resultados preliminares Taís Andrade DIAS

PROTOCOLO PARA INDUÇÃO EXPERIMENTAL DE DIBETES MELLITUS POR
ALOXANA EM RATAS – resultados preliminares
Taís Andrade DIAS1, Neusa Margarida PAULO2, Kênnia Rocha REZENDE3, Luiz
Augusto de SOUZA4, Fernanda Figueiredo MENDES1, Danilo Ferreira
RODRIGUES4
1
Mestranda, Escola de Veterinária e Zootecnia – UFG, [email protected]
Professora Doutora, Escola de Veterinária e Zootecnia – UFG
3
Professora Doutora, Faculdade de Farmácia – UFG
4
Doutorando, Escola de Veterinária e Zootecnia – UFG
2
Palavras chave: pâncreas, glicemia, modelo experimental
INTRODUÇÃO
O diabetes mellitus é uma doença crônica sistêmica decorrente de uma
deficiência relativa ou absoluta de insulina, que compromete o metabolismo de
carboidratos, gorduras e proteínas. Esse comprometimento metabólico é causado
pela hiperglicemia resultante da ausência de secreção de insulina ou da resistência
a sua ação nos tecidos (PÖPPL & GAONZÁLEZ, 2005; PINTO et al., 2009).
Nas últimas décadas, devido ao aumento de sua prevalência, morbidade
e mortalidade, o diabetes mellitus tem se tornado um sério problema de saúde
pública (RATHMANN & GIANI, 2004). Esta enfermidade está entre as dez maiores
causas de mortalidade no Brasil (COBAS & GOMES, 2010) e de acordo com a
Organização Mundial de Saúde (OMS), ainda neste século serão 11 milhões de
indivíduos diabéticos no país e, até 2030, 366 milhões no mundo (TORQUATO et
al., 2000; RATHMANN & GIANI, 2004).
Diversas complicações estão relacionadas com a presença do diabetes,
entre elas a nefropatia, cegueira, aterosclerose, doença cardiovascular, trombose,
infartos e amputações de membros, sendo a doença uma das principais causas de
incapacitação física para o trabalho (LERCO et al., 2003).
Desta forma, estudos básicos são importantes para a compreensão dos
mecanismos fisiopatológicos do diabetes, bem como, para sua prevenção e
tratamento. Modelos experimentais que possam determinar de maneira controlada o
papel de cada um dos componentes envolvidos na patogenia da doença, fornecendo
subsídios para sua melhor compreensão, são indispensáveis para tais estudos
(CESARETTI & KOHLMANN, 2006).
A indução química do diabetes em animais tem sido amplamente
empregada nos estudos das complicações causadas pela doença. Vários agentes
químicos são citotóxicos para as células β do pâncreas, porém apenas a aloxana e a
estreptozotocina (STZ) tem sido sistematicamente investigadas e amplamente
empregadas para induzir diabetes nos animais (RODRÍGUEZ & MÉNDEZ, 1994).
A aloxana é uma pirimidina com estrutura semelhante ao ácido úrico e a
glicose. Possui propriedades diabetogênicas com ação seletiva e destrutiva sobre as
células β pancreáticas. A indução ao diabetes mellitus em animais experimentais,
está relacionada à formação de radicais superóxido e hidroxila que são
especificamente tóxicos para tais células, levando à degeneração e morte definitiva
das mesmas. Outros experimentos sugerem que a inibição da secreção de insulina
por aloxana é causada por sua interferência com as proteínas citoplasmáticas que
contêm sulfidril e dissulfide (LIMA et al., 2001).
Apesar de sua ampla utilização, os protocolos de indução diabética por
aloxana ainda não estão totalmente elucidados e estabelecidos, havendo ainda
algumas controvérsias a serem esclarecidas. Neste contexto, o presente estudo tem
por objetivo padronizar um protocolo de indução experimental do diabetes mellitus
em ratas.
MATERIAL E MÉTODOS
Até o momento foram utilizados 18 ratos da linhagem Wistar, fêmeas,
adultas, com peso corporal inicial variando entre 160-200g, fornecidas pelo Biotério
da Universidade Federal de Goiás. Os animais foram alojados em gaiolas coletivas
contendo três indivíduos cada, receberam alimentação específica para espécie e
água potável à vontade, sendo submetidos a período de adaptação de 10 dias.
Para indução química do diabetes, os animais foram mantidos em jejum
sólido por 24 horas. Após este período realizou-se a pesagem e dosagem da
glicemia de cada indivíduo na pré-indução. Os níveis de glicose foram monitorados
por meio de glicosímetro comercial OneTouch Ultra (Johnson & Johnson ®).
A solução de aloxana monoidratada (Sigma-Aldrich Inc, St Louis, MO,
USA) foi preparada minutos antes da aplicação por meio da diluição do fármaco em
solução salina 0,9%, em uma concentração de 60mg/mL. O preparo da solução foi
realizado em ambiente escuro, utilizando frasco âmbar envolvido por papel alumínio
para evitar contato da luz, visto que o composto é fotossensível. Além disso, após a
diluição, o frasco foi mantido refrigerado até o momento da aplicação. Os animais
receberam única dose de 120mg/kg de aloxana via intraperitoneal. Uma hora e meia
depois, a alimentação foi reintroduzida aos animais.
Dez dias após a indução, os animais foram submetidos a 8 horas de jejum
sólido e reavaliados quanto ao peso e nível glicêmico. Aqueles que obtiveram
glicemia superior a 200mg/dL foram considerados diabéticos. Os animais que não
obtiveram este índice foram novamente submetidos ao protocolo de indução. Os
indivíduos diabéticos foram pesados e tiveram seus níveis de glicemia aferidos
semanalmente durante 21 dias.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Dos 18 animais submetidos à indução química do diabetes, 11 (61,2%)
obtiveram glicemias superiores à 200mg/dL e foram considerados severamente
diabéticos, visto que os níveis de glicose sanguínea considerados normais para a
espécie variam entre 50 à 135mg/dL (HARKNESS & WAGNER, 1993). Dentre os
animais diabéticos, quatro (36,4%) necessitaram de duas tentativas de indução para
confirmação da doença. Os índices de sucesso na indução do diabetes por aloxana
em ratos variam nos diferentes estudos. CARVALHO et al. (2003), LERCO et al.
(2003) e DINIZ (2007) obtiveram cerca de 40% de ratos diabéticos após aplicação
de aloxana utilizando diferentes protocolos, porém não relataram a necessidade de
repetição do protocolo. Desta forma, o protocolo utilizado se mostra de acordo com a
literatura consultada.
Além disso, a literatura menciona índices variados de mortalidade dos
animais após a indução diabética. Múltiplos fatores capazes de mudar os efeitos da
droga e a sensibilidade do hospedeiro podem estar ligados à morte dos animais,
como: estado de hidratação da droga, velocidade de infusão, via de administração,
dieta, tempo de jejum, peso do animal, entre outros (LERCO et al., 2003). Até o
momento nenhum óbito foi registrado no presente estudo.
Como esperado foi observado aumento progressivo dos níveis de glicose
sanguínea e perda significativa do peso corporal dos animais (Tabela 1) durante o
período experimental, caracterizando o quadro diabético grave e permanente
provocado pela aloxana.
Tabela 1: Médias e desvios padrões do nível de glicemia sanguínea em jejum e peso de 18
ratas Wistar no pré e pós indução química do diabetes mellitus por aloxana nos diferentes
períodos experimentais.
PréConfirmação
7 dias
14 dias
21 dias
indução
Glicemia em jejum
(mg/dL)
88,7±27,2
441,8±65,2
467,2±48,6
498,9±36,3
527,6±31,6
Peso (g)
176,4±17
157,3±13,4
149,1±17,5
149,2±19,5
165,6±22,5
Outros sinais clínicos associados ao diabetes mellitus também foram
observados
como
polifagia,
polidipsia,
poliúria,
apatia,
desidratação
e
comprometimento progressivo e acentuado do estado geral dos animais. Esta
sintomatologia é causada pela severidade do diabetes mellitus provocado pela
aloxana e também pela ausência de tratamento e controle dos níveis glicêmicos.
Pesquisadores que trabalham com a indução química do diabetes mellitus por meio
da aloxana são unanimes em relatar o surgimento e a permanência destes sinais em
todos os trabalhos consultados (CARVALHO et al., 2003; LERCO et al., 2003;
DINIZ, 2007; DUARTE et al., 2010; LEME et al., 2010), confirmando a eficácia do
protocolo proposto.
CONCLUSÕES
Até o momento, o protocolo proposto para indução experimental do
diabetes mellitus utilizando aloxana se mostrou eficaz. Todos os sinais clínicos e
laboratoriais esperados foram encontrados e permaneceram durante todo o tempo
de avaliação, caracterizando um quadro severo e progressivo da doença. Além
disso, não houve nenhum registro de óbito até o momento sugerindo metodologia
mais segura.
AGRADECIMENTOS
À Profª. Dra. Adriana Augusto de Rezende e ao Doutorando Raul
Hernandes Bortolin da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte pela grande contribuição.
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