UNIVERSIDADE SAGRADO CORAÇÃO Efeitos de drogas

UNIVERSIDADE SAGRADO CORAÇÃO
DALVA PAZZINI GRION
Efeitos de drogas supressoras de perda óssea no
reparo ósseo de ratas normais e ovariectomizadas.
Estudo com Alendronato de Sódio e Ranelato de
Estrôncio.
BAURU
2014
DALVA PAZZINI GRION
Efeitos de drogas supressoras de perda óssea no
reparo ósseo de ratas normais e ovariectomizadas.
Estudo com Alendronato de Sódio e Ranelato de
Estrôncio.
Tese apresentada pela aluna Dalva Pazzini
Grion à Pró-Reitoria de Pesquisa e PósGraduação da Universidade Sagrado
Coração, como parte dos requisitos para
obtenção do título de Doutor em Biologia
Oral, área de concentração: Biologia Oral,
sob orientação da Profa. Dra. Angela Mitie
Otta Kinoshita.
BAURU
2014
Grion, Dalva Pazzini.
G868e
Efeitos de drogas supressoras de perda óssea no reparo
ósseo de ratas normais e ovariectomizadas. Estudo com
Alendronato de Sódio e Ranelato de Estrôncio / Dalva
Pazzini Grion -- 2014.
64f. : il.
Orientador: Prof. Dr. Angela Mitie Otta Kinoshita.
Tese (Doutorado em Biologia Oral) – Universidade do
Sagrado Coração – Bauru – SP.
1. Osteoporose. 2. Menopausa. 3. Reparo ósseo. 4.
Ovariectomia. 5. Tratamento. I. Kinoshita, Angela Mitie Otta.
II. Título.
DALVA PAZZINI GRION
Efeitos de drogas supressoras de perda óssea no reparo ósseo de
ratas normais e ovariectomizadas. Estudo com Alendronato de
Sódio e Ranelato de Estrôncio.
Tese apresentada pela aluna Dalva Pazzini Grion à Pró-Reitoria de Pesquisa e PósGraduação da Universidade Sagrado Coração, como parte dos requisitos para
obtenção do título de Doutor em Biologia Oral, área de concentração: Biologia Oral,
sob orientação da Profª. Drª. Angela Mitie Otta Kinoshita.
Banca Examinadora:
______________________________________________
Profª. Drª. Angela Mitie Otta Kinoshita
Universidade Sagrado Coração
______________________________________________
Profª Drª Pâmela Letícia dos Santos
Universidade Sagrado Coração
______________________________________________
Profª Drª Jéssica Lemos Gulinelli
Universidade Sagrado Coração
____________________________________________
Profª Drª Roberta Okamoto
Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho
______________________________________________
Profº Dr Dejair Caitano do Nascimento
Instituto Lauro de Souza Lima
Bauru, 24 de Fevereiro de 2014.
Dedico este trabalho aos meus pais
Miguel e Maria (in memorian) que por
uma vida de amor, trabalho e dedicação
me mostraram o caminho da honestidade
e persistência, possibilitando a realização
de sonhos e conquistas. Ao meu esposo
Neto,
pelo
apoio
incondicional
principalmente
nos
momentos
de
incertezas, tão comuns a quem trilha
novos caminhos.
AGRADECIMENTOS
Agradeço à Profª Drª Angela Mitie Otta Kinoshita que, tão brilhantemente orientou
esse trabalho com o Dom da pesquisa. Agradeço pela oportunidade de estar
novamente ao seu lado desfrutando de seus conhecimentos e sabedoria, sempre
com tamanha serenidade. Meu respeito e admiração!
À colega de doutorado, companheira de tantas horas, Regina Magrini Guedes de
Azevedo, pela colaboração nos trabalhos de pesquisa e que, com seu bom humor
constante tornou mais suaves os momentos árduos...Obrigada pela amizade.
Ao Leonardo Marques pela grande colaboração nos procedimentos cirúrgicos com
extrema competência e determinação.
Aos alunos Pérola Padilha Góes, Bruno Oliver Pierim, Mariana Marques Escobar
Bueno, Marina Rolon, Cristina Constâncio e Ana Carolina Trukes Coelho pela
dedicação e empenho.
Aos funcionários da USC pelo auxílio e prontidão sempre.
Ao CNPq pelo financiamento parcial do projeto.
6
“Mesmo quando tudo parece desabar,
cabe a mim decidir entre rir ou chorar, ir
ou ficar, desistir ou lutar; porque descobri,
no caminho incerto da vida, que o mais
importante é o decidir.” (Cora Coralina)
7
RESUMO
Osteoporose pós-menopausa ocorre devido à deficiência estrogênica que leva à
reabsorção óssea aumentada. O Alendronato de sódio (ALD) é um bisfosfonato
amplamente empregado na prevenção e tratamento da osteoporose, aumentando a
densidade mineral óssea, e consequentemente, reduzindo a incidência de fraturas,
porém em tratamentos com altas doses ou a longo prazo pode causar osteonecrose
e fraturas atípicas. O Ranelato de estrôncio (RE) além de promover a formação de
novo osso também inibe
diferenciação
dos
a
reabsorção
óssea
osteoclastos. Sabendo que o
através
da
diminuição
metabolismo
ósseo
da
em
indivíduos normais é diferente daquele em indivíduos osteoporóticos, o objetivo
desse trabalho é avaliar e comparar o efeito das drogas supressoras de
reabsorção óssea em animais com depleção estrogênica e normais na reparação
óssea por meio de avaliação radiográfica e histomorfométrica. Foram utilizadas 108
ratas que foram submetidas à cirurgia de ovariectomia (OVX) ou cirurgia fictícia
(SHAM) divididas randomicamente em 6 grupos com 18 cada, distribuídas como
segue: OVX/ALD, OVX/RE e
OVX/NaCl, SHAM OVX/ALD,
SHAM OVX/RE e
SHAM OVX/NaCl. Após a ovariectomia (60 dias), todos os animais foram tratados
com a droga relativa ao grupo até o término do período experimental. Após 30
dias de tratamento, um defeito de 5mm de diâmetro foi criado cirurgicamente na
calvária dos animais. Após 7, 15, 45 dias, os animais foram submetidos à eutanásia
e as peças ósseas removidas.
A análise dos resultados foi realizada por
microscopia e radiografia. A histomorfometria, aos 15 dias mostra que os grupos
tratados (ALD e RE) apresentaram maior formação óssea em relação ao não tratado
(NaCl) tanto nos grupos SHAM quanto no grupo OVX (p<0.05 ANOVA, Tukey). Além
disso, os animais tratados com RE apresentam maior formação óssea em relação
ao grupo ALD. De modo semelhante, aos 45 dias os resultados da morfometria
indicam que na região da borda do defeito, os grupos tratados (ALD e RE)
apresentaram maior formação óssea em relação ao grupo não tratado (NaCl) tanto
no grupo SHAM quanto no grupo OVX (p<0.05 ANOVA, Tukey).
Palavras Chaves: Osteoporose. Menopausa. Reparo Ósseo.Tratamento.
Ovariectomia.
8
ABSTRACT
Postmenopausal osteoporosis due to estrogen deficiency occurs as a consequence
of increased bone resorption. Sodium Alendronate (ALD) is a bisphosphonate widely
used in the prevention and treatment of osteoporosis that increases bone mineral
density and consequently reduces the incidence of fractures. In treatments with high
doses or long-term can cause osteonecrosis and atypical fractures. The Strontium
ranelate (RE) promotes new bone formation and also inhibits bone resorption by
decreasing osteoclast differentiation. As the bone metabolism in normal subjects is
different from that in osteoporotic individuals, the aim of this work is to evaluate and
compare the effect of suppressing drugs on bone resorption in subjects with normal
and estrogen depletion in bone repair. The total of 108 rats was randomly divided
into 6 groups of 18 each and underwent surgical ovariectomy (OVX) or sham surgery
(SHAM), distributed as follows: OVX / ALD, OVX / OVX and RE / NaCl, SHAM OVX /
ALD OVX SHAM / SHAM and OVX RE / NaCl. After ovariectomy (60 days), all
animals were treated with the drug relative to the group until the end of the
experimental period. After 30 days of treatment, a defect of 5 mm diameter was
surgically created in the calvaria of animals. After 7, 15, 45 days, the animals were
euthanized and bone pieces removed. The analyses of results was performed by
microscopy. The histomorphometry at 15 days shows that the treated groups (ALD
and RE) showed greater bone formation compared to untreated (NaCl) in both
groups, SHAM and OVX (p <0,05 ANOVA, Tukey). Furthermore, animals treated with
RE show increased bone formation compared to the ALD group. Similarly, at 45 days
the results indicate that in the edge region of defect, the treated groups (ALD and
RE) showed greater bone formation compared to the untreated group (NaCl) in both
the SHAM group and the OVX group (p <0,05 ANOVA, Tukey).
Palavras-chave: Osteoporosis. Menopausal. Bone repair.
ranelate . Ovariectomy.
Alendronate. Strontium
9
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1- Estrutura química dos bisfosfonatos (Russell et al 2007). ....................... 211
Figura 2- Estrutura química do alendronato (Russell et al 2007). ...........................233
Figura 3 - Estrutura química do Ranelato de Estrôncio (Blake & Fogelman, 2006).266
Figura 4- Delineamento experimental ..................................................................... 322
Figura 5 - Cirurgia de Ovariectomia. (A) Antissepsia da área cirúrgica; (B) Incisão e
localização de tuba uterina e ovário; (C) Ligadura da tuba uterina e (D) Ovário
removido.................................................................................................................. 344
Figura 6 - Lâmina de esfregaço vaginal. (Aumento 40x). ........................................ 355
Figura 7 - Cirurgia de Craniotomia: (A) Incisão; (B) Confecção do defeito com Broca
Trefina de 5mm; (C) Defeito de 5mm de diâmetro e (D) Sutura do corte cirúrgico . 377
Figura 8 - Remoção da região do defeito ósseo........................................................38
Figura 9 –Peça encaminhada para análise histológica. ............................................ 39
Figura 10 - Telerradiografias dos defeitos ósseos após tratamento e respectivos
períodos.. .................................................................................................................. 42
Figura 11 – Imagens Histológicas do Grupo NaCl. ................................................. 444
Figura 12 - Imagens Histológicas do Grupo Ranelato de Estrôncio ........................466
Figura 13 - Imagens Histológicas do Grupo Alendronato de Sódio. ..........................48
Figura 14 - Histomorfometria do tecido ósseo nos períodos de 15 e 45 dias. (A)
Borda do defeito. (B) Centro do defeito. .................................................................... 51
Figura 15 - Histomorfometria do tecido ósseo do período de 15 dias. (A) Borda do
feito. (B) Centro do defeito.) .................................................................................... 522
Figura 16- Histomorfometria do tecido ósseo do período de 45 dias. (A) Borda do
feito. (B) Centro do defeito. ..................................................................................... 533
10
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 12
2 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................. 14
2.1 OSTEOPOROSE .............................................................................................14
2.2 REPARO ÓSSEO ...............................................................................................16
2.3 TRATAMENTO DA OSTEOPOROSE ................................................................18
2.3.1 Vitamina D e Cálcio.......................................................................................19
2.3.2 Análogos do Hormônio da Paratireoide (Pth) ................................................ 19
2.3.3 Moduladores de Receptor Seletivo de Estrógenos (SERMs) ........................20
2.3.4 Anticorpos Monoclonais Humanos ................................................................20
2.3.5 Inibidor Seletivo de Catepsina-K ................................................................... 20
2.3.6 Bisfosfonatos................................................................................................. 21
2.3.7 Ranelato de Estrôncio ...................................................................................26
3 MATERIAIS E MÉTODOS .....................................................................................31
3.1 LOCAL E GRUPOS DE ESTUDO .................................................................... 31
3.2 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ................................................................32
3.3 PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS .................................................................. 33
3.3.1 Anestesia e Antissepsia ............................................................................. 33
3.3.2 Ovariectomia e Cirurgia SHAM ................................................................. 33
3.3.3 Comprovação do ciclo estral...................................................................... 34
3.3.4 Tratamento ................................................................................................35
3.3.5 Técnica cirúrgica – Craniotomia................................................................. 36
3.4. PREPARO DAS PEÇAS E FORMA DE ANÁLISE DOS RESULTADOS ........ 37
3.4.1. Análise Macroscópica ............................................................................... 38
3.4.2 Análise Radiográfica .................................................................................. 38
3.4.3 Análise Histológica.....................................................................................39
3.4.4 Histomorfometria........................................................................................39
3.4.5 Análise Estatística......................................................................................40
4 RESULTADOS ....................................................................................................... 41
4.1 ANÁLISE MACROSCÓPICA............................................................................ 41
4.2 ANÁLISE RADIOGRÁFICA .............................................................................. 41
4.3. ANÁLISE HISTOLÓGICA................................................................................ 43
4.3.1 Grupo NaCl SHAM e OVX ........................................................................ 43
11
4.3.2 Grupo Ranelato de Estrôncio SHAM e OVX .............................................. 45
4.3.3 Grupo Alendronato de Sódio SHAM e OVX............................................... 47
4.4 HISTOMORFOMETRIA E ANÁLISE ESTATÍSTICA ........................................ 49
5 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 54
6 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 59
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 60
ANEXO A – PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA ............................64
12
1 INTRODUÇÃO
De acordo com o Relatório Global da Organização Mundial de Saúde sobre
Prevenção de Quedas na Velhice (2010)(1), o número de pessoas com mais de 60
anos cresce com rapidez maior do que qualquer outro grupo etário. O número desse
grupo foi estimado para 688 milhões de pessoas, em 2006, projetado para crescer
para quase dois bilhões de pessoas até 2050. Os segmentos mais velhos da
população, com idades superiores a 80 anos, particularmente suscetíveis a quedas
e suas consequências é o grupo que cresce com rapidez maior e espera-se que
chegue a representar 20% da população mais idosa até 2050.
Assim o aumento da expectativa de vida reflete no maior número de
indivíduos afetados por doenças crônico-degenerativas, e a osteoporose é a doença
osteometabólica de maior prevalência mundial constituindo-se um problema de
saúde pública com grande impacto sócio-econômico (2).
O termo osteoporose foi inicialmente introduzido na França e Alemanha no
século passado, com o significado de “osso poroso” originado de análise histológica
e redefinido, posteriormente, como “osso normalmente mineralizado, mas em
quantidade reduzida” (3).
Trata-se de um distúrbio multifatorial e progressivo do esqueleto caracterizado
por redução da massa óssea e deterioração da microarquitetura do tecido, com
consequente aumento da fragilidade óssea e do risco de fraturas (4) (5). É um
problema que atinge um maior número de mulheres quando comparada aos
homens, na proporção de 5:2, com idade superior a 50 anos (6). Esta diferença
pode ser explicada em parte pelo menor pico de massa óssea e alterações
hormonais que ocorrem quando a mulher atinge a fase da menopausa. Além do que,
a longevidade das mulheres é maior que a dos homens, tendo mais tempo para a
redução na massa óssea (7).
O volume e a qualidade do osso são fatores importantes na área da ortopedia
e odontologia, pois em várias situações ocorre a falta de tecido ósseo necessário
para práticas clínicas de fixação de próteses e implantes (7). Ressaltando que o
reparo ósseo de defeitos relativamente grandes, congênitos ou decorrentes de
13
fraturas, cirurgias ou doenças, quando deixados ao seu livre curso não se resolvem
ou o fazem muito lentamente e de modo incompleto. Nessas condições o uso de
drogas antirreabsortivas pode representar uma alternativa de grande importância
para favorecer o reparo, além de ser uma prática não dispendiosa e facilmente
aplicável na clínica (8).
O reparo de defeitos relativamente grandes representa um desafio de ordem
ortopédica e odontológica, sendo sua resolução difícil e lenta, principalmente em se
tratando de indivíduos com metabolismo ósseo comprometido.
Poucos estudos têm sido realizados para comparar os efeitos de Alendronato
de Sódio (ALD) e Ranelato de Estrôncio (RE) em indivíduos normais e
osteoporóticos. Assim, nosso estudo tem por objetivo verificar os efeitos das duas
drogas antirreabsortivas, em modelo animal que simula condições em mulheres
normais e mulheres no período pós-menopausa, em que a deficiência estrogênica
favorece o aparecimento de quadros osteoporóticos, comparando os resultados
obtidos através de análise histomorfométrica e radiográfica da neoformação óssea
em
defeitos
críticos
confeccionados
em
calvária
de
ratas
normais
e
ovariectomizadas.
Entre as mulheres mais velhas, o tratamento com bisfosfonato por mais de
cinco anos foi associado com um risco aumentado de fraturas da diáfise
subtrocanteriana ou femoral (9), fraturas conhecidas como atípicas. Osteonecrose
de mandíbula também tem sido relatada atualmente com outro efeito colateral dos
bisfosfonatos. Ambos os efeitos são devidos a um estado de baixo turnover ósseo
induzido pela droga. Embora o principal efeito seja a antireabsorção, a interrupção
da conexão entre osteoblastos e osteoclastos promovida pelos bisfosfonatos resulta,
além da redução da reabsorção, na diminuição da formação óssea a longo prazo
(10).
O ranelato de estrôncio é a única droga que apresenta efeito combinado entre
a estimulação da formação e inibição de reabsorção óssea. Age sobre a superfície
do osso e estimula a diferenciação de osteoblastos por estimular receptores
sensíveis ao cálcio, mas inibe a diferenciação osteoclástica por inibir a produção de
Receptor de Fator Ativador Kappa B (RANK) e aumentar a atividade de
Osteoprotegerina (OPG) (11).
14
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 OSTEOPOROSE
A osteoporose é uma doença silenciosa, pois geralmente é assintomática e
diagnosticada somente após a ocorrência de alguma fratura por fragilidade (11). A
determinação da densidade mineral óssea (DMO) através da Densitometria Óssea
por Raios-X de dupla energia (DXA) e a Tomografia Micro-Computadorizada (microCT) são métodos válidos para diagnosticar precocemente a osteoporose e predizer
o risco de fraturas, além de avaliar, através de testes sucessivos, se um tratamento
está ou não apresentando resultados satisfatórios (12,13).
A dosagem sanguínea de biomarcadores como a osteocalcina (OCN) e o
Paratormônio (PTH) também é útil para diagnosticar a doença e monitorar o efeito
de drogas antiosteoporóticas (8).
A OCN é produzida somente por osteoblastos. Baixos níveis de OCN indicam
função osteoblástica prejudicada podendo gerar um desequilíbrio entre osteoblastos
e osteoclastos seguida de perda de massa óssea (8).
O PTH aumenta a liberação de cálcio acumulado nos ossos, portanto, altos
níveis de PTH no soro indica descalcificação óssea (13).
Pode ser classificada como osteoporose primária quando ocorre por causas
naturais como a menopausa e a senilidade, e osteoporose secundária quando há
uma causa inicial como uso crônico de medicamentos corticóides e algumas
doenças como artrite reumatóide, mieloma múltiplo, alterações endócrinas,
desnutrição e doenças neoplásicas (13,14).
A osteoporose pós-menopausa é caracterizada por uma pronunciada
reabsorção óssea devido à redução dos níveis de estrógenos ocasionando a perda
de massa óssea e riscos de fraturas em ossos longos e vértebras (2,12), e as de
quadril e de vértebras as que oferecem sérios riscos de saúde aos pacientes,
resultando em períodos de internação prolongados, diminuição da autonomia,
redução da qualidade de vida e aumento das taxas de mortalidade (4).
A menopausa é caracterizada pela supressão do ciclo menstrual que ocorre
nas mulheres por volta dos 48,7anos, tendo seu diagnóstico firmado após um ano
15
de amenorreia (9) com manifestações de vários sintomas sistêmicos e alterações
metabólicas que influenciarão na qualidade de vida e na saúde da mulher, dentre
elas a osteoporose e suas consequências. Os hormônios sexuais têm importante
papel no crescimento ósseo e na manutenção do pico de massa óssea (12).
Após a menopausa, a deficiência de estrogênio leva a uma regulação positiva
de RANKL (Ligante de Receptor Ativador de Fator Nuclear KappaB) nas células da
medula óssea, que é um importante determinante do aumento de reabsorção óssea,
enquanto o próprio estrogênio estimula a produção de osteoprotegerina (OPG) nos
osteoblastos, exercendo, em consequência, efeitos antirreabsortivos no osso. Os
efeitos extra esqueléticos da deficiência de estrogênio baseiam-se principalmente no
aumento da excreção renal de cálcio e na redução da absorção intestinal do mineral.
A deficiência de estrógenos também causa um aumento contínuo nos níveis de PTH
(14), além de representar um fator dominante na formação do tecido ósseo cortical
por sustentar osteoblastos e prevenir a reabsorção óssea através da supressão da
osteoclastogênese e estimular a apoptose dos osteoclastos (15).
A deficiência estrogênica está associada a mudanças na conectividade de
estruturas trabeculares ósseas, como redução do número de trabéculas e aumento
dos espaços trabeculares caracterizando a perda de massa óssea e redução da
força (16).
A reposição estrogênica é empregada como medida preventiva e terapêutica
(17) do sistema esquelético contra fraturas e perda de tecido ósseo primariamente
por inibir a reabsorção óssea (18). O 17-beta-estradiol promoveu apoptose em
osteoclastos de ratos in vitro e in vivo, o que sugere que os estrógenos podem
prevenir perda óssea excessiva antes e após a menopausa pela indução da
apoptose dos osteoclastos (17).
Atualmente, vários agentes antiosteoporóticos tem sido empregados no
tratamento clínico da doença, tais como os bisfosfonatos (alendronato, risedronato,
zolendronato,
e
outros),
ranelato
de
estrôncio,
hormônio
paratireoideano,
moduladores de receptores seletivos de estrógenos e calcitonina (14,18).
Fratura óssea é a mais temida complicação da osteoporose e resulta,
frequentemente, na incapacidade e perda de autonomia de pacientes com
16
consequências socioeconômicas. Com o aumento da idade, entre outros fatores, o
reparo ósseo das fraturas se torna mais difícil e demorado (19). Fraturas
osteoporóticas de espinha e quadril levam a 20% de mortalidade, devido à
hospitalização por longos períodos associada à outras intercorrências como
pneumonia e doenças tromboembólicas devidas à imobilização crônica (20).
2.2 REPARO ÓSSEO
O tecido ósseo é um tecido dinâmico, pois está em constante atividade de
remodelação, sendo que a massa óssea depende do equilíbrio entre a formação
através de osteoblastos e a reabsorção óssea por osteoclastos, funções celulares
que são mediadas por fatores locais e sistêmicos (2,14).
O reparo e remodelação ósseos são realizados por um complexo esforço
celular, fatores bioativos e matriz extracelular para estimular a proliferação,
diferenciação e migração de células osteoprogenitoras. A indução de cascatas de
sinalização para o tecido reparado resulta de elevada expressão de fatores próinflamatórios, angiogênicos e de crescimento osteogênicos liberados por células do
local da lesão, muitos dos quais participam do desenvolvimento embrionário e da
homeostase óssea (17).
O tecido ósseo tem a capacidade de reparar fraturas ou defeitos locais por
meio do processo de regeneração, com a formação de novo tecido que apresente a
mesma organização estrutural do tecido anterior, sem a formação de cicatriz (17).
O reparo ósseo após uma lesão é caracterizado por 3 fases: inflamação,
renovação e remodelação. Fatores de crescimento são moléculas sinalizadoras
solúveis que controlam uma variedade de respostas celulares através de ligantes de
receptores específicos de membrana das células alvo. Na fase inflamatória há o
recrutamento de células de defesa e progenitoras mesenquimais (21) e o processo é
controlado por fatores de crescimento e citocinas pró-inflamatórias liberadas
temporariamente e localmente após a lesão. Entre as moléculas inflamatórias
envolvidas estão o fator de necrose tumoral-α (TNF-α), interleucinas (IL), interferon-γ
(IT-γ) e prostaglandinas (PG) que estimulam a migração e diferenciação de
17
osteoblastos e osteoclastos além de ativar uma cascata secundária que aumenta a
angiogênese e o reparo ósseo (19).
Na segunda fase, há a formação de um calo mineralizado através de 2 vias
de osteogênese: a formação direta de osso através de resposta do periósteo
(ossificação intramembranosa) e a formação de osso através de uma cartilagem
intermediária (ossificação endocondral). Nesses dois processos, a angiogênese se
torna um fator concorrente ou correlato para a neovascularização (21). A presença
de uma rede microvascular local sustenta células mesenquimais, osteogênicas e
condrogênicas necessárias para o reparo. A angiogênese é regulada por moléculas
solúveis como o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de
crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento fibroblástico (FGF)
e fator de crescimento semelhante à insulina (IGF) (19).
O terceiro estágio da regeneração óssea ocorre com a remodelação do tecido
ósseo lamelar até uma estrutura semelhante ao osso existente antes da injúria (21).
Várias situações contribuem para um reparo ósseo prejudicado como idade
avançada, osteoporose, estados de má nutrição e a fase pós-menopausa (20). Os
hormônios sexuais têm importante papel no crescimento ósseo e na manutenção do
pico de massa óssea. Em casos de ovariectomia realizada em mulheres jovens ou
ainda, na menopausa precoce, também pode se observar uma perda acelerada da
massa óssea, com instalação mais rápida de quadro osteoporótico (17).
Nesses casos o processo de reparo normal é deficiente e não atinge o reparo
completo. Porém, ainda não há um consenso a respeito de qual estágio do reparo é
mais afetado pela deficiência estrogênica, se a fase inicial de formação, se na fase
de mineralização ou na fase mais tardia, a remodelação (17).
Assim, medicamentos que possam estimular a reparação óssea se fazem
cada vez mais necessários, pois é crescente o número de fraturas as quais
representam grande impacto na qualidade de vida dos pacientes além de
consequências consideráveis à sociedade do ponto de vista econômico. Casos em
que o reparo ósseo não ocorre de forma completa dentro de um período de 4 a 6
meses somente uma mudança de tratamento poderá evoluir para reparo total (20).
18
Kuroda, Noritake e Kasugai (3) mostraram que em ratas ovariectomizadas a
Densidade Mineral Óssea (DMO) da porção trabecular do fêmur foi reduzida quando
comparada ao grupo controle (não-ovariectomizadas).
Os modelos de estudos com a criação de defeito ósseo na calvária de ratas
oferece grande similaridade com ossos da região maxilofacial, pois o osso da calota
craniana se desenvolve morfo e embriologicamente a partir de uma membrana o que
lhe confere características de osso membranoso. Anatomicamente a calvária é
formada por duas placas de osso cortical, intercaladas com osso esponjoso,
assemelhando-se à mandíbula (22).
O reparo do defeito se inicia pelas bordas com a formação de osso lamelar
(22). Defeitos de 3 a 5 mm de diâmetro, um arcabouço de matriz osteóide é formado
inicialmente e depois há uma deposição de osso lamelar nos espaços
intertrabeculares recém-formados. Após 4 semanas os defeitos são preenchidos
completamente por osso compacto. A finalização do preenchimento não significa a
completa cicatrização, pois a estrutura do osso regenerado ainda é muito diferente
da estrutura do osso cortical osteonal, embora pareça compacto. Isso ocorrerá
através do remodelamento harvesiano que se inicia pelo córtex imediatamente
adjacente à margem da perfuração inicial, em aproximadamente 3 semanas após a
confecção do defeito. A remodelação segue da margem do defeito para o osso
recém-formado e o substitui com ósteons secundários orientados longitudinalmente
(23).
2.3 TRATAMENTO DA OSTEOPOROSE
O
tratamento
da
osteoporose
busca
primeiramente
medidas
não
farmacológicas como dieta balanceada com concentrações ideais de vitamina D e
cálcio, exercícios físicos adequados e regulares, supressão de tabaco, abstinência
do uso excessivo de álcool e prevenção de quedas. Na falha dessas medidas aí sim
é empregada a terapia farmacológica (24).
19
Atualmente várias terapias farmacológicas que reduzem de fato o número de
fraturas através da melhora da massa óssea estão disponíveis no mercado. A
maioria dos medicamentos comercializados reduz a perda óssea através da inibição
da reabsorção óssea, mas as terapias novas podem aumentar diretamente a massa
óssea, como é o caso do paratormônio (24).
Nas duas últimas décadas, desenvolveram-se opções de tratamento
farmacológico e não farmacológico para reduzir o risco de fraturas em pacientes
osteoporóticos. A terapêutica para osteoporose que vem sendo adotada com maior
prevalência é aquela dada por agentes antirreabsortivos, como os bisfosfonatos,
porém a eficácia antifratura de tais agentes mostrou-se bem inferior à desejada (25).
O tratamento ideal para a osteoporose deve fornecer eficácia antifratura em
vários sítios do sistema esquelético incluindo espinha, sítios não-vertebrais e quadril;
alta margem de segurança; modo de administração e intervalos entre as doses que
facilitem a aderência ao tratamento; compatibilidade com drogas prescritas para
outras patologias e custo acessível (13).
2.3.1 Vitamina D e Cálcio
A deficiência de vitamina D e de cálcio leva ao hiperparatitreoidismo
secundário, à osteomalácia e à osteoporose, assim concentrações ideais dessas
substâncias são a base da prevenção e tratamento da osteoporose. A dose
recomendada de vitamina D é de 800UI/ dia e do cálcio em indivíduos adultos, 10001200mg diariamente, sendo a associação recomendada, pois há estudos que
mostram que o cálcio em altas doses, quando administrado sem a vitamina D,
aumenta o risco de doenças cardiovasculares (26).
2.3.2 Análogos do Hormônio da Paratireoide (Pth)
Análogos do hormônio paratireoideano como o PTH I-34 e PTH I-84 são
indicados como terapêutica na osteoporose estabelecida em mulheres no período
pós-menopausa. São drogas anabólicas, pois não só preservam a densidade
20
mineral óssea por bloquear a atividade osteoclástica, mas também aumentam o
número de osteoblastos e tem efeito reduzido sobre a reabsorção (26).
2.3.3 Moduladores de Receptor Seletivo de Estrógenos (SERMs)
O raloxifeno é um modulador de receptor seletivo de estrógenos (SERM), ou
seja, atua como um agonista hormonal em ossos, lipídios e sistema de coagulação
sanguínea, e age como antagonista estrogênico em mamas e útero, tendo efeito
protetor contra o câncer de mama.
É pouco indicado na prevenção de fraturas
osteoporóticas, pois apresenta efeito preventivo apenas para fraturas vertebrais, e
não de quadril, além de estar associado ao risco de trombose venosa (26).
2.3.4 Anticorpos Monoclonais Humanos
O denosumab é um anticorpo monoclonal humano que se liga à RANKL e
inibe a interação RANK-RANKL levando à supressão da formação, função e
sobrevivência dos osteoclastos, o que pode ser comprovado pela inibição da
concentração de C-telopeptídio, um marcador sérico de reabsorção óssea. Assim
tem sido uma nova abordagem na prevenção de fraturas osteoporóticas (26).
2.3.5 Inibidor Seletivo de Catepsina-K
A catepsina-K é uma protease que induz a degradação da matriz óssea
mediada por osteoclastos. O inibidor seletivo de catepsina K, odanacatibe,
administrado semanalmente, promove grande aumento na densidade mineral óssea
na coluna lombar e quadril. Normalmente, a formação e a reabsorção ósseas
ocorrem de forma interligada, durante o tratamento com odanacatibe, ocorre um
desacoplamento desses processos (26).
21
2.3.6 Bisfosfonatos
Os bisfosfonatos são fármacos de escolha para o tratamento de uma série de
doenças ósseas onde há uma excessiva atividade osteoclástica, merecendo
destaque a osteoporose, que atualmente se tornou um problema de saúde pública
devido ao aumento da expectativa de vida da população. São bastante utilizados
também nos casos de osteoporose secundária, causada por uso prolongado de
glicocorticoides, gravidez, transplante de órgãos e paraplegia (24).
Os bisfosfonatos pertencem a uma classe de fármacos que apresentam uma
ligação P-C-P em sua estrutura química e agem como inibidores da reabsorção
óssea, mediada por osteoclastos. São empregados no tratamento de diversas
desordens ósseas como a doença de Paget, hipercalcemia maligna, osteoporose e a
doença mestastática e osteolítica (24). São análogos do ácido pirofosfórico,
sustância endógena que se encontra no organismo sob a forma de pirofosfato, um
inibidor natural da reabsorção óssea. Os bisfosfonatos, por serem sintetizados
quimicamente através de modificações moleculares apresentam maior resistência à
degradação enzimática e maior meia-vida biológica o que acaba por influenciar no
metabolismo ósseo (25).
Figura 1- Estrutura química dos bisfosfonatos (Russell et al 2007).
Os bisfosfonatos agem diretamente sobre os osteoclastos e interferem em
processos
bioquímicos
intracelulares
específicos
como
a
biossíntese
de
22
isoprenóides e subsequente prenilação de proteínas para inibir a atividade celular
(25).
Os osteoclastos realizam endocitose, assim os bisfosfonatos presentes no
espaço onde ocorre a reabsorção podem penetrar nestas células, afetando seu
metabolismo e induzindo apoptose (24).
Os bisfosfonatos ligam-se aos cristais de hidroxiapatita, tendo, portanto, uma
afinidade muito alta pelo osso. São liberados da matriz óssea mediante exposição a
ácido e enzimas secretados por um osteoclasto ativo. Após o início da terapia oral
com bisfosfonatos, a supressão da reabsorção óssea ocorre dentro de cerca de três
meses, a despeito da frequência de dosagem, sendo mais rápida após
administração endovenosa (24).
Ficou demonstrado que, após três anos de tratamento, os bisfosfonatos
aumentam a DMO do quadril em 3%-6% e a da coluna vertebral em 5%-8%. Em
mulheres com osteoporose, o ácido zoledrônico, o alendronato e o risedronato
também reduzem as fraturas não vertebrais em 25%-40%, inclusive a fratura de
quadril em 40%-60% (11).
A administração endovenosa rápida de bisfosfonatos parenterais pode causar
toxicidade renal. O uso de bisfosfonatos parenterais não é recomendado para
pacientes com clearance de creatinina inferior a 30-35 mL/min e pacientes com
outras doenças que resultam em baixa densidade óssea, como a osteodistrofia renal
(11,26).
Os bisfosfonatos apresentam baixa absorção intestinal em humanos,
refletindo em biodisponibilidade oral em torno de 0,7% para o alendronato, 0,3%
para o pamidronato, 3-7% para o etidronato e 1-2% para o clodronato. A baixa
absorção é devida ao caráter lipofílico bastante baixo, o que dificulta sua passagem
através de barreira epitelial (24). A única rota de eliminação dos bisfosfonatos é a
excreção renal. Uma vez ligados ao tecido ósseo, os bisfosfonatos são liberados
somente quando o tecido ósseo sofre reabsorção.
De modo geral, os bisfosfonatos apresentam poucos efeitos adversos sendo
mais comumente observados distúrbios gastrintestinais e alterações no paladar (24).
23
O Alendronato, foi o primeiro bisfosfonato a ser aprovado para o tratamento
da osteoporose nos EUA em 1995. Desde então, bisfosfonatos mais novos e com
um maior intervalo entre as doses vêm sendo introduzidos, numa tentativa parcial de
aumentar a adesão ao tratamento (11).
Figura 2- Estrutura química do alendronato (Russell et al 2007).
O alendronato pode se ligar à superfície óssea e inibir a FPPS (Farnesil
Difosfato Sintetase), enzima da sequência da biossíntese do colesterol, pela via do
melavonato, requerida para a produção de geranilgeranil difosfato (27). A
geranilgeranil difosfato se liga a membrana celular por um processo de isoprenilação
de proteínas. A depleção desta enzima reduz a prenilação de proteínas que
controlam a forma celular e a formação da borda em escova dos osteoclastos,
resultando
em
prejuízo
da
sua
função
reabsortiva
(28),
aumentando
significativamente a densidade mineral óssea e reduzindo fraturas vertebrais e nãovertebrais, o que vem sendo demonstrado em 20 anos de uso clínico com segurança
e eficácia (27).
A eficácia clínica do alendronato parece ser maior que a prevista a partir de
sua potência celular o que pode ser atribuído à sua maior afinidade ao mineral o que
também pode explicar sua maior afinidade à redução do turnover ósseo quando
comparado ao seu análogo, o risedronato que é o inibidor mais potente de FPPS
entre os bisfosfonatos clinicamente importantes (25).
Dados histomorfométricos mostram que o turnover ósseo não é suprimido
completamente, mas parece alcançar níveis menores que aqueles encontrados na
fase de pré-menopausa. Tal redução na remodelação óssea se apresenta maior
24
para o alendronato, ibandronato e zoledronato do que para risedronato ou etidronato
quando avaliadas doses usadas no tratamento de osteoporose (25).
Os bisfosfonatos podem afetar a reabsorção mediada por osteoclastos
através de efeitos sobre o recrutamento de osteoclastos, diferenciação e atividade
reabsortiva e podem ainda afetar a morfologia osteoclástica e causar apoptose
dessas células in vitro. A acidificação das vesículas intracelulares parece ser
necessária para permitir o movimento dos bisfosfonatos dentro do cito sol e dentro
de outras organelas como os peroxissomos, onde eles exercem seu efeito
bioquímico (25).
Após atingirem os sítios importantes do esqueleto, todos os bisfosfonatos
inibem a reabsorção óssea através de efeitos intracelulares nos osteoclastos. O
efeito inicial dos bisfosfonatos contendo nitrogênio em sua molécula (alendronato)
parece ser prejudicar a função dos osteoclastos e reduzir a reabsorção.
Eventualmente esses podem causar apoptose, mas esta não é o principal fator para
a inibição dos osteoclastos (25).
Os bisfosfonatos são classificados em 2 grupos, de acordo com seu
mecanismo de ação. No primeiro grupo estão os bisfosfonatos que não possuem
átomos de nitrogênio em sua molécula como o clodronato e etidronato. E podem ser
metabolicamente incorporados em análogos β, γ-metileno não hidrolisáveis de
Adenosina Trifosfato (ATP) pela reversão de reações aminoacil-tRNA sintetase
normalmente envolvidas em ativação de aminoácidos durante a síntese proteica
(33). Esse grupo de fármacos são provavelmente metabolizados em nucleotídeos
tipo App-Cp devido a sua semelhança ao pirofosfato presentes naturalmente no
organismo. É provável que o acúmulo intracelular desses metabólitos inibe a função
dos osteoclastos e induz à apoptose (25).
Já no segundo grupo estão os bisfosfonatos mais potentes, aqueles que
possuem
Nitrogênio
ligado
(N-BPs),
como
o
alendronato,
risedronato
e
zolendronato. Membros deste grupo interferem com outras reações metabólicas,
principalmente na via sintética do mevalonato, conhecida por sua participação na
biossíntese de colesterol e outros esteróis. Várias enzimas dessa via utilizam
isoprenóide difosfato como substrato e os bisfosfonatos contendo nitrogênio
poderiam então agir como substratos análogos de um ou mais dos isoprenóides
25
difosfatos. Sabe-se que o maior alvo é agora uma enzima, a FPPS, a qual é inibida
por todos os bisfosfonatos N-BPs usados clinicamente. A FPPS ocorre em
peroxisomas, mitocôndrias e no citosol e o sítio de ação dos N-BPs é desconhecido
(25).
Após se ligarem à matriz mineral óssea, os bisfosfonatos são internalizados
através de endocitose. Os bisfosfonatos simples são metabolizados no citosol dos
osteoclastos em análogos de ATP que induzem à apoptose das células. Os N-BPs
inibem FPPs, prevenindo a prenilação de pequenas proteínas GTPase essenciais
para as funções e sobrevivência de osteoclastos. A inibição de FPPS também causa
o acúmulo de IPP que é incorporado a ApppI ( um análogo de ATP capaz de induzir
a apoptose de osteoclastos) (25).
Embora os bisfosfonatos sejam reconhecidamente benéficos no tratamento
de fraturas osteoporóticas típicas, são pouco empregados em indivíduos que
apresentam alto risco de fraturas (29).
Park-Wyllie et al (29) mostraram em seu trabalho que
essa classe de
medicamentos, quando utilizada por período de 5 anos ou mais, oferecem um maior
risco de fraturas subtrocantérica ou de diáfise femural.
Em seu trabalho, Chen e colaboradores (27) mostraram que o alendronato de
sódio apresenta efeitos melhores que a calcitonina de salmão sobre osteointegração
de implantes de hidroxiapatita, o que pode ser atribuído aos diferentes mecanismos
de ação. Ambas as drogas apresentam ação antirreabsortiva, porém a calcitonina de
salmão não apresenta formação óssea significante e o papel de inibição
osteoclástica realizado pelo alendronato é bem maior. Tais efeitos foram observados
tanto em condições osteoporóticas quanto em animais com metabolismo ósseo
normal, o que indica que o alendronato de sódio pode ser útil quando da
implantação de próteses, principalmente em indivíduos idosos em que a
osteoporose está frequentemente instalada, favorecendo sua osteointegração e
evitando seu afrouxamento, instabilidade e afundamento.
Os bisfosfonatos reduzem a atividade osteoclástica através da inibição de
farnesil difosfato sintetase, enzima que leva à perda de proteínas ligantes de
guanosina trifosfato (GTP). Estas proteínas são a chave da atividade osteoclástica e
26
é esta interferência na via mevalonato que interrompe a atividade dos osteoclastos
e, consequentemente a reabsorção óssea. Os N-BPs tem sido associados à necrose
de mandíbula, sendo que os mecanismos moleculares responsáveis por esses
efeitos adversos ainda não estão totalmente esclarecidos, porém o turnover ósseo
aumentado é o mecanismo primário que leva à necrose. O maior fator de risco são
as infecções da mandíbula e o uso de bisfosfonatos nessas condições deve ser
cauteloso ou evitado. O risco de desenvolver osteonecrose nas articulações é maior
quando há terapia a longo prazo com essas drogas, além de outros fatores como a
extração dentária em pacientes idosos portadores de mieloma múltiplo. Apesar
desses efeitos os bisfosfonatos, de forma geral, têm demonstrado boa tolerabilidade
e boa eficácia (30).
O uso de bisfosfonatos pode estar associado a alguns efeitos colaterais além
daqueles já conhecidos como reações gastrointestinais superiores, mas também à
necrose asséptica da mandíbula e fraturas espontâneas atípicas de fêmur, sendo
considerado o uso por período superior a 3 anos como fator de risco (26).
2.3.7 Ranelato de Estrôncio
O ranelato de estrôncio (RE) é um medicamento de uso oral desenvolvido
para o tratamento e prevenção de osteoporose. É composto por dois átomos de
estrôncio e uma molécula de ácido ranélico (11,30,31), seu nome químico é 5-[bis
(carboximetil)amino]-2-carboxi-4-ciano-3-tiofenacético ácido estrôncio (30).
Figura 3 - Estrutura química do Ranelato de Estrôncio (Blake & Fogelman, 2006).
27
Desde 2004, o ranelato de estrôncio foi aprovado para o tratamento da
osteoporose em países europeus (11). Nos Estados Unidos, não é aprovado pelo
FDA, mas é licenciado para formulação oral (2g/dia) para uso restrito na prevenção
de fraturas osteoporóticas vertebrais e não vertebrais, em pacientes em que o uso
de bisfosfonatos não foi bem sucedido ou quando há contraindicações para seu uso
(14). Os bisfosfonatos são potentes inibidores da remodelação óssea e permanecem
no tecido ósseo por muito tempo após a suspensão de seu uso. Considerando que o
Ranelato de Estrôncio se liga predominantemente em tecido ósseo neoformado, a
exposição prévia a bisfosfonatos pode inibir a ação do RE, sendo aconselhável um
intervalo de no mínimo 6 meses sem bisfosfonatos para iniciar o tratamento com RE
(32).
É administrado na dose de 2g/dia, apresentado em sachês sob a forma de
grânulos que deve ser suspenso em água e ingerido à noite, ao deitar. Caso seja
prescrito juntamente com suplementação cálcica, esta deve ser tomada em período
diferente daquele para evitar que sua absorção seja reduzida. A ingestão de
alimentos, leite e derivados lácteos deve ser pelo menos 2 horas antes do Ranelato
de Estrôncio (33).
É considerado uma droga segura e eficaz por apresentar poucos efeitos
colaterais (31), embora raramente possa induzir erupções cutâneas com eosinofilia e
trombose venosa profunda (14,26).
Roux (34) relata que os efeitos colaterais mais comuns apresentados pelos
pacientes durante os três primeiros meses de tratamento com Ranelato de Estrôncio
foram náusea, diarreia, cefaleia e dermatites. Está contra-indicado também a
pacientes com fenilcetonúria, pois o RE contém a fenilalanina (20).
O ranelato de estrôncio atua estimulando a formação óssea e reduzindo a
reabsorção, por isso tem sido referido como agente de dupla ação óssea
(30),
podendo ter papel benéfico na cura de fraturas (20). Altera os marcadores da
remodelação óssea, aumentando os de formação e reduzindo os de reabsorção.
Aumenta a densidade mineral óssea em vários sítios do esqueleto (32) e
apresenta alta afinidade pelo tecido ósseo, porém a substituição do estrôncio por
cálcio na hidroxiapatita é baixa e o estrôncio adsorve à superfície dos cristais.
28
Assim, características dos cristais ósseos se tornam inalteradas na crista ilíaca
humana, verificadas em biópsias obtidas após 60 meses de tratamento com a droga
administrada na dose de 2g/ dia (30).
In vitro, mostrou-se que o ranelato de estrôncio aumenta a atividade
osteoblástica, inclusive aumentando a síntese de colágeno e modulando o sistema
OPG/RANKL a favor de OPG. Além disso, diminui a reabsorção óssea através da
redução da diferenciação e da atividade de reabsorção de osteoclastos, e aumenta a
apoptose osteoclástica. Em um resumo dos resultados de quatro estudos clínicos
sobre o ranelato de estrôncio, três para tratamento da osteoporose e um para a
prevenção da doença, realizados por um período de três anos, o fármaco
proporcionou um aumento da DMO em todos os sítios osteoporóticos, redução de
37% nas fraturas vertebrais e redução de 14% nas fraturas não vertebrais (11). A
eficácia em prevenir fraturas vertebrais e não-vertebrais é mantida mesmo após
longos períodos de tratamento, até 8 anos (34,35).
Mais recentemente, um seguimento de cinco anos de um dos estudos de
tratamento demonstrou redução de 43% e de 24% nas fraturas de quadril e
vértebras, respectivamente (11).
Têm sido demonstrado que o RE reduz a progressão radiológica e a dor em
casos de osteoartite em joelho, problema que está frequentemente associado à
osteoporose em pacientes idosos (26), podendo ser utilizado no tratamento da
osteoporose em diferentes estágios de severidade, devido ao seu amplo espectro de
ação (34).
Yalin et al (31) realizaram estudo em ratas ovariectomizadas sobre o efeito do
RE diante do estresse oxidativo causado pela OVX e o sistema de defesa
antioxidante do organismo. Os autores observaram que o ranelato de estrôncio
apresenta efeito preventivo sobre o estresse oxidativo durante o tratamento da
osteoporose pós-menopausa por eliminar radicais livres resultantes da peroxidação
lipídica causada pela ovariectomia e por induzir atividades de enzimas antioxidantes.
O Estrôncio, assim como o próprio Cálcio, ativam o Receptor Sensível ao
Cálcio (CaSR) (27), resultando na ativação da produção de IP3 e sinalização de
29
Proteína Kinase Mitógena (MAPK). Isso sugere que o RE pode atuar através de
CaSR, ativando a replicação de células osteoblásticas (36).
Outro mecanismo de ação do RE, sugerido por Marie (2007) (36), é aquele
em que o agente aumenta a produção de Prostaglandinas E2 (PGE2) em
osteoblastos. A PGE2 está envolvida na cicatrização de fraturas por estimular a
síntese de proteínas colágenas e não colágenas do tecido ósseo.
Segundo Chen, Li & Yang (2013) (37), o duplo efeito do
Ranelato de
Estrôncio se deve ao fato de que a droga regula a expressão do Ligante do Receptor
de Fator Ativador Kappa B (RANKL) e Osteoprotegerina (OPG). O RANKL é um
membro da superfamília do Fator de Necrose Tumoral (TNF) produzido por préosteoblastos e osteoblastos que ativa seu receptor RANK expresso por préosteoclastos e osteoblastos. Isto resulta na ativação de vias sinalizadoras que
promovem a formação e diferenciação de osteoclastos maduros e aumenta sua
sobrevivência. A OPG é uma proteína solúvel produzida por osteoblastos e seus
precursores e atua como um falso-receptor para RANKL, inibindo assim, a
osteoclastogênese induzida por esse ligante. A taxa entre RANKL/OPG é essencial
para controlar a osteoclastogênese e a reabsorção óssea.
A eficácia de RE em aumentar a DMO e reduzir riscos de fraturas vertebrais e
não-vertebrais em mulheres osteoporóticas no período pós-menopausa tem sido
provada por vários estudos (27).
A deficiência estrogênica apresentada por mulheres na pós-menopausa induz
um aumento da taxa RANKL/OPG, o que gera a reabsorção acelerada e perda de
massa óssea, características dessa fase. Testes in vitro com células osteoblásticas
primárias humanas mostram que o Ranelato de Estrôncio regula para baixo a
expressão de RANKL e aumenta a OPG, reduzindo a taxa RANKL/OPG (36).
Pouco se sabe a respeito do efeito das drogas anti-osteoporóticas sobre o
reparo ósseo em fraturas, porém estudos recentes têm demonstrado que, devido à
dupla ação do RE sobre o turnover ósseo com sua ação antirreabsortiva e efeito
anabólico esse agente pode contribuir clinicamente na indução da cura de fraturas
em humanos. Porém, essa ação parece estar presente somente naquelas condições
30
em que o reparo ósseo está prejudicado e não em condições fisiológicas normais
(20).
31
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 LOCAL E GRUPOS DE ESTUDO
Este trabalho foi previamente analisado e aprovado pelo Comitê de Ética em
Pesquisa da Universidade Sagrado Coração, Bauru/SP, sob o protocolo nº 228/11
(Anexo 1).
Foram utilizadas neste estudo 108 ratas adultas Wistar (Rattus norvegicus),
com peso corporal médio de 250g e 90 dias de idade, obtidas do Biotério da USC,
Universidade Sagrado Coração. Durante o período experimental, foram mantidas
em caixas plásticas, alimentadas com água e ração ad libtum, num ambiente
de temperatura e luz controladas (ciclo de 12 horas). Os animais foram
aleatoriamente
distribuídos
em 6
grupos experimentais de 18 animais cada,
descritos a seguir:
1) OVX/ALD –foram submetidos à cirurgia de ovariectomia e receberam tratamento
com Alendronato de Sódio
2) OVX/RE - foram submetidos à cirurgia de ovariectomia e receberam tratamento
com Ranelato de Estrôncio
3) OVX/NaCl - foram submetidos à cirurgia de ovariectomia e receberam tratamento
com com NaCl
4)
SHAM OVX/ALD –foram submetidos à cirurgia fictícia de ovariectomia (sem
remoção dos ovários) e receberam tratamento com Alendronato de Sódio
5) SHAM OVX/RE - foram submetidos à cirurgia fictícia de ovariectomia (sem
remoção dos ovários) e receberam tratamento com Ranelato de Estrôncio
6) SHAM OVX/NaCl – foram submetidos à cirurgia fictícia de ovariectomia (sem
remoção dos ovários) e receberam tratamento com NaCl.
O grupo OVX/NaCl corresponde ao grupo de animais com deficiência
estrogênica e sem tratamento e o grupo SHAM OVX/NaCl, ao grupo normal, com
produção estrogênica normal.
32
3.2 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Conforme Figura 4, os animais dos grupos OVX foram submetidos à
ovariectomia e foram preservados por 60 dias. A seguir, todos os animais foram
tratados com a droga respectiva ao grupo, por via oral, e esse tratamento se
estendeu até a data da eutanásia. Trinta dias após o início do tratamento, um defeito
ósseo circular de 5mm de diâmetro foi efetuado cirurgicamente na calvária dos
animais. Após 7, 15 e 45 dias, os animais foram submetidos à eutanásia e as peças
das calotas cranianas removidas para análises histológicas e radiológicas.
Figura 4- Delineamento experimental
33
3.3 PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS
3.3.1 Anestesia e Antissepsia
Para a realização dos procedimentos cirúrgicos, os animais foram sedados
com administração de relaxante muscular por via intramuscular (IM) de cloridrato de
xilazina (Rompum®-Bayer, São Paulo, SP, Brasil) na dose de 13mg/kg de peso
corpóreo, seguido da administração intramuscular do anestésico cloridrato de
Ketamina (Dopalen® – Vetbrands, Jacareí, SP, Brasil) com dosagem de 87mg/kg de
peso corpóreo.
Após o início de ação da sedação foram realizados os procedimentos de
tricotomia e antissepsia na região a ser operada com PVPI (polivinilpirrolidona –
RIODEINE ®, Rioquímica, São José do Rio Preto, SP, Brasil) conforme Figura 5 A.
3.3.2 Ovariectomia e Cirurgia SHAM
Na sequência, após anestesia e tricotomia, nos animais do grupo OVX, foram
realizadas incisões bilaterais de aproximadamente 1,0cm de extensão na região
dorsolateral nas camadas superiores da pele e na camada muscular Utilizando
lâmina de bisturi nº 15 acoplado ao cabo nº3. As tubas uterinas foram localizadas e
ligadas com fio de sutura reabsorvível ( Vicryl 4-0®, Polyglactin 910/Ethicon Inc.,
Johnson & Johnson, São Paulo, SP, Brasil) (Figura 5C) para contenção de
hemorragia. Os ovários foram expostos com auxílio de pinça (Figura 5B) e em
seguida removidos (Figura 5D). As trompas foram recolocadas na cavidade
abdominal e, na sequência, a sutura foi realizada por planos com fio de seda (Seda
4-0®, Johnson & Johnson, São Paulo, SP, Brasil).
Nos grupos SHAM foram realizados os mesmos procedimentos até a
localização dos ovários, os quais foram expostos e recolocados em suas posições
originais e as camadas de tecidos suturadas, simulando o estresse cirúrgico.
34
Após as cirurgias, os animais receberam, por via intramuscular, uma dose
única de Enrofloxacino (Flotril® 2,5% - Schering-Plough, São Paulo, SP, Brasil) 10,0
mg/kg de peso corpóreo e Dipirona Sódica (D-500® - Fort Dodge, Campinas, SP,
Brasil) na dose de 150,0 mg/kg, para prevenção de infecções e analgesia pósoperatória, respectivamente.
Figura 5 - Cirurgia de Ovariectomia. (A) Antissepsia da área cirúrgica; (B) Incisão e localização
de tuba uterina e ovário; (C) Ligadura da tuba uterina e (D) Ovário removido.
3.3.3 Comprovação do ciclo estral
A constatação do ciclo estral foi realizada por meio de esfregaços vaginais. O
material foi coletado com auxílio de uma micropipeta semi-automática de 20µL e
solução de NaCl 0,9%. Primeiramente foi introduzido um volume de 20µL da solução
salina no canal vaginal das ratas e aspirado em seguida, como um movimento de
35
lavagem. Após a coleta o material foi transferido para lâminas histológicas,
espalhados e protegidos com lamínula de vidro e analisadas em microscópio óptico
em objetiva de 40x. A análise foi fundamentada no tipo e quantidade de células
epiteliais descamadas e infiltração de leucócitos. No período que antecedeu as
ovariectomias, o ciclo estral foi analisado por 5 dias consecutivos para verificar se as
ratas estavam com seus ciclos regulares. Decorridos 60 dias da ovariectomia foram
coletados novos esfregaços vaginais para confirmação de que a remoção dos
ovários havia sido bem sucedida. Todas as ratas apresentaram-se na fase Diestro
do ciclo estral (Figura 6).
Figura 6- Lâmina de esfregaço vaginal. Fase Cíclica do período Diestro do Ciclo Estral comprovada
pela presença predominante de leucócitos (Aumento 40x).
3.3.4 Tratamento
Após um período de 60 dias da ovariectomia ou cirurgia SHAM teve início o
tratamento dos animais por via oral, através de gavagem com agulha IC-810
(INSIGHT EQUIPAMENTOS, Ribeirão Preto, SP, Brasil). Os animais dos grupos
OVX/ALD
e SHAM OVX/ALD receberam o medicamento Alendronato de Sódio
(Purifarma®, São Paulo, SP, Brasil) na dose de 0,2mg/kg/dia, os grupos OVX/RE e
SHAM OVX/RE receberam 625mg/kg/dia de Ranelato de Estrôncio (PROTOS®,
36
Laboratórios Servier do Brasil Ltda, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) e os grupos
OVX/NaCl e SHAM OVX/NaCl receberam 0,3 mL da solução de NaCl 0,9% .
3.3.5 Técnica cirúrgica – Craniotomia
Decorridos 30 dias de tratamento com as respectivas drogas, os animais
foram submetidos à cirurgia de craniotomia para a confecção do defeito. Os animais
foram sedados com administração de relaxante muscular por via intramuscular (IM)
de cloridrato de xilazina (Rompum®-Bayer, São Paulo, SP, Brasil) na dose de
13mg/kg de peso corpóreo, seguido da administração intramuscular do anestésico
cloridrato de Ketamina (Dopalen® – Vetbrands, Jacareí, SP, Brasil) com dosagem
de 87mg/kg de peso corpóreo. Na sequência passaram por tricotomia da área da
calota craniana e a antissepsia realizada com PVPI. A área a ser operada foi isolada
com campos cirúrgicos estéreis, uma incisão de aproximadamente 2,0 cm foi
realizada na pele e periósteo (Figura 7A), estendendo da região occipital até a
região fronto-nasal com uso de lâmina de bisturi nº 15, montada em cabo de bisturi
nº 3 Bard-Parker e o periósteo descolado com o uso de um sindesmótomo com
exposição da calota craniana. Com o auxílio de uma broca trefina (Neodent
®
,
Curitiba, PR, Brasil) (Figura 7B), montada em contra-ângulo NSK (Palhoça, SC,
Brasil) acoplado em micromotor elétrico D Force 1000 (DentFlex®, Ribeirão Preto,
SP, Brasil) com velocidade de
1.200 rpm, foi confeccionado um defeito ósseo
circular de 5mm de diâmetro (Figura 7C), no lado esquerdo do osso parietal,
adjacente à sutura parietal, sob constante e abundante irrigação com solução de
NaCl 0,9% estéril para evitar necrose óssea. Em seguida, foi realizada a sutura por
planos, primeiramente do periósteo sobre o defeito com fio de sutura reabsorvível (
Vicryl 4-0®, Polyglactin 910/Ethicon Inc., New Brunswick, New Jersey, EUA),
seguida pela sutura da pele com fio de seda (Seda 4-0®, Johnson & Johnson New
Brunswick, New Jersey, EUA) (Figura 7D).
37
Figura 7- Cirurgia de Craniotomia: Confecção do defeito ósseo. (A) Incisão; (B) Confecção do defeito
com Broca Trefina de 5mm; (C) Defeito de 5mm de diâmetro e (D) Sutura do corte cirúrgico
Após os procedimentos cirúrgicos, como profilaxia antimicrobiana, os animais
receberam uma dose de Enrofloxacino (Flotril® 2,5% - Schering-Plough, São Paulo,
SP, Brasil), equivalente a 10,0 mg/kg de peso corpóreo por via intramuscular e
Dipirona Sódica (D-500® - Fort Dodge, Campinas, SP, Brasil) na dose de 150,0
mg/Kg.
3.4. PREPARO DAS PEÇAS E FORMA DE ANÁLISE DOS RESULTADOS
Os animais foram submetidos à eutanásia por meio de sobredosagem de
anestésico Ketamina e as peças coletadas com auxílio de disco de Carborundum
(Figura 8) acoplado a um micromotor cirúrgico, após 7, 15 e 45 dias da confecção do
defeito. Subsequentemente, as peças foram fixadas em formol a 10% por 48 horas
38
para serem analisadas macroscopicamente, radiografadas e os confeccionados
cortes histológicos.
Figura 8- Remoção da região do defeito ósseo.
3.4.1. Análise Macroscópica
Os espécimes foram analisados macroscopicamente em suas dimensões,
coloração e fotografados em lente de aproximação.
3.4.2 Análise Radiográfica
As peças foram teleradiografadas em equipamento de Raio-X Digital
Panorâmico Cranex-D (Sorodex, Finlândia) com receptor digital de imagem CCD e
com tamanho de pixel 96 micrômetros, com os seguintes parâmetros: Ponto
focal=0,5mm; Filtro=2,7mm Al; Potencial de Operação do tubo para Telerradiografia:
66kVp e 10mA. Os resultados foram obtidos com base na análise qualitativa das
imagens radiográficas.
39
3.4.3 Análise Histológica
Inicialmente as peças foram fixadas em formol a 10% por 48 horas, seguida
de descalcificação usando EDTA18% (ácido etilenodiaminotetracético) e incluídas
em parafina. Os cortes microscópicos foram obtidos no sentido longitudinal com seis
micrômetros de espessura e corados pelo método de Tricrômico de Masson,
analisados e descritos em todas as suas peculiaridades. Foram selecionados e
fotografados os dados mais relevantes, no próprio microscópio, para a competente
comprovação. (Figura 9).
Figura 9 –Peça encaminhada para análise histológica.
As lâminas foram observadas no fotomicroscópio Nikon Eclipse 80i, acoplado
a um analisador de imagens (Image Pró-Plus® 5.1). Todas as imagens foram salvas
para posterior análise cuidadosa de todas as estruturas e tecidos presentes,
observando-se principalmente a neoformação óssea.
Imagens panorâmicas foram capturadas com aumento de 2x.
3.4.4 Histomorfometria
Os cortes microscópicos corados pelo método Tricrômico de Masson
referentes a cada grupo e período de estudo foram submetidas à Histomorfometria.
40
A análise mensurou o tecido ósseo neoformado e tecido conjuntivo presentes na
região do defeito através do programa ImageJ (NIH- National Institute of Health).
Foi avaliado 1 corte, sendo o mais representativo de cada grupo, sendo que
para cada corte foram analisadas 3 regiões, bordas direita e esquerda e centro do
defeito com ampliação de 20x.
3.4.5 Análise Estatística
Na análise dos resultados foi considerada a seguinte proporção de tecido
ósseo:
%
Ó
=
%
ó
á
∗ 100
Sendo que a área total é a soma de todos os tecidos considerados (tecido
ósseo e conjuntivo).
Os resultados da histomorfometria foram avaliados estatisticamente pelo teste
de normalidade (Shapiro-Wilk) e após a confirmação da normalidade foram
submetidos aos testes ANOVA e Tukey pos hoc, através do programa BioEstat 5.3.
As diferenças das médias foram estatisticamente significativas quando P<0,05.
41
4 RESULTADOS
4.1 ANÁLISE MACROSCÓPICA
Os animais foram diariamente observados clinicamente, principalmente as
áreas cirúrgicas e proximidades com o objetivo de identificar sinais de infecção.
As peças foram analisadas quanto á sua coloração e morfologia e não foi
observada nenhuma alteração compatível com necrose ou processo infeccioso,
sendo todas consideradas normais para as demais análises.
4.2 ANÁLISE RADIOGRÁFICA
A Figura 10(A), (B), (C), (D), (E) e (F) mostram as radiografias dos grupos
SHAM/NaCl e OVX/NaCl, nos períodos de 7, 15 e 45 dias após a indução do defeito.
Em A e B (7 dias) é possível observar áreas radiolúcidas, ou seja , sem formação de
tecido ósseo. No período de 15 dias, representado pela Figura 10(C) e (D) observase pequenas diferenças na neoformação óssea no grupo SHAM/NaCl e OVX/NaCl,
sendo que nas bordas do defeito em (D) referente a OVX/NaCl, observa-se menor
densidade radiopaca que em (C), compatível com início de formação de tecido
ósseo. Na Figura 10(E) e (F) estão representados os grupos com período de 45 dias
após osteotomia. Em (E) é possível notar área de bem maior radiopacidade que em
(F), ou seja, houve maior neoformação óssea no grupo SHAM do que no grupo
OVX.
A Figura 10(G), (H), (I), (J), (K) e (L) mostram as radiografias dos grupos
SHAM/RE e OVX/RE, aos 7, 15 e 45 dias após a indução do defeito. Nas imagens
(G) e (H) referente ao período de 7 dias nota-se áreas radiolúcidas, ou seja, sem
formação de tecido ósseo. Nas radiografias (I) e (J) referentes ao período de 15 dias
é possível observar áreas com discreta radiopacidade compatível com início de
neoformação óssea, porém em SHAM (I) a evidência é maior. No período de 45
dias, representado pela Figura 10(K) e (L) foram observadas pequenas diferenças
na neoformação óssea entre os grupos SHAM/RE (K) e OVX/RE (L). Na região do
42
defeito em (L) observa-se maior densidade radiopaca que em (K), compatível com
formação de tecido ósseo.
Na Figura 10(M), (N), (O), (P), (Q) e (R) estão representadas as radiografias
dos grupos ALD/SHAM e ALD/OVX nos períodos de 7, 15 e 45 dias. Em (M) e (N)
são observadas regiões radiolúcidas condizente com ausência de tecido ósseo. No
período de 15 dias, representado por (O) e (P), observa-se maior radiopacidade em
(O), grupo SHAM/ALD compatível com neoformação óssea maior que no grupo
OVX/ALD. Aos 45 dias (Q) e (R), nota-se que também houve maior neoformação
óssea em SHAM/ALD (Q) do que em OVX/ALD (R).
Figura 10 - Telerradiografias dos defeitos ósseos após tratamento e respectivos períodos. A, B, C, D,
E e F grupo NaCl, sendo A e B (7dias), C e D (15 dias) e E e F (45 dias); A,C e E grupo SHAM e B,D
e F grupo OVX. G,H, I, J, K e L grupo Ranelato de Estrôncio, sendo G e H (7 dias), I e J (15 dias) e K
e L (45 dias); G, I e K grupo SHAM e H, J e L grupo OVX. M, N, O, P, Q e R grupo Alendronato de
Sódio, sendo M e N (7 dias), O e P (15 dias) e Q e R (45 dias); M, O e Q grupo SHAM e N, P e R
grupo OVX.
43
4.3. ANÁLISE HISTOLÓGICA
4.3.1 Grupo NaCl SHAM e OVX
A Figura 11 mostra as fotomicrografias relativas ao tratamento com NaCl. No
período de 7 dias no grupo SHAM/NaCl
observa-se a presença de coágulo
sanguíneo preenchendo toda extensão do defeito (A) e a presença de tecido ósseo
lamelar remanescente (OR). Em maior aumento (B) é possível verificar o coágulo em
diferenciação (coloração vermelha) e a formação inicial de tecido conjuntivo
(coloração azulada). No grupo OVX/NaCl também nota-se a presença de coágulo
sanguíneo em toda a extensão do defeito (C) e em maior aumento observa-se o
coágulo sanguíneo em diferenciação (D).
No período de 15 dias, o grupo Sham/NaCl apresenta início de neoformação
óssea partindo da borda do defeito em direção ao centro e uma trabécula óssea
mais ao centro (em destaque). Em (F) imagem em maior aumento da trabécula
óssea neoformada revestida em sua porção superior por uma estreita faixa de tecido
conjuntivo contendo uma rima de osteoblastos. No grupo OVX/NaCl (G) observa-se
a presença de trabéculas ósseas sendo formadas partindo da borda do defeito para
o centro e tecido conjuntivo preenchendo a grande região central do defeito. Na
imagem de maior aumento (H) destaque para as trabéculas ósseas neoformadas,
permeadas por osteócitos, e regiões de tecido conjuntivo em diferenciação.
No período de 45 dias do grupo NaCl (Sham e OVX) todo o coágulo
sanguíneo fora diferenciado e substituído (I) e (K) por tecido conjuntivo e tecido
ósseo neoformado. No grupo Sham/NaCl é possível notar a presença de tecido
ósseo neoformado e
tecido conjuntivo na região central do defeito (I). Em (J),
aumento maior destaca osso lamelar formado no centro do defeito e na base inferior
uma camada de tecido conjuntivo permeado por osteoblastos ativos. No grupo
OVX/NaCl observa-se tecido ósseo neoformado na borda em direção ao centro e
tecido conjuntivo em diferenciação preenchendo toda a extensão do defeito induzido
(K). Em maior aumento (L) tecido ósseo lamelar e presença de osteócitos em grande
número.
44
Figura 11 – Imagens Histológicas do Grupo NaCl. Período de 7 dias: grupo Sham (A) e (B); grupo
OVX (C) e (D). Período de 15 dias: grupo Sham (E) e (F); grupo OVX (G) e (H). Período de 45 dias:
grupo Sham (I) e (J); grupo OVX (K) e (L). Em (A), (C), (E), (G), (I) e (K), Tricrômico de Masson,
Aumento 2x. Em (B), (D), (F), (H), (J) e (L), Tricrômico de Masson, Aumento 40x.
45
4.3.2 Grupo Ranelato de Estrôncio SHAM e OVX
A Figura 12 mostra as fotomicrografias relativas ao tratamento com Ranelato
de Estrôncio. No período de 7 dias nos grupos SHAM (A) e OVX/RE (C) nota-se a
presença de coágulo sanguíneo (B) preenchendo a extensão do defeito, porém no
grupo OVX nota-se, na imagem em maior aumento (D), a diferenciação do coágulo
em tecido conjuntivo.
No período de 15 dias observa-se a ausência de coágulo sanguíneo no
interior do defeito e preenchimento da região central por tecido conjuntivo (E, G).
Nota-se, ainda, a formação de osso trabecular na borda do defeito em direção ao
centro. No grupo SHAM
em maior aumento (F) é possível verificar trabéculas
ósseas neoformadas e grande número de osteócitos, envoltas por tecido conjuntivo
ricamente permeado por células ósseas em diferenciação. Em (H) nota-se
trabéculas ósseas circundadas por osteoblastos ativos e tecido conjuntivo em
diferenciação.
No período de 45 dias no grupo SHAM (I) nota-se a presença de grande
quantidade de tecido ósseo sendo formado da borda para o centro do defeito. Em
maior aumento (J) observa-se tecido ósseo neoformado permeado por osteócitos e
porção de osso remanescente (OR). No grupo OVX (K) verifica-se também a
neoformação óssea das bordas para o centro, em menor proporção que no grupo
SHAM. Em (L), imagem em maior aumento destacando tecido ósseo neoformado,
pavimentado por numerosos osteócitos.
46
Figura 12- Imagens Histológicas do Grupo Ranelato de EstrôncioPeríodo de 7 dias: (A) e (B) grupo
SHAM; (C) e (D) grupo OVX. Período de 15 dias: (E) e (F) grupo SHAM; (G) e (H) grupo OVX.
Período de 45 dias: (I) e (J) grupo SHAM; (K) e (L) grupo OVX. (Tricrômico de Masson. Em (A), (C),
(E), (G), (I) e (K) Aumento 2x. Em (B), (D), (F), (H), (J) e (L), Aumento 40x).
47
4.3.3 Grupo Alendronato de Sódio SHAM e OVX
A figura 13 mostra as fotomicrografias dos grupos tratados com Alendronato
de Sódio. No período de 7 dias do grupo SHAM/ALD verifica-se a presença de
coágulo preenchendo a área do defeito (A) e em maior aumento, destaque para o
coágulo sanguíneo iniciando diferenciação em tecido conjuntivo. No grupo OVX/
ALD nota-se a presença de coágulo sanguíneo diferenciando-se em tecido
conjuntivo (C). Em (D) imagem em maior aumento destacando coágulo sanguíneo
com início de formação de fibras de tecido conjuntivo.
No período de 15 dias do grupo SHAM/ALD é possível verificar a presença
de tecido ósseo sendo formado na margem do defeito e tecido conjuntivo
preenchendo toda a região central (E). Em maior aumento (F) área com formação de
trabéculas ósseas em destaque e grande número de osteócitos e tecido conjuntivo
em diferenciação. Em (G) o grupo OVX também apresenta formação de trabéculas
ósseas na borda do defeito em menor proporção que no grupo SHAM. Em (H)
presença de tecido conjuntivo permeado por células ósseas e grande número de
osteócitos nas trabéculas.
No período de 45 dias do grupo SHAM/ALD 45 dias observa-se a presença de
tecido ósseo lamelar preenchendo toda a extensão do defeito criado (I). Imagem em
aumento maior (J) destacando área com formação óssea e grande número de
osteócitos envolta por tecido conjuntivo permeado por osteoblastos ativos. No grupo
OVX/ALD verifica-se a formação de osso lamelar formado na borda esquerda do
defeito (K), em menor proporção que no grupo SHAM no mesmo período e ainda a
presença de tecido conjuntivo no centro do defeito. Em maior aumento (L) observase tecido ósseo lamelar permeado por osteócitos.
48
Figura 13 - Imagens Histológicas do Grupo Alendronato de Sódio.Período de 7 dias: (A) e (B) grupo
SHAM; (C) e (D) grupo OVX. Período de 15 dias: (E) e (F) grupo SHAM; (G) e (H) grupo OVX.
Período de 45 dias: (I) e (J) grupo SHAM; (K) e (L) grupo OVX. (Tricrômico de Masson. Em (A), (C),
(E), (G), (I) e (K) Aumento 2x. Em (B), (D), (F), (H), (J) e (L), Aumento 40x).
49
4.4 HISTOMORFOMETRIA E ANÁLISE ESTATÍSTICA
A Tabela 1 mostra os resultados da histomorfometria do tecido ósseo
neoformado e tecido conjuntivo nas bordas e centro do defeito, após período 15
dias e de acordo com o tratamento tanto em ratas do grupo SHAM como do grupo
OVX.
Nos grupos SHAM/ALD e SHAM/RE houve maior neoformação óssea quando
comparado ao grupo SHAM/NaCl mostrando que ambas as drogas possuem efeito
positivo no reparo ósseo em indivíduos com metabolismo ósseo normal. Diferença
semelhante foi apresentada pelos grupos OVX/ALD e OVX/RE comparados ao
grupo OVX/NaCl, confirmando os efeitos das drogas sobre o reparo ósseo em ratas
com deficiência estrogênica.
Ao comparar os efeitos das duas drogas, tanto os animais OVX quanto os
pertencentes aos grupos SHAM verifica-se uma diferença significativa na
neoformação óssea no grupo tratado com RE sobre o grupo tratado com ALD.
Tabela 1 Valor médio e desvio-padrão de tecido ósseo e tecido conjuntivo referente
ao período de 15 dias
%TO Borda
%TC Borda
%TO Centro
% TC Centro
SHAM NaCl
33.4 ± 3.9
66.6 ± 3.9
46.7 ± 3.0
53.3 ± 3.0
OVX NaCl
28.9 ± 0.0
71.1 ± 0.0
0.0 ± 0.0
100.0 ± 0.0
SHAM ALD
53.5 ± 0.2
46.5 ± 0.2
0.0 ± 0.0
100.0 ± 0.0
OVX ALD
48.9 ± 10.4
51.1 ± 10.4
9.5 ± 8.7
90.5 ± 8.7
SHAM RE
76.2 ± 5.7
23.8 ± 5.7
25.3 ± 14.3
74.7 ± 14.3
OVX RE
70.7 ± 8.6
29.3 ± 8.6
7.2 ± 10.2
92.8 ± 10.2
50
A Tabela 2 mostra os resultados de histomorfometria do tecido ósseo
neoformado e tecido conjuntivo nas bordas e centro do defeito, após 45 dias e com o
respectivo tratamento realizado em ratas do grupo SHAM e do grupo OVX.
Nesse período de tratamento houve maior formação óssea nos grupos
SHAM/ALD
e
SHAM/RE,
quando comparados
ao
grupo sem tratamento
(SHAM/NaCl). Também encontramos diferença significante ao compararmos os
grupos OVX/ALD e OVX/RE com o grupo OVX/NaCl. Tais resultados mostram o
efeito positivo das duas drogas tanto sobre o reparo ósseo
em ratas com
metabolismo ósseo normal quanto em ratas com depleção estrogênica.
Comparando os efeitos do ALD e do RE não houve diferença significativa na
neoformação óssea tanto nos animais OVX quanto nos pertencentes aos grupos
SHAM.
Tabela 2 Valor médio e desvio-padrão de tecido ósseo e tecido conjuntivo referente
ao período de 45 dias
%TO Borda
%TC Borda
%TO Centro
% TC Centro
SHAM NaCl
69.1 ± 0.3
30.9 ± 0.3
16,7 ± 40,8
83.3 ± 40.8
OVX NaCl
60.9 ± 7.1
39.1 ± 7.1
0.0 ± 0.0
100.0 ± 0.0
SHAM ALD
84.4 ± 10.8
15.6 ± 10.8
53.4 ± 7.0
46.6 ± 7.0
OVX ALD
81.9 ± 10.1
18.1 ± 10.1
32.1 ± 32.5
67.9 ± 32.5
SHAM RE
83.6 ± 7.4
16.4 ± 7.4
4.3 ± 7.4
95.7 ± 7.4
OVX RE
82.7 ± 4.9
17.3 ± 4.9
2.5 ± 5.8
97.5 ± 5.8
A Figura 14 representa o percentual de tecido ósseo neoformado nas bordas
e centro do defeito referente aos períodos de 15 e 45 dias de acordo com o
tratamento nos grupos SHAM e OVX. Houve diferença estatística na neoformação
óssea na borda do defeito entre os grupos OVX/NaCl e OVX/ALD e OVX/RE no
período de 45 dias.
51
100
15 dias
45 dias
Tecido Ósseo Borda (%)
80
60
40
20
0
SHAM NaCl OVX NaCl SHAM ALD
OVX ALD
SHAM RE
OVX RE
(A)
100
15 d
45d
% Tecido Ósseo no Centro
80
60
40
20
0
SHAM NaCl OVX NaCl SHAM ALD OVX ALD
SHAM RE
OVX RE
(B)
Figura 14 -Histomorfometria do tecido ósseo nos períodos de 15 e 45 dias. (A) Borda do defeito. (B)
Centro do defeito.
52
Os resultados apresentaram normalidade (Shapiro-Wilk), com isso, procedeuse o teste ANOVA e Tukey para comparação entre todos os resultados. As
diferenças estatísticas significantes estão mostradas nas figuras 15 e 16. A Figura
15 mostra os resultados do período de 15 dias e a Figura 16 do período de 45 dias.
100
90
(b)
Tecido Ósseo Borda (%)
80
70
(b)
(c)
(c)
60
50
40
(a)
(a)
30
20
10
0
SHAM NaCl OVX NaCl SHAM ALD
OVX ALD
SHAM RE
OVX RE
(A)
100
90
Tecido Ósseo Centro (%)
80
70
60
(a)
50
(b)
40
30
(b)
20
10
(b)
(b)
(b)
0
SHAM NaCl OVX NaCl SHAM ALD
OVX ALD
SHAM RE
OVX RE
(B)
Figura 15- Histomorfometria do tecido ósseo do período de 15 dias. (A) Borda do defeito. (B) Centro
do defeito. Letras diferentes e setas indicam diferença estatisticamente significante (p<0.05, ANOVA,
Tukey)
53
100
(b)
(b)
(b)
(b)
Tecido Ósseo Borda(%)
80
(a)
(a)
60
40
20
0
SHAM NaCl OVX NaCl SHAM ALD
OVX ALD
SHAM RE
OVX RE
(A)
100
% Tec Ósseo Centro
80
(b)
60
40
(b)
(a)
20
(a)
(a)
(a)
0
SHAM NaCl OVX NaCl SHAM ALD
OVX ALD
SHAM RE
OVX RE
(B)
Figura 16- Histomorfometria do tecido ósseo do período de 45 dias. (A) Borda do feito. (B) Centro do
defeito. Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante (p<0.05, ANOVA, Tukey)
54
5 DISCUSSÃO
A perda óssea induzida por ovariectomia em ratas tem sido frequentemente
empregada como modelo de osteoporose pós-menopausa e é considerado de
grande importância clínica para estas condições em humanos, pois simula o
comportamento ósseo ocorrido durante a fase pós-menopausa em humanos (16). O
FDA Guidelines (38) recomenda esse modelo em estudos que avaliam os efeitos de
agentes preventivos da osteoporose resultante da deficiência estrogênica. O modelo
é também empregado em estudos sobre a ação de drogas no tratamento da
osteoporose (16).
Na fase pós-menopausa o metabolismo ósseo se apresenta acelerado, com
desequilíbrio favorável à reabsorção, em decorrência da deficiência estrogênica, e
consequentemente a perda óssea em ossos longos e vértebras e em todo o sistema
esquelético feminino (39).
Neste trabalho foi utilizado, além da ovariectomia em ratas, o modelo de
defeitos ósseos por ostectomia na calvária dos animais que tem sido amplamente
utilizado para estudo do reparo ósseo, pois, ao contrário das fraturas, este modelo
está menos sujeito aos fatores mecânicos e às obstruções no suprimento
sanguíneo, possibilitando avaliações sobre a influência de medidas cirúrgicas e
farmacológicas no reparo ósseo (22).
O objetivo deste trabalho foi analisar a influência de drogas supressoras da
perda óssea, Alendronato de Sódio e Ranelato de Estrôncio, sobre o reparo ósseo
em animais normais e em animais em que há uma desordem do metabolismo ósseo,
como é o caso de mulheres que se encontram no período pós-menopausa, onde a
deficiência estrogênica tem como consequência a osteoporose.
Poucos estudos comparativos tem sido realizados sobre o efeito de
Alendronato de Sódio e Ranelato de Estrôncio em pacientes osteoporóticos e em
animais (40).
55
Ambas as drogas apresentam capacidade em reduzir os índices de fraturas
em pacientes osteoporóticos em grandes estudos clínicos e são indicadas
mundialmente para tratamento da osteoporose. Enquanto os BPs preservam o
volume trabecular e microarquitetura óssea, e consequentemente , a força óssea, o
RE tem despertado grande interesse devido a sua potente dupla funcionalidade, ou
seja, capacidade de formação óssea associada à ação antirreabsortiva.
Quando administrados por via oral, os bisfosfonatos podem causar irritação
no esôfago. Recomenda-se a ingestão de bisfosfonatos com um copo cheio de água
pura ao se levantar pela manhã, devendo o paciente permanecer em pé por cerca
de pelo menos 30 minutos após deglutição do comprimido e descontinuar seu uso
tão logo se manifestem os sintomas esofágicos. No entanto, a presença de
alimentos causa acentuada redução da absorção dos bisfosfonatos, devendo-se
também manter o mesmo intervalo de tempo até a primeira alimentação diária (25).
Apesar de os BPs bloquearem a reabsorção óssea de forma efetiva acabam
por interferir na fase subsequente associada aos osteoblastos reduzindo a formação
óssea em até 50%, em tratamentos longos. Por outro lado, estudos revelam que o
RE aumenta função osteoblástica na remodelação e na neoformação óssea (40).
O uso excessivo ou prolongado de bisfosfonatos, acima de 3 anos, pode
causar supressão da remodelação óssea e acúmulo de micro danos e, portanto
aumentar a fragilidade óssea, levando a fraturas atípicas de pelve e de ossos longos
(41). Em caso relatado pelos autores, a paciente apresentou nível normal baixo de
marcadores de turnover ósseo, correlacionando com baixa taxa de formação óssea
mostrada em análise histomorfométrica, o que é tipicamente observado em fraturas
associadas à terapia com bisfosfonatos. Já o aumento da massa óssea produzido
pelo RE é mantido mesmo após longos períodos de tratamento, cerca de 8 anos ou
mais, o que implica na redução significativa dos riscos de fraturas (35).
As drogas que apresentam efeito anticatabólico, como o ALD, reduzem a taxa
de remodelação óssea com redução de marcadores de reabsorção, mas também
reduzem os marcadores de formação óssea. As drogas anabólicas aumentam a
formação óssea e secundariamente levam a um aumento da reabsorção, como por
exemplo, o PTH(35).
56
Em estudo realizado por Chen et al (2010)(27) o Alendronato de sódio
apresentou efeito superior à Calcitonina sobre a osteointegração de implante de
hidroxiapatita em joelho de ratas ovariectomizadas, com aumento da densidade
mineral óssea.
O mecanismo de ação do Ranelato de Estrôncio é diferente de todas as
outras drogas indicadas para tratamento da osteoporose. É considerado como droga
de dupla ação, pois induz efeitos opostos, ou seja, aumenta a formação e reduz a
reabsorção óssea, agindo sobre osteoblastos e osteoclastos, respectivamente (41).
Wu et al (2013) (40) ao comparar grupos de ratas OVX tratadas com
Risedronato (bisfosfonato), Risedronato + RE e um grupo tratado somente com RE
constatou, através de EPMA (Electron Probe Micro-Analysis) que, apesar do
Risedronato preservar a massa óssea e a microarquitetura, quando associado ao
RE há uma redução significante na formação de osso remodelado quando
comparado ao grupo tratado somente com RE.
Os resultados deste trabalho mostram que o tratamento com drogas
antirreabsortivas administradas em ratas ovariectomizadas proporciona um aumento
significativo sobre a formação de tecido ósseo quando comparadas àquelas que não
receberam tratamento. No período de 15 dias (Figuras 15 A e B) o grupo OVX/NaCl
apresentou neoformação óssea de 28.9% ± 0.0 nas bordas do defeito , sendo que o
grupo OVX/ALD teve 48.9% ± 10.4 e o grupo OVX/RE 70.7% ± 8.6 de osso
neoformado. Comparando o efeito das duas drogas sobre a formação óssea, houve
maior formação óssea no grupo tratado com RE do que o ALD. Esses resultados
mostram o importante potencial de ação do RE na formação óssea de indivíduos em
que o metabolismo ósseo possa estar alterado, como na deficiência estrogênica.
Além disso, o RE mostrou maior resultado na formação óssea nas ratas normais
(SHAM/RE 76.2% ± 5.7) em relação ao grupo não tratado (SHAM/NaCl (33.4% ±
3.9) e também no grupo ALD (SHAM/ALD 53.5% ± 0.2).
No período de 45 dias (Figura 16 A e B) houve diferenças significantes na
neoformação óssea apresentada pelos grupos SHAM/ALD (84.4% ± 10.8) e
SHAM/RE (83.6% ± 7.4) quando comparados ao grupo SHAM/NaCl (69.1% ± 0.3).
Porém entre os grupos tratados, não há diferença significativa (p>0.05). Padrão
semelhante foi encontrado nos grupos ovariectomizados. Diferença estatisticamente
57
significante foi encontrada entre o resultado do grupo OVX/NaCl (60.9% ± 7.1) em
relação aos grupos OVX/ALD (81.9% ± 10.1) e OVX/RE (82.7% ± 4.9).
Os
resultados indicam que as duas drogas produzem efeitos semelhantes na
neoformação óssea tanto em indivíduos com depleção estrogência quanto em
indivíduos normais.
Os resultados indicam ação positiva do Alendronato de sódio na reparação
óssea. Resultados semelhantes foram relatados no estudo realizado por Chen et al
(2011) (27) o Alendronato de sódio apresentou efeito superior à Calcitonina sobre a
osteointegração de implante de hidroxiapatita em joelho de ratas ovariectomizadas,
com aumento da densidade mineral óssea. Jee et al (2010)(42) através de modelo
experimental de ratas ovariectomizadas mostrou que o ALD promove reparação
óssea e previne a perda óssea alveolar após extração dentária.
Conforme
já
mencionado,
o
RE
reduz
a
reabsorção
óssea
e,
simultaneamente, aumenta a formação óssea. Esse efeito foi observado nos
resultados desse trabalho, uma vez que tanto o grupo SHAM quanto o grupo OVX
tratados com RE apresentaram maior formação óssea em relação ao grupo NaCl.
Esse resultado está em acordo com outros trabalhos na literatura. Exemplificando,
Bain et al (2009)(43) encontrou, através de modelo experimental similar a esse
trabalho, prevenção na perda óssea e na deterioração da microarquitetura óssea
devido à ovariectomia e aumento na resistência mecânica em animais submetidos
ao tratamento com RE. Em relação à reparação óssea, Annemarie Brüel et al (2011)
(44) demonstrou que o RE estimula a formação do calo ósseo nos períodos iniciais
na reparação em fraturas de tíbia (3 semanas), gerando calo ósseo de maior
volume. Similarmente, Li et al (2011) (45) demonstrou que o tratamento com RE
otimiza a osteointegração de implantes, pois esse tratamento proporcionou aumento
da densidade óssea na região do implante e aumento na área de contato com
implante.
Os resultados deste trabalho também estão de acordo com Chen et al (2013)
(37) que comparou os efeitos das duas drogas sobre animais que foram submetidos
a OVX e constatou através de histomorfometria que houve aumento significante na
taxa volume ósseo/volume trabecular da região distal do fêmur, quando comparado
com o grupo OVX sem tratamento. No mesmo trabalho, não foi observada diferença
58
importante entre os dois fármacos, como evidenciado em nosso trabalho no período
de 45 dias.
O RE é uma droga que tem demonstrado reduções nos riscos de fraturas por
fragilidade, vertebral, não-vertebral e quadril tanto em mulheres quanto em homens,
além de oferecer segurança no seu uso e poucos efeitos colaterais. Os efeitos
secundários raros e a administração facilitada, realizada à noite ao deitar, facilita a
aderência ao tratamento. Assim, o RE pode se indicado como droga de primeira
escolha no tratamento da osteoporose.
59
6 CONCLUSÃO
Dentro das limitações deste estudo pode-se concluir que o tratamento com
drogas antirreabsortivas, Alendronato de Sódio e Ranelato de Estrôncio, aumenta a
formação óssea. Adicionalmente, o Ranelato de Estrôncio resulta em ação positiva
maior quando comparado ao Alendronato de Sódio, tanto em ratas com metabolismo
ósseo normal como naquelas com deficiência estrogênica.
60
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ANEXO A – PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA