Expressão da proteína recombinante MSP1

1
UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
ESCOLA DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
CAROLINA LESSA AQUINO
EXPRESSÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE MSP-119 kDa DE Plasmodium falciparum
EM SISTEMA DE BACULOVÍRUS
RIO DE JANEIRO
2009
2
CAROLINA LESSA AQUINO
EXPRESSÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE MSP-119 kDa DE Plasmodium falciparum
EM SISTEMA DE BACULOVÍRUS
Monografia submetida como parte dos
requisitos para obtenção do grau de Bacharel
em Biomedicina, pela Universidade Federal do
Estado do Rio de Janeiro (UNIRIO), na área de
concentração de Microbiologia.
Orientadora científica: Dra. Myrna Cristina
Bonaldo.
Co-orientadora científica: MSc Maria Luiza
Borges Azevedo.
Orientadora acadêmica: Dra. Carmem Soares
de Meirelles Saramago.
RIO DE JANEIRO
2009
3
CAROLINA LESSA AQUINO
EXPRESSÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE MSP-119 kDa DE Plasmodium falciparum
EM SISTEMA DE BACULOVÍRUS
Monografia submetida como parte dos
requisitos para obtenção do grau de Bacharel
em Biomedicina, pela Universidade Federal do
Estado do Rio de Janeiro (UNIRIO), na área de
concentração de Microbiologia.
Orientadora científica: Dra. Myrna Cristina
Bonaldo
Co-orientadora científica: MSc Maria Luiza
Borges Azevedo
Orientadora acadêmica: Dra. Carmem Soares
de Meirelles Saramago
Aprovada em: 29/06/2009
BANCA EXAMINADORA:
___________________________________________________________________________
Dra. Carmem Soares de Meirelles Saramago
Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro
___________________________________________________________________________
Dr. Marcello Xavier Sampaio
Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro
___________________________________________________________________________
Dra. Simone Morais da Costa
Fundação Oswaldo Cruz
4
Aos meus pais, avós e namorado.
5
AGRADECIMENTOS
À Dra. Myrna Cristina Bonaldo, pela orientação e pela oportunidade de participar de sua
equipe.
À MSc Maria Luiza Borges Azevedo, pela orientação, paciência, confiança e amizade.
À
Dra.
Ariane
Leites
Larentes,
do
Laboratório
de
Tecnologia
Recombinante
(BioManguinhos, FIOCRUZ), pela ajuda com a densitometria.
Aos colegas do Laboratório de Biologia Molecular de Flavivírus (Instituto Oswaldo Cruz,
FIOCRUZ), pela receptividade, companhia e momentos de descontração.
Á Dra. Carla Holandino Quaresma e aos amigos do Laboratório Multidisciplinar de Ciências
Farmacêuticas (Departamento de Medicamentos, UFRJ), que também muito contribuíram
para minha formação acadêmica.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, ao Programa de
Desenvolvimento Tecnológico em Insumos para Saúde e à Fundação Oswaldo Cruz, pelo
financiamento do projeto.
À Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro, pela formação que me foi dada e ao seu
corpo docente, pelos conhecimentos passados.
6
Aos meus pais queridos, por acreditarem e investirem em mim, pela confiança, pela
compreensão e pelo amor diário.
Aos meus avós queridos, em especial minha avó Lindalva, também por acreditar e investir em
mim, por todo o carinho e amor.
Ao meu namorado, por todo amor, paciência e compreensão; por ser minha criança grande.
À Aline, minha amiga-irmã, pelas palavras amigas e por estar sempre presente na minha vida.
Aos amigos que encontrei na UNIRIO, por fazerem da faculdade um momento ainda mais
especial.
7
RESUMO
A malária é uma das doenças parasitárias mais sérias do mundo, causada por parasitas do
gênero Plasmodium sp. Os sintomas clínicos ocorrem durante o ciclo eritrocítico do parasito,
que se inicia com a invasão do eritrócito pelo merozoíto. Uma das proteínas envolvidas nesse
processo é proteína de superfície do merozoíto 1 (MSP-1), sendo essa proteína muito estudada
como alvo para desenvolvimento de uma vacina para malária clínica. No momento da
invasão, a MSP-1 sofre duas proteólises resultando num fragmento C-terminal de 19 kDa
(MSP-119 kDa). Estão sendo desenvolvidos, em nosso laboratório, estudos para geração de uma
vacina combinada febre amarela-malária utilizando o vírus da febre amarela vacinal, cepa
17D, como vetor de expressão para MSP-119 kDa. Dessa forma, o objetivo do presente trabalho
foi expressar a proteína MSP-119
kDa
em células de inseto utilizando baculovírus, para sua
posterior utilização em estudos de caracterização desses vírus recombinantes. Foi possível
obter um cassete de expressão da MSP-119
kDa
para sua expressão em células de inseto
utilizando baculovírus. A proteína foi detectada em SDS-PAGE a partir de 48 horas de
infecção. Após 96 horas, a MSP-119 kDa correspondeu a cerca de 12 % da massa protéica total
celular. A proteína será purificada e empregada na obtenção de anti-soros específicos e em
testes com soros de camundongos imunizados com vírus recombinantes FA/MSP-119 kDa.
8
ABSTRACT
Malaria is one of the most serious parasitic disease of the world. It is caused by Plasmodium
sp. parasites. The symptoms occur during the erithrocytic cycle of the parasite that initiate
with erythrocyte invasion by the merozoite. One of the proteins involved in this process is the
merozoite surface protein 1 (MSP-1). For this reason, MSP-1 is one of the most studied target
for the development of a vaccine for clinical malaria. Immediately before invasion, MSP-1
suffers 2 proteolytic processes, resulting in a C-terminus fragment of 19 kDa (MSP-119 kDa).
Our group has been working on the development of a vaccine for both yellow fever (YF) and
malaria through the generation of recombinant flavivirus carrying the MSP-119
kDa
antigen.
Then the aim of this work was to express the recombinant protein MSP-119
kDa
using a
baculovirus expression system. It was possible to detect MSP-119 kDa in insect cells infected
with recombinant baculovirus from 48 hours in SDS-PAGE. At 96 hours of infection,
approximately 12 % of the total cellular proteins corresponded to MSP-119 kDa. The MSP-119
kDa
will be purified and used in immunologic assays with the serum of YF/MSP-119
immunized mice.
kDa
–
9
ABREVIATURAS
AcMNPV
Autographa californica “Multiple Nuclear Polihedrosis Virus”
DNA do inglês, “Desoxyribonucleic Acid”
DO
Densidade óptica
E
Proteína do Envelope
ECV do inglês, “Extracellular Viruses”
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
EGF
do inglês, “Epidermal Growth Factor”
EGFP do inglês, “Enhanced Green Fluorescent Protein”
FA 17D
Vírus da Febre Amarela cepa 17D
GPI
Glicosilfosfatidilinositol
GV
do inglês, “Granulosis Viruses”
ICTVdB
LB
do inglês, “International Committee on Taxonomy of Viruses Database”
Luria-Bertani
MNPV do inglês, “Multiple Nuclear Polihedrosis Viruses”
M.O.I. do inglês, “Multiplicity of Infection”
MSP do inglês, “Merozoite Surface Protein”
10
MSP-119 kDa
Proteína de superfície do merozoíto 1 domínio 19 kDa
NPV do inglês, “Nuclear Polihedrosis Viruses”
NS1
do inglês, “Non-structural Protein”
OMS Organização Mundial de Saúde
pb
Pares de base
PCR
do inglês, “Polimerase Chain Reaction”
PPM Padrão de peso molecular
RE
Retículo Endoplasmático
RNM Ressonância Nuclear Magnética
SAP
do inglês, “Shrimp Alcaline Phosphatase”
SDS
Dodecil Sulfato de Sódio
SDS-PAGE
Sf
do inglês, SDS “Polyacrylamide Gel Electrophoresis”
Spodoptera frugiperda
SNPV do inglês, “Single Nuclear Polihedrosis Viruses”
TAE
Tampão Tris-Acetato-EDTA
TE
Tampão Tris-EDTA
TEV
do inglês, “Tobacco Etch Virus”
tPA
do inglês, “Human Tissue Plasminogen Activator”
11
SUMÁRIO
1 Introdução ................................................................................................................................... ........11
1. 1 Malária ........................................................................................................................................ 11
1.1.1 Biologia do parasito .............................................................................................................. 11
1.1.2 Estrutura, processamento e importância imunitária da MSP-1.............................................15
1.1.3 Vacina e imunidade protetora................................................................................................18
1.2 Vírus vacinal da febre amarela.....................................................................................................20
1.3 Expressão de proteínas em células de inseto utilizando baculovírus............................................22
2 Objetivos ........................................................................................................................................ .....29
2.1 Objetivo geral .............................................................................................................................. 29
2.2 Objetivos específicos...................................................................................................................29
3 Materiais e métodos........................................................................................................................... .30
3.1 Amplificação e clonagem do fragmento MSP-119 kDa Modificada................................................30
3.1.1 Eletroforese e visualização de DNA......................................................................................30
3.1.2 Amplificação do fragmento MSP-119 kDa Modificada............................................................30
3.1.3 Células...................................................................................................................................33
3.1.4 Clonagem no vetor de transferência pFastBac DUAL..........................................................34
3.2 Obtenção do baculovírus recombinante........................................................................................38
3.2.1 Produção do bacmídio recombinante.....................................................................................38
3.2.2 Transfecção de células de inseto............................................................................................40
3.2.3 Infecção de células de inseto.................................................................................................41
3.2.4 Detecção do DNA viral e verificação da presença do fragmento clonado............................42
3.3 Expressão da proteína recombinante MSP-119 kDa Modificada.....................................................44
3.3.1 Eletroforese de proteína.........................................................................................................44
3.3.2 Cinética de expressão da MSP-119 kDa Modificada recombinante..........................................44
3.3.3 Análise do rendimento por densitometria..............................................................................45
4 Resultados............................................................................................................................................46
4.1 Amplificação e clonagem do fragmento MSP-119 kDa Modificada............................................46
4.2 Obtenção do baculovírus recombinante....................................................................................49
4.3 Expressão da proteína recombinante MSP-119 kDa Modificada.................................................51
5 Discussão.............................................................................................................................................53
6 Conclusões...........................................................................................................................................57
7 Perspectivas.........................................................................................................................................58
8 Bibliografia..........................................................................................................................................59
12
1 INTRODUÇÃO
1.1 Malária
1.1.1 Biologia do parasito
Plasmodium sp. (Marchiafava & Celi, 1885), agente causador da malária, é um microorganismo unicelular eucariótico. Mais de 100 espécies de Plasmodium sp. podem infectar
inúmeras espécies animais, incluindo répteis, pássaros e mamíferos, mas, sob condições
naturais, apenas 4 espécies infectam humanos: Plasmodium (Laverania) falciparum (Welcha,
1897), Plasmodium vivax (Grassi & Feletti 1890) Labbé, 1892, Plasmodium (Plasmodium)
malariae (Grassi & Feletti, 1892) e Plasmodium ovale (Stephens, 1922). Essas espécies
diferem entre si por sua distribuição geográfica, morfologia, resposta imune e resistência a
drogas, sendo P. vivax e P. falciparum as mais frequentes. Apesar de P. vivax ser mais
frequente que P. falciparum, sua infecção raramente leva o indivíduo à morte, enquanto P.
falciparum é o maior causador de mortes por malária. O plasmódio é transmitido aos
hospedeiros mamíferos pela fêmea do mosquito Anopheles sp. (Meigen, 1818). Existem mais
de 400 espécies de Anopheles sp. pelo mundo, das quais 60 são vetores de malária sob
condições naturais e, dessas, 30 são de maior importância (TUTEJA, 2007).
O ciclo de vida do plasmódio é extremamente complexo (Figura 1). Esporozoítos
infectivos, provenientes das glândulas salivares da fêmea do mosquito Anopheles sp., são
injetados no hospedeiro vertebrado. Os esporozoítos são células alongadas, assexuadas e
13
móveis, que migram até o fígado e invadem os hepatócitos através de um mecanismo em que
a proteólise de proteínas na superfície do parasito desempenha um papel fundamental
(SILVIE et al., 2004; COPPI et al., 2005; MENARD et al., 2008).
Figura 1: Representação esquemática do ciclo de vida do plasmódio. Durante uma refeição, o mosquito infectado
injeta esporozoítos infectivos no hospedeiro vertebrado (1). Os esporozoítos alcançam o fígado (2) e sofrem
esquizogonia hepática (3), originando merozoítos. Os merozoítos que caem na corrente sanguínea (4) invadem
eritrócitos (5). Nos eritrócitos infectados, há formação do esquizonte sanguíneo, que se rompe, liberando novos
merozoítos na corrente sanguínea (6); ou há formação de gametócitos (7). Um mosquito, ao se alimentar de um
hospedeiro vertebrado infectado, ingere eritrócitos contendo gametócitos (8). No mosquito, os gametócitos
evoluem a gametas maduros e se fundem (9) originando o oocineto (10), que evolui a oocisto (11). O oocisto se
rompe, liberando esporozoítos infectivos que migram para as glândulas salivares do mosquito (12). Em uma
nova refeição, o mosquito injeta esporozoítos no hospedeiro vertebrado (1), perpetuando o ciclo do plasmódio.
Adaptado de Centers for Disease Control and Prevention. Disponível em: http://www.cdc.gov/malaria/
biology/life_cycle.htm.
No hepatócito, os esporozoítos se dividem rápida e assexuadamente em uma replicação
chamada de esquizogonia, na qual há a formação de uma célula multinucleada chamada
14
esquizonte hepático. O esquizonte hepático se divide e dá origem à nova forma do parasito no
seu ciclo de vida, chamada de merozoíto. O merozoíto se caracteriza por ser estruturalmente
semelhante ao esporozoíto, embora mais curto e largo e por ter sua superfície recoberta por
um envoltório piloso, composto por várias proteínas de superfície que são importantes na
aderência ao eritrócito (TUTEJA, 2007).
Os merozoítos liberados do fígado caem na corrente sanguínea, onde invadem
eritrócitos. O contato inicial é crucial para o reconhecimento da célula competente para
invasão pelo parasito. Primeiramente, esse reconhecimento é de baixa afinidade e reversível e
ocorre em qualquer ponto da sua superfície. Depois, inicia-se a reorientação do merozoíto, no
intuito de justapor sua porção apical à membrana eritrocítica e, assim, permitir uma interação
mais íntima entre as células. É formada uma junção oclusiva, que é movida para porção
posterior do merozoíto. As moléculas que medeiam a adesão ao eritrócito são, então,
gradativamente removidas através de proteases, em um processo que culmina na perda do
envoltório piloso. À medida que o merozoíto penetra na célula, é formado um vacúolo
parasitóforo a partir da membrana celular, no qual o parasito seguirá se desenvolvendo
(AIKAWA et al., 1978; COWMAN et al., 2006).
Um grande número de interações específicas entre o parasito e a célula hospedeira já foi
identificado. O seqüenciamento do genoma do P. falciparum revelou que muitas moléculas
envolvidas na invasão celular são membros de famílias de genes. As proteínas de superfície
do merozoíto (MSP), por exemplo, constituem uma classe importante de proteínas de
membrana identificadas nos merozoítos livres e em desenvolvimento. Elas estão envolvidas
na interação inicial via resíduos de ácido siálico na superfície do eritrócito (TUTEJA, 2007).
O antígeno de ligação ao eritrócito 175 (EBA-175) é uma proteína de P. falciparum que se
liga à glicoforina A, glicoproteína mais freqüente na superfície do eritrócito, que atua como
receptor para o parasito (SIM et al., 1994; MILLER et al., 2002).
15
No eritrócito, o merozoíto se transforma em trofozoíto, também referido como “forma
de anel” devido à sua morfologia característica. O trofozoíto, então, aumenta seu tamanho e
sua atividade metabólica, o que inclui glicólise acentuada, digestão do citoplasma do
eritrócito e proteólise da hemoglobina. A proteólise da hemoglobina leva à liberação de seu
grupamento heme, composto tóxico para o parasito. Entretanto, o parasito não é capaz de
degradá-lo, mas sim de polimerizá-lo, processo que resulta na formação da hemozoína,
substância de coloração escura, também conhecida como pigmento malárico (TUTEJA,
2007).
O fim da fase trofozoíta é marcado por múltiplas divisões nucleares, levando à formação
do esquizonte sanguíneo. O esquizonte, por sua vez, se divide e produz cerca de 20
merozoítos. O eritrócito rico em merozoítos se rompe e libera, além dos parasitos, toxinas no
corpo do hospedeiro. Esse ciclo invasão-replicação-liberação dura cerca de 48 horas no caso
do P. falciparum e caracteriza o conhecido quadro clínico de febre e calafrios da malária
(TUTEJA, 2007).
O plasmódio entra na fase sexual quando alguns merozoítos, no eritrócito, se
transformam em micro- e macrogametócitos, células capazes de se diferenciarem em gametas
masculino e feminino respectivamente. Os eritrócitos contendo gametócitos não se rompem e
são levados ao hospedeiro invertebrado quando o mosquito se alimenta de um mamífero
infectado. Somente no trato gastrointestinal médio do mosquito os gametócitos são capazes de
evoluir a micro- e macrogametas, originando gametas masculino e feminino maduros. Os
gametas se fundem e o zigoto diplóide se desenvolve na parede intestinal, formando oocistos.
Dentro dos oocistos, inúmeras mitoses ocorrem, em uma reprodução chamada esporogonia.
Com a ruptura do oocisto, esporozoítos são liberados e migram para as glândulas salivares do
mosquito. O mosquito se mantém infectivo por 1 a 2 meses e, em uma nova alimentação,
16
injeta os esporozoítos na corrente sanguínea do hospedeiro vertebrado, perpetuando o ciclo do
plasmódio (TUTEJA, 2007).
1.1.2 Estrutura, processamento e importância imunitária da MSP-1
Muitas são as proteínas envolvidas no processo de invasão do eritrócito. O envoltório
piloso do merozoíto é rico em proteínas ancoradas na membrana através de uma região
glicosilfosfatidilinositol (GPI) e seus ligantes associados. Atualmente, já foram descritas 9
proteínas ancoradas por GPI na superfície do merozoíto de P. falciparum e todas são
potencialmente ligantes do eritrócito: MSP-1, MSP-2, MSP-4, MSP-5, MSP-10, Pf 12, Pf 38,
Pf 92 e Pf 113. Tais proteínas não estão igualmente distribuídas, apresentando diferentes
funções no processo de invasão. Além da âncora por GPI, muitas proteínas de superfície
apresentam outras características comuns, incluindo domínios ricos em cisteína. Entre estes,
está incluído o domínio semelhante ao fator de crescimento epitelial (EGF) na porção Cterminal (SANDERS et al., 2005; COWMAN et al., 2006).
A MSP-1 é a proteína mais abundante na superfície do merozoíto; portanto, acredita-se
que seja essencial para sobrevivência do parasito e sua aderência ao eritrócito (COWMAN et
al., 2006). É sintetizada durante as esquizogonias hepática e sanguínea e seu tamanho varia de
180 a 225 kDa de acordo com a espécie. Nos estágios iniciais da sua biossíntese, um peptídeo
sinal N-terminal é removido e sua porção C-terminal hidrofóbica é substituída por uma região
GPI, que será responsável pela inserção da proteína na membrana do merozoíto (BENTLEY,
2006).
17
A MSP-1 sofre duas proteólises até chegar a sua forma efetiva. A primeira ocorre no
estágio de esquizonte, gerando 4 produtos polipetídicos de aproximadamente 30, 83, 38 e 42
kDa, os quais permanecem ligados não covalentemente (HOLDER et al., 1992). O complexo
protéico adere à superfície do parasito através da região GPI na porção C-terminal do
fragmento de 42 kDa. O segundo processamento proteolítico ocorre no momento da invasão
eritrocítica. O fragmento C-terminal de 42 kDa é dividido em dois, gerando um fragmento Nterminal de 33 kDa que é liberado juntamente com o complexo polipeptídico (BLACKMAN
et al., 1991) e permanecendo um fragmento C-terminal de 19 kDa ancorado à membrana pelo
GPI (BLACKMAN et al., 1990).
Elementos estruturais foram identificados na MSP-1 domínio 42 kDa (MSP-142
kDa)
indicando que a proteína pode se apresentar na forma de dímero e que, após a segunda
proteólise, o complexo é liberado na forma dimérica, permanecendo, na superfície do
merozoíto, os dois fragmentos MSP-1 domínio 19 kDa (MSP-119 kDa) monoméricos (Figura 2)
(BABON et al., 2007).
Figura 2: Modelo proposto para MSP-1 na superfície do parasito. Duas moléculas de MSP-1 formam um dímero;
após um processamento primário, os dímeros são clivados em fragmentos que mantêm um complexo na
superfície do merozoíto. Um segundo processamento ocorre com a clivagem do fragmento de 42 kDa, no
momento da invasão do eritrócito. O domínio 19 kDa, agora monomérico, permanece na superfície do merozoíto
e medeia a invasão ao eritrócito. Adaptado de Babon et al., 2007.
18
A MSP-119 kDa foi estudada por cristalografia de raio-X e ressonância nuclear magnética
(RNM). Como já se esperava por sua estrutura primária, a proteína contém dois domínios
semelhantes ao EGF in tandem. Esses domínios estão em íntimo contato através de resíduos
invariáveis e altamente conservados. Essa proximidade lhe confere uma forma compacta e
rígida. A MSP-119 kDa possui apenas 5 sítios dimórficos, os quais se encontram espaçados na
sua superfície de modo que a resposta imune não é afetada por permutações nesses resíduos
(PIZARRO et al., 2003; BENTLEY, 2006).
A função da MSP-119
kDa
ainda não foi totalmente elucidada, mas acredita-se que ela
forme uma co-ligação com MSP-9, que se liga à proteína de membrana banda 3 do eritrócito
e, assim, auxilie na invasão da célula pelo merozoíto (LI et al., 2004; BENTLEY, 2006).
Epítopos da MSP119 kDa reconhecidos por anticorpos monoclonais foram detalhadamente
estudados por RNM e cristalografia de raio-X. Anticorpos monoclonais que previnem a
invasão do eritrócito agem impedindo o segundo processamento proteolítico, pois
reconhecem epítopos sobrepostos no primeiro domínio semelhante ao EGF. Anticorpos que se
ligam a regiões adjacentes nesse mesmo domínio não inibem essa proteólise (BENTLEY,
2006; PIZARRO et al., 2003), indicando que porções do primeiro domínio semelhante ao
EGF presente na MSP-119
kDa
são fundamentais para o seu reconhecimento pelo sistema
imune hospedeiro. Por ser essencial à invasão do eritrócito pelo parasito, a MSP-119 kDa vem
sendo muito estudada como um potencial alvo para desenvolvimento de uma vacina contra a
malária clínica.
19
1.1.3 Vacina e imunidade protetora
Segundo as estimativas da Organização Mundial de Saúde (OMS), em 2006 havia 3,3
bilhões de pessoas em risco de contrair malária. Foram registrados 247 milhões de casos,
resultando em quase 1 milhão de mortes, principalmente em menores de 5 anos de idade. Em
2008, havia 109 países com malária endêmica, dos quais 45 estavam na África. No Brasil,
mais de 350.000 casos de malária foram reportados anualmente entre 2001 e 2007, com um
máximo de 600.000 casos em 2005. A transmissão ocorre principalmente na região da
Amazônia, onde 10 a 15% da população estão em risco. Quase todos os casos suspeitos foram
confirmados para doença, dos quais 19% foram causados pelo Plasmodium falciparum em
2007 (OMS, 2008).
Esses números mostram a necessidade do desenvolvimento de uma vacina eficaz para
malária, mas são muitos os obstáculos nesse sentido. A existência de 4 espécies capazes de
infectar o homem, associada ao complexo ciclo de vida do parasito e seu alto grau de
polimorfismo constituem uma combinação de fatores complicadores nesse sentido (LI et al.,
2007). A imunidade adquirida para malária surge após infecções recorrentes; a resistência ao
desenvolvimento das formas graves da doença aumenta com a idade do indivíduo, de modo
que crianças apresentam maior risco de desenvolverem a malária com severa morbidade e
mortalidade (GUPTA et al., 1999; MARSH et al., 2006). A imunidade adquirida não protege
contra a infecção pelo plasmódio, mas controla o desenvolvimento da doença e está
relacionada a antígenos do parasito com baixo grau de polimorfismos (BEESON et al., 2008).
A importância dos anticorpos na proteção contra malária já foi claramente demonstrada
através de estudos clínicos nos quais soros hiperimunes ou imunoglobulinas purificadas de
adultos reduziram a parasitemia e levaram à cura de crianças doentes (COHEN et al., 1961;
20
PLEASS et al., 2005). Além disso, anticorpos maternos parecem prevenir a infecção em
recém-nascidos (LOGIE et al., 1973; PLEASS et al., 2005). Acredita-se que anticorpos
protetores tenham como alvo primário antígenos de superfície do merozoíto e ligantes do
eritrócito, embora seu papel na imunidade protetora não esteja completamente entendido.
Vários mecanismos, incluindo a inibição da invasão do eritrócito pelo merozoíto, fagocitose
mediada por anticorpos e o sistema complemento são possíveis. Também pouco é
compreendido da imunidade mediada por células na malária, mas sabe-se que o
reconhecimento por células T CD4+ é importante tanto para produção de anticorpos pelas
células B quanto para produção de células T CD8+ de memória (BEESON et al., 2008).
Apesar dos desafios, resultados promissores foram alcançados com RTS,S, uma vacina
pré-eritrocítica, baseada na proteína circunsporozoíta (CSP). A RTS,S foi desenvolvida a
partir de um gene que codifica a porção repetitiva da CSP - indutora de resposta humoral via
anticorpos -, um fragmento final da CSP – indutor de resposta celular através de células T – e
o antígeno de superfície do vírus da hepatite B. A vacina é empregada juntamente com um
adjuvante e vem demonstrando proteção contra malária clínica em adultos e crianças africanas
(BOJANG et al., 2009).
A abordagem tradicional no desenvolvimento de vacinas para malária se baseia em
proteínas recombinantes. Porém, um dos principais desafios dessa abordagem é que a
proteína, por si só, geralmente é pouco imunogênica, tornando necessária a adição de
adjuvantes para deflagrar a resposta imune. Além disso, sua conformação estrutural, que
influencia diretamente na capacidade de gerar uma resposta imunológica efetiva, deve ser
mantida após as metodologias de purificação da proteína recombinante em um rendimento
que torne possível sua produção em larga escala (LI et al., 2007).
Vetores virais, por outro lado, são empregados no desenvolvimento de vacinas há
décadas e parecem ser capazes de induzir respostas humoral e celular na ausência de
21
adjuvantes. Como essas vacinas utilizam as células hospedeiras para gerar os alvos
antigênicos, sua conformação nativa é garantida. Além disso, vetores virais têm a capacidade
de carrear múltiplos antígenos, de diferentes estágios de vida do parasito, e,
consequentemente, potencial para induzir uma resposta imune abrangente (LI et al., 2007).
Neste sentido, o uso de vírus atenuados – empregados com sucesso em várias vacinas
humanas – como vetores de expressão para antígenos plasmodiais poderia acarretar uma
proteção eficaz e duradoura à malária humana.
1.2 Vírus vacinal da febre amarela
Constituinte de uma das vacinas humanas de maior sucesso, o Vírus da Febre Amarela
(ICTVdB, 2006), cepa 17D (FA 17D), é um vírus atenuado, produzido em ovos embrionados
de galinha e usado para vacinação humana há 70 anos. Nos últimos 50 anos, mais de 600
milhões de doses da vacina foram administradas. A administração é por via subcutânea, em
dose única, e 99-100 % dos indivíduos vacinados desenvolvem anticorpos neutralizantes após
a vacinação (MONATH, 2005). A reimunização é necessária a cada 10 anos para manter a
carteira internacional de vacinação em dia, entretanto, a imunidade efetiva é provavelmente
para toda a vida (POLAND et al., 1981).
Algumas das propriedades da vacina incluem replicação viral limitada no hospedeiro,
com significativa expansão e disseminação da massa viral, conferindo imunidade duradoura.
A vacina é barata e envolve uma metodologia de produção e de controle de qualidade bem
estabelecidas (BONALDO et al., 2007). Tais características fazem do vírus FA 17D um vetor
de expressão em potencial no desenvolvimento de novas vacinas atenuadas.
22
O vírus FA 17D vem sendo utilizado como vetor para desenvolvimento de vacinas
quiméricas contra outros flavivírus, como o Vírus da Encefalite Japonesa (ICTVdB, 2006),
Vírus do Oeste do Nilo (ICTVdB, 2006) e Vírus da Dengue (ICTVdB, 2006; PUGACHEV et
al., 2005), mas pode, também, expressar proteínas heterólogas pela inserção da seqüência
codificante na região não-estrutural do genoma viral ou em sítios específicos no gene da
proteína do envelope (E) (BONALDO et al., 2006).
Foi estabelecida, em nosso laboratório, uma metodologia inovadora de geração de
flavivírus vivos contendo inserções gênicas heterólogas entre os genes das proteínas E e da
proteína não estrutural 1 (NS1). Tal metodologia se baseou na duplicação de regiões
funcionais que flanqueiam a região intergênica E/NS1 no gene a ser inserido de modo que
essas regiões ficassem fusionadas à proteína expressa. Isso permitiu o processamento correto
do precursor da poliproteína viral sem comprometer substancialmente a viabilidade dos vírus
gerados. O vírus recombinante apresentou estabilidade genética quanto ao gene heterólogo e
foi capaz de induzir a produção de anticorpos neutralizantes para febre amarela e para a
proteína “Enhanced Green Fluorescent Protein” (EGFP), inserida no genoma viral, em
camundongos BALB/c imunizados (BONALDO et al., 2007).
O desenvolvimento de uma vacina combinada contra febre amarela e malária seria de
extrema importância, uma vez que estas doenças apresentam áreas endêmicas quase que
coincidentes nas Américas, sendo essa uma abordagem extremamente relevante no controle
de ambas as endemias. Estudos nesse sentido já vêm sendo realizados em nosso laboratório
com o desenvolvimento do vírus FA 17D recombinante para MSP-119 kDa. Entretanto, faz-se
necessário obter a proteína recombinante para ser utilizada como insumo em estudos para
caracterização de tais vírus. A obtenção da MSP-119 kDa permitirá analisar o curso da infecção
pelos vírus recombinantes em células cultivadas in vitro e também avaliar a resposta imune
induzida pelo vírus FA/MSP-119 kDa em camundongos imunizados.
23
1.3 Expressão de proteínas em células de inseto utilizando baculovírus
Os baculovírus são vírus que naturalmente infectam insetos e são amplamente
empregados na biotecnologia como vetores de expressão de proteínas. O principal sítio do
genoma viral empregado para expressão de proteínas recombinantes está no gene da
poliedrina, uma proteína produzida em grandes quantidades em células de inseto nos estágios
finais da infecção, ou seja, a associação com seu promotor pode induzir a expressão eficiente
de proteínas heterólogas. Além disso, a poliedrina, apesar de ser requerida no ciclo normal do
vírus, não é necessária para manutenção da infecção em células cultivadas in vitro – tornando
viável a clonagem e expressão de proteínas nesse sítio. Outro local utilizado para expressão
de proteínas em células de inseto utilizando baculovírus é o gene da proteína P10, outra
proteína estrutural sintetizada em grandes quantidades pela célula no fim da infecção (KING
et al., 1992).
Os baculovírus são constituídos por um DNA circular de dupla fita, que varia de 80 a
180 kb, que se encontra inserido em um nucleocapsídeo alongado. Os nucleocapsídeos são
empacotados em um envelope para formar as partículas virais ou virions. Os virions podem
ou não formar corpo de oclusão, o qual pode ser chamado de poliedro, quando composto pela
proteína poliedrina ou de grânulo, quando composto pela proteína granulina. Poliedrina e
granulina são proteínas muito relacionadas que constituem o componente principal do corpo
de oclusão (KING et al., 1992).
Baseado no número de nucleocapsídeos dentro do poliedro, os baculovírus são divididos
em 3 subgrupos: subgrupo A ou Vírus da Poliedrose Nuclear (NPV), no qual o poliedro
contém inúmeras partículas virais, sendo estas compostas por único (SNPV) ou múltiplos
(MNPV) nucleocapsídeos - os vírus da categoria MNPV foram desenvolvidos como vetores
24
de expressão; subgrupo B ou Vírus Granulares (GV), no qual uma partícula viral com único
nucleocapsídeo é ocluída por grânulos formados pela proteína granulina; e subgrupo C, no
qual os vírus não formam corpos de oclusão (KING et al., 1992).
Infecções por baculovírus foram descritas em diferentes espécies de insetos incluindo
Lepidoptera (Linnaeus, 1758), Hymenoptera (Linnaeus, 1758), Diptera (Linnaeus, 1758) e
Coleoptera (Linnaeus, 1758), mas nunca em humanos ou mamíferos. O baculovírus isolado
de Autographa californica (Speyer, 1875) é chamado AcMNPV (ICTVdB, 2006) e é
amplamente estudado a nível molecular devido à facilidade com que é cultivado em cultura de
células sendo, por isso, o baculovírus popularmente empregado na expressão de proteínas
(KING et al., 1992).
Os baculovírus desenvolveram dois importantes recursos que permitem sua adaptação
ao longo do seu ciclo de vida (Figura 3): a formação de uma estrutura estável no meio
ambiente, mas susceptível ao pH alcalino do trato digestivo médio do inseto; e uma estrutura
resistente ao meio alcalino e às enzimas digestivas. A primeira, chamada de corpo de oclusão,
é o poliedro ou grânulo, e chegará ao inseto quando este ingerir um alimento contaminado. A
segunda, o virion em si ou vírus extracelulares (ECV), será liberada do corpo de oclusão em
meio ao pH alcalino e seguirá a infecção no inseto. Ao infectar novas células, o ECV pode
levar à formação de novos virions, seguindo para infecção sistêmica do inseto, ou à formação
dos corpos de oclusão. Entretanto, a maioria dos nucleocapsídeos formados parece ser
destinada a permanecer no núcleo e formar os corpos de oclusão (KING et al., 1992).
Essa produção bifásica dos ECV e dos corpos de oclusão observada no inseto também é
observada em cultura de células. Os genes dos baculovírus são expressos de forma
coordenada nas células infectadas. Por convenção, essa expressão é dividida em 4 fases: genes
bem iniciais ( ), iniciais (β), tardios (γ) e muito tardios (δ). Um evento característico do final
da replicação do DNA viral é a hiperexpressão dos genes muito tardiamente expressos,
25
transcritos no período em que ocorre a formação dos corpos de oclusão no interior do núcleo
celular, em aproximadamente 15 horas após a infecção. É nessa fase em que há
superexpressão da poliedrina e da P10. Seus promotores podem, juntos, resultar em 50 % da
massa total de proteínas nas células nesse estágio de infecção (KING et al., 1992).
Como todo sistema de expressão protéica, o uso de baculovírus apresenta vantagens e
desvantagens. A principal vantagem consiste na presença dos genes da poliedrina e da P10,
regulados por fortes promotores e não necessários à infecção viral in vitro, o que resultará na
alta expressão da proteína de interesse. A ocorrência da expressão desses genes na etapa final
da infecção constitui outra vantagem: a possibilidade de expressão de uma proteína citotóxica,
que pudesse afetar a replicação viral caso fosse expressa nos estágios iniciais da infecção
(KING et al., 1992). O sistema de expressão em células de inseto utilizando baculovírus
apresenta vantagens relacionadas à biologia do vírus em si, como: (1) o grande genoma viral,
que permite a inserção de seqüências de tamanho variado sem que isso afete a replicação do
vírus, (2) não foi descrita, até hoje, infecção em humanos, o que garante a segurança do
manipulador durante os experimentos e (3) a produção das proteínas virais ocorre em uma
célula eucariótica, aumentando as chances de a proteína recombinante sofrer modificações
pós-traducionais e adquirir sua conformação nativa. O padrão de glicosilação em células de
inseto, no entanto, é diferente do padrão das células de vertebrados, tornando o trabalho com
glicoproteínas de organismos vertebrados limitado. Outra desvantagem do sistema decorre do
fato de os baculovírus promoverem a morte das células infectadas, tornando necessária a
reinfecção de culturas de células de inseto frescas, o que impede a expressão contínua da
proteína de interesse (KING et al., 1992).
26
Figura 3: Representação esquemática do ciclo de vida do baculovírus. Um inseto ingere alimento contaminado
com poliedro contendo partículas virais infectivas (P). Ocorre a liberação dos nucleocapsídeos (NC), que
penetram nas células do trato gastrointestinal do animal e liberam o DNA viral no núcleo celular. Há formação
de novos nucleocapsídeos, que podem sair da célula e infectar novas células (ECV) ou permanecer no núcleo e
ser incorporado na formação de novos poliedros (PDV). Fonte: King e Posee, 1992.
O grande genoma dos baculovírus não permite que sejam manipulados diretamente com
enzimas de restrição ou DNA ligases para inserir seqüências externas, sendo necessário adotar
uma abordagem indireta para tal. Foi desenvolvida, inicialmente, uma metodologia baseada
na inserção de porções do genoma viral contendo o gene da poliedrina em plasmídeos
bacterianos, possibilitando sua replicação em Escherichia coli (Migula, 1895) Castellani &
Chalmers, 1919. O gene da poliedrina foi, então, manipulado com enzimas de restrição para
que houvesse sua liberação, mas mantendo seu promotor intacto. Com um sítio de restrição
logo depois do promotor, a inserção do DNA externo é facilitada. O plasmídeo final,
contendo o promotor da poliedrina seguido de um sítio único de restrição foi chamado de
vetor de transferência. A seqüência inserida no vetor de transferência é transferida para o
genoma viral através de uma cotransfecção de células derivadas de Spodoptera frugiperda
27
(Smith & Abbot, 1797) - células Sf - com o genoma infectivo do baculovírus e o plasmídeo
recombinante. No decorrer da infecção, as seqüências que flanqueiam a porção recombinante
do plasmídeo recombinam com as seqüências homólogas no genoma viral e, assim, trocam o
gene da poliedrina pelo gene recombinante, originando o vetor de expressão e culminando na
expressão da proteína de interesse pelas células de inseto infectadas (KING et al., 1992).
Atualmente, existem sistemas comercialmente disponíveis para expressão de proteínas
em células de inseto através da infecção com baculovírus recombinantes desenvolvidos de
modo a facilitar a manipulação desde a clonagem da seqüência de interesse no genoma viral
até a obtenção da proteína recombinante (KING et al., 1992). O “Bac-to-Bac Baculovírus
Expression System”, da Invitrogen, se baseia na transposição sítio-específica de um cassete de
expressão presente em um vetor de transferência, para um plasmídeo bifuncional,
denominado bacmídio, que possui capacidade de replicação em células de inseto e em E. coli
(Figura 4).
No sistema, a seqüência que codifica a proteína de interesse é clonada em um vetor de
transferência, dentro do transposon bacteriano Tn7, que carreia um gene de resistência a
gentamicina e uma região de múltiplo sítio de clonagem, esta última localizada entre um
promotor específico de baculovírus (5’ terminal) e um sinal de poliadenilação SV40 (3’
terminal), possibilitando, assim, sua expressão em células de inseto.
O vetor de transferência recombinante é, então, transformado em E. coli DH10Bac,
linhagem bacteriana que contém o bacmídio e um plasmídeo auxiliador. O bacmídio contém
um gene de resistência à canamicina e um segmento de DNA que codifica o peptídeo lacZ .
Inserido na porção N-terminal do gene do lacZ há um pequeno segmento contendo um sítio
específico de recombinação para o transposon bacteriano Tn7, sem interferir na fase de leitura
do peptídeo do lacZ . Dessa forma, a construção de bacmídios recombinantes se dá através da
28
transposição do cassete de expressão do vetor de transferência contendo a seqüência de
interesse, sendo as funções de transposição determinadas pelo plasmídeo auxiliador que, além
TetR
AmpR
Transformação
GmR
CanR
AmpR
Seleção com antimicrobianos,
X-Gal e IPTG
TetR
CanR
Extração do bacmídio
recombinante
GmR
Bacmídio
recombinante
Transfecção de
células de inseto
Infecção de células
de inseto
Partículas
virais recombinantes
Figura 4: Resumo
esquemático
do “Bac-to-Bac Expression System”, Invitrogen. A seqüência de interesse é
clonada em um plasmídeo de transferência e, este, transformado em E. coli DH10 Bac para transposição do
fragmento de interesse com o bacmídio. As colônias brancas são submetidas à extração do bacmídio
Expressão
gene recombinante
recombinante e células de inseto são transfectadas com o mesmo. Os baculovírus gerados
são doestocados
e
ou
utilizados nos ensaios de expressão da proteína recombinante. Adaptado de “Bac-toBac Baculovírus Expression
Amplificação viral
System”, Invitrogen.
29
de codificar transposases, confere resistência à tetraciclina. A inserção do cassete de
expressão no bacmídio interrompe a expressão do peptídeo lacZ , de modo que, na presença
do substrato cromogênico Bluo-gal ou X-gal e do indutor IPTG, as colônias contendo o
bacmídio recombinante tornam-se brancas, enquanto as colônias azuis carregam o bacmídio
inalterado.
O bacmídio recombinante pode ser purificado de culturas em pequena escala e utilizado
na transfecção de células de inseto. Os estoques virais obtidos a partir das células de inseto
infectadas podem ser empregados na infecção de novas células para subseqüente expressão,
purificação e análise da proteína desejada.
30
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
o
Expressar a proteína recombinante MSP-119 kDa de Plasmodium falciparum em
células de inseto utilizando baculovírus.
2.2 Objetivos específicos
o
Amplificar a seqüência que codifica a proteína MSP-119 kDa;
o
Clonar o produto da amplificação no vetor de transferência pFastBac DUAL;
o
Obter o bacmídio recombinante;
o
Transfectar células Sf9 com bacmídio recombinante;
o
Obter estoque de baculovírus recombinantes;
o
Caracterizar a expressão da MSP-119 kDa em células Sf9.
31
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Amplificação e clonagem do fragmento MSP-119 kDa Modificada
3.1.1 Eletroforese e visualização de DNA
Os fragmentos de DNA foram visualizados por eletroforese em gel de agarose (BioRad), na concentração adequada ao tamanho do fragmento, utilizando o tampão TAE 1X
(Tris-Acetato 40 mM e EDTA 1 mM). As amostras foram diluídas em tampão de amostra 6X
(Promega) para aplicação no gel. As corridas foram realizadas a aproximadamente 70 V.
Após a eletroforese, o gel de agarose foi corado em solução de brometo de etídeo (Bio-Rad)
0,5 µg/mL por aproximadamente 2 min e, em seguida, descorado em água durante
aproximadamente 10 min. O DNA foi visualizado e registrado em transiluminador de luz
ultravioleta (Quantity One, versão 4.6.3, Bio-Rad). As análises foram feitas através de
comparação com padrões de tamanho e massa de DNA adequados (Invitrogen).
3.1.2 Amplificação do fragmento MSP-119 kDa Modificada
A seqüência que codifica a proteína MSP-119
kDa
foi amplificada a partir de um
plasmídeo recombinante, que contém o cassete de expressão da MSP-119 kDa de P. falciparum
32
inserido na região intergênica E/NS1 do vírus FA 17D. Este plasmídeo é um derivado do pT3
- plasmídeo construído em nosso laboratório (BONALDO et al., 2007) - que contém o DNA
complementar à porção central do genoma do vírus FA 17D.
O fragmento que codifica a MSP-119
kDa
Modificada, a ser clonado no vetor de
transferência, foi obtido por reação de PCR (MULLIS et al., 1986), na qual os
oligonucleotídeos iniciadores utilizados continham, além da região de complementaridade à
seqüência, outros nucleotídeos que acrescentaram, ao produto final, sítios específicos para
enzimas de restrição, favorecendo a clonagem no vetor de transferência pFastBac DUAL
(Invitrogen) e seqüências codificando uma cauda de histidina e um sítio para protease
“Tobacco Etch Vírus” (TEV), para posterior purificação da proteína recombinante por
cromatografia de afinidade.
Em uma primeira etapa, foram utilizados os oligonucleotídeos iniciadores RG 466 (+),
complementar aos 9 últimos códons da porção N-terminal da NS1 e contendo um códon de
iniciação e um sítio para enzima de restrição Xba I; e RG 468 (-), complementar à porção Cterminal da MSP-119 kDa e codificando um espaçador e um sítio para protease TEV. Em uma
segunda etapa, foram utilizados os oligonucleotídeos iniciadores RG 466 (+) e RG 467 (-),
este último complementar à sequência referente ao espaçador e ao TEV e codificando 6
resíduos de histidina e um sítio para enzima de restrição Hind III.
O fragmento MSP-119
kDa
Modificada contém, portanto, um sítio de restrição para
enzima Xba I, um códon de iniciação, 9 códons da porção N-terminal da NS1, a seqüência da
MSP-119 kDa. Na sua porção 3´ terminal, o fragmento codifica um espaçador, um sítio para
protease TEV, 6 aminoácidos histidina e carrega um sítio de restrição para enzima Hind III
(Figura 5).
A reação foi feita em termociclador programável (Gene Amp PCR System 9700,
Applied Biosystems). O protocolo envolveu uma primeira etapa de aquecimento a 94 °C por 2
33
min para desnaturação do plasmídeo, seguida por 30 ciclos de desnaturação a 94 °C por 15 s,
pareamento dos oligonucleotídeos iniciadores a 55 °C por 30 s e extensão da nova fita por
uma polimerase a 68 °C por 1 min, além de uma extensão final de 5 min a 68 °C. Foi utilizada
a enzima Platinum Pfx DNA Polimerase (Invitrogen), de acordo com as recomendações do
fabricante. Para todas as reações de PCR neste trabalho, um molde de água livre de nuclease
(Promega) foi utilizado como controle da reação.
ETAPA 1:
pT3 + cDNA FA
pT3 + cDNA FA
MSP-1 19KDa
RG 466
RG 468
ETAPA 2:
MSP-1 19KDa
RG 466
RG 467
FRAGMENTO MSP-1 19KDa MODIFICADA:
MSP-1 19KDa
~500pb
Figura 5: Esquema representativo das etapas de PCR realizadas para obtenção do fragmento MSP-119 kDa
Modificada. O fragmento foi obtido a partir do cassete de expressão heterólogo clonado no cDNA do genoma do
vírus FA 17D contido no plasmídeo pT3. Os oligonucleotídeos iniciadores continham, além da região de
complementaridade à seqüência, outros nucleotídeos que acrescentaram, ao produto final, sítios específicos para
enzimas de restrição e seqüências para posterior purificação da proteína recombinante. 1cm corresponde a
aproximadamente 20 pares de base (pb).
34
3.1.3 Células
Escherichia coli DH5
(Invitrogen) e Escherichia coli SURE (Stratagene), células
utilizadas na transformação de plasmídeos por eletroporação durante a clonagem, foram
submetidas a um tratamento com água e glicerol 10 % para torná-las eletrocompetentes
(adaptado do manual de instruções do “Gene Pulser XCell”, Bio-Rad). Células E. coli DH5 e
E. coli SURE foram plaqueadas em meio LB-ágar [1 % (p/v) triptona, 0,5 % (p/v) extrato de
levedura, 1 % (p/v) NaCl, pH 7,0, 1,5 % (p/v) ágar] por estriamento e as placas foram
incubadas a 37 °C (Max 4000 Barnstead, Lab-Line) por aproximadamente 16 h. O préinóculo foi feito a partir de uma colônia isolada que foi transferida para meio LB líquido [1 %
(p/v) triptona, 0,5 % (p/v) extrato de levedura, 1 % (p/v) NaCl, pH 7,0] e cultivada a 37 °C,
sob agitação (Max 4000 Barnstead, Lab-Line), por aproximadamente 16 h. O inóculo foi feito
na proporção de 1:100 do pré-inóculo em meio BHI líquido (BD Biosciences) e cultivado a
37 °C, sob agitação. Alíquotas de 1 mL foram retiradas de 30 em 30 min para aferição da
DO600nm em espectrofotômetro (BioSpec 1601, Shimadzu) até que a cultura atingisse um valor
de absorbância entre 0,5 e 0,6. As células foram, então, transferidas para tubos cônicos de 50
mL previamente gelados e mantidas no gelo por 15 min, paralisando, assim, seu crescimento.
Os tubos foram centrifugados a 16000 x g, 4 °C (Centrifuge 5810, Eppendorf) por 15 min,
para retirada do meio de cultivo. Os sobrenadantes foram descartados e os precipitados foram
ressuspendidos em 5 mL de água tipo I estéril e gelada. Foi acrescentada, a cada tubo, água
estéril e gelada até o volume final de 50 mL e os tubos foram centrifugados novamente nas
mesmas condições. Essa lavagem com água foi repetida e uma nova centrifugação foi feita.
Os precipitados foram, então, ressuspendidos em 2 mL de glicerol 10 % (Sigma) e reunidos
em único tubo, que foi centrifugado novamente nas mesmas condições. Finalmente, o
35
precipitado foi ressuspendido em 800 µL de glicerol 10 % e alíquotas de 50 µL foram feitas
para tubos de 1,5 mL. As alíquotas foram deixadas a -20 °C por 1h e, depois, armazenadas a
-70 °C até utilização.
Células Escherichia coli DH10Bac quimiocompetentes (Invitrogen) foram utilizadas na
transformação do plasmídeo de transferência recombinante por choque térmico para geração
do bacmídio recombinante.
Células Sf9 (Invitrogen), derivadas de ovário de Spodoptera frugiperda, entre a 4ª e 30ª
passagens, foram cultivadas em meio de Grace (Invitrogen) suplementado com 10 % de SFB
(Gibco) e 10 µg/mL de gentamicina (Gibco) por 3-4 dias e utilizadas para transfecção com o
bacmídio recombinante e para infecção com os baculovírus recombinantes.
3.1.4 Clonagem no vetor de transferência pFastBac DUAL
Inicialmente, o fragmento MSP-119
kDa
Modificada amplificado foi digerido
simultaneamente com as enzimas Hind III e Xba I (Invitrogen), de acordo com as
recomendações do fabricante. O produto da digestão foi purificado seguindo a metodologia de
purificação de DNA do “DNA Purification Kit” (GE Health Care) de acordo com as
recomendações do fabricante para purificação de DNA a partir de reações enzimáticas. O
produto da purificação foi analisado por eletroforese em gel da agarose conforme descrito no
item 3.1.1 e conservado a -20 °C até a ligação ao vetor de transferência.
O vetor de transferência pFastBac DUAL, selecionado para o desenvolvimento do
trabalho, foi linearizado com as mesmas enzimas, purificado utilizando o mesmo sistema, de
acordo com as recomendações do fabricante e analisado por eletroforese em gel da agarose
36
conforme descrito no item 3.1.1. Para otimizar a reação de ligação, o vetor foi desfosforilado
nas extremidades 5’ com a enzima “Shrimp Alkaline Phosphatase” (SAP, Promega), de
acordo com as recomendações do fabricante.
Após cálculo das massas necessárias à reação de ligação, aproximadamente 230 ng de
plasmídeo e 240 ng de inserto foram precipitados na presença de 10 % de Acetato de Sódio
3M (Promega) e 3 volumes de etanol 96 % gelado (Merck, SAMBROOK et al., 1989). A
mistura foi incubada em banho de gelo seco e etanol 96 % por 30 min e centrifugada a 16000
x g (Centrifuge 5415D, Eppendorf) por 20 min. O sobrenadante foi descartado e, em seguida,
o precipitado foi lavado com 4 volumes de etanol 70 % gelado. Foi feita nova centrifugação a
16000 x g por 10 min e o sobrenadante foi novamente descartado. O precipitado foi seco
aquecendo-se a 62 °C em termobloco (ThermoStatPlus, Eppendorf) e, então, ressuspendido
diretamente na reação de ligação, a qual foi realizada com a enzima T4 DNA Ligase
(Invitrogen), de acordo com as recomendações do fabricante.
O produto da reação de ligação foi transformado em E. coli DH5 e E. coli SURE
eletrocompetentes por eletroporação (DOWER et al., 1988). Uma alíquota de 2 µL da reação
de ligação foi acrescentada à 50 µL de células eletrocompetentes; a suspensão foi transferida
para uma cuveta gelada e, então, eletroporada a 2,5 kV, 25 µF e 200 Ω (“Gene Pulser XCell”,
Bio-Rad). Foram adicionados 450 µL de meio S.O.C. (Invitrogen) à cuveta e a suspensão foi
transferida para tubos cônicos de 15 mL para cultivo a 37 °C, sob agitação, durante 1 h. Uma
alíquota de 100 µL das células transformadas foi cultivada em meio LB-ágar suplementado
com 100 µg/mL de ampicilina (Sigma) a 37 °C, por aproximadamente 16 h. As colônias
resultantes foram repicadas para meio LB líquido suplementado com 100 µg/mL de
ampicilina e incubadas a 37 °C, por 16 h, sob agitação. Uma alíquota contendo 10 pg do
plasmídeo comercial pUC 19 (Invitrogen) foi utilizado como controle positivo da eficiência
das células para transformação.
37
Uma alíquota de 100 µL de cada cultivo foi submetida à extração do DNA plasmidial
com 50 µL de solução fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1, Invitrogen) e 3 µL de
tampão de amostra para eletroforese de DNA [2,5 mL glicerol 99 %, 1 mL TAE 5X, 0,5 mL
azul de bromofenol 10 % (p/v)] (AZEVEDO, 2004). A mistura foi vigorosamente agitada
(Vortex-2 Genie, Scientific Industries) por 1 min e centrifugada a 16000 x g por 3 min. A fase
aquosa foi submetida à eletroforese em gel de agarose e visualizada conforme descrito no
item 3.1.1, para uma seleção inicial dos plasmídeos recombinantes de acordo com tamanho.
Os plasmídeos recombinantes foram purificados a partir de 3 mL do cultivo utilizando o
“Qiagen Miniprep Kit” (Qiagen), de acordo com as recomendações do fabricante. Os
plasmídeos purificados foram visualizados por eletroforese em gel de agarose conforme
descrito no item 3.1.1 e armazenados a -20 °C.
A confirmação da presença do fragmento MSP-119 kDa Modificada foi feita por digestão
dos plasmídeos recombinantes com as enzimas Hind III e Xba I, de acordo com as
recomendações do fabricante e por PCR utilizando os oligonucleotídeos iniciadores
empregados na obtenção do fragmento MSP-119 kDa Modificada. Os produtos das reações de
digestão e PCR foram visualizados por eletroforese em gel de agarose conforme descrito no
item 3.1.1. Em ambos os ensaios, esperava-se visualizar um fragmento de aproximadamente
500 pares de base (pb), correspondente ao fragmento de interesse e, no ensaio de digestão
enzimática, esperava-se visualizar, ainda, um fragmento de 5200 pb, referente ao vetor
linearizado.
Os plasmídeos recombinantes selecionados foram submetidos ao seqüenciamento
nucleotídico para confirmação da integridade do fragmento MSP-119
kDa
Modificada
(SANGER et al., 1977). Para o seqüenciamento, foi empregada a metodologia “ABI Prism
Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit”, versão 3.1 (Aplied Biosystems),
de acordo com as recomendações do fabricante. Os oligonucleotídeos iniciadores utilizados
38
foram RG 466 (+) e RG 446 (-), este último complementar à porção central da MSP-119 kDa
(Figura 6).
RG 436 (+)
pFastBac DUAL (+)
RG 466 (+)
RG 446 (-)
pFastBac DUAL (-)
Fragmento MSP-1 domínio 19 kDa Modificado
Transposon pFastBac DUAL
Tn7/R
GmR
PPH SV40
Tn7/L
DNA do Bacmídio
M13/pUC (+)
M13/pUC (-)
~3000 pb
Figura 6: Esquema representativo do produto esperado no PCR para confirmação da presença do fragmento
MSP-119 kDa Modificada após transposição; e das regiões de complementaridade dos oligonucleotídeos utilizados
na reação de seqüenciamento nucleotídico dos bacmídios recombinantes. Adaptado de “Bac-toBac Baculovirus
Expression System”, Invitrogen.
A precipitação do produto da reação de seqüenciamento foi feita em tubo cônico de 1,5
mL, na presença de isopropanol (Merck) a uma concentração final de 60 % (v/v) durante 15
min à temperatura ambiente. O tubo foi centrifugado a 16000 x g durante 30 min. O
sobrenadante foi descartado e o precipitado foi ressuspendido em 250 µL de etanol 70 %
(v/v). O tubo foi novamente centrifugado, nas mesmas condições, e o sobrenadante foi
descartado. O precipitado foi seco incubando-se o tubo a 90 °C durante 1 min, sob
monitoramento e, então, ressuspendido em 12 µL de formamida (Applied Biosystems). Em
seguida, o tubo foi aquecido a 95 °C durante 5 min para desnaturação do DNA. Uma alíquota
de 10 µL dessa solução foi transferida para uma placa de seqüenciamento, que foi levada ao
seqüenciador (ABI Prism 3100 Genetic Analyser, Applied biosystems).
As seqüências foram analisadas por meio do programa Chromas, versão 3.0
(Technelysium Pty Ltda) e do SeqMan II do conjunto Lasergene, versão 5.07 (DNAStar,
39
Inc.). Baseado no resultado do sequenciamento nucleotídico, foram escolhidos 3 plasmídeos
recombinantes para transposição de E. coli DH10Bac e obtenção do bacmídio recombinante.
A figura 7 mostra um esquema resumindo as etapas até aqui realizadas.
Figura 7: Resumo esquemático mostrando as etapas realizadas para obtenção do fragmento MSP-119 kDa
Modificada clonado no vetor de transferência pFastBac DUAL. O fragmento MSP-119 kDa Modificada, obtido por
PCR, foi clonado no vetor pFastBac DUAL. O plasmídeo recombinante foi transformado em E. coli e os clones
selecionados na presença de ampicilina foram submetidos à extração do DNA plasmidial. Os plasmídeos
recombinantes foram confirmados quanto à presença do inserto por PCR e digestão enzimática. Os clones
selecionados para dar continuidade ao trabalho foram submetidos ao seqüenciamento nucleotídico.
3.2 Obtenção do baculovírus recombinante
3.2.1 Produção do bacmídio recombinante
Aproximadamente 10 ng do pFastBac DUAL recombinante foram transformados em E.
coli DH10Bac quimiocompetentes (Invitrogen) por choque térmico (COHEN et al., 1972)
40
para transposição com bacmídio, seguindo as recomendações do “Bac-to-Bac Baculovirus
Expression System” (Invitrogen). Em tubo cônico de 1,5 mL, a referida massa de DNA foi
adicionada à 100 µL de células E. coli DH10Bac. A mistura foi incubada no gelo durante 30
min, sendo rapidamente transferida para banho-maria a 42 °C durante 45 s e, em seguida,
incubada novamente no gelo durante 2 min. Foram acrescentados 900 µL de meio S.O.C ao
tubo , que foi incubado a 37 °C, sob agitação, durante 4 h. Uma alíquota de 100 µL das
células transformadas foi cultivada em meio LB-ágar suplementado com canamicina 50
µg/mL (Gibco), gentamicina 7 µg/mL (Gibco), tetraciclina 10 µg/mL (Sigma), X-gal 100
µg/mL (Invitrogen) e IPTG 40 µg/mL (Invitrogen), a 37 °C, por aproximadamente 36 h. As
colônias brancas resultantes foram estriadas por 2 vezes consecutivas em meio LB-ágar com
os suplementos mencionados a fim de verificar a estabilidade dos clones. As colônias que
permaneceram brancas foram inoculadas em meio LB líquido suplementado com os
antimicrobianos mencionados por aproximadamente 36 h, sob agitação.
Após a transposição, os bacmídios foram purificados a partir de 3 mL de cultivo
utilizando o “FlexiPrep Kit” (Amersham Pharmacia Biotech Inc), de acordo com as
recomendações do fabricante para isolamento de cosmídios. Os bacmídios purificados foram
armazenados a -20 °C.
A verificação da presença do fragmento MSP-119
kDa
Modificada nos bacmídios
purificados foi feita através de PCR utilizando “PCR SuperMix High Fidelity” (Invitrogen),
de acordo com as recomendações do fabricante. Os oligonucleotídeos iniciadores utilizados
foram M13/pUC (+) e M13/pUC (-) (Invitrogen), complementares ao bacmídio (Figura 6). Os
produtos das reações foram visualizados por eletroforese em gel de agarose conforme descrito
no item 3.1.1 e analisados quanto ao tamanho.
Os bacmídios recombinantes foram submetidos ao seqüenciamento nucleotídico,
conforme descrito no item 3.1.4. Como molde, foram utilizados os produtos do ensaio de PCR
41
para seleção dos recombinantes. Os seguintes oligonucleotídeos iniciadores foram
empregados: M13pUC (+) e M13/pUC (-), complementares ao bacmídio; pFastBac DUAL
(+) e pFastBac DUAL (-), complementares à região transposta do pFastBac DUAL; RG 466
(+), complementar à porção inicial do fragmento MSP-119 kDa Modificada; RG 446 (-) e RG
436 (+), complementares à porção central da seqüência da MSP-119
kDa,
como pode ser
visualizado no esquema da figura 6. Os bacmídios recombinantes foram armazenados a
-20 °C.
3.2.2 Transfecção de células de inseto (Sf9)
Células Sf9, cultivadas conforme descrito no item 3.1.3, foram transfectadas com
bacmídio recombinante conforme as recomendações do “Bac-to-Bac Baculovirus Expression
System”. As células foram destacadas mecanicamente da garrafa de cultura e quantificadas
em Câmara de Neubauer ao microscópio óptico (CKX41, Olympus). A transfecção foi
realizada em placa de 6 orifícios, com 106 células viáveis por orifício em 2 mL de meio de
Grace suplementado. A placa foi incubada a 27 °C durante 2 h para que as células aderissem.
As células aderidas foram lavadas com 2 mL de meio de Grace.
Para transfecção foram preparadas duas soluções: solução A, composta por 5 µL do
bacmídio recombinante purificado e 100 µL de meio de Grace e solução B, composta por 6
µL de Cellfectin (Invitrogen) e 100 µL de meio de Grace. As duas soluções foram misturadas
e, após 45 minutos, foram adicionados à mistura 800 µL de meio de Grace. Ao controle
negativo (células não infectadas), foi acrescentado 1 mL de meio de Grace; ao outro orifício,
foi acrescentado 1 mL da solução de transfecção. As células foram incubadas a 27 °C durante
42
5 h em câmara úmida. Passado o tempo de incubação, o meio foi removido e 2 mL de meio de
Grace suplementado foi adicionado aos orifícios. As células foram, então, incubadas a 27 °C
durante 72 h.
Para recolher os vírus, as células foram destacadas da superfície da placa
mecanicamente e a suspensão celular foi clarificada por centrifugação a 500 x g durante 5
min. Os sobrenadantes da centrifugação foram transferidos para novos tubos e armazenados a
4 °C, protegidos da luz. De acordo com o fabricante, os títulos virais recuperados no
sobrenadante estão entre 2 x 107 e 4 x 107 pfu/mL.
3.2.3 Infecção de células de inseto (Sf9)
A infecção de células Sf9 foi feita em garrafas de cultura de 25 cm 2 contendo 1 x 106
células viáveis. As células foram deixadas em repouso por 2 h a 27 °C para que aderissem e
inoculadas com o vírus recombinante a uma multiplicidade de infecção (M.O.I) de 1,
considerando o menor título viral esperado (2 x 107 pfu/mL). Ao controle negativo, foi
acrescentado igual volume de meio de Grace. Os cultivos inoculados foram mantidos a 27 °C
durante 1 h, sendo levemente agitados a cada 15 min. Passado o tempo de incubação, foi
acrescentado meio de Grace suplementado a um volume final de 10 mL e as células foram
incubadas a 27 °C durante o tempo de infecção desejado.
As células foram, então, destacadas mecanicamente da garrafa de cultura e a suspensão
celular foi clarificada centrifugando a 500 x g durante 5 min. As células foram lavadas 2
vezes com 500 µL de PBS e armazenadas em 100 µL de PBS a -20 °C.
43
3.2.4 Detecção do DNA viral e verificação da presença do fragmento clonado
Células Sf9 infectadas com baculovírus recombinantes e células Sf9 não infectadas
(controle negativo) foram recolhidas após 24 h e 48 h de incubação, conforme descrito no
item 3.2.3 e submetidas à extração do DNA total (KING et al., 1992).
As células foram rompidas com 250 µL de tampão de rompimento (50 mM Tris-HCl,
pH 8,0, 5 % β-mercaptoetanol, 0,4 % SDS, 10mM EDTA, pH 8,0) e foram adicionados 12,5
% de proteinase K (10 mg/mL, Sigma). A mistura foi homogeneizada e incubada a 37 °C
durante 30 min. Foi feita uma extração dos debris celulares com igual volume de solução de
fenol:clorofórmio:álcool isoamílico e centrifugação a 16000 x g durante 5 min. A fase aquosa
foi transferida para novo tubo e extraída novamente com igual volume de solução de
fenol:clorofórmio:álcool isoamílico. A fase aquosa foi precipitada na presença de 10 % de
Acetato de Sódio 3 M e 3 volumes de etanol 96 % gelado, conforme descrito no item 3.1.4. O
precipitado foi mantido em 100 µL de TE (QIAGEN) a 4 °C durante 16 h. Passado esse
tempo, foi aquecido a 37 °C por 10 min e só então foi ressuspendido.
A detecção do DNA viral foi feita através de PCR utilizando os oligonucleotídeos
iniciadores M13/pUC (+) e M13/pUC (-) para confirmar a presença dos vírus recombinantes.
Uma alíquota de 3 µL do DNA total extraído foi utilizada como molde para a reação, a qual
foi realizada com “PCR SuperMix High Fidelity” (Invitrogen), de acordo com as
recomendações do fabricante. O bacmídio utilizado na transfecção de células Sf9 foi
empregado como controle positivo da reação.
Os produtos de PCR foram submetidos ao seqüenciamento nucleotídico, conforme
descrito no item 3.1.4. Os oligonucleotídeos iniciadores utilizados foram os mesmos
empregados nas reações de seqüenciamento dos bacmídios (item 3.2.1, figura 6).
44
A figura 8 mostra um esquema representativo dos passos realizados nesta etapa do
trabalho.
Canamicina
Gentamicina
Tetraciclina
X-gal / IPTG
Plasmídeo
recombinante
Transposição em
E. coli DH10Bac
Transfecção de
células de inseto
P1 Baculovírus
recombinantes
Sequenciamento
nucleotídico
Confirmação da presença do
inserto no baculovírus
Seleção dos clones
recombinantes
Confirmação da presença
do inserto no bacmídio
Sequenciamento
nucleotídico
Figura 8: Resumo esquemático das etapas desenvolvidas para obtenção do baculovírus recombinante. O
plasmídeo recombinante foi transformado em E. coli DH10Bac e os clones selecionados na presença de
gentamicina, tetracilcina, canamicina, X-gal e IPTG foram confirmado quanto à presença do inserto por PCR. Os
clones selecionados foram submetidos ao seqüenciamento nucleotídico e um deles foi utilizado na transfecção de
células de inseto para produção dos baculovírus recombinantes. Os baculovírus obtidos foram confirmados
quanto à presença do inserto por PCR e a integridade do fragmento MSP-119 kDa Modificada clonado foi
verificada por seqüenciamento nucleotídico.
45
3.3 Expressão da proteína recombinante MSP-119 kDa Modificada
3.3.1 Eletroforese de proteína
As proteínas foram visualizadas por eletroforese em gel de SDS-PAGE 15 % em
sistema de Miniprotean II, da Bio-Rad (LAEMMLI, 1970). As soluções necessárias à corrida
eletroforética, bem como a montagem do sistema foram feitos conforme as recomendações do
fabricante. Uma alíquota de 12 µL de células Sf9 infectadas obtidas em diferentes tempos de
infecção foi acrescida de 3 µL de tampão de amostra 5X, rompida por fervura em banhomaria a 100 °C por 5 min e aplicada no gel. A corrida foi realizada a aproximadamente 80 V.
Após a eletroforese, o gel de poliacrilamida foi corado em solução de Azul de Coomassie
R250 (2,5g/L em solução de 45 % metanol e 15 % ácido acético) durante 16 h e descorado em
solução de etanol 30 % por aproximadamente 2 h. As proteínas foram visualizadas a olho nu.
O gel foi devidamente seco e registrado por digitalização.
3.3.2 Cinética de expressão da MSP-119 kDa Modificada recombinante
Células Sf9 foram infectadas conforme descrito no item 3.2.3 e recolhidas após 24, 48,
72 e 96 h de incubação com baculovírus recombinante. Os precipitados celulares foram
rompidos e analisados por SDS-PAGE conforme descrito no item 3.3.1.
46
3.3.3 Análise do rendimento por densitometria
O rendimento da MSP-119 kDa Modificada expressa foi avaliado por densitometria (GS800 Calibrated Densitometer, Bio-Rad), utilizando o programa Quantity One, versão 4.4.1, da
Bio-Rad. Foi avaliado, também, o percentual da MSP-119 kDa expressa em relação às demais
proteínas celulares.
47
4 RESULTADOS
4.1 Amplificação e clonagem do fragmento MSP-119 kDa Modificada
Para obtenção do fragmento MSP-119 kDa Modificada foram realizadas 2 etapas de PCR,
como mostra a figura 5. Após a primeira etapa, foi gerado um fragmento de aproximadamente
500 pb utilizando-se os oligonucleotídeos RG 466 (+) e RG 468 (-) (Figura 9A). O produto
dessa reação foi utilizado como molde na segunda etapa, na qual foram utilizados os
oligonucleotídeos RG 466 (+) e RG 467 (-), gerando o fragmento MSP-119 kDa Modificada, de
aproximadamente 500 pb (Figura 9B). Não é possível diferenciar, quanto ao tamanho, o
produto das etapas 1 e 2 pois a diferença de nucleotídeos entre eles é de aproximadamente 40
pb.
A
B
800 pb
~500 pb
400 pb
Figura 9: Eletroforese em gel de 0,8 % agarose dos produtos de PCR para obtenção do fragmento MSP-119 kDa
Modificada. PPM: “Low Mass DNA Ladder”. A: Eletroforese da primeira etapa do PCR. 1: controle da reação,
2: produto esperado na etapa 1. B: Eletroforese da segunda etapa do PCR. 1: controle da reação, 2: produto
esperado na etapa 2. A seta indica a banda correspondente ao produto esperado na amplificação.
Após digestão do inserto e do vetor com as enzimas Xba I e Hind III, ambos foram
submetidos à reação de ligação com a enzima T4 DNA Ligase e o produto da ligação foi
48
transformado em células E. coli DH5 e E. coli SURE por eletroporação. Foram gerados 9
clones resultantes da transformação do produto da ligação em E. coli DH5 e 18 clones em E.
coli SURE. O controle positivo da transformação feito através do plasmídeo comercial pUC
19 confirmou a eficiência das células competentes.
Os 27 clones gerados foram cultivados em meio LB líquido para extração do DNA
plasmidial com solução de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico. Uma seleção inicial dos
recombinantes foi feita comparando-se, em relação ao tamanho, os plasmídeos extraídos com
o plasmídeo pFastBac DUAL sem inserção. Após eletroforese em gel de agarose, foi possível
visualizar 12 clones de maior tamanho – compatível com o tamanho esperado para o
plasmídeo recombinante, aproximadamente 5700 pb - quando comparados com os demais
sem inserção - de aproximadamente 5200 pb (Figura 10). Dos recombinantes, 4 foram
oriundos de E. coli SURE (clones 3, 4, 8 e 14) e 8 foram oriundos de E. coli DH5 (19, 20,
22, 23, 24, 25, 26 e 27).
Figura 10: Eletroforese em gel de 0,8 % agarose da extração do DNA plasmidial dos clones obtidos após
transformação. 1 a 27: produto da extração do DNA plasmidial dos clones 1 a 27 respectivamente, 28: pFastBac
DUAL sem inserção. As raias com asterisco apresentam os plasmídeos dos clones possivelmente recombinantes.
49
A confirmação da presença do fragmento MSP-119
kDa
Modificada nestes clones foi
obtida por ensaio de PCR com os oligonucleotídeos RG 466 (+) e RG 467 (-), que gerou o
produto esperado de cerca de 500 pb (Figura 11A). Da mesma forma, a clivagem com as
enzimas Xba I e Hind III (Figura 11B) produziu um perfil contendo uma banda de
aproximadamente 5200 pb, correspondente ao vetor, e outra de aproximadamente 500 pb,
correspondente ao fragmento de interesse. Todos os 12 clones foram positivos para ambos os
ensaios e foram submetidos à reação de sequenciamento nucleotídico para verificação da
integridade do fragmento MSP-119 kDa Modificada.
A
800 pb
~500 pb
400 pb
B
6557 pb
4361 pb
800 pb
400 pb
5200 pb
~500 pb
Figura 11: Confirmação da presença do fragmento MSP-119 kDa Modificada nos clones obtidos após ligação ao
pFastBac DUAL. A: Eletroforese em gel de 1 % agarose dos produtos do PCR. PPM: “Low Mass DNA Ladder”,
1: controle da reação, 2 a 13: reação feita com os clones 3, 4, 8, 14, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, e 27
respectivamente. B: Eletroforese em gel de 0,8 % agarose dos produtos das reações de digestão. PPM 1:
“Lambda Hind III DNA Ladder”, PPM 2: “Low Mass DNA Ladder”, 1 a 12: digestão dos clones 3, 4, 8, 14, 19,
20, 22, 23, 24, 25, 26, e 27 respectivamente. As setas indicam as banda esperadas.
Os plasmídeos recombinantes foram seqüenciados utilizando-se os oligonucleotídeos
RG466 (+) e RG446 (-). Todos obtiveram 100 % de identidade com a seqüência esperada.
50
Aleatoriamente, foram escolhidos 3 clones para dar continuidade ao trabalho, os clones 3, 22
e 26.
4.2 Obtenção do baculovírus recombinante
Os 3 plasmídeos recombinantes escolhidos foram utilizados na transposição de células
E. coli DH10Bac. Todas as transposições geraram colônias brancas. Foram selecionados 4
clones provenientes do clone 3, referidos como 3.1, 3.2, 3.3 e 3.4; 4 clones provenientes do
clone 22, referidos como 22.1, 22.2, 22.3 e 22.4; e 2 clones provenientes do clone 26,
referidos como 26.1 e 26.2. Os clones selecionados foram estriados 2 vezes consecutivas em
meio LB-ágar suplementado conforme descrito no item 3.2.1 e apresentaram estabilidade em
relação à transposição. Os clones foram, então, cultivados em meio LB líquido suplementado
para extração do DNA do bacmídio.
A seleção dos bacmídios recombinantes foi feita por PCR utilizando os
oligonucleotídeos iniciadores M13/pUC (+) e M13/pUC (-), na qual se esperava obter um
produto de aproximadamente 3000 pb (Figura 6). Os clones 3.1, 3.2, 3.4, 22.1, 22.2, 22.4,
26.1 e 26.2 apresentaram produto amplificado compatível com o esperado (Figura 12); os
demais foram descartados.
O bacmídio 3.1 foi escolhido para ser submetido ao seqüenciamento nucleotídico e dar
continuidade ao trabalho. Os oligonucleotídeos empregados na reação de seqüenciamento
foram RG 466 (+), RG 436 (+), RG 446 (-), pFastBac DUAL (+), pFastBac DUAL (-),
M13/pUC (+) e M13/pUC (-). Foi possível confirmar a integridade gênica de todo o
fragmento MSP-119 kDa Modificada que foi clonado.
51
4361 pb
~3 kb
2322 pb
Figura 12: Eletroforese em gel de 1 % agarose dos produtos do PCR para confirmação da presença do fragmento
MSP-119 kDa Modificada nos bacmídios extraídos após transposição em E. coli DH10Bac. PPM: “Lambda Hind
III DNA Ladder”, 1: controle da reação, 2 a 11: reação feita com os bacmídios 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 22.1, 22.2, 22.3,
22.4, 26.1 e 26.2 respectivamente. A seta indica a banda correspondente ao produto esperado na amplificação.
Células Sf9 foram transfectadas com bacmídio 3.1. Após 72 h da transfecção, foi
possível observar células em suspensão no meio de cultura e de volume aumentado, aspectos
que, segundo o fabricante, são característicos de células Sf9 infectadas com baculovírus; o
controle negativo permaneceu inalterado. O sobrenadante da transfecção foi utilizado na
produção do estoque viral que, por sua vez, foi utilizado nas infecções posteriores.
As células infectadas com os baculovírus recombinantes durante 24 h e 48 h e os
respectivos controles negativos foram submetidas à extração do DNA total para detecção do
fragmento MSP-119
kDa
Modificada no DNA viral através de PCR utilizando os
oligonucleotídeos iniciadores RG 466 (+) e M13pUC (-). O bacmídio 3.1 foi empregado
como controle positivo da reação. Foi possível detectar produto amplificado, de
aproximadamente 1000 pb, referente ao fragmento MSP-119 kDa Modificada no DNA viral, nas
reações feitas com o DNA total das células infectadas em 24 h e 48 h (Figura 13).
Para certificação de que o fragmento clonado manteve sua integridade gênica após a
formação dos vírus, foi realizado o seqüenciamento nucleotídico utilizando como molde os
produtos do PCR feito para detecção do DNA viral. Os oligonucleotídeos empregados na
52
reação de seqüenciamento foram RG 466 (+), RG 436 (+), RG 446 (-), pFastBac DUAL (+),
pFastBac DUAL (-), M13/pUC (+) e M13/pUC (-). Foi possível confirmar a integridade
gênica de todo o fragmento MSP-119 kDa Modificada que foi clonado nas células infectadas
com baculovírus recombinante por 24 h.
Figura 13: Eletroforese em gel de 0,8 % agarose dos produtos do PCR para detecção do fragmento MSP-119 kDa
2027
Modificada no DNA
de pb
células infectadas com baculovírus recombinante. PPM: “Lambda Hind III DNA
Ladder”, 1: controle da reação, 2: controle positivo da reação, feito com bacmídio 3.1, 3: reação com DNA de
células não infectadas cultivadas por 24 h, 4: reação com DNA de células infectadas por 24 h, 5: reação com ~1000 pb
DNA de células não infectadas cultivadas por 48 h e 6: reação com DNA de células infectadas por 48 h. A seta
indica a banda correspondente ao produto esperado na amplificação.
500 pb
4.3 Expressão da proteína recombinante MSP-119 kDa Modificada
A cinética de expressão da proteína MSP-119 kDa Modificada recombinante permitiu a
detecção, em SDS-PAGE, de uma banda de aproximadamente 18 kDa - correspondente à
proteína de interesse - a partir de 48 h de infecção. Após 72 h e 96 h de infecção, a expressão
foi significativa (Figura 14).
53
A análise preliminar da expressão da MSP-119 kDa Modificada por densitometria revelou
que, em 96 h, houve uma maior produção da proteína comparado aos outros tempos. O
percentual de expressão da MSP-119 kDa Modificada em relação às demais proteínas celulares
aumentou gradativamente com o tempo de infecção, alcançando aproximadamente 8 % e 12
% da massa total de proteínas celulares em 72 h e 96 h, respectivamente.
PPM
1
2
3
4
5
18,4 kDa
20 kDa
15 kDa
Figura 14: SDS-PAGE da cinética de expressão da MSP-119 kDa Modificada. PPM: “Precision Plus Protein
Standard DUAL Color” (Bio-Rad). 1: Células Sf9 cultivadas por 72 h não infectadas. 2 a 5: Células Sf9
rompidas após infecção com baculovírus recombinante por 24, 48, 72 e 96 horas de infecção, respectivamente. A
seta indica a banda correspondente à proteína recombinante.
54
5 DISCUSSÃO
O presente trabalho se propôs a expressar a proteína recombinante MSP-119
kDa
Modificada em células de inseto utilizando baculovírus. O primeiro estudo de expressão e
verificação da imunogenicidade da MSP-119
kDa
Modificada de P. falciparum foi feito em
sistema procarioto (HOLDER et al., 1988). Embora a proteína expressa tenha induzido uma
resposta imune por anticorpos em camundongos imunizados, o sistema procarioto não foi
capaz de reproduzir a estrutura nativa da proteína e os soros dos animais imunizados
apresentaram baixo título de anticorpos específicos.
A estrutura tridimensional de uma proteína é fundamental para o exercício de sua função
biológica em um organismo. Em se tratando de micro-organismos, a estrutura tridimensional
de compostos de superfície pode ser importante para o reconhecido de uma célula susceptível
a infecção e para o reconhecimento pelo sistema imune hospedeiro, constituindo um antígeno.
Os determinantes antigênicos estão diretamente relacionados à conformação da proteína e são
geralmente formados por regiões descontínuas da cadeia protéica que se aproximam quando a
proteína assume sua estrutura tridimensional. No caso de proteínas que contém múltiplas
pontes dissulfeto, como a MSP-119 kDa Modificada, a conformação protéica é substancialmente
alterada quando na ausência dessas interações o que afeta diretamente sua imunogenicidade.
Para expressão de proteínas cuja integridade conformacional é estritamente requerida, a
expressão pode ser feita em sistemas eucariotos, pois os organismos eucariotos geralmente
fazem uma série de modificações pós-traducionais nas proteínas sintetizadas, conferindo sua
estrutura adequada. A expressão em sistemas eucariotos pode ser feita em células de
mamíferos, em leveduras ou em células de inseto utilizando baculovírus.
55
Os baculovírus, em especial o AcMNPV, são amplamente empregados na expressão de
uma grande número de genes eucarióticos. Os produtos, geralmente, assumem uma
conformação correta e são submetidos a uma série de modificações pós-traducionais,
resultando na completa atividade biológica da molécula e antigenicidade esperada. A
formação de pontes dissulfeto constitui uma modificação pós-traducional que, no caso da
MSP-119
kDa
Modificada, é essencial para sua conformação e, consequentemente, para sua
função. A formação dessas pontes dissulfeto é favorecida no lúmen do retículo
endoplasmático (RE) da célula, que se caracteriza por ser um ambiente oxidativo. Ao
contrário, o citosol é um ambiente altamente redutor e, por isso, proteínas ricas em pontes
dissulfeto somente adquirem sua conformação tridimensional após passarem pelo RE. De
igual forma, espera-se que o correto enovelamento da MSP-119 kDa Modificada só ocorra após
sua passagem pelo RE, evento que só é possível na presença de um peptídeo sinal N-terminal,
responsável por direcioná-la a esta organela.
O primeiro estudo expressando antígenos protéicos maláricos em células de inseto
utilizando baculovírus foi feito por Murphy e colaboradores (MURPHY et al., 1990), no qual
sequências referentes à porção C-terminal da MSP-1 e à porção repetitiva da CSP foram
expressas em diferentes construções. Os autores mostraram que as proteínas puderam ser
expressas em células de inseto tanto na forma híbrida como separadamente. Entretanto, sua
conformação correta e antigenicidade só foram garantidas na presença de um peptídeo sinal e
puderam ser secretadas quando retirada a âncora hidrofóbica.
Em nosso estudo, não podemos afirmar que a MSP-119 kDa Modificada obtida apresenta a
conformação esperada, pois o cassete de expressão desenvolvido para clonagem da proteína
no genoma viral não continha um peptídeo sinal para direcioná-la ao RE. Entretanto, estamos
desenvolvendo um estudo em paralelo com um outro cassete de expressão, que contém Fator
de Ativação do Plasminogênio Tecidual Humano (tPA) como peptídeo sinal (GOLDEN et al.,
56
1998) e nosso objetivo é comparar os resultados obtidos nessas diferentes construções. A
expressão da MSP-119 kDa Modificada recombinante está sendo útil para o estabelecimento da
metodologia de expressão em células de inseto utilizando baculovírus que será empregada não
somente para esse novo cassete de expressão para MSP-119 kDa Modificada, mas também em
outros estudos que são desenvolvidos em nosso laboratório. No projeto destinado ao
desenvolvimento de uma vacina combinada para febre amarela e malária, a proteína expressa
será empregada na geração de anti-soros específicos, que serão utilizados em estudos de
caracterização da infecção pelo vírus recombinante.
Obtivemos um bom rendimento com o resultado preliminar da expressão da MSP-119 kDa
Modificada. Pelo SDS-PAGE (Figura 14), é possível observar que provavelmente houve
expressão da proteína a partir de 48 horas de infecção com baculovírus recombinante. As
bandas referentes à MSP-119 kDa Modificada nos demais tempos se mostraram gradativamente
mais intensas, o que foi confirmado por densitometria e está de acordo com o esperado, uma
vez que o cassete de expressão da MSP-119 kDa Modificada foi clonado fusionado ao promotor
da poliedrina, que é um promotor induzido tardiamente na infecção pelo baculovírus.
De acordo com o “Bac-to-Bac Baculovirus Expression System”, o máximo de expressão
de proteínas recombinantes a serem secretadas é geralmente observado entre 30 e 72 horas de
infecção enquanto proteínas recombinantes que permanecerão intracelulares geralmente
apresentam um máximo de expressão entre 48 e 96 horas. O resultado aqui apresentado está
consistente com o esperado. Quando comparamos a proporção entre a expressão da MSP-119
kDa
Modificada com as demais proteínas celulares, vemos que essa relação aumenta com o
tempo de infecção, chegando a aproximadamente 12 % das proteínas totais em 96 horas.
Seria interessante acrescentar mais um tempo de infecção, de 120 horas, e verificar se
ocorrem alterações significativas no perfil de expressão da proteína observado. Estabelecido o
melhor tempo de infecção para expressão da MSP-119
kDa
Modificada, a proteína será
57
purificada por cromatografia de afinidade em coluna de níquel para, então, ser usada nos
ensaios de caracterização dos vírus recombinantes.
58
6 CONCLUSÕES
o
Foi possível obter um cassete de expressão para clonagem da MSP-119 kDa Modificada
no genoma de baculovírus;
o
A expressão da MSP-119 kDa Modificada foi detectada em SDS-PAGE a partir de 48
horas de infecção com baculovírus recombinante;
o
A análise preliminar por densitometria revelou que, em 96 horas, a expressão da
proteína recombinante correspondeu a aproximadamente 12 % da massa protéica total
celular;
o
O sistema de expressão em células de inseto utilizando baculovírus se mostrou
adequado para expressão da proteína MSP-119
falciparum.
kDa
Modificada de Plasmodium
59
7 PERSPECTIVAS
o
Purificar a MSP-119 kDa Modificada recombinante por cromatografia de afinidade em
coluna de níquel;
o
Imunizar camundongos com a proteína recombinante purificada para obtenção de antisoros específicos a serem utilizados em estudos de caracterização da infecção pelo
vírus recombinante FA/MSP-119 kDa;
o
Desenvolver um novo cassete de expressão contendo o peptídeo sinal TPA e comparar
os resultados obtidos.
60
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