UNIVERSIDADE SAGRADO CORAÇÃO DALVA PAZZINI GRION Efeitos de drogas supressoras de perda óssea no reparo ósseo de ratas normais e ovariectomizadas. Estudo com Alendronato de Sódio e Ranelato de Estrôncio. BAURU 2014 DALVA PAZZINI GRION Efeitos de drogas supressoras de perda óssea no reparo ósseo de ratas normais e ovariectomizadas. Estudo com Alendronato de Sódio e Ranelato de Estrôncio. Tese apresentada pela aluna Dalva Pazzini Grion à Pró-Reitoria de Pesquisa e PósGraduação da Universidade Sagrado Coração, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Biologia Oral, área de concentração: Biologia Oral, sob orientação da Profa. Dra. Angela Mitie Otta Kinoshita. BAURU 2014 Grion, Dalva Pazzini. G868e Efeitos de drogas supressoras de perda óssea no reparo ósseo de ratas normais e ovariectomizadas. Estudo com Alendronato de Sódio e Ranelato de Estrôncio / Dalva Pazzini Grion -- 2014. 64f. : il. Orientador: Prof. Dr. Angela Mitie Otta Kinoshita. Tese (Doutorado em Biologia Oral) – Universidade do Sagrado Coração – Bauru – SP. 1. Osteoporose. 2. Menopausa. 3. Reparo ósseo. 4. Ovariectomia. 5. Tratamento. I. Kinoshita, Angela Mitie Otta. II. Título. DALVA PAZZINI GRION Efeitos de drogas supressoras de perda óssea no reparo ósseo de ratas normais e ovariectomizadas. Estudo com Alendronato de Sódio e Ranelato de Estrôncio. Tese apresentada pela aluna Dalva Pazzini Grion à Pró-Reitoria de Pesquisa e PósGraduação da Universidade Sagrado Coração, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Biologia Oral, área de concentração: Biologia Oral, sob orientação da Profª. Drª. Angela Mitie Otta Kinoshita. Banca Examinadora: ______________________________________________ Profª. Drª. Angela Mitie Otta Kinoshita Universidade Sagrado Coração ______________________________________________ Profª Drª Pâmela Letícia dos Santos Universidade Sagrado Coração ______________________________________________ Profª Drª Jéssica Lemos Gulinelli Universidade Sagrado Coração ____________________________________________ Profª Drª Roberta Okamoto Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho ______________________________________________ Profº Dr Dejair Caitano do Nascimento Instituto Lauro de Souza Lima Bauru, 24 de Fevereiro de 2014. Dedico este trabalho aos meus pais Miguel e Maria (in memorian) que por uma vida de amor, trabalho e dedicação me mostraram o caminho da honestidade e persistência, possibilitando a realização de sonhos e conquistas. Ao meu esposo Neto, pelo apoio incondicional principalmente nos momentos de incertezas, tão comuns a quem trilha novos caminhos. AGRADECIMENTOS Agradeço à Profª Drª Angela Mitie Otta Kinoshita que, tão brilhantemente orientou esse trabalho com o Dom da pesquisa. Agradeço pela oportunidade de estar novamente ao seu lado desfrutando de seus conhecimentos e sabedoria, sempre com tamanha serenidade. Meu respeito e admiração! À colega de doutorado, companheira de tantas horas, Regina Magrini Guedes de Azevedo, pela colaboração nos trabalhos de pesquisa e que, com seu bom humor constante tornou mais suaves os momentos árduos...Obrigada pela amizade. Ao Leonardo Marques pela grande colaboração nos procedimentos cirúrgicos com extrema competência e determinação. Aos alunos Pérola Padilha Góes, Bruno Oliver Pierim, Mariana Marques Escobar Bueno, Marina Rolon, Cristina Constâncio e Ana Carolina Trukes Coelho pela dedicação e empenho. Aos funcionários da USC pelo auxílio e prontidão sempre. Ao CNPq pelo financiamento parcial do projeto. 6 “Mesmo quando tudo parece desabar, cabe a mim decidir entre rir ou chorar, ir ou ficar, desistir ou lutar; porque descobri, no caminho incerto da vida, que o mais importante é o decidir.” (Cora Coralina) 7 RESUMO Osteoporose pós-menopausa ocorre devido à deficiência estrogênica que leva à reabsorção óssea aumentada. O Alendronato de sódio (ALD) é um bisfosfonato amplamente empregado na prevenção e tratamento da osteoporose, aumentando a densidade mineral óssea, e consequentemente, reduzindo a incidência de fraturas, porém em tratamentos com altas doses ou a longo prazo pode causar osteonecrose e fraturas atípicas. O Ranelato de estrôncio (RE) além de promover a formação de novo osso também inibe diferenciação dos a reabsorção óssea osteoclastos. Sabendo que o através da diminuição metabolismo ósseo da em indivíduos normais é diferente daquele em indivíduos osteoporóticos, o objetivo desse trabalho é avaliar e comparar o efeito das drogas supressoras de reabsorção óssea em animais com depleção estrogênica e normais na reparação óssea por meio de avaliação radiográfica e histomorfométrica. Foram utilizadas 108 ratas que foram submetidas à cirurgia de ovariectomia (OVX) ou cirurgia fictícia (SHAM) divididas randomicamente em 6 grupos com 18 cada, distribuídas como segue: OVX/ALD, OVX/RE e OVX/NaCl, SHAM OVX/ALD, SHAM OVX/RE e SHAM OVX/NaCl. Após a ovariectomia (60 dias), todos os animais foram tratados com a droga relativa ao grupo até o término do período experimental. Após 30 dias de tratamento, um defeito de 5mm de diâmetro foi criado cirurgicamente na calvária dos animais. Após 7, 15, 45 dias, os animais foram submetidos à eutanásia e as peças ósseas removidas. A análise dos resultados foi realizada por microscopia e radiografia. A histomorfometria, aos 15 dias mostra que os grupos tratados (ALD e RE) apresentaram maior formação óssea em relação ao não tratado (NaCl) tanto nos grupos SHAM quanto no grupo OVX (p<0.05 ANOVA, Tukey). Além disso, os animais tratados com RE apresentam maior formação óssea em relação ao grupo ALD. De modo semelhante, aos 45 dias os resultados da morfometria indicam que na região da borda do defeito, os grupos tratados (ALD e RE) apresentaram maior formação óssea em relação ao grupo não tratado (NaCl) tanto no grupo SHAM quanto no grupo OVX (p<0.05 ANOVA, Tukey). Palavras Chaves: Osteoporose. Menopausa. Reparo Ósseo.Tratamento. Ovariectomia. 8 ABSTRACT Postmenopausal osteoporosis due to estrogen deficiency occurs as a consequence of increased bone resorption. Sodium Alendronate (ALD) is a bisphosphonate widely used in the prevention and treatment of osteoporosis that increases bone mineral density and consequently reduces the incidence of fractures. In treatments with high doses or long-term can cause osteonecrosis and atypical fractures. The Strontium ranelate (RE) promotes new bone formation and also inhibits bone resorption by decreasing osteoclast differentiation. As the bone metabolism in normal subjects is different from that in osteoporotic individuals, the aim of this work is to evaluate and compare the effect of suppressing drugs on bone resorption in subjects with normal and estrogen depletion in bone repair. The total of 108 rats was randomly divided into 6 groups of 18 each and underwent surgical ovariectomy (OVX) or sham surgery (SHAM), distributed as follows: OVX / ALD, OVX / OVX and RE / NaCl, SHAM OVX / ALD OVX SHAM / SHAM and OVX RE / NaCl. After ovariectomy (60 days), all animals were treated with the drug relative to the group until the end of the experimental period. After 30 days of treatment, a defect of 5 mm diameter was surgically created in the calvaria of animals. After 7, 15, 45 days, the animals were euthanized and bone pieces removed. The analyses of results was performed by microscopy. The histomorphometry at 15 days shows that the treated groups (ALD and RE) showed greater bone formation compared to untreated (NaCl) in both groups, SHAM and OVX (p <0,05 ANOVA, Tukey). Furthermore, animals treated with RE show increased bone formation compared to the ALD group. Similarly, at 45 days the results indicate that in the edge region of defect, the treated groups (ALD and RE) showed greater bone formation compared to the untreated group (NaCl) in both the SHAM group and the OVX group (p <0,05 ANOVA, Tukey). Palavras-chave: Osteoporosis. Menopausal. Bone repair. ranelate . Ovariectomy. Alendronate. Strontium 9 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1- Estrutura química dos bisfosfonatos (Russell et al 2007). ....................... 211 Figura 2- Estrutura química do alendronato (Russell et al 2007). ...........................233 Figura 3 - Estrutura química do Ranelato de Estrôncio (Blake & Fogelman, 2006).266 Figura 4- Delineamento experimental ..................................................................... 322 Figura 5 - Cirurgia de Ovariectomia. (A) Antissepsia da área cirúrgica; (B) Incisão e localização de tuba uterina e ovário; (C) Ligadura da tuba uterina e (D) Ovário removido.................................................................................................................. 344 Figura 6 - Lâmina de esfregaço vaginal. (Aumento 40x). ........................................ 355 Figura 7 - Cirurgia de Craniotomia: (A) Incisão; (B) Confecção do defeito com Broca Trefina de 5mm; (C) Defeito de 5mm de diâmetro e (D) Sutura do corte cirúrgico . 377 Figura 8 - Remoção da região do defeito ósseo........................................................38 Figura 9 –Peça encaminhada para análise histológica. ............................................ 39 Figura 10 - Telerradiografias dos defeitos ósseos após tratamento e respectivos períodos.. .................................................................................................................. 42 Figura 11 – Imagens Histológicas do Grupo NaCl. ................................................. 444 Figura 12 - Imagens Histológicas do Grupo Ranelato de Estrôncio ........................466 Figura 13 - Imagens Histológicas do Grupo Alendronato de Sódio. ..........................48 Figura 14 - Histomorfometria do tecido ósseo nos períodos de 15 e 45 dias. (A) Borda do defeito. (B) Centro do defeito. .................................................................... 51 Figura 15 - Histomorfometria do tecido ósseo do período de 15 dias. (A) Borda do feito. (B) Centro do defeito.) .................................................................................... 522 Figura 16- Histomorfometria do tecido ósseo do período de 45 dias. (A) Borda do feito. (B) Centro do defeito. ..................................................................................... 533 10 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 12 2 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................. 14 2.1 OSTEOPOROSE .............................................................................................14 2.2 REPARO ÓSSEO ...............................................................................................16 2.3 TRATAMENTO DA OSTEOPOROSE ................................................................18 2.3.1 Vitamina D e Cálcio.......................................................................................19 2.3.2 Análogos do Hormônio da Paratireoide (Pth) ................................................ 19 2.3.3 Moduladores de Receptor Seletivo de Estrógenos (SERMs) ........................20 2.3.4 Anticorpos Monoclonais Humanos ................................................................20 2.3.5 Inibidor Seletivo de Catepsina-K ................................................................... 20 2.3.6 Bisfosfonatos................................................................................................. 21 2.3.7 Ranelato de Estrôncio ...................................................................................26 3 MATERIAIS E MÉTODOS .....................................................................................31 3.1 LOCAL E GRUPOS DE ESTUDO .................................................................... 31 3.2 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ................................................................32 3.3 PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS .................................................................. 33 3.3.1 Anestesia e Antissepsia ............................................................................. 33 3.3.2 Ovariectomia e Cirurgia SHAM ................................................................. 33 3.3.3 Comprovação do ciclo estral...................................................................... 34 3.3.4 Tratamento ................................................................................................35 3.3.5 Técnica cirúrgica – Craniotomia................................................................. 36 3.4. PREPARO DAS PEÇAS E FORMA DE ANÁLISE DOS RESULTADOS ........ 37 3.4.1. Análise Macroscópica ............................................................................... 38 3.4.2 Análise Radiográfica .................................................................................. 38 3.4.3 Análise Histológica.....................................................................................39 3.4.4 Histomorfometria........................................................................................39 3.4.5 Análise Estatística......................................................................................40 4 RESULTADOS ....................................................................................................... 41 4.1 ANÁLISE MACROSCÓPICA............................................................................ 41 4.2 ANÁLISE RADIOGRÁFICA .............................................................................. 41 4.3. ANÁLISE HISTOLÓGICA................................................................................ 43 4.3.1 Grupo NaCl SHAM e OVX ........................................................................ 43 11 4.3.2 Grupo Ranelato de Estrôncio SHAM e OVX .............................................. 45 4.3.3 Grupo Alendronato de Sódio SHAM e OVX............................................... 47 4.4 HISTOMORFOMETRIA E ANÁLISE ESTATÍSTICA ........................................ 49 5 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 54 6 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 59 REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 60 ANEXO A – PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA ............................64 12 1 INTRODUÇÃO De acordo com o Relatório Global da Organização Mundial de Saúde sobre Prevenção de Quedas na Velhice (2010)(1), o número de pessoas com mais de 60 anos cresce com rapidez maior do que qualquer outro grupo etário. O número desse grupo foi estimado para 688 milhões de pessoas, em 2006, projetado para crescer para quase dois bilhões de pessoas até 2050. Os segmentos mais velhos da população, com idades superiores a 80 anos, particularmente suscetíveis a quedas e suas consequências é o grupo que cresce com rapidez maior e espera-se que chegue a representar 20% da população mais idosa até 2050. Assim o aumento da expectativa de vida reflete no maior número de indivíduos afetados por doenças crônico-degenerativas, e a osteoporose é a doença osteometabólica de maior prevalência mundial constituindo-se um problema de saúde pública com grande impacto sócio-econômico (2). O termo osteoporose foi inicialmente introduzido na França e Alemanha no século passado, com o significado de “osso poroso” originado de análise histológica e redefinido, posteriormente, como “osso normalmente mineralizado, mas em quantidade reduzida” (3). Trata-se de um distúrbio multifatorial e progressivo do esqueleto caracterizado por redução da massa óssea e deterioração da microarquitetura do tecido, com consequente aumento da fragilidade óssea e do risco de fraturas (4) (5). É um problema que atinge um maior número de mulheres quando comparada aos homens, na proporção de 5:2, com idade superior a 50 anos (6). Esta diferença pode ser explicada em parte pelo menor pico de massa óssea e alterações hormonais que ocorrem quando a mulher atinge a fase da menopausa. Além do que, a longevidade das mulheres é maior que a dos homens, tendo mais tempo para a redução na massa óssea (7). O volume e a qualidade do osso são fatores importantes na área da ortopedia e odontologia, pois em várias situações ocorre a falta de tecido ósseo necessário para práticas clínicas de fixação de próteses e implantes (7). Ressaltando que o reparo ósseo de defeitos relativamente grandes, congênitos ou decorrentes de 13 fraturas, cirurgias ou doenças, quando deixados ao seu livre curso não se resolvem ou o fazem muito lentamente e de modo incompleto. Nessas condições o uso de drogas antirreabsortivas pode representar uma alternativa de grande importância para favorecer o reparo, além de ser uma prática não dispendiosa e facilmente aplicável na clínica (8). O reparo de defeitos relativamente grandes representa um desafio de ordem ortopédica e odontológica, sendo sua resolução difícil e lenta, principalmente em se tratando de indivíduos com metabolismo ósseo comprometido. Poucos estudos têm sido realizados para comparar os efeitos de Alendronato de Sódio (ALD) e Ranelato de Estrôncio (RE) em indivíduos normais e osteoporóticos. Assim, nosso estudo tem por objetivo verificar os efeitos das duas drogas antirreabsortivas, em modelo animal que simula condições em mulheres normais e mulheres no período pós-menopausa, em que a deficiência estrogênica favorece o aparecimento de quadros osteoporóticos, comparando os resultados obtidos através de análise histomorfométrica e radiográfica da neoformação óssea em defeitos críticos confeccionados em calvária de ratas normais e ovariectomizadas. Entre as mulheres mais velhas, o tratamento com bisfosfonato por mais de cinco anos foi associado com um risco aumentado de fraturas da diáfise subtrocanteriana ou femoral (9), fraturas conhecidas como atípicas. Osteonecrose de mandíbula também tem sido relatada atualmente com outro efeito colateral dos bisfosfonatos. Ambos os efeitos são devidos a um estado de baixo turnover ósseo induzido pela droga. Embora o principal efeito seja a antireabsorção, a interrupção da conexão entre osteoblastos e osteoclastos promovida pelos bisfosfonatos resulta, além da redução da reabsorção, na diminuição da formação óssea a longo prazo (10). O ranelato de estrôncio é a única droga que apresenta efeito combinado entre a estimulação da formação e inibição de reabsorção óssea. Age sobre a superfície do osso e estimula a diferenciação de osteoblastos por estimular receptores sensíveis ao cálcio, mas inibe a diferenciação osteoclástica por inibir a produção de Receptor de Fator Ativador Kappa B (RANK) e aumentar a atividade de Osteoprotegerina (OPG) (11). 14 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 OSTEOPOROSE A osteoporose é uma doença silenciosa, pois geralmente é assintomática e diagnosticada somente após a ocorrência de alguma fratura por fragilidade (11). A determinação da densidade mineral óssea (DMO) através da Densitometria Óssea por Raios-X de dupla energia (DXA) e a Tomografia Micro-Computadorizada (microCT) são métodos válidos para diagnosticar precocemente a osteoporose e predizer o risco de fraturas, além de avaliar, através de testes sucessivos, se um tratamento está ou não apresentando resultados satisfatórios (12,13). A dosagem sanguínea de biomarcadores como a osteocalcina (OCN) e o Paratormônio (PTH) também é útil para diagnosticar a doença e monitorar o efeito de drogas antiosteoporóticas (8). A OCN é produzida somente por osteoblastos. Baixos níveis de OCN indicam função osteoblástica prejudicada podendo gerar um desequilíbrio entre osteoblastos e osteoclastos seguida de perda de massa óssea (8). O PTH aumenta a liberação de cálcio acumulado nos ossos, portanto, altos níveis de PTH no soro indica descalcificação óssea (13). Pode ser classificada como osteoporose primária quando ocorre por causas naturais como a menopausa e a senilidade, e osteoporose secundária quando há uma causa inicial como uso crônico de medicamentos corticóides e algumas doenças como artrite reumatóide, mieloma múltiplo, alterações endócrinas, desnutrição e doenças neoplásicas (13,14). A osteoporose pós-menopausa é caracterizada por uma pronunciada reabsorção óssea devido à redução dos níveis de estrógenos ocasionando a perda de massa óssea e riscos de fraturas em ossos longos e vértebras (2,12), e as de quadril e de vértebras as que oferecem sérios riscos de saúde aos pacientes, resultando em períodos de internação prolongados, diminuição da autonomia, redução da qualidade de vida e aumento das taxas de mortalidade (4). A menopausa é caracterizada pela supressão do ciclo menstrual que ocorre nas mulheres por volta dos 48,7anos, tendo seu diagnóstico firmado após um ano 15 de amenorreia (9) com manifestações de vários sintomas sistêmicos e alterações metabólicas que influenciarão na qualidade de vida e na saúde da mulher, dentre elas a osteoporose e suas consequências. Os hormônios sexuais têm importante papel no crescimento ósseo e na manutenção do pico de massa óssea (12). Após a menopausa, a deficiência de estrogênio leva a uma regulação positiva de RANKL (Ligante de Receptor Ativador de Fator Nuclear KappaB) nas células da medula óssea, que é um importante determinante do aumento de reabsorção óssea, enquanto o próprio estrogênio estimula a produção de osteoprotegerina (OPG) nos osteoblastos, exercendo, em consequência, efeitos antirreabsortivos no osso. Os efeitos extra esqueléticos da deficiência de estrogênio baseiam-se principalmente no aumento da excreção renal de cálcio e na redução da absorção intestinal do mineral. A deficiência de estrógenos também causa um aumento contínuo nos níveis de PTH (14), além de representar um fator dominante na formação do tecido ósseo cortical por sustentar osteoblastos e prevenir a reabsorção óssea através da supressão da osteoclastogênese e estimular a apoptose dos osteoclastos (15). A deficiência estrogênica está associada a mudanças na conectividade de estruturas trabeculares ósseas, como redução do número de trabéculas e aumento dos espaços trabeculares caracterizando a perda de massa óssea e redução da força (16). A reposição estrogênica é empregada como medida preventiva e terapêutica (17) do sistema esquelético contra fraturas e perda de tecido ósseo primariamente por inibir a reabsorção óssea (18). O 17-beta-estradiol promoveu apoptose em osteoclastos de ratos in vitro e in vivo, o que sugere que os estrógenos podem prevenir perda óssea excessiva antes e após a menopausa pela indução da apoptose dos osteoclastos (17). Atualmente, vários agentes antiosteoporóticos tem sido empregados no tratamento clínico da doença, tais como os bisfosfonatos (alendronato, risedronato, zolendronato, e outros), ranelato de estrôncio, hormônio paratireoideano, moduladores de receptores seletivos de estrógenos e calcitonina (14,18). Fratura óssea é a mais temida complicação da osteoporose e resulta, frequentemente, na incapacidade e perda de autonomia de pacientes com 16 consequências socioeconômicas. Com o aumento da idade, entre outros fatores, o reparo ósseo das fraturas se torna mais difícil e demorado (19). Fraturas osteoporóticas de espinha e quadril levam a 20% de mortalidade, devido à hospitalização por longos períodos associada à outras intercorrências como pneumonia e doenças tromboembólicas devidas à imobilização crônica (20). 2.2 REPARO ÓSSEO O tecido ósseo é um tecido dinâmico, pois está em constante atividade de remodelação, sendo que a massa óssea depende do equilíbrio entre a formação através de osteoblastos e a reabsorção óssea por osteoclastos, funções celulares que são mediadas por fatores locais e sistêmicos (2,14). O reparo e remodelação ósseos são realizados por um complexo esforço celular, fatores bioativos e matriz extracelular para estimular a proliferação, diferenciação e migração de células osteoprogenitoras. A indução de cascatas de sinalização para o tecido reparado resulta de elevada expressão de fatores próinflamatórios, angiogênicos e de crescimento osteogênicos liberados por células do local da lesão, muitos dos quais participam do desenvolvimento embrionário e da homeostase óssea (17). O tecido ósseo tem a capacidade de reparar fraturas ou defeitos locais por meio do processo de regeneração, com a formação de novo tecido que apresente a mesma organização estrutural do tecido anterior, sem a formação de cicatriz (17). O reparo ósseo após uma lesão é caracterizado por 3 fases: inflamação, renovação e remodelação. Fatores de crescimento são moléculas sinalizadoras solúveis que controlam uma variedade de respostas celulares através de ligantes de receptores específicos de membrana das células alvo. Na fase inflamatória há o recrutamento de células de defesa e progenitoras mesenquimais (21) e o processo é controlado por fatores de crescimento e citocinas pró-inflamatórias liberadas temporariamente e localmente após a lesão. Entre as moléculas inflamatórias envolvidas estão o fator de necrose tumoral-α (TNF-α), interleucinas (IL), interferon-γ (IT-γ) e prostaglandinas (PG) que estimulam a migração e diferenciação de 17 osteoblastos e osteoclastos além de ativar uma cascata secundária que aumenta a angiogênese e o reparo ósseo (19). Na segunda fase, há a formação de um calo mineralizado através de 2 vias de osteogênese: a formação direta de osso através de resposta do periósteo (ossificação intramembranosa) e a formação de osso através de uma cartilagem intermediária (ossificação endocondral). Nesses dois processos, a angiogênese se torna um fator concorrente ou correlato para a neovascularização (21). A presença de uma rede microvascular local sustenta células mesenquimais, osteogênicas e condrogênicas necessárias para o reparo. A angiogênese é regulada por moléculas solúveis como o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento fibroblástico (FGF) e fator de crescimento semelhante à insulina (IGF) (19). O terceiro estágio da regeneração óssea ocorre com a remodelação do tecido ósseo lamelar até uma estrutura semelhante ao osso existente antes da injúria (21). Várias situações contribuem para um reparo ósseo prejudicado como idade avançada, osteoporose, estados de má nutrição e a fase pós-menopausa (20). Os hormônios sexuais têm importante papel no crescimento ósseo e na manutenção do pico de massa óssea. Em casos de ovariectomia realizada em mulheres jovens ou ainda, na menopausa precoce, também pode se observar uma perda acelerada da massa óssea, com instalação mais rápida de quadro osteoporótico (17). Nesses casos o processo de reparo normal é deficiente e não atinge o reparo completo. Porém, ainda não há um consenso a respeito de qual estágio do reparo é mais afetado pela deficiência estrogênica, se a fase inicial de formação, se na fase de mineralização ou na fase mais tardia, a remodelação (17). Assim, medicamentos que possam estimular a reparação óssea se fazem cada vez mais necessários, pois é crescente o número de fraturas as quais representam grande impacto na qualidade de vida dos pacientes além de consequências consideráveis à sociedade do ponto de vista econômico. Casos em que o reparo ósseo não ocorre de forma completa dentro de um período de 4 a 6 meses somente uma mudança de tratamento poderá evoluir para reparo total (20). 18 Kuroda, Noritake e Kasugai (3) mostraram que em ratas ovariectomizadas a Densidade Mineral Óssea (DMO) da porção trabecular do fêmur foi reduzida quando comparada ao grupo controle (não-ovariectomizadas). Os modelos de estudos com a criação de defeito ósseo na calvária de ratas oferece grande similaridade com ossos da região maxilofacial, pois o osso da calota craniana se desenvolve morfo e embriologicamente a partir de uma membrana o que lhe confere características de osso membranoso. Anatomicamente a calvária é formada por duas placas de osso cortical, intercaladas com osso esponjoso, assemelhando-se à mandíbula (22). O reparo do defeito se inicia pelas bordas com a formação de osso lamelar (22). Defeitos de 3 a 5 mm de diâmetro, um arcabouço de matriz osteóide é formado inicialmente e depois há uma deposição de osso lamelar nos espaços intertrabeculares recém-formados. Após 4 semanas os defeitos são preenchidos completamente por osso compacto. A finalização do preenchimento não significa a completa cicatrização, pois a estrutura do osso regenerado ainda é muito diferente da estrutura do osso cortical osteonal, embora pareça compacto. Isso ocorrerá através do remodelamento harvesiano que se inicia pelo córtex imediatamente adjacente à margem da perfuração inicial, em aproximadamente 3 semanas após a confecção do defeito. A remodelação segue da margem do defeito para o osso recém-formado e o substitui com ósteons secundários orientados longitudinalmente (23). 2.3 TRATAMENTO DA OSTEOPOROSE O tratamento da osteoporose busca primeiramente medidas não farmacológicas como dieta balanceada com concentrações ideais de vitamina D e cálcio, exercícios físicos adequados e regulares, supressão de tabaco, abstinência do uso excessivo de álcool e prevenção de quedas. Na falha dessas medidas aí sim é empregada a terapia farmacológica (24). 19 Atualmente várias terapias farmacológicas que reduzem de fato o número de fraturas através da melhora da massa óssea estão disponíveis no mercado. A maioria dos medicamentos comercializados reduz a perda óssea através da inibição da reabsorção óssea, mas as terapias novas podem aumentar diretamente a massa óssea, como é o caso do paratormônio (24). Nas duas últimas décadas, desenvolveram-se opções de tratamento farmacológico e não farmacológico para reduzir o risco de fraturas em pacientes osteoporóticos. A terapêutica para osteoporose que vem sendo adotada com maior prevalência é aquela dada por agentes antirreabsortivos, como os bisfosfonatos, porém a eficácia antifratura de tais agentes mostrou-se bem inferior à desejada (25). O tratamento ideal para a osteoporose deve fornecer eficácia antifratura em vários sítios do sistema esquelético incluindo espinha, sítios não-vertebrais e quadril; alta margem de segurança; modo de administração e intervalos entre as doses que facilitem a aderência ao tratamento; compatibilidade com drogas prescritas para outras patologias e custo acessível (13). 2.3.1 Vitamina D e Cálcio A deficiência de vitamina D e de cálcio leva ao hiperparatitreoidismo secundário, à osteomalácia e à osteoporose, assim concentrações ideais dessas substâncias são a base da prevenção e tratamento da osteoporose. A dose recomendada de vitamina D é de 800UI/ dia e do cálcio em indivíduos adultos, 10001200mg diariamente, sendo a associação recomendada, pois há estudos que mostram que o cálcio em altas doses, quando administrado sem a vitamina D, aumenta o risco de doenças cardiovasculares (26). 2.3.2 Análogos do Hormônio da Paratireoide (Pth) Análogos do hormônio paratireoideano como o PTH I-34 e PTH I-84 são indicados como terapêutica na osteoporose estabelecida em mulheres no período pós-menopausa. São drogas anabólicas, pois não só preservam a densidade 20 mineral óssea por bloquear a atividade osteoclástica, mas também aumentam o número de osteoblastos e tem efeito reduzido sobre a reabsorção (26). 2.3.3 Moduladores de Receptor Seletivo de Estrógenos (SERMs) O raloxifeno é um modulador de receptor seletivo de estrógenos (SERM), ou seja, atua como um agonista hormonal em ossos, lipídios e sistema de coagulação sanguínea, e age como antagonista estrogênico em mamas e útero, tendo efeito protetor contra o câncer de mama. É pouco indicado na prevenção de fraturas osteoporóticas, pois apresenta efeito preventivo apenas para fraturas vertebrais, e não de quadril, além de estar associado ao risco de trombose venosa (26). 2.3.4 Anticorpos Monoclonais Humanos O denosumab é um anticorpo monoclonal humano que se liga à RANKL e inibe a interação RANK-RANKL levando à supressão da formação, função e sobrevivência dos osteoclastos, o que pode ser comprovado pela inibição da concentração de C-telopeptídio, um marcador sérico de reabsorção óssea. Assim tem sido uma nova abordagem na prevenção de fraturas osteoporóticas (26). 2.3.5 Inibidor Seletivo de Catepsina-K A catepsina-K é uma protease que induz a degradação da matriz óssea mediada por osteoclastos. O inibidor seletivo de catepsina K, odanacatibe, administrado semanalmente, promove grande aumento na densidade mineral óssea na coluna lombar e quadril. Normalmente, a formação e a reabsorção ósseas ocorrem de forma interligada, durante o tratamento com odanacatibe, ocorre um desacoplamento desses processos (26). 21 2.3.6 Bisfosfonatos Os bisfosfonatos são fármacos de escolha para o tratamento de uma série de doenças ósseas onde há uma excessiva atividade osteoclástica, merecendo destaque a osteoporose, que atualmente se tornou um problema de saúde pública devido ao aumento da expectativa de vida da população. São bastante utilizados também nos casos de osteoporose secundária, causada por uso prolongado de glicocorticoides, gravidez, transplante de órgãos e paraplegia (24). Os bisfosfonatos pertencem a uma classe de fármacos que apresentam uma ligação P-C-P em sua estrutura química e agem como inibidores da reabsorção óssea, mediada por osteoclastos. São empregados no tratamento de diversas desordens ósseas como a doença de Paget, hipercalcemia maligna, osteoporose e a doença mestastática e osteolítica (24). São análogos do ácido pirofosfórico, sustância endógena que se encontra no organismo sob a forma de pirofosfato, um inibidor natural da reabsorção óssea. Os bisfosfonatos, por serem sintetizados quimicamente através de modificações moleculares apresentam maior resistência à degradação enzimática e maior meia-vida biológica o que acaba por influenciar no metabolismo ósseo (25). Figura 1- Estrutura química dos bisfosfonatos (Russell et al 2007). Os bisfosfonatos agem diretamente sobre os osteoclastos e interferem em processos bioquímicos intracelulares específicos como a biossíntese de 22 isoprenóides e subsequente prenilação de proteínas para inibir a atividade celular (25). Os osteoclastos realizam endocitose, assim os bisfosfonatos presentes no espaço onde ocorre a reabsorção podem penetrar nestas células, afetando seu metabolismo e induzindo apoptose (24). Os bisfosfonatos ligam-se aos cristais de hidroxiapatita, tendo, portanto, uma afinidade muito alta pelo osso. São liberados da matriz óssea mediante exposição a ácido e enzimas secretados por um osteoclasto ativo. Após o início da terapia oral com bisfosfonatos, a supressão da reabsorção óssea ocorre dentro de cerca de três meses, a despeito da frequência de dosagem, sendo mais rápida após administração endovenosa (24). Ficou demonstrado que, após três anos de tratamento, os bisfosfonatos aumentam a DMO do quadril em 3%-6% e a da coluna vertebral em 5%-8%. Em mulheres com osteoporose, o ácido zoledrônico, o alendronato e o risedronato também reduzem as fraturas não vertebrais em 25%-40%, inclusive a fratura de quadril em 40%-60% (11). A administração endovenosa rápida de bisfosfonatos parenterais pode causar toxicidade renal. O uso de bisfosfonatos parenterais não é recomendado para pacientes com clearance de creatinina inferior a 30-35 mL/min e pacientes com outras doenças que resultam em baixa densidade óssea, como a osteodistrofia renal (11,26). Os bisfosfonatos apresentam baixa absorção intestinal em humanos, refletindo em biodisponibilidade oral em torno de 0,7% para o alendronato, 0,3% para o pamidronato, 3-7% para o etidronato e 1-2% para o clodronato. A baixa absorção é devida ao caráter lipofílico bastante baixo, o que dificulta sua passagem através de barreira epitelial (24). A única rota de eliminação dos bisfosfonatos é a excreção renal. Uma vez ligados ao tecido ósseo, os bisfosfonatos são liberados somente quando o tecido ósseo sofre reabsorção. De modo geral, os bisfosfonatos apresentam poucos efeitos adversos sendo mais comumente observados distúrbios gastrintestinais e alterações no paladar (24). 23 O Alendronato, foi o primeiro bisfosfonato a ser aprovado para o tratamento da osteoporose nos EUA em 1995. Desde então, bisfosfonatos mais novos e com um maior intervalo entre as doses vêm sendo introduzidos, numa tentativa parcial de aumentar a adesão ao tratamento (11). Figura 2- Estrutura química do alendronato (Russell et al 2007). O alendronato pode se ligar à superfície óssea e inibir a FPPS (Farnesil Difosfato Sintetase), enzima da sequência da biossíntese do colesterol, pela via do melavonato, requerida para a produção de geranilgeranil difosfato (27). A geranilgeranil difosfato se liga a membrana celular por um processo de isoprenilação de proteínas. A depleção desta enzima reduz a prenilação de proteínas que controlam a forma celular e a formação da borda em escova dos osteoclastos, resultando em prejuízo da sua função reabsortiva (28), aumentando significativamente a densidade mineral óssea e reduzindo fraturas vertebrais e nãovertebrais, o que vem sendo demonstrado em 20 anos de uso clínico com segurança e eficácia (27). A eficácia clínica do alendronato parece ser maior que a prevista a partir de sua potência celular o que pode ser atribuído à sua maior afinidade ao mineral o que também pode explicar sua maior afinidade à redução do turnover ósseo quando comparado ao seu análogo, o risedronato que é o inibidor mais potente de FPPS entre os bisfosfonatos clinicamente importantes (25). Dados histomorfométricos mostram que o turnover ósseo não é suprimido completamente, mas parece alcançar níveis menores que aqueles encontrados na fase de pré-menopausa. Tal redução na remodelação óssea se apresenta maior 24 para o alendronato, ibandronato e zoledronato do que para risedronato ou etidronato quando avaliadas doses usadas no tratamento de osteoporose (25). Os bisfosfonatos podem afetar a reabsorção mediada por osteoclastos através de efeitos sobre o recrutamento de osteoclastos, diferenciação e atividade reabsortiva e podem ainda afetar a morfologia osteoclástica e causar apoptose dessas células in vitro. A acidificação das vesículas intracelulares parece ser necessária para permitir o movimento dos bisfosfonatos dentro do cito sol e dentro de outras organelas como os peroxissomos, onde eles exercem seu efeito bioquímico (25). Após atingirem os sítios importantes do esqueleto, todos os bisfosfonatos inibem a reabsorção óssea através de efeitos intracelulares nos osteoclastos. O efeito inicial dos bisfosfonatos contendo nitrogênio em sua molécula (alendronato) parece ser prejudicar a função dos osteoclastos e reduzir a reabsorção. Eventualmente esses podem causar apoptose, mas esta não é o principal fator para a inibição dos osteoclastos (25). Os bisfosfonatos são classificados em 2 grupos, de acordo com seu mecanismo de ação. No primeiro grupo estão os bisfosfonatos que não possuem átomos de nitrogênio em sua molécula como o clodronato e etidronato. E podem ser metabolicamente incorporados em análogos β, γ-metileno não hidrolisáveis de Adenosina Trifosfato (ATP) pela reversão de reações aminoacil-tRNA sintetase normalmente envolvidas em ativação de aminoácidos durante a síntese proteica (33). Esse grupo de fármacos são provavelmente metabolizados em nucleotídeos tipo App-Cp devido a sua semelhança ao pirofosfato presentes naturalmente no organismo. É provável que o acúmulo intracelular desses metabólitos inibe a função dos osteoclastos e induz à apoptose (25). Já no segundo grupo estão os bisfosfonatos mais potentes, aqueles que possuem Nitrogênio ligado (N-BPs), como o alendronato, risedronato e zolendronato. Membros deste grupo interferem com outras reações metabólicas, principalmente na via sintética do mevalonato, conhecida por sua participação na biossíntese de colesterol e outros esteróis. Várias enzimas dessa via utilizam isoprenóide difosfato como substrato e os bisfosfonatos contendo nitrogênio poderiam então agir como substratos análogos de um ou mais dos isoprenóides 25 difosfatos. Sabe-se que o maior alvo é agora uma enzima, a FPPS, a qual é inibida por todos os bisfosfonatos N-BPs usados clinicamente. A FPPS ocorre em peroxisomas, mitocôndrias e no citosol e o sítio de ação dos N-BPs é desconhecido (25). Após se ligarem à matriz mineral óssea, os bisfosfonatos são internalizados através de endocitose. Os bisfosfonatos simples são metabolizados no citosol dos osteoclastos em análogos de ATP que induzem à apoptose das células. Os N-BPs inibem FPPs, prevenindo a prenilação de pequenas proteínas GTPase essenciais para as funções e sobrevivência de osteoclastos. A inibição de FPPS também causa o acúmulo de IPP que é incorporado a ApppI ( um análogo de ATP capaz de induzir a apoptose de osteoclastos) (25). Embora os bisfosfonatos sejam reconhecidamente benéficos no tratamento de fraturas osteoporóticas típicas, são pouco empregados em indivíduos que apresentam alto risco de fraturas (29). Park-Wyllie et al (29) mostraram em seu trabalho que essa classe de medicamentos, quando utilizada por período de 5 anos ou mais, oferecem um maior risco de fraturas subtrocantérica ou de diáfise femural. Em seu trabalho, Chen e colaboradores (27) mostraram que o alendronato de sódio apresenta efeitos melhores que a calcitonina de salmão sobre osteointegração de implantes de hidroxiapatita, o que pode ser atribuído aos diferentes mecanismos de ação. Ambas as drogas apresentam ação antirreabsortiva, porém a calcitonina de salmão não apresenta formação óssea significante e o papel de inibição osteoclástica realizado pelo alendronato é bem maior. Tais efeitos foram observados tanto em condições osteoporóticas quanto em animais com metabolismo ósseo normal, o que indica que o alendronato de sódio pode ser útil quando da implantação de próteses, principalmente em indivíduos idosos em que a osteoporose está frequentemente instalada, favorecendo sua osteointegração e evitando seu afrouxamento, instabilidade e afundamento. Os bisfosfonatos reduzem a atividade osteoclástica através da inibição de farnesil difosfato sintetase, enzima que leva à perda de proteínas ligantes de guanosina trifosfato (GTP). Estas proteínas são a chave da atividade osteoclástica e 26 é esta interferência na via mevalonato que interrompe a atividade dos osteoclastos e, consequentemente a reabsorção óssea. Os N-BPs tem sido associados à necrose de mandíbula, sendo que os mecanismos moleculares responsáveis por esses efeitos adversos ainda não estão totalmente esclarecidos, porém o turnover ósseo aumentado é o mecanismo primário que leva à necrose. O maior fator de risco são as infecções da mandíbula e o uso de bisfosfonatos nessas condições deve ser cauteloso ou evitado. O risco de desenvolver osteonecrose nas articulações é maior quando há terapia a longo prazo com essas drogas, além de outros fatores como a extração dentária em pacientes idosos portadores de mieloma múltiplo. Apesar desses efeitos os bisfosfonatos, de forma geral, têm demonstrado boa tolerabilidade e boa eficácia (30). O uso de bisfosfonatos pode estar associado a alguns efeitos colaterais além daqueles já conhecidos como reações gastrointestinais superiores, mas também à necrose asséptica da mandíbula e fraturas espontâneas atípicas de fêmur, sendo considerado o uso por período superior a 3 anos como fator de risco (26). 2.3.7 Ranelato de Estrôncio O ranelato de estrôncio (RE) é um medicamento de uso oral desenvolvido para o tratamento e prevenção de osteoporose. É composto por dois átomos de estrôncio e uma molécula de ácido ranélico (11,30,31), seu nome químico é 5-[bis (carboximetil)amino]-2-carboxi-4-ciano-3-tiofenacético ácido estrôncio (30). Figura 3 - Estrutura química do Ranelato de Estrôncio (Blake & Fogelman, 2006). 27 Desde 2004, o ranelato de estrôncio foi aprovado para o tratamento da osteoporose em países europeus (11). Nos Estados Unidos, não é aprovado pelo FDA, mas é licenciado para formulação oral (2g/dia) para uso restrito na prevenção de fraturas osteoporóticas vertebrais e não vertebrais, em pacientes em que o uso de bisfosfonatos não foi bem sucedido ou quando há contraindicações para seu uso (14). Os bisfosfonatos são potentes inibidores da remodelação óssea e permanecem no tecido ósseo por muito tempo após a suspensão de seu uso. Considerando que o Ranelato de Estrôncio se liga predominantemente em tecido ósseo neoformado, a exposição prévia a bisfosfonatos pode inibir a ação do RE, sendo aconselhável um intervalo de no mínimo 6 meses sem bisfosfonatos para iniciar o tratamento com RE (32). É administrado na dose de 2g/dia, apresentado em sachês sob a forma de grânulos que deve ser suspenso em água e ingerido à noite, ao deitar. Caso seja prescrito juntamente com suplementação cálcica, esta deve ser tomada em período diferente daquele para evitar que sua absorção seja reduzida. A ingestão de alimentos, leite e derivados lácteos deve ser pelo menos 2 horas antes do Ranelato de Estrôncio (33). É considerado uma droga segura e eficaz por apresentar poucos efeitos colaterais (31), embora raramente possa induzir erupções cutâneas com eosinofilia e trombose venosa profunda (14,26). Roux (34) relata que os efeitos colaterais mais comuns apresentados pelos pacientes durante os três primeiros meses de tratamento com Ranelato de Estrôncio foram náusea, diarreia, cefaleia e dermatites. Está contra-indicado também a pacientes com fenilcetonúria, pois o RE contém a fenilalanina (20). O ranelato de estrôncio atua estimulando a formação óssea e reduzindo a reabsorção, por isso tem sido referido como agente de dupla ação óssea (30), podendo ter papel benéfico na cura de fraturas (20). Altera os marcadores da remodelação óssea, aumentando os de formação e reduzindo os de reabsorção. Aumenta a densidade mineral óssea em vários sítios do esqueleto (32) e apresenta alta afinidade pelo tecido ósseo, porém a substituição do estrôncio por cálcio na hidroxiapatita é baixa e o estrôncio adsorve à superfície dos cristais. 28 Assim, características dos cristais ósseos se tornam inalteradas na crista ilíaca humana, verificadas em biópsias obtidas após 60 meses de tratamento com a droga administrada na dose de 2g/ dia (30). In vitro, mostrou-se que o ranelato de estrôncio aumenta a atividade osteoblástica, inclusive aumentando a síntese de colágeno e modulando o sistema OPG/RANKL a favor de OPG. Além disso, diminui a reabsorção óssea através da redução da diferenciação e da atividade de reabsorção de osteoclastos, e aumenta a apoptose osteoclástica. Em um resumo dos resultados de quatro estudos clínicos sobre o ranelato de estrôncio, três para tratamento da osteoporose e um para a prevenção da doença, realizados por um período de três anos, o fármaco proporcionou um aumento da DMO em todos os sítios osteoporóticos, redução de 37% nas fraturas vertebrais e redução de 14% nas fraturas não vertebrais (11). A eficácia em prevenir fraturas vertebrais e não-vertebrais é mantida mesmo após longos períodos de tratamento, até 8 anos (34,35). Mais recentemente, um seguimento de cinco anos de um dos estudos de tratamento demonstrou redução de 43% e de 24% nas fraturas de quadril e vértebras, respectivamente (11). Têm sido demonstrado que o RE reduz a progressão radiológica e a dor em casos de osteoartite em joelho, problema que está frequentemente associado à osteoporose em pacientes idosos (26), podendo ser utilizado no tratamento da osteoporose em diferentes estágios de severidade, devido ao seu amplo espectro de ação (34). Yalin et al (31) realizaram estudo em ratas ovariectomizadas sobre o efeito do RE diante do estresse oxidativo causado pela OVX e o sistema de defesa antioxidante do organismo. Os autores observaram que o ranelato de estrôncio apresenta efeito preventivo sobre o estresse oxidativo durante o tratamento da osteoporose pós-menopausa por eliminar radicais livres resultantes da peroxidação lipídica causada pela ovariectomia e por induzir atividades de enzimas antioxidantes. O Estrôncio, assim como o próprio Cálcio, ativam o Receptor Sensível ao Cálcio (CaSR) (27), resultando na ativação da produção de IP3 e sinalização de 29 Proteína Kinase Mitógena (MAPK). Isso sugere que o RE pode atuar através de CaSR, ativando a replicação de células osteoblásticas (36). Outro mecanismo de ação do RE, sugerido por Marie (2007) (36), é aquele em que o agente aumenta a produção de Prostaglandinas E2 (PGE2) em osteoblastos. A PGE2 está envolvida na cicatrização de fraturas por estimular a síntese de proteínas colágenas e não colágenas do tecido ósseo. Segundo Chen, Li & Yang (2013) (37), o duplo efeito do Ranelato de Estrôncio se deve ao fato de que a droga regula a expressão do Ligante do Receptor de Fator Ativador Kappa B (RANKL) e Osteoprotegerina (OPG). O RANKL é um membro da superfamília do Fator de Necrose Tumoral (TNF) produzido por préosteoblastos e osteoblastos que ativa seu receptor RANK expresso por préosteoclastos e osteoblastos. Isto resulta na ativação de vias sinalizadoras que promovem a formação e diferenciação de osteoclastos maduros e aumenta sua sobrevivência. A OPG é uma proteína solúvel produzida por osteoblastos e seus precursores e atua como um falso-receptor para RANKL, inibindo assim, a osteoclastogênese induzida por esse ligante. A taxa entre RANKL/OPG é essencial para controlar a osteoclastogênese e a reabsorção óssea. A eficácia de RE em aumentar a DMO e reduzir riscos de fraturas vertebrais e não-vertebrais em mulheres osteoporóticas no período pós-menopausa tem sido provada por vários estudos (27). A deficiência estrogênica apresentada por mulheres na pós-menopausa induz um aumento da taxa RANKL/OPG, o que gera a reabsorção acelerada e perda de massa óssea, características dessa fase. Testes in vitro com células osteoblásticas primárias humanas mostram que o Ranelato de Estrôncio regula para baixo a expressão de RANKL e aumenta a OPG, reduzindo a taxa RANKL/OPG (36). Pouco se sabe a respeito do efeito das drogas anti-osteoporóticas sobre o reparo ósseo em fraturas, porém estudos recentes têm demonstrado que, devido à dupla ação do RE sobre o turnover ósseo com sua ação antirreabsortiva e efeito anabólico esse agente pode contribuir clinicamente na indução da cura de fraturas em humanos. Porém, essa ação parece estar presente somente naquelas condições 30 em que o reparo ósseo está prejudicado e não em condições fisiológicas normais (20). 31 3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 LOCAL E GRUPOS DE ESTUDO Este trabalho foi previamente analisado e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Sagrado Coração, Bauru/SP, sob o protocolo nº 228/11 (Anexo 1). Foram utilizadas neste estudo 108 ratas adultas Wistar (Rattus norvegicus), com peso corporal médio de 250g e 90 dias de idade, obtidas do Biotério da USC, Universidade Sagrado Coração. Durante o período experimental, foram mantidas em caixas plásticas, alimentadas com água e ração ad libtum, num ambiente de temperatura e luz controladas (ciclo de 12 horas). Os animais foram aleatoriamente distribuídos em 6 grupos experimentais de 18 animais cada, descritos a seguir: 1) OVX/ALD –foram submetidos à cirurgia de ovariectomia e receberam tratamento com Alendronato de Sódio 2) OVX/RE - foram submetidos à cirurgia de ovariectomia e receberam tratamento com Ranelato de Estrôncio 3) OVX/NaCl - foram submetidos à cirurgia de ovariectomia e receberam tratamento com com NaCl 4) SHAM OVX/ALD –foram submetidos à cirurgia fictícia de ovariectomia (sem remoção dos ovários) e receberam tratamento com Alendronato de Sódio 5) SHAM OVX/RE - foram submetidos à cirurgia fictícia de ovariectomia (sem remoção dos ovários) e receberam tratamento com Ranelato de Estrôncio 6) SHAM OVX/NaCl – foram submetidos à cirurgia fictícia de ovariectomia (sem remoção dos ovários) e receberam tratamento com NaCl. O grupo OVX/NaCl corresponde ao grupo de animais com deficiência estrogênica e sem tratamento e o grupo SHAM OVX/NaCl, ao grupo normal, com produção estrogênica normal. 32 3.2 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL Conforme Figura 4, os animais dos grupos OVX foram submetidos à ovariectomia e foram preservados por 60 dias. A seguir, todos os animais foram tratados com a droga respectiva ao grupo, por via oral, e esse tratamento se estendeu até a data da eutanásia. Trinta dias após o início do tratamento, um defeito ósseo circular de 5mm de diâmetro foi efetuado cirurgicamente na calvária dos animais. Após 7, 15 e 45 dias, os animais foram submetidos à eutanásia e as peças das calotas cranianas removidas para análises histológicas e radiológicas. Figura 4- Delineamento experimental 33 3.3 PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS 3.3.1 Anestesia e Antissepsia Para a realização dos procedimentos cirúrgicos, os animais foram sedados com administração de relaxante muscular por via intramuscular (IM) de cloridrato de xilazina (Rompum®-Bayer, São Paulo, SP, Brasil) na dose de 13mg/kg de peso corpóreo, seguido da administração intramuscular do anestésico cloridrato de Ketamina (Dopalen® – Vetbrands, Jacareí, SP, Brasil) com dosagem de 87mg/kg de peso corpóreo. Após o início de ação da sedação foram realizados os procedimentos de tricotomia e antissepsia na região a ser operada com PVPI (polivinilpirrolidona – RIODEINE ®, Rioquímica, São José do Rio Preto, SP, Brasil) conforme Figura 5 A. 3.3.2 Ovariectomia e Cirurgia SHAM Na sequência, após anestesia e tricotomia, nos animais do grupo OVX, foram realizadas incisões bilaterais de aproximadamente 1,0cm de extensão na região dorsolateral nas camadas superiores da pele e na camada muscular Utilizando lâmina de bisturi nº 15 acoplado ao cabo nº3. As tubas uterinas foram localizadas e ligadas com fio de sutura reabsorvível ( Vicryl 4-0®, Polyglactin 910/Ethicon Inc., Johnson & Johnson, São Paulo, SP, Brasil) (Figura 5C) para contenção de hemorragia. Os ovários foram expostos com auxílio de pinça (Figura 5B) e em seguida removidos (Figura 5D). As trompas foram recolocadas na cavidade abdominal e, na sequência, a sutura foi realizada por planos com fio de seda (Seda 4-0®, Johnson & Johnson, São Paulo, SP, Brasil). Nos grupos SHAM foram realizados os mesmos procedimentos até a localização dos ovários, os quais foram expostos e recolocados em suas posições originais e as camadas de tecidos suturadas, simulando o estresse cirúrgico. 34 Após as cirurgias, os animais receberam, por via intramuscular, uma dose única de Enrofloxacino (Flotril® 2,5% - Schering-Plough, São Paulo, SP, Brasil) 10,0 mg/kg de peso corpóreo e Dipirona Sódica (D-500® - Fort Dodge, Campinas, SP, Brasil) na dose de 150,0 mg/kg, para prevenção de infecções e analgesia pósoperatória, respectivamente. Figura 5 - Cirurgia de Ovariectomia. (A) Antissepsia da área cirúrgica; (B) Incisão e localização de tuba uterina e ovário; (C) Ligadura da tuba uterina e (D) Ovário removido. 3.3.3 Comprovação do ciclo estral A constatação do ciclo estral foi realizada por meio de esfregaços vaginais. O material foi coletado com auxílio de uma micropipeta semi-automática de 20µL e solução de NaCl 0,9%. Primeiramente foi introduzido um volume de 20µL da solução salina no canal vaginal das ratas e aspirado em seguida, como um movimento de 35 lavagem. Após a coleta o material foi transferido para lâminas histológicas, espalhados e protegidos com lamínula de vidro e analisadas em microscópio óptico em objetiva de 40x. A análise foi fundamentada no tipo e quantidade de células epiteliais descamadas e infiltração de leucócitos. No período que antecedeu as ovariectomias, o ciclo estral foi analisado por 5 dias consecutivos para verificar se as ratas estavam com seus ciclos regulares. Decorridos 60 dias da ovariectomia foram coletados novos esfregaços vaginais para confirmação de que a remoção dos ovários havia sido bem sucedida. Todas as ratas apresentaram-se na fase Diestro do ciclo estral (Figura 6). Figura 6- Lâmina de esfregaço vaginal. Fase Cíclica do período Diestro do Ciclo Estral comprovada pela presença predominante de leucócitos (Aumento 40x). 3.3.4 Tratamento Após um período de 60 dias da ovariectomia ou cirurgia SHAM teve início o tratamento dos animais por via oral, através de gavagem com agulha IC-810 (INSIGHT EQUIPAMENTOS, Ribeirão Preto, SP, Brasil). Os animais dos grupos OVX/ALD e SHAM OVX/ALD receberam o medicamento Alendronato de Sódio (Purifarma®, São Paulo, SP, Brasil) na dose de 0,2mg/kg/dia, os grupos OVX/RE e SHAM OVX/RE receberam 625mg/kg/dia de Ranelato de Estrôncio (PROTOS®, 36 Laboratórios Servier do Brasil Ltda, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) e os grupos OVX/NaCl e SHAM OVX/NaCl receberam 0,3 mL da solução de NaCl 0,9% . 3.3.5 Técnica cirúrgica – Craniotomia Decorridos 30 dias de tratamento com as respectivas drogas, os animais foram submetidos à cirurgia de craniotomia para a confecção do defeito. Os animais foram sedados com administração de relaxante muscular por via intramuscular (IM) de cloridrato de xilazina (Rompum®-Bayer, São Paulo, SP, Brasil) na dose de 13mg/kg de peso corpóreo, seguido da administração intramuscular do anestésico cloridrato de Ketamina (Dopalen® – Vetbrands, Jacareí, SP, Brasil) com dosagem de 87mg/kg de peso corpóreo. Na sequência passaram por tricotomia da área da calota craniana e a antissepsia realizada com PVPI. A área a ser operada foi isolada com campos cirúrgicos estéreis, uma incisão de aproximadamente 2,0 cm foi realizada na pele e periósteo (Figura 7A), estendendo da região occipital até a região fronto-nasal com uso de lâmina de bisturi nº 15, montada em cabo de bisturi nº 3 Bard-Parker e o periósteo descolado com o uso de um sindesmótomo com exposição da calota craniana. Com o auxílio de uma broca trefina (Neodent ® , Curitiba, PR, Brasil) (Figura 7B), montada em contra-ângulo NSK (Palhoça, SC, Brasil) acoplado em micromotor elétrico D Force 1000 (DentFlex®, Ribeirão Preto, SP, Brasil) com velocidade de 1.200 rpm, foi confeccionado um defeito ósseo circular de 5mm de diâmetro (Figura 7C), no lado esquerdo do osso parietal, adjacente à sutura parietal, sob constante e abundante irrigação com solução de NaCl 0,9% estéril para evitar necrose óssea. Em seguida, foi realizada a sutura por planos, primeiramente do periósteo sobre o defeito com fio de sutura reabsorvível ( Vicryl 4-0®, Polyglactin 910/Ethicon Inc., New Brunswick, New Jersey, EUA), seguida pela sutura da pele com fio de seda (Seda 4-0®, Johnson & Johnson New Brunswick, New Jersey, EUA) (Figura 7D). 37 Figura 7- Cirurgia de Craniotomia: Confecção do defeito ósseo. (A) Incisão; (B) Confecção do defeito com Broca Trefina de 5mm; (C) Defeito de 5mm de diâmetro e (D) Sutura do corte cirúrgico Após os procedimentos cirúrgicos, como profilaxia antimicrobiana, os animais receberam uma dose de Enrofloxacino (Flotril® 2,5% - Schering-Plough, São Paulo, SP, Brasil), equivalente a 10,0 mg/kg de peso corpóreo por via intramuscular e Dipirona Sódica (D-500® - Fort Dodge, Campinas, SP, Brasil) na dose de 150,0 mg/Kg. 3.4. PREPARO DAS PEÇAS E FORMA DE ANÁLISE DOS RESULTADOS Os animais foram submetidos à eutanásia por meio de sobredosagem de anestésico Ketamina e as peças coletadas com auxílio de disco de Carborundum (Figura 8) acoplado a um micromotor cirúrgico, após 7, 15 e 45 dias da confecção do defeito. Subsequentemente, as peças foram fixadas em formol a 10% por 48 horas 38 para serem analisadas macroscopicamente, radiografadas e os confeccionados cortes histológicos. Figura 8- Remoção da região do defeito ósseo. 3.4.1. Análise Macroscópica Os espécimes foram analisados macroscopicamente em suas dimensões, coloração e fotografados em lente de aproximação. 3.4.2 Análise Radiográfica As peças foram teleradiografadas em equipamento de Raio-X Digital Panorâmico Cranex-D (Sorodex, Finlândia) com receptor digital de imagem CCD e com tamanho de pixel 96 micrômetros, com os seguintes parâmetros: Ponto focal=0,5mm; Filtro=2,7mm Al; Potencial de Operação do tubo para Telerradiografia: 66kVp e 10mA. Os resultados foram obtidos com base na análise qualitativa das imagens radiográficas. 39 3.4.3 Análise Histológica Inicialmente as peças foram fixadas em formol a 10% por 48 horas, seguida de descalcificação usando EDTA18% (ácido etilenodiaminotetracético) e incluídas em parafina. Os cortes microscópicos foram obtidos no sentido longitudinal com seis micrômetros de espessura e corados pelo método de Tricrômico de Masson, analisados e descritos em todas as suas peculiaridades. Foram selecionados e fotografados os dados mais relevantes, no próprio microscópio, para a competente comprovação. (Figura 9). Figura 9 –Peça encaminhada para análise histológica. As lâminas foram observadas no fotomicroscópio Nikon Eclipse 80i, acoplado a um analisador de imagens (Image Pró-Plus® 5.1). Todas as imagens foram salvas para posterior análise cuidadosa de todas as estruturas e tecidos presentes, observando-se principalmente a neoformação óssea. Imagens panorâmicas foram capturadas com aumento de 2x. 3.4.4 Histomorfometria Os cortes microscópicos corados pelo método Tricrômico de Masson referentes a cada grupo e período de estudo foram submetidas à Histomorfometria. 40 A análise mensurou o tecido ósseo neoformado e tecido conjuntivo presentes na região do defeito através do programa ImageJ (NIH- National Institute of Health). Foi avaliado 1 corte, sendo o mais representativo de cada grupo, sendo que para cada corte foram analisadas 3 regiões, bordas direita e esquerda e centro do defeito com ampliação de 20x. 3.4.5 Análise Estatística Na análise dos resultados foi considerada a seguinte proporção de tecido ósseo: % Ó = % ó á ∗ 100 Sendo que a área total é a soma de todos os tecidos considerados (tecido ósseo e conjuntivo). Os resultados da histomorfometria foram avaliados estatisticamente pelo teste de normalidade (Shapiro-Wilk) e após a confirmação da normalidade foram submetidos aos testes ANOVA e Tukey pos hoc, através do programa BioEstat 5.3. As diferenças das médias foram estatisticamente significativas quando P<0,05. 41 4 RESULTADOS 4.1 ANÁLISE MACROSCÓPICA Os animais foram diariamente observados clinicamente, principalmente as áreas cirúrgicas e proximidades com o objetivo de identificar sinais de infecção. As peças foram analisadas quanto á sua coloração e morfologia e não foi observada nenhuma alteração compatível com necrose ou processo infeccioso, sendo todas consideradas normais para as demais análises. 4.2 ANÁLISE RADIOGRÁFICA A Figura 10(A), (B), (C), (D), (E) e (F) mostram as radiografias dos grupos SHAM/NaCl e OVX/NaCl, nos períodos de 7, 15 e 45 dias após a indução do defeito. Em A e B (7 dias) é possível observar áreas radiolúcidas, ou seja , sem formação de tecido ósseo. No período de 15 dias, representado pela Figura 10(C) e (D) observase pequenas diferenças na neoformação óssea no grupo SHAM/NaCl e OVX/NaCl, sendo que nas bordas do defeito em (D) referente a OVX/NaCl, observa-se menor densidade radiopaca que em (C), compatível com início de formação de tecido ósseo. Na Figura 10(E) e (F) estão representados os grupos com período de 45 dias após osteotomia. Em (E) é possível notar área de bem maior radiopacidade que em (F), ou seja, houve maior neoformação óssea no grupo SHAM do que no grupo OVX. A Figura 10(G), (H), (I), (J), (K) e (L) mostram as radiografias dos grupos SHAM/RE e OVX/RE, aos 7, 15 e 45 dias após a indução do defeito. Nas imagens (G) e (H) referente ao período de 7 dias nota-se áreas radiolúcidas, ou seja, sem formação de tecido ósseo. Nas radiografias (I) e (J) referentes ao período de 15 dias é possível observar áreas com discreta radiopacidade compatível com início de neoformação óssea, porém em SHAM (I) a evidência é maior. No período de 45 dias, representado pela Figura 10(K) e (L) foram observadas pequenas diferenças na neoformação óssea entre os grupos SHAM/RE (K) e OVX/RE (L). Na região do 42 defeito em (L) observa-se maior densidade radiopaca que em (K), compatível com formação de tecido ósseo. Na Figura 10(M), (N), (O), (P), (Q) e (R) estão representadas as radiografias dos grupos ALD/SHAM e ALD/OVX nos períodos de 7, 15 e 45 dias. Em (M) e (N) são observadas regiões radiolúcidas condizente com ausência de tecido ósseo. No período de 15 dias, representado por (O) e (P), observa-se maior radiopacidade em (O), grupo SHAM/ALD compatível com neoformação óssea maior que no grupo OVX/ALD. Aos 45 dias (Q) e (R), nota-se que também houve maior neoformação óssea em SHAM/ALD (Q) do que em OVX/ALD (R). Figura 10 - Telerradiografias dos defeitos ósseos após tratamento e respectivos períodos. A, B, C, D, E e F grupo NaCl, sendo A e B (7dias), C e D (15 dias) e E e F (45 dias); A,C e E grupo SHAM e B,D e F grupo OVX. G,H, I, J, K e L grupo Ranelato de Estrôncio, sendo G e H (7 dias), I e J (15 dias) e K e L (45 dias); G, I e K grupo SHAM e H, J e L grupo OVX. M, N, O, P, Q e R grupo Alendronato de Sódio, sendo M e N (7 dias), O e P (15 dias) e Q e R (45 dias); M, O e Q grupo SHAM e N, P e R grupo OVX. 43 4.3. ANÁLISE HISTOLÓGICA 4.3.1 Grupo NaCl SHAM e OVX A Figura 11 mostra as fotomicrografias relativas ao tratamento com NaCl. No período de 7 dias no grupo SHAM/NaCl observa-se a presença de coágulo sanguíneo preenchendo toda extensão do defeito (A) e a presença de tecido ósseo lamelar remanescente (OR). Em maior aumento (B) é possível verificar o coágulo em diferenciação (coloração vermelha) e a formação inicial de tecido conjuntivo (coloração azulada). No grupo OVX/NaCl também nota-se a presença de coágulo sanguíneo em toda a extensão do defeito (C) e em maior aumento observa-se o coágulo sanguíneo em diferenciação (D). No período de 15 dias, o grupo Sham/NaCl apresenta início de neoformação óssea partindo da borda do defeito em direção ao centro e uma trabécula óssea mais ao centro (em destaque). Em (F) imagem em maior aumento da trabécula óssea neoformada revestida em sua porção superior por uma estreita faixa de tecido conjuntivo contendo uma rima de osteoblastos. No grupo OVX/NaCl (G) observa-se a presença de trabéculas ósseas sendo formadas partindo da borda do defeito para o centro e tecido conjuntivo preenchendo a grande região central do defeito. Na imagem de maior aumento (H) destaque para as trabéculas ósseas neoformadas, permeadas por osteócitos, e regiões de tecido conjuntivo em diferenciação. No período de 45 dias do grupo NaCl (Sham e OVX) todo o coágulo sanguíneo fora diferenciado e substituído (I) e (K) por tecido conjuntivo e tecido ósseo neoformado. No grupo Sham/NaCl é possível notar a presença de tecido ósseo neoformado e tecido conjuntivo na região central do defeito (I). Em (J), aumento maior destaca osso lamelar formado no centro do defeito e na base inferior uma camada de tecido conjuntivo permeado por osteoblastos ativos. No grupo OVX/NaCl observa-se tecido ósseo neoformado na borda em direção ao centro e tecido conjuntivo em diferenciação preenchendo toda a extensão do defeito induzido (K). Em maior aumento (L) tecido ósseo lamelar e presença de osteócitos em grande número. 44 Figura 11 – Imagens Histológicas do Grupo NaCl. Período de 7 dias: grupo Sham (A) e (B); grupo OVX (C) e (D). Período de 15 dias: grupo Sham (E) e (F); grupo OVX (G) e (H). Período de 45 dias: grupo Sham (I) e (J); grupo OVX (K) e (L). Em (A), (C), (E), (G), (I) e (K), Tricrômico de Masson, Aumento 2x. Em (B), (D), (F), (H), (J) e (L), Tricrômico de Masson, Aumento 40x. 45 4.3.2 Grupo Ranelato de Estrôncio SHAM e OVX A Figura 12 mostra as fotomicrografias relativas ao tratamento com Ranelato de Estrôncio. No período de 7 dias nos grupos SHAM (A) e OVX/RE (C) nota-se a presença de coágulo sanguíneo (B) preenchendo a extensão do defeito, porém no grupo OVX nota-se, na imagem em maior aumento (D), a diferenciação do coágulo em tecido conjuntivo. No período de 15 dias observa-se a ausência de coágulo sanguíneo no interior do defeito e preenchimento da região central por tecido conjuntivo (E, G). Nota-se, ainda, a formação de osso trabecular na borda do defeito em direção ao centro. No grupo SHAM em maior aumento (F) é possível verificar trabéculas ósseas neoformadas e grande número de osteócitos, envoltas por tecido conjuntivo ricamente permeado por células ósseas em diferenciação. Em (H) nota-se trabéculas ósseas circundadas por osteoblastos ativos e tecido conjuntivo em diferenciação. No período de 45 dias no grupo SHAM (I) nota-se a presença de grande quantidade de tecido ósseo sendo formado da borda para o centro do defeito. Em maior aumento (J) observa-se tecido ósseo neoformado permeado por osteócitos e porção de osso remanescente (OR). No grupo OVX (K) verifica-se também a neoformação óssea das bordas para o centro, em menor proporção que no grupo SHAM. Em (L), imagem em maior aumento destacando tecido ósseo neoformado, pavimentado por numerosos osteócitos. 46 Figura 12- Imagens Histológicas do Grupo Ranelato de EstrôncioPeríodo de 7 dias: (A) e (B) grupo SHAM; (C) e (D) grupo OVX. Período de 15 dias: (E) e (F) grupo SHAM; (G) e (H) grupo OVX. Período de 45 dias: (I) e (J) grupo SHAM; (K) e (L) grupo OVX. (Tricrômico de Masson. Em (A), (C), (E), (G), (I) e (K) Aumento 2x. Em (B), (D), (F), (H), (J) e (L), Aumento 40x). 47 4.3.3 Grupo Alendronato de Sódio SHAM e OVX A figura 13 mostra as fotomicrografias dos grupos tratados com Alendronato de Sódio. No período de 7 dias do grupo SHAM/ALD verifica-se a presença de coágulo preenchendo a área do defeito (A) e em maior aumento, destaque para o coágulo sanguíneo iniciando diferenciação em tecido conjuntivo. No grupo OVX/ ALD nota-se a presença de coágulo sanguíneo diferenciando-se em tecido conjuntivo (C). Em (D) imagem em maior aumento destacando coágulo sanguíneo com início de formação de fibras de tecido conjuntivo. No período de 15 dias do grupo SHAM/ALD é possível verificar a presença de tecido ósseo sendo formado na margem do defeito e tecido conjuntivo preenchendo toda a região central (E). Em maior aumento (F) área com formação de trabéculas ósseas em destaque e grande número de osteócitos e tecido conjuntivo em diferenciação. Em (G) o grupo OVX também apresenta formação de trabéculas ósseas na borda do defeito em menor proporção que no grupo SHAM. Em (H) presença de tecido conjuntivo permeado por células ósseas e grande número de osteócitos nas trabéculas. No período de 45 dias do grupo SHAM/ALD 45 dias observa-se a presença de tecido ósseo lamelar preenchendo toda a extensão do defeito criado (I). Imagem em aumento maior (J) destacando área com formação óssea e grande número de osteócitos envolta por tecido conjuntivo permeado por osteoblastos ativos. No grupo OVX/ALD verifica-se a formação de osso lamelar formado na borda esquerda do defeito (K), em menor proporção que no grupo SHAM no mesmo período e ainda a presença de tecido conjuntivo no centro do defeito. Em maior aumento (L) observase tecido ósseo lamelar permeado por osteócitos. 48 Figura 13 - Imagens Histológicas do Grupo Alendronato de Sódio.Período de 7 dias: (A) e (B) grupo SHAM; (C) e (D) grupo OVX. Período de 15 dias: (E) e (F) grupo SHAM; (G) e (H) grupo OVX. Período de 45 dias: (I) e (J) grupo SHAM; (K) e (L) grupo OVX. (Tricrômico de Masson. Em (A), (C), (E), (G), (I) e (K) Aumento 2x. Em (B), (D), (F), (H), (J) e (L), Aumento 40x). 49 4.4 HISTOMORFOMETRIA E ANÁLISE ESTATÍSTICA A Tabela 1 mostra os resultados da histomorfometria do tecido ósseo neoformado e tecido conjuntivo nas bordas e centro do defeito, após período 15 dias e de acordo com o tratamento tanto em ratas do grupo SHAM como do grupo OVX. Nos grupos SHAM/ALD e SHAM/RE houve maior neoformação óssea quando comparado ao grupo SHAM/NaCl mostrando que ambas as drogas possuem efeito positivo no reparo ósseo em indivíduos com metabolismo ósseo normal. Diferença semelhante foi apresentada pelos grupos OVX/ALD e OVX/RE comparados ao grupo OVX/NaCl, confirmando os efeitos das drogas sobre o reparo ósseo em ratas com deficiência estrogênica. Ao comparar os efeitos das duas drogas, tanto os animais OVX quanto os pertencentes aos grupos SHAM verifica-se uma diferença significativa na neoformação óssea no grupo tratado com RE sobre o grupo tratado com ALD. Tabela 1 Valor médio e desvio-padrão de tecido ósseo e tecido conjuntivo referente ao período de 15 dias %TO Borda %TC Borda %TO Centro % TC Centro SHAM NaCl 33.4 ± 3.9 66.6 ± 3.9 46.7 ± 3.0 53.3 ± 3.0 OVX NaCl 28.9 ± 0.0 71.1 ± 0.0 0.0 ± 0.0 100.0 ± 0.0 SHAM ALD 53.5 ± 0.2 46.5 ± 0.2 0.0 ± 0.0 100.0 ± 0.0 OVX ALD 48.9 ± 10.4 51.1 ± 10.4 9.5 ± 8.7 90.5 ± 8.7 SHAM RE 76.2 ± 5.7 23.8 ± 5.7 25.3 ± 14.3 74.7 ± 14.3 OVX RE 70.7 ± 8.6 29.3 ± 8.6 7.2 ± 10.2 92.8 ± 10.2 50 A Tabela 2 mostra os resultados de histomorfometria do tecido ósseo neoformado e tecido conjuntivo nas bordas e centro do defeito, após 45 dias e com o respectivo tratamento realizado em ratas do grupo SHAM e do grupo OVX. Nesse período de tratamento houve maior formação óssea nos grupos SHAM/ALD e SHAM/RE, quando comparados ao grupo sem tratamento (SHAM/NaCl). Também encontramos diferença significante ao compararmos os grupos OVX/ALD e OVX/RE com o grupo OVX/NaCl. Tais resultados mostram o efeito positivo das duas drogas tanto sobre o reparo ósseo em ratas com metabolismo ósseo normal quanto em ratas com depleção estrogênica. Comparando os efeitos do ALD e do RE não houve diferença significativa na neoformação óssea tanto nos animais OVX quanto nos pertencentes aos grupos SHAM. Tabela 2 Valor médio e desvio-padrão de tecido ósseo e tecido conjuntivo referente ao período de 45 dias %TO Borda %TC Borda %TO Centro % TC Centro SHAM NaCl 69.1 ± 0.3 30.9 ± 0.3 16,7 ± 40,8 83.3 ± 40.8 OVX NaCl 60.9 ± 7.1 39.1 ± 7.1 0.0 ± 0.0 100.0 ± 0.0 SHAM ALD 84.4 ± 10.8 15.6 ± 10.8 53.4 ± 7.0 46.6 ± 7.0 OVX ALD 81.9 ± 10.1 18.1 ± 10.1 32.1 ± 32.5 67.9 ± 32.5 SHAM RE 83.6 ± 7.4 16.4 ± 7.4 4.3 ± 7.4 95.7 ± 7.4 OVX RE 82.7 ± 4.9 17.3 ± 4.9 2.5 ± 5.8 97.5 ± 5.8 A Figura 14 representa o percentual de tecido ósseo neoformado nas bordas e centro do defeito referente aos períodos de 15 e 45 dias de acordo com o tratamento nos grupos SHAM e OVX. Houve diferença estatística na neoformação óssea na borda do defeito entre os grupos OVX/NaCl e OVX/ALD e OVX/RE no período de 45 dias. 51 100 15 dias 45 dias Tecido Ósseo Borda (%) 80 60 40 20 0 SHAM NaCl OVX NaCl SHAM ALD OVX ALD SHAM RE OVX RE (A) 100 15 d 45d % Tecido Ósseo no Centro 80 60 40 20 0 SHAM NaCl OVX NaCl SHAM ALD OVX ALD SHAM RE OVX RE (B) Figura 14 -Histomorfometria do tecido ósseo nos períodos de 15 e 45 dias. (A) Borda do defeito. (B) Centro do defeito. 52 Os resultados apresentaram normalidade (Shapiro-Wilk), com isso, procedeuse o teste ANOVA e Tukey para comparação entre todos os resultados. As diferenças estatísticas significantes estão mostradas nas figuras 15 e 16. A Figura 15 mostra os resultados do período de 15 dias e a Figura 16 do período de 45 dias. 100 90 (b) Tecido Ósseo Borda (%) 80 70 (b) (c) (c) 60 50 40 (a) (a) 30 20 10 0 SHAM NaCl OVX NaCl SHAM ALD OVX ALD SHAM RE OVX RE (A) 100 90 Tecido Ósseo Centro (%) 80 70 60 (a) 50 (b) 40 30 (b) 20 10 (b) (b) (b) 0 SHAM NaCl OVX NaCl SHAM ALD OVX ALD SHAM RE OVX RE (B) Figura 15- Histomorfometria do tecido ósseo do período de 15 dias. (A) Borda do defeito. (B) Centro do defeito. Letras diferentes e setas indicam diferença estatisticamente significante (p<0.05, ANOVA, Tukey) 53 100 (b) (b) (b) (b) Tecido Ósseo Borda(%) 80 (a) (a) 60 40 20 0 SHAM NaCl OVX NaCl SHAM ALD OVX ALD SHAM RE OVX RE (A) 100 % Tec Ósseo Centro 80 (b) 60 40 (b) (a) 20 (a) (a) (a) 0 SHAM NaCl OVX NaCl SHAM ALD OVX ALD SHAM RE OVX RE (B) Figura 16- Histomorfometria do tecido ósseo do período de 45 dias. (A) Borda do feito. (B) Centro do defeito. Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante (p<0.05, ANOVA, Tukey) 54 5 DISCUSSÃO A perda óssea induzida por ovariectomia em ratas tem sido frequentemente empregada como modelo de osteoporose pós-menopausa e é considerado de grande importância clínica para estas condições em humanos, pois simula o comportamento ósseo ocorrido durante a fase pós-menopausa em humanos (16). O FDA Guidelines (38) recomenda esse modelo em estudos que avaliam os efeitos de agentes preventivos da osteoporose resultante da deficiência estrogênica. O modelo é também empregado em estudos sobre a ação de drogas no tratamento da osteoporose (16). Na fase pós-menopausa o metabolismo ósseo se apresenta acelerado, com desequilíbrio favorável à reabsorção, em decorrência da deficiência estrogênica, e consequentemente a perda óssea em ossos longos e vértebras e em todo o sistema esquelético feminino (39). Neste trabalho foi utilizado, além da ovariectomia em ratas, o modelo de defeitos ósseos por ostectomia na calvária dos animais que tem sido amplamente utilizado para estudo do reparo ósseo, pois, ao contrário das fraturas, este modelo está menos sujeito aos fatores mecânicos e às obstruções no suprimento sanguíneo, possibilitando avaliações sobre a influência de medidas cirúrgicas e farmacológicas no reparo ósseo (22). O objetivo deste trabalho foi analisar a influência de drogas supressoras da perda óssea, Alendronato de Sódio e Ranelato de Estrôncio, sobre o reparo ósseo em animais normais e em animais em que há uma desordem do metabolismo ósseo, como é o caso de mulheres que se encontram no período pós-menopausa, onde a deficiência estrogênica tem como consequência a osteoporose. Poucos estudos comparativos tem sido realizados sobre o efeito de Alendronato de Sódio e Ranelato de Estrôncio em pacientes osteoporóticos e em animais (40). 55 Ambas as drogas apresentam capacidade em reduzir os índices de fraturas em pacientes osteoporóticos em grandes estudos clínicos e são indicadas mundialmente para tratamento da osteoporose. Enquanto os BPs preservam o volume trabecular e microarquitetura óssea, e consequentemente , a força óssea, o RE tem despertado grande interesse devido a sua potente dupla funcionalidade, ou seja, capacidade de formação óssea associada à ação antirreabsortiva. Quando administrados por via oral, os bisfosfonatos podem causar irritação no esôfago. Recomenda-se a ingestão de bisfosfonatos com um copo cheio de água pura ao se levantar pela manhã, devendo o paciente permanecer em pé por cerca de pelo menos 30 minutos após deglutição do comprimido e descontinuar seu uso tão logo se manifestem os sintomas esofágicos. No entanto, a presença de alimentos causa acentuada redução da absorção dos bisfosfonatos, devendo-se também manter o mesmo intervalo de tempo até a primeira alimentação diária (25). Apesar de os BPs bloquearem a reabsorção óssea de forma efetiva acabam por interferir na fase subsequente associada aos osteoblastos reduzindo a formação óssea em até 50%, em tratamentos longos. Por outro lado, estudos revelam que o RE aumenta função osteoblástica na remodelação e na neoformação óssea (40). O uso excessivo ou prolongado de bisfosfonatos, acima de 3 anos, pode causar supressão da remodelação óssea e acúmulo de micro danos e, portanto aumentar a fragilidade óssea, levando a fraturas atípicas de pelve e de ossos longos (41). Em caso relatado pelos autores, a paciente apresentou nível normal baixo de marcadores de turnover ósseo, correlacionando com baixa taxa de formação óssea mostrada em análise histomorfométrica, o que é tipicamente observado em fraturas associadas à terapia com bisfosfonatos. Já o aumento da massa óssea produzido pelo RE é mantido mesmo após longos períodos de tratamento, cerca de 8 anos ou mais, o que implica na redução significativa dos riscos de fraturas (35). As drogas que apresentam efeito anticatabólico, como o ALD, reduzem a taxa de remodelação óssea com redução de marcadores de reabsorção, mas também reduzem os marcadores de formação óssea. As drogas anabólicas aumentam a formação óssea e secundariamente levam a um aumento da reabsorção, como por exemplo, o PTH(35). 56 Em estudo realizado por Chen et al (2010)(27) o Alendronato de sódio apresentou efeito superior à Calcitonina sobre a osteointegração de implante de hidroxiapatita em joelho de ratas ovariectomizadas, com aumento da densidade mineral óssea. O mecanismo de ação do Ranelato de Estrôncio é diferente de todas as outras drogas indicadas para tratamento da osteoporose. É considerado como droga de dupla ação, pois induz efeitos opostos, ou seja, aumenta a formação e reduz a reabsorção óssea, agindo sobre osteoblastos e osteoclastos, respectivamente (41). Wu et al (2013) (40) ao comparar grupos de ratas OVX tratadas com Risedronato (bisfosfonato), Risedronato + RE e um grupo tratado somente com RE constatou, através de EPMA (Electron Probe Micro-Analysis) que, apesar do Risedronato preservar a massa óssea e a microarquitetura, quando associado ao RE há uma redução significante na formação de osso remodelado quando comparado ao grupo tratado somente com RE. Os resultados deste trabalho mostram que o tratamento com drogas antirreabsortivas administradas em ratas ovariectomizadas proporciona um aumento significativo sobre a formação de tecido ósseo quando comparadas àquelas que não receberam tratamento. No período de 15 dias (Figuras 15 A e B) o grupo OVX/NaCl apresentou neoformação óssea de 28.9% ± 0.0 nas bordas do defeito , sendo que o grupo OVX/ALD teve 48.9% ± 10.4 e o grupo OVX/RE 70.7% ± 8.6 de osso neoformado. Comparando o efeito das duas drogas sobre a formação óssea, houve maior formação óssea no grupo tratado com RE do que o ALD. Esses resultados mostram o importante potencial de ação do RE na formação óssea de indivíduos em que o metabolismo ósseo possa estar alterado, como na deficiência estrogênica. Além disso, o RE mostrou maior resultado na formação óssea nas ratas normais (SHAM/RE 76.2% ± 5.7) em relação ao grupo não tratado (SHAM/NaCl (33.4% ± 3.9) e também no grupo ALD (SHAM/ALD 53.5% ± 0.2). No período de 45 dias (Figura 16 A e B) houve diferenças significantes na neoformação óssea apresentada pelos grupos SHAM/ALD (84.4% ± 10.8) e SHAM/RE (83.6% ± 7.4) quando comparados ao grupo SHAM/NaCl (69.1% ± 0.3). Porém entre os grupos tratados, não há diferença significativa (p>0.05). Padrão semelhante foi encontrado nos grupos ovariectomizados. Diferença estatisticamente 57 significante foi encontrada entre o resultado do grupo OVX/NaCl (60.9% ± 7.1) em relação aos grupos OVX/ALD (81.9% ± 10.1) e OVX/RE (82.7% ± 4.9). Os resultados indicam que as duas drogas produzem efeitos semelhantes na neoformação óssea tanto em indivíduos com depleção estrogência quanto em indivíduos normais. Os resultados indicam ação positiva do Alendronato de sódio na reparação óssea. Resultados semelhantes foram relatados no estudo realizado por Chen et al (2011) (27) o Alendronato de sódio apresentou efeito superior à Calcitonina sobre a osteointegração de implante de hidroxiapatita em joelho de ratas ovariectomizadas, com aumento da densidade mineral óssea. Jee et al (2010)(42) através de modelo experimental de ratas ovariectomizadas mostrou que o ALD promove reparação óssea e previne a perda óssea alveolar após extração dentária. Conforme já mencionado, o RE reduz a reabsorção óssea e, simultaneamente, aumenta a formação óssea. Esse efeito foi observado nos resultados desse trabalho, uma vez que tanto o grupo SHAM quanto o grupo OVX tratados com RE apresentaram maior formação óssea em relação ao grupo NaCl. Esse resultado está em acordo com outros trabalhos na literatura. Exemplificando, Bain et al (2009)(43) encontrou, através de modelo experimental similar a esse trabalho, prevenção na perda óssea e na deterioração da microarquitetura óssea devido à ovariectomia e aumento na resistência mecânica em animais submetidos ao tratamento com RE. Em relação à reparação óssea, Annemarie Brüel et al (2011) (44) demonstrou que o RE estimula a formação do calo ósseo nos períodos iniciais na reparação em fraturas de tíbia (3 semanas), gerando calo ósseo de maior volume. Similarmente, Li et al (2011) (45) demonstrou que o tratamento com RE otimiza a osteointegração de implantes, pois esse tratamento proporcionou aumento da densidade óssea na região do implante e aumento na área de contato com implante. Os resultados deste trabalho também estão de acordo com Chen et al (2013) (37) que comparou os efeitos das duas drogas sobre animais que foram submetidos a OVX e constatou através de histomorfometria que houve aumento significante na taxa volume ósseo/volume trabecular da região distal do fêmur, quando comparado com o grupo OVX sem tratamento. No mesmo trabalho, não foi observada diferença 58 importante entre os dois fármacos, como evidenciado em nosso trabalho no período de 45 dias. O RE é uma droga que tem demonstrado reduções nos riscos de fraturas por fragilidade, vertebral, não-vertebral e quadril tanto em mulheres quanto em homens, além de oferecer segurança no seu uso e poucos efeitos colaterais. Os efeitos secundários raros e a administração facilitada, realizada à noite ao deitar, facilita a aderência ao tratamento. Assim, o RE pode se indicado como droga de primeira escolha no tratamento da osteoporose. 59 6 CONCLUSÃO Dentro das limitações deste estudo pode-se concluir que o tratamento com drogas antirreabsortivas, Alendronato de Sódio e Ranelato de Estrôncio, aumenta a formação óssea. Adicionalmente, o Ranelato de Estrôncio resulta em ação positiva maior quando comparado ao Alendronato de Sódio, tanto em ratas com metabolismo ósseo normal como naquelas com deficiência estrogênica. 60 REFERÊNCIAS 1. Kalache A. Relatório Global da OMS sobre Prevenção de Quedas na velhice. São Paulo: OMS (2010). 2. Pereira ECS. Longitudinal study of estrogen deficiency on rats.[dissertation]. São José dos Campos. Faculdade de Odontologia, Estadual Paulista; 2011. 3. Kuroda S, Noritake K, Kasugai S. Osteoporosis and Bone Regeneration. Osteoporosis. InTech. 2012;2. 781-802. 4. Lirani-Galvão APR, Lazaretti-Castro M. Physical approach for prevention and treatment of osteoporosis. 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