uso do elisa no sorodiagnóstico e detecção de focos da leucose

XIII JORNADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO – JEPEX 2013 – UFRPE: Recife, 09 a 13 de dezembro.
USO DO ELISA NO SORODIAGNÓSTICO E DETECÇÃO DE
FOCOS DA LEUCOSE ENZOÓTICA BOVINA EM REBANHOS
DO ESTADO DE PERNAMBUCO
Jéssica Martins de Andrade1, Artur Cezar de Carvalho Fernandes2, Luiz Carlos Fontes Baptista Filho², Tamyres Izarelly
Barbosa da Silva², Roniery Carlos Gonçalves Galindo², Lidiane Guabiraba e Silva², Lúcio Esmeraldo Honório de Melo³

Introdução
A Leucose Enzoótica Bovina (LEB) é uma doença transmissível, cosmopolita, que caracteriza-se pela sua evolução
crônica e de impacto socioeconômico internacional, sendo anual a notificação de sua ocorrência prevista nas normas
zoosanitárias internacionais por comprometer o desempenho produtivo dos rebanhos, estabelecer sucessivas
condenações de carcaças em matadouros, restringir o comércio de animais e aumentar os custos com serviços
veterinários (OIE, 2008). É causada por um retrovírus exógeno linfotrópico B, o vírus da leucose bovina (VLB) , que
compromete primariamente o sistema linfóide do bovino infectado, responsável pelo surgimento de processos
desorganizativos dos seus tecidos e órgãos, principalmente linfonodos, os quais pedem suas características primárias e
são gradativamente substituídos por um novo tecido, de natureza neoplásica, formador de linfossarcomas, podendo
haver ou não leucemização (JAIN, 1993; MATSUOKA & JEANG, 2007).
Na cadeia epidemiológica da LEB, tanto a infecção quanto a doença representam o mesmo risco, assim os animais
portadores do VLB, além de fonte natural, são agentes de alta infecciosidade e precursores da gênese da leucose
enzoótica em uma população de bovinos (BIRGEL et al., 1982). Observa-se uma maior disseminação do VLB entre os
bovinos de exploração leiteira, em relação aos destinados à produção de carne. Esse fato pode ser associado a uma
maior susceptibilidade dos bovinos leiteiros a infecção pelo VLB devido às variações de manejo e a maior permanência
dos animais nos rebanhos (LORENZ, 1987).
Para o diagnóstico sorológico da LEB, os principais testes recomendados são a imunodífusão em gel de ágar (IDGA)
e o Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay (ELISA) (MILLER & VAN DER MAATEN, 1977; EL-HAFEIZ, 2010).
A imunodifusão em gel ágar é uma técnica da rotina laboratorial capaz de identificar bovinos portadores de
anticorpos séricos específicos anti-VLB, através de uma alta especificidade e adequada sensibilidade. Além de sua
grande praticidade e baixo custo de realização. A partir do ano de 1980, a utilização a IDGA tornou-se obrigatória para
a importação e exportação de gado, pois foi adotada como teste oficial de diagnóstico da LEB pela Comunidade
Econômica Européia (MILLER & VAN DER MAATEN, 1977; EVERMANN et al., 1987; MAMMERICKX, 1987).
O ELISA vem se destacando no diagnóstico da LEB, pois apresenta alguns benefícios significativos como a obtenção
de um resultado mais rápido e a possibilidade de utilizar pools contendo, cada um, no máximo dez amostras diferentes.
Ainda é possível a aplicação eficiente do teste em condições onde haja uma baixa concentração de títulos de anticorpos
(BRENNER et al., 1994; OIE, 2008; EL-HAFEIZ, 2010).
Material e métodos
Foi realizada a colheita de sangue de 389 bovinos leiteiros provenientes de 13 rebanhos do estado de Pernambuco,
selecionados por conveniência, com base em estudo não probabilístico (MAROTTI et al., 2008).
Devido a razões técnicas, apenas 327 foram submetidas à IDGA e por necessidade de padronizar pools com 10
amostras pertencentes a um mesmo rebanho, para essa etapa utilizou-se 360 amostras, constituindo assim 36 pools. As
amostras foram processadas e analisadas no Laboratório Clínico de Animais de Produção (LACAP) da UFRPE.
Na realização do teste imunoenzimático, utilizou-se o kit ELISA CHEKIT-Leucose-serum produzido pelo laboratório
IDEXX®. O protocolo seguido foi o mesmo recomendado pelo fabricante.
Foi realizada utilizando a técnica da Imunodifusão Radial Dupla de Ouchterlony (MILLER & VAN DER MAATEN,
1977; BIRGEL et al., 1982).
Para selecionar as 10 amostras de cada pool, realizou-se um sorteio aleatório, utilizando-se o programa Microsoft
Office Excel 2007®, no entanto cada grupo foi constituído por amostras de animais provenientes de um mesmo rebanho.
As análises estatísticas foram baseadas na avaliação de testes de diagnóstico para a obtenção da sensibilidade e da
especificidade do ELISA, considerando-se a imunodifusão como “padrão ouro” e também avaliando a sensibilidade e
especificidade do ELISA em relação aos pools amostrais.
1
Primeiro Autor é Discente de Graduação do Curso de Medicina Veterinária da Universidade Federal Rural de Pernambuco. Rua Dom Manoel de
Medeiros, s/n, Dois Irmãos, Recife, PE, CEP 52171-900. E-mail: [email protected]
2
Segundo Autor é Discente do Programa de Pós-Graduação em Ciência Veterináriada da Universidade Federal Rural de Pernambuco. Rua Dom
Manoel de Medeiros, s/n, Dois Irmãos, Recife, PE, CEP 52171-900.
4
Terceiro Autor é Professor Doutor Associado do Departamento de Medicina Veterinária da Universidade Federal Rural de Pernambuco. Rua
Dom Manoel de Medeiros, s/n, Dois Irmãos, Recife, PE, CEP 52171-900.
XIII JORNADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO – JEPEX 2013 – UFRPE: Recife, 09 a 13 de dezembro.
Resultados e Discussão
Na etapa inicial, foram testadas 327 amostras das 389 obtidas em 13 rebanhos do estado de Pernambuco, destas 19
apresentaram resultados inconclusivos na IDGA e seis para o ELISA. Foram excluídas das análises os resultados
inconclusivos, então foram avaliados as demais 302 amostras com resultados positivos ou negativos.
Com relação ao ELISA, 45% das amostras resultaram positivas (136/302), enquanto que na IDGA foram observados
24,2% de amostras positivas (73/302). Das 73 amostras consideradas positivas à IDGA, apenas uma não foi detectada
também pelo ELISA. Observou-se uma discordância ainda em 64 amostras que resultaram positivas ao ELISA que não
foram detectadas pela IDGA (tabela 1).
A alta incidência de bovinos positivos no ELISA e negativos na IDGA, possivelmente está associada ao fato do teste
imunoenzimático ser capaz de detectar animais positivos para o VLB mesmo quando há uma baixa concentração de
anticorpos, devido a sua elevada sensibilidade a qual tem se destacado em alguns trabalhos (BRENNER et al., 1994;
EL-HAFEIZ et al., 2010; TRONO, 2001). Esses títulos baixos de anticorpos estão presentes, por exemplo, em
infecções recentes e em vacas no período próximo ao parto (FLORES et al., 1989). Essa menor habilidade da IDGA
gera uma restrição quanto à aplicação do teste em programas de controle do VLB, pois a permanência dos animais já
infectados que não são detectados como positivos (falso-negativos) gera um risco aos demais animais hígidos (FLORES
et al., 1989).
Avaliando-se o ELISA através da IDGA, técnica consolidada e considerada como “padrão ouro”, constatou-se uma
sensibilidade de 98,6% e uma especificidade de 72% (tabela 2). Apesar da IDGA ser um método amplamente utilizado
pela sua adequada sensibilidade, praticidade, custo de realização reduzido e não requerer equipamentos laboratoriais de
alta tecnologia, há um interesse de se buscar de uma maior sensibilidade e resultados mais rápidos e de maior precisão.
Nesse contexo, o ELISA vem se destacando com valores de sensibilidade e especificidade satisfatórios.
Além da análise inicial das amostras individualmente, em um segundo momento testou-se a funcionalidade da
formação de grupos amostrais, denominados pools, nos rebanhos estudados, com a finalidade de identificar possíveis
focos da LEB em algumas regiões do estado de Pernambuco. Para esta etapa foram utilizadas 360, dentre as 389
amostras de animais provenientes dos 13 rebanhos do estado de Pernambuco, constituindo 36 pools, onde 29
apresentaram resultados positivos e apenas sete resultados negativos.
Para calcular a especificidade e sensibilidade da técnica por pools foram considerados positivos os pools com ao
menos uma amostra positiva ao ELISA (Tabela 3). Ao se realizar uma análise dos pools através dos resultados
apresentados pelas amostras individualmente no teste imunoenzimático, foi identificada uma sensibilidade de 93,5% e
uma especificidade de 100% (Tabela 4).
A partir dos valores favoráveis obtidos, pode-se considerar bastante satisfatória a aplicabilidade do ELISA para LEB
em pools contendo 10 amostras em estágios mais avançados em um programa de controle ou erradicação da LEB, onde
a prevalência da doença apresenta valores muito baixos, destacando-se assim como uma opção economicamente mais
viável e de curto período de execução. Nesse contexto, a realização do ELISA em amostras individuais é recomendada
quando são identificados pools positivos, sendo necessário apenas testar individualmente as que constituem os pools
com resultado positivo.
Dos 36 pools testados, apenas dois que apresentaram resultado negativo possuíam uma amostra positiva em um e
duas positivas em outro. Essa discordância entre os resultados das amostras individualmente e dos pools pode estar
associado a um baixo título de anticorpos presentes em cada amostra, dificultando assim a detecção das mesmas durante
a realização do teste em pools, no entanto ainda é de grande relevância a utilização da técnica visando uma obtenção
mais rápida e eficiente dos resultados.
Agradecimentos
Agradeço ao meu orientador e a todos os integrantes do grupo de pesquisa, o qual participo, pelo apoio e a atenção
constantes. Agradeço também ao CNPq pelo incentivo financeiro às pequisas realizadas.
Referências
BIRGEL, E. H.; BENESI, F. J.; D'ANGELINO, J. L.; HAGIWARA, M. K. Características leucométricas do sangue de
bovinos de rebanhos acometidos por leucose enzoótico dos bovinos adultos. In: Semana de Veterinária da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, 1, Campinas, 1982, p.73
BRENNER, J.; MOSS, S.; MOALEM, U. A comparative study of the Elisa and AGID techniques for the detection of
bovine leucosis virus antibodies in bovine serum and milk. Israel J. Vet. Med., 1994, v. 49, n. 4, p. 165-167.
EL-HAFEIZ, Y.G.M; METIAS, K.N; ABRAHIM, I.G.A. Comparative Serological Detection of Enzootic Bovine
Leukosis Virus (EBLV) in cattle sera. Global Veterinaria, 2010, v. 4 (3); p. 267-270.
EVERMANN, J. F.; DIGIACOMO, R. F.; HOPKINS, S. G. Bovine leukosis virus: understanding viral transmission and
the methods of control. Veterinary Medicine, 1987, v. 82, p.1051-8.
XIII JORNADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO – JEPEX 2013 – UFRPE: Recife, 09 a 13 de dezembro.
FLORES, E. F.; WEIBLEN, R.; PEREIRA, N. M.; PORTOLANN, J. A. B.; SANCHEZ, C. M.; SOARES, M. R. L.
Utilização da Imunodifusão em gel ágar (IDGA) no controle da infecção pelo vírus da leucose bovina (VLB). Revista
Centro de Ciências Rurais, 1989, v. 19, p. 169-176.
JAIN, N. C. Essentials of Veterinary Hematology. Lea & Febiger. Philadelphia, 1993, 348p.
LORENZ, R. J.; STRAUB, O. C. The epidemiology of enzootic bovine leukosis. In:. ed. Enzootic bovine leukosis and
bovine leukemia virus. Boston, Martinus Nijhoff, 1987, p.51-68.
MAMMERICKX, M. The immunodifusion tests for the detecion of bovine leukemia virus infected animais. In:
Enzootic bovine leukosis and bovine leukemia virus. Boston, Martinus Nijhoff, 1987, p.195-200.
MAROTTI, J.; GALHARDO, A. P. M.; FURUYAMA, R. J.; PIGOZZO, M. N.; CAMPOS, T. N. & LAGANÁ, D. C.
Amostragem em pesquisa clínica: Tamanho da amostra. Revista de Odontologia da USP, 2008, v. 20, n.2, p.186-194.
MATSUOKA, M.; JEANG, K.T. Human T-cell leukaemia virus type 1 (HTLV-1) infectivity and cellular
transformation. Nat. Rev. Cancer, 2007, v. 7, p. 270-280.
MILLER, J. M.; VAN DER MAATEN, M. J. Use of glycoprotein antigen in the imunodiffusion test for bovine
leukemia virus antibodies. European Journal of Cancer, 1977, v. 13, p. 1369-1375.
OIE (WORLD ORGANIZATION FOR ANIMAL HEALTH). Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial
Animals (mammals, birds and bees). Sixth Edition, 2008
Tabela 1.
Comparativo dos resultados da IDGA e da ELISA.
IDGA
Positivo
Negativo
ELISA
Total
Positivo
72
64
136
Negativo
1
165
166
TOTAL
73
229
302
Tabela 2.
Sensibilidade e especificidade do ELISA.
Sensibilidade (%)
Especificidade (%)
98,6
72
ELISA
Tabela 3. Comparativo
dos resultados das amostras individuais e em pools.
ELISA
Positivo
Negativo
Pools
Positivo
29
0
29
Negativo
2
5
7
Total
31
5
36
Tabela 4.
Pools
Total
Sensibilidade e especificidade dos pools.
Sensibilidade (%)
Especificidade (%)
93,5
100