar que o pico refere-se a um único composto (BRASIL, 2003).
3.6.2 Linearidade
Significa dizer que a metodologia é capaz de apresentar resultados
diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra, dentro do intervalo
40
especificado. A recomendação é que o teste seja realizado com, no mínimo, 5
concentrações diferentes do analito (ICH, 2005; BRASIL, 2003).
Após a análise, são confeccionados os gráficos de linearidade. Se houver
relação linear visual, os dados devem ser tratados com análises estatísticas, que
irão determinar o coeficiente de correlação (r), cujo valor mínimo aceitável é de 0,99,
a intersecção com eixo y, coeficiente angular, soma residual dos quadrados mínimos
da regressão linear e desvio padrão relativo. Como critério de aceitação estipulado é
um (r) de no mínimo 0,99 (INMETRO, 2003; BRASIL, 2003).
3.6.3 Intervalo
O intervalo é determinado entre os limites de identificação inferior e superior
de um método analítico. O limite inferior pode ser definido pelo limite de
quantificação, enquanto que o limite superior depende da resposta do equipamento
(INMETRO, 2003).
Geralmente o intervalo de análise estipulado é derivado do estudo de
linearidade, e estabelecido pela confirmação de que o método apresenta exatidão,
precisão e linearidade adequados quando aplicado a amostra que se apresente
dentro do intervalo especificado (BRASIL, 2003).
O Quadro 6 relaciona os limites porcentuais do teor do analito que devem
estar contidos no intervalo de linearidade para alguns métodos analíticos.
Quadro 6 - Limites porcentuais do teor do analito que devem estar contidos no
intervalo de linearidade para alguns métodos analíticos.
Ensaio
Determinação
Alcance
quantitativa
do
De 80 % a 120 % da concentração teórica do teste
analito em matérias-primas ou em
formas farmacêuticas
Determinação de impurezas
Do nível de impureza esperado até 120 % do limite máximo
especificado. Quando apresentarem importância toxicológica
ou efeitos farmacológicos inesperados, os limites de
quantificação
e
detecção
devem
ser
adequados
quantidades de impurezas a serem controladas
Uniformidade de conteúdo
De 70 % a 130 % da concentração teórica do teste
às
41
Continuação Quadro 6
Ensaio de dissolução
De ± 20 % sobre o valor especificado para o intervalo. Caso
a especificação para a dissolução envolva mais que um
tempo,
o alcance do método deve incluir –20 % sobre o menor valor
e + 20 % sobre o maior valor.
(BRASIL, 2003)
3.6.4 Precisão
É a avaliação da proximidade dos resultados com amostragens múltiplas de
uma mesma amostra. A precisão é dividida em três níveis: repetibilidade, precisão
intermediária e reprodutibilidade (INMETRO, 2003).
Repetibilidade ou precisão intra-corrida, é a concordância entre os resultados
dentro de um curto período com o mesmo analista e mesmos equipamentos. Neste
teste devem ser realizados no mínimo 9 determinações, sendo tréplica de três
concentrações diferentes (alta, média e baixa) ou no mínimo 6 determinações a
100% da concentração teste (BRASIL, 2003).
Precisão intermediária ou precisão inter-corridas, seria a concordância dos
resultados dentro do mesmo laboratório em análises realizadas por analistas, dias
e/ou equipamentos diferentes. Recomenda-se, no mínimo dois dias de análise com
analistas diferentes (BRASIL, 2003; ICH, 2005)
Já a reprodutibilidade ou precisão inter-laboratorial, refere-se resultados
relacionados com análises em laboratórios diferentes, como estudo colaborativo,
geralmente utilizados para padronização de metodologia, como inclusão em
compêndios oficiais (BRASIL, 2003; BRUCE; MINKKINEN; RIEKKOLA, 1998).
A precisão de um método analítico pode ser expressa com os dados de
desvio padrão e desvio padrão relativo (DPR) ou coeficiente de variação (CV), onde
o CV aceitável encontra-se abaixo de 5 % (BRASIL, 2003; INMETRO, 2003).
3.6.5 Limite de detecção
É a menor quantidade de analito detectada, presente na amostra, não
necessariamente quantificado. O limite de detecção (LD) é avaliado por uma solução
de concentração conhecida e decrescente até um menor nível detectável. Para
42
métodos qualitativos a detecção pode ser feita visualmente até a menor
concentração capaz de ser detectada visualmente (BRASIL, 2003; ICH, 2005).
Para métodos instrumentais como CLAE, CG, o limite de detecção pode ser
estimado pela concentração correspondente a um pico três vezes maior que o ruído
na linha de base. Outro modo seria utilizando a equação 1 (BRASIL, 2003):
LD : DP α x 3
Equação 1
IC
onde LD: limite de detecção; DP α: desvio padrão do intercepto com o eixo y ou
coeficiente linear, de no mínimo, três curvas de calibração construídas contendo
concentrações do fármaco próximas ao limite de quantificação. Ou pode ser obtido a
partir da curva de calibração proveniente da análise de um número apropriado de
amostras do branco; IC: inclinação da curva de calibração ou coeficiente angular.
3.6.6 Limite de quantificação
É a menor quantidade que pode ser determinada com precisão e exatidão
aceitáveis
para
as
condições
experimentais
estabelecidas.
É
aplicável
principalmente para detecção de impurezas, produtos de degradação de fármacos
ou produtos farmacêuticos, é expresso em concentração (p/v, p/p, ppm). Assim
como limite de detecção, é utilizada uma solução com concentrações decrescentes
ate o menor nível determinável com precisão e exatidão que produzam um pico dez
vezes maior que o ruído de linha base ou pode ser calculado pela equação 2
(BRASIL, 2003).
LQ : DP α x 10
Equação 2
IC
onde LQ: limite de detecção
3.6.7 Exatidão
É a proximidade dos valores obtidos aos valores reais. Para fármacos podese utilizar um padrão de referência, ou comparar os resultados obtidos na
metodologia que está sendo validada com resultados obtidos de uma metodologia
com a exatidão conhecida (BRUCE; MINKKINEN; RIEKKOLA, 1998; BRASIL, 2003).
43
Para forma farmacêutica, é analisada uma amostra em que uma quantidade
de fármaco é adicionada a uma mistura dos componentes do medicamento (placebo
contaminado), porém, quando nem todos os componentes do medicamento estão
disponíveis, se aceita a utilização do método de adição de padrão em quantidades
conhecidas a uma amostra de medicamento (ICH, 2005; BRASIL, 2003).
Para análise de impurezas, tem-se a adição das impurezas ou dos produtos
de degradação ao medicamento. Caso não estejam disponíveis, pode-se realizar
outro método bem caracterizado a fim de estimar a exatidão (BRASIL, 2003).
A exatidão é calculada como a porcentagem de recuperação do analito
adicionado em concentração conhecida, conforme a Equação 3 (BRASIL, 2003):
Exatidão = Concentração média experimental x 100
Equação 3
Concentração teórica
A exatidão deve ser realizada após o teste de linearidade e especificidade do
mesmo, com no mínimo nove determinações, ou seja, tréplica de três concentrações
diferentes alta, média e baixa (BRASIL, 2003).
3.6.8 Robustez
Definida como a capacidade do método resistir a pequenas e deliberadas
variações que possam ocorrer nos parâmetros analisados, o que indica a confiança
durante o uso normal (INMETRO, 2003).
Em análises utilizando métodos cromatográficos, recomenda-se que sejam
variados o pH da fase móvel, a composição ou concentração da fase móvel,
diferentes colunas ou lotes diferentes do mesmo fabricante, temperatura do forno, e
fluxo da fase móvel. No quadro abaixo estão descritos alguns dos parâmetros que
devem ser avaliados para a robustez da metodologia (BRASIL, 2003).
44
Quadro 7 - Fatores que devem ser considerados na determinação da robustez do
método analítico.
·Estabilidade
Preparo das Amostras
das
soluções
analíticas
·Tempo de extração
·Variação
Espectrofotometria
do
pH
da
solução
·Temperatura
·Diferentes fabricantes de solventes
·Variação
·Variação
Cromatografia Líquida
·Diferentes
do
na
lotes
pH
da
composição
fase
da
fase
móvel
móvel
ou
fabricantes
de
colunas
ou
fabricantes
de
colunas
·Temperatura
·Fluxo da fase móvel
·Diferentes
Cromatografia Gasosa
lotes
·Temperatura
·Velocidade do gás de arraste
(BRASIL, 2003)
3.7 Diabetes Mellitus
O Diabetes Melitus é uma patologia de fatores etiológicos múltiplos,
caracterizada principalmente por uma diminuição ou por ausência na produção de
insulina
pelas
ilhotas
pancreáticas,
podendo
ser
acompanhada
pelo
comprometimento da ação da mesma no organismo devido à diminuição da
sensibilidade dos receptores celulares (KATZUNG, 2006).
Classificada em quatro categorias: tipo 1 ou diabetes insulinodependente, tipo
2 ou diabetes não insulinodependente, tipo 3 (pacientes que contem diabetes do
tipo 1 e tipo 2 associadas) e tipo 4 ou diabetes gestacional (BEERS; BERKOW,
1999; KATZUNG, 2006).
O Diabetes tipo 1 pode ocorrer em qualquer idade. Porém, é mais comum ser
diagnosticado na infância ou adolescência e é responsável por 10 a 15 % dos casos
de diabetes e caracteriza-se por hiperglicemia, aonde o pâncreas não produz ou
produz quantidades insuficientes de insulina. Cerca de 80 % dos portadores de
diabetes tipo 1 apresentam auto-imunidade contra estas células β-pancreáticas
(MERCK SHARP & DONE, 2010; SOCIEDADE BRASILEIRA DE DIABETES, 2010).
45
No Diabetes do tipo 2, geralmente diagnosticada a partir dos 30 anos de
idade, podendo ocorrer também em crianças e adolescentes, é caracterizada por
hiperglicemia, além de resistência celular à insulina. Este tipo de diabetes
comumente está associada à obesidade, especialmente na porção abdominal do
corpo, devido à hiperinsulinemia resultante, que pode levar também à hipertensão e
doença arterial coronariana (SOCIEDADE BRASILEIRA DE DIABETES, 2010).
Em outras etiologias, como doenças não pancreática, terapias farmacológicas
que possam elevar a glicemia pode-se classificar como diabetes do tipo 3. Algumas
mulheres em sua primeira gestação podem apresentar um aumento anormal de
glicose sanguínea, denominado de diabetes gestacional, onde os hormônios
placentários produzidos criam uma resistência a insulina, que se acentua no último
trimestre da gestação (KATZUNG, 2006).
O diagnóstico de diabetes quase sempre é feito em pacientes que realizam
exames rotineiros, pois na maioria dos casos a hiperglicemia é assintomática. A
hiperglicemia, quando sintomática, pode vir acompanhada de sintomas como
glicosúria, diurese osmótica que leva a desidratação, poliúria, polidipsia e perda de
peso. Pode causar, também, visão borrada, fadiga, náusea e propensão a infecções.
Em mulheres com diabetes tipo 2 geralmente se associa com coceira devido à
candidíase vaginal (BEERS; BERKOW, 1999; SOCIEDADE BRASILEIRA DE
DIABETES, 2010).
Devido a longos períodos de hiperglicemia mal controlada, algumas
complicações podem ser observadas, como retinopatias, acompanhada de
hemorragias ou descolamento da retina; doenças macrovasculares, como
aterosclerose; deterioração cutânea e infecções; doenças vasculares periféricas
graves, que podem levar à amputação de membros, em geral inferiores, e nefropatia
evidenciada por albuminúria (MERCK SHARP & DONE, 2010).
Ainda outras complicações, como polineuropatias simétrica, distal e
predominantemente sensorial, caracterizada por adormecimento, formigamento e
parestesias nas extremidades, dores intensas, profundas e debilitantes, perda da
sensibilidade do tornozelo, que dificulta a percepção de traumas. Riscos de
infecções ficam aumentados devido à diminuição da imunidade celular causada por
hiperglicemia aguda e deficiências circulatórias, que podem acarretar em úlceras
indolores, que muitas vezes leva à amputação (BEERS; BERKOW, 1999).
46
A patologia já virou pandemia, e está em crescimento acentuado,
principalmente em países desenvolvidos, pois a qualidade de vida está alterada,
modificando a alimentação, propiciando o aparecimento da obesidade, hábitos de
vida rotineiros que causam o estresse, envelhecimento populacional e histórico de
diabetes na família (LEAL, 2010).
Esta doença silenciosa representa uma preocupação na saúde pública
mundial, tendo em vista que 35 milhões de pessoas nas Américas apresentavam
esta doença no ano de 2000, com perspectiva de triplicar esta incidência na faixa
etária de 45 – 64 anos e duplicar na faixa de 20 – 44 anos e mais de 65 anos, até
2025 (KING et al., 1998; SARTORELI; FRANCO, 2003).
Segundo a OMS (organização mundial da saúde), 220 milhões de pessoas
são portadoras da patologia no mundo, e esta é responsável por 5 % das mortes. No
Brasil, a prevalência desta em 2009 foi de 6,4 % na faixa etária de 20 – 79 anos,
afetando 258 milhões de pessoas. Estima-se que até o ano de 2030, 439 milhões de
pessoas serão portadoras da patologia (SHAW; SICREE; ZIMMET, 2009).
Nos Estados Unidos da América a prevalência de diabetes na faixa etária de
20 anos de idade foi de 1,9 milhões de pessoas em 2010, sendo que 18,8 milhões
de casos diagnosticados e 79 milhões de pacientes encontram-se na faixa de
prediabéticos (NATIONAL DIABETES FACT SHEET, 2011).
O aumento da incidência desta patologia vem associado ao aumento da
expectativa de vida, bem como ao aumento do sobrepeso e da obesidade. Esta
patologia também é responsável pelo maior número de internações devido às
complicações graves causadas e que necessitam de cuidados médicos integrais
(SARTORELI; FRANCO, 2003).
No tratamento do diabetes a terapia medicamentosa é fundamental, além de
reeducação alimentar e práticas de exercícios físicos. Como terapia medicamentosa
emprega-se, principalmente, a insulina, utilizada com o objetivo de controlar os
pulsos de glicemia após as refeições em todos os tipos de diabetes, mas
principalmente no tipo 1 ou insulinodependente (MERCK SHARP & DONE, 2010).
Além da insulina, existem classes de medicamentos hipoglicemiantes, as
quais auxiliam no aumento da secreção de insulina por estímulo direto no pâncreas,
como exemplo as sulfoniluréias (glibenclamida, tolbutamida, clorpromamida,
glimepirida, glipizida e tolazamida). Já as meglitinidas, como a repaglinida, que não
atua diretamente na hexocitose da insulina e derivados da D-fenilalanina, como
47
nateglinida que também exerce efeito sobre a secreção da insulina (BEERS;
BERKOW, 1999; KATZUNG, 2006).
Enquanto os fármacos distintos acima atuam aumentando os níveis
plasmáticos de insulina, outros aumentam a sensibilidade dos receptores celulares a
ação
da
insulina,
como
as
classes
farmacológicas
das
tiazolidinodionas
(pioglitazona, rosiglitazona), e as biguanidas cuja principal representante é a
metformina (KATZUNG, 2006).
3.7.1 Cloridrato de metformina
O cloridrato de metformina é conhecido como cloridrato de 1,1dimetilbiguanida (figura 5). Apresenta-se na forma de cristais brancos, solúveis em
água, pouco solúveis em álcool e praticamente insolúveis em acetona, cloreto de
metileno, éter e clorofórmio. É comercializado também na forma de pclorofenoxiacetato e pamoato de metformina. O teor de matéria-prima seca na forma
de cloridrato é de 98,5 a 101,0 %, com ponto de fusão na faixa de 222 ºC a 226 ºC
(FARMACOPEIA PORTUGUESA, 2006; BRITISH PHARMACOPOEIA, 2008;
O´NEIL et al., 2006; UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2008)
Figura 5 - Estrutura molecular do cloridrato de metformina
Pertencente à classe das biguanidas, a metformina tem tempo de meia vida
de 1,5 – 3 h, não exibe ligação com proteínas plasmáticas e nem é metabolizada
pelo fígado, sendo excretado na urina sob a forma inalterada. Os mecanismos de
ação propostos são vários como (a) estimulação da glicólise nos tecidos e remoção
do plasma, (b) redução da gliconeogênese hepática e renal, (c) redução da absorção
da glicose pelo trato gastrointestinal, (d) redução dos níveis plasmáticos de
glucagon, e ainda, além de hipoglicemiante, pode ser utilizado no tratamento de
ovário policístico (KATZUNG, 2006; O´NEIL et al., 2006).
O fármaco é prescrito quando a terapia com insulina é ineficaz, e sendo um
agente poupador de insulina, não aumenta o peso corporal, não provoca
48
hipoglicemia, apresentando vantagens em relação às demais classes de
hipoglicemiantes. O esquema de administração varia de 500 mg a 2,55 g ao dia,
ajustando para a menor dosagem eficaz (BEERS; BERKOW, 1999; KATZUNG,
2006).
Como efeitos colaterais apresenta: desconfortos gastrointestinais, como
anorexia, náusea, vômito, desconforto abdominal, diarréia, freqüente em 20 % dos
pacientes, que podem ser evitados se administrar junto com as refeições. Sendo
contra-indicada em pacientes com doença renal, alcoolismo, hepatopatia ou
predisposição a anorexia tecidual (BEERS; BERKOW, 1999; KATZUNG, 2006).
Este fármaco tem sido recentemente redescoberto devido à sua capacidade
de inibir significativamente o crescimento de linhagens celulares de câncer ovariano
e potencializar a quimioterapia (GOTIEB et al., 2008; RATTAN et al., 2011) e está
sendo submetido a testes clínicos de Fase II combinado com quimioterapia em
câncer de pâncreas (UNIVERSITY OF AMSTERDAM, 2011).
Na maioria dos fármacos, em condições inadequadas de armazenamento,
pode ocorrer a degradação e, consequentemente, a formação de impurezas. No
caso do cloridrato de metformina (Figura 5), as impurezas (Figura 6) são
cianoguanidina (A), 4,6-diamino-1,3,5-triazino-2-il)guanidina (B), N,N-dimetil-1,3,5triazino-2,4,6-triamina
(C),
1,3,5-triazino-2,4,6-triamino
ou
melamina
(D),
1-
metilbiguanida (E) e N-metilmetenamida (FARMACOPEIA PORTUGUESA, 2006;
BRITISH PHARMACOPOEIA, 2008).
A cianoguanidina (A) também chamada diciandiamida, é um dímero de
cianamida e um intermediário da síntese do cloridrato de metformina e da melamina
(D), a qual é um trímero da cianoguanidina (ALI et al., 2008).
49
NH2
N
NH2
N
N
H2N
NH
H2N
CN
N
NH
H2N
HN
NH
(A)
N
N
N
CH3
CH3
NH2
(B)
(C)
NH2
N
H2N
N
N
NH
NH2
H2N
(D)
NH
NH
NH
CH3
(E)
Figura 6 - Estrutura molecular das impurezas especificadas do cloridrato de
metformina
O limite máximo permitido para a impureza especificada (A) é de 0,01 %. Para
as demais substâncias relacionadas detectáveis o limite permitido é de 0,02 %, ou
no máximo a área do pico obtido no cromatograma da solução padrão melamina (D).
Quanto a metais pesados, é permitido no máximo 10 ppm ou 0,001 %, a perda por
dessecação deve ser de, no máximo, 0,5 % e as cinzas sulfatadas de no máximo 0,1
% (FARMACOPEIA PORTUGUESA, 2006; BRITISH PHARMACOPOEIA, 2008;
UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2008).
Quanto às formas farmacêuticas, o cloridrato de metformina está disponível
na forma de comprimido, nas dosagens de 500 mg, 850 mg e 1000 mg . O
medicamento de referência é o Glifage®. Além deste, o laboratório Merck
comercializa o Glifage XR® (comprimidos de ação prolongada) (CAETANO, 2008).
Até 2011 havia 64 especialidades farmacêuticas comercializadas no Brasil com as
doses acima citadas do referido fármaco (ANVISA, 2011).
3.7.2 Métodos por CLAE para análise do cloridrato de metformina
A maior parte dos estudos com metformina envolve análise do fármaco em
amostras biológicas. Um dos métodos desenvolvidos com objetivos de fazer o
doseamento plasmático dos níveis de metformina foi descrito por Vesterqvist,
50
Nabbie e Swanson (1998). A amostra de plasma contendo cloridrato de metformina
foi injetada no sistema cromatográfico (CLAE) utilizando uma coluna de troca iônica
preparativa e fase móvel fosfato de amônio 0,05 M. Posteriormente, outra coluna de
troca iônica analítica com fase móvel de fosfato de amônio 0,4 M foi empregada e a
metformina eluiu em 5 min. Após a validação da metodologia, os autores concluíram
que o método é robusto, rápido e sensível para doseamento de metformina em
plasma sanguíneo.
Outro método foi desenvolvido por Porta et al. (2008), para análise do
fármaco em plasma e objetivava a aplicação em ensaios de farmacocinética e
bioequivalência. Foi empregada coluna MetaSil com grupos fenil ligados; fase móvel
composta de tampão fosfato 0,02 M pH 7,0 com acetonitrila (50:50 v/v) em fluxo de
1mL/min; temperatura do forno de 40 ºC e detecção em 236 nm. O método foi
validadeo e os autores argumentam sobre sua aplicação em ensaios de
bioequivalência, avaliação biológica e estudos de farmacocinética.
Ainda com objetivo de doseamento do cloridrato de metformina em plasma
humano, foi utilizado como fase estacionária uma coluna de sílica C18 end capped
(Inertsil ODS-2, 250 x 4,6 mm, 5 µm) e fase móvel constituída de metanol:água
(65:35 v/v), com fluxo de 1mL/min, na temperatura ambiente. Como resultado a
metformina teve tempo de retenção de 15 minutos. A metodologia apresentou
precisão e exatidão para dosagem plasmática de metformina (TACHE et al., 2001).
Zarghi et al. (2003) utilizaram uma coluna µBondapak C18 (150 x 4,6 mm, 4
µm), fase móvel composta de acetonitrila: tampão dodecil sulfato de sódio 0,01 M e
fosfato dihidrogenado 0,01 M (pH 5,1) 40:60 (v/v), com detecção em 235 nm. Os
autores argumentaram que o método apresentou boa sensibilidade, seletividade e
precisão, podendo ser utilizado para estudos de farmacocinética utilizando o
cloridrato de metformina. Este método apresenta a desvantagem do fármaco eluir
em 3,4 min, muito próximo ao volume morto, dificultando a separação das impurezas
que eluam previamente ao fármaco.
Existem ainda metodologias desenvolvidas para doseamento simultâneo do
cloridrato de metformina e outros fármacos, como descrito por Georgita et al. (2007),
onde há a eluição do cloridrato de metformina e glibenclamida na mesma amostra
(plasma). Utilizando coluna Zorbax® CN (150 x 4,6 mm, 5 µm), com pré-coluna
Phenomenex® C18 (2 x 4 mm), fase móvel contendo 50 % de solução de acetato de
amônio 0,01 M, pH ajustado para 3,5 com ácido acético e 50 % de acetonitrila,
51
volume de injeção de 50 µL, fluxo de 1 mL/min e temperatura do forno de 25 ºC, e
como detector do tipo espectrômetro de massas. As amostras foram contaminadas
com dois produtos de degradação, um de cada fármaco e submetidas à análise. Os
autores concluíram que a metodologia foi validada e que poderia ser utilizada em
estudos de bioequivalência de amostras que contivessem mistura de metformina e
glibenclamida.
Nos compêndios oficiais, o método preconizado para o doseamento da
matéria-prima de cloridrato de metformina é a titulação. A metodologia por CLAE é
indicada apenas para ensaios de substâncias relacionadas, ou seja, análise das
substâncias provenientes do processo de degradação do fármaco, as quais são
consideradas
impurezas
(FARMACOPEIA
PORTUGUESA,
2006;
BRITISH
PHARMACOPOEIA, 2008).
Nas Farmacopeias Portuguesa, Britânica e Americana, para a matéria-prima
de cloridrato de metfomina, no item relativo à quantificação das substâncias
relacionadas recomenda-se o emprego de uma solução padrão do cloridrato de
metformina (5 mg/mL), solução padrão do cloridrato de metformina diluída (5 µg/mL),
uma solução da impureza (cianoguanidina-A) na concentração de 1 µg/mL e uma
solução de resolução (mistura de metformina e melamina) nas concentrações de 5
µg/mL e 2 µg/mL, respectivamente. O tempo de corrida deve ser duas vezes o
tempo de retenção do cloridrato de metformina (FARMACOPEIA PORTUGUESA,
2006; BRITISH PHARMACOPOEIA, 2008; UNITED STATES PHARMACOPEIA,
2008).
Como fase estacionária, as farmacopeias recomendam utilizar sílica gel
porosa ligada quimicamente à grupo ácido benzenossulfônico (0,25 m x 4,6 mm, 5
µm). Para a impureza cianoguanidina padroniza-se como fase móvel uma solução
de dihidrogenofosfato de amônio (17 g/L), com pH ajustado para 3,0 com ácido
fosfórico, fluxo de 1 mL/min e volume de injeção de 20 µL (FARMACOPEIA
PORTUGUESA, 2006; BRITISH PHARMACOPOEIA, 2008)
A Farmacopeia Americana recomenda como fase estacionária, sílica porosa
ligada a grupos de troca iônica, ácidos fortes (0,25 m x 4,6 mm, 10 µm), denominada
L9. A fase móvel é a mesma da farmacopeia britânica, o fluxo pode ser variável de
1,0 a 1,7 mL/min e o volume de injeção de 20 µL (UNITED STATES
PHARMACOPEIA, 2008).
52
Para análise de teor do cloridrato de metformina em comprimidos, o método
preconizado é a técnica de espectrofotometria no UV (BRITISH PHARMACOPOEIA,
2008; UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2008).
Nos ensaios de substância relacionada, nos comprimidos, procede-se da
mesma forma que para a matéria-prima, segundo a Farmacopeia Americana
(UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2008). A farmacopeia britânica (BRITISH
PHARMACOPEIA,
2008)
no
ensaio
de
substâncias
relacionadas,
mais
especificamente para presença de cianoguanidina (A), a solução é preparada com
os comprimidos do cloridrato de metformina (5 mg/mL) e uma solução com padrão
de cianoguanidina (1 µg/mL), comparando-se os cromatogramas das duas soluções.
A área de qualquer impureza com tempo de retenção diferente da cianoguanidina
não deve ser maior que o pico correspondente à cianoguanidina (0,02 %) (BRITISH
PHARMACOPEIA, 2008).
Neste caso específico de pesquisa de cianoguanidina em comprimidos,
utiliza-se outro sistema de eluente, e a coluna cromatográfica recomentada possui
outras dimensões. O sistema eluente emprega solução de ortofosfato de amônio
dihidrogenado 1,7 %, com pH ajustado para 3,0 com ácido ortofosfórico, fluxo de 1
mL/min, utilizando como fase estacionária a sílica gel porosa com grupos
benzenosulfônico ligados, porém, com 12,5 cm de comprimento por 4,6 mm de
espessura
e
partículas
de
5
µm
(Partisphere
5
µm
SCX)
(BRITISH
PHARMACOPEIA, 2008).
Recentemente foi publicado o resultado de um desenvolvimento e validação
de método de quantificação do cloridrato de metformina, utilizando testes de
degradação forçada. Porém, as condições de degradação aplicada à matéria-prima
não foram especificadas, sendo apenas citada a realização de estresse químico com
ácido, base, agente oxidante, e estresse físico com luz e calor, sem detalhar o
tempo de contato, a temperatura, as concentrações dos agentes degradantes e a
metodologia utilizada (SAKALGAONKAR; MIRGANE; ARBAD, 2008).
As condições cromatográficas aplicadas no referido estudo foram fase
estacionária Inertisil ODS 3V (250 mm x 4,6 mm, 5 µm), fase móvel composta de
uma mistura de acetonitrila e tampão (25 mM de fosfato de potássio dibásico 7:93 e
5 mM de hexano sulfônico sal sódico) 7:93, pH ajustado para 3,0 com ácido
fosfórico, fluxo de 1 mL/min, volume de injeção 20 µL, e comprimento de onda 218
nm. As amostras do padrão cloridrato de metformina e as amostras do cloridrato de
53
metformina submetidas ao processo de degradação forçado foram diluídas até uma
concentração de 25 ppm. Os autores não observaram nenhum produto de
degradação formado nas condições utilizadas, com contradições nas análises da
linearidade do método (SAKALGAONKAR; MIRGANE; ARBAD, 2008).
O trabalho citado contradiz as monografias farmacopeicas, pois algumas das
estruturas dos possíveis produtos de degradação e impurezas deste fármaco já são
conhecidas e elucidadas, e podem ser geradas por processo de degradação ou até
mesmo ser resíduos da síntese em laboratório, como a diciandiamida, a qual é a
substância de partida na síntese da metformina (BRITISH PHARMACOPOEIA, 2008;
SHALMASHI, 2008).
Ali e colaboradores (2008) desenvolveram e validaram um MIE seletivo para o
cloridrato de metformina, cianoguanidina e melamina, além dos produtos de
degradação gerados em diferentes condições de degradação, empregando
cromatografia líquida de interação hidrofílica (HILIC) em CLAE. O método baseou-se
na interação hidrofílica dos analitos com a sílica da fase estacionária.
Riwari (2009) validou um método MIE por CLAE em fase reversa,
empregando como fase móvel tampão fosfato e metanol (21:79 v/v), porém somente
demonstrou a separação do cloridrato de metformina da impureza cianoguanidina,
sem a realização de testes de degradação forçada.
Bhamare et al. (2011) demonstraram a validação de um Método MIE por
CLAE-UV para a associação do cloridrato de metformina e fenofibrato, usando uma
coluna de fase reversa (Inertsil® ODS). Neste método, como a fase móvel continha
apenas água acidificada e acetonitrila, o cloridrato de metformina eluiu muito
próximo ao volume morto. Os autores aplicaram condições de degradação a fim de
demonstrar a seletividade do método, na presença dos dois fármacos. Porém, não
demonstraram a eluição das impurezas especificadas pelas farmacopéias, que
provavelmente eluiriam antes do cloridrato de metformina, devido à polaridade
elevada destas substâncias.
Os métodos discutidos acima para o doseamento do cloridrato de metformina
na literatura estão resumidos no Quadro 8 abaixo:
54
Quadro 8 - Métodos analíticos para o doseamento da metformina por CLAE
Fase móvel
Fosfato de amônio 0,4 M
Acetonitrila:dodecil sulfato de
sódio 0,01 M e fosfato de
sódio dihidrogenado 0,01
M,pH 5,1, (40:60 v/v)
Água:metanol (65:35 v/v)
Tampão fosfato 0,02 M:
acetonitrila pH 7,0 (50:50 v/v)
acetato de amônio 0,01 M,
pH 3,5 com ácido acético:
acetonitrila (50:50 v/v)
Fosfato de amônio 17 g/L pH
3,0 com ac. fosfórico
(ensaio para substâncias
relacionadas)
Acetonitrila: tampão (25 mM
de fosfato de potássio
dibásico e 5 mM de sal
sódico de ácido sulfônico
hexano) pH 3,0 com ácido
Fosfórico (7:93 v/v)
Fosfato de amônio a 17 g/L
pH 3,0 com ac. Fosfórico
(ensaio para substâncias
relacionadas)
ortofosfato diidrogenado de
amônio 1,7 % pH 3.0
(teor de cianoguanidina em
comprimidos)
Fosfato
de
amônio
monobásico pH 3,0
Fosfato
de
sódio
hidrogenado 25 mM pH 3,0:
acetonitrila (84:16 v/v)
Fosfato
de
amônio
diidrogenado 0,01 mM pH 5.0
Acetonitrila: água em pH 3
com ác. Ortofosfórico (70:30
v/v)
Tipo de coluna
Temp.
(°C)
Nc
Sistema de
detecção (nm)
UV/232
Referência
Nc
UV/235
2
C18 endcapped Inertsil
ODS-2 (250 x 4,6mm)
MetaSil-fenil (150 x 4,6mm)
T.A.
UV/280
3
40
UV/236
4
Zorbax CN (150 x 4,6 mm, 5
µm), com pré-coluna
Phenomenex C18 (2 x 4
mm)
Gel de Sílica poroso de
forma irregular com grupos
benzenosulfônicos (5
micrometros) 4,6 x 250 mm
25
Espectrometria
de massas
5
Nc
UV/218
6
Sílica C18 endcapped
Inertsil ODS-3V (250 x 4,6
mm)
25
UV/218
7
Gel de Sílica poroso de
forma irregular com grupos
benzenosulfônicos (10 µm)
4,6 x 250 mm ou (5 µm) 4,6
x 125 mm
Gel de Sílica poroso de
forma irregular com grupos
benzenosulfônicos 12,5 cm
x 4 mm (Partisphere 5 µm
SCX)
Spherisorb SCX L9 4,6 x
250 mm (revestida com
ácidos fortes trocadores de
cátions)
Coluna HILIC – Si 250 x 4,6
mm Waters, 5 µm
Nc
UV/218
8
Nc
UV/218
8
Nc
UV/218
9
T. A.
UV/ 218
10
T. A.
UV/232
11
30°C
UV/250
12
Coluna de extração tipo
troca-iônica (7,5 x 4,6 mm),
com uma válvula de troca e
coluna analítica de troca
iônica (250 x 4,6 mm).
C18 150 x 4.6 mm
µbondapak
Nova-pack silica 4 µm, 150
x 3,9 mm
Inertsil® ODS
1
Nc: não consta; T.A.: Temperatura Ambiente; 1) Vesterqvist; Nabbie; Swanson (1998); 2)
Zarghi et al. (2003);3) Tache et al. (2001); 4) Porta et al. (2008); 5) Georgita et al. (2007); 6)
Farmacopeia Portuguêsa (2005); 7) Sakalgaonkar; Mirgane; Arbad (2008); 8) British
Pharmacopeia (2008); 9) United States Pharmacopeia (2008); 10) Ali et al. (2008); 11)
Riwani (2009); 12) Bhamare et al. (2011).
55
Apesar do grande número de metodologias desenvolvidas para o fármaco em
questão, poucas podem ser consideradas MIE. Entre aquelas que cumprem este
requisito, há o emprego de colunas especiais, como é o caso dos métodos
farmacopeicos e o uso da HILIC. Nos métodos que empregaram colunas mais
comuns, de fase reversa, não há uma clara demonstração da separação de mais de
um produto de degradação do fármaco. Tampouco há informação sobre a influência
de diferentes fabricantes e excipientes no perfil de degradação do cloridrato de
metformina, e dados de qualificação quanto à citotoxicidade dos produtos
degradados.
56
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Materiais
• Acetato de etila PA, marca Isofar
• Acetonitrila grau HPLC, marca J. T. Baker
• Ácido acético PA, marca Nuclear
• Ácido ortofosfórico, marca Merck
• Água ultrapura grau HPLC
• Anfotericina B, marca Fungizona, GIBCO
• Brometo de etídio, marca Sigma Aldrich
• Clorofórmio PA, marca Vetec
• Cloridrato de metformina SQR; 98,2 % teor (procedência China, Lote
20051129)
• Diacetato de fluoresceína, marca Sigma Aldrich
• Diciandiamida PA, marca Sigma Aldrich
• Diclorometano PA, marca Isofar
• Dimetilsulfóxido PA, marca nuclear
• Dodecilsulfato de sódio marca Tedia
• Fosfato de potássio, marca Synth
• Fosfato de potássio monobásico, marca Synth
• Fosfato de sódio dibásico, marca Synth
• Fosfato de sódio monobásico, marca Synth
• Glifage® 500 mg, laboratório merck , lote BR18409
• Glucoformin® 500mg, laboratório Novo Nordisk , lote LVM70304
• H2O2 PA, marca Isofar
• HCl PA ,marca Biotec
• Heptanossulfonato de sódio ,marca Vetec
• Hexano Grau HPLC, marca Isofar
• L-glutamina
• Melamina PA, marca Sigma Aldrich
• Metanol Grau HPLC, marca J. T. Baker
• Metanol PA, marca Vetec
57
• MTT PA, marca Sigma
• NaOH PA, marca Isofar
• Octanossulfonato de sódio PA, marca Vetec
• Placas cromatográficas de sílica gel 60 F254, marca Merck®
• Placa cromatográficas de sílica gel (2 mm x 20 cm), marca Merck®
• Permanganato de potássio PA, marca Dinamica
• Pool de antibióticos (Neomicina, Estreptomicina e penicilina,) marca GIBCO
• Sílica gel em pó (0,04 – 0,06 mm), marca Merck®
• Soro fetal bovino, marca GIBCO
4.2 Equipamentos
• Balança analítica Mettler Toledo modelo AG 204
• Balança Micro analítica Shimadzu modelo AVW2220D
• Banho de ultrassom cleaner
• Bomba vácuo Marconi modelo 2107V6200TFEZI
• Capela de fluxo laminar Pachane, modelo 400
• Câmara de UV Dist modelo DVIRUV
• Cromatógrafo (Shimadzu modelo LC-10AD LC system) consistindo de uma
bomba binária (LC10AD) e um detector tipo DAD - photo diode array
Shimadzu (SPD-M10A), com injetor automático (SIL-10A) e software Class
VP (version 5.33)
• Cromatógrafo (Waters modelo 600 pump) com detector tipo DAD (2996),
injetor automático (717 plus) e um degaseificador in line (degasser AF) e
software Millennium Empower
• Cromatógrafo (Shimadzu, modelo GCMS-QP2010S) tipo GC-MS com
Detector de Massas (QP-2010, composto por: Analisador de Íons tipo
Quadrupólo com pré-quadrupólo em aço inox), Fonte de Ionização tipo
Impacto de elétrons (EI);com Software GCMSsolution, versão 2.53SU1; Auto
injetor AOC-20i para GCMS-QP2010S e Detector de Ionização de Chama
(FID), modelo FID-2010.
• Câmara de UV Dist Modelo DVIRUV 300
58
• Estufa de CO2 Ultrasafe Biosystem modelo FTF 212UV
• Espectrômetro supercondutor de RMN Multinuclear com Transformada de
Fourier modelo AC300F MHz para observar 1H/13C equipado com imã
supercondutor BC 47/50, marca Bruker
• Leitor de microplaca ASYS modelo Expert plus UV
•
Liofilizador (Thermo Savant, VLP 200) com bomba de vácuo (Thermo Savant,
VPOF 110)
• Microscópio de fluorescência invertida olympus modelo CKX 41
• pHgâmetro Digimed modelo DM 20
• Rotaevaporador Tecnal TE- 211
• Ulrapurificador Easy Pure LE, modelo D 738
4.3 Doseamento do cloridrato de metformina nas especialidades farmacêuticas
Inicialmente foi realizado o doseamento de três especialidades farmacêuticas
contendo cloridrato de metformina: o medicamento referência, Glifage® 500 mg cujo
fabricante é o laboratório Merck Sharp & Done, o genérico, do laboratório Medley e o
similar Glucoformin®, do laboratório Novo Nordisk, utilizando método por CLAE
previamente desenvolvido e validado pelo UNIVALI-LAPAM (Laboratório de
Produção e Análise de Medicamentos). O referido método foi adaptado da
Farmacopeia Britânica (BRITISH PHARMACOPEIA, 2008), a qual não utiliza
solvente orgânico na fase móvel (Quadro 8). Este método (LAPAM) consiste no uso
de uma coluna especial de fase ligada (SCX C18 com grupo benzenossulfônico
ligados). A coluna empregada foi do modelo Luna® (Phenomenex) com diâmetro de
4,6 mm e comprimento de 100 mm e tamanho de partícula 5 µm. Como fase móvel
foi utilizada uma solução tampão fosfato de potássio monobásico 150 mM e metanol
95:5 (v/v), pH 3,0 acidificado com ácido fosfórico, fluxo de 1 mL/min, temperatura do
forno de 30 ºC, volume de injeção de 20 µl e detecção em 218 nm.
O
método
utilizado foi empregado
tanto
para
o
doseamento
das
especialidades farmacêuticas quanto para selecionar as condições de estresse do
fármaco cloridrato de metformina, para posterior degradação das especialidades
farmacêuticas. Na validação deste método por CLAE, pelo UNIVALI-LAPAM
59
(comunicação pessoal baseada no relatório de validação analítica RVA 08), foi
previamente determinada a linearidade na faixa de 20 – 200 µg/mL (r2 de 0,9996),
sua exatidão (% de recuperação nos níveis de 80, 100 e 120 µg/mL) com
recuperação média de 101,5 % (CV de 1,30 %), precisão (CV da repetibilidade 0,93
% e da precisão intermediaria de 0,66 %), e robustez quanto à variação de ± 10 %
no fluxo da fase móvel e na temperatura (CV máximo de 0,37 %), sendo
considerado validado de acordo com as normas oficiais (BRASIL, 2003). Porém a
seletividade deste método não havia sido determinada, afim de verificar se o método
é tipo MIE.
No doseamento dos comprimidos, a solução amostra foi preparada pesandose 20 comprimidos, triturando e pesando o equivalente a 100 mg de cloridrato de
metformina em um balão volumétrico de 100 mL. A solução foi sonicada por 5 min,
com 50 mL de água purificada, completando o volume com o mesmo solvente . Após
a solução foi filtrada com papel filtro tarja preta, descartando os 20 mL iniciais.
Foram transferidos 5 mL e diluídos para balão de 50 mL com água purificada,
obtendo concentração teórica final de 100 µg/mL. As amostras foram preparadas em
triplicata e cada triplicata foi injetada em duplicata, totalizando 6 análises.
A solução padrão (SP) foi preparada pesando-se o equivalente a 100 mg de
cloridrato de metformina SQR (Substância Química de Referência), em um balão
volumétrico de 100 mL. A solução foi sonicada por 5 min, com 50 mL de água
purificada, completando o volume com o mesmo solvente e após, filtrada com papel
filtro qualitativo, descartando os 20 mL iniciais. 5 mL foi transferido e diluídos para
balão de 50 mL com água purificada, obtendo concentração final de 100 µg/mL.
Como solução de resolução foi utilizado 1 mL da solução de melamina 100 µg/mL
com 5 mL da SP em balão de 50 mL, completando o volume com água purificada.
Após filtração, em filtro de membrana de celulose regenerada com diâmetro
de poro de 0,45 µm, 20 µL das soluções padrão (quintuplicata), amostra e solução
de resolução foram injetadas no cromatógrafo com auxílio de injetor automático. O
cálculo de doseamento dos comprimidos foi realizado utilizando a equação 4:
% = Aa x Mp x Pot x Mc
Xap x Ma x 25
Equação 4
60
Onde: Aa: Área do pico principal (média duplicata) obtido no cromatograma da
Solução Amostra; Mp: Massa do padrão (mg); Pot: Potência (teor) do padrão (%);
Mc: Massa da amostra (mg) correspondente a 100mg de metformina cloridrato; Xap:
média das áreas pico principal obtido solução amostra; Ma: Massa da amostra (mg).
4.4 Estabelecimento das condições de degradação do cloridrato de
metformina
Inicialmente o fármaco foi submetido a teste de degradação forçado nas
condições ácida, básica, neutra, oxidante e fotolítica, a fim de se obter 10 – 30 % de
degradação (BRASIL, 2008). Posteriormente foi analisada por CLAE pelo método
previamente validado pelo UNIVALI-LAPAM, descrito no item 4.3, Os parâmetros
avaliados foram:
percentual de degradação do fármaco, aparecimento de picos
suplementares (com absorção na faixa do UV) e resolução em relação ao fármaco.
Após serem estabelecidas as condições de degradação para o fármaco
isolado, de forma a visualizar o aparecimento de picos suplementares nos
cromatogramas com detecção em 218 nm ou 232 nm, o protocolo selecionado foi
repetido com as três formulações comerciais do cloridrato de metformina 500 mg
(Glifage®, Glucoformin® e Genérico Medley). Neste caso empregou-se uma
quantidade de pó equivalente a 12,5 mg de cloridrato de metformina em balão
volumétrico de 25 mL (concentração teórica de 500 µg/mL).
4.4.1 Hidrólise ácida
Uma solução do fármaco na concentração final de 500 µg/mL foi preparada
com HCl 1 M (volume final 25 mL) e submetida à refluxo por 1, 2, 3, 4, 6 e 14 h. A
condição de 6 h sob refluxo foi repetida com as três formulações comerciais.
4.4.2 Hidrólise básica
Uma solução do fármaco na concentração final de 500 µg/mL foi preparada
com solução de NaOH 1 M, 0,1 M e 0,01 M (volume final 25 mL) e deixada em
refluxo por 30 min (para as três concentrações), 1, 2, 4 h (para 1 M). Foi testado,
também, o solvente NaOH 0,1 M sob agitação em temperatura ambiente (T.A.), por
61
24 e 48 h. A condição de NaOH 0,1 M sob agitação em T. A., por 24 h, foi repetida
com as formulações comerciais.
4.4.3 Hidrólise Neutra
Uma solução do fármaco de concentração final de 500 µg/mL foi preparada
com água ultrapura, mantida sob refluxo por 1, 2, 4, 14, 24, 36 e 39 h. A condição de
39 h foi repetida com as formulações comerciais.
4.4.4 Degradação oxidativa
Foram testados dois agentes oxidantes. Uma solução de concentração de
500 µg/mL do fármaco foi preparada com uma solução de peróxido de hidrogênio
(H2O2) 3 %, mesma concentração de fármaco, sob refluxo, nos tempos de 6, 12 e 24
h. Como não houve degradação significativa foram preparadas amostra com H2O2
10 % e 32 % (500 µg/mL do fármaco), deixados agitando à temperatura ambiente
por 24 e 48h.
A condição de H2O2 32 % por 48 h sob agitação a temperatura ambiente foi
repetida com as formulações comerciais.
4.4.5 Fotólise
Neste teste foram testadas duas condições. Primeiramente o pó foi colocado
em um vidro relógio e deixado em exposição à luz ambiente por 24 h. Na segunda
condição uma solução aquosa do fármaco na concentração de 500 µg/mL em água,
foi colocada em placas de Petri (volume final 25 mL) e deixado em exposição sob
uma lâmpada UV em comprimento de onda 254 nm por 3,5 h, sendo esta última
condição repetida com as formulações comerciais.
Para monitorar as condições de degradação, após os testes, as soluções
foram diluídas até uma concentração teórica de 25 µg/mL com água e analisadas
por CLAE, utilizando uma solução aquosa de cloridrato de metformina (padrão
secundário) a 25 µg/mL recentemente preparada. Como referência para a estimativa
do percentual de degradação. Foi analisada também a resolução dos picos
suplementares que surgiram nos cromatogramas em relação ao pico do analito.
62
4.5 Caracterização dos produtos de degradação
Embora não fosse um objetivo deste projeto, foram realizadas algumas
tentativas de isolamento e caracterização dos produtos de degradação, empregando
Cromatografia em camada delgada (CCD), Cromatografia em camada preparativa
(CCP), Cromatografia em coluna tipo Flash e análise por RMN H1 e CG-MS.
As amostras degradadas nas condições selecionadas foram primeiramente
secas utilizando fluxo de nitrogênio comprimido com as soluções mergulhadas em
tubos de ensaio com tampa de rosca em banho maria a 60 ºC, sendo redissolvidas
em metanol antes da aplicação nas cromatoplacas. Posteriormente foi testada a
secagem em liofilizador e em roetaevaporador (aquecidas a uma temperatura de 85
ºC, sob vácuo).
4.5.1 Cromatografia em camada delgada
Para as análise em CCD foram empregadas placas cromatográficas de sílica
gel 60 F254 (Merck®). Foram testadas as seguintes fases móveis: MeOH:CH3Cl
(50:50) – (60:40) – (40:60) – (45:55) – (80:20), MeOH:Hex:Ác. Acético (2:1:1gota),
Acetato de etila:Acetona:MeOH:H2O (25:8:3:1), Butanol:Ác Acético: H2O (4:1:5),
MeOH:Ác. Acético (97:3) - (70:30) - (93:7) – (50:50), H2O:MeOH:(NH4)2SO4
(2:1:0,5% p/v), Hex:Act Etila (7:1), Act etila:Ác. Acético (80:20) – (90:10), , MeOH:Ác.
Acético: H2O (1:1:1), MeOH:NH4OH 10% e 20%, CH3Cl:Ác. Acético: H2O
(50:42,5:7,5%) – (50:42,5:7,5%) – (65:35:4), Butanol:Acetona: H2O (6:3:1), Act.
Etila:Acetona: MeOH: H2O (25:8:3:1), CH3Cl:MeOH:Ác. Acético (20:80:4 gotas) –
(60,75:32,71:6,54) – (65,42:28,04:6,54) – (62,5:31,25:6,25) – (53,84:36,88:5,73) –
(48,78:42,58:8,54) – (59,83:34,19:5,98) – (70:30:3 gotas) – (70:30:5 gotas) (63,63:31,80:5,45)
–
(64,81:32,40:2,77),
Act
etila:Ác.
Acético
(80:20),
Act
etila:Acetona (10:90), Act Etila: Acetona: Ác acético (60:32:8), Diclorometano:MeOH
(50:50) – (60:40) – (40:60).
Como solução reveladora foi utilizada ninhidrina 5 %, em metanol 50 % (em
água, borrifando na placa e revelando com aquecimento à 110 ºC.
63
4.5.2 Cromatografia em camada delgada preparativa
Prosseguiu-se com a análise da amostra submetida à degradação ácida,
empregando o método em CCP, utilizando placa de sílica gel (2 mm x 20 cm), e
como fase móvel uma mistura de Diclorometano:MeOH (50:50).
4.5.3 Ressonância magnética nuclear
Uma das bandas obtidas na CCP (número 6), aparentemente pura, foi
analisada por RMN H1. A banda 5 que continha dois compostos co-eluindo foi
submetida a uma posterior cromatografia em coluna, com fase estacionária sílica gel
(0,04 – 0,06 mm), em seringa de 20 mL, e como fase móvel utilizou-se 40 mL dos
seguintes sistema de solventes, CH3Cl 100 %, CH3Cl:MeOH 50:50 e MeOH 100%.
As subfrações obtidas foram recromatografadas em CCD, e a sub-banda 3 oriunda
da banda 5 anterior também foi analisada por RMN H1, em metanol deuterado.
4.5.4 Coluna Flash
Em paralelo foi preparada uma coluna tipo Flash com a amostra degradada
na condição de degradação ácida. Para esta coluna foi utilizada sílica gel em pó
(0,04 – 0,06 mm) a qual foi empacotada com CH3Cl e eluída com um sistema de
solvente CH3Cl:MeOH 50:50, auxiliado por um sistema de pressão positiva acoplado
ao sistema cromatográfico fechado. As frações obtidas foram monitoras por CCD e
eluidas no mesmo sistema solvente.
4.5.5 Espectroscopia de massas
Todas as condições de degradação (ácida, básica, neutra, oxidante e fotólise)
em solução de 25 µg/mL foram submetidas à injeção direta no GC-MS QP 2010S,
utilizando o sistema de injeção direta na fonte de íons a 30 ºC, aquecida a 40 ºC/min
até 70 ºC, permanecendo por 2 min e em seguida, aquecida 70 ºC/min até 350 ºC,
permanecendo por 10 min nesta condição (tempo de análise 10 min) na tentativa de
elucidar as estruturas dos compostos gerados pela degradação. Porém, devido à
impossibilidade de análise de tantos compostos em mistura (dados não mostrados),
foi realizada outra CCP nas mesmas condições acima citadas, utilizando a amostra
degradada em condição ácida, para posterior análise por GC-MS.
64
4.6 Desenvolvimento de método alternativo para análise dos produtos de
degradação por CLAE
Na tentativa de buscar um método alternativo, indicador de estabilidade (MIE)
para o cloridrato de metformina, adequado às necessidades e que fosse acessível
aos laboratórios analíticos, foram testadas outras condições, empregando colunas
de fase reversa, com diferentes fases móveis.
As colunas cromatográficas, fases móveis e demais condições testadas estão
descritas no Quadro 9.
Quadro 9 – Condições cromatográficas testadas durante desenvolvimento da
metodologia de análise do cloridrato de metformina e seus produtos de degradação.
Condição
Coluna
Cromatográfica
Fase móvel
Fluxo
pH
1
sílica ODS C18
(Luna®,
Phenomenex) 250
x 4,6 mm, 5 µm
Dodecil sulfato de sódio 1 mM e
fosfato de sódio monobásico 10 mM,
e metanol (40:60 - 45:55 - 60:40 75:25 - 80:20 v/v)
0,8; 0,6
e 0,5
5,5
2
sílica ODS C18
(Luna®,
Phenomenex) 250
x 4,6 mm, 5 µm
Fosfato de sódio monobásico e
dibásico 25 mM 50 ppm de ácido
octanossulfônico: metanol (70:30 80:20 - 95:05 - 98:02 v/v)
0,8; 0,6
e
7,5
3
sílica ODS C18
(Luna®,
Phenomenex) 250
x 4,6 mm, 5 µm
Fosfato de sódio monobásico e
dibásico 25 mM 100 ppm de ácido
octanossulfônico: metanol (95:05 v/v)
0,5
5,5
4
sílica ODS C18
(Luna®,
Phenomenex) 250
x 4,6 mm, 5 µm
Fosfato de sódio monobásico e
dibásico 25 mM 100 ppm de ácido
octanossulfônico:acetonitrila (96:04
v/v)
0,5
7,6
5
sílica ODS C18
(Luna®,
Phenomenex) 250
x 4,6 mm, 5 µm
Tampão fosfato de sódio monobásico
e dibásico 25 mM:metanol:
acetonitrila (95: 2,5: 2,5 - 95: 4:1 95:4,5:0,5 v/v)
0,5
7,5
6
sílica ODS C18
(Luna®,
Phenomenex) 250
x 4,6 mm, 5 µm
Água acidificada com ácido
perclórico:acetonitrila (50:50 - 80:20 95:05 v/v)
0,5
3,0
mL/min
0,5
65
Continuação Quadro 9
7
sílica ODS C18
(Luna®,
Phenomenex) 250
x 4,6 mm, 5 µm
Água acidificada com ácido
perclórico: metanol (95:05 v/v)
0,5
3,0
8
sílica ODS C18
(Luna®,
Phenomenex) 250
x 4,6 mm, 5 µm
Tampão fosfato de sódio monobásico
e dibásico 50 mM: metanol e
acetonitrila (90:7,5:1,5 – 95:3,5:1,5
v/v)
0,5
7,5
9
sílica ODS C18
(Luna®,
Phenomenex) 250
x 4,6 mm, 5 µm
Tampão fosfato de sódio monobásico
e dibásico 50 mM: acetonitrila (95:05 93:07 v/v)
0,5
7,5
10
Synergi Hydro
RP80A ,
Phenomenex ®,
150 x 4,6 mm
Tampão fosfato de sódio monobásico
e dibásico 50 mM:acetonitrila (93:07,
95:05 v/v)
0,5, 0,6
e 0,8
7,5
11
XBridge®, 4,6
x150 mm 5 µm
Tampão fosfato de sódio monobásico
e dodecilsulfato de sódio com e
metanol (45:55: 50:50)
0,8
5,5
12
XBridge®, 4,6
x150 mm 5 µm
Água acidificada com ácido
perclórico:acetonitrila em gradiente de
5 – 100 %
0,8
2,5
13
XBridge®, 4,6
x150 mm 5 µm
Tampão fosfato 0,1 M com 50 ppm de
trietilamina:metanol (40:60 - 50:50 –
70:30 – 90:10)
0,8
5,5
Comprimento de onda de detecção: 232 nm; temperatura de 30 °C
Paralelamente foi desenvolvido um método que emprega a metodologia de
pareamento iônico, em coluna C18, adaptado da análise do hidrogeno tartarato de
rivastigmina (RAO et al., 2005), um fármaco bastante hidrofílico e com
características básicas, semelhantes ao cloridrato de metformina.
Para este método foi utilizado uma coluna de sílica ODS C18 (Luna®,
Phenomenex®, 250 x 4,6 mm, 5 µm), monitorando-se em 210 e 232 nm. Foram
testados os fluxos de 0,8 e 1,0 mL/min, nas temperaturas de 30, 35 e 40 °C. Fixouse o valor de pH da fase móvel em 3,0 (com ácido ortofosfórico PA), o fluxo em 1,0
mL/min, e a proporção de fase aquosa da fase móvel (heptanossulfonato 10 mM)
em 75 %, foi realizada uma otimização do método em um planejamento fatorial 32
66
variando a temperatura e a proporção dos dois solventes orgânicos (acetonitrila e
metanol), como mostra o quadro 10.
Quadro 10 - Análise fatorial da variação entre temperatura, e proporção de fase
móvel orgânica no método por CLAE de pareamento iônico
Condição
Temperatura
fase móvel
ACN:MeOH (v/v)
5:20
1
30 ºC
10:15
15:10
5:20
2
35 ºC
10:15
15:10
5:20
3
40 ºC
10:15
15:10
A solução padrão de cloridrato de metformina utilizada em todas as análises
foi dissolvida em água ultrapura, na concentração de 20 µg/mL e injetado um volume
de 20 µL.
A amostra do medicamento referência Glifage® degradada (20 µg/mL) em
meio ácida foi injetada nas condições acima durante a fase de desenvolvimento do
método, a fim de selecionar a condição que proporcionasse um tempo de análise
adequado, boa resolução entre o analito e os produtos de degradação e a
reprodutibilidade das áreas e tempos de retenção.
4.7 Validação analítica
Após definição de um método alternativo adequado para análise da
metformina e seus produtos de degradação prosseguiu-se com a validação do
método.
Para a validação foram realizados os testes de linearidade, precisão,
exatidão, seletividade, intervalo, limite de detecção e quantificação, e robustez
67
(BRASIL, 2003). Tais parâmetros foram determinados tendo em vista a aplicação do
método como sendo de categoria I (emprego no doseamento do fármaco de
comprimidos) e na categoria II (emprego do método para detectar e quantificar
impurezas).
4.7.1 Linearidade e intervalo
Para análise da linearidade do método desenvolvido foram selecionadas sete
concentrações crescentes do cloridrato de metformina SP (5, 10, 15, 20, 30, 40 e 50
µg/mL) em água ultrapura grau I, sendo que cada concentração foi preparada em
triplicata e analisada por CLAE em duplicata (totalizando 6 análises de cada
concentração). Foram elaboradas duas curvas analíticas em dois dias diferentes,
com ensaios independentes. Posteriormente foram analisados os dados de média,
desvio padrão, coeficiente de variação (CV) para cada nível de concentração e
realizada a regressão linear, em software Excel 3,0. Obteve-se o coeficiente de
correlação de Pearson (r), a equação da reta, a significância da regressão e análise
dos resíduos (BRASIL, 2003).
4.7.2 Exatidão
A exatidão foi realizada pelo ensaio de recuperação do cloridrato de
metformina SP, onde concentrações descritas no quadro 11 foram adicionadas à
solução amostra (comprimidos de Glifage 500 mg) de concentração conhecida.
A solução amostra foi preparada pesando o equivalente a 10 comprimidos de
500 mg do medicamento referência Glifage® e triturado em gral de porcelana. Desta
mistura foi pesado cerca de 5,27 mg do pó, (equivalente a 5,0 mg do fármaco),
transferido para um balão de 50 mL, acrescentado cerca de 25 mL de água ultrapura
e sonicado por 5 min. Após, foi completado o volume com água (concentração
teórica de 100 µg/mL).
A solução padrão foi preparada pesando-se 25 mg do cloridrato de
metformina
SP e dissolvido em água, em balão de 25 mL (concentração de 1
mg/mL).
O ensaio foi realizado em três níveis de concentração 15, 25 e 35 µg/mL,
cada uma das concentrações foi preparada e analisada em triplicata (Quadro 11).
68
Quadro 11 – Ensaio de Exatidão por recuperação do padrão
Balão 10 mL
Volume (mL) da solução
Volume (mL) da solução
Concentração
amostra 100 µg/mL
padrão a 1000 µg/mL
teórica (µg/mL)
1
0,5
0,1
15
2
0,5
0,2
25
3
0,5
0,3
35
4
0,5
--
--
5
--
0,2
20
Para análise da recuperação do padrão foi utilizada a Equação 3 (ítem 3.5.7),
onde a concentração teórica representa 100 % e o valor obtido pela concentração
adicionada deve estar entre 100 ± 2 % (GREEN, 1996).
4.7.3 Seletividade
Utilizando o ensaio de exatidão com a recuperação do padrão, avaliou-se a
interferência dos excipientes na análise do cloridrato de metformina, através do
cálculo de regra de três abaixo:
ACCM ---------------- 100 %
ACPCM -------------- X %
Interferência: 100 – X %
Onde: ACCM: Área do cromatograma referente ao cloridrato de metformina SP (20
µg/mL) – balão 5; ACPCM: Área do cromatograma referente ao balão 2 com adição
do cloridrato de metformina (20 µg/mL), após descontar a área relativa ao pico da
solução amostra (balão 4).
A seletividade do método também foi avaliada pela resolução entre os picos
de melamina e cloridrato de metformina (UNITED STATES PHARMACOPEIA,
2008), bem como entre os picos de impurezas na amostra degradada por hidrólise
ácida. Outro parâmetro relativo à seletividade do método foi a estimativa de pureza
espectral do pico referente ao cloridrato de metformina, pelo detector DAD, antes e
após os testes de degradação forçada, avaliando se o método é do tipo MIE.
69
4.7.4 Precisão
4.7.4.1 Repetibilidade
A repetibilidade foi avaliada com três concentrações diferentes de amostra
preparadas em triplicata, com injeção em quadruplicata. Estas amostras foram
preparadas pelo mesmo analista no mesmo dia.
Triturou-se 10 comprimidos de cloridrato de metformina 500 mg (Glifage ®) e
pesou-se o equivalente a 10, 20 e 30 mg de cloridrato de metformina, completando
volume com água em balão de 100 mL. Uma alíquota de 1 mL de cada solução foi
diluída com água em balão de 10 mL, totalizando concentrações de 10, 20 e 30
µg/mL.
Uma solução do padrão foi preparada na concentração de 500 µg/mL e 1 mL
foi transferido em balão volumétrico de 25 mL, para obter solução cuja concentração
final de 20 µg/mL e analisada em triplicata.
Para verificar a adequabilidade do método preparou-se a solução de
resolução pesando-se 10,0 mg de melamina e transferindo-se para balão
volumétrico de 100 mL, sonicado até dissolução. Transferiu-se então 0,5 mL dessa
solução e 1 mL da solução padrão (500 µg/mL) para um balão volumétrico de 25 mL
e completou-se com água, cujas concentrações finais dos dois analitos foi de 20
µg/mL.
As amostras foram filtradas em membrana de 45 µm e injetadas no
cromatógrafo.
Foram calculadas as médias, desvio-padrão e coeficiente de variação para
cada nível de concentração.
4.7.4.2 Precisão intermediária
A precisão intermediária foi avaliada com três diferentes concentrações de
amostra preparadas e analisadas, cada uma em triplicata. Estas amostras foram
preparadas pelo mesmo analista em 2 dias diferentes, conforme descrito no teste de
repetibilidade descrita anteriormente.
70
4.7.5 Limite de detecção e quantificação
O LD e o LQ foram estimados através do cálculo da equações 1 e 2, descritos
nos itens 3.5.5 e 3.5.6, respectivamente. Os dados foram obtidos no ensaio de
linearidade.
4.7.6 Robustez
Para avaliar a robustez do método foram realizadas pequenas e deliberadas
variações na temperatura do forno (29, 30 e 31 °C) e no fluxo da fase móvel (0,9; 1,0
e 1,1 mL/min).
A solução padrão de cloridrato de metformina a 20 µg/mL e a solução da
amostra Glifage®, submetida à degradação por hidrólise ácida foram empregadas
para a análise da robustez do método, injetada em sextuplicata, em cada condição,
calculando-se o teor do fármaco.
4.8 Ensaios de citotoxicidade
O ensaio foi realizado no Laboratório de Farmacologia in vitro, com orientação
do Prof. Dr. Rilton Alves de Souza.
Para o estudo foi utilizada a linhagem celular L292, pertencente à família dos
fibroblastos. As células foram plaqueadas na quantidade de 20.000 células por poço,
em placa de 96 poços, e deixadas em estufa com 5 % de concentração de CO2, na
temperatura de 37 ºC, com meio de cultura adequado acrescido de soro fetal bovino,
antibiótico e antifúngico, deixados em contato com as células por 24 h antes do
experimento.
O meio de cultivo celular foi renovado e posteriormente foram aplicados 20 uL
de cada amostra diluindo-se para concentrações de 100, 10, 1 e 0,1 µg/mL
preparadas conforme descrito abaixo.
Amostras do fármaco degradadas nas diferentes condições (500 µg/mL)
foram submetidas a processo de secagem utilizando o liofilizador.
Posteriormente
foi
utilizado
o
rotaevaporador.
As
amostras
das
especialidades farmacêuticas (500 µg/mL) foram aquecidas a uma temperatura de
85 ºC, sob vácuo, solubilizadas em metanol, evaporando o metanol em capela, com
secador térmico.
71
O pó restante foi pesado e dissolvido em tampão salino fosfato PBS isento de
cálcio e magnésio, pH 7,45, na concentração inicial de 1000 µg/mL. Após a análise
do pH das amostras, já em fluxo laminar, estas foram filtradas em membrana
esterilizante, e diluídas em tampão PBS, nas diluições de 1000, 100, 10, 1 µg/mL,
antes de serem aplicadas nos poços contendo as células.
Como controle positivo foi utilizado o detergente TritonX 100® e como
controle negativo, o próprio tampão fosfato. As células permaneceram em estufa de
CO2 por mais 24 h.
Para análise de viabilidade celular, após 20 h de exposição, foram
adicionados 20 µL do sal de tetrazólio MTT (sal de brometo metil tetrazólio; 5 mg/mL
preparada em tampão PBS) e deixada em estufa até completar 24 h. Posteriormente
foi removido todo o meio de cultivo e adicionado 200 µL de dimetilssufóxido para
solubilizar os cristais de formazam.
As placas foram lidas em leitor de microplaca com luz UV no comprimento de
onda de 570 a 620 nm e a viabilidade celular foi calculada (equação 5).
Viabilidade (%) = (Abs amostra / Abs controle negativo) x 100
Equação 5
Onde: Abs = absorbância
O teste de microscopia foi realizado como forma de análise de citotoxicidade
observando possíveis mudanças no formato celular. As células foram fixadas com
metanol gelado e deixadas em contato por 10 min. Foi removido o metanol e
adicionado uma mistura de diacetato de fluoresceína e brometo de etídio 1:100,
incubados por 10 min a T. A., o sobrenadante removido e lavado duas vezes com
tampão PBS e posteriormente lidas em microscópio de fluorescência invertida.
4.9 Análise estatística
A análise de dados dos resultados gerados por CLAE foi realizada pelo
programa Excel, utilizando dados como média, desvio padrão e coeficiente de
variação ou desvio padrão relativo (%), analise de regressão, teste T e Anova como
teste a posteriori.
72
Nos testes de citotoxicidade celular foi utilizado o programa Prisma e como
teste a posteriori o teste de Dounett.
73
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Utilizando o método desenvolvido e validado no UNIVALI – LAPAM,
empregando coluna SCX, o cloridrato de metformina eluiu em cerca de 8,0 min e as
principais impurezas, cianoguanidina e melamina, em 1,5 e 2,8 min, respectivamente
(Figura 7), demonstrando uma boa resolução entre estes compostos, com boa
simetria (T) dos picos (T = 1,27), com tempo total de corrida de 15 min.
30
30
mAU
20
20
10
0
mAU
40
40
10
50
0
50
a
0
1
2
3
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6
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8
9
10
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13
14
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800
Minutes
800
700
b
500
500
mAU
400
400
300
300
200
200
100
100
0
mAU
600
600
0
700
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Minutes
Figura 7 – Cromatogramas relativos ao ensaio de doseamento: (a) cloridrato de
metformina 25 µg/mL (b) mistura de cloridrato de metformina, cianoguanidina e
melamina, em 25 µg/mL empregando coluna Luna SCX ®,
tampão fosfato de
potássio 150 mM pH 3,0:metanol 95:05, fluxo de 1 mL/min, a 30 °C, com detecção
em 218 nm.
74
Os cromatogramas referentes às formulações comerciais apresentaram o
mesmo perfil do fármaco isolado (dados não mostrados). Como os cromatogramas
das especialidades farmacêuticas ficaram muito semelhantes, o método demonstrou
ter boa reprodutibilidade e também seletividade para a separação das duas
principais impurezas do fármaco, a cianoguanidina e a melamina (Figura 7b).
5.1 Doseamento das Especialidades Farmacêuticas
Empregando o método previamente desenvolvido e validado pelo UNIVALILAPAM, as especialidades farmacêuticas empregada neste trabalho foram
analisadas quanto ao teor médio. De acordo com a tabela 2, os medicamentos
analisados apresentaram teor do cloridrato de metformina dentro de 90 – 110 %, e o
CV ficou abaixo de 1,5 % demonstrando estarem de acordo com o especificado pela
farmacopeia britânica (BRITISH PHARMACOPOEIA, 2008).
Tabela 2 - Resultado do doseamento dos medicamentos Glifage ®, Glucoformin ® e
genérico Medley.
Teor (%)
CV (%)
Referência-Glifage®
98,60
0,37
Similar - Glucoformin®
100,10
0,20
Genérico - Medley
101,00
1,40
Entre grupos
1,24
5.2 Teste de degradação forçada
Com auxílio desta mesma metodologia citada acima foram selecionadas as
condições de degradação do cloridrato de metformina, inicialmente com o fármaco
isolado (Figura 8). Observou-se que o método por CLAE é seletivo para o analito,
com boa resolução entre este e as demais impurezas que surgiram nas diferentes
condições de estresse avaliados (Figura 8)
1
2
3
4
5
6
7
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10
11
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m AU
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20
20
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30
60
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40
0
60
a
0
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5
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8
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8
8
8
8
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m AU
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0
0
-2
-2
0
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6
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6
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d
6
m AU
2
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mAU
0
70
50
m AU
50
70
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1
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6
Minutes
7
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13
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15
9
10
11 12
13
14 15
5
5
0
m AU
20
25
15
25
e
0
-5
-10
6
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m AU
m AU
10
10
m AU
5
0
-5
-5
5
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10
0
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15
5
3
9
20
-1 0
15
15
10
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1
7
-5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15
Minutes
Figura 8 - Cromatograma de análise de degradação do fármaco a 25 µg/mL em
água: (a) cloridrato de metformina (20 µg/mL); (b) degradação ácida(HCl 1 M 6 h
refluxo); (c) degradação básica (NaOH 0,1 M 24 h T. A.); (d) degradação neutra
(água 39 h refluxo); (e) degradação oxidativa (H2O2 32% 48 h T.A.) e (f) degradação
por fotólise (água 3,5 h câmara fechada 254 nm). Condições cromatográficas
conforme Figura 7.
76
Na hidrólise ácida surgiram 3 picos adicionais (2,5, 4,0 e 5,5 min de tempo de
retenção) após o tempo morto (t0), que foi de 1,3 min, e a área do pico do fármaco
diminui, indicando sua degradação na condição selecionada (Figura 8b).
Na hidrólise básica, a área do pico do fármaco também diminuiu e surgiu um
pico adicional em 4,8 min (Figura 8c). Já na hidrólise neutra foi observada uma
diminuição da área do analito e somente um pico adicional, em cerca de 2,0 min
(Figura 8d). Na degradação por oxidação, além da diminuição da área do pico do
analito, surgiram 3 picos adicionais em 3,0, 4,0 e 5,5 min, na exposição à luz UV
houve uma pequena diminuição do pico do analito e surgiram 2 picos adicionais, em
4,0 e 5,5 min. Verificou-se que, em 3 das condições aplicadas, surgiram os picos em
4,0 e 5,5 min, sugerindo tratar-se dos mesmos produtos de degradação.
As amostras degradadas também foram analisadas por CCD item 5.3.
Em relação às condições de degradação, na condição ácida, o refluxo com
tempos superiores a 6 h resultou em um elevado percentual de degradação. Por isso
o tempo ideal de exposição determinado para esta condição foi de 6h em refluxo
com HCl 1 M.
Na degradação básica, inicialmente utilizou-se refluxo, o qual através do
emprego do calor acelera a velocidade das reações, e juntamente com
concentrações mais altas de NaOH, proporcionavam, elevados percentuais de
degradação. Desta forma a condição selecionada foi de 24 h sob agitação mecânica,
na temperatura ambiente com NaOH 0,1 M.
A condição de degradação neutra, utilizando apenas água, necessitou maior
tempo de exposição, com uso de calor para que houvesse degradação do fármaco,
e a condição selecionada foi 39 h em refluxo.
A condição oxidante, com emprego de calor em altas concentrações de
peróxido de hidrogênio proporcionou um percentual muito elevado de degradação do
fármaco. Optou-se pelo emprego da maior concentração de H2O2 (32 %), tempo de
exposição do fármaco necessitou de 48 h com agitação mecânica em temperatura
ambiente.
Na fotólise foi selecionado 3,5 h de exposição à luz ultravioleta (254 nm) com
amostra diluída em água, pois a exposição na forma sólida não resultou em
degradação nas condições avaliadas.
77
Quanto às características físicas das amostras, enquanto o cloridrato de
metformina apresenta-se como um pó branco, cristalino, a amostra degradada em
condição ácida após terem sido secas pelo processo de liofilização, apresentou-se
como um sólido de coloração amarelada, altamente higroscópicas. Na condição
básica apresentou-se branca e higroscópica.Já nas demais condições apresentaram
com pó branco, fino.
De modo geral as porcentagens de degradação do fármaco isolado (Tabela
3), nas condições de degradação selecionadas, foram maiores do que o
recomendado de 10 – 30 % (BRASIL, 2008). Optou-se pelo uso de condições de
degradação mais drásticas no fármaco isolado tendo em vista o possível efeito
“protetor” dos excipientes nas especialidades farmacêuticas e a observação de um
maior número de impurezas nos cromatogramas, assegurando que o método
analítico empregado fosse indicativo da estabilidade do fármaco.
Tabela 3 – Porcentagens de degradação do cloridrato de metformina nas diferentes
condições de degradação selecionadas (ácida, base, oxidante, neutra e fotolítica).
Condição de degradação
Índice de pureza do
a
Porcentagem de
pico de metformina
degradação
Metformina padrão
1.00000
0
Ácido (HCl 1 M, 6 h em refluxo)
1.00000
5,74 %
Base (0,1 M em agitação T.A. por 24 h)
0.99968
84,50 %
Neutra (39 h refluxo com água ultrapura)
0.99959
88,99 %
Oxidante (48 h agitação T. A. H2O2 32 %)
0.99993
72,12 %
Fotólise (3,5 h exposição Luz UV)
0.99999
28,12 %
a
estimado pelo detector DAD
Com base nos cromatogramas e análise da porcentagem de degradação
denota-se que houve a degradação do cloridrato de metformina quando submetido
às condições selecionadas, com aparecimento de impurezas, contrariando os
resultados previamente publicados por Sakalgaonkar; Mirgane e Arbad (2008) que
não observaram picos suplementares nos cromatogramas da amostra degradada.
O interesse em estudar os produtos de degradação é auxiliar na exigência de
qualificação das impurezas nas especialidades farmacêuticas e no desenvolvimento
de um método analítico que seja indicador de estabilidade do fármaco (método MIE).
78
O método tem que demonstrar ser seletivo para análise do fármaco. Para isso
conta-se com o auxilio da análise do índice de pureza, onde neste caso todos os
picos referentes ao cloridrato de metformina nos cromatogramas das amostras
degradadas, apresentaram valores próximos a 1,0 (Tabela 3), indicando ser puros,
com ausência de co-eluição. Portanto, o método demonstrou ser do tipo MIE, onde
impurezas não afetam a seletividade do método.
Um método de eletroforese capilar desenvolvido e validado por Hamdam,
Jaber e Abushoffa (2010) foi empregado na análise do cloridrato de metformina
submetido às condições de degradação neutra (água), ácida (HCl 0,1 M), básica
(NaOH 0,1 M), oxidativa (H2O2 10 %), todas sob refluxo a 80 °C por 6 h e fotolít ica
(exposição a 254 nm por 24 h). Os autores demonstraram uma degradação superior
do fármaco na condição básica, porém, nas demais condições, não foi observada
degradação das amostras.
Em um método desenvolvido por Ali et al. (2008), utilizando a técnica de
HILIC, os autores submeteram o cloridrato de metformina à degradação ácida com
HCl 0,1 N aquecidas a 80 ºC e observaram uma degradação de 12,9 % após 5 h e
de 43,1 % após 8 h, com o surgimento de 2 picos adjacentes, com eluição anterior
ao pico do fármaco. Na degradação básica com NaOH 0,1 N, aquecida a 80 ºC,
analisando em vários tempos até 5 h, os autores observam que o fármaco degrada
com muita intensidade em pouco tempo, degradando 17,6 % em apenas 10 min.
Surgiram vários picos suplementares no cromatograma da amostra degradada e um
pico extra com eluição em 2,5 min, após o pico da cianoguanidina, mostrou aumento
gradativo com o tempo de exposição ao agente alcalino. Na degradação neutra com
aquecimento a 80 ºC por 10 h, não houve o aparecimento de picos extras, tampouco
a degradação do fármaco. Na degradação oxidativa em H2O2 3 % sob aquecimento
a 80 ºC por 5 h, restaram 77,5 % do fármaco e surgiram 3 picos suplementares. Na
degradação fotolítica (exposição a lâmpada UV por 30 dias) surgiu um pico com
tempo de retenção semelhante à cianoguanidina e o teor do fármaco ficou em 93,97
%.
No presente trabalho, optou-se por não empregar calor na degradação
alcalina, portanto, foi necessário um tempo maior de exposição ao NaOH 0,1 M para
resultar em degradação do fármaco (24 h) onde observou-se a presença de somente
um pico suplementar. Provavelmente, a presença do calor, empregado nos trabalhos
supracitados tenha acelerado o processo de degradação do fármaco e propiciado o
79
surgimento de outros produtos de degradação. No caso da degradação ácida, foi
utilizado uma concentração 10x superior de HCl, o que proporcionou uma leve
degradação do fármaco e o surgimento de 3 picos extras no cromatograma após o t0
(Figura 8b) e na CCD (Figura 12c), sendo a condição que proporcionou degradação
menos intensa na amostra, semelhante ao encontrado por Ali et al. (2008), porém
com mais picos extras. Na condição neutra também foi observado picos extras,
porém houve uma intensa degradação, provavelmente, devido ao tempo 4 vezes
superior ao empregado por Ali et al. (2008). A condição oxidante, no presente
trabalho foi empregado uma concentração e um tempo superior de exposição ao
agente oxidante, sem emprego de calor e o resultado foi semelhante em termos de
percentual de degradação do fármaco e do surgimento de 3 picos extras, em relação
ao trabalho dos referidos autores. Na exposição à luz UV, no presente trabalho
houve maior degradação (28,12 %) e o surgimento de um pico extra, porém, os
referidos autores empregaram um tempo de exposição cerca de 10x superior e
também observaram um pico extra, coincidindo com o tempo de retenção da
cianoguanidina. Verificou-se que houve degradação significativa do fármaco nas
condições selecionadas, as mesmas condições de degradação foram aplicadas nas
especialidades farmacêuticas, Glifage®, Glucoformin® e genérico Medley conforme
figuras 9, 10 e 11.
80
14
d
14
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10
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8
8
8
m AU
6
m AU
m AU
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15
Minutes
e
f
Figura 9 - Cromatogramas de degradação do Glifage®: (a) amostra sem
degradação, (b) degradação ácida, (c) básica, (d) neutra, (e) oxidativa e (f) fotólise.
Condições cromatográficas idem Figura 7.
Como pode ser observado, especialidade Glifage®, mostrou um perfil de
degradação similar ao apresentado pelo fármaco (figuras 8 e 9); porém, com menor
intensidade. Na hidrólise ácida (figura 9b), somente 2 picos adicionais foram
81
observados, frente a 3 picos apresentados na degradação do fármaco isolado (figura
8b).
Na hidrólise básica (figura 9c) da especialidade farmacêutica não surgiu o
pico adicional, como observado para o fármaco (figura 8c). O perfil do cromatograma
da amostra submetida à oxidação (figura 9e) somente 1 pico adicional (em 3,0 min)
foi observado nesta especialidade, enquanto haviam 3 picos no fármaco isolado
(figura 8e). Na fotólise desta amostra (figura 9f), não foram observados picos
suplementares, enquanto o fármaco isolado apresentou 2 picos suplementares após
exposto à luz UV (figura 8f).
O analito presente na especialidade farmacêutica sofreu menor grau de
degradação com o surgimento de menor quantidade de produtos de degradação,
quando submetido aos testes de estresse em relação ao fármaco isolado.
Na figura 10 está apresentado o perfil cromatográfico da especialidade
Glucoformin®, o qual apresentou perfil cromatográfico idêntico ao da especialidade
Glifage® após degradação (Figura 9) e ao Genérico Medley (Figura 11).
45
50
b
15
15
10
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0
0
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-1 0
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-1 0
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0
0
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4
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10 11 12 13 14 15
Minutes
Figura 10 - Cromatogramas de degradação do Glucoformin®: (a) amostra sem
degradação, (b) degradação ácida, (c) básica, (d) neutra, (e) oxidativa e (f) fotólise.
Condições cromatográficas idem Figura 7.
40
40
40
35
50
50
40
83
0
0
-5
-5
10
mAU
0
30
25
m AU
mAU
20
15
10
5
5
30
10
m AU
20
15
10
20
20
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12 13
14
0
15
1
2
3
4
5
6
7
2 .5
2.5
0 .0
0.0
-2.5
-5.0
7
15
8
9
1 0 .0 1 2 .5 1 5 .0 1 7 .5
17.5
15.0
d
10.0
7.5
2.5
0.0
-2.5
-5.0
5.0
0
10 11 12 13 14 15
12.5
mAU
mAU
5 .0
5.0
-5 .0 -2 .5
7.5
6
14
5 .0m A U7 .5
10.0
5
12 13
2 .5
15.0
12.5
4
11
0 .0
c
3
10
-2 .5
17.5
2
9
-5 .0
7m.5A U 1 0 .0 1 2 .5 1 5 .0 1 7 .5 2 0 .0
20.0
1
8
Minutes
Minutes
0
30
25
30
0
a
35
b
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15
Minutes
50
Minutes
50
f
10
10
-10
0
-20
10
-2 0
0
mAU
0
0
40
20
-1 0
30
30
20
10 m AU 20
30
30
0
40
mAU
m
2 0A U
40
-1 0
40
e
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15
0
-10
1
2
Minutes
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15
Minutes
Figura 11 - Cromatogramas de degradação do medicamento Genérico: (a) amostra
sem degradação, (b) degradação ácida, (c) básica, (d) neutra, (e) oxidativa e (f)
fotólise. Condições cromatográficas idem Figura 7.
Com base nas áreas dos cromatogramas, foi calculado o percentual de
degradação do cloridato de metformina (Tabela 4). Como pode ser observado, a
84
degradação do fármaco e das especialidades mostraram diferenças tanto no número
e área dos picos (Figuras 8-11) quanto no percentual de degradação do analito
(Tabela 4).
Tabela 4 - Porcentagens de degradação do fármaco e comprimidos
Condição de
degradação
Amostra
Porcentagem média
de degradação
Reagente e Tempo
de contato
Ácida
Cloridrato de metformina
5,7
HCl 1 M 6 h em
refluxo
Glifage
6,6
Glucoformin
16,1
Genérico
20,6
Cloridrato de metformina
84,5
Glifage
75,5
Glucoformin
53,5
Genérico
57,7
Cloridrato de metformina
89,0
Glifage
84,9
Glucoformin
29,6
Genérico
55,6
Cloridrato de metformina
72,1
Glifage
27,1
Glucoformin
20,9
Genérico
20,9
Cloridrato de metformina
28,1
Glifage
11,4
Glucoformin
1,5
Genérico
11,4
Básica
Neutra
Oxidante
Fotólise
NaOH 0,1 M 24 h
Temp ambiente
Água 39 h refluxo
H2O2 32 % 48 h temp
ambiente
Água exposição 3 h
em câmara UV 254
nm
Exceto na condição ácida, nas demais, houve uma maior degradação do
analito
no
fármaco
isolado
do
que
nas
especialidades
farmacêuticas.
Provavelmente, a diferença encontrada deve-se à presença e à variedade de
85
excipientes
nas
formulações,
as
quais
dispões
de
agentes
umectantes,
opacificantes, polímeros utilizados no revestimento, lubrificantes, antiumectantes,
aglutinantes e desagregantes, como adjuvantes farmacotécnicos, os quais não estão
presentes em todas as formulações, e suas concentrações não estão descritas pelos
fabricantes.
As formulações não dispõem de antioxidantes ou estabilizantes, além de
diferirem nos processos de fabricação, uma vez que não pertencem ao mesmo
fabricante, podendo ser uma das causas na variabilidade nos perfis de degradação.
O método farmacopeico, adaptado pelo UNIVALI-LAPAM, mostrou ser do
tipo MIE para as 3 especialidades farmacêuticas, permitindo selecionar as condições
de degradação do fármaco para posterior desenvolvimento de um método alternativo
por CLAE e análise de citotoxicidade do fármaco e das especialidades farmacêuticas
degradadas.
5.3 Caracterização dos produtos de degradação
Para realizar a CCD preparativa foram utilizadas diferentes fases móveis, a
fim de obter a melhor condição para a separação dos compostos presentes. As
fases móveis que apresentaram melhores resultados, após revelação das
cromatoplacas por solução de ninhidrina 5 %, com auxílio da chapa de aquecimento,
estão representadas na figura 12.
Também revelou-se as placas por UV 254 nm, porém, devido à baixa
absorbância do cloridrato de metformina, que absorve mais em 218 – 232 nm, e das
substâncias geradas durante o processo de degradação, que absorvem no UV,
houve necessidade da revelação química.
86
(a)
(b)
(c)
Figura 12 – Desenho esquemático das placas de CCD utilizando: fase móvel
CH3Cl:MeOH:Ac. Acético nas proporções: (a) 63,63:31,80:5,45; (b) 50:42,5:75; (c)
64,81:32,40:2,77. M = metformina padrão; D = diciandiamida; Me = melamina,; A =
amostra degradada por hidrólise ácida;N = amostra degradada por hidrólise neutra;
O = amostra degradada por oxidação.
As condições de degradação básica e fotolítica também foram analisadas por
CCD, porém, não apresentaram resultados satisfatórios, de maneira que não houve
separação entre os produtos gerados no processo de degradação (dados não
mostrados).
A melhor fase móvel foi a da condição c, na qual apresentou uma boa
resolução entre os compostos, mostrando 3 bandas na amostra degradada na
condição ácida, além do analito.
Comparando a análise por CLAE (Figura 8) e por CCD (Figura 12),
apareceram o mesmo número de bandas ou picos adicionais na condição de
degradação ácida, confirmando o número de produtos de degradação nesta
condição. Já na degradação por oxidação, a CCD (Figura 12a) mostra apenas 2
bandas adicionais, enquanto a CLAE (Figura 8e) surgiram 3 picos. Na hidrólise
neutra não foram observados picos adicionais na CCD. Por outro lado na amostra
havia 1 pico adicional, considerando-se a maior sensibilidade da CLAE, por isso os
resultados são relativamente semelhantes.
Devido ao surgimento de um maior número de compostos gerados durante as
condições de degradação optou-se por dar continuidade aos demais experimentos
somente com a condição de degradação ácida.
Foram então testadas outras fases móveis como CH3Cl:MeOH 50:50 e
diclorometano: Metanol 50:50 (Figura 13).
87
(a)
(b)
(c)
Figura 13 – Desenho esquemático das placas de cromatografia em camada delgada
da amostra ácida utilizando como fase móvel (a) CH3Cl:MeOH:Ac. Acético
63,63:31,80:5,45 (b) CH3Cl:MeOH 50:50 (c) diclorometano:MeOH 50:50 e revelador
ninhidrina 5 %.
Com a fase móvel da condição c (Figura 13) foram repetidas várias placas
idênticas mostrando-se reprodutível. Utilizando esta fase móvel foi realizada uma
CCP(Figura 14) porém a separação não foi tão eficiente e houve o aparecimento de
bandas suplementares, pois os compostos gerados no processo de degradação
provavelmente apresentam polaridades muito semelhantes uma vez que são
considerados derivados da mesma substância que á o cloridrato de metformina.
Na placa de CCP (Figura 14a) uma maior quantidade de amostra degradada
em meio ácido foi aplicada e houve o aparecimento de seis bandas cromatográfica
ao invés de quatro anteriormente descritas.
As substâncias então ficaram com Rf muito próximo. Todas as bandas de
número 6 foram removidas da placa e dissolvidas em 20 mL de metanol, seguida
pela filtração em papel filtro, evaporação e recromatografadas em CCD, usando a
mesma fase móvel diclorometano:MeOH 50:50 (Figura 14b).
88
(a)
(b)
Figura 14 – (a) Desenho representativo da CCP do cloridrato de metfromina
degradado em meio ácido; (b) desenho representativo da recromatografia em CCD
das bandas encontradas em (a) usando a fase móvel diclorometano: metanol 50:50
e revelador ninhidrina 5 %.
A placa realizada com as bandas extraídas CCP demonstrou baixa resolução
dos compostos derivados com polaridades muito semelhantes. A única banda que
aparentemente estava pura foi à banda seis que anteriormente não estava presente
nas placas de CCD, provavelmente por apresentar-se em quantidades menores no
monitoramento por CCD
Selecionou-se a banda 6 para análise por RMN H1 e a banda 5 onde havia
aparentemente dois compostos foi submetida a coluna cromatográfica sob pressão
(tipo flash) e obteve-se três frações 1 - clorofórmio, 2 – CH3Cl:MeOH 50:50 e 3metanólica, (Figura 15) onde a fração metanólica apresentou apenas um composto e
também foi analisada também por RMN H1.
Figura 15 – Desenho representativo da CCD obtida com as frações eluídas da
coluna flash na qual foi aplicada a fração 5. Fase móvel Diclorometano:metanol
50:50, revelador ninhidrina 5 %.
89
Nenhuma das fases móveis testadas em CCD foi eficaz na separação das
substâncias geradas durante a degradação ácida. Provavelmente devido à
similaridade estrutural entre os produtos de degradação, e à elevada polaridade dos
mesmos, além da presença do HCl o qual pode interagir com as substâncias.
Adicionalmente as substâncias formadas durante a hidrólise ácida podem ter sido
geradas pelo emprego do calor associado ao ácido que possibilitou a formação de
pelo menos 4 substâncias como observado na Figura 13a.
A análise de RMN H1 representadas nas figuras 16 e 17 não possibilitaram
concluir qual composto se refere às substâncias isoladas, necessitando realizar mais
análises como RMN C13, espectrometria de massas e espectroscopia de
infravermelho. Esta última, apesar de evidenciar apenas os tipos de grupos químicos
presente no composto poderia informar se o composto é cíclico apresentando anéis
aromáticos ou alicíclico, complementando as demais análises.
Figura 16 – Espectro de RMN H1 da fração 6 da CCP.
90
Figura 17 - Espectro de RMN H1 da subfração 3 da fração 5 da CCP
Analisou-se então todas as condições de degradação (ácida, base, neutra,
oxidante e fotolítica) por injeção direta no GC-MS. Devido a presença de muitas
substâncias, não foi possível concluir sobre a natureza dos compostos presentes,
por apresentar uma quantidade muito grande de fragmentos moleculares nos
espectros gerados (dados não mostrados).
A CCP foi repetida e foi extraída, novamente, a banda 6 referida acima. Esta
foi analisada em CCD utilizando-se como fase móvel diclorometano:metanol 50:50.
A CCD indicou que a banda estava aparentemente pura. Na análise por MS,
sugeriu-se que esta banda extraída da CCD preparativa não continha apenas um
composto, o que foi confirmado pela repetição de uma cromatoplaca de CCD,
utilizando sistema eluente Hexano: acetato de etila 30:70, onde houve a separação
daquela banda inicialmente isolada em mais três bandas, com valores de Rf bem
diferentes conforme figura 18.
91
Figura 18 – Desenho representativo da CCD obtida com a fração 6 eluída da CCP,
solvente hex:act etila 30:70, reveladas em câmara UV, 254 nm.
Constatou-se, com base nos cromatogramas gerados por CLAE que, devido à
semelhança no tempo de retenção, coloração após revelar, espectro de UV, Rf e
nos fragmentos moleculares referentes ao cloridrato de metformina, que em todas as
amostras degradadas havia quantidades consideráveis do fármaco não degradado,
conforme já observado por CLAE. Houve dificuldade em separar compostos que
podem ser derivados do cloridrato de metformina, ou ainda produtos que sofreram
várias etapas de degradação nas condições selecionadas dos testes, pois existe
uma semelhança muito grande de polaridade. Devido ao baixo rendimento da CCP,
gerando pouca quantidade de material para análise não foi possível uma posterior
utilização da banda 6 para nova análise e este estudo necessita ser complementado.
5.4 Desenvolvimento de Método alternativo para Doseamento do
fármaco e análise dos produtos de degradação por CLAE
Muitas tentativas foram executadas afim de desenvolver uma metodologia
que empregasse uma coluna comum, tipo C18, e fases móveis de uso habitual em
laboratórios, conforme demonstrado no quadro 9 (dados não mostrados). Mediante a
elevada hidrofilicidade e basicidade do analito e das impurezas presentes nas
amostras degradadas, não se obteve uma adequada interação dos analitos com a
fase estacionária em fase reversa, o que resultou em picos distorcidos com
assimetria inaceitável, bem como afetou a reprodutibilidade do sistema.
92
A dificuldade no desenvolvimento dos métodos cromatográficos se deve,
provavelmente à característica químicas do cloridrato de metformina, cujo é
constituído basicamente por grupamentos aminas e amidas, os quais apresentam
tendência a se ionizarem. Em valores de pH de fase móvel alcalino (pH 7,5),
próximos ao limite de pH tolerado pelas colunas cromatográficas (pH 8,0), o
composto apresenta-se em estado parcial de ionização próximo ao seu pKa de 12,4
(LAUDO JANUMET, 2010), o que explicaria as diferenças obtidas nos tempos de
retenção em cada cromatograma em algumas das condições testadas (KROMIDAS,
2005).
Diante destas dificuldades, optou-se então pelo emprego da metodologia de
pareamento iônico, utilizando o heptanossulfonato de sódio, baseado no método de
análise do hidrogeno tartarato de rivastigmina (RAO et al., 2005).
Entre todos os métodos testados, o método empregando o sistema de
pareamento
iônico
foi
o
mais
adequado.
A
fase
móvel
consistiu
de
heptanossulfonato de sódio 10 mM pH 3,0 (A), como agente de pareamento iônico,
com acetonitrila (B) e metanol (C). Na otimização deste método foram testadas 3
temperaturas diferentes e 3 proporções de B e C (quadro 10). Um cromatograma
representativo de cada condição testada neste método está apresentado nas figuras
19, 20 e 21. A amostra utilizada para o desenvolvimento do método alternativo foi o
Glifage® degradado em meio ácido que havia apresentado mais picos adicionais,
detectado pelo método adaptado da Farmacopeia Britânica e previamente validado
pelo UNIVALI-LAPAM (Figuras 8, 9-11).
50
93
40
50
40
m
AU
20
20
10
10
0
0
-10
0
2
4
6
8
10
12
14
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18
20
22
24
26
28
m
AU
30
30
-10
a
30
100
Minutes
80
b
100
m
AU
40
60
80
20
0
-20
20
0
40
m
AU
60
-20
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
90
Minutes
70
80
c
90
80
m
AU
30 40 50 60
70
60
40
m
AU
50
20
20
10
10
0
0
-10
30
-10
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Minutes
Figura 19 - Cromatogramas da amostra Glifage® a 20 µg/mL após degradação
ácida, detecção em 204 nm, a 30°C , 1 mL/min, fase móvel composta de
heptanossulfonato de sódio 10 mM pH 3,0 (A), como agente de pareamento iônico,
com acetonitrila (B) e metanol (C): a) A:B:C (75:05:20) b) A:B:C (75:10:15); c) A:B:C
(75:15:10), Coluna sílica ODS C 18 (Luna® Phenomenex 250 x 4,6 mm, 5 µm).
O t0 neste sistema cromatográfico foi de 2,4 min e o número de picos
suplementares foi maior, visualizando-se, ao menos, 4 picos com tempo de retenção
94
que variaram de acordo com a proporção dos solventes orgânicos na fase móvel
(Figura 19).
mAU
20
20
10
10
0
-10
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
mAU
30
30
0
40
-10
40
a
30
Minutes
20
0
mAU
60
mAU
40
40
-20
60
20
80
0
80
b
-20
0
2
4
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10
12
14
16
18
20
80
60
60
mAU
40
40
20
0
-20
80
20
100
0
c
0
mAU
100
Minutes
-20
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
Minutes
Figura 20 - Cromatogramas da amostra Glifage® a 20 µg/mL após degradação
ácida, detecção em 204 nm, a 35°C , 1 mL/min, fase móvel composta de
heptanossulfonato de sódio 10 mM pH 3,0 (A), como agente de pareamento iônico,
com acetonitrila (B) e metanol (C): a) A:B:C (75:05:20) b) A:B:C (75:10:15); c) A:B:C
(75:15:10), Coluna sílica ODS C 18 (Luna® Phenomenex 250 x 4,6 mm, 5 µm).
70
95
70
40
40
mAU
30
30
20
20
10
10
0
-10
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
mAU
50
50
0
60
-10
60
a
30
80
Minutes
80
50
50
mAU
30 40
40
20
20
10
10
0
-10
-20
30
0
mAU
60
60
0
70
-10
70
b
-20
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
100
Minutes
100
mAU
40
40
20
20
0
0
mAU
80
60
60
-20
80
0
c
-20
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Minutes
Figura 21 - Cromatogramas da amostra Glifage® a 20 µg/mL após degradação
ácida, detecção em 204 nm, a 40°C , 1 mL/min, fase móvel composta de
heptanossulfonato de sódio 10 mM pH 3,0 (A), como agente de pareamento iônico,
com acetonitrila (B) e metanol (C): a) A:B:C (75:05:20) b) A:B:C (75:10:15); c) A:B:C
(75:15:10), Coluna sílica ODS C 18 (Luna® Phenomenex 250 x 4,6 mm, 5 µm).
96
Nestes cromatogramas foram avaliados dados de resolução entre os picos do
cloridrato de metformina e seu pico vizinho, assimetria do pico correspondente ao
analito, tempo de retenção e aspecto do cromatograma.
Analisando primeiramente a influência da temperatura nos cromatogramas, à
medida que aumenta a temperatura tem-se uma diminuição do tempo de retenção
do fármaco, aumento da assimetria e diminuição da resolução entre os picos
cromatográficos.
Como
exemplo
a
condição
de
fase
móvel
75:10:15
(hetpanossulfonato:ACN:MeOH) demonstradas na tabela 5.
Tabela 5 – Parâmetros cromatográficos da análise por CLAE em pareamento iônico
do cloridrato de metformina após degradação ácida, nas diferentes temperaturas
testadas
Temperatura ºC
Tempo de retenção
Assimetria
Resolução
(min)
30
24,705
1,16
4,31
35
21,317
1,20
2,88
40
16,917
1,28
0
Analisando a variação das proporções de fase móvel nestes três níveis
(75:05:20; 75:10:15; 7515:10 heptanossulfonato:ACN:MeOH), observa-se que a
medida que aumenta a proporção de acetonitrila, tem-se a diminuição do tempo de
retenção do pico correspondente ao cloridrato de metformina, bem como a
diminuição da resolução entre os picos e a co-eluição de alguns picos. A assimetria
entre os picos, nestas proporções, não foi alterada significativamente.
Dentre todas as condições testadas, a temperatura que apresentou os
melhores resultados foi a de 30 ºC, com tempos de retenção adequados em todas
as análises, sem distorções nos picos cromatográficos. A proporção que apresentou
melhor
resolução
entre
os
picos
foi
de
75:10:15
para
fase
móvel
heptanossulfonato:ACN:MeOH, pH 3,0 e fluxo de 1,0 mL/min. Esta condição então
foi adotada como a condição inicial para prosseguir com a otimização do método.
Neste sistema eluente, o cloridrato de metformina apresentou um tempo de
retenção adequado (15 min), boa resolução com relação ao pico vizinho (R = 2,08) e
boa reprodutibilidade nos tempos de retenção (dados não mostrados).
97
Como a amostra foi armazenada em geladeira, provavelmente possa ter
ocorrido alterações em sua composição, com degradação suplementar, mesmo
armazenada em geladeira e diluída com água. Este fato pode justificar a diferença
no perfil cromatográfico da amostra com os dois métodos (Figura 8b e 13b)
A condição selecionada foi repetida em outro cromatógrafo (Waters), como
forma de demonstrar a robustez do método e o resultado está apresentado na
Figura 22. Observa-se a reprodutibilidade no tempo de retenção do pico
correspondente ao cloridrato de metformina.
Figura 22 – Cromatograma da amostra Glifage® após degradação ácida (20 µg/mL)
na fase móvel heptanossulfonato de sódio 10 mM pH 3,0:acetonitrila:metanol
(75:10:15 v/v), 1 mL/min fluxo e 30 ºC temperatura, detecção em 210 nm, coluna
C18 (Luna®, Phenomenex), no cromatógrafo Waters.
Na tentativa de melhorar a resolução do pico adjacente ao cloridrato de
metformina, que diminuiu neste cromatógrafo, o fluxo para 0,8 mL/min (Figura 23).
No entanto não houve uma melhora significativa e o tempo de retenção ficou em
19,5 min, prolongando excessivamente a corrida.
Figura 23 – Cromatograma da amostra Glifage® após degradação ácida (20 µg/mL)
na fase móvel heptanossulfonato de sódio 10 mM pH 3,0:acetonitrila:metanol
(75:10:15 v/v), 0,8 mL/min fluxo e 30 ºC temperatura, detecção em 210 nm, coluna
C18 (Luna®, Phenomenex), no cromatógrafo Waters.
98
Na sequência foi alterada novamente a proporção de acetonitrila na fase
móvel, utilizando: heptanossulfonato de sódio 10 mM pH 3,0:acetonitrila:metanol 75:
8:17 (v/v) retornando ao fluxo de 1 mL/min fluxo e mantendo 30 ºC (Figura 24).
Nesta condição, a resolução entre o pico do fármaco e o pico vizinho melhorou,
apresentando uma assimetria adequada.
Figura 24 – Cromatograma da amostra Glifage® após degradação ácida (20 µg/mL)
na fase móvel heptanossulfonato de sódio 10 mM pH 3,0:acetonitrila:metanol
(75:8:17 v/v), 1 mL/min fluxo e 30º C temperatura, detecção em 210 nm, coluna C18
(Luna®, Phenomenex), no cromatógrafo Waters.
Tendo em vista a otimização deste método, foi analisada a mistura de
diciandiamida, melamina e cloridrato de metformina para verificar a separação entre
os compostos (Figura 25).
99
Figura 25 – Cromatogramas de análise diciandiamida , melamina e cloridrato de
metformina (MTF) (20 µg/mL) nas condições cromatográficas citadas na Figura 24.
Fazendo uma comparação entre os perfis de absorção nos cromatogramas
das figuras 24 e 25 pode-se observar que umas das impurezas geradas (pico 1 da
figura 24) durante o processo de degradação em meio ácido exibe um perfil de
absorção semelhante à diciandiamida, com mesmo tempo de retenção (3,5 min),
sugerindo ser a mesma substância. Já os demais picos exibiram perfis diferentes.
Apesar do segundo pico da figura 24 apresentar tempos de retenção semelhante à
impureza melamina não parece tratar-se deste composto.
Neste método, houve uma boa separação entre as principais impurezas
conhecidas do cloridrato de metformina, bem como em relação aos produtos de
degradação desconhecidos, formados na condição de hidrólise ácida selecionada
para a especialidade farmacêutica. Foram analisadas também as demais
especialidades farmacêuticas degradadas em todas as condições de degradação
(ácido, base, neutra, oxido e fotolítica), a fim de comparar, neste método, o
percentual e o perfil de degradação das amostras, comprovando se o método é
indicativo da estabilidade do fármaco nas diferentes amostras.
Comparando o Cloridrato de metformina degradado em meio ácido e
analisados no cromatógrafos Shimadzu e Waters, nas mesmas condições
cromatográficas (Figura 26), foi possivel observar alterações nos tempos de
100
retenção, possivelmente provenientes dos equipamentos, O perfil cromatográfico
desta amostra analisada no método anterior (Figura 8b) apresentava 3 picos
adicionais enquanto a mesma amostra analisada com o método alternativo (Figura
26a), apresenta mais picos adicionais,porém, a resolução do pico do analito e suas
impurezas é adequada em ambos os equipamentos e métodos. As especialidades
farmacêuticas degradadas em meio ácido apresentaram perfil cromatográfico
semelhante, com menor intensidade de degradação, em relação ao fármaco, como
1
0
0
já havia sido observado anteriormente (Figuras 9b-11b).
8
0
100
a
m
A
U
4
0
6
0
80
2
0
0
-2
0
20
0
40
m
A
U
60
-20
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
Minutes
AU
0,030
b
0,020
0,010
0,000
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
Minutes
18,00
0,030
AU
22,00
24,00
26,00
28,00
18,376
0,040
20,00
30,00
c
0,020
0,010
0,000
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
Minutes
0,030
AU
18,00
20,00
22,00
24,00
26,00
28,00
18,452
2,00
30,00
d
0,020
0,010
0,000
2,00
4,00
Figura 26 -
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
Minutes
18,00
20,00
22,00
24,00
26,00
28,00
30,00
Cromatogramas de análise do Cloridrato de metformina e das
especialidades farmacêuticas submetidas a hidólise ácida (HCl 1 M 6 h refluxo), a 25
µg/mL: (a) Cloridrato de metformina (cromatógrafo Shimadzu); (b) Glifage®, (c)
Glucoformin®, (d) Genérico, nas condições cromatográficas citadas na Figura 24, no
cromatógrafo Waters.
18,212
101
AU
0,030
a
0,020
0,010
0,000
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
Minutes
0,030
AU
20,00
22,00
24,00
26,00
28,00
18,119
0,040
18,00
30,00
b
0,020
0,010
0,000
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
Minutes
0,030
AU
20,00
22,00
24,00
26,00
28,00
18,177
0,040
18,00
30,00
c
0,020
0,010
0,000
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
Minutes
18,00
20,00
22,00
24,00
26,00
28,00
30,00
d
Figura 27 - Cromatogramas de análise do Cloridrato de metformina e das
especialidades farmacêuticas submetidas a hidólise básica (NaOH 0,1 M 24 h T.A.),
a 25 µg/mL: (a) Cloridrato de metformina; (b) Glifage®, (c) Glucoformin®, (d)
Genérico, nas condições cromatográficas citadas na Figura 24, no cromatógrafo
Waters.
O perfil de degradação do fármaco após degradação básica (Figura 27a)
apresentou picos adicionais discretos diferindo da análise realizada com o método
baseado na Farmacopeia Britânica onde apresentou somente um pico adicional
mais evidente (Figura 8c). Já os comprimidos tratados sob mesma condição
102
apresentaram perfil semelhante entre si (Figura 27c-27d) e em relação à análise
anterior (Figuras 9c-11c), sem picos adicionais, somente com uma diminuição da
área do pico do analito. Provavelmente os produtos de degradação formados nesta
condição não absorvem no UV.
18,285
0,030
a
AU
0,020
0,010
0,000
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
Minutes
0,030
AU
18,00
20,00
22,00
24,00
26,00
28,00
30,00
b
1 8 ,3 5 9
2,00
0,020
0,010
0,000
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
Minutes
0,030
AU
18,00
20,00
22,00
24,00
26,00
28,00
18,416
2,00
30,00
c
0,020
0,010
0,000
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
Minutes
Figura 28 - Cromatogramas de análise das
18,00
20,00
22,00
24,00
26,00
28,00
30,00
especialidades farmacêuticas
submetidas a hidólise neutra (39 h refluxo), a 25 µg/mL: (a) Glifage®, (b)
Glucoformin®, (c) Genérico, nas condições cromatográficas citadas na Figura 24, no
cromatógrafo Waters.
As especialidades degradadas na condição neutra (Figura 28), demostraram
um perfil de degradação semelhante entre si, porém o Glifage® apresenta mais
picos adicionais (Figura 28a), semelhante ao perfil observado nesta mesma amostra,
com o método adaptado da Farmacopeia Britânica (Figura 9d), enquanto as outras
103
duas especialidades (28b e 28c) não apresentaram picos adicionais após o t0, de
modo similar ao observado no método anterior (Figuras 10d e 11d).
0,08
a
18,420
0,06
AU
0,04
0,02
0,00
-0,02
-0,04
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
Minutes
18,00
20,00
22,00
24,00
26,00
28,00
30,00
0,10
b
0,08
18,286
0,06
AU
0,04
0,02
0,00
-0,02
-0,04
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
Minutes
18,00
20,00
22,00
24,00
26,00
28,00
30,00
0,10
c
0,08
18,315
AU
0,06
0,04
0,02
0,00
-0,02
-0,04
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
Minutes
18,00
20,00
22,00
24,00
26,00
28,00
2,875
2,00
0,10
d
23,683
0,02
18,340
AU
7,459
0,04
10,836
0,06
9,963
8,250
0,08
30,00
0,00
-0,02
-0,04
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
Minutes
18,00
20,00
22,00
24,00
26,00
28,00
30,00
Figura 29 - Cromatogramas de análise do Cloridrato de metformina e das
especialidades farmacêuticas submetidos a oxidação (H2O2 48 h T. A.), a 25 µg/mL:
(a) Cloridrato de metformina; (b) Glifage®, (c) Glucoformin®, (d) Genérico,nas
condições cromatográficas citadas na Figura 24, no cromatógrafo Waters.
104
Todas as amostras degradadas, foram armazenadas em geladeira por 6
meses, e mesmo diluídas podem ter continuado a sofrer degradação em algumas
condições, evidenciada pelo aparecimento de mais picos, especialmente na amostra
sob oxidação (Figura 29) em relação à mesma amostra analisada anteriormente no
método adaptado da Farmacopeia Britânica (Figura 8e, 9e-11e). Houve o
aparecimento de 2 picos suplementares, sendo um com tempo de retenção superior
ao do analito nas amostras armazenadas. Porém, ambos os métodos apresentaram
boa resolução entre o analito e suas impurezas
18,347
0,050
AU
0,040
a
0,030
0,020
0,010
0,000
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
Minutes
18,00
20,00
22,00
24,00
26,00
28,00
18,378
2,00
b
AU
0,04
30,00
0,02
0,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
Minutes
18,00
20,00
22,00
24,00
26,00
28,00
18,378
2,00
c
AU
0,04
30,00
0,02
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
Minutes
18,00
20,00
22,00
24,00
26,00
28,00
30,00
Figura 30 - Cromatogramas de análise da comprimidos submetidos à Fotólise (3,5 h
exposição a luz UV), a 25 µg/mL: (a) Glifage®, (b) Glucoformin®, (d) Genérico, nas
condições cromatográficas citadas na Figura 24, no cromatógrafo Waters.
As
especialidades
farmacêuticas
apresentaram
semelhante
perfil
cromatográfico com um único pico adicional quando submetidos a fotólise (Figura
105
30). A mesma amostra recém preparada e analisada no método anterior não havia
apresentado picos adicionais (Figuras 9f-11f), podendo ter sofrido degradação
posterior durante armazenamento. O tempo de retenção deste pico é similar ao da
diciandiamida, com boa resolução em relação ao analito.
A fim de comparar as porcentagens de degradação das especialidades
farmacêuticas, foi analisada a área do pico do analito, em comparação do analito
recém preparado sob mesmas condições cromatográficas(Tabela 6).
As porcentagens de degradação obtidas em outro cromatografo (Waters),
utilizando o método de pareamento iônico, de modo geral,
ficaram superiores
aquelas anteriormente obtidas pelo método desenvolvido no LAPAM-UNIVALI,
possivelmente devido às alterações das amostras.
Tabela 6 - Comparação dos percentuais de degradação do cloridrato de metformina
e especialidades farmacêuticas e entre os métodos por CLAE
Condição de
degradação
Ácida
Básica
Amostra
Porcentagem média
de degradação
Reagente e
Tempo de
contato
Método Lapam
Porcentagem média
de degradação
Método pareamento
iônico
Cloridrato de
metformina
5,7
nd
HCl 1 M 6 h em
refluxo
Glifage
6,6
40,1
Glucoformin
16,1
27,9
Genérico
20,6
35,0
Cloridrato de
metformina
84,5
nd
Glifage
75,5
13,2
Glucoformin
53,5
9,8
Genérico
57,7
16,0
NaOH 0,1 M 24
h Temp
ambiente
106
Continuação Tabela 6
Neutra
Oxidante
Fotólise
Cloridrato de
metformina
89,0
nd
Glifage
84,9
48,4
Glucoformin
29,6
31,9
Genérico
55,6
31,2
Cloridrato de
metformina
72,1
nd
Glifage
27,1
72,3
Glucoformin
20,9
91,2
Genérico
20,9
78,9
Cloridrato de
metformina
28,1
nd
Glifage
11,4
3,0
Glucoformin
1,5
nd
Genérico
11,4
4,0
Água 39 h
refluxo
H2O2 32 % 48 h
temp ambiente
Água exposição
3h em câmara
UV 254 nm
nd =não determinado
Com base nos resultados obtidos, ambos os métodos são indicativos de
estabilidade, capazes de detectar compostos com absorção no UV nos
comprimentos de onda de 204 a 390nm (capacidade do detector tipo DAD), e que
mesmo na presença das impurezas os métodos são seletivos e propiciam o
doseamento do fármaco, podendo ser empregados no estudo de estabilidade das
especialidades farmacêuticas. Portanto, o método alternativo desenvolvido foi
submetido à validação analítica.
5.5 Validação do método de pareamento iônico por CLAE
Nos ensaios de linearidade realizados foram construídas duas curvas de
calibração,em dois dias diferentes, nos níveis de 5 – 20 µg/mL. Os dados foram
reunidos e plotados em um gráfico de dispersão (Figura 31).
107
4500000
4000000
3500000
3000000
2500000
2000000
1500000
1000000
500000
0
0
10
20
30
40
50
60
Figura 31 - Gráfico de linearidade do cloridrato de metformina por CLAE em
pareamento iônico com fase móvel heptanossulfonato de sódio 10 mM pH
3,0:acetonitrila:metanol (75:8:17 v/v), 1 mL/min fluxo e 30 ºC temperatura, detecção
em 210 nm, coluna C18 (Luna®, Phenomenex), no cromatógrafo Waters.
O método mostrou linearidade adequada na faixa de concentração testada,
apresentando a equação de reta y = 78070,61x -38313,4 e r = 0,9995, valor
aceitável de acordo com normas nacionais e internacionais (BRASIL, 2003, ICH,
2005). Na análise de regressão, os valores de Fcalculado (6061,6) e Fcrítico (6,6.10-9),
demonstram que a regressão linear foi significativa. A análise dos resíduos
demonstrou haver pouca dispersão e de forma aleatória em toda a faixa de
concentração estudada (dados não mostrados). O LD calculado baseado na
equação 1 foi de 1,47 µg/mL e o LQ de 4,90 µg/mL (equação 2), demonstrando a
sensibilidade do método.
No ensaio de exatidão a recuperação média do padrão nos níveis de
concentração 10, 20 e 30 µg/mL estão demonstrados na tabela 7.
108
Tabela 7 - Ensaio de exatidão do método por CLAE de pareamento iônico, por
análise de recuperação do padrão cloridrato de metformina
Nível de
concentração
Conc. padrão
adicionado
Conc. média
padrão recuperada
(µg/ml) ± (DP)
% de recuperação
médio ± (DP)
CV
(µg/ml)
Baixa
10,00
10,18 (0,22)
101,77 (2,02)
1,99
Média
20,00
20,18 (0,38)
100,88 (1,93)
1,91
Alta
30,00
30,82 (0,25)
102,76 (0,83)
0,86
101,78 (1,81)
1,78
Recuperação média (%)
DP = desvio padrão; CV = coeficiente de variação
Os dados acima demonstraram que o método apresenta exatidão adequada
com valores de recuperação média de 100 ± 2 % e o CV abaixo de 2 % (GREEN,
1996).
O método demonstrou-se seletivo, pois apresentou uma interferência de
0,88% na presença dos excipientes do comprimido, quando comparado com o
fármaco isolado, calculado de acordo com o descrito no item 4.7.3 (Seletividade).
Também foi evidenciado nos cromatogramas da mistura do analito com as
impurezas comerciais (Figura 26) e das amostras degradadas (Figuras 27-31), uma
boa separação das impurezas em relação ao pico principal referente ao cloridrato de
metformina e ainda pelo elevado índice de pureza do pico do analito estimado pelo
PDA (Tabela 2) nas amostras degradadas.
A precisão do método avaliada pela repetibilidade (intra-dia) e precisão
intermediária (inter-dias), analisando a amostra Glifage®, está demonstrados na
tabela 8.
109
Tabela 8 - Ensaio de Precisão do método por CLAE de pareamento iônico,
Precisão
Conc teórica
Conc prática
Teor
CV
(µ
µg/mL)
(µ
µg/mL)
(%)
10
10,03
99,78
2,68
20
19,83
99,13
1,26
30
30,00
100,00
2,46
10
10,11
101,01
2,40
20
19,78
98,91
1,40
30
29,67
98,90
1,66
10
9,73
97,31
3,83
20
19,65
98,25
1,23
30
29,40
98,00
1,20
99,66
2,28
1º dia
2º dia
3º dia
Teor Médio
CV = coeficiente de variação
Como pode ser observado as nas análises realizadas em três dias
consecutivos, demonstraram a precisão de método, apresentando um teor médio
dentro do preconizado (90 – 110 %) e um CV médio dentro do especificado de 5 %
tanto para repetibilidade quanto para precisão intermediária (BRASIL, 2003).
Na robustez foi analisado o efeito de pequenas variações de fluxo e
temperatura (± 1 %) do método na área, teor e tempo de retenção do fármaco nas
amostras, cujos resultados estão demonstrados na tabela 9.
110
Tabela 9 - Ensaio de robustez com variação de temperatura e fluxo da fase móvel
Parâmetro
Área (CV)
Tempo de retenção
Teor (CV)
(min) (CV)
Temperatura
(ºC)
29
1347528 (1,39)
18,04 (0,18)
100,31 (1,39)
30
1345413 (1,04)
17,87 (0,29)
100,16 (1,04)
31
1336971 (1,38)
17,30 (0,10)
99,53 (1,38)
CV
1,25
1,74
2,09
Fcal/Fcrit
0,63/3,68
8,18/3,68
653,16/3,68
0,9
1515592 (3,06)
17,87 (0,29)
100 (3,06)
1,0
1345413 (1,03)
21,43 (0,18)
100 (1,03)
1,1
1252330 (1,15)
16,99 (0,08)
100 (1,15)
CV
8,94
15,61
10,59
Fcal/Fcrit
125,66/3,68
389,38/3,68
22898,31/3,68
Fluxo (mL/min)
Nos dados de CV da robustez em todas as análises da variação de
temperatura os valores apresentados ficaram dentro do preconizado em até 5 %
(BRASIL, 2003).
O método demostrou ser robusto em relação à pequenas e deliberadas
alterações no fluxo (Tabela 9). Mesmo quando o Fcalc ficou superior ao Fcrit, o CV
ficou próximo de 2% para esta variação em todas os parâmetros cromatográficos
analisados. Por outro lado, o método de cromatografia de par iônico é
significativamente afetado pela temperatura, mesmo em pequenas alterações, como
mostrado pelo CV > 5% e Fcalc >> Fcrit (Tabela 9). Uma alteração na seletividade e no
espaçamento de bandas neste tipo de método são esperados já que dois ou mais
distintos processos contribuem para a retenção da amostra: troca iônica e/ou
111
processos de fase reversa, ionização do tampão e analito, e adsorção do reagente
de par iônico. Portanto, para a reprodutibilidade da separação neste tipo de método,
é importante termostatizar a coluna (Snyder; Kirkland; Glajch, 1997).
5.6 Citotoxicidade
Nas análises de citotoxicidade medindo a absorbância de cristais de
formazam dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO), todas as concentrações testadas
(0,1; 1; 10 e 100 µg/mL) apresentaram os mesmos resultados. Portanto, optou-se
por apresentar os resultados da absorção em UV da maior concentração (100
µg/mL) de fármaco degrado em condição ácida, básica, neutra, oxidante e fotólise
(Tabela 10).
Tabela 10 – Viabilidade celular em L929 do cloridrato de metformina antes e após as
diferentes condições de degradação
Amostra
Absorbância
Viabilidade (%) (CV %)
Ácida
1,083
91,52 (14,95)
Básica
1,099
92,90 (10,99)
Neutra
1,096
92,59 (16,38)
Oxidante
1,210
102,25 (13,89)
Fotólise
1,034
87,41 (12,73)
Cloridrato de metformina
1,006
85,05 (9,03)
Controle +
0,096
7,45 (2,14)
Controle -
1,183
100,00 (0,11)
controle negativo = tampão fosfato ; controle positivo = Triton X 100®
O controle positivo (detergente Triton X 100®) conforme esperado, reduziu
drasticamente o percentual de viabilidade celular (7 %), enquanto que o cloridrato de
metformina e seus produtos de degradação, submetidas às diferentes condições de
degradação, não afetaram significativamente a viabilidade celular. Não houve
diferença destas amostras e do controle negativo tampão fosfato em que a
viabilidade celular ficou em 100 %, indicando ausência de citotoxicidade (Tabela 10).
112
Para evidenciar o resultado apresentado, foi realizada a microscopia óptica
para análise da morfologia celular e vitalidade celular conforme figura 32.
Figura 32- Análise microscópica celular. a - células coradas com brometo de etídio e
diacetato de fluorisceína. b - células sem corante. c - células coradas com corante
Giemsa. 1 - condição ácida, 2 - condição básica, 3 - condição neutra, 4 - condição
oxidante, 5 - Fotólise, 6 – Metformina padrão, 7 – Controle positivo (Triton X100®), 8
- Controle negativo (tampão PBS).
Com base em todos os testes realizados pode-se concluir que nenhuma das
condições de degradação aplicadas à amostra de metformina apresentou toxicidade
celular, e quando comparado com o controle negativo observou-se que as células
mantém seu formato original e núcleo integro (Figura 32).
Se o controle positivo for analisado observa-se que as células estão em
pequena quantidade, o formato está diferenciado, e a microscopia invertida de
fluorescência demonstrou que as células já não mais apresentam o núcleo bem
delimitado confirmando a toxicidade do mesmo.
O ensaio foi repetido com as especialidades farmacêuticas degradadas na
condição ácida e os resultados estão expostos na figura 33.
113
a
b
Figura 33 – a) Gráfico de viabilidade celular na análise de citotoxicidade dos
produtos de degradação das especialidades farmacêuticas submetida a degradação
ácida; b) Análise microcópica ds células coradas com diacetato de fluorisceina e
brometo de etídio 1:100, onde: A) Glifage® degradada em meio ácido, B)
Glucoformin® degradada em meio ácido, C) Genérico degradada em meio ácido, D)
Controle negativo tampao PBS e E) controle positivo Triton X 100®.
As amostras foram analisadas em quatro níveis de concentração. No entanto
foram apresentadas apenas os resultados obtidos na concentração de 100 µg/mL
devido ao fato de nenhuma das amostras degradadas apresentarem citotoxicidade,
pois a viabilidade celular foi muito próxima aos valores obtidos pelo controle
negativo. Na análise de microscopia de fluorescência invertida observou-se que as
células mantiveram-se íntegras,e com citoplasma bem delimitado, evidenciando a
ausência de dano celular (Figura 33).
Muitos estudos acerca da toxicidade da melamina estão relatados, pois é uma
substância que apresenta perigo se ingerida, inalada ou absorvida pela pele, além
de ser uma substância comprovadamente cancerígena. Faz parte da composição de
plásticos e pode ser liberada pelo aquecimento deste em contato com os alimentos
114
(BRADLEY, 2009; EFSA, 2010). A dose letal estipulada (DL 50) é de mais de 3 kg
de peso corporal. A ingestão diária total (TDI), segundo a European Food Safety
Authority (EFSA), é de 0,2 mg/kg (EFSA, 2010).
A melamina sozinha não apresenta tanto risco em nível sistêmico, mas é
capaz de se associar com outras substâncias formando complexos, como, por
exemplo, com o ácido úrico, formando cristais que podem causar danos renais
(EFSA, 2010).
Um estudo com alimentos de origem animal foi realizado com a melamina e
um análogo, o ácido cianúrico. Isolados, nenhuma destas substâncias apresentaram
toxicidade, porém, em associação, que ocorre em alimentos como o leite em pó e
rações animais, pode formar complexos e causar o dano renal (PUSCHNER et al.,
2007).
Estudos em ratos demonstram que a cianoguanidina (diciandiamida) também
apresenta efeito toxico quando administrada, com aumento da uréia sérica,
migração de eosinófilos para epitélio tubular renal, concluindo que num nível de 10%
na dieta é inequivocadamente tóxico (MATSUSHIMA et al., 1991). Segundo a
resolução que regulamenta a fabricação de recipientes plásticos, a cianoguanidina
faz parte da lista positiva para utilização como reticulante para fabricação de
elastômeros (BRASIL, 2001).
Os resultados apresentados nos ensaios de citotoxicidade sugerem que os
produtos gerados durante o processo de degradação provavelmente não se referem
à melamina, evidenciados pelos cromatogramas anteriormente apresentados
(Figuras 25 e 26) onde nenhum dos espectros de absorção se iguala ao desta
substância. A diciandiamida, se presente, parece estar em concentrações abaixo do
considerado tóxico no modelo utilizado. Nos níveis de concentração presente nas
amostras degradadas, os produtos de degradação não apresentaram citotoxicidade,
sendo portanto, qualificados nas amostras estudadas.
115
6 CONCLUSÃO
As condições de degradação forçada selecionadas para o cloridrato de
metformina, que proporcionaram o aparecimento de picos suplementares nos
cromatogramas foram: 6 h em refluxo, com HCl 1 M (condição ácida); 24 h em
agitação à temperatura ambiente, com NaOH 0,1 M (condição básica); 48 h em
agitação à temperatura ambiente, com H2O2 32 % (condição oxidante); 39 h sob
refluxo com água ultrapura (condição neutra) e 3,5 h de exposição em câmara de
UV, comprimento de onda 254 nm (fotólise);
Os métodos alternativos utilizados na tentativa de isolamentos das
substancias geradas durante o processo de degradação não foram suficientes para
isolar e identificar as impurezas, necessitando de metodologias complementares;
O método por CLAE adaptado da Farmacopeia Britânica (2008) mostrou ser
indicativo da estabilidade do cloridrato de metformina, com boa resolução entre o
fármaco e seus produtos de degradação que absorvem no UV;
Foi desenvolvido com sucesso um método por CLAE, baseado em
pareamento iônico, o qual é indicativo de estabilidade do fármaco, com linearidade
na faixa de 5 - 50 µg/mL (r > 0,999), com LD e LQ de 1,47 e 4,90 µg/mL,
respectivamente, com boa exatidão (recuperação de 100 ± 2,0%) e precisão (CV <
3,0% nos ensaios intra-dia e inter-dias), com boa seletividade (resolução adequado
do pico do analito em relação às impurezas comercias e aos produtos de
degradação gerados nas amostras e elevado índice de pureza do pico do analito
pelo PDA) e indicativo da estabilidade do fármaco. O método apresentou ser robusto
frente à pequenas variações no fluxo da fase móvel, porém, a temperatura deve ser
monitorada para a reprodutibilidade da separação. Portanto o método foi
considerado validado.
As especialidades farmacêuticas apresentaram perfis de degradação
semelhantes ao do fármaco isolado, porém com menor intensidade, provavelmente
devido ao efeito protetor dos excipientes;
A oxidação das especialidades farmacêuticas foi a condição de degradação
que proporcionou o aparecimento de mais picos suplementares nos cromatograma,
pelo método de pareamento iônico;
116
Os compostos gerados durante a degradação do fármaco nas diferentes
condições de degradação e das especialidades após degradação em meio ácido,
não apresentaram citotoxicidade in vitro frente às células L 929.
117
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