Identificação e função de genes salivares e intestinais durante o

Universidade Federal de Minas Gerais
Instituto de Ciências Biológicas
Departamento de Parasitologia
Tese de doutorado
Caracterização de atividades salivares e intestinais relacionadas ao
processo alimentar de Triatoma infestans Klug, 1834 (Hemiptera:
Reduviidae) sobre hospedeiros invertebrados e vertebrados
Ceres Luciana Alves
Orientador:
Marcos Horácio Pereira
Co-orientadores:
Nelder de Figueiredo Gontijo
Ricardo Nascimento Araujo
Belo Horizonte, MG
2011
Ceres Luciana Alves
Caracterização de atividades salivares e intestinais relacionadas ao
processo alimentar de Triatoma infestans Klug, 1834 (Hemiptera:
Reduviidae) sobre hospedeiros invertebrados e vertebrados
Tese de doutorado apresentada ao programa de Pósgraduação em Parasitologia do Instituto de Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais,
como requisito parcial à obtenção do título de Doutor
em Parasitologia.
Área de Concentração Entomologia
Orientador:
Marcos Horácio Pereira
Co-orientadores:
Nelder de Figueiredo Gontijo
Ricardo Nascimento Araujo
Belo Horizonte, MG
2011
Alves, Ceres Luciana
Caracterização de atividades salivares e intestinais relacionadas ao
processo alimentar de Triatoma infestans Klug, 1834 (Hemipetera :
Reduviidae) sobre hospedeiros invertebrados e vertebrados.
[manuscrito] / Ceres Luciana Alves. - 2011
108f. : il. ; 29,5 cm.
Orientador: Marcos Horácio Pereira. Co-orientadores: Nelder de
Figueiredo Gontijo, Ricardo Nascimento Araujo.
Tese (doutorado) – Universidade Federal de Minas Gerais,
Instituto de Ciências Biológicas.
1. Hemolinfagia. 2.Triatoma infestans. 3. Triatominae 4.
Hematofagia. 5. Saliva - Teses. 6. Inseto - Intestino médio - Teses. I.
Pereira, Marcos Horácio. II. Gontijo, Nelder de Figueiredo III. Araújo,
Ricardo Nascimento. IV. Universidade Federal de Minas Gerais.
Instituto de Cências Biológicas. III. Título.
CDU: 595.75
Aos meus pais e irmãos
pelo amor, incentivo,
apoio e compreensão
Agradecimentos
Agradeço à Deus por estar sempre presente na minha vida, e tornar tudo possível.
À minha família, que me apoiou, durante todas as etapas da minha vida, minha mãe
Zoraide, meu pai Benedito, meu irmão Hertz, minha irmã Geisa e a Daniele minha
Cunhada. Muito obrigada por todo amor, carinho e compreensão. Obrigada também por
sonhar junto comigo, e por sempre me apoiar. Sem vocês tantos outros sonhos não
seriam possíveis, muito obrigada!!!
Ao meu orientador, o Professor Dr. Marcos Horácio Pereira muito obrigada pela
oportunidade de fazer parte da equipe do Laboratório de Fisiologia de Insetos
Hematófagos (LFIH), pela orientação e acompanhamento desde a iniciação científica,
pelo aprendizado constante ao longo desses anos, enfim, obrigada mesmo por tudo...
Ao meu co-orientador, o Professor Dr. Nelder de Figueiredo Gontijo também pela
orientação e acompanhamento desde a iniciação científica, pelas valiosas discussões e
disposição para ajudar sempre.
Ao meu co-orientador, o Professor Dr. Ricardo Nascimento Araújo muitíssimo obrigada
pela constante orientação, paciência, confiança, disposição para me ajudar nos
experimentos e por toda a dedicação ao longo dos últimos anos...
Ao César Nonato, técnico do LFIH, muito obrigada pela amizade, ajuda cotidiana,
profissionalismo e excelente convivência ao longo de todos esses anos.
À Dra. Vânia Cristina dos Santos, pós-doutoranda do LFIH e MINHA AMIGA, que me
indicou para fazer parte da equipe do LFIH e tornou possível que eu chegasse até aqui.
Muito obrigada pela constante e incondicional ajuda, amizade e ouvidoria, além da
excelente convivência cotidiana.
À Dra. Adriana Coelho Soares, pós-doutoranda do LFIH, obrigada pela amizade, ajuda
cotidiana, paciência e excelente convivência.
À Rafaela M. M. Paim, doutoranda do LFIH, muito obrigada por todas as consultorias,
pela paciência, amizade, excelente convivência e ajuda cotidiana.
Ao Vladimir Fazito do Vale, doutorando do LFIH, obrigada pela amizade, ajuda
cotidiana, excelente convivência.
Aos "outros", também amigos do LFIH que representam a "nova geração": Alexandre,
Luciana, Antônio, Kléber, Cássio, Kolyvan, Dimitri, Rafaello e Gabriel, obrigada pela
ajuda, por serem pessoas tão especiais, que propiciam um ambiente de trabalho
agradabilíssimo.
Aos "ex" integrantes do LFIH: Luciane, Isabella, Adriana, Daniela, Jéssica, Luiza,
Raquel, Annalice, Andreza, Natasha, Fernanda, Camila, Bruno, Iancor, André, Lucas
agradeço pelo divertido convívio cotidiano, e desejo que o sucesso continue
acompanhando vocês.
Aos remanescente da Família Mexicana” (Turma de Mestrado 2005 – Departamento de
Parasitologia do ICB/UFMG) e os Agregados, obrigada pelo privilégio de desfrutar da
companhia de vocês, por ordem alfabética gostaria de agradecer em especial Ana
Flávia pela amizade, constante disponibilidade e carinho. Camila pela amizade e
excelente convívio. Kelly Key pela amizade, carinho e atenção. Priscila pela amizade,
constante atenção e disponibilidade para minhas dúvidas nos assuntos de
bioinformática. Renata Cristina pela amizade, paciência, carinho, disponibilidade e
conspiração. Sílvia pela amizade, paciência, ajuda cotidiana e ouvidoria. Sydnei,
amizade, constante ajuda e disponibilidade, além do cuidado e do excelente atendimento
aos meus cachorros de estimação.
Aos amigos de Departamento de Parasitologia, pela convivência e carinho, em especial
Luciana, Lara, Helen, Tiago, Iara, Carol, Pedro, Tati, Rodrigo, Júlia, Letícia, Andrey,
Laila, Juliana, Anderson, Breno, Iuri.
Aos colegas do Laboratório de Triatomíneos e Epidemiologia da Doença de Chagas do
IRR/FIOCRUZ.
À Dr. Silvia Ermelinda Barbosa, do Laboratório de Triatomíneos e Epidemiologia da
Doença de Chagas do IRR/FIOCRUZ, pelo carinho, atenção e pelas importantes críticas
e excelentes sugestões feitas ao trabalho durante o exame de qualificação desta tese.
À Professora Dra. Élida Mara Rabelo, do Laboratório de Parasitologia Molecular, por
sempre disponibilizar a infra-estrutura do seu laboratório, pelo excelente convívio e por
suas importantes críticas e excelentes sugestões feitas ao trabalho durante o exame de
qualificação desta tese.
Ao Professor Dr. Alan Lane de Melo, muito obrigada pelo carinho, atenção e
importantes ensinamentos que contribuíram para a minha formação, profissional e
pessoal.
Aos Professores Dr. Pedro Marcos Linardi e Dr. José Ramiro Botelho, do Laboratório
de Ectoparasitos, pelo carinho, atenção e excelente convívio cotidiano.
À secretária do curso de Pós-graduação em Parasitologia, nossa querida Sumara
Aparecida G. Ferreira, pela constante ajuda, atenção e carinho incondicional.
Ao Laboratório de Imunologia e Genômica de Parasitos (Departamento de Parasitologia
do ICB - UFMG) em nome da Professora Dra. Daniella Castanheira Bartholomeu e do
Professor Dr. Ricardo Toshio Fujiwara, pela disponibilidade e gentileza no uso de
equipamentos
À Dr. Aparecida S. Tanaka e ao Dr. Agenor Vasconcelos pela colaboração durante a
realização das análises por espectrometria de massa.
“Sonhe com aquilo que você quiser.
Seja o que você quer ser,
porque você possui apenas uma vida
e nela só se tem uma chance
de fazer aquilo que se quer.”
Clarice Lispector
Este Trabalho foi realizado no Laboratório de Fisiologia de Insetos Hematófagos
(LFIH), do Departamento de Parasitologia - ICB - UFMG, e contou com o apoio da
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) (concessão de
Bolsa de Doutorado), e com o apoio financeiro do Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e da Fundação de Amparo a
Pesquisa de Minas Gerais (FAPEMIG).
RESUMO
Nesse trabalho foi demonstrada a importância de algumas atividades presentes
na glândula salivar e no intestino médio anterior do triatomíneo T. infestans, durante o
processo de alimentação. A saliva dos triatomíneos além de contribuir para obtenção de
sangue durante o processo de hematofagia, também auxilia o processo de hemolinfagia.
Na saliva de T. infestans foi caracterizada uma atividade paralisante sobre
invertebrados, que favoreceria a obtenção de hemolinfa como fonte de alimentação
(hemolinfagia), pois foi observado que os insetos alvos da hemolinfagia, permanecem
parcialmente imóveis durante esse processo alimentar. A molécula responsável pela
atividade paralisante presente na saliva de T. infestans é termorresistente, possui baixo
peso molecular, e aparentemente não possui natureza proteica nem lipídica. Além disso,
foi demonstrado pela primeira vez que a saliva de T. infestans atua sobre o sistema
imune de invertebrado, sendo capaz de inibir a ativação da profenoloxidase (proPO) de
invertebrados. No presente trabalho, também foi parcialmente caracterizada a molécula
responsável pela atividade hemaglutinante, sobre hemácias de diferentes hospedeiros
vertebrados, presente no intestino médio anterior de T. infestans. A molécula é termoresistente, sua natureza provavelmente é proteica, e ela possivelmente é constituída por
subunidades menores que apresentam variações no perfil eletroforético, dependendo do
tratamento ao qual a molécula foi submetida (tratada ou não termicamente). A cinética
da atividade hemaglutinante de ninfas de terceiro estádio em jejum, demostrou que a
atividade foi inicialmente baixa ou ausente, aumentando entre 5 e 7 dias após a muda,
mantendo-se elevada até 25 dias de observação. A atividade hemaglutinante
provavelmente não é devida a ação de lectinas. As análises por espectrometria de massa
sugerem que a molécula hemaglutinante seja uma ferritina, e o encontro de uma
sequência de ferritina-like provavelmente secretada no intestino médio anterior reforça
essa hipótese.
ABSTRACT
This work demonstrated the importance of activities present in the salivary gland
and anterior midgut of the triatomine T. infestans during the feeding process. The
insect's saliva contributed to the blood feeding and also aided in the process of
hemolymphagy. A paralyzing activity was identified in the saliva of T. infestans and the
effect on invertebrates was characterized. This activity facilitates the obtention of
hemolymph, once the target insects remained partially immobile during this process
(hemolymphagy). The molecule responsible for paralysis is thermo-stable, has a low
molecular weight, and apparently has no protein or lipid nature. Furthermore, the saliva
of T. infestans acts on the immune system of invertebrates, being able to inhibit the
activation of invertebrate proPO cascade. The present work also partially characterized
the molecule responsible for the hemagglutination activity present in the anterior midgut
of T. infestans. The molecule is thermo-stable, have probably proteic characteristics and
consists of smaller subunits that have variations in the electrophoretic profile depending
on the treatment in which the molecule was submitted (thermally treated or not). The
insect age after molt influenced significantly the hemagglutinant activity, in third instar
nymphs of T. infestans, the activity is low or absent until approximately 5 days after
moult, and increases and remains at higher levels from 5 days after moult. The
hemagglutinant activity is not promoted by lectins and the analysis by mass
spectrometry suggests that the hemagglutinin is a ferritin. The identification of a
ferritin-like sequence expressed in the anterior midgut reinforces this hypothesis.
LISTA DE FIGURAS
Página
Figrua 1
Figura 2
Figura 3
Figura 4
Figura 5
Figura 6
Figura 7
Figura 8
Figura 9
Figura 10
Figura 11
Figura 12
Figura 13
Figura 14
Figura 15
Figura 16
Figura 17
Glândulas salivares das tribos Triatomini e Rhodniini
Esquema do tubo digestivo dos triatomíneos
Esquema representativo do sitema imune de insetos, ilustrando o
processo de ativação da cascata da profenoloxidase.
Esquema representando a sequência de procedimentos
experimentais realizados
Esquema da região dorsal dos segmentos abdominal de
triatomíneos
Metodologia utilizada para avaliar a frequência e a amplitude das
contrações do vaso dorsal
Detalhe do vaso dorsal de R. prolixus
Hemolinfagia de ninfas de segundo estádio de T. infestans em
um espécime adulto de R. prolixus
Aspecto do abodômen e do conteúdo do intestino médio anterior
de ninfas de segundo estádio de T. infestans após hemolinfagia
(A e C) ou cleptohematofagia (B e D) em ninfas de quinto
estádio de R. prolixus
Perfil eletroforético (SDS-PAGE 12,5%) do conteúdo intestinal
de ninfas de segundo estádio de T. infestans após hemolinfagia e
cleptohematofagia em ninfas de R. prolixus
Hemolinfagia de ninfas de primeiro estádio de T. infestans em
ninfas de quinto estádio de R. prolixus
Efeito da saliva de T. infestans sobre a cascata da
profenoloxidase (proPO) da hemolinfa de ninfas de quarto
estádio de R. prolixus
Avaliação das contrações do vaso dorsal durante a hemolinfagia
de ninfas de segundo estádio de T. infestans em adultos de R.
prolixus
In situ avaliação da frequência e da amplitude relativa das
contrações do vaso dorsal depois da adição da saliva bruta de T.
infestans e lavagem (retirada) da amostra adicionando solução
salina à preparação
Cromatograma da saliva semipurificada de T. infestans
utilizando coluna C8 fase reversa
Fórmulas estruturais das moléculas orgânicas com similaridade
ao composto presente na fração purificada da saliva de T.
infestans
Representação dos perfis e dos valores relativos de absorvância
obtidos nos ensaios de hemaglutinação em espectrofotômetro
04
06
20
19
26
27
28
32
33
33
34
36
38
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41
54
Figura 18
Figura 19
Figura 20
Figura 21
Figura 22
Figura 23
Figura 24
Figura 25
Figura 26
Figura 27
Figura 28
Figura 29
Figura 30
Figura 31
Figura 32
Efeito da adição do extrato de intestino médio anterior de T.
infestans em suspensão de hemácias de camnundongo
Atividade hemaglutinante do extrato de intestino médio anterior
de ninfas de terceiro estádio de T. infestans em diferentes dias
após a muda
Perfil eletroforético (PAGE 12,5% (A) e PAGE 6% (B)) do
extrato intestinal de ninfas de quinto estádio de T. infestans
Eletroforese (SDS-PAGE 7,5%) corresponde a porção não
filtrada (>100 kDa) do extrato de intestino tratado termicamente
de ninfas de quinto estádio de T. infestans
Eletroforese corresponde a porção não filtrada (>100 kDa) do
extrato de intestino tratado termicamente de ninfas de quinto
estádio de T. infestans antes e após a eletroeluição
Western blot utilizando soro de camundongos Balb/C
imunizados contra proteína de 16,5 kDa.
Eletroforese mostrando as bandas de interesse para identificação
por espectrometria de massa do perfil protéico das amostras do
extrato de intestino de ninfas de quinto estádio de T. infestans
tratados termicamente
Gel de agarose 1,5% mostrando a expressão da ferritina na
glândula salivar e no intestino médio anterior de ninfas de T.
infestans
Gel de agarose 1,5% mostrando a expressão da ferritina apenas
no intestino médio anterior de ninfas de T. infestans
Alinhamento das sequências de ferritina de T. infestans com
outras sequências de ferritinas de diferentes insetos hematófagos
Dendograma construído após o alinhamento das sequências de
ferritinas encontradas em alguns insetos hematófagos
selecionados
Atividade hemaglutinante do extrato de intestino médio anterior
de ninfas de terceiro estádio de T. infestans em diferentes dias
após a administração de 10 µg de dsRNA
Cinética de expressão relativa de RNAm da ferritina em ninfas
de terceiro estádio de T. infestans, em diferentes dias após a
muda
Cromatograma do extrato intestinal de ninfas de quinto estádio
de T. infestans tratado termicamente utilizando coluna de troca
iônica
Relação entre a absorvância das amostras no comprimento de
onda 280 nm e o título de hemaglutinação das frações obtidas
após cromatografia em coluna de troca iônica
67
68
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74
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77
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Figura 33
Figura 34
Figura 35
Perfil eletroforético das frações resultantes da HPLC troca iônica
(A) (SDS-PAGE 15%), (B) SDS-PAGE 6%
Cromatograma do extrato intestinal de ninfas de quinto estádio
de T. infestans tratado termicamente utilizando coluna de
filtração molecular
Relação entre a absorvância das amostras no comprimento de
onda 280 nm e o título de hemaglutinação das frações obtidas
após cromatografia em coluna de troca iônica
85
86
86
LISTA DE TABELAS
Efeito da injeção da saliva bruta ou semipurificada de T.
infestans em ninfas de segundo estádio de R. prolixus
Tabela 2 Paralisia de ninfas de segundo estádio de R. prolixus induzida
pela injeção das frações da saliva semipurificada de T. infestans
após cromatografia em coluna C8 de fase reversa
Tabela 3 Oligos utilizados nas reações de PCR
Tabela 4 Atividade hemaglutinante do extrato de intestino médio anterior
de ninfas de T. infestans sobre hemácias de diferentes
hospedeiros vertebrados
Tabela 5 Efeito de diferentes tratamentos sobre a atividade
hemaglutinante presente no extrato de intestino médio anterior
de ninfas de quinto estádio de T. infestans
Tabela 6 Efeito da temperatura sobre atividade hemaglutinante do
extrato de intestino médio anterior de ninfas de quinto estádio
de T. infestans
Tabela 7 Efeito do pH sobre a atividade hemaglutinante do extrato de
intestino médio anteriror de ninfas de quinto estádio de T.
infestans
Tabela 8 Efeito da ultrafiltração do extrato de intestino médio anterior de
ninfas de quinto estádio de T. infestans sobre a atividade
hemaglutinante
Tabela 9 Resultados obtidos na espectrômetria de massas das proteínas
de interesse das amostras de extrato de intestino tratado
termicamente de ninfas de T. infestans
Tabela 10 Grupos de insetos injetados e avaliação da atividade
hemaglutinante em diferentes dias após a administração do
dsRNA
Tabela 11 Quantificação de proteínas totais e títulos de hemaglutinação
das frações resultantes da cromatografia em coluna de troca
iônica
Tabela 12 Quantificação de proteínas totais e títulos de hemaglutinação
das frações resultantes da cromatografia em coluna de filtração
molecular
Tabela 1
Página
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41
62
66
69
70
70
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76
80
84
87
SUMÁRIO
1.3
1.4
1.5
Página
Introdução
01
Biologia, ingestão de sangue e capacidade vetorial dos triatomíneos
01
A glândula salivar e a ação de biomoléculas salivares durante o
02
processo de hematofagia dos triatomíneos
A influência do ambiente intestinal durante o repasto sanguíneo
05
Hemolinfagia e cleptohematofagia nos triatomíneos
09
Sequências gênicas e proteoma de triatomíneos
14
2
Justificativa
17
3
3.1
3.2
Objetivos
Objetivo Geral
Objetivos específicos
18
18
18
1
1.1
1.2
Material e Métodos (Parte 1 – Hemolinfagia)
Delineamento Experimental
Manutenção dos insetos
4.1
Obtenção da saliva
4.2
Semipurificação da saliva
4.3
Hemolinfagia e cleptohematofagia em condições de laboratório
4.4
Influência da hemolinfagia na taxa de sobrevivência das ninfas de T.
4.5
infestans
Estimativa do volume de hemolinfa
4.6
Avaliação do efeito da saliva de T. infestans sobre a ativação da
4.7
cascata da profenoloxidase
Avaliação do efeito da saliva de T. infestans sobre a atividade da
4.8
fenoloxidase
Caracterização da atividade paralisante
4.9
4.9.1 Efeito da injeção de saliva de T. infestans sobre a motilidade de
ninfas de R. prolixus
4.9.2 Ensaio "in vivo" do efeito da saliva sobre o vaso dorsal de R. prolixus
4.9.3 Ensaio "in situ" do efeito da saliva sobre o vaso dorsal de R. prolixus
4.10. Caracterização da natureza da molécula salivar com atividade
paralisante
4.10.1 Tratamento com proteinase K
4.10.2 Extração de lipídeos
Cromatografia líquida de alta performance (HPLC)
4.11
Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
4.12
Análise estatística
4.13
4
19
19
20
21
21
22
22
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23
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24
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28
29
29
30
30
31
31
5.4
5.5
5.6
5.7
Resultados (Parte 1 – Hemolinfagia)
Caracterização da hemolinfagia e cleptohematofagia de ninfas de T.
infestans
Influência da hemolinfagia na taxa de sobrevivência de ninfas de T.
infestans
Efeito da saliva de T. infestans sobre a ativação do sistema da
profenoloxidase (proPO)
Caracterização da atividade paralisante da saliva de T. infestans
Caracterização da molécula paralisante da saliva de T. infestans
Identificação da molécula paralisante da saliva de T. infestans
Espectrometria de massa dos compostos ativos
6
Discussão (Parte 1 – Hemolinfagia)
42
7
Conclusões (Parte 1 – Hemolinfagia)
51
8
8.1
8.2
8.3
8.4
8.5
8.5.1
8.5.2
8.5.3
8.5.4
8.5.5
8.5.6
8.5.7
8.6
8.7
8.8
8.9
8.10
8.11
8.12
8.12.1
8.12.2
8.12.3
8.13
8.13.1
8.13.2
Material e Métodos (Parte 2 – Atividade hemaglutinante)
Obtenção do intestino médio anterior e preparação dos extratos
Preparação da suspensão de hemácias
Ensaio de hemaglutinação em lâmina
Ensaio de hemaglutinação em espectrofotômetro
Caracterização da molécula hemaglutinante
Quantificação do título de hemaglutinação
Tratamento térmico do extrato intestinal
Quantificação de proteínas antes e após o tratamento térmico
Tratamento do extrato intestinal com proteases
Estabilidade térmica
Efeito da variação do pH sobre a atividade hemaglutinante
Tratamento do extrato intestinal com colágeno e gelatina
Semipurificação do extrato de intestino
Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
Eletroeluição
Imunização
Western Blot
Espectrometria de massa: Obtenção e análise dos peptídeos
Silenciamento Gênico por RNAi
Extração de RNA, síntese de cDNA e PCR
Produção de dsRNA e silenciamento de genes alvo por RNAi
Avaliação dos níveis de RNAm pós-silenciamento
Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)
Coluna de Troca iônica
Coluna de filtração molecular
52
52
52
53
53
54
54
55
55
55
56
56
56
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58
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60
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64
64
65
5
5.1
5.2
5.3
33
35
36
39
39
41
66
66
9.5
9.6
9.7
9.8
9.9
Resultados (Parte 2 – Atividade hemaglutinante)
Ação hemaglutinante do extrato intestinal sobre hemácias de
diferentes hospedeiros vertebrados
Atividade hemaglutinante do extrato intestinal em diferentes dias
após a muda
Avaliação da estabilidade da atividade hemaglutinante após
diferentes tratamentos
Perfil eletroforético do extrato de intestino médio anterior de T.
infestans
Identificação da molécula responsável pela atividade hemaglutinante
Western Blot
Identificação da molécula por espectrometria de massa
Pesquisa no banco de dados do NCBI e silenciamento gênico (RNAi)
Fracionamento do conteudo intestinal por HPLC
10
Discussão (Parte 2 – Atividade hemaglutinante)
88
11
Conclusões (Parte 2 – Atividade hemaglutinante)
97
Referências Bibliográficas
99
9
9.1
9.2
9.3
9.4
Anexo I – Artigo aceito para publicação
68
68
71
73
74
75
76
82
1. Introdução
1.1 Biologia, ingestão de sangue e capacidade vetorial dos triatomíneos
Os triatomíneos são insetos pertencentes à família Reduviidae, subfamília
Triatominae. Eles são paurometábolos, isto é, o seu ciclo biológico de desenvolvimento
passa pelas fases de ovo, ninfa (com cinco estádios ninfais) e adulto (macho e fêmea)
(Lent and Wygodzinsky, 1979).
Tanto as formas imaturas, quanto os insetos adultos, necessitam de sangue para
o desenvolvimento biológico. Eles atuam como ectoparasitos temporários, que se
alimentam do sangue de hospedeiros vertebrados, diretamente dos vasos (vênulas ou
arteríolas) da pele (Lavoipierre et al., 1959). Dessa hematofagia decorre a importância
médica desses insetos, que são vetores de tripanossomatídeos, agentes causadores de
doenças em humanos e outros mamíferos (Lent and Wygodzinsky, 1979).
O ciclo de vida e a dinâmica populacional dos triatomíneos estão diretamente
relacionados à interação com seus hospedeiros vertebrados (Schofield, 1994). A
percepção da presença do vetor pelo hospedeiro vertebrado durante a hematofagia
representa uma ameaça para o vetor, e é um fator determinante para o seu sucesso na
aquisição de sangue. Ao perceber o vetor, o hospedeiro vertebrado tenta eliminá-lo
mecanicamente, o que pode provocar desde uma interrupção precoce do repasto
sanguíneo, até mesmo a morte desse vetor (Rossignol et al., 1985). Nos triatomíneos
essa ameaça é contornada por dois mecanismos cooperativos: a produção de anestésicos
salivares capazes de impedir que o hospedeiro perceba a perfuração da pele (Dan et al.,
1999), e a presença (o desenvolvimento) de uma bomba muscular, a bomba cibarial
(formada por um complexo de fortes músculos, localizada na cabeça do inseto) que é
capaz de gerar alta pressão e permitir a ingestão de grandes quantidades de sangue em
pouco tempo (Guarneri et al., 2000a).
1
Em triatomíneos, o contato com seus hospedeiros vertebrados ocorre apenas
durante o repasto sanguíneo, que, geralmente, dura de 20 a 50 minutos. Durante este
tempo, dependendo da espécie, um triatomíneo adulto pode ingerir em média 5 a 8
vezes o seu próprio peso (peso inicial) em sangue (Schofield, 1994).
Esse tempo de contato dos triatomíneos com os hospedeiros vertebrados é
influenciado pela taxa de ingestão de sangue (que varia entre as espécies de
triatomíneos); pelo estágio de desenvolvimento dos insetos (ninfa ou adulto); bem como
pela fisiologia do hospedeiro (Guarneri et al., 2000a, 2003; Sant'Anna et al., 2001).
Uma implicação da melhor exploração do recurso alimentar pelos triatomíneos
refere-se à dinâmica de dejeções e, consequentemente, à transmissão do Trypanosoma
cruzi (Chagas, 1909) para os seres humanos. Segundo Trumper e Gorla (1991), o
momento da dejeção depende não só da espécie de triatomíneo, como também da
quantidade de sangue ingerida, pois os triatomíneos que fazem repastos sanguíneos
maiores tendem a defecar mais rapidamente do que aqueles que fazem repastos
menores, favorecendo assim a transmissão do T. cruzi via urina e fezes contaminadas.
Os triatomíneos T. infestans e Rhodnius prolixus Stal, 1859 estão entre as espécies
estudadas que apresentam as maiores taxas de ingestão de sangue (Guarneri et al.,
2000a, 2003; Sant'Anna et al., 2001) e são os principais vetores de T. cruzi para
humanos nas Américas (Cruz-Lopez et al., 2001; Garcia et al., 2007) .
1.2 A glândula salivar e a ação de biomoléculas salivares durante o processo de
hematofagia dos triatomíneos
A hematofagia é um processo complexo que envolve tanto adaptações
sensoriais, como a detecção de emissões de infravermelho provenientes da pele do
hospedeiro, facilitando o encontro dos vasos (Ferreira et al., 2007), quanto adaptações
na morfologia do aparato alimentar (Barth, 1952, 1953; Kraus, 1957) e adaptações
2
fisiológicas, como a presença de diversas moléculas bioativas na sua saliva (Ribeiro,
1995), que auxiliam na ingestão do sangue (Ribeiro and Garcia, 1980).
Os vertebrados possuem sofisticados sistemas hemostáticos, que visam
minimizar a perda de sangue. Entretanto, os artrópodes hematófagos apresentam um
amplo e redundante repertório de moléculas, com atividades anti-hemostáticas, como
anticoagulantes, inibidores de agregação plaquetária e vasodilatadores, capazes de
facilitar a ingestão do sangue de hospedeiros vertebrados (Ribeiro and Francischetti,
2003; Ribeiro, 1995).
A glândula salivar dos artrópodes hematófagos é um dos principais órgãos
envolvidos na adaptação à hematofagia. Nos triatomíneos as glândulas salivares estão
situadas na região toráxica, lateralmente ao esôfago. Os estudos sobre anatomia e
morfologia das glândulas salivares da família Triatominae foram realizados em
espécimes das tribos Triatomini e Rhodniini, não existindo estudos sobre espécimes das
demais tribos (Alberproseniini, Bolboderini, Cavernicolini, Linshcosteusinii) (Baptist,
1941; Barth, 1954; Lacombe, 1999). Na tribo Triatomini cada par de glândula salivar é
composto por 3 unidades: uma glândula principal (D1), uma suplementar (D2) e uma
acessória (D3), enquanto que a tribo Rhodniini apresenta uma glândula principal e uma
glândula menor acessória (Fig. 1) (Baptist, 1941).
3
Figura 1 – Glândulas salivares das tribos Triatomini (A) e Rhodniini (B). Adaptado de Baptist
(1941).
Além da sua função primitiva de lubrificar as peças bucais (Miles, 1972), a
saliva dos triatomíneos auxilia na obtenção de sangue, sendo liberada durante todo o
processo de alimentação (Soares et al., 2006).
A partir do trabalho pioneiro de Ribeiro e Garcia (1980), que demonstrou que a
saliva de um inseto hematófago (R. prolixus) possuía a capacidade de inibir a agregação
plaquetária do sangue do hospedeiro vertebrado, facilitando assim a ingestão de sangue
pelo inseto, seguiu-se a identificação de inúmeros agentes anti-hemostáticos,
antiinflamatórios, imunossupressores e analgésicos na saliva de diversos artrópodes
hematófagos (Ribeiro and Francischetti, 2003), tais como, anticoagulantes (Champagne
et al., 1995; Gudderra et al., 2005; Hellmann and Hawkins, 1964, 1965; Pereira et al.,
4
1996; Ribeiro et al., 1995; Ribeiro et al., 1998) vasodilatadores (Ribeiro et al., 1993;
Ribeiro et al., 1990; Ribeiro and Nussenzveig, 1993; Yuda et al., 1996), antihistamínico (Ribeiro and Walker, 1994; Ribeiro and Sarkis, 1982), uma proteína
formadora de poro (Amino et al., 2002), bloqueador de canal de sódio (Dan et al., 1999)
e inibidores de agregação plaquetária induzida por ADP (Faudry et al., 2004;
Francischetti et al., 2000; Ribeiro and Garcia, 1980; Sarkis et al., 1986), trombina
(Golodne et al., 2003; Ngo et al., 1998), colágeno (Andersen et al., 2003; NoeskeJungblut et al., 1994; Ribeiro and Garcia, 1981), ácido araquidônico (Francischetti et
al., 2000; Ribeiro and Sarkis, 1982) e fator de ativação de plaquetas (Golodne et al.,
2003). Além de substâncias que facilitam a localização dos vasos e a manutenção do
fluxo sanguíneo, também foram descritas atividades imunossupressora (Kalvachova et
al., 1999), sialidásicas (Amino et al., 2001), e atividade anticomplemento (Barros et al.,
2009; Cavalcante et al., 2003) que protege o tubo digestivo contra o ataque do
complemento e auxiliam no processo de alimentação, reduzindo a resposta imune e
inflamatória do hospedeiro vertebrado.
1.3 A influência do ambiente intestinal durante o repasto sanguíneo
Além das glândulas salivares, o intestino também representa um importante
órgão no processo alimentar dos triatomíneos. O tubo digestivo dos triatomíneos pode
ser subdividido em 3 partes: intestino anterior, intestino médio (anterior e posterior) e
intestino posterior (Fig. 2). O sangue ingerido passa pelo intestino anterior (faringe e
esôfago) e é armazenado na parte anterior do intestino médio, onde a água e os íons são
transportados para a hemolinfa e túbulos de Malpighi. O sangue concentrado passa em
pequenas quantidades à parte digestiva e absortiva do intestino médio posterior (Kollien
and Schaub, 2000). O intestino posterior é constituído pela ampola retal e o reto, e
possui um importante papel na reabsorção de água e sais minerais. Na ampola retal
5
ficam contidas fezes e urina para serem eliminadas posteriormente pelo reto (Terra and
Ferreira, 1994).
Figura 2 – Esquema do tubo digestivo dos triatomíneos. Adaptado de Ramirez-Perez (1969).
Poucas moléculas intestinais com atividades farmacológicas, que auxiliam na
hematofagia, foram
descritas em
triatomíneos,
dentre elas
destacam-se os
anticoagulantes intestinais que foram descritos em várias espécies. No intestino de R.
prolixus, a proteína que inibe a coagulação sanguínea é denominada rhodinina
(Friedrich et al., 1993), em T. infestans infestina (Campos et al., 2002) e em Triatoma
brasiliensis Neiva,1911 brasiliensina (Araujo et al., 2007).
6
Em 2007, Araujo et al. demonstraram que a inibição, por RNAi ou pela ingestão
de trombina, da atividade anticoagulante do intestino médio anterior de T. brasiliensis
causa uma redução significativa da quantidade de sangue ingerida. A explicação para
esta redução foi que o sangue no intestino do inseto precisa estar em baixa viscosidade
durante a alimentação, uma vez que a alta viscosidade sanguínea induziria uma maior
pressão hídrica intestinal, o que interferiria no bombeamento do sangue para outras
partes do intestino. Como o canal alimentar dos triatomíneos é contínuo, problemas no
fluxo do sangue ingerido, em qualquer local do tubo alimentar (incluindo o intestino
médio anterior), poderiam interferir na performance alimentar do inseto (Araujo et al.,
2007). Além disso, a coagulação do sangue poderia causar um aumento repentino na
viscosidade do sangue, devido à formação de fibrina (Puckett et al., 2005). Sendo assim,
evitar um aumento da viscosidade sanguínea dentro do tubo digestivo, durante a fase de
bombeamento do sangue, parece ser uma função fisiológica importante para os insetos
hematófagos.
Seguindo o mesmo contexto dos resultados encontrados por Araujo et al.,
(2007), outros fenômenos que interferem na viscosidade do sangue ingerido, também
poderiam influenciar o processo alimentar dos triatomíneos. Dentre os fenômenos
podemos citar a aglutinação eritrocitária (ou hemaglutinação) que ocorre no intestino
médio anterior dos triatomíneos logo após a ingestão de sangue. Esta atividade, descrita
inicialmente para T. infestans (Gregorio and Ratcliffe, 1991) e R. prolixus (Pereira et al.,
1981), foi atribuída à participação de lectinas. As lectinas são definidas como proteínas
ligantes de carboidratos, capazes de aglutinar células e/ou glicoconjugados, através da
ligação específica a carboidratos de superfície (Goldstein et al., 1980). Várias
hemaglutininas (aglutininas de hemácias) têm sido descritas na hemolinfa e/ou nos
extratos de tecidos de outros artrópodes (Ibrahim et al., 1984; Kamwendo et al., 1993;
7
Mohamed et al., 1992; Wallbanks et al., 1986), entretanto seu papel biológico ainda não
foi totalmente elucidado. Acredita-se que elas estejam relacionadas ao reconhecimento
de moléculas estranhas, nas reações de defesa contra bactérias, protozoários,
nematódeos e fungos, e consequentemente na interação parasito-vetor (Ingram et al.,
1984).
Resultados obtidos por Hypsa e Grubhffer (1995) sobre a molécula
hemaglutinante presente no intestino de T. infestans sugerem que ela possui um sítio de
ligação complexo, que reconhece fragmentos específicos da cadeia glicídica em vez de
resíduos individuais de monossacarídeos, não entrando, portanto, na definição
convencional de lectinas (Grubhoffer et al., 1997). Embora possa haver diferenças entre
as condições experimentais ocasionando diversas controvérsias nos resultados, os
trabalhos publicados até o momento com hemaglutininas do intestino médio anterior de
triatomíneos indicam que podem existir variações entre as populações de insetos
estudadas e que o fenômeno é ainda pouco conhecido (Grubhoffer et al., 1997). Hypsa e
Grubhffer (1995) identificaram um peptídio de 20 kDa com atividade hemaglutinante
no intestino médio anterior de T. infestans, porém a sequência dessa molécula ainda não
é conhecida.
Além do intestino médio anterior, a atividade de hemaglutinação, nos
triatomíneos, também foi detectada em outros tecidos (hemolinfa e intestino médio
posterior), entretanto seu papel biológico ainda não é conhecido. Como algumas
aglutininas foram capazes de aglutinar formas epimastigotas de T. cruzi e de
Trypanosoma rangeli Tejera, 1920, foi sugerido que elas possam ter um papel
relacionado à interação parasito-vetor (Gregorio and Ratcliffe, 1991; Pereira et al.,
1981).
8
Araujo et al., (2009a) mostraram que o fenômeno da hemaglutinação no
triatomíneo T. brasiliensis inicia-se assim que o sangue ingerido chega ao intestino
médio anterior, o que causa a separação dos eritrócitos do plasma. O processo ocorre
muito rapidamente, sendo mais rápido e intenso que a agregação eritrocitária observada
no sangue de alguns animais. Intrigantemente, quando esses triatomíneos se alimentam
do sangue de um hospedeiro específico (Thrichomys apereoides (Lund, 1839), um
roedor naturalmente associado ao triatomíneo T. brasiliensis) essa separação não ocorre
no intestino, e o tamanho do repasto sanguíneo é reduzido significantemente tanto em
experimentos realizados in vivo quanto in vitro. Estes resultados preliminares indicam
que a atividade hemaglutinante pode ter um papel importante no processo alimentar dos
triatomíneos, principalmente pelo fato da hemaglutinação influenciar a viscosidade do
sangue ingerido. A importância da hemaglutinação para a alimentação é reforçada pelo
fato da atividade estar presente no intestino médio anterior de insetos em jejum, fato
também observado em R. prolixus (Pereira et al., 1981), que indica que a atividade
hemaglutinante precisa estar presente assim que o sangue chega ao intestino.
1.4 Hemolinfagia e cleptohematofagia nos triatomíneos
Apesar dos triatomíneos alimentarem-se preferencialmente do sangue de
hospedeiros vertebrados, ninfas em jejum podem alimentar-se em outras ninfas
ingurgitadas, sendo capazes de ingerir hemolinfa (processo chamado de hemolinfagia)
(Ruas-Neto et al. 2001) ou o conteúdo intestinal (processo chamado de
cleptohematofagia) (Sandoval et al. 2000) dessas ninfas ingurgitadas. Este hábito foi
primeiramente relatado como "canibalismo" por Brumpt (1914), ao descrever que
algumas ninfas das colônias de triatomíneos, das espécies T. infestans, Triatoma
chagasi Brumpt e Gomes, 1914, Triatoma sordida (Stal, 1859), Panstrongylus megistus
(Burmeister, 1835) e R. prolixus, que estavam em jejum, frequentemente alimentavam9
se em outras ninfas engurgitadas. A hemolinfagia tem sido frequentemente relatada em
algumas espécies de triatomíneos por diferentes autores como: T. sordida (Torres 1915),
P. megistus (Abalos e Wygodzinsky 1951), R. prolixus, Triatoma pallidipennis (Stal,
1872), Triatoma guasayana Wygodzinsky e Abalos, 1949 e Triatoma longipes Barber,
1937, Triatoma phyllosoma Burmeister, 1835 (Ryckman 1951), Triatoma klugi
Carcavallo et al., 2001 (Emmanuelle-Machado et al. 2002), T. infestans, Triatoma
protracta (Uhler, 1894), Triatoma maculata (Erichson, 1848) (Brumpt 1914, Torres
1915, Ryckman 1951, Phillips 1960), Belminus herreri Lent e Wygodzinsky, 1979
(Sandoval et al. 2000, Sandoval et al. 2004) e Belminus ferroae Sandoval et al. 2010
(Sandoval et al. 2010).
Abalos e Wygodzinsky (1951) descreveram que Triatoma rubrovaria
(Blanchard, 1843) poderia usar a hemolinfa de diferentes artrópodes (como por
exemplo, hemolinfa de larvas de borboletas e/ou de aranhas) como fonte alimentar.
Miles et al., (1981) observaram que ninfas de 1º, 2º e 3º estádios do triatomíneo
Eratyrus mucronatus Stal, 1859 alimentam-se preferencialmente da hemolinfa de outros
artrópodes, como por exemplo, de aranhas, enquanto que os demais estádios ninfais e os
espécimes adultos alimentam-se de sangue de vertebrados. Estudos de laboratório com
as espécies Triatoma circummaculata (Stal, 1859), T. rubrovaria, e Triatoma
carcavalloi Jurberg et al., 1998 sugerem que o comportamento de hemolinfagia também
seja comum nestas espécies (Lorosa et al., 2000; Ruas-Neto et al., 2001). Um estudo
recente destaca que B. herreri, um triatomíneo que habita regiões de floresta entre a
Colômbia e o Panamá, poderia colonizar construções humanas e o intradomicílio, e as
ninfas dessa espécie teriam preferência por se alimentar de hemolinfa de baratas a
sangue de hospedeiros vertebrados (Sandoval et al., 2004).
10
Ryckman (1951) observou que durante a hemolinfagia, as ninfas que eram
sugadas permaneciam paradas durante todo o processo de alimentação e aparentemente
não sofriam danos em consequência desse tipo de alimentação e não morriam. Em
condições de laboratório, durante o processo de hemolinfagia dos triatomíneos, não se
observa a pré-digestão dos tecidos e nem a morte dos artrópodos sugados, apenas uma
imobilização temporária dos mesmos (Lorosa et al., 2000).
O hábito de sugar hemolinfa poderia representar uma fonte alternativa de
alimento para os triatomíneos em períodos de escassez de hospedeiros vertebrados
disponíveis para a realização da hematofagia. Além disso, a hemolinfagia e/ou
cleptohematofagia também podem ter implicações importantes na transmissão dos
tripanossomatídeos T. cruzi e T. rangeli entre os triatomíneos. Em condições
experimentais foi demonstrado que ninfas não infectadas poderiam se infectar ao se
alimentar de ninfas infectadas por T. rangeli (Anez, 1982). Brumpt (1914) foi o
primeiro a sugerir que o "canibalismo" poderia servir para aumentar a porcentagem de
infecção pelo T. cruzi entre os triatomíneos. Dias (1936) demonstrou que 29% das
ninfas de P. megistus que ingeriram sangue de triatomíneos infectados adquiriram a
infecção por T. cruzi. Pinero e Torrealba (1977) sugerem que o "canibalismo" poderia
ter um importante papel na transmissão de T. rangeli em condições naturais, o que
explicaria as altas taxas de infecção, por T. rangeli, encontradas em R. prolixus,
coletados de palmeiras na Venezuela.
Apesar dos vários relatos sobre hemolinfagia em hospedeiros invertebrados, o
papel da saliva durante a hemolinfagia em hospedeiros invertebrados ainda não é
conhecido. Algumas atividades presentes na saliva de triatomíneos poderiam favorecer
o processo de alimentação em hospedeiros invertebrados, entre elas, destacam-se os
efeitos imunossupressor e paralisante.
11
Os artrópodes possuem um sistema circulatório aberto, por isso, após sofrer uma
injúria em seus tecidos, eles devem estabelecer uma estratégia que bloqueie rapidamente
a perda de hemolinfa. A coagulação da hemolinfa é a primeira resposta para uma injúria
no corpo do inseto, e ela também evita a propagação de patógenos invasores na
hemolinfa, sendo, portanto parte integrante da imunidade inata (Theopold et al., 2004).
O sistema imune dos invertebrados contra patógenos invasores inclui respostas
rápidas que envolvem a ativação de cascatas proteolíticas da hemolinfa. Ele é composto
pelas respostas imunes celular e humoral. A resposta imune celular é mediada pelos
hemócitos (células da hemolinfa) e compreende a fagocitose, a formação de nódulos e o
encapsulamento de patógenos. Fazem parte da resposta imune humoral a síntese de
peptídeos antimicrobianos e ativação do sistema da profenoloxidase (proPO).
A ativação da proPO é desencadeada pela presença de componentes da parede
de células microbianas, tais como, lipopolissacarídeos e peptídeoglicanos, na hemolinfa
dos insetos. As serino proteases convertem a proPO circulante em fenoloxidase (PO)
(Fig. 3). Esta ativação é estritamente regulada por serpinas (inibidores de serino
proteases), inibidores da PO e lectinas, restringindo a atividade da PO à superfície do
patógeno (Ferrandon et al., 2007; Gillespie et al., 1997). A PO é responsável pelo
processo de melanização que resulta na encapsulação de patógenos, esclerotização da
cutícula e reparo da lesão (Andersen, 1985; Theopold et al., 2002). Apesar do processo
de melanização causar ou levar à morte os patógenos, a melanização sistêmica é
prejudicial para o inseto. Fatores de inibição naturalmente encontrados na hemolinfa
regulam e impedem uma superativação. Uma relação entre a cascata de melanização e a
coagulação da hemolinfa tem sido sugerida (Cerenius and Soderhall, 2004; Theopold et
al., 2002).
12
Figura 3 – Esquema representativo do sitema imune de insetos, ilustrando o processo de
ativação da cascata da profenoloxidase. Adaptado de Cerenius e Soderhall, 2004.
Com relação a um possível efeito paralisante na saliva dos triatomíneos, que
favoreça a hemolinfagia, destacam-se as observações realizadas por Ryckman (1951) de
que os insetos alvos permaneciam imóveis durante a hemolinfagia. A hipótese mais
provável seria uma ação da saliva dos triatomíneos, atuando na minimização da
percepção do hospedeiro, favorecendo asssim a obtenção da dieta, tal como acontece
durante a alimentação dos triatomíneos em hospedeiros vertebrados. Alves (2007)
demonstrou que a saliva semipurificada de T. infestans é capaz de inibir tanto os
batimentos do vaso dorsal isolado de R. prolixus como o potencial de ação composto de
nervo isolado de rato, sugerindo que a atividade paralisante pode ter o mesmo
mecanismo de ação da atividade anestésica descrita por Dan et al. (1999) e poderia ser
atribuída à mesma molécula.
13
1.5 Sequências gênicas e proteoma de triatomíneos
Nos resultados obtidos através do sequenciamento em larga escala de cDNAs de
glândulas salivares de diferentes artrópodes hematófagos, têm-se observado uma
enorme variedade de transcritos que codificam proteínas com funções aparentemente
relacionadas à alimentação de sangue. Este fato sugere que as moléculas bioativas da
saliva estejam submetidas a uma intensa pressão seletiva e que o desenvolvimento
destas funções esteja experimentando um contínuo processo de diversificação durante a
evolução dos grupos (Ribeiro et al., 2007).
Os sialomas (resultados de transcriptomas e proteomas da glândula salivar) de
triatomíneos publicados até o momento – R. prolixus (Ribeiro et al., 2004), T.
brasiliensis (Santos et al., 2007) e T. infestans (Assumpção et al., 2008) – têm mostrado
que estes insetos apresentam majoritariamente na sua saliva, um grande número e
variedade de proteínas (Assumpção et al., 2008; Ribeiro et al., 2004; Santos et al.,
2007). Dentre as proteínas descritas, as lipocalinas, proteínas em forma de barril e que
geralmente atuam no transporte de moléculas hidrofóbicas (Flower et al., 2000), são as
mais abundantes. Elas representaram 93,8% das proteínas secretadas nas glândulas
salivares de T. brasiliensis (Santos et al., 2007), 55% em T. infestans, (Assumpção et
al., 2008) e 83,7% em R. prolixus (Ribeiro et al., 2004).
Além das diferenças percentuais entre as lipocalinas, observam-se também
diferenças significativas entre o repertório de moléculas salivares dos triatomíneos. As
nitroforinas (NP) são as lipocalinas salivares mais abundantes encontradas em
triatomíneos do gênero Rhodnius, e não são observadas no gênero Triatoma
(Champagne et al., 1995). Além disso, a apirase salivar e as atividades anticoagulante e
vasodilatadora mostraram diferenças quantitativas e qualitativas entre as espécies de
triatomíneos estudadas (Ribeiro et al., 1998).
14
Entre as sequências de proteínas que provavelmente são secretadas na saliva de
T. infestans e que estão disponíveis no NCBI apenas algumas foram caracterizadas
funcionalmente, como a trialisina (Amino et al., 2002), a enzima apirase (Faudry et al.,
2004) e a triplatina (Morita et al., 2006).
Apesar de ser um importante órgão envolvido no processo alimentar dos
triatomíneos, o intestino tem sido normalmente negligenciado em estudos genômicos,
pois, na tentativa de identificar genes que possam ser importantes para o processo
alimentar, a maior parte das publicações focou na descrição do sialoma dos triatomíneos
(Assumpção et al., 2008; Ribeiro et al., 2004; Santos et al., 2007). Poucos projetos de
sequenciamento foram desenvolvidos focando o intestino dos triatomíneos e apenas
algumas sequências são conhecidas, como por exemplo, da rodinina, infestina e
brasiliensina, genes que inibem a coagulação sanguínea no intestino de R. prolixus
(Friedrich et al., 1993); T. infestans (Campos et al., 2002) e T. brasiliensis (Araujo et
al., 2007), respectivamente.
Neste contexto, é importante um conhecimento mais detalhado sobre as
moléculas presentes na glândula salivar e no intestino dos triatomíneos, principalmente
àquelas relacionadas ao processo de alimentação.
Atualmente várias ferramentas estão disponíveis para estudos de genômica
funcional, dentre elas destacam-se programas de bioinformática e o RNA interferente
(RNAi). O RNAi é um mecanismo de interferência pós-transcricional (Montgomery et
al., 1998; Ngo et al., 1998) altamente específico (Duxbury et al., 2004) que permite
estudar a função de um gene pela clivagem do RNA mensageiro de interesse
(Montgomery et al., 1998; Ngo et al., 1998; Zamore et al., 2000). O RNAi constitui-se
em uma ferramenta rápida e eficaz para avaliar “in vivo” o papel funcional de
moléculas, sobretudo em “non-model organisms”. Esta técnica foi utilizada pela
15
primeira vez em triatomíneos, em 2006, quando Araujo et al. demonstraram sua
viabilidade para o silenciamento de genes salivares, através da injeção e/ou da ingestão
de dsRNA. Neste estudo o gene alvo foi a lipolicana salivar nitroforina 2 de R. prolixus.
Em 2007, Araujo et al. demonstraram a viabilidade do RNAi para o silenciamento de
genes intestinais e também para estudos de genômica funcional de triatomíneos ao inibir
a atividade da proteína anticoagulante do intestino médio anterior de T. brasiliensis
(brasiliensina). A utilidade do RNAi para o estudo da importância de genes salivares
durante o processo alimentar de R. prolixus também foi demonstrada por Araujo et al.,
(2009b).
16
2 Justificativa
Os triatomíneos alimentam-se preferencialmente do sangue de hospedeiros
vertebrados, podendo, em períodos de escassez de hospedeiro vertebrado, alimentar da
hemolinfa de hospedeiros invertebrados. As glândulas salivares e o intestino são os
principais órgãos envolvidos no processo alimentar desses insetos. Neste contexto,
torna-se importante o estudo de moléculas presentes nestes órgãos, pois eles são
responsáveis pela produção de diversas moléculas bioativas que atuam no processo de
alimentação dos triatomíneos, permitindo a eles obterem sangue de hospedeiros
vertebrados (hematofagia) e/ou hemolinfa de hospedeiros invertebrados (hemolinfagia).
Um maior conhecimento dessas moléculas bioativas e da sua participação na
hematofagia ou na hemolinfagia poderia gerar informações importantes para entender a
biologia, dinâmica populacional e interação dos triatomíneos com seus hospedeiros
vertebrados, invertebrados e os agentes etiológicos de doenças.
Na tentativa de identificar moléculas bioativas e de elucidar os parâmetros que
possam afetar a hematofagia, diversos estudos envolvendo o sequenciamento de
bibliotecas de cDNA foram desenvolvidos nos últimos anos. O aumento da
disponibilidade de genomas e sequências de transcriptomas dos triatomíneos e de outras
espécies vetoras de agentes etiológicos de doenças tem proporcionado à comunidade
científica uma vasta informação para estudos posteriores. Entretanto ainda são
necessários estudos para identificar e caracterizar os genes “chaves” responsáveis pelos
diferentes processos fisiológicos dos triatomíneos, entre eles, os genes relacionados à
alimentação, pois, é durante o processo alimenar que o agente etiológico circula entre o
hospedeiro e o vetor.
17
3 Objetivos
3.1 Objetivo Geral
Caracterizar funcionalmente atividades salivares e intestinais relacionadas ao
processo alimentar de T. infestans sobre hospedeiros invertebrados e vertebrados, bem
como, identificar as moléculas responsáveis por essas atividades.
3.2 Objetivos Específicos
Parte 1 – Hemolinfagia
a) Caracterizar o processo de hemolinfagia de ninfas de T. infestans em ambiente
artificial (condições de laboratório).
b) Avaliar a importância da hemolinfagia na taxa de sobrevivência de ninfas de T.
infestans.
c) Avaliar o efeito da saliva de T. infestans sobre a cascata da profenoloxidase de
invertebrados.
d) Caracterizar a ação paralisante da saliva de T. infestans sobre invertebrados.
e) Identificar a molécula paralisante presente na saliva de T. infestans.
Parte 2 – Atividade hemaglutinante
a) Caracterizar a atividade hemaglutinante presente no intestino médio anterior de T.
infestans.
b) Identificar a molécula responsável pela atividade hemaglutinante presente no
intestino médio anterior de T. infestans.
18
4 Material e Métodos – Parte 1 - Hemolinfagia
Delineamento Experimental
Para caracterizar a hemolinfagia e avaliar sua importância para os triatomíneos,
espécimes de T. infestans foram utilizados como modelo experimental de hemolinfagia.
Ninfas de quinto estádio e adultos de R. prolixus foram utilizadas como "hospedeiro"
invertebrado e representaram os alvos da hemolinfagia.
Primeiramente foi feita a reprodução da hemolinfagia, em condições de
laboratório, utilizando-se ninfas de segundo estádio de T. infestans que se alimentaram
em ninfas de quinto estádio ou adultos de R. prolixus. As condições experimentais estão
detalhadas no item 4.4.
Posteriormente foi avaliada a influência da hemolinfagia sobre o prolongamento
da taxa de sobrevivência de ninfas de primeiro estádio de T. infestans na ausência de
hospedeiro vertebrado (item 4.5).
A ação da saliva de adultos de T. infestans sobre o sistema imune de
invertebrados foi avaliada antes e após a ativação da cascata da profenoloxidase (itens
4.7 e 4.8 respectivamente), utilizando a hemolinfa de ninfas de quarto estádio de R.
prolixus.
Também foi analisado o efeito paralisante da saliva de T. infestans sobre
invertebrados, utilizando os ensaios de paralisia de ninfas de R. prolixus após injeção da
saliva de adultos de T. infestans (item 4.9.1). A paralisia dos batimentos do vaso dorsal
de R. prolixus foi avaliada em testes "in vivo" (item 4.9.2) quando ninfas de segundo
estádio de T. infestans alimentavam-se da hemolinfa de adultos de R. prolixus e em
testes "in situ" (item 4.9.3) quando foi adicionado saliva de adultos de T. infestans sobre
o vaso dorsal de adultos de R. prolixus.
Em seguida foi realizada a caracterização e identificação da molécula salivar
19
com atividade paralisante sobre invertebrados. O delineamento experimental da parte 1
– Hemolinfagia está representado na figura 4.
Hemolinfagia em T. infestans
4.4 Hemolinfagia em
condições de laboratório
4.5 Influência sobre a taxa
de sobrevivência de ninfas
de primeiro estádio
Ação da saliva
4.9 Paralisante sobre invertebrados
4.9.1 Motilidade de ninfas de
segundo estádio de R. prolixus
injetadas com saliva
Sobre o sistema imune
de invertebrados
4.7 Fenoloxidase
não ativada
4.8 Fenoloxidase
ativada
Vaso dorsal de R. prolixus
4.9.2"In vivo"
4.9.3 "In situ"
4.10. e 4.11 Caracterização e identificação
da molécula salivar com atividade
paralisante
Figura 4 – Esquema representando a sequência de procedimentos experimentais realizados.
4.1 Manutenção dos insetos
As colônias de triatomíneos são mantidas sob condições semicontroladas de
temperatura e umidade (28 ± 2ºC e 65 ± 10%), com fotoperíodo de 12 horas de
claro/escuro no Laboratório de Fisiologia de Insetos Hematófagos (LFIH) do
Departamento de Parasitologia, ICB/UFMG. A alimentação dos insetos é realizada
semanalmente em ratos previamente anestesiados. Os espécimes de T. infestans são
oriundos de uma colônia originada de espécimes coletados em diferentes regiões da
20
Bolívia, e a de R. prolixus de insetos coletados em Honduras. Estas colônias são
mantidas no LFIH há mais de 10 anos.
4.2 Obtenção da saliva
A saliva de triatomíneos adultos foi coletada de acordo com Amino et al. (2001).
Inicialmente adultos de T. infestans foram imobilizados individualmente entre os dedos
de uma das mãos do coletor. Após assoprar levemente o inseto, a saliva do triatomíneo
era liberada pela extensão do rostro e coletada em um tubo capilar de vidro. A saliva era
transferida para um tubo de microcentrífuga (mantido em banho de gelo durante a
coleta), e posteriormente, armazenada em freezer a -20oC até seu uso. Foram obtidos
volumes de 0,5 a 1 μl de saliva por inseto.
Nos experimentos utilizando saliva bruta, a amostra foi seca utilizando uma
centrífuga evaporadora (Centrivap Concentrator) e dissolvida no mesmo volume inicial
com solução salina (154 mM de NaCl). Esse procedimento foi realizado para utilizar a
solução salina como controle nos experimentos e para comparar a saliva bruta com a
saliva semipurificada.
4.3 Semipurificação da saliva
A saliva bruta de adultos de T. infestans foi diluída em água MilliQ, na
proporção de 1:1, e submetida à fervura por 2 minutos. Em seguida, a amostra foi
centrifugada a 20.900 g durante 20 minutos à temperatura ambiente e o sobrenadante foi
transferido para uma coluna com limite de exclusão de 5 kDa (Ultrafree®-MC
Microcentrifuge). A porção ultrafiltrada (moléculas de peso molecular menor que 5
kDa) foi seca em centrífuga evaporadora e em seguida dissolvida (no mesmo volume
inicial) em solução salina. A saliva submetida a este tratamento foi chamada de
semipurificada.
21
4.4 Hemolinfagia e cleptohematofagia em condições de laboratório
Ninfas de segundo estádio de T. infestans, com estado fisiológico similar (10 a
15 dias em jejum e peso de 2 a 3 mg), foram colocadas em contato com ninfas de quinto
estádio ou adultos de R. prolixus. Espécimes de R. prolixus que haviam sido
alimentados 3 a 5 dias antes da realização dos experimentos, foram utilizadas nos
ensaios de hemolinfagia. Nos ensaios de cleptohematofagia os espécimes de R. prolixus
foram alimentados 1-3 horas antes da realização do experimento. A proporção utilizada
foi de 1 R. prolixus para 10 ninfas de T. infestans. Em alguns experimentos os
espécimes de R. prolixus estavam soltos sobre a placa e em outros eles foram
imobilizados com fita adesiva. Em alguns ensaios os espécimes de R. prolixus
imobilizados também foram mantidos durante 5 minutos em uma incubadora a 40oC
antes dos experimentos. As ninfas de T. infestans foram pesadas antes e após os ensaios
para o cálculo do ganho de peso. Cada experimento de hemolinfagia foi repetido 10
vezes.
4.5 Influência da hemolinfagia na taxa de sobrevivência das ninfas de T. infestans
Foram formados dois grupos (teste e controle) com 45 ninfas de primeiro estádio
de T. infestans, com estado fisiológico similar (2 dias após a muda e peso médio de 1,33
± 0,17 mg). No grupo teste, as 45 ninfas ficaram em contato com duas ninfas de quinto
estádio de R. prolixus, dentro de um pote de acrílico. No grupo controle, o pote de
acrílico, continha apenas as 45 ninfas de T. infestans. Os potes de acrílico eram forrados
com um papel de filtro no seu interior e tampados com uma malha de pano. Os grupos
foram mantidos sob as mesmas condições de temperatura e umidade do insetário de
triatomíneos. As ninfas de T. infestans foram pesadas a cada 15 dias, durante 120 dias.
As ninfas de quinto estádio de R. prolixus haviam sido alimentadas 3 a 5 dias antes de
22
serem utilizadas neste ensaio, e eram substituídas, por outras ninfas de quinto estádio,
24 horas após mudarem para o estágio adulto.
4.6 Estimativa do volume de hemolinfa
A estimativa do volume hemolinfa de uma ninfa de quinto estádio de R.
prolixus, foi feita de acordo com a metodologia de Naidu (2001). Dez ninfas de quinto
estádio de R. prolixus foram pesadas individualmente, e em seguida tiveram a cutícula
dorsal removida, e a hemolinfa coletada por capilaridade com o auxílio de um papel de
filtro. Essas ninfas foram então, pesadas novamente e o volume de hemolinfa foi
estimado pela subtração dos pesos.
4.7 Avaliação do efeito da saliva de T. infestans sobre a ativação da cascata da
profenoloxidase
Para avaliar o efeito da saliva sobre a ativação da profenoloxidase, os ensaios
foram realizados utilizando o método de Gomes et al. (2003) modificado. Trinta ninfas
de quarto estádio de R. prolixus com estado fisiológico similar (8 ± 2 dias após a muda e
peso médio de 18 ± 3 mg) foram injetadas lateralmente na região do tórax, com 552 nl
de salina ou saliva bruta de T. infestans. As injeções foram feitas usando um
microinjetor (Nanoinjector, Drummond). Ninfas não injetadas foram utilizadas como
grupo controle.
Vinte quatro horas após a injeção, as ninfas tiveram o fêmur (da terceira perna
direita) cortado para a coleta de hemolinfa. Foram montados “pools” de 2 μl de
hemolinfa provenientes de 2 ninfas. Cada "pool" de hemolinfa foi colocado em tubos de
microcentrífuga de 1,5 ml contendo 18 μl de tampão HEPES/NaCl (10 mM de HEPESNaOH, 154 mM de NaCl, 10 mM de CaCl2, pH 7.4)
23
Dez microlitros das amostras de hemolinfa diluída foram adicionados a uma
placa de 96 poços, contendo 35 μl de tampão HEPES/NaCl. As reações foram iniciadas
pela adição de 15 μl de uma solução de L-DOPA saturada (4 mg/ml) (Sigma Chemical
Company). A formação do DOPA-cromo, pela ação da fenoloxidase sobre L-DOPA, foi
medida espectrofotometricamente, a 492 nm em um leitor de placa (VersaMax Tunable
Microplate reader, Molecular Devices), a cada 30 segundos, a 28oC. As reações foram
realizadas durante 7,5 minutos e a média da velocidade máxima (aumento da
absorbância/minuto) foi usada para comparações entre os grupos (não injetado, injetado
com salina ou com saliva). Os ensaios foram feitos em duplicata para cada amostra,
totalizando 15 medidas da PO por grupo.
4.8 Avaliação do efeito da saliva de T. infestans sobre a atividade da fenoloxidase
Para avaliar o efeito da saliva sobre a atividade da fenoloxidase ativada, 30
ninfas de R. prolixus foram injetadas lateralmente na região do tórax, com 552 nl de
salina e tiveram sua hemolinfa coletada 24 horas após a injeção, conforme descrito no
item 4.7.
Antes de iniciar a reação com L-DOPA, as amostras foram divididas em duas
alíquotas de 10 μl (cada) e adicionadas a uma placa de 96 poços contendo 35 μl de
tampão HEPES/NaCl. Uma das alíquotas foi incubada por 10 minutos com 0,5 μl de
saliva bruta e a outra foi incubada com 0,5 μl de salina (controle). As medidas foram
feitas conforme descrito no item 4.7.
4.9 Caracterização da atividade paralisante
4.9.1 Efeito da injeção de saliva de T. infestans sobre a motilidade de ninfas de R.
prolixus
Ninfas de segundo estádio de R. prolixus com estado fisiológico similar (8 ± 2
24
dias após a muda) foram injetadas lateralmente na região do tórax, entre o primeiro e o
segundo par de pernas, com 276 nl de salina (controle), saliva bruta ou saliva
semipurificada de T. infestans. Após a injeção, cada ninfa foi colocada, sobre uma placa
de Petri, com a superfície dorsal para baixo e o tempo gasto para se desvirarem foi
medido e comparado com o grupo controle (injeção de salina). Vinte quatro horas após
a injeção, as ninfas que sobreviveram foram alimentadas em ratos (previamente
anestesiados), e o ganho de peso foi calculado.
4.9.2 Ensaio "in vivo" do efeito da saliva sobre o vaso dorsal de R. prolixus
O vaso dorsal dos triatomíneos é um tubo, localizado na linha mediana,
dorsalmente ao trato alimentar e que se estende do tórax ao abdômen (Fig. 5). A porção
posterior do vaso dorsal, o coração, é dividida por válvulas em uma série de câmaras,
cada uma das quais contendo um par de aberturas laterais (óstios). A parte anterior do
vaso dorsal, a qual não possui óstio, é a aorta dorsal. A hemolinfa circula
principalmente pela atividade de contração longitudinal do vaso dorsal, que se inicia da
parte posterior para a anterior, a qual se abre na cavidade geral do corpo, a hemocele
(Chiang et al., 1990).
25
Figura 5 – Esquema da região dorsal dos segmentos abdominal de triatomíneos (A) e detalhe
do vaso dorsal após a remoção do tergo (B). Legenda: I – IX divisões dos segmentos
abdominais. Adaptado de Ramirez-Perez (1969).
O triatomíneo R. prolixus foi escolhido como modelo experimental, pois seu
vaso dorsal apresenta coloração esverdeada (Fig. 6 e 7), devido ao acúmulo do
pigmento biliverdina nas células pericárdicas (Paiva-Silva et al., 2006; Wigglesworth,
1943), o que facilita a visualização do vaso dorsal e favorece o registo do seu
funcionamento, conforme metodologia descrita a seguir.
Para avaliar o efeito da saliva de T. infestans sobre o vaso dorsal de insetos,
durante a hemolinfagia, adultos de R. prolixus (que haviam se alimentado do sangue de
ratos, 5 dias antes da realização dos ensaios) foram imobilizados sobre uma placa de
Petri, as asas foram cortadas com o auxílio de uma tesoura e uma gota de óleo mineral
foi aplicada sobre o abdômen do inseto, para facilitar a visualização do vaso dorsal.
Nesta placa, foram adicionadas 10 ninfas de segundo estádio de T. infestans com estado
fisiológico similar (peso de 2 a 3 mg e em jejum de 10 a 15 dias). A atividade do vaso
dorsal de R. prolixus foi gravada utilizando uma câmera digital (Olympus C-4000)
acoplada a um microscópio estereoscópio (Olympus SZ4045). As imagens produzidas
26
foram analisadas utilizando o software ImageJ (Abramoff et al., 2004) para avaliar a
frequência e a amplitude das contrações do coração. Uma seção pré-definida da região
anterior contrátil do coração (entre os segmentos V ao VI) (Chiang et al., 1990),
contendo aproximadamente 1 mm do vaso dorsal foi selecionada e a área do vaso dorsal
incluída nessa seção foi medida em cada moldura do vídeo (25 frames/segundos).
Usando essa metodologia, as contrações são vistas como valores reduzidos da área do
vaso dorsal, enquanto que o relaxamento do vaso aumenta a área da seção selecionada
(Fig. 6). Os valores foram transferidos para o programa SigmaPlot v.8.0 para análise e
representação gráfica. As variações da área do vaso dorsal (que representa uma
estimativa do diâmetro do vaso) foram medidas durante todo o ensaio (antes, durante e
depois da hemolinfagia). Foram realizados cinco experimentos.
A
B
Figura 6 – Metodologia utilizada para avaliar a frequência e a amplitude das contrações do vaso
dorsal. (A) Seção selecionada da região anterior contrátil do coração entre os segmentos
abdominal V ao VI; (B) Detalhe da área do vaso dorsal selecionada que foi analisada utilizando
o programa ImageJ.
4.9.3 Ensaio "in situ" do efeito da saliva sobre o vaso dorsal de R. prolixus
Adultos de R. prolixus foram imobilizados sobre uma placa de Petri e tiveram
suas asas cortadas. Os segmentos abdominal II a VII (Chiang et al. 1990) foram
removidos e o vaso dorsal foi exposto (Fig. 7). O vaso dorsal foi tratado com 50 μl de
solução salina por 1 minuto a temperatura ambiente. Após esse período, a salina foi
27
removida e 1 μl das amostras: solução salina (controle) ou soluções testes (saliva bruta
ou saliva semipurificada), foram adicionadas na preparação. O processo foi gravado e
analisado utilizando o ImageJ conforme descrito no item 4.9. As variações da área do
vaso foram registradas durante 90 segundos após a adição das amostras. Depois desse
período, as amostras foram retiradas, através da adição de 50 μl de solução salina e as
batidas do coração foram analisadas por mais 30 segundos. Para avaliar a estabilidade
da preparação, foram realizados ensaios controles, com a adição de solução salina, que
demonstraram que os batimentos do vaso dorsal mantêm-se regulares (sem variação de
frequência e amplitude) por mais de uma hora, nas condições experimentais descritas
anteriormente. Foram realizados cinco experimentos.
A
B
Figura 7 – Detalhe do vaso dorsal de R. prolixus (seta) observado sob microscópio
estereoscópio. Cor esverdeada do vaso devido a presença da biliverdina. (A) Aumento de 8 X
após a remoção da região dorsal (tergo) do abdômen e (B) aumento de 30 X. Fonte: Alves,
2007.
4.10 Caracterização da natureza da molécula salivar com atividade paralisante
4.10.1 Tratamento com proteinase K
A saliva semipurificada (35 μl) foi seca em centrífuga evaporadora, dissolvida
no mesmo volume em solução salina e incubada com 1 μl de proteinase K (Promega) na
concentração final de 0.018 μg/μl em um volume final de 36 μl. Após 3 horas de
incubação a 37oC, essa mistura foi filtrada utilizando uma coluna com limite de
28
exclusão de 5 kDa (Millipore) (para remover as moléculas de proteinase K – 28,9 kDa)
e o filtrado (material com peso molecular inferior a 5 kDa) foi utilizado nos ensaios.
Como controle, 35 μl de solução salina também foram incubados com proteinase
K e submetidos aos mesmos procedimentos descritos anteriormente.
A atividade da proteinase K nas condições experimentais utilizada foi avaliada
pela sua capacidade de inativar a lisozima de acordo com o ensaio descrito por Cançado
et al. (2008).
4.10.2 Extração de lipídeos
Para a extração de lipídeos, 20 μl de saliva semipurificada foram adicionados a
180 μl de água MilliQ, 250 μl de clorofórmio e 500 μl de metanol. Essa mistura foi
vortexada a cada 5 minutos, durante 60 minutos. Em seguida ela foi centrifugada a 1000
g por 30 minutos.
A fase líquida foi separada do precipitado formado e adicionada a uma mistura
contendo 800 µl de clorofórmio e 800 µl de água destilada. Esta nova solução foi
homogeneizada por 30 segundos em vórtex e após centrifugação de 30 minutos a 1.000
g à temperatura ambiente, separou-se as duas fases formadas: a fase aquosa (porção
superior, não lipídica) e a fase orgânica (porção inferior contendo os lipídeos da
amostra). As amostras de cada fase (aquosa e orgânica) foram secas em centrífuga
evaporadora.
Para os ensaios, a fase aquosa foi dissolvida em 20 µl de salina, e a fase orgânica
em 20 µl de salina contendo 5% de dimetil sulfóxido (DMSO) (Sigma). Salina contendo
5% de DMSO foi usada como controle.
4.11 Cromatografia líquida de alta performance (HPLC)
Cinquenta microlitros de saliva semipurificada foram cromatografados em uma
29
coluna de fase reversa C8, utilizando um gradiente linear de acetonitrila (0 a 100%), em
35 minutos. Os picos foram monitorados no comprimento de onda de 215 nm. As
frações obtidas após a cromatografia foram coletadas e secas em uma centrífuga
evaporadora para a retirada da fase móvel. Posteriormente cada fração foi dissolvida em
10 µl de solução salina e utilizada nos ensaios de efeito sobre o vaso dorsal e de
motilidade de ninfas.
4.12 Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
A eletroforese em gel de poliacrilamida foi realizada de acordo com o método de
Laemmli (1970) modificado. As ninfas de segundo estádio de T. infestans após
realizarem a hemolinfagia ou cleptohematofagia tiveram o intestino (médio anterior)
dissecado e transferido para tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, contendo 10 µl de
solução salina (NaCl 154 mM). Cada tubo contendo o intestino médio anterior foi
macerado utilizando-se um pistilo de vidro, sonicado por 1 minuto, centrifugado por 5
minutos a 12.000 g e o sobrenadante dessas amostras foi adicionado ao tampão da
amostra contendo β-mercaptoetanol, e em seguida aplicado no gel. Para visualisar as
proteínas presentes, o gel foi corado com nitrato de prata.
4.13 Análise estatística
Os dados foram representados pela média ± desvio padrão. A normalidade dos
dados foi avaliada pelo teste Kolmogorov-Smirnov. Variáveis com distribuição normal
foram comparadas utilizando o teste de Qui-quadrado e/ou ANOVA seguida pelo teste
de Tukey para identificar diferenças entre os grupos.
30
5 Resultados – Parte 1 – Hemolinfagia
5.1 Caracterização da hemolinfagia e cleptohematofagia de ninfas de T. infestans
Nas condições utilizadas durante os ensaios, a hemolinfagia foi facilmente
induzida em laboratório. Quando as ninfas de segundo estádio de T. infestans (em jejum
de 10 a 15 dias) foram colocadas em contato com ninfas de quinto estádio ou adultos de
R. prolixus (que haviam se alimentado de sangue 3 a 5 dias antes da realização desse
experimento), aproximadamente 80% (n=100) perfuraram o abdômen dos espécimes de
R. prolixus (n=10) para se alimentarem. Quando os espécimes de R. prolixus foram
previamente aquecidos, aparentemente eles tornaram-se mais "atrativos", pois quase
todas as ninfas de T. infestans (98%, n=100) tentaram alimentar-se neles. Os insetos que
tiveram sua hemolinfa sugada manifestaram certo incômodo às picadas, e, às vezes,
retiravam as ninfas que tentavam se alimentar neles, com o auxílio de suas pernas.
Entretanto, alguns deles permaneceram imóveis por períodos de tempo relativamente
longos, o suficiente para permitir a alimentação de uma ninfa de segundo estádio.
Quando 10 adultos de R. prolixus (que haviam se alimentado de sangue 3 a 5
dias antes da realização desse experimento) foram imobilizados e colocados juntamente
com 100 ninfas de segundo estádio de T. infestans (em jejum de 10 a 15 dias) (Fig. 8),
10% das ninfas de T. infestans foram capazes de se alimentar e aumentar mais de duas
vezes o seu peso inicial (2,5 ± 0,3 mg). O ganho de peso médio das ninfas foi de 7,6 ±
2,3 mg. Várias ninfas perfuraram o abdômen dos insetos adultos, mas não se
alimentaram ou ingurgitaram menos que o dobro do peso inicial.
Interessantemente, o abdômen de uma ninfa de T. infestans recém alimentada de
hemolinfa apresentava-se mais claro (Figs. 8, 9A) e após a dissecação do inseto,
verificou-se que o conteúdo do intestino médio anterior era transparente (Fig. 9C),
indicando a ingestão de hemolinfa.
31
A
B
Figura 8 – Hemolinfagia de ninfas de segundo estádio de T. infestans em um espécime adulto
de R. prolixus (A e B).
Quando foram utilizadas ninfas de quinto estádio de R. prolixus recém
alimentadas de sangue (1 – 3 horas após repasto em hospedeiro vertebrado) foi possível
reproduzir em condições de laboratório a cleptohematofagia. As ninfas de segundo
estádio de T. infestans foram capazes de sugar o conteúdo intestinal dos espécimes de R.
prolixus, realizando assim a cleptohematofagia. O abdômen das ninfas que realizaram a
cleptohematofagia possuia cor escura (Fig.9B), e a vizualização do conteúdo do
intestino médio anterior, após dissecação do inseto, revelou uma coloração vermelha,
típica de sangue (Fig.9D).
A análise do perfil eletroforético referente às bandas do conteúdo intestinal de
ninfas de segundo estádio de T. infestans que realizaram cleptohematofagia, comparada
com o perfil das ninfas que realizaram hemolinfagia demonstra diferentes padrões de
bandas e a presença de grande quantidade de proteínas, no conteúdo intestinal das ninfas
que realizaram cleptohematofagia (Fig. 10).
32
A
B
C
D
Figura 9 – Aspecto do abodômen (A e B) e do conteúdo do intestino médio anterior (C e D) de
ninfas de segundo estádio de T. infestans após hemolinfagia (A e C) em ninfas de quinto estádio
de R. prolixus que haviam se alimentado de sangue 3 a 5 dias antes do experimento; e
cleptohematofagia (B e D) em ninfas de quinto estádio de R. prolixus que haviam se alimentado
de sangue 1 a 3 horas antes do experimento.
Figura 10 – Perfil eletroforético (SDS-PAGE 12,5%) do conteúdo intestinal de ninfas de
segundo estádio de T. infestans após hemolinfagia e cleptohematofagia em ninfas de R.
prolixus. Legenda: Colunas: 1 – Padrão de peso molecular; 2 – conteúdo do intestino médio
anterior após hemolinfagia; 3 – conteúdo do intestino médio anterior após cleptohematofagia.
5.2 Influência da hemolinfagia na taxa de sobrevivência de ninfas de T. infestans
A importância da hemolinfagia para ninfas, em estádios iniciais de
desenvolvimento, foi monitorada durante 120 dias (Fig. 11). O grupo controle foi
formado por 45 ninfas de primeiro estádio de T. infestans, enquanto que o grupo teste
era composto por 45 ninfas de primeiro estádio de T. infestans colocadas em contato
33
com duas ninfas do quinto estádio de R. prolixus (que haviam se alimentado de sangue
3 a 5 dias antes da realização desse experimento). Em comparação com o grupo
controle, o peso das ninfas de primeiro estádio do grupo teste foi significativamente
maior a partir de 30 dias do início do experimento, e manteve-se significativamente
maior até que todas as ninfas do grupo controle estivessem mortas (teste T, p <0,001), o
que aconteceu 60 dias após o início do experimento. As ninfas do grupo teste foram
capazes de manter ou aumentar seu peso corporal ao longo dos 120 dias (Fig. 11A),
indicando que elas estavam sugando a hemolinfa dos espécimes de R. prolixus e essa
ingestão de hemolinfa prolongou a sua taxa de sobrevivência (Fig. 11B). Duas ninfas
(4,4%) do grupo teste mudaram para o segundo estádio alimentando-se apenas de
hemolinfa. A quantidade média de hemolinfa de uma ninfa de quinto estádio de R.
prolixus foi estimada em 33,7 ± 6,9 mg (n = 10).
A
B
100
4,0
Controle
Teste
90
80
Controle
Teste
3,0
% de ninfas vivas
Peso médio das ninfas (mg)
3,5
*
2,5
*
2,0
*
1,5
70
60
50
40
30
1,0
20
0,5
10
0,0
0
30
45
60
75
90
105
120
Período de escassez de sangue (dias)
0
0
30
45
60
75
90
105
120
Período de escassez de sangue (dias)
Figura 11 – Hemolinfagia de ninfas de primeiro estádio de T. infestans em ninfas de quinto
estádio de R. prolixus. (A) Variação do peso corporal de ninfas de primeiro estádio de T.
infestans (média ± desvio padrão); (B) Taxa de sobrevivência de ninfas de primeiro estádio de
T. infestans. Os grupos continham 45 ninfas de primeiro estádio de T. infestans sozinhas
(controle) ou em contato com duas ninfas de quinto estádio de R. prolixus (teste). O asterisco
(*) indica uma diferença significativa em relação aos demais grupos (teste T, p <0,001).
34
5.3 Efeito da saliva de T. infestans sobre a ativação do sistema da profenoloxidase
(proPO)
Para verificar os efeitos da hemolinfagia de triatomíneos sobre o sistema imune
de hospedeiros invertebrados, a ativação da proPO foi avaliada 24 horas após a injeção
de 552 nl de saliva bruta de T. infestans em ninfas de quarto estádio de R. prolixus. Os
resultados demostraram que as ninfas injetadas com saliva tiveram uma atividade da PO
73% menor do que ninfas injetadas apenas com solução salina (ANOVA / Tukey, p
<0,001). Além disso, os insetos injetados com a saliva bruta tiveram um padrão de
ativação similar aos insetos do grupo não-injetado (ANOVA / ns) (FIG. 12A). Esses
resultados demonstram que quando os insetos são injetados com salina há uma ativação
da cascata da proPO, enquanto que nos insetos injetados com saliva bruta ocorre uma
inibição da ativação da cascata da proPO.
Diante desses resultados, foi avaliado se a atividade da PO (após ativação da
cascata da proPO pela injeção de salina) poderia ser inibida pela saliva de T. infestans.
A hemolinfa de ninfas de quarto estádio de R. prolixus (injetadas com solução salina 24
horas antes) foi incubada com saliva bruta ou solução salina, e a atividade da PO foi
medida. Não houve diferença na atividade da PO entre grupos de insetos injetados com
solução salina, que foram incubadas com saliva bruta ou com solução salina (FIG. 12B;
análise de variância, ns). Além disso, a atividade da PO no grupo das ninfas injetadas
com solução salina foi quatro vezes maior do que no grupo controle (ninfas não
injetadadas) (ANOVA / Tukey, p<0,001), demonstrando com isso, que a saliva de T.
infestans não inibiu diretamente a atividade da PO quando a cascata da proPO já estava
ativada.
35
A
B
Figura 12 – Efeito da saliva de T. infestans sobre a cascata da profenoloxidase (proPO) da
hemolinfa de ninfas de quarto estádio de R. prolixus. (A) Efeito da saliva na ativação da cascata
da proPO. (B) Efeito da saliva sobre a PO ativada. Os asteriscos (*) indicam uma diferença
significativa em relação aos demais grupos (ANOVA / Tukey, p <0,001). Os valores
correspondem à média ± desvio padrão de cada grupo.
5.4 Caracterização da atividade paralisante da saliva de T. infestans
Para avaliar se a saliva é capaz de promover outros efeitos que possam favorecer
a hemolinfagia, como por exemplo, a paralisia do inseto durante a retirada de hemolinfa,
ninfas de segundo estádio de R. prolixus foram injetadas com saliva bruta ou saliva
semipurificada de T. infestans. Todas as ninfas injetadas permaneceram imóveis por
pelo menos 10 minutos (Tab. 1). Aparentemente a saliva, ao ser injetada nas ninfas não
é nociva. Vinte quatro horas após a injeção de saliva bruta ou saliva semipurificada, a
mortalidade (X2, 3 g. l., p = 0,49) e o ganho de peso das ninfas após a alimentação em
ratos (ANOVA / ns) não foram significativamente diferentes do grupo controle (Tab. 1).
A mortalidade dos grupos foi aparentemente, uma consequência do dano causado pelas
injeções. O tempo total de paralisia foi considerado o período necessário para que as
ninfas se desvirassem. Mesmo após se desvirarem, as ninfas injetadas com amostras de
36
saliva bruta ou saliva semipurificada permaneceram com movimentos lentos por longos
períodos (~ 2 horas).
Tabela 1 - Efeito da injeção da saliva bruta ou semipurificada de T. infestans em ninfas
de segundo estádio de R. prolixus
Nos parâmetros mortalidade (X2, 3 graus de liberdade, p = 0,49) e o ganho de peso (ANOVA /
Tukey p>0,05) não há diferença estatística entre os grupos.
O funcionamento do vaso dorsal foi avaliado "in vivo", enquanto as ninfas de
segundo estádio de T. infestans alimentavam-se da hemolinfa de adultos imobilizados
de R. prolixus (Fig. 13A). A frequência e a amplitude das contrações vaso dorsal de R.
prolixus diminuiu gradualmente após a inserção das peças bucais das ninfas no seu
abdômen (n=5). A figura 13B representa um dos experimentos realizados, dos 90 aos
120 segundos após a picada onde, observa-se que a frequência e a amplitude das
contrações do vaso dorsal foram reduzidas em aproximadamente 46 e 50%,
respectivamente. Em alguns experimentos, as contrações do vaso dorsal pararam
completamente por períodos de até 20 segundos. Após o término do processo de
alimentação, as contrações do vaso dorsal mantiveram-se em baixas frequências e
amplitude por aproximadamente 5 minutos e voltaram a aumentar gradualmente até
atingirem os valores iniciais (n=5).
37
A
B
Figura 13 – Avaliação das contrações do vaso dorsal durante a hemolinfagia de ninfas de
segundo estádio de T. infestans em adultos de R. prolixus. (A) Vista do vaso dorsal (setas) por
transparência durante a hemolinfagia. (B) Representação gráfica da frequência e amplitude
relativa das contrações do vaso dorsal durante a hemolinfagia. O gráfico mostra os resultados de
um dos experimentos (n=5) e a primeira área medida do vaso dorsal foi considerada 100%.
A paralisia do vaso dorsal causada pela saliva foi confirmada por meio de um
sistema onde a frequência e a amplitude das contrações foram analisadas "in situ". A
adição de 1 μl de saliva bruta ou saliva semipurificada de T. infestans diretamente na
preparação de vaso dorsal de R. prolixus causou uma paralisia imediata e total das
contrações (n = 5 para cada amostra; Fig. 14). Esse efeito foi revertido imediatamente
após a lavagem com salina. Quando a saliva bruta foi aplicada, a frequência das
contrações permaneceu baixa por longos períodos (pelo menos 40 segundos) após a
lavagem (retirada da saliva pela adição de solução salina na preparação).
38
Figura 14 – In situ avaliação da frequência e da amplitude relativa das contrações do vaso
dorsal depois da adição da saliva bruta de T. infestans e lavagem (retirada) da amostra
adicionando solução salina à preparação. O gráfico representa um dos experimentos e a primeira
área medida do vaso dorsal foi considerada 100%.
5.5 Caracterização da molécula paralisante da saliva de T. infestans
O tratamento da saliva semipurificada com proteinase K não interferiu na
atividade paralisante sobre as contrações do vaso dorsal de R. prolixus que
permaneceram presentes (n = 3).
Após submeter a saliva semipurificada de T. infestans ao protocolo de extração
de lipídios, a molécula ativa estava presente na fase aquosa, que causou uma parada nas
contrações quando adicionada às preparações de vaso dorsal de R. prolixus (n = 3). A
frequência e a amplitude das contrações voltaram aos níveis anteriores à adição de
saliva após a lavagem. O material presente na fase orgânica não causou redução nas
contrações ou amplitude do vaso dorsal.
5.6. Identificação da molécula paralisante da saliva de T. infestans
Para identificar a molécula salivar com atividade paralisante, 50 µl de saliva
39
semipurificada de T. infestans foram cromatografados usando uma coluna de fase
reversa C8. Todas as frações resultantes da cromatografia foram testadas, e apenas as
frações 7 e 8 (correspondentes a dois picos sobrepostos) (Fig. 15) induziram uma
paralisia imediata das contrações do vaso dorsal de R. prolixus, e este efeito foi
revertido após a lavagem. Essas frações (7 e 8) também foram as únicas frações que
apresentaram atividade paralisante, quando injetadas em ninfas de segundo estádio de R.
prolixus. Ambas induziram uma paralisia por mais de 10 minutos em 62% (8 em 13)
das ninfas injetadas e os níveis de mortalidade foram inferiores a 15% (Tab. 2).
Figura 15 – Cromatograma da saliva semipurificada de T. infestans utilizando coluna C8 fase
reversa. A área pontilhada indica o pico contendo as frações (7 e 8) com atividade paralisante.
40
Tabela 2 – Paralisia de ninfas de segundo estádio de R. prolixus induzida pela injeção
das frações da saliva semipurificada de T. infestans após cromatografia em coluna C8 de
fase reversa.
Frações
testadas
Número de
ninfas por
grupo
Número de ninfas
imobilizadas por
mais de 10 minutos
Mortalidade
24 horas após
a injeção
Ganho de peso
24 horas após as
injeções (mg)
7
8
1, 3, 4, 5,
6,10,11, 13,
14, 18 e 19
13
13
5
8
8
0
2 (15.4%)
1 (7.7%)
0
9.06 ± 2.65
9.1 ± 2.48
9.03±1.61 a
9.24 ±1.67
5.7 Espectrometria de massa dos compostos ativos
Uma análise por espectrometria de massa das frações ativas (frações 7 e 8)
resultantes da cromatografia da saliva semipurificada de T. infestans, em coluna C8 de
fase reversa, identificou um composto com similaridade a alguns compostos orgânicos:
dissulfiram, 2-aminothiazol, benzeno, benzamidina e dapsona. Os compostos benzeno e
benzamidina possuem anel aromático em sua estrutura química; dapsona possui além do
anel aromático dois agrupamentos amina em sua estrutura química, enquanto que
dissulfiram e 2-aminothiazol possuem agrupamento amina (Fig.16).
Figura 16 – Fórmulas estruturais das moléculas orgânicas com similaridade ao composto
presente na fração purificada da saliva de T. infestans.
41
6 Discussão – Parte 1 – Hemolinfagia
Os resultados do presente estudo confirmaram que a hemolinfagia entre
triatomíneos é um comportamento comum, sobretudo nos primeiros estágios ninfais em
jejum prolongado. Ninfas de primeiro e segundo estádio utilizaram a hemolinfa de
ninfas de estágios mais avançados ou adultos como fonte de alimento. Entretanto, nós
observamos que algumas ninfas precisaram de estímulo extra para serem motivadas a se
alimentar da hemolinfa dos insetos alvos. Como o calor é atrativo para insetos
hematófagos (Ferreira et al., 2007), o aquecimento dos insetos alvos induziu um maior
número de ninfas em jejum a perfurar o corpo dele à procura de alimento (hemolinfa).
Embora outros estímulos possam estar relacionados a resposta de extensão da
probóscida (PER), resposta que antecede a picada no hospedeiro, o calor é um estímulo
importante para os triatomíneos (Guerenstein and Lazzari, 2009) e foi muito útil nos
experimentos para facilitar a observação da hemolinfagia, entretanto ele não foi um
estímulo essencial para a ocorrência da hemolinfagia.
A cleptohematofagia de ninfas de segundo estádio de T. infestans em ninfas de
quinto estádio de R. prolixus foi reproduzida apenas quando ninfas de R. prolixus recém
alimentadas de sangue (1 a 3 horas após respasto) foram utilizadas como insetos alvo.
As ninfas de segundo estádio de T. infestans foram capazes de sugar o conteúdo
intestinal dos insetos alvos, e a análise do conteúdo do intestino médio anterior dessas
ninfas demonstrou a presença de sangue.
Para evitar a cleptohematofagia nos experimentos de hemolinfagia, foram
utilizados insetos alvos que haviam realizado respasto sanguíneo pelo menos 3 dias
antes da realização dos ensaios; pois os triatomíneos assim que se alimentam de sangue
de hospedeiros vertebrados, ocorre no intestino uma rápida excreção dos líquidos
presente no sangue ingerido, e o conteúdo restante desse sangue é concentrado e
armazenado no intestino médio anterior (Lehane, 1996; Maddrell, 1964). Dessa forma,
42
3 dias após o repasto sanguíneo, o sangue no interior do intestino do triatomíneo
encontra-se concentrado e em alta viscosidade. Provavelmente esta é a razão das ninfas
de T. infestans não se alimentarem do conteúdo intestinal do inseto alvo (R. prolixus).
Ao examinar o conteúdo do intestino médio anterior das ninfas que realizaram
hemolinfagia aparentemente foi observada apenas a presença de hemolinfa.
Os ensaios avaliando a influência da hemolinfagia sobre a taxa de sobrevivência
de ninfas de primeiro estádio de T. infestans demonstraram que esse hábito é importante
durante períodos prolongados de escassez de sangue, pois ele possibilitou às ninfas que
se alimentaram de hemolinfa permanecerem vivas por longos períodos mesmo na
ausência de sangue. A ingestão de hemolinfa prolongou em mais de 50% o período de
sobrevivência dessas ninfas, quando comparado com ninfas submetidas ao jejum total
de alimento. As ninfas que realizaram a hemolinfagia foram capazes de sobreviver por
pelo menos 120 dias, enquanto as ninfas submetidas ao jejum de sangue e de hemolinfa
sobreviveram menos de 75 dias. Estudos anteriores demonstraram que ninfas de
primeiro estádio de T. infestans sobrevivem por 31 a 90 dias sem alimento
(Perlowagora-Szumlewicz, 1969). Interessantemente, ninfas de primeiro estádio,
aparentemente, alimentam-se exclusivamente de ninfas de estádio mais avançados,
como quarto, quinto estádio ou adultos. Não foi observada hemolinfagia entre ninfas de
estádios iniciais como primeiro e segundo. As ninfas de T. infestans que sobreviveram
alimentando-se exclusivamente de hemolinfa de R. prolixus não tiveram nenhum dano
fisiológico aparente e após o término dos experimentos elas foram capazes de realizar
respasto sanguíneo em hospedeiro vertebrado (rato, previamente anestesiado)
normalmente. O ganho de peso e o tempo de muda foram similares aos de ninfas de
segundo estádio da colônia (dados não mostrados). Na natureza, onde hospedeiros
43
vertebrados não estão sempre disponíveis, as ninfas que ingerem hemolinfa certamente
obtêm uma vantagem considerável sobre outras ninfas em jejum total de alimento.
O comportamento de agregação dos triatomíneos em abrigos também pode
favorecer a hemolinfagia. Pires et al. (2002) observaram que ninfas em estádios iniciais
e adultos de T. infestans, assim como de P. megistus tendem a ficar agregadas em locais
onde a superfície está impregnada por suas fezes e/ou substâncias cuticulares. Esta
tendência de agregação também tem sido observada nos triatomíneos R. prolixus e T.
infestans de maneira inter e intraespecífica (Figueiras and Lazzari, 2002). Na natureza
essa agregação favoreceria a hemolinfagia de ninfas de estádios iniciais em outras
ninfas e/ou adultos, proporcionando a elas uma fonte constante de alimento no próprio
abrigo, evitando assim a exposição a possíveis predadores durante a busca por um
hospedeiro vertebrado. Além disso, os abrigos oferecem condições ideais para a
reprodução, proteção e postura, e, portanto, para a colonização do habitat pelo
triatomíneo (Vitta et al., 2007).
Com relação à saliva dos triatomíneos, os resultados encontrados no presente
estudo sugerem que, assim como na hematofagia, a saliva pode ser também importante
para a hemolinfagia. A saliva de T. infestans foi capaz de inibir a ativação da cascata da
proPO. Em invertebrados, as respostas imunes são imediatas (Cerenius et al., 2010;
Vilmos and Kurucz, 1998), e uma inibição parcial ou total delas favoreceria a
hemolinfagia, ao evitar o aparecimento de respostas imunes (por exemplo, a coagulação
da hemolinfa) próximas ao local da picada. Foi demonstrado que um aumento na
viscosidade da dieta ingerida reduz a eficiência alimentar dos triatomíneos (Smith,
1979). Dessa maneira, um aumento na viscosidade da hemolinfa, devido à ativação da
cascata de coagulação dificultaria a hemolinfagia.
44
Acredita-se que os sinais de ativação, da PO e de outras respostas imunes de
invertebrados como degranulação celular, síntese de proteínas antimicrobianas e
coagulação de hemolinfa, são os mesmos, pelo menos em algum grau (Jiravanichpaisal
et al., 2006; Lemaitre and Hoffmann, 2007). A saliva de T. infestans contém serpinas
que são importantes inibidores de serino proteases. Serino proteases estão envolvidas na
inflamação, coagulação sanguínea e ativação do complemento, bem como na regulação
da ativação da PO (Assumpção et al., 2008; Soderhall and Cerenius, 1998) . As serpinas
seriam moléculas que, poderiam estar inibindo a ativação da proPO, entretanto esta
suspeita ainda dever ser confirmada uma vez que as moléculas que inibem essa ativação
ainda não são conhecidas.
Outra evidência de que a saliva de T. infestans é capaz de interferir no sistema
da profenoloxidase são as observações indiretas do conteúdo intestinal das ninfas que
ingeriram hemolinfa. A hemolinfa ingerida apresentou uma cor amarelo clara e não
marrom escura (cor característica de hemolinfa coletada na ausência de inibidores, após
poucos minutos). Esta cor escura é devida à deposição de melanina, um dos produtos
gerados pela ativação do sistema da profenoloxidase. Contudo, não podemos descartar a
possibilidade de que a inibição do sistema da proPO seja devida ou auxiliada por
moléculas presentes no intestino médio anterior.
Interessantemente, quando a saliva de T. infestans foi adicionada a hemolinfa
contendo a cascata da proPO ativada, não houve redução na atividade da PO já formada,
sugerindo que a saliva só atua sobre o processo de ativação inicial e não sobre os fatores
intermediários da cascata.
É importante ressaltar que para avaliar os efeitos da saliva sobre a cascata proPO
durante hemolinfagia, a atividade da PO deveria ser medida em um período de 0 a 15
minutos após a picada/lesão, esse período corresponde ao tempo médio que ninfas de
45
segundo estádio gastam para se alimentarem (Guarneri et al., 2003; Guarneri et al.,
2000b). Além disso, uma vez que a ativação da PO é imediata e altamente localizada
(Richman and Kafatos, 1996), uma melhor caracterização seria obtida somente através
da avaliação do efeito local de saliva. Embora essas análises não tenham sido realizadas,
os resultados obtidos 24 horas após as lesões terem sido provocadas podem ser
indicativos sobre os eventos que ocorrem durante esses períodos iniciais.
Durante a hemolinfagia, também foi observado que alguns espécimes de
triatomíneos alvos demonstravam incômodo às picadas exercidas pelas ninfas que se
alimentavam neles, e às vezes, eles tentavam remover essas ninfas com as pernas.
Apesar desta tentativa de remoção, as ninfas eram capazes de se alimentar. E, quando os
espécimes alvos foram imobilizados, o número de ninfas que se alimentaram neles
aumentou. As observações deste estudo corroboram os estudos anteriores de Ryckman
(1951) e Lorosa et al. (2000) que demonstraram que os insetos alvos permanecem com
motilidade reduzida ou imóveis, durante a hemolinfagia, por um período de tempo
suficiente para as ninfas completem a sua alimentação. A saliva pode ter um papel
importante nesta imobilização. Foi demonstrado que ninfas de segundo estádio de T.
infestans são capazes de reduzir consideravelmente a amplitude e as contrações do vaso
dorsal de R. prolixus (ensaios in vivo) quando se alimentaram da hemolinfa de adultos.
Para caracterizar essa atividade paralisante, a saliva foi testada em dois
diferentes modelos. No primeiro modelo, a saliva de insetos adultos de T. infestans foi
adicionada diretamente no vaso dorsal de adultos de R. prolixus (ensaios in situ) e
produziu um efeito semelhante aos observados durante a hemolinfagia de ninfas de
segundo estádio de R. prolixus. A saliva de T. infestans causou uma redução na
amplitude e na frequência de contrações do vaso dorsal de R. prolixus tanto nos ensaios
in situ quanto nos in vivo, e em algumas vezes foi observada uma parada total das
46
contrações do vaso dorsal. No segundo modelo, a saliva de adultos de T. infestans foi
injetada no tórax de ninfas de segundo estádio de R. prolixus, e uma única injeção de
276 nl de saliva causou a paralisia dos insetos por mais de 10 minutos.
A saliva de insetos adultos de T. infestans foi utilizada nos experimentos, pois a
extração de uma quantidade suficiente de saliva de ninfas de segundo estádio é
extremamente difícil. Embora trabalhos anteriores demonstrem que os componentes
salivares dos triatomíneos podem variar ao longo de seu desenvolvimento (Guarneri et
al., 2003; Moreira et al., 2003), a molécula responsável pela atividade paralisante parece
ser expressa nos estádios ninfais e no estágio adulto do inseto.
Analisando os possíveis efeitos nocivos da saliva sobre insetos alvos, nosso
trabalho está de acordo com estudos anteriores, que demonstram que em condições de
laboratório, a hemolinfagia exercida por triatomíneos aparentemente não causa
nenhuma pré-digestão do tecido ou a morte dos espécimes alvos (Lorosa et al., 2000;
Ryckman, 1951). Aparentemente a saliva liberada durante a hemolinfagia apenas
provoca uma paralisia (parcial ou total) temporária (Noireau et al., 2005).
Embora a saliva de T. infestans possua uma proteína formadora de poros,
trialisina, que é capaz de lisar células de bactérias e tripanossomatídeos, e em altas
concentrações lisar eritrócitos de mamíferos (Amino et al., 2002), e serino proteases
(Amino et al., 2001), (que provavelmente possuem uma função de ativar outras
moléculas salivares, e não função digestiva), no presente estudo nenhum efeito nocivo
aparente da saliva de T. infestans foi observado quando ela foi injetada em ninfas de R.
prolixus. As ninfas foram capazes de se alimentar 24 horas após a injeção e mudaram
para o estádio seguinte sem problemas aparentes.
Os ensaios de caracterização da molécula com atividade paralisante indicam que
ela é termo-estável e tem baixo peso molecular (<5 kDa). A atividade da molécula foi
47
mantida após a remoção da fase lipídica e após o tratamento da amostra com proteinase
K. Essas características (não lipídica ou protéica, de baixo peso molecular) apresentadas
pela molécula dificultam a manipulação e a caracterização do composto funcional.
Embora a filogenia dos triatomíneos seja controversa, todos os autores
concordam com a existência de um predador reduviídeo como ancestral das espécies
hematófagas da subfamília Triatominae (Hypsa et al., 2002; Schofield, 1988). A saliva
de insetos predadores contém muitas proteases digestivas, que são responsáveis pela
pré-digestão dos tecidos das presas e causam muita dor. Em triatomíneos, essas enzimas
foram perdidas, durante a evolução para a hematofagia, possibilitando então ao inseto
ingerir sangue pela picada indolor (Tartarotti et al., 2004). O fato de moléculas salivares
de triatomíneos não matarem ou digerirem o inseto alvo, mas apenas provocarem uma
paralisia temporária torna o processo de hemolinfagia mais parecido com a hematofagia
do que com a predação. Essa paralisia temporária pode estar relacionada à presença de
inibidores de canais de sódio na saliva de T. infestans (Dan et al., 1999), os quais
paralisariam os hospedeiros invertebrados e atuariam como um composto anestésico em
animais vertebrados. A hemolinfagia pode ser um hábito remanescente da evolução dos
triatomíneos hematófagos a partir de predadores reduviídeos (Schofield, 1988) ou
apenas uma variação da hematofagia. A hemolinfagia nas espécies hematófagas pode ter
experimentado uma pressão positiva durante a evolução para minimizar a dependência
constante destes insetos por sangue de hospedeiros vertebrados.
Além dos triatomíneos, outras espécies de insetos hematófagos (dípteros)
também possuem relatos de hemolinfagia. Em condições de laboratório, fêmeas dos
mosquitos Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) e Culex tarsalis Linnaeus, 1758 podem se
alimentar dos fluidos (hemolinfa) de larvas de lepidópteros e produzirem ovos viáveis
sem terem se alimentado de sangue (Harris and Cooke, 1969). Fêmeas do mosquito
48
Mansonia titillans (Walker, 1848) frequentemente sugam o conteúdo intestinal de
outros mosquitos que haviam se alimentado recentemente de sangue ou outros fluidos
(Burton, 1963).
Os experimentos de caracterização da hemolinfagia confirmaram que os
triatomíneos podem alimentam-se em indivíduos de outras espécies de triatomíneos,
entretanto na natureza, diferentes espécies de triatomíneos vivendo junto no mesmo
ecótopo é uma ocorrência incomum (Pires et al., 2002). R. prolixus e T. infestans
possuem diferentes distribuições geográficas e habitam distintos ecótopos (Noireau et
al., 2005). Diferentes espécies de invertebrados têm sido encontradas compartilhando os
mesmos ecótopos dos triatomíneos e foi demonstrado que espécimes de baratas
(Dictyoptera) podem representar uma importante fonte de hemolinfa (Freitas et al.,
2005; Lorosa et al., 2000; Ruas-Neto et al., 2001). Portanto, a ocorrência da
hemolinfagia em triatomíneos deve ser mais frequente entre indivíduos da mesma
espécie e/ou em outros invertebrados que compartilham os mesmos ecótopos.
Resultados preliminares, da análise por espectrometria de massa das frações da
saliva semipurificada de T. infestans (obtidas após cromatografia) identificou
similaridade da molécula paralisante com alguns compostos orgânicos como:
dissulfiram, 2-aminothiazol, dapsona, benzeno e benzamidina. Dentre estes compostos,
os dois primeiros apresentam agrupamentos amina em suas estruturas químicas, os dois
últimos possuem um anel aromático, e a dapsona apresenta tanto o agrupamento
aromático, quanto agrupamentos amina.
Fámacos descritos com propriedade bloqueadora de canais de sódio possuem
uma estrutura química formada por um anel aromático (que é a porção lipossolúvel do
fármaco, responsável pela penetração no nervo) e ligantes intermediários de
agrupamentos amina (que é a porção hidrofílica da molécula, que determina a
49
velocidade de ação do fármaco) (Becker and Reed, 2006). Nossa hipótese é que a
atividade paralisante presente na saliva de T. infestans possa ter o mesmo mecanismo de
ação da atividade bloqueadora de canais de sódio descrita por Dan et al., 1999.
50
7 Conclusões – Parte 1 – Hemolinfagia
 Ninfas de triatomíneos em estádios iniciais, em jejum, frequentemente realizam
a hemolinfagia em ninfas de estádios mais avançados.
 Na ausência de sangue de hospedeiro vertebrado, a hemolinfagia representa uma
fonte alternativa de alimentação para os triatomíneos, capaz de prolongar taxa de
sobrevivência das ninfas.
 A saliva de T. infestans é capaz de inibir a ativação da cascata da proPO de
invertebrados; entretanto, não exerce efeito sobre a PO ativada.
 A saliva de T. infestans causa in vivo uma paralisia temporária, sem causar danos
significativos para as ninfas, e quando aplicada sobre o vaso dorsal de R.
prolixus é capaz de paralisar os batimentos.
 A molécula responsável pela atividade paralisante presente na saliva de T.
infestans é termorresistente, possui baixo peso molecular (<5 kDa), e sua
natureza provavelmente não é protéica ou lipídica.
51
8 Material e Métodos – Parte 2 – Atividade hemaglutinante
8.1 Obtenção do intestino médio anterior e preparação dos extratos
O intestino médio anterior das ninfas de T. infestans foi dissecado com o auxílio
de pinças e tesoura sob microscópio estereoscópico e transferido para tubos de
microcentrífuga de 1,5 ml contendo solução salina (NaCl 154 mM), na proporção de 1
intestino para 10 µl de solução salina.
Cada tubo contendo o intestino médio anterior foi macerado utilizando-se um
pistilo de vidro, sonicado por 1 minuto, centrifugado por 5 minutos a 12.000 g e o
sobrenadante foi transferido para um novo tubo e estocado a -20oC até o uso.
8.2 Preparação da suspensão de hemácias
Para a preparação da suspensão de hemácias, o sangue de diferentes hospedeiros
vertebrados foi retirado utilizando-se o sal sódico do ácido etilenodiamino tetra-acético
– EDTA (20 µl de EDTA 300 mM / ml de sangue) como anticoagulante. O sangue foi
centrifugado por 15 min a 5.000 g, o plasma foi descartado e as hemácias foram
resuspendidas em solução salina ajustando o hematócrito para a concentração de uso de
cada ensaio.
Os hospedeiros vertebrados utilizados para coleta de sangue (Tabela 4) foram:
camundongos Mus musculus (Linnaeus, 1758) das linhagens: Swiss, Balb/C e Hairless;
hamster – Mesocricetus auratus Waterhouse, 1839; rato – Rattus norvegicus
Berkenhout, 1769; Coelho – Oryctolagus cuniculus (Linnaeus, 1758), gerbil – Meriones
unguiculatus Milne-Edwards, 1867; galinha – Gallus gallus domesticus (Linnaeus,
1758); boi – Bos taurus Linnaeus, 1758; cachorro – Canis lupus familiaris Linnaeus,
1758; carneiro – Ovis aries Linnaeus, 1758; homem – Homo sapiens Linnaeus, 1758.
52
8.3 Ensaio de hemaglutinação em lâmina
Em uma lâmina de microscopia de vidro foram adicionados 9 µl de suspensão de
hemácias no hematócrito 15% e 1 µl do extrato de intestino médio anterior. Após
homogeneização, a mistura foi examinada entre lâmina e lamínula ao microscópio
óptico para verificar a ocorrência do fenômeno de aglutinação sobre hemácias de
diferentes hospedeiros vertebrados. Como controle o extrato de intestino médio anterior
foi substituído por 1 µl de solução salina.
8.4 Ensaio de hemaglutinação em espectrofotômetro
Para avaliar a cinética do fenômeno e quantificar o nível de aglutinação, 5 l de
extrato de intestino médio anterior de ninfas de terceiro estádio de T. infestans, com
diferentes dias pós muda (0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 15 e 25 dias) foram adicionados a orifícios
de uma placa de 96 poços contendo 5 l de solução salina. O fenômeno foi disparado
pela adição de 100 l de suspensão de hemácias com hematócrito ajustado para 5% com
solução salina. No grupo controle, o extrato de intestino foi substituído por solução
salina. A variação na turbidez (porcentagem de redução da absorvância) em cada
amostra foi avaliada por 10 minutos a 650 nm em um leitor de ELISA (VersaMax
Tunable Microplate Reader, Molecular Devices) por leituras realizadas a cada 13
segundos, com agitação de 8 segundos nos intervalos de cada leitura.
Para calcular a redução da absorvância da amostra, o valor inicial da absorvância
a 650nm foi subtraído da média dos três menores valores da absorvância. E, esses
valores foram convertidos em porcentagem, sendo o valor inicial da absorvância a 650
nm considerado 100%. A figura 17 ilustra os valores da absorvância, quando não há
hemaglutinação (1) e quando ocorre hemaglutinação (2), demonstrando a diferença dos
perfis e dos valores das absorvâncias, durante os 10 minutos de ensaio. A média dos
53
valores da redução da absorvância obtidas de 8 amostras de intestino médio anterior, por
cada grupo, foram utilizadas para caracterizar a atividade hemaglutinante.
100
% relativa de absorvância (650 nm)
(1)
95
90
85
(2)
80
75
0
100
200
300
400
500
600
Tempo (segundos)
Figura 17 – Representação dos perfis e dos valores relativos de absorvância obtidos nos ensaios
de hemaglutinação em espectrofotômetro.
Legenda: (1) –
ausência de hemaglutinação; (2) -- -- presença de hemaglutinação.
8.5 Caracterização da molécula hemaglutinante
Para os ensaios de caracterização da molécula hemaglutinante foram utilizados
extratos de intestino médio anterior retirados de ninfas de quinto estádio de T. infestans
a partir do 15º dia após a muda, na proporção de 1 intestino para 10 µl de solução salina.
8.5.1 Quantificação do título de hemaglutinação
Alíquotas de 30 µl, de três "pools" diferentes de extrato intestinal de ninfas de
quinto estádio foram diluídas em série no fator 2 para avaliar os títulos de
hemaglutinação em lâmina.
54
8.5.2 Tratamento térmico do extrato intestinal
Trinta microlitros de extrato intestinal de ninfas de quinto estádio foram
aquecidos a 98°C por 5 minutos, em seguida a amostra foi centrifugada por 5 minutos a
12.000 g e o sobrenadante resultante foi chamado de extrato de intestino tratado
termicamente e seus títulos de hemaglutinação foram reavaliados. Foram realizadas 3
repetições com 3 amostras de "pools" diferentes.
8.5.3 Quantificação de proteínas antes e após o tratamento térmico
A concentração de proteínas do extrato de intestino médio anterior de ninfas de
quinto estádio foi estimada antes e após o tratamento térmico, pelo método de Bradford
(1976), para estimar a perda de proteína após o tratamento térmico. Foram quantificadas
individualmente 10 amostras de extrato intestinal de 10 ninfas.
8.5.4 Tratamento do extrato intestinal com proteases
Duas alíquotas do extrato de intestino médio anterior de ninfas de quinto estádio,
tratado e não tratado termicamente, contendo 100 g de proteína em um volume de 25
µl cada, foram tratadas com 0,5 µg/µl de proteinase K (Sigma-Aldrich) ou tripsina
(Sigma-Aldrich) em tampão HEPES (HEPES-NaOH 20 Mm, NaCl a 154 mM, pH 7,4)
em volume final de 50 µl, e o tratamento foi feito por 4 horas a 37ºC.
Como controle, 100 g de proteínas do extrato de intestino tratado e não tratado
termicamente foram mantidos nas mesmas condições, porém sem a adição de proteinase
K ou tripsina.
Após a incubação as amostras tratada e não-tratada com proteinase K ou tripsina
foram fervidas por 3 minutos, centrifugadas por 3 minutos a 12.000 g e o sobrenadante
foi utilizado nos ensaios de hemaglutinação.
55
Também foi realizado um controle, contendo apenas protease (proteinase K ou
tripsina) diluídas em solução tampão e submetidas aos mesmos procedimentos descritos
anteriormente.
8.5.5 Estabilidade térmica
Para determinar a estabilidade térmica da atividade hemaglutinante, amostras de
intestino médio anterior tratado e não tratado termicamente foram incubadas por 30
minutos, em diferentes temperaturas (10oC, 23oC, 37oC, 45oC, 60oC e 72oC).
8.5.6 Efeito da variação do pH sobre a atividade hemaglutinante
Em 9 l de suspensão de hemácias, no hematócrito 15%, diluídas em diferentes
pHs de soluções: citrato – (20 mM de ácido cítrico-NaOH, NaCl a 154 mM ) em pHs 3
e 5; MES (20 Mm de MES, NaCl a 154 mM) em pH 6; HEPES (20 Mm de
HEPES/NaOH, NaCl a 154 mM) em pH 7; TRIS (20 mM de Tris/HCl, NaCl a 154
mM) nos pHs 8, 9 e 10 foram adicionados 1 l de amostras de extrato intestinal de
ninfas de quinto estádio e o efeito da variação do pH sobre a atividade hemaglutinante
do conteúdo intestinal foi avaliada.
8.5.7 Tratamento do extrato intestinal com colágeno e gelatina
Cem microlitros de extrato de intestino de ninfas de quinto estádio tratado e não
tratado termicamente foram incubados com 4 mg de colágeno tipo I nativo (SigmaAldrich) e mantidos por 30 minutos à temperatura ambiente. Dez microlitros dessa
solução foram retirados, diluídos em série e utilizados nos ensaios de hemaglutinação
em lâmina.
Dez microlitros de extrato de intestino de ninfas de quinto estádio tratado e não
tratado termicamente foram adicionados de gelatina para a concentração final de 2% e
56
mantidos por 5 minutos a temperatura ambiente. Alíquotas de 1 l dessa solução foram
retiradas e utilizadas nos ensaios de hemaglutinação em lâmina.
8.6 Semipurificação do extrato de intestino
Amostras de extrato de intestino de ninfas de quinto estádio tratado e não tratado
termicamente foram transferidos para colunas com limite de exclusão de 30 e 100 kDa
(Ultrafree®-MC Microcentrifuge/Milipore) e ultrafiltrados a 4.900 g a 4 oC até que
quase todo o conteúdo passasse pela membrana. A parte superior do filtro foi lavada por
três vezes com solução salina e coletada em um novo tubo de 1,5 ml. As alíquotas que
continham as moléculas acima de 100 kDa, abaixo de 100 kDa e abaixo de 30 kDa
foram testadas nos ensaios de hemaglutinação em lâmina.
8.7 Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
A eletroforese em gel de poliacrilamida foi realizada de acordo com o método de
Laemmli (1970) modificado. As amostras foram adicionadas ao tampão da amostra
contendo ou não β-mercaptoetanol, e em seguida foram aplicadas no gel. Para visualisar
as proteínas presentes, os géis foram corados por azul de comassie.
8.8 Eletroeluição
Foi realizada uma eletroforese em gel de poliacrilamida a 7,5%, de canaleta
única, onde foram aplicados 200 l da amostra (160 l de extrato de intestino de ninfas
de quinto estádio + 40 l de tampão da amostra sem β-mercaptoetanol). Após 45
minutos de corrida, a 120 V, o gel foi corado durante 15 minutos com solução de azul
de comassie (1,25 g de azul de comassiee, 35 ml de ácido acético, 25 ml de metanol,
água deslitilada qsp 500 ml) e descorado com solução descorante (10% de ácido acético,
57
(7%) metanol, água qsp 100ml) até que fosse visualizada uma banda de alto peso
molecular (banda de interesse).
A banda foi excisada do gel com o auxílio de um estilete, cortada em pequenos
pedaços (1 a 2 mm) e transferida para uma membrana de diálise com limite de exclusão
de 12 kDa. A membrana de diálise foi colocada horizontalmente em uma cuba de
eletroforese contendo tampão de corrida (25 mM Tris base, 192 mM glicina, 0,1 %
SDS). As proteínas foram eletroeluídas a 100 V, por 1 hora, em gelo. A fase líquida foi
transferida para uma nova membrana, e submetida a uma diálise em 2 litros de solução
salina, a 4 oC, por 24 horas.
Após a diálise foi realizada uma eletroforese em gel de poliacrilamida para
verificar a presença da proteína.
8.9 Imunização
Quatro camundongos Balb/c, de seis semanas de idade, foram utilizados para
imunização. Cada camundongo recebeu, por via intraperitonial, uma injeção contendo
24 µg da amostra resultante da eletroeluição (10 µl da amostra diluída em 90 µl de
salina) emulsificado em 100 µl do adjuvante de Freund. Cada camundongo recebeu 4
injeções, com intervalos de 7 dias entre as aplicações, e após 1 mês de imunização, os
animais foram anestesiados com Tiopental (100 mg/kg), o sangue foi retirado
diretamente do ventrículo esquerdo com uma seringa, transferido para um tubo e
mantido a temperatura ambiente por 1 hora. Após a centrifugação a 1000 g por 30
minutos, o soro foi retirado e armazenado a -20oC até o uso.
8.10 Western Blot
Foi realizada uma eletroforese em gel de poliacrilamida 15%, onde foram
aplicados em cada canaleta, 10 µg da proteína de 16,5 kDa, 5 µl do extrato de intestino
58
de ninfas de quinto estádio tratado termicamente e 5 µl do extrato de intestino de ninfas
de quinto estádio não tratado termicamente. Obteve-se a réplica do gel em membrana
de nitrocelulose (HybondTM-P, Amersham Biosciences) após transferência, a 80-90 V
(~200 mA) por 2 horas, em banho de gelo. Os sítios de ligação livres da nitrocelulose
foram saturados com PBS-Tween (PBS/T, pH 7,4) a 0,1% contendo 10% de leite em pó
desnatado (Molico, Nestlé) por 2 horas, sob agitação. Em seguida, a membrana foi
lavada 3 vezes, durante 10 minutos com PBS/T, sob agitação e armazenada a -20 oC. No
dia seguinte, a membrana foi incubada por 1 hora com os soros dos camundongos
diluídos em PBS/T na concentração de 1/200, à temperatura ambiente, sob agitação.
Após 3 lavagens de 7 minutos, com PBS/T, sob agitação, foi feita a incubação da
membrana por 1 hora com anti-IgG de camundongo conjugado com peroxidase diluído
em PBS (pH 7,4) na concentração de 1/1000. Após esse período, a membrana foi
novamente lavada, 2 vezes, por 7 minutos, com PBS/T e 1 vez com PBS e, então,
revelada com os reagentes do kit DAB Substrate Kit for Peroxidase (Vector
Laboratories Inc.).
8.11 Espectrometria de massa: Obtenção e análise dos peptídeos
O espectrômetro de massa sistema MALDITOF-TOF MS (Autoflex III
Smarbeam, Bruker Daltonics) utilizado pertence ao Núcleo de Estrutura e Função de
Biomoléculas do Departamento de Bioquímica e Imunologia, ICB/UFMG e as análises
foram feitas pelo Dr. Agenor Vasconcelos.
Após a realização da eletroforese, as bandas de interesse, foram coradas por azul
de comassie, excisadas do gel com o auxílio de lâmina de bisturi, descoradas em
solução de acetonitrila 50% contendo bicarbonato de amônio 25 mM, pH 8,
desidratadas com acetonitrila 100% e em seguida secas em uma centrífuga evaporadora.
Posteriormente, as amostras foram tratadas com tripsina e mantidas a 37oC por 16 horas.
59
As soluções contendo os peptídeos resultantes da tripsinólise das amostras foram
dessalinizadas utilizando-se micro colunas de purificação C18 Zip Tip (MilliporeBreadford, EUA) de acordo com as recomendações do fabricante. As amostras foram
aplicadas em uma placa MTP (Anchorchip 800/384), juntamente com a matriz CHCA
(ácido -ciano-4-hidroxicinâmico), e analisadas em modo refletido. Os peptídeos
observados foram fragmentados e analisados nos programas FlexAnalysis 3.0 (Bruker
Daltonics) e Bio tools 3.0 (Bruker Daltonics).
As sequências de peptídeos derivadas das amostras estudadas sob análise de
espectrometria de massa e espectrometria de massa em tandem foram confrontadas com
os bancos de dados disponíveis na internet.
8.12 Silenciamento Gênico por RNAi
Nos ensaios de RNAi foram utilizadas ninfas de terceiro estádio de T. infestans.
8.12.1 Extração de RNA, síntese de cDNA e PCR
A extração de RNA do intestino médio anterior foi feita a partir de um “pool” de
4 intestinos (médio anterior) dissecados de ninfas de terceiro estádio de T. infestans
utilizando o kit RNeasy Mini kit (Qiagen,USA) de acordo com as recomendações do
fabricante. O RNA das amostras de intestino foi eluído em 24 µl de água milliQ estéril e
quantificado em espectrofotômetro na absorbância de 260 nm. Para essa quantificação,
foram utilizados 4 µl do eluído, diluídos 1:25 em um volume final de 100 µl de água
milliQ. A concentração de RNA nas amostras foi avaliada considerando que cada
unidade de absorbância a 260 nm equivale à concentração de 40 µg/µl de RNA. Após a
quantificação, 1 µg do RNA foi utilizado para a síntese de cDNA usando 1 µl de
hexâmeros randômicos (Promega) na concentração de 1 µg/µl e o sistema da
transcriptase reversa M-MLV (Promega) em um volume final de 25 µl. A reação foi
60
realizada em um termociclador, a 25oC por 10 minutos, 37oC por 60 minutos e 70oC por
15 minutos e posteriormente foi armazenada a -20oC.
O cDNA sintetizado foi utilizado como molde para as reações de PCR, que
foram realizadas em 35 ciclos (94ºC por 30 segundos, 60ºC por 30 segundos, 72ºC por
45 segundos) com 1 µl do cDNA do intestino, 200 nM de cada iniciador (Tab. 3), 200
µM de dNTPs e 1 U de Taq polimerase (Phoneutria) em um volume final de 20 µl.
O RNA de epitélio de camundongo foi extraído com Trizol (Invitrogen). Um
pequeno fragmento da cauda e da pele de um camundongo foi macerado com o auxílio
de um triturador de tecidos. O RNA foi redissolvido em 100 µl de água milliQ. Após a
quantificação do RNA em espectrofotômetro na absorbância de 260 nm, 1 µg do RNA
foi utilizado para a síntese do cDNA (conforme descrito anteriormente), que serviu
como molde para a PCR da queratina (Krt28- Número de acesso NM_027574 ), gene
que foi utilizado como controle inespecífico do silenciamento. A PCR da queratina de
camundongo também foi realizada em 35 ciclos (94ºC por 30 segundos, 60ºC por 30
segundos, 72ºC por 45 segundos) com 1 µl do cDNA do epitélio de camundongo, 200
nM de cada iniciador (Tab. 3), 200 µM de dNTPs e 1 U de Taq polimerase (Phoneutria)
em um volume final de 20 µl .
Os produtos das PCRs foram analisados em gel de agarose 1,5%, que foi corado
em solução de brometo de etídeo a 0,5 µg/ml, visualizado sob luz ultravioleta e
fotografado. Nos géis foram aplicados, além dos 5 µl do padrão de peso molecular de
100 pb, uma mistura de 2 µl do produto da PCR com 3 µl de água milliQ e 1 µl do
tampão da amostra. Para cada par de iniciadores utilizados, foi feito um controle
negativo (branco), onde o cDNA foi substituído por água milliQ, a fim de descartar a
presença de contaminação por DNA nos iniciadores ou em qualquer outro reagente da
PCR.
61
Os iniciadores utilizados nas reações de PCR foram desenhados com o software
Primer3
(http://primer3.sourceforge.net/),
com
o
promotor
T7
(5´taatacgactcactatagggaga 3´) adicionado à extremidade 5’ de cada iniciador. Os
iniciadores utilizados nas reações de PCR, cujo produto foi utilizado como molde para a
produção dos dsRNAs estão listados na tabela 3.
Tabela 3 – Oligos utilizados nas reações de PCR
Gene
Ferritina da
glândula
Ferritina
intestinal
(RT-PCR)
Queratina
Ferritina
intestinal
(q-PCR)
18s (RR18s)
18s (RR18s)
Senso
5’  3’
T7 + tggcagtgagtcaagttcgt
Antisenso
5’  3’
T7 + atacggcctcctcgcttatt
Amplicom
(pb)
272
T7 + agattcagaagaaaggcaacacg
T7 + agatttgtggagcatcacattcttt
265
T7 + ggggtctcctctctggaaac
cgtatgtaaggttgccatcag
T7 + attagcagccgtggaagaga
atggcagcggtgatttctac
275
110
tccttcgtgctaggaattgg
gtacaaagggcagggacgta
105
cctgcggcttaatttgactc
gtacaaagggcagggacgta
468
8.12.2 Produção de dsRNA e silenciamento de genes alvo por RNAi
Os dsRNAs foram sintetizados utilizando o kit MegaScript High Yeild
Transcription Kit (Ambion) de acordo com as recomendações do fabricante. Os
produtos da PCR contendo o promotor T7 em ambas as extremidades foram utilizados
como molde para a síntese de dsRNA. Após a incubação do dsRNA por 14 horas a
37oC, foi adicionado 1 µl de DNAse RQ1 (livre de RNAse, Amion) por reação (a cada
20 µl de dsRNA). O volume do RNA dupla fita recém sintetizado e tratado foi então
triplicado com água milliQ livre de RNAse, precipitado com isopropanol 100% e depois
lavado com etanol 70%. O dsRNA foi redissolvido em água MilliQ e quantificado por
espectrofotometria no comprimento de onda de 260 nm. Para a quantificação, foi
utilizado 0,5 µl do dsRNA, diluído 1:200 em água no mesmo volume final de 100 µl. A
qualidade das fitas foi avaliada por eletroforese em gel de agarose a 1,5%, onde também
62
foi utilizado 0,5 µl do dsRNA, agora diluído 1:40 em água e adicionado tampão de
amostra. Após a quantificação, o dsRNA foi secado em centrífuga evaporadora e
redissolvido em solução salina 0,9% (NaCl 154 mM) na concentração final de 7,5
µg/µl.
O gene alvo (ferritina) foi silenciado através da introdução do dsRNA na
hemolinfa de ninfas de terceiro estádio de T. infestans, via injeção lateral no tórax dos
insetos, entre a primeira e segunda perna, com o auxílio de um microinjetor
(Nanoinjector, Drummond) (Araujo et al., 2006; 2007; 2009a).
Ninfas com idade e peso semelhantes foram divididas em grupos controles e
teste. Os grupos controles foram formados por insetos injetados apenas com solução
salina ou injetados com o dsRNA inespecífico (queratina), enquanto o grupo teste foi
injetado com o dsRNA do gene alvo (ferritina). Em todos os grupos de insetos
injetados, o volume final do líquido introduzido foi o mesmo. Foram aplicadas duas
injeções de 5 µg de dsRNA, em cada inseto, com intervalos de 48 horas entre as
injeções.
8.12.3 Avaliação dos níveis de RNAm pós-silenciamento
Quarenta e oito horas após a última injeção, os níveis de mRNA correspondente
ao gene alvo (ferritina) foram avaliados por PCR em tempo real (qPCR), utilizando o
Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) de acordo com as
recomendações do fabricante, comparando os grupos controles ao teste. A detecção dos
resultados foi realizada pelo ABIPRISM 7500 Sequence Detection System (Applied
Biosystems). Cada reação foi feita em duplicata, contendo 1 µl dos produtos da reação
de síntese de cDNA de um "pool" de 4 intestinos (médio anterior) de ninfas de cada um
dos grupos testados, 300 nM de cada iniciador (Tab. 3), 12,5 µl do Power SYBR
63
Green PCR Master Mix em um volume final de 25 µl. As condições de amplificação
foram: 95oC por 10 minutos, 40 ciclos de 95oC por 15 segundos e 60oC por 1 minuto.
Como controle negativo (branco), o cDNA foi substituído por água milliQ estéril. Após
as reações, foi feita a análise da curva de dissociação dos amplificados de cada amostra
para verificar se as qPCRs estavam produzindo mais de um produto ou se havia
formação de dímeros.
Os produtos de qPCR tiveram sua especificidade confirmada pela análise da
eletroforese em gel de agarose a 1,5%, corado com brometo de etídeo e visualizado
através de luz ultravioleta. A quantidade relativa de transcritos-alvo em cada amostra foi
determinada usando o método 2-Ct (Livak and Schmittgen, 2001) e o RNA ribosomal
18s (RR18s) foi utilizado para a normalização dos resultados. Os iniciadores para a
qPCR do RNA ribossomal 18s e para a ferritina estão listados na tabela 3.
O fenótipo dos insetos injetados com dsRNA do gene alvo (ferritina) e dos
insetos controle foi avaliado 2, 7 e 10 dias após a última injeção, através do ensaio
biológico "in vitro"de hemaglutinação.
8.13 Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)
8.13.1 Coluna de Troca iônica
Amostras de 50µl de extrato de intestino de ninfas de quinto estádio tratados
termicamente (5 intestinos) foram cromatografados em uma coluna de troca iônica de 5
cm x 4,6 mm (Discovery®BIO PolyMA-WAX, Supelco). A coluna foi equilibrada em
tampão TRIS (20 mM de Tris/HCl, pH 7,2). Como fase móvel foi utilizado um
gradiente linear de tampão TRIS (20 mM de Tris/HCl, NaCl a 1M em pH 7,2), (de 0 a
100% em 32 minutos), com o fluxo de 0,25 ml/minuto. As amostras foram monitoradas
nos comprimentos de onda de 280 nm e 404 nm. As frações resultantes foram coletadas
a cada minuto e utilizadas nos ensaios de hemaglutinação.
64
8.13.2 Coluna de filtração molecular
Amostras de 50µl de extrato de intestino de ninfas de quinto estádio tratados
termicamente (5 intestinos) foram cromatografados em uma coluna de filtração
molecular de 30 cm x 4,6 mm, range: 0,5 a 150 kDa, Discovery®BIO GFC 150 (SigmaAldrich). A coluna foi equilibrada em solução salina 0,45% e o fluxo utilizado foi de
0,4 ml/minuto. As amostras foram monitoradas nos comprimentos de onda de 280 nm e
404 nm. As frações resultantes foram coletadas a cada minuto e utilizadas nos ensaios
de hemaglutinação.
65
9 Resultados – Parte 2 – Atividade hemaglutinante
9.1 Ação hemaglutinante do extrato intestinal sobre hemácias de diferentes
hospedeiros vertebrados
Nos ensaios de hemaglutinação em lâmina, utilizando-se suspensão de hemácias
de diferentes vertebrados (camundongo, hairless, hamster, rato, coelho, galinha, gerbil,
boi, cachorro, carneiro, homem) não foi observada a ocorrência de hemaglutinação nas
suspensões de hemácias dos vertebrados gerbil, boi, cachorro, carneiro e homem,
quando em contato com o extrato de intestino de ninfas de T. infestans (Tab 4).
Tabela 4: Atividade hemaglutinante do extrato de intestino médio anterior de ninfas de
T. infestans sobre hemácias de diferentes hospedeiros vertebrados.
Hospedeiro utilizado
Camundongo (Swiss. Balb/C, Hairless)
Hamster
Rato
Coelho
Galinha
Gerbil
Boi
Cachorro
Carneiro
Homem (A, B, O)
Hematócrito
15%
30%
Aglutina
Aglutina
Aglutina
Aglutina
Aglutina
Aglutina
Aglutina
Aglutina
Aglutina
Aglutina
Não aglutina
Não aglutina
Não aglutina
Não aglutina
Não aglutina
Não aglutina
Não aglutina
Não aglutina
Não aglutina
Não aglutina
A partir desses resultados, para a realização dos demais experimentos, optou-se
pela utilização de suspensões de hemácias de camundongos.
A figura 18 ilustra o típico fenômeno de hemaglutinação visualizado em lâmina,
após a adição de 1 µl de extrato de intestino médio anterior de T. infestans, em 9 µl de
suspensão de hemácias de camundongo.
66
A
B
Figura 18 – Efeito da adição do extrato de intestino médio anterior de T. infestans em
suspensão de hemácias de camnundongo. (A) Hemaglutinação com a formação de grumos entre
as hemácias; (B) detalhe da rede de fibras que ligam os eritrócitos que se apresentam com
formato alongado e fusiforme.
67
9.2 Atividade hemaglutinante do extrato intestinal em diferentes dias após a muda
A cinética do fenômeno de aglutinação, presente no extrato de intestino de
ninfas de terceiro estádio de T. infestans, em diferentes dias após a muda demonstraram
que a atividade aglutinante é relativamente baixa ou ausente até o quinto dia após a
muda e aumenta gradualmente a partir do sétimo dia, atingindo um pico e estabilizando
Atividade hemaglutinante* (Abs 650 nm)
em torno do dia 15 após a muda (Fig. 19).
10
8
6
4
2
0
0
1
2
3
4
5
7
15
25
dias após a muda
Figura 19 – Atividade hemaglutinante do extrato de intestino médio anterior de ninfas de
terceiro estádio de T. infestans em diferentes dias após a muda. *porcentagem de redução na
absorbância da amostra a 650 nm menos a redução do controle (sem extrato de intestino).
9.3 Avaliação da estabilidade da atividade hemaglutinante após diferentes
tratamentos
Quando o extrato de intestino médio anterior de ninfas de quinto estádio de T.
infestans foi aquecido por 5 minutos a 98oC, a atividade hemaglutinante manteve-se
presente, demonstrando com isso, que a molécula responsável pela atividade
68
hemaglutinante é termo-resistente. A partir desses resultados, os demais tratamentos
foram realizados nas amostras de intestino médio anterior tratado e não tratado
termicamente. Os resultados encontrados estão descritos a seguir e representados na
tabela 5.
A incubação do extrato intestinal de T. infestans (tratado e não tratado
termicamente) com as proteases proteinase K e tripsina causaram a inibição da atividade
hemaglutinante, sugerindo que a molécula responsável pela atividade hemaglutinante
seja protéica ou possua parte protéica em sua estrutura.
Não houve inibição da atividade hemaglutinante do extrato intestinal de T.
infestans após incubação com colágeno ou gelatina a 2%, o que sugere que a atividade
hemaglutinante não é devido a presença de fibronectina.
Tabela 5 – Efeito de diferentes tratamentos sobre a atividade hemaglutinante presente
no extrato de intestino médio anterior de ninfas de quinto estádio de T. infestans.
Tratamentos
Proteinase K 0,5 µg/µl
Tripsina 0,5 µg/µl
Colágeno
Gelatina 2%
Efeito após o tratamento
Não aglutina
Não aglutina
Aglutina
Aglutina
Quando as amostras de extrato de intestino tratado e não tratado termicamente
foram diluídas em série, observou-se que elas foram capazes de aglutinar até os títulos
de 1:8192 e 1:4096, respectivamente.
Quando as amostras de extrato de intestino tratado e não tratado termicamente
diluídas em série foram mantidas em diferentes temperaturas, por 30 minutos, observase que as amostras de intestino tratado termicamente sofrem maior inibição da atividade
hemaglutinante, pois há uma redução nos títulos de hemaglutinação, enquanto as
amostras não tratadas termicamente foram mais estáveis (Tab. 6).
69
Tabela 6 – Efeito da temperatura sobre atividade hemaglutinante do extrato de intestino
médio anterior de ninfas de quinto estádio de T. infestans
Título de hemaglutinação
Temperatura ( C)
Extrato de intestino não
Extrato de intestino
tratado termicamente*
tratado termicamente*
10
4096
1024
23
8192
4096
37
4096
1024
45
4096
1024
60
4096
1024
72
4096
1024
*n=2 para cada tratamento.
o
A atividade hemaglutinante manteve-se presente, nas amostras de intestino
tratado e não tratado termicamente, em diferentes variações de pHs (3 a 10). As
amostras de intestino não tratado termicamente sofreram redução dos títulos da
atividade hemaglutinante em pHs muito ácidos (3 e 5), enquanto para as amostras
tratadas termicamente não houve variação (Tab. 7). Apesar das hemácias sofrerem uma
ligeira deformação em sua forma quando estavam em contato com alguns dos tampões
utilizados, a atividade hemaglutinante do extrato intestinal continuou presente e o
fenômeno de hemaglutinação foi facilmente visualizado em lâmina.
Tabela 7 – Efeito do pH sobre a atividade hemaglutinante do extrato de intestino médio
anterior de ninfas de quinto estádio de T. infestans
Título de hemaglutinação
pH
Extrato de intestino não
Extrato de intestino
tratado termicamente*
tratado termicamente*
3
2048
4096
5
4096
4096
6
8192
4096
7
8192
4096
8
8192
4096
9
8192
4096
10
8192
4096
*n=2 para cada tratamento.
70
Quando o extrato de intestino de T. infestans foi ultrafiltrado em colunas com
limite de exclusão de 100 kDa, a atividade hemaglutinante esteve presente apenas na
porção não filtrada (> 100 kDa), enquanto que no extrato de intestino tratado
termicamente, a atividade hemaglutinante foi observada tanto na porção acima de 100
kDa, quanto na porção abaixo de 100 kDa (Tab 8). Isso sugere que após submeter o
extrato de intestino ao tratamento térmico, a molécula responsável pela atividade
hemaglutinante desmembra-se em moléculas menores. Apesar desse possível
desmembramento, quando o extrato de intestino tratado e não tratado termicamente é
ultrafiltrado em colunas com limite de exclusão de 30 kDa a atividade hemaglutinante
está presente somente na fração acima de 30 kDa, o que sugere que no caso de
desmembramento da molécula, subunidades menores que 30 kDa não possuem
atividade hemaglutinante.
Tabela 8 – Efeito da ultrafiltração do extrato de intestino médio anterior de ninfas de
quinto estádio de T. infestans sobre a atividade hemaglutinante.
Extrato de intestino
Não tratado termicamente
Tratado termicamente
Ultrafiltração
> 100 kDa
< 100 kDa
< 30 kDa
> 100 kDa
< 100 kDa
< 30 kDa
Efeito
Aglutina
Não aglutina
Não aglutina
Aglutina
Aglutina
Não aglutina
9.4 Perfil eletroforético do extrato de intestino médio anterior de T. infestans
O extrato de intestino não tratado termicamente apresenta uma grande
quantidade de proteínas, o que dificulta a visualização das bandas. Quando o extrato de
intestino é tratado termicamente o perfil eletroforético da amostra é facilmente
visualizado, pois há uma quantidade consideravelmente menor de proteínas (o
tratamento térmico causa uma redução de aproximadamente 95 ± 4,2% (n=10) das
71
proteínas totais do extrato) o que facilita a visualização das bandas (Fig. 20), por isso o
extrato de intestino tratado termicamente foi utilizado nos procedimentos para tentar
identificar a molécula responsável pela atividade hemaglutinante.
A
B
Figura 20 – Perfil eletroforético (PAGE 12,5% (A) e PAGE 6% (B)) do extrato intestinal de
ninfas de quinto estádio de T. infestans. Colunas: 1 – Padrão de peso molecular; 2, 4 e 6 – 2 µl
de extrato de intestino não tratado termicamente; 3, 5 e 7 – 5 µl de extrato de intestino tratado
termicamente. Géis corados com azul de coomassie.
A hipótese de desmembramento da molécula responsável pela atividade
hemaglutinante é reforçada pelo perfil eletroforético da fração retida após ultrafiltração
do extrato de intestino em colunas com limite de exclusão de 100 kDa. Nele são
observadas além de uma banda de peso molecular maior que 100 kDa, outras duas
bandas de aproximadamente 40 e 45 kDa que, devido o processo de ultrafiltração da
amostra, elas não deveriam ser observadas nessa fração (Fig. 21).
72
Figura 21 – Eletroforese (SDS-PAGE 7,5%) correspondente à porção não filtrada (>100 kDa)
do extrato de intestino tratado termicamente de ninfas de quinto estádio de T. infestans.
Colunas: 1 – Padrão de peso molecular; 2– 5 µl da amostra filtrada (fração > 100 kDa) do
extrato de intestino tratado termicamente. Gel corado com azul de Coomassie.
9.5 Identificação da molécula responsável pela atividade hemaglutinante
Os resultados obtidos até o momento indicam que a atividade hemaglutinante
pode ser proveniente de uma banda de ~240 kDa identificada na fração acima de 100
kDa no extrato de intestino após ultrafiltração, uma vez que ela foi a mais intensa no
PAGE e apresentou peso molecular maior que 100 kDa. Esta banda foi então,
eletroeluída do gel, dialisada e avaliada novamente por eletroforese. Interessantemente,
após eletroeluição, essa amostra apresentou apenas uma banda de 16,5 kDa, o que
reforça a hipótese de que a molécula hemaglutinante desmembra-se em moléculas
menores, que também possuem atividade hemaglutinante, enquanto não atingem o
desmembramento máximo (Fig. 22). Esta proteína de 16,5 kDa foi utilizada nos ensaios
de hemaglutinação, porém ela não apresentou atividade hemaglutinante, o que corrobora
os nossos dados anteriores de que moléculas menores que 30 kDa não possuem
atividade hemaglutinante.
73
A
B
Figura 22 – Eletroforese correspondente à porção não filtrada (>100 kDa) do extrato de
intestino tratado termicamente de ninfas de quinto estádio de T. infestans antes da eletroeluição
(A) (SDS-PAGE 7,5%), e após eletroeluição (B) SDS-PAGE 15%. Colunas: 1 – Padrão de peso
molecular; 2 – 5 µl do material eletroeluído.
9.6 Western Blot
O soro dos camundongos Balb/C que foram imunizados contra a proteína de
16,5 kDa não reconheceu a banda de 16,5 kDa, porém esses soros reconheceram bandas
de alto peso molecular presentes nas amostras de extrato de intestino não tratado e
tratado termicamente (Fig. 23).
1
2
3
kDa
117
85
49
35
25
19
Figura 23 – Western blot utilizando soro de camundongos Balb/C imunizados contra proteína
de 16,5 kDa. Colunas: 1 – 10 µg da proteína de 16,5 kDa, 2 – 5 µl do extrato de intestino de
ninfas de quinto estádio tratado termicamente, 3 – 5 µl do extrato de intestino de ninfas de
quinto estádio não tratado termicamente.
74
9.7 Identificação da molécula por espectrometria de massa
Em outra tentativa de identificar a molécula responsável pela atividade
hemaglutinante, algumas bandas identificadas no PAGE foram excisadas e submetidas à
espectometria de massas (Fig. 24).
I
II
III
kDa
225
150
75
50
35
Figura 24 – Eletroforese mostrando as bandas de interesse para identificação por espectrometria de
massa do perfil protéico das amostras do extrato de intestino de ninfas de quinto estádio de T. infestans
tratados termicamente, I – SDS-PAGE 7,5%, II – SDS-PAGE 15%, III – SDS-PAGE 6%. Colunas: a –
Padrão de peso molecular, b - 5 µl da amostra ultrafiltrada (fração > 100 kDa) do extrato de intestino
tratado termicamente, c – 10 µg da proteína de 16,5 kDa eletroeluída, d - 5 µl de extrato de intestino
tratado termicamente. Números 1 a 8 – bandas excisadas dos géis para análise em espectrômetro de
massa.
A tabela 9 apresenta o resultados obtidos na espectrometria de massas das
proteínas de interesse. Das 8 amostras selecionadas 6 tiveram identificação significativa.
75
Tabela 9 – Resultados obtidos na espectrômetria de massas das proteínas de interesse
das amostras de extrato de intestino tratado termicamente de ninfas de T. infestans.
Amostra
1
2
3
4
5
6
7
8
Tamanho estimado
240 kDa
50 kDa
45 kDa
16,5 kDa
>241 kDa
241 kDa
199 kDa
182 kDa
Resultado
Não identificado
Alpha-antitripsina
Prealbumina
Ferritina
Capsídeo de Triatoma vírus
Não identificado
Alpha-globina
Ferritina
# acesso
#68052028
# 136466
#149689086
#20451030
#30027750
#149689086
9.8 Pesquisa no banco de dados do NCBI e silenciamento gênico (RNAi)
A partir dos resultados obtidos na espectrometria de massa suspeitou-se que a
ferritina seria a molécula responsável pela atividade hemaglutinante.
No banco da dados (NCBI) foi encontrada uma sequência completa de uma
ferritina proveniente de uma biblioteca de glândula salivar de T. infestans (Assumpção
et al., 2007) que não apresentava peptídeo sinal. A RT-PCR utilizando os iniciadores
desenhados para esta sequência demonstraram que ela é expressa tanto na glândula
salivar quanto no intestino médio anterior
de T. infestans (Fig. 25). Entretanto o
silenciamento gênico (RNAi) não apresentou resultados satisfatórios. O RNAi
utilizando diferentes quantidade de dsRNA não foi capaz de reduzir os níveis de RNAm
da ferritina no intestino e na glândula salivar a redução foi aproximadamente 75%
(dados não mostrados).
Figura 25 – Gel de agarose 1,5% mostrando a expressão da ferritina na glândula salivar e no intestino
médio anterior de ninfas de T. infestans. Colunas: 1 – 8 µl do padrão de peso molecular, 2 – 2 µl dos
produtos da PCR da glândula salivar, 3 – 2 µl dos produtos da PCR do intestino médio anterior, 4 –
controle negativo.
76
A partir de resultados de uma biblioteca de cDNA de intestino médio anterior de
T. infestans (realizada pela Dra Aparecida S. Tanaka – UNIFESP), foi identificada uma
outra ferritina cuja sequência apresenta peptídeo sinal. Foram montados novos
iniciadores para esta sequência e a RT-PCR demonstrou que esta molécula não é
expressa na glândula salivar, mas está presente no intestino médio anterior (ferritina
intestinal) (Fig. 26).
1
5
6
500 pb
300 pb
Figura 26 – Gel de agarose 1,5% mostrando a expressão da ferritina apenas no intestino médio anterior
de ninfas de T. infestans. Colunas: 1 – 8 µl do padrão de peso molecular, 2 –2 µl dos produtos da PCR da
glândula salivar, 3 – 2 µl dos produtos da PCR do intestino médio anterior, 4 – controle negativo, 5 –
rRNA 18 s glândula salivar, 6 rRNA 18 s intestino médio anterior.
Estas sequências foram alinhadas com outras sequências de ferritinas de
diferentes insetos hematófagos: 4 contigs que possuem domínio de ferritina
identificados
no
genoma
de
R.
prolixus
(http://genome.wustl.edu/genomes/view/rhodnius_prolixus/), uma ferritina identificada
no intestino do flebotomíneo Phlebotomus papatasi (Scopoli, 1786); uma ferritina
identificada no intestino do flebotomíneo Lutzomyia longipalpis (Lutz e Neiva, 1912);
uma ferritina identificada no genoma do mosquito Culex quinquefasciatus Linnaeus,
1758; uma ferritina identificada no sialoma do percevejo Cimex lectularis (Linnaeus
1758) (Fig. 27).
77
Figura 27 – Alinhamento das sequências de ferritina de T. infestans com outras sequências de ferritinas
de diferentes insetos hematófagos. Legenda: Ti-intestino: sequência de uma ferritina obtida a partir da
biblioteca de cDNA de intestino médio anterior de T. infestans realizada pela Dra Aparecida S. Tanaka –
UNIFESP; as sequências Rp-493, Rp-1172, Rp-1173 e Rp-8696: representam as sequências de ferritinas
de 4 contigs identificados no genoma de R. prolixus; Lutzomyia-int: sequência de uma ferritina presente
no intestino de L. longipalpis (ABV60307.1); Phlebotomus-int: sequência de uma ferritina presente no
intestino de P. papatasi (ABV44737.1); Ti-glândula: sequência da ferritina presente na glândula salivar
de T. infestans (EF638992.1); Cimex-gl: sequência da ferritina presenta na glândula salivar de C.
lectularis
(ACY69889.1); Culex-ferritin: sequência de uma ferritina encontrada no genoma de C.
quinquefasciatus (XP_001845494).
A árvore filogenética construída após o alinhamento das sequências de ferritinas
de T. infestans com outros insetos hematófagos, sugere que os triatomíneos apresentam
2 tipos de ferritina, uma provavelmente secretada (contendo peptídeo sinal) expressa no
78
intestino médio anterior (Ti-intestino, Fig. 28) e outra, possivelmente intracelular
expressa no intestino médio anterior e na glândula salivar (Ti-glândula, Fig. 28). Estas
moléculas deverão ser sequenciadas para que sua composição seja confirmada.
Figura 28 – Árvore filogenética de algumas sequências de aminoácidos de ferritinas dos insetos
hematófagos selecionados. Os ramos da árvore foram construidos utilizando o programa ClustalW pelo
método Neighbor Joing. Legenda: Ti – glandula: sequência da ferritina presente na glândula salivar de T.
infestans; Cimex-gl: sequência da ferritina presenta na glândula salivar de C. lectularis, Culex-ferritin:
sequência de uma ferritina encontrada no genoma de C. quinquefasciatus, Rp-8696 ferritin: sequência de
ferritina identificada no genoma de R. prolixus; Lutzomyia-int: sequência de uma ferritina presente no
intestino de L. longipalpis; Phlebotomus-int: sequência de uma ferritina presente no intestino de P.
papatasi, Ti-intestino: sequência de uma ferritina obtida a partir da biblioteca de cDNA de intestino
médio anterior de T. infestans realizada pela Dra Aparecida S. Tanaka – UNIFESP; Rp-493 ferritin, Rp1172 ferritin, Rp-1173 ferritin sequências de ferritinas identificadas no genoma de R. prolixus. As setas
indicam as ferritinas encontradas em T. infestans. Os valores nos ramos indicam as porcentagens de
bootstrap (com 500 replicatas) adquiridas após a construção da árvore. Apenas valores acima de 90% são
mostrados.
A introdução do dsRNA da ferritina secretada (sequência expressa apenas no
intestino) em ninfas de terceiro estádio de T. infestans injetados 2 e 10 dias após a muda
79
foi avaliada por q-PCR. A análise por qPCR demonstrou que há uma redução dos níveis
de mRNA semelhante entre os dois grupos (94% e 93%, respectivamente) 48 horas após
a segunda injeção de dsRNA.
O efeito do silenciamento gênico da ferritina secretada sobre a atividade
hemaglutinante do extrato intestinal, de ninfas de terceiro estádio de T. infestans, foi
avaliado em diferentes dias (2, 7 e 10) após a administração do dsRNA. Não houve
diferença nos níveis de atividade hemaglutinante entre os grupos controle e teste (Tab.
10 e Fig. 29) após o silenciamento. Estes testes foram realizados em diferentes dias após
a última injeção, pois caso a molécula tivesse meia vida longa, os testes seriam capazes
de identificar a perda da função.
O possível silenciamento e perda da atividade hemaglutinante também foram
avaliados em espectrofotômetro, para que os resultados pudessem ser quantitativos e
possibilitassem avaliar pequenas diferenças entre os grupos controles e teste. Entretanto,
não houve diferença estatística entre nenhum dos grupos avaliados (insetos silenciados e
controles) (Fig. 29).
Tabela 10 – Grupos de insetos injetados e avaliação da atividade hemaglutinante em
diferentes dias após a administração do dsRNA.
Injeção após
a muda
24 horas
Número de insetos
injetados*
12C
11 K
17 T
Dissecação após a
segunda injeção
2 dias
Atividade
2C
12 K
17 T
7 dias
Aglutina
Aglutina
Aglutina
9C
5T
10 dias
Aglutina
Aglutina
Aglutina
Aglutina
Aglutina
* C – insetos injetados com solução salina, T – insetos injetados com dsRNA da ferritina, K – insetos
injetados com dsRNA inespecífico (queratina).
80
Atividade hemaglutinante* (UA 650 nm)
14
12
ds Queratina
Ctrl Salina
ds Ferritina
10
8
6
4
2
0
Brc
2
7
10
dias após a segunda injeção
Figura 29 – Atividade hemaglutinante do extrato de intestino médio anterior de ninfas de terceiro estádio
de T. infestans em diferentes dias após a administração de 10 µg de dsRNA. *porcentagem de redução na
absorbância da amostra a 650 nm; Controle – sangue adicionado de salina sem extrato de intestino, Grupo
controle 1 – insetos injetados com solução salina, Grupo teste – insetos injetados com dsRNA da ferritina,
Grupo controle 2 – insetos injetados com dsRNA inespecífico (queratina).
Foi realizada uma cinética de expressão dos níveis de RNAm da ferritina, em
ninfas de terceiro estádio de T. infestans, em diferentes dias após a muda (0, 1, 2, 7, 15,
25) para tentar determinar o melhor momento de se introduzir o dsRNA. Observa-se
que há um pico de produção de RNAm da ferritina nas primeiras 24 horas após a muda,
e 48 horas após muda, os níveis de RNAm relativos a ferritina começam a diminuir
gradativamente, apresentando um pequeno aumento 15 dias após a muda, e reduzindo
novamente 25 dias após a muda (Fig. 30).
81
média de expressão relativa
de RNAm da ferritina*
6
5
4
3
2
1
0
0
1
2
7
15
25
dias após a muda
Figura 30 – Cinética de expressão relativa de RNAm da ferritina em ninfas de terceiro estádio de T.
infestans, em diferentes dias após a muda. *Os valores representam a média de expressão de RNAm de 2
"pools" de 4 intestinos médio anterior por grupo, em diferentes dias após a muda.
9.9 Fracionamento do conteudo intestinal por HPLC
Quando o extrato de intestino tratado termicamente foi cromatografado em
coluna de troca iônica, foram observadas duas regiões com picos de absorvância a 280
nm acima de 250 mUA, a primeira entre 1 e 8 minutos e a segunda entre 23 e 36
minutos (Fig. 31). Apenas as frações que correspondem aos tempos 27, 28, 29 e 30,
apresentaram atividade hemaglutinante, sendo que os maiores títulos de atividade
hemaglutinante, após diluição seriada foram vistos nas frações 28 (1:128), 29 (1:256) e
30 (1:128) (Fig. 32 e Tab. 11). Os valores da absorvância a 280 nm, em cada amostra,
foram determinados em espectrofotômetro e esses dados foram associados aos títulos de
atividade hemaglutinante (Fig. 32). Das frações avaliadas (25-34) apenas as frações 26 e
27 não apresentam valores de absorvância no comprimento de onda de 260 nm maiores
que a absorvânica no comprimento de onda de 280 nm (Tab.11), por isso, não foi
82
utilizada a quantificação de proteínas totais das amostras, pela fórmula: (Abs280x1,55)
– (Abs260x0,76), pois a maioria das amostras ficaram com os valores de concentração
de total de proteínas (µg/µl) negativos (Tab. 11)
Resultados
semelhantes
foram
obtidos
quando
as
amostras
foram
cromatografadas em coluna de filtração molecular.
Figura 31 – Cromatograma do extrato intestinal de ninfas de quinto estádio de T. infestans tratado
termicamente utilizando coluna de troca iônica. Os picos delimitados pelo retângulo representam as
frações com atividade hemaglutinante.
83
Figura 32– Relação entre a absorvância das amostras no comprimento de onda 280 nm e o título de
hemaglutinação das frações obtidas após cromatografia em coluna de troca iônica.
Tabela 11 – Quantificação de proteínas totais e títulos de hemaglutinação das frações
resultantes da cromatografia em coluna de troca iônica
Frações
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
280 Abs280x1,55 260 Abs260x0,76
0,101
0,1566
0,193
0,1467
1,727
2,6769
1,143
0,8687
2,712
4,2036
1,227
0,9325
0,479
0,7425
1,509
1,1468
0,371
0,5751
2,878
2,1873
0,184
0,2852
0,878
0,6673
0,118
0,1829
0,363
0,2759
0,079
0,1225
0,2
0,152
0,306
0,4743
0,56
0,4256
0,219
0,3395
0,382
0,2903
Título de
ug/ul hemaglutinação
0,010
0
1,808
0
3,271
8
-0,404
128
-1,612
256
-0,382
128
-0,093
0
-0,030
0
0,049
0
0,049
0
O perfil eletroforético das frações que possuem atividade hemaglutinante foi
obtido após cada fração (27, 28, 29 e 30) ter sido individualmente concentrada,
utilizando um filtro de membrana com limite de exclusão de 5kDa. Essas amostras
concentradas foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida nas
84
concentrações de 6 e 17,5%, e foram visualizadas bandas principalmente entre os pesos
moleculares de 75 a 35 kDa (Fig.33).
Figura 33 – Perfil eletroforético das frações resultantes da HPLC troca iônica (A) (SDS-PAGE 15%), (B)
SDS-PAGE 6%. Colunas: 1 – Padrão de peso molecular; 2 – 5 frações 27, 28, 29 e 30, respectivamente.
Quando o extrato de intestino tratado termicamente foi cromatografado em
coluna de filtração molecular, observamos uma região com picos de absorvância a 280
nm acima de 250 mUA, entre 9 e 16 minutos (Fig. 34). Entretanto, apenas as frações do
tempo 5 ao 13, apresentam atividade hemaglutinante.
As frações que correspondem aos tempos 6 e 7 apresentaram os maiores títulos
de atividade hemaglutinante, após diluição seriada (1:32). Nos dados obtidos pela
associação dos valores de absorvância a 280 nm e os títulos de atividade
hemaglutinante, em cada amostra, observa-se que as frações que apresentam os maiores
títulos de atividade hemaglutinante, possuem valores de absorvância no comprimento de
onda de 260 nm maiores ou iguais aos valores no comprimento de onda 280 nm (Fig. 35
e Tab. 12).
85
Figura 34 – Cromatograma do extrato intestinal de ninfas de quinto estádio de T. infestans tratado
termicamente utilizando coluna de filtração molecular. Os picos delimitados pelo retângulo representam
as frações com atividade hemaglutinante.
Figura 35– Relação entre a absorvância das amostras no comprimento de onda 280 nm e o título de
hemaglutinação das frações obtidas após cromatografia em coluna de troca iônica.
86
Tabela 12 – Quantificação de proteínas totais e títulos de hemaglutinação das frações
resultantes da cromatografia em coluna de filtração molecular
Frações
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
Abs280 Abs280x1,55 Abs260 Abs260x0,76
0,142
0,2201
0,125
0,095
0,1721
0,0821
0,111
0,108
0,1752
0,0737
0,113
0,097
0,126
0,1953
0,111
0,0844
0,47
0,7285
0,645
0,4902
0,77
1,1935
1,593
1,2107
2,573
3,9882
2,834
2,1538
0,733
1,1362
0,609
0,4628
0,52
0,806
0,438
0,3329
0,306
0,4743
0,264
0,2006
0,533
0,8262
0,433
0,3291
0,091
0,1411
0,107
0,0813
0,075
0,1163
0,084
0,0638
0,061
0,0946
0,075
0,057
0,1147
0,074
0,072
0,0547
0,107
0,069
0,068
0,0517
ug/ul
0,125
0,090
0,101
0,111
0,238
-0,017
1,834
0,673
0,473
0,274
0,497
0,060
0,052
0,038
0,060
0,055
diluições
4
32
32
16
16
16
16
4
4
4
4
4
0
0
0
0
87
10 Discussão – Parte 2 – Atividade hemaglutinante
O intestino dos triatomíneos é um importante órgão envolvido no processo
alimentar, onde ocorre a digestão e absorção dos nutrientes presentes no sangue que
serão utilizados nos processos fisiológicos do inseto. O sangue ingerido pelo
triatomíneo é armazenado no intestino médio anterior, onde ocorre à absorção de água e
de alguns íons; as hemácias sofrem lise e alguns carboidratos são digeridos. O conteúdo
do sangue, agora concentrado, é então direcionado lentamente para o intestino médio
posterior, onde os carboidratos, lipídeos e proteínas são digeridos (Terra e Ferreira,
1994).
Durante o processo de ingestão do sangue pelo triatomíneo é importante a
manutenção de uma viscosidade baixa na dieta ingerida, pois como o tubo digestivo
desses insetos é contínuo, um aumento na viscosidade do sangue ingerido pode
comprometer a quantidade de sangue ingerida. Até o momento, foram descritas duas
atividades presentes no intestino médio anterior dos triatomíneos, que podem interferir
na quantidade de sangue ingerido: a atividade anticoagulante e a atividade
hemaglutinante (Araujo et al. 2007 e 2009a).
Araujo et al. (2007) demonstraram in vivo a influência do processo de
coagulação sanguínea no interior do tubo digestivo do triatomíneo T. brasiliensis sobre
a quantidade de sangue ingerida por esse inseto. A inibição da proteína anticoagulante
intestinal (brasiliensina), por RNAi ou pela ingestão de trombina, causou um aumento
na viscosidade dos sangue no interior do intestino do inseto, e esse aumento na
viscosidade comprometeu significativamente a quantidade de sangue ingerida.
Em 2009, Araujo et al., demonstraram pela primeira vez que atividade
hemaglutinante presente no intestino médio anterior do triatomíneo T. brasiliensis tem
um importante papel na sua alimentação sanguínea. Neste estudo a quantidade de
88
sangue ingerido por esse triatomíneo foi significativamente maior quando ele ingeriu o
sangue de um hospedeiro vertebrado (R. norvegicus) e no interior do tubo digestivo do
inseto ocorreu a hemaglutinação (separação das hemácias dos líquidos sanguíneos).
Quando não ocorre a hemaglutinação (no interior do intestino do inseto) a quantidade de
sangue do hospedeiro vertebrado (T. apereoides) que foi ingerida pelo triatomíneo T.
brasiliensis foi significativamente menor. Além disso, houve um maior número de
interrupções durante a alimentação desse triatomíneo, nesse hospedeiro vertebrado.
No presente trabalho foi realizada uma caracterização parcial de uma molécula
presente no intestino médio anterior de T. infestans que possui uma potente atividade
hemaglutinante, sobre hemácias de diferentes hospedeiros vertebrados. Altos títulos de
atividade hemaglutinante sobre hemácias de camundongo foram obtidos com o extrato
de intestino de ninfas de quinto estádio. No entanto, não houve atividade
hemaglutinante quando as hemácias dos vertebrados gerbil, boi, cachorro, carneiro,
homem foram testadas. Essa ausência de atividade hemaglutinante pode ser atribuída a
diferenças existentes nas proteínas de superfície das hemácias testadas.
Em nosso estudo, foi verificado que variações de pHs (3-10) não influenciaram
os títulos de atividade hemaglutinante do extrato de intestino tratado termicamente,
enquanto que os títulos de hemaglutinação do extrato de intestino não tratado
termicamente sofreram redução apenas em pHs mais ácidos (3 e 5). O fato dos menores
títulos de atividade hemaglutinante terem sido observados em pHs ácidos, reforça a
idéia dessa atividade estar relacionada ao processo de alimentação, pois no intestino
médio anterior o pH é básico (pH 7) e os títulos de atividade hemaglutinante são altos
(Barros et al., 2009). Uma redução dos títulos de hemaglutinação na faixa de pH 3-5
também foi observada por Ratcliffe et al., (1996) para a atividade hemaglutinante do
intestino de R. prolixus.
89
A caracterização da cinética da atividade hemaglutinante presente no intestino
de ninfas de terceiro estádio demonstrou que poucos dias após a muda (de 1 a cinco
dias) , a atividade hemaglutinante é baixa ou ausente. Esse padrão de atividade pode ser
atribuído ao fato de que os triatomíneos, apesar de exercerem a hematofagia durante
todos os seus estágios de desenvolvimento, dificilmente se alimentam de sangue poucos
dias após a muda. Em condições de laboratório, foi verificado que, em geral, os
triatomíneos se alimentam de sangue a partir de 2 a 3 após a muda para a espécie
Triatoma pseudomaculata Correa e Espínola, 1964 e de 4 dias após a muda para T.
brasiliensis (Soares et al., 2000).
A presença de atividade hemaglutinante no intestino (médio anterior) de ninfas
de terceiro estádio de T. infestans, em jejum após a muda, reforça a idéia de que essa
atividade participe do processo de alimentação sanguínea dos triatomíneos, uma vez que
moléculas intestinais importantes para a obtenção de sangue precisam estar presentes e
ativas antes da chegada do sangue ao intestino, ou os processos de hemostasia
(coagulação) não seriam inibidos, e nem a hemaglutinação desencadeada, fazendo com
que uma quantidade de sangue insuficiente para o ingurgitamento fosse obtida. Essa
hipótese é reforçada pelos resultados obtidos por Grubhoffer et al., ( 1997) e Pereira et
al., (1981) estudando aglutininas em triatomíneos, onde foi observada que a atividade
hemaglutinante não é induzida pelo repasto sanguíneo e que não há diferença da
atividade hemaglutinante entre insetos em jejum e insetos alimentados. Diferentemente
do observado nos atrópodes hematófagos L. longipalpis, Phlebotomus duboscqi NeveuLemaire, 1906, Ixodes ricinus (Linnaeus, 1758), Glossina morsitans Westwood, 1851,
em que a atividade hemaglutinante intestinal foi induzida pela alimentação de sangue,
sendo secretada em resposta a ingestão de proteínas (Palánová e Volf, 1997; Uhlir et al.,
1996; Igram e Molyneux, 1988).
90
A maioria dos trabalhos realizados sobre hemaglutinantes intestinais de
artrópodes hematófagos L. longipalpis e P. dubosqi (Palánová e Volf, 1997), I. ricinus
(Uhlir et al., 1996), G. morsitans (Igram e Molyneux, 1988), Anopheles gambie Giles,
1902 (Mohamed et al., 1992), A. aegypti (Grubhoffer e Wells, 1993 e Grubhoffer e
Noriega, 1995), R. prolixus (Pereira et al, 1891; Gregorio e Ratcliffe, 1991; Ratcliffe et
al., 1996) tem demonstrado que as moléculas hemaglutinantes intestinais, são em sua
maioria lectinas e sua atividade é inibida por açúcares, ou pelo tratamento térmico em
temperaturas acima de 50oC, demonstrando que em geral essas moléculas são termolábeis.
Em nosso trabalho, foi observado que a molécula responsável pela atividade
hemaglutinante no intestino médio anterior de T. infestans, é termo-resistente, pois os
títulos de hemaglutinação sobre hemácias de camundongo continuaram altos, mesmo
após o extrato de intestino ter sido tratado termicamente (aquecimento a 98oC por 5
minutos).
Apesar dos títulos de atividade hemaglutinante presente no intestino médio
anterior demonstrarem ter sido estáveis mesmo após variações de temperatura (como,
congelamento a -20oC, aquecimento a 98oC), quando as amostras foram diluídas em
série e mantidas por 30 minutos, em diferentes temperaturas (10oC, 23oC, 37oC, 45oC,
60oC e 72oC), os títulos de hemaglutinação sofreram redução da atividade em todas as
temperaturas, exceto a temperatura ambiente (23oC). Intrigantemente, as maiores
reduções nos títulos de atividade hemaglutinante foram observadas para as amostras de
intestino
tratadas
termicamente.
Essa
diminuição
nos
títulos
da
atividade
hemaglutinante poderia ser atribuída à alteração no equilíbrio químico da molécula, que
após ser diluída em série, e mantida em diferentes temperaturas, passou para um estado
de equilíbrio que não é ativo.
91
Assim como nos resultados obtidos por Araujo et al.,(2009a) a visualização do
fenômeno de hemaglutinação (em lâmina), desencadeado pela molécula hemaglutinante
do intestino de T. infestans não resultou na formação de rosetas típicas formadas pela
aglutinação promovida por lectinas. Foram observadas a formação de fibras que se
ligaram aos eritrócitos, e alguns deles tiveram sua forma arredondada modificada para
um formato fusiforme. Araujo et al., (2009a) sugeriram que essas fibras poderiam ser
formadas por fibras elásticas, uma vez que elas foram coradas por orceína (um corante
que cora especificamente fibras elásticas) (Behmoaras et al., 2005). Os resultados
obtidos após eletroforese indicaram que a molécula hemaglutinante apresenta alto peso
molecular, por isso, suspeitou-se que a hemaglutinação poderia ser promovida por
fibronectinas, entretanto quando o extrato de intestino de T. infestans foi mantido em
contanto com colágeno não desnaturado e colágeno desnaturado (gelatina) e
posteriormente utilizado nos ensaios de hemaglutinação, não foi observada inibição da
atividade hemaglutinante, sugerindo então que a atividade hemaglutinante não é devida
à presença de fibronectinas. Esses resultados corroboram os resultados obtidos por
Hypsa e Grubhofer (1995) estudando a hemaglutinina presente no intestino de T.
infestans, em que foi observado que a molécula hemaglutinante possui um sítio de
ligação complexo, que reconhece fragmentos específicos da cadeia glicídica em vez de
resíduos individuais de monossacarídeos, e o fato da atividade não ser inibida por
nenhum dos mono e oligossacarídeos testados, sugere que a atividade hemaglutinante
não seja promovida por lectinas.
A atividade hemaglutinante presente no extrato de intestino foi totalmente
inibida pela ação de enzimas proteolíticas (proteinase K e tripsina), sugerindo que a
molécula responsável pela atividade hemaglutinante tenha natureza protéica.
A semipurificação do extrato de intestino de T. infestans demonstrou que a
92
molécula hemaglutinante possui peso molecular maior que 100 kDa, pois quando o
extrato de intestino foi ultrafiltrado em coluna com limite de exclusão de 100 kDa, a
atividade hemaglutinante esteve presente apenas na porção não filtrada (> 100 kDa).
Entretanto, no extrato de intestino tratado termicamente, a atividade hemaglutinante foi
observada tanto na porção acima de 100 kDa, quanto na porção abaixo de 100 kDa,
sugerindo que após o tratamento térmico, a molécula responsável pela atividade
hemaglutinante desmembra-se em moléculas menores. Apesar desse possível
desmembramento, quando o extrato de intestino tratado e não tratado termicamente foi
ultrafiltrado em coluna com limite de exclusão de 30 kDa a atividade hemaglutinante
esteve presente somente na fração acima de 30 kDa, o que sugere que no caso de
desmembramento da molécula, subunidades menores que 30 kDa não possuem
atividade hemaglutinante. Estes resultados poderiam explicar porque o peptídeo (de
16,5 kDa) resultante da eletroeluição da fração acima de 100 kDa do extrato de intestino
tratado termicamente não apresenta atividade hemaglutinante.
Nos resultados obtidos pelo Western blot, o peptídeo de 16,5 kDa não foi
reconhecido pelo anticorpo produzido contra ele, entretanto o anticorpo reconheceu
várias bandas de altos pesos moleculares presentes no intestino não tratado e tratado
termicamente, o que reforça a idéia de desmembramento da molécula. No entanto, o
fato do anticorpo não ter reconhecido o peptídeo de 16,5 kDa permanece uma dúvida.
Esta observação poderia ser atribuída à possilidade da não ligação do peptídeo de 16,5
kDa à membrana, uma vez que através de um dot blot , o peptídeo não foi observado
após corar pelo ponceau (dados não mostrados).
Dentre as moléculas identificadas após análise por espectrofotometria de massa,
duas delas foram identificadas como sendo ferritina: a banda referente ao peptídeo de
16,5 kDa, resultante da eletroeluição da fração acima de 100 kDa do extrato de intestino
93
tratado termicamente; e uma banda acima de 150 kDa, resultante da eletroforese do
intestino não tratado termicamente.
As ferritinas são proteínas que se ligam a íons de ferro, atuando na detoxificação
do ferro nas células, bem como no armazenamento de ferro na forma não tóxica, que é
utilizado em importantes processos metabólicos (Yevenes et al., 2010). Elas são
encontradas em diferentes tipos de células de vertebrados, invertebrados, plantas,
fungos e bactérias. As ferritinas de insetos, assim como as ferritinas de mamíferos, são
proteínas poliméricas, de alto peso molecular, formadas pela associação de duas
subunidades que apresentam uma cadeia pesada (H) – responsável pela oxidação do íon
ferro (Fe+2) para uma forma não tóxica (Fe+3) e outra leve (L) – responsável pela
mineralização de ferro (núcleos) na cavidade interna da molécula. As ferritinas podem
ser intracelulares (responsáveis por retirar o excesso de ferro intracelular nas células) ou
secretadas (responsáveis por remover o excesso de ferro e distribuí-lo para outros
tecidos periféricos, onde seja requerido). Além disso, tem sido sugerido que as ferritinas
dos insetos teriam função também na resposta imune (Charlesworth et al., 1997; Nichol
and Locke, 1999). Em insetos, ao contrário dos vertebrados, as ferritinas mais
predominantes são as secretadas (Nichol and Locke, 1999).
A ocorrência do fenômeno de hemaglutinação no interior do intestino médio
anterior de triatomíneos além de favorecer a ingestão de uma maior quantidade de
sangue, pode também representar um importante mecanismo fisiológico contra o efeito
tóxico de altas concentrações de ferro proveniente da ruptura das hemácias. A
hemaglutinação atuaria retardando o processo de lise (hemólise) das hemácias (uma vez
que as hemácias presentes no centro dos grumos formados, levariam mais tempo para
serem rompidas), e com isso a quantidade de ferro liberada durante a hemólise,
94
ocorreria aos poucos, evitando com isso a liberação de altas concentrações de ferro, que
poderiam ser prejudiciais as células.
O alinhamento das sequências de ferritinas de T. infestans provenientes de uma
biblioteca de glândula salivar (Assumpção et al., 2007) e de uma bibliotea de cDNA de
intestino médio anterior (realizado pela Dra. Aparecida S. Tanaka – UNIFESP) com
outras ferritinas de alguns insetos hematófagos, sugere que os triatomíneos apresentam
2 tipos de ferritina, uma provavelmente secretada (contendo peptídeo sinal) expressa no
intestino médio anterior e outra intracelular expressa no intestino médio anterior, na
glândula salivar e provavelmente em outros órgãos (os testes serão feitos). Os resultados
obtidos pela RT-PCR mostram que os triatomíneos possuem dois tipos de ferritina, uma
expressa na glândula salivar e outra no intestino.
A análise do perfil de expressão dos níveis de RNAm relativos a ferritina
intestinal em ninfas de terceiro estádio de T. infestans demonstrou que nas primeiras 24
horas após a muda ocorre um aumento expressivo do RNAm, demonstrando com isso,
que o momento utilizado para introduzir o dsRNA para silenciar a ferritina intestinal (1
dia após a muda) foi o mais indicado. Entretanto, os resultados obtidos após a
administração do dsRNA indicam que apesar de haver uma redução efetiva nos níveis
de RNAm relativo a ferritina, a atividade hemaglutinante do intestino continuou
presente nos insetos silenciados (que foram avaliados em diferentes dias após a
administração do dsRNA). O perfil eletroforético das proteínas presentes no extrato de
intestino das ninfas silenciadas também foi avaliado (dados não mostrados), e
aparentemente a banda referente à ferritina não desaparece, pois não foram observadas
diferenças na densitometria da banda entre os insetos dos grupos controles e grupos
silenciados.
95
Caso a meia vida da ferritina seja alta, e a atividade hemaglutinante observada
em ninfas silenciadas, pode ser proveniente de proteínas que foram produzidas no
estágio anterior (antes da muda do inseto), uma estratégia para "gastar" a proteína
acumulada seria alimentar os insetos após a introdução do dsRNA, e avaliar após
diferentes dias, a atividade hemaglutinante, bem como a duração do silenciamento.
Dessa forma poderíamos confirmar se a ferritina é mesmo a molécula responsável pela
atividade hemaglutinante. Araujo et al. (2006) observaram que a partir de 48 horas após
introdução do dsRNA para silenciar a nitroforina salivar de R. prolixus havia uma
redução significativa nos níveis de RNAm, entretanto a perda da atividade
anticoagulante só foi observada depois que as ninfas injetadas "gastaram" a proteína
que estava armazenada na glândula salivar. Além disso, eles verificaram que o efeito do
silenciamento (redução nos níveis de RNAm da nitroforina) foi perdido alguns dias
após a muda do inseto para o próximo estádio.
Os perfis obtidos após cromatografia do intestino tratado termicamente,
utilizando uma coluna de troca iônica e de filtração molecular demonstram que as
amostras que possuem maiores títulos de atividade hemaglutinante, são aquelas em que
há uma sopreposição entre os comprimentos de onde de 280 nm e 404 nm, que
correspondem as absorvâncias de proteínas e do agrupamento prostético heme,
respectivamente, o que reforça a hipótese de que a ferritina é molécula responsável pela
atividade hemaglutinante. Intrigantemente, essas amostras apresentaram altos níveis de
absorvância no comprimento de onda de 260 nm, o que poderia ser atribuído a uma
maior proporção do aminoácido fenilalanina na estrutura da molécula com atividade
hemaglutinante.
96
11 Conclusões – Parte 2 – Atividade hemaglutinante
 A molécula responsável pela atividade hemaglutinante presente no intestino
médio anterior de T. infestans é termo-resistente, e sua natureza povavelmente é
proteica.
 A atividade hemaglutinante presente no intestino médio anterior de T. infestans
atua sobre hemácias de diferentes hospedeiros vertebrados, entre eles,
camundongo, rato, coelho, hamster e galinha.
 A atividade hemaglutinante provavelmente não é devida a ação de lectinas, pois
durante o fenômeno observa-se a formação de fibras elásticas ligando a parede
das hemácias e não se observa a formação de rosetas.
 A atividade hemaglutinante presente no intestino médio anterior de ninfas de
terceiro estádio de T. infestans é baixa ou ausente poucos dias após a muda, e
apresenta um aumento significativo 5 dias após a muda.
 A molécula responsável pela atividade hemaglutinante provavelmente é
constituída por subunidades menores e apresenta variações no seu perfil
eletroforético, dependendo do tratamento a qual foi submetida (tratada ou não
termicamente).
 Nossas análises sugerem que a molécula hemaglutinante seja uma ferritina. A
busca no banco de dados de sequências de ferritinas em triatomíneos
97
demonstrou a existência de pelo menos uma ferritina-like secretada (com
peptídeo sinal) no intestino médio anterior.
98
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Anexo – 1 Artigo publicado: "Importance and Physiological Effects of Hemolymphagy in
Triatomines (Hemiptera: Reduviidae)"
Aceito para publicação em 23 de novembro de 2010
Periódico: Journal of Medical Entomology