Mestrado em Engenharia Ambiental

Mestrado em
Engenharia Ambiental
Programa de Pós-Graduação em Engenharia Ambiental
DISSERTAÇÃO
CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA
E MOLECULAR DE BACTÉRIAS
REDUTORAS DE SULFATO
ISOLADAS NA RPPN DO CARAÇA,
MG
AUTOR: IVAN CEZARINI PATRÍCIO
OURO PRETO, MG
2009
Universidade Federal de Ouro Preto
Programa de Pós-Graduação Engenharia Ambiental
Mestrado em Engenharia Ambiental
Ivan Cezarini Patrício
“CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA E MOLECULAR DE
BACTÉRIAS REDUTORAS DE SULFATO ISOLADAS NA
RPPN DO CARAÇA, MG”
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Engenharia Ambiental,
Universidade Federal de Ouro Preto, como
parte dos requisitos necessários para a
obtenção do título: “Mestre em Engenharia
Ambiental – Área de Concentração:
Saneamento Ambiental”
Orientadora: Profa. Dra.. Maria Célia da Silva Lanna
Co-Orientadora: Profa. Dra.. Silvana de Queiroz Silva
Ouro Preto, MG
2009
P314c
Patrício, Ivan Cezarini.
Caracterização bioquímica e molecular de bactérias redutoras de sulfato
isoladas na RPPN do Caraça, MG [manuscrito] / Ivan Cezarini Patrício. - 2009.
xi, 89f. : il., graf., tabs.
Orientadora: Profa. Dra. Maria Célia da Silva Lanna.
Co-orientadora: Profa. Dra. Silvana de Queiroz Silva.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto.
Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Mestrado em Engenharia Ambiental.
Área de concentração: Saneamento Ambiental.
1. Sulfatos - Teses. 2. Biorremediação - Teses. 3. Bioquímica molecular Teses. I. Universidade Federal de Ouro Preto. II. Título.
CDU: 577(815.1)
Catalogação: [email protected]
AGRADECIMENTOS
A realização deste trabalho contou com a ajuda de várias pessoas, tanto de maneira
direta quanto indiretamente, aos quais agradeço:
-
Em primeiro lugar meus pais e familiares, que sempre me apoiaram para a continuidade
de meus estudos desde o meu ingresso na universidade;
-
Ao Programa de Pós-graduação em Engenharia Ambiental – ProAgua – e seus
coordenadores, professores e funcionários pela oportunidade de realizar o presente
trabalho;
-
Ao programa de bolsas da CAPES e ao PRODOC-CAPES que forneceram recursos
sem os quais a minha estadia na instituição e realização do trabalho não seriam
possíveis;
-
À Profa. Dra. Maria Célia da Silva Lanna, que me concedeu a possibilidade de
confeccionar este projeto no Laboratório de Microbiologia do ICEB-UFOP além com
os meios necessários à realização do mesmo;
-
À Profa. Dra. Silvana de Queiroz Silva, que como minha co-orientadora deu importantes
contribuições para a realização do trabalho;
-
Ao Profo. Dr. Hubert Mathias Peter Roeser e seus alunos e pesquisadores do DEGEO,
que realizaram a coleta das amostras utilizadas neste trabalho, além de fornecer ajuda
necessária á sua confecção;
-
A Universidade Federal de Ouro Preto – UFOP – e seus professores e técnicos que
forneceram apoio á confecção do trabalho;
-
Aos professores, técnicos, estagiários, bolsistas e mestrandos que atualmente fazem
parte, ou mesmo já fizeram, do Laboratório de Microbiologia do ICEB cuja ajuda na
confecção dos experimentos e apoio foram imprescindíveis para o término do trabalho;
-
Aos estudantes do Laboratório de Microscopia e Microanálise (Microlab) do
Departamento de Geologia da UFOP (DEGEO), pela disponibilidade para realização
das análises;
-
Aos meus grandes amigos da República DNA, da qual fui morador, que sempre me
apoiaram de várias formas e com os quais sempre pude contar.
II
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO...................................................................................................... 12
1.1
Objetivo Geral ........................................................................................................ 14
1.2
Objetivos Específicos ............................................................................................. 14
2
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................. 15
2.1
Classificação Taxonômica e Caracterização dos Grupos de BRS ..................... 15
2.2
Distribuição e Ecologia dos Grupos de BRS ....................................................... 18
2.3
Bioquímica e Fisiologia das Bactérias Redutoras de Sulfato ............................. 20
2.4
Utilização das BRS para Imobilização de Metais e Biorremediação ................ 23
2.5
Estudo de BRS em Biorreatores ........................................................................... 27
2.6
BRS Associadas à Biocorrosão ............................................................................. 30
3
MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................. 33
3.1
Área de Estudo e de Amostragem ........................................................................ 33
3.2
Cultivo Inicial das Amostras................................................................................. 34
3.3
Isolamento das Culturas Puras de Bactérias Redutoras de Sulfato.................. 35
3.4
Caracterização dos Isolados Obtidos ................................................................... 36
3.4.1 Caracterização Morfológica ................................................................................... 36
3.4.2 Caracterização Bioquímica Visando a Identificação Taxonômica ...................... 37
3.4.3 Caracterização Bioquímica Visando a Identificação de Processos ...................... 38
3.4.4 Caracterização Taxonômica Presuntiva dos Isolados ........................................... 39
3.4.5 Caracterização Molecular dos Isolados ................................................................. 39
3.5
Métodos para Escolha de Linhagens para Testes Fisiológicos .......................... 40
3.5.1 Determinação do Tempo de Redução de Sulfato em Relação ao pH ................... 41
3.5.2 Determinação do Número de Células dos Isolados após Redução de Sulfato em
Diferentes Valores de pH ................................................................................................... 41
3.6
Determinação das Curvas de Crescimento e Tempo de Geração dos Isolados 42
3.7
Quantificação do Consumo de Sulfato pelos Isolados ........................................ 44
3.8
Quantificação da Produção de Sulfeto pelos Isolados ........................................ 45
4
RESULTADOS ...................................................................................................... 46
III
4.1
Amostras Positivas para Redução de Sulfato ...................................................... 46
4.2
Linhagens Isoladas................................................................................................. 47
4.3
Caracterização Morfológica dos Isolados ............................................................ 48
4.3.1 Morfologia das Colônias ........................................................................................ 48
4.3.2 Morfologia das Células Observadas ao Microscópio Ótico (M.O.) ...................... 48
4.3.3 Morfologia das Células ao Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV) .......... 49
4.4
Caracterização Bioquímica dos Isolados ............................................................. 51
4.5
Identificação Taxonômica Presuntiva dos Isolados ............................................ 57
4.6
Caracterização Molecular dos Isolados ............................................................... 58
4.7
Escolha de Linhagens para Testes Fisiológicos ................................................... 62
4.8
Curva de Crescimento e Tempo de Geração dos Isolados ................................. 65
4.9
Quantificação do Consumo de Sulfato e Produção de Sulfeto pelos Isolados .. 66
5
DISCUSSÃO .......................................................................................................... 69
6
CONCLUSÕES ...................................................................................................... 75
7
PERSPECTIVAS ................................................................................................... 77
8
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................. 78
9
ANEXOS ................................................................................................................. 86
IV
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 2-1: Árvore filogenética baseada em seqüências de DNA ribossomal descritas
em bactérias redutoras de sulfato. Números dentro dos quadros indicam o
número de espécies diferentes presentes em um determinado grupo e entre
parênteses a identificação no banco de dados. Modificado de Muyzer e
Stams (2008). .............................................................................................. 17
FIGURA 2-2: Ciclo biogeoquímico do enxofre segundo Muyzer e Stams (2008). ........... 18
FIGURA 2-3: Redução assimilativa e dissimilativa do sulfato. Adaptado de Madigan et al.
(2009). ......................................................................................................... 21
FIGURA 2-4: Modelo de Ress revisado segundo Brunner e Bernasconi (2005)............... 22
FIGURA 2-5: Rota de biodegradação proposta para (A) Fluoreno e (B) Fenantreno por
BRS segundo TSAI et al. (2008). ............................................................... 25
FIGURA 2-6: Modelo da corrosão do aço por BRS segundo Barton e Fauque (2009). .... 30
FIGURA 3-1: Região do Rio Conceição, MG. Locais de coleta e principais atividades
humanas próximas. ..................................................................................... 33
FIGURA 4-1: Crescimento dos organismos em meio sólido de Postgate C após
enriquecimento e espalhamento das amostras. Incubação em anaerobiose
por 24 horas................................................................................................. 46
FIGURA 4-2: Isolados de BRS das amostras apresentando diferenças na redução de
sulfato (visualmente) em meio Postgate C após uma semana de incubação à
32 ºC em anaerobiose, o primeiro tubo (da esquerda para a direita)
demonstra um controle negativo. ................................................................ 47
FIGURA 4-3: Isolados bacterianos ao microscópio eletrônico. A: R104A, B: R105A, C:
R107A, D: R111A, E: R301A, F: R305A, G: R307A e H: R310A............ 50
FIGURA 4-4: Teste de desnitrificação de dois dos isolados. O primeiro e o segundo tubos
(da esquerda para a direita) representam, respectivamente, um controle
negativo e um positivo utilizando E. coli.................................................... 53
FIGURA 4-5: Dendrograma indicando a diferenciação bioquímica entre os isolados da
amostra R1A. Os números de 1 à 12 representam, respectivamente, os
isolados de R101A à R112A. ...................................................................... 56
FIGURA 4-6: Dendrograma indicando a diferenciação bioquímica entre os isolados da
amostra R3A. Os números de 1 à 14 representam, respectivamente, os
isolados de R301A à R314A. ...................................................................... 56
V
FIGURA 4-7: Gel de agarose mostrando a amplificação do DNA dos isolados. .............. 59
FIGURA 4-8: Gel de agarose mostrando a amplificação do DNA dos isolados. .............. 59
FIGURA 4-9: Gel de agarose mostrando a quantificação do DNA dos isolados. ............. 60
FIGURA 4-10: Árvore filogenética contendo sequências do gene DNAr 16S (1.137 pb)
construída pelo método Neighbor-Joining e modelo Maximum Composite
Likelihood no programa Mega 4.1. Análise de Bootstrap com 1000
réplicas. Números de referência no GenBank se encontram entre
parênteses.. .................................................................................................. 61
FIGURA 4-11: Curvas de crescimento dos isolados e equação de sua fase exponencial. . 65
FIGURA 4-12: Valores das concentrações de sulfato e sulfeto acumulado dos isolados em
crescimento controlado. .............................................................................. 67
FIGURA 9-1: Curva padrão de sulfato. ............................................................................. 87
FIGURA 9-2: Curva padrão de sulfeto. ............................................................................. 88 VI
LISTA DE QUADROS
QUADRO 4-1: Características das colônias das linhagens isoladas observadas em meio
Postgate C sólido. ...................................................................................... 48
QUADRO 4-2: Características morfológicas ao M.O. das linhagens isoladas após técnica
de coloração de Gram. .............................................................................. 49
QUADRO 4-3: Características metabólicas gerais dos isolados da Amostra R1A
incubados em anaerobiose à 32ºC por 48 horas. ....................................... 51
QUADRO 4-4: Características metabólicas gerais dos isolados da Amostra R3A
incubados em anaerobiose à 32 ºC por 48 horas. ...................................... 52
QUADRO 4-5: Diferenciação dos isolados quanto à atividade de catalase e
desnitrificação. Teste de desnitrificação realizado após incubação à 32 ºC
em anaerobiose por uma semana em meio de cultura peptonado
(CLESCERI et al., 1999). ......................................................................... 52
QUADRO 4-6: Características dos isolados quanto à utilização de diferentes substratos
como fonte de carbono. Incubação à 32 ºC em anaerobiose por uma
semana. Amostras R1A. ............................................................................ 54
QUADRO 4-7: Características dos isolados quanto à utilização de diferentes substratos
como fonte de carbono. Incubação a 32 ºC em anaerobiose por uma
semana. Amostras R3A. ............................................................................ 55
QUADRO 4-8: Similaridade bioquímica entre os isolados da amostra R1A. .................... 57
QUADRO 4-9: Similaridade bioquímica entre os isolados da amostra R3A. .................... 57
QUADRO 4-10: Proximidade taxonômica entre os isolados seqüenciados e os
microrganismos catalogados no GenBank. ............................................... 61 VII
LISTA DE TABELAS
TABELA 2-1: Equações estequiométricas dos principais doadores de elétrons utilizados
pelas BRS. Baseada no trabalho de Liamleam e Annachhatre (2007)....... 29
TABELA 4-1: Número médio de UFC´s entre as amostras positivas para redução de
sulfato. ........................................................................................................ 46
TABELA 4-2: Concentração de DNA das amostras purificadas segundo leitura do Ladder
Massa. ........................................................................................................ 60
TABELA 4-3: Determinação do tempo de início de redução do sulfato pelos isolados em
diferentes valores de pH. ............................................................................ 62
TABELA 4-4: Determinação do tempo de redução completa de sulfato pelos isolados em
diferentes valores de pH. ............................................................................ 63
TABELA 4-5: Determinação do número de células em cada isolado após redução total do
sulfato nos diferentes valores de pH testados. ........................................... 64
TABELA 4-6: Equação da fase exponensial, R2, µmax e Tg dos isolados calculados com
base em suas curvas de crescimento. ......................................................... 66
TABELA 4-7: Relação entre o consumo de sulfato e a produção de sulfeto pelos isolados.
.................................................................................................................... 68
TABELA 9-1: Solução Tampão A para dosagem de sulfato, segundo Clesceri et al.
(1999). ........................................................................................................ 86
TABELA 9-2: Soluções para dosagem de sulfeto total, segundo Clesceri et al. (1999). ... 88 VIII
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AFS: Adenosina Fosfosulfato.
BRN: Bactérias Redutoras de Nitrato.
BRS: Bactérias Redutoras de Sulfato.
BTEX: benzeno, tolueno, etilbenzeno e xileno.
DAM: Drenagem àcidas de minas.
DEGEO: Departamento de Geologia.
FAFS: Fosfoadenosina fosfosulfato.
ICEB: Instituto de Ciências Exatas e Biológicas.
MEV : Microscópio Eletrônico de Varredura.
MICROLAB: Laboratório de Microscopia e Microanálise do Departamento de Geologia.
M.O.: Microscópio ótico.
PAH’s: Polycyclic Aromatic Hydrocarbons = Hidrocarbonetos Aromáticos Policíclicos.
RPPN: Reserva Particular do Patrimônio Ambiental
Tg: Tempo de geração.
UFC’s: Unidades Formadoras de Colônias.
UFOP: Universidade Federal de Ouro Preto.
IX
RESUMO
O estudo sobre as bactérias redutoras de sulfato (BRS) tem sido direcionado, entre
vários aspectos, a sua identificação, considerando a importância das mesmas para os
processos de remediação de ambientes contaminados pelas mais diversas substâncias, visto
a atual demanda ambiental nos países industrializados. O uso de microrganismos na
remediação requer um conhecimento detalhado sobre a sua fisiologia e bioquímica, o qual
tem sido subsidiado por diversas pesquisas visando o aprimoramento de técnicas de
isolamento e identificação das diferentes características que tornam este grupo de bactérias
de grande utilidade nestes processos. No presente trabalho, a partir de amostras de
sedimento do Rio Conceição localizado na RPPN do Caraça em Minas Gerais, Brasil,
foram isoladas linhagens bacterianas de bastonetes Gram negativos e Gram positivos
capazes de reduzir sulfato a sulfeto de hidrogênio. Esses isolados bacterianos foram
submetidos a testes para a sua caracterização bioquímica e mostraram-se capazes de
utilizar variados substratos como fonte de carbono e elétrons para a redução de sulfato.
Testes adicionais demonstraram a capacidade destas linhagens em realizar metabolismos
diferenciados como a redução de nitrato. Em relação à investigação da sua fisiologia foram
determinadas as taxas de crescimento dos isolados R102A, R106A, R112A, R304A,
R307A e R313A em cultivo controlado, assim como a eficiência destas diferentes
linhagens para a produção de sulfeto como produto da redução do sulfato consumido,
embora não tenham sido observadas diferenças significativas entre algumas linhagens. A
identificação filogenética dos isolados citados, baseada nas sequências do DNAr 16S,
indicou que os mesmos pertencem à família Enterobacteriaceae, com similaridade em
torno de 99% com espécies de Enterobacter sp. e Pantoea sp. Com base nos resultados
fisiológicos e filogenéticos pode-se definir tais isolados como possivelmente pertencentes à
família Enterobacteriaceae. A utilização alternativa do sulfato como aceptor final de
elétrons demonstrada pelas linhagens isoladas, apesar desta característica metabólica ser
pouco comum entre os representantes da família Enterobacteriaceae é condizente com a
versatilidade desse grupo taxonômico. Destaca-se ainda que, a flexibilidade metabólica
para os isolados indica a possibilidade da sua utilização em processos de biorremediação e
imobilização de metais.
X
ABSTRACT
The study of sulphate-reducing bacteria (SRB) has been conducted, among several
aspects, for their identification, considering the importance of this bacteria for remediation
of contaminated environments by many substances, in observation at the current
environmental demands in industrialized countries. The application of microorganisms in
remediation requires a detailed knowledge about their physiology and biochemistry, which
has been subsidized by many approaches seeking the improvement of isolation and
identification techniques of different characteristics that make this bacterial group very
helpful in these processes. In this work, from sediment samples of Rio Conceição located
in the Caraça’s RPPN in Minas Gerais, Brazil, were isolated bacterial strains of Gram
negative and Gram positive rods able to reduce sulphate to hydrogen sulfide. These
bacterial strains were tested for their biochemical characterization and proved capable of
using several substrates as carbon and electrons sources to reduce sulphate. Additional
tests demonstrated the ability of these strains to perform distinguished metabolic features
as nitrate reduction. In relation to the physiological properties were determined the growth
rates of R102A, R106A, R112A, R304A, R307A e R313A strains in controlled cultivate,
as well as the efficiency of the various lineages for the production of sulfide as sulphatereduction product, although no significant differences have been observed among some
strains. Phylogenetic identification of these strains based on 16s rDNA sequences,
indicated that many of the isolates belong to the family Enterobacteriaceae, with similarity
around 99% with species of Enterobacter sp. and sp Pantoea. Based on the physiology and
phylogenetic results it can be conclude that the isolates as belong to the family
Enterobacteriaceae. The capability of using sulphate as electron’s acceptor demonstrated
by strains, despite being unusual among the family Enterobacteriaceae members is
consistent with the versatility of this taxonomic group. The metabolic flexibility
demonstrated by the isolates indicates the possibility of their use in bioremediation and
imobilization of metals.
XI
1
INTRODUÇÃO
Bactérias redutoras de sulfato (BRS) é uma designação usual para alguns grupos
bacterianos de vida livre, no meio ambiente. Estes são organismos que utilizam formas
oxidativas de enxofre, ao invés do oxigênio, como aceptor final de elétrons, tendo como
produto dessa reação o gás sulfídrico (H2S), processo esse denominado de “respiração do
sulfato” ou também de redução dissimilativa do enxofre (MADIGAN et al., 2009).
Atualmente, dezenas de gêneros de bactérias redutoras de sulfato são conhecidos,
podendo os mesmos ser distribuídos em vários grupos, tanto de bactérias Gram negativas
quanto de Gram positivas. As BRS apresentam um bom desenvolvimento em uma faixa
ampla de pH, podendo ser mesófilas, ou seja, a temperatura ideal de crescimento é de 20ºC
a 40ºC, ou termófilas crescendo e temperatura de até 70ºC (BARTON e FAUQUE, 2009).
A literatura registra vários trabalhos subseqüentes à descoberta das BRS, entretanto
não se identifica continuidade nos trabalhos iniciais, ou seja, inicialmente os trabalhos
eram baseados somente em questões de identificação e caracterização das BRS, sendo que
o seu uso biotecnológico só foi abrangido mais tardiamente, principalmente com o
surgimento de questões ambientais. Provavelmente este fato possa ser atribuído à
dificuldade de isolamento e manutenção das culturas puras, pois essas são bactérias
anaeróbias e o contato com o oxigênio pode levar á inativação ou inibição de muitas
enzimas ou proteínas utilizadas no processo de redução. Entretanto, mais recentemente,
têm sido detectados alguns desses microrganismos com certa habilidade na utilização de
oxigênio (LEMOS et al., 2001). Já foi comprovada a presença da enzima catalase nesses
organismos, fato que justifica o possível crescimento na presença de oxigênio
(WIERINGA et al., 2000).
Este grupo de bactéria é bastante difundido na natureza podendo ser encontrado
tanto no ambiente aquático quanto no ambiente terrestre, mas ocorre principalmente em
sedimentos,
onde
as
condições
redutoras
são
mais
favoráveis.
Por
serem
quimioheterotróficos utilizam compostos orgânicos de baixo peso molecular, tais como:
lactose, acetato e propionato, além do hidrogênio molecular (H2), como doadores de
elétrons e fonte de energia para o seu crescimento. Os compostos de enxofre mais
utilizados como aceptores finais de elétrons pelas BRS, são sulfitos (SO32-), tiossulfatos
(S2O32-) e sulfato (SO42-). Entretanto, a redução do sulfato, forma mais oxidativa do
12
enxofre, é a mais difundida devido à abundância do mesmo no ambiente (RABUS et al.,
2006).
Outro aspecto relevante com relação à redução dissimilativa do sulfato é a
importância geológica e processos, visto que o gás sulfídrico produzido pode reagir com
metais presentes no ambiente levando a formação de sulfetos metálicos. Evidências dessa
atuação podem ser remetidas à participação das BRS na formação, por exemplo, de
depósitos de Pirita (FeS2) (CARVALHO, 2004). O conhecimento desse processo permitiu
investigar o uso dessas bactérias em processos de remediação de metais pesados no
ambiente (WEEB et al., 1998).
Com a crescente preocupação com relação às questões ambientais, a investigação
de vários aspectos das BRS tornou-se relevante, uma vez que as BRS são importantes no
ciclo do carbono e do enxofre, em condições anaeróbicas (MUYZER e STAMS, 2008).
Com isso, muitos estudos sobre a sua dinâmica biogeoquímica, problemas chaves de
filogenia e relação evolutiva, fisiologia celular, ecologia microbiana e aplicabilidade
industrial vem sendo realizados.
13
1.1 Objetivo Geral
Isolar e caracterizar bactérias com capacidade de redução do íon sulfato de
sedimentos do rio Conceição, buscando elucidar aspectos bioquímicos e fisiológicos úteis
das mesmas para bioprocessos.
1.2 Objetivos Específicos
O presente trabalho engloba os seguintes objetivos:
1. Isolar bactérias redutoras de sulfato de amostras de corpos d’água e sedimentos;
2. Caracterizar e identificar os isolados e seus gêneros taxonômicos levando em
consideração seus aspectos morfológicos e metabólicos;
3. Investigar possíveis adaptações fisiológicas ao ambiente, como o crescimento em
diferentes pHs, respiração do nitrato e a utilização de diferentes fontes de carbono
como doadores de elétrons;
4. Determinar as curvas de crescimento dos isolados e seu tempo de geração, podendo
inferir sobre sua velocidade de crescimento;
5. Determinar a capacidade dos isolados em consumir sulfato com concomitante produção
de sulfeto;
6. Caracterizar o perfil filogenético dos fragmentos amplificados de 16s DNA dos
isolados.
14
2
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Classificação Taxonômica e Caracterização dos Grupos de BRS
No mundo dos procariotos existem diversos organismos que são capazes de realizar
vários tipos diferentes de metabolismos, sendo que entre eles existem os que possuem a
capacidade única de viverem em ambientes totalmente isentos de oxigênio; realizando
assim reações bioquímicas que produzem energia por meio da redução dos mais diferentes
tipos de compostos que agem como aceptores finais de elétrons, entre os quais se podem
citar o nitrato, manganês, ferro, enxofre (em diferentes formas), dióxido de carbono, bem
como formas oxidadas de compostos naturalmente menos abundantes como o arsenato,
cromato, selenato e urânio (RABUS et al., 2006).
Entre estes organismos existe um grupo microbiano de grande interesse, as BRS,
que se apresentam na forma de células esféricas, ovóides, bastonetes ou vibrióides, com
diâmetro em torno de 0,3 a 0,4 μm, ocorrendo sozinhas, em pares ou, algumas vezes, em
agregados. Algumas apresentam flagelos polares ou peritríquios; vivendo principalmente
em ambientes anóxicos aquáticos e sedimentos (HOLT, 1994), e perfazem o único grupo
de organismos procariotos com a habilidade comum de produzir energia por meio da
redução dissimilativa de sulfato para gás sulfídrico (LLOYD et al., 2001).
Por redução dissimilativa de sulfato entende-se a utilização conjunta da oxi-redução
de compostos orgânicos ou hidrogênio molecular com a redução de sulfato como um
aceptor externo de elétrons sob condições anaeróbicas (TEBO e OBRAZTSOVA, 1998);
este processo se diferencia em muito da redução assimilativa de sulfato, onde o mesmo é
convertido a enxofre molecular na forma de aminoácidos e segue por diferentes vias
bioquímicas (MADIGAN et al., 2009).
Embora haja diversos estudos recentes sobre as BRS, as mesmas são conhecidas há
muito tempo, sendo que os pesquisadores Ferdinand Cohn em 1867 e Lothar Meyer em
1964 foram os primeiros a identificar a redução biológica do sulfato como a responsável
por crescentes concentrações de gás sulfídrico em habitats aquáticos (RABUS et al., 2006).
No entanto, apenas em 1895 o professor holandês Martinus W. Beijerinck (1851 – 1931)
da Escola Politécnica de Delft isolou as primeiras culturas puras de BRS por meio do
15
conceito e metodologia, por ele mesmo formulados, de “cultura de enriquecimento”
(MADIGAN et al., 2009).
Desde esta época muitos avanços têm ocorrido quanto à identificação das BRS,
uma vez que muitos trabalhos têm proposto várias características tanto bioquímicas quanto
morfológicas visando à construção de uma chave para os grupos. Em seu trabalho, HOLT
et al. (1994), propuseram uma divisão em quatro subgrupos levando se em consideração
características morfológicas e bioquímicas, sendo estas últimas ligadas à oxidação
completa dos substratos orgânicos até CO2 (QUADRO 2-1). Nas demais chaves presentes
no livro são propostas diversas outras características para identificação de gêneros e
espécies para cada grupo.
QUADRO 2-1: Diferenciação de subgrupos de 1 a 4 de bactérias dissimilativas de sulfato ou enxofre
segundo HOLT (1994).
2. BRS não
formadoras de
esporos;
oxidação
incompleta de
substratos
3. BRS não
formadoras de
esporos;
oxidação
completa de
substratos
+
+
+
-
-
+ ou -
-
+
+ ou -
-
+
+
1. BRS
Características formadoras de
esporos
Sulfato
reduzido a
sulfito
Enxofre
reduzido a
sulfito
Substratos
orgânicos
completamente
reduzidos à
CO2
4. Bactérias
redutoras de
enxofre
Muitos outros autores também citam a oxidação completa de compostos orgânicos
como uma característica muito importante para a caracterização destas bactérias
(MADIGAN et al., 2009 e CASTRO et al., 2000), sendo que a oxidação do acetato é muito
conhecida e considerada relevante. Embora a energética de sua reação ainda não tenha sido
totalmente elucidada, o seu mecanismo é muito bem conhecido (MADIGAN et al., 2009).
Além desta, dentre as principais características citadas para identificação estão a
motilidade, forma da célula e tipo de reação ao procedimento de coloração de Gram
(CASTRO et al., 2000).
16
Embora estas características bioquímicas e morfológicas sejam até hoje muito
utilizadas para a identificação das BRS, deve-se salientar que vários trabalhos têm se
utilizado de ferramentas moleculares (DIAS et al., 2008; BAHR et al., 2005; MENERT et
al., 2004; CASTRO et al., 2000 e STACKEBRANDT et al., 1997), a fim de buscar
métodos para catalogar as diversas espécies que, atualmente, passam de 220 estando
divididas em cerca de 60 gêneros (BARTON e FAUQUE, 2009).
Em relação a este tópico pode-se citar um trabalho bastante abrangente realizado
por Muyzer e Stams (2008), que agruparam grande parte das espécies conhecidas de BRS
em uma árvore filogenética confeccionada segundo seqüências de DNA ribossomal
presentes em banco de dados ARB-SILVA (FIGURA 2-1).
FIGURA 2-1: Árvore filogenética baseada em seqüências de DNA ribossomal descritas em bactérias
redutoras de sulfato. Números dentro dos quadros indicam o número de espécies diferentes
presentes em um determinado grupo e entre parênteses a identificação no banco de dados.
Modificado de Muyzer e Stams (2008).
17
Assim, as BRS fazem parte de cinco subdivisões pertencentes ao domínio Bacteria
(Deltaproteobacteria,
Nitrospirae,
Clostridia,
Thermodesulfobiaceae
e
Thermodesulfobacteria), além de 2 subdivisões pertencentes ao domínio Archaea
(Euryarchaeota e Crenarchaeota). Deve-se ressaltar que, segundo Barton e Fauque (2009),
as BRS presentes à subdivisão Clostridia são todas pertencentes à família Firmicutes e
perfazem os únicos gêneros de BRS Gram positivas formadoras de esporos.
Tais características mostram como as BRS são um grupo diverso, sendo
adicionadas cada vez mais espécies e gêneros a este grupo em função dos estudos cada vez
mais freqüentes.
2.2 Distribuição e Ecologia dos Grupos de BRS
Segundo observado em relação ao grupo das BRS, as mesmas são importantes não
apenas pelo seu óbvio papel no ciclo biogeoquímico do enxofre (FIGURA 2-2), como
também pela produção do gás sulfídrico que não só é conhecido pela sua toxicidade e
cheiro característico, como também pela sua alta reatividade que causa um grande impacto
de alterações nos constituintes do ambiente (RABUS et al., 2006).
FIGURA 2-2: Ciclo biogeoquímico do enxofre segundo Muyzer e Stams (2008).
18
Com relação à sua distribuição ambiental, as BRS são consideradas amplamente
presentes em grandes profundidades. A grande maioria de suas espécies foram
encontradas, principalmente, em ambientes considerados anóxicos como minas profundas
de ouro da África do Sul e aqüíferos basálticos profundos em Washington, EUA (BAKER
et al., 2003), ou mesmo poços petrolíferos do Golfo do México (MIRANDA-TELLO et
al., 2004).
Porém, muitos pesquisadores, a exemplo de Wieringa et al. (2000), evidenciam as
descobertas de BRS com capacidade de sobreviver em ambientes onde existe a presença de
oxigênio, sendo relatada a presença de enzimas de proteção contra os danos celulares
recorrentes do metabolismo de redução de oxigênio como, por exemplo, a catalase e a
superóxido dismutase. Além disso, Lemos et al. (2001) demonstraram a presença de
metabolismo oxidativo em um exemplar de BRS identificado como Desulfovibrio gigas
cujo gênero, a exemplo do gênero Desulfomicrobium, é amplamente relatado como capaz
de sobreviver ao oxigênio tendo não apenas espécies identificadas em condições
oligotróficas, como também relatadas a presença de enzimas redutoras de oxigênio em
alguns de seus exemplares (SANTANA, 2008; BADE et al., 2000 e SASS et al., 1997).
Assim, vários estudos recentes mostram que este grupo de microrganismos pode ser
identificado em diversos ambientes como, por exemplo, na rizosfera de algumas plantas
(CIFUENTES et al., 2003); em solos diversos (MILETTO et al., 2007), bem como em
solos úmidos usados para o cultivo de arroz (LIU et al., 2009) onde os seus representantes
Gram positivos já foram identificados como de grande importância nos processos
biogeoquímicos destes locais (STUBNER e MEUSER, 2000), em sedimentos marinhos
(ISHII et al., 2004), de estuários (DEVEREUX et al., 1996), e de lagos de água doce e
salgada (PEDUZZI et al., 2003 e LI et al., 1999), no trato gastrointestinal de humanos e
animais (DETHLEFSEN et al., 2006 e LIN et al., 1997), e até mesmo associadas à doenças
periodontais e colites ulcerativas em humanos (LANGENDIJK et al., 2000 e PITCHER et
al., 2000). Dentre todos estes locais, as BRS marinhas são consideradas como as mais
abundantes já que este ambiente apresenta maior quantidade de sulfato dissolvido em
relação aos outros citados (MUYZER e STAMS, 2008).
Por fim, as BRS foram provavelmente as maiores responsáveis pela formação de
depósitos de sulfetos metálicos em ambientes pré-históricos anaeróbios, sendo tais jazidas
atualmente muito exploradas para fins comerciais (CARVALHO, 2004).
19
Assim, as BRS se mostram amplamente difundidas no ambiente, o que, ligado à sua
diversidade metabólica, as torna de grande valia no equilíbrio dos processos biológicos dos
ecossistemas.
2.3 Bioquímica e Fisiologia das Bactérias Redutoras de Sulfato
Segundo Rabus et al. (2006) existem cinco importantes atributos referentes ao
metabolismo das BRS que são explorados na maioria dos estudos realizados atualmente:
1. O metabolismo de sulfato a sulfeto que é bioquimicamente mais complexo do que a
redução do oxigênio pelas bactérias aeróbicas;
2. A ampla variedade de compostos orgânicos que podem ser utilizados pelas BRS como
fontes de carbono e energia;
3. O fluxo que ocorre entre doadores e aceptores de elétrons associado à cadeia
respiratória e que envolve uma grande quantidade de carreadores;
4. A capacidade de alguns grupos de síntese celular utilizando CO₂ durante seu
crescimento na presença de H₂ e sulfato;
5. A regulação do metabolismo, que o aspecto menos explorado entre os grupos de BRS.
Quanto ao metabolismo as BRS são um grupo formado essencialmente por
bactérias quimiorganotróficas heterotróficas, embora representantes de alguns gêneros
como Desulfosarcina, Desulfonema, Desulfococcus, Desulfobacterium, Desulfotomaculum
e algumas espécies de Desulfovibrio apresentem a capacidade de crescer com metabolismo
quimiolitotrófico autotrófico, utilizando H₂ como doador de elétrons e CO₂ como fonte de
carbono (MADIGAN et al., 2009). Porém, embora ocorram tipos diferentes de
metabolismo em algumas espécies, todas as BRS possuem a capacidade de utilizar o
sulfato como seu aceptor final de elétrons, sendo a rota bioquímica muito bem conhecida,
ocorrendo a participação na mesma de diversas enzimas específicas (FIGURA 2-3).
20
FIGURA 2-3: Redução assimilativa e dissimilativa do sulfato. Adaptado de Madigan et al. (2009).
AFS: Adenosina Fosfosulfato.
FAFS: Fosfoadenosina fosfosulfato.
As taxas de crescimento das BRS sugerem que para cada sulfato reduzido há a
formação de uma molécula de ATP (MADIGAN et al., 2009). Além disso, diferente de
algumas espécies de bactérias redutoras de nitrato, as BRS usualmente não excretam
intermediários de seu metabolismo respiratório, liberando assim apenas o produto final do
mesmo, o ácido sulfídrico (RABUS et al., 2006).
A rota demonstrada na FIGURA 2-3 é baseada no modelo proposto por Ress
publicado em 1973, sendo que, recentemente Brunner e Bernasconi (2005) propuseram, em
um trabalho de revisão, adições ao mesmo levando em conta observações de muitos outros
trabalhos posteriores. Assim, segundo a revisão do modelo de Ress proposta por ambos
(FIGURA 2-4), a redução do sulfito para a formação do gás sulfídrico possui diversos
passos com a formação de vários compostos intermediários como, por exemplo, o
tiosulfato e o tritionato, além disso, pode ser observado um fluxo inverso para algumas
dessas reações.
21
FIGURA 2-4: Modelo de Ress revisado segundo Brunner e Bernasconi (2005).
O metabolismo de redução de sulfato apresenta uma enorme variedade de possíveis
compostos que podem ser utilizados pelas BRS como aceptores finais de elétrons, sendo
que, Madigan et al. (2009) e Rabus et al. (2006), citaram, além do sulfato, o enxofre
orgânico, sulfeto, enxofre elementar, tiossulfato, sulfito, sulfonatos, dimetilsulfoxido,
nitrato (desnitrificação), nitrito, arsenato, oxigênio, fumarato, acrilato, urânio entre outros.
Além disso, os autores ressaltam que compostos como o gás hidrogênio, lactato, etanol,
acetaldeido, acetona, açucares, glicolato, malato, fumarato, succinato, aminoácidos,
compostos aromáticos polares, hidrocarbonetos aromáticos, hidrocarbonetos saturados,
metano, acetato, propionato, formiato, butirato e ácidos graxos diversos entre outros já
foram identificados como doadores de elétrons, assim como a fermentação de alguns
compostos orgânicos como o piruvato formando acetato, H₂ e CO₂ também já foi relatada.
Por serem de grande interesse em vários processos industriais, alguns aspectos do
22
metabolismo de vários dos compostos citados, pela ação das BRS, serão discutidos
posteriormente com mais detalhes.
Outra interessante via que podemos citar é a capacidade de redução de alguns
metais pesados utilizados como aceptores finais de elétrons. Embora não se tenha
detectado crescimento significativo das culturas nas condições propensas à tais reações
(LLOYD et al., 2001 e TEBO e OBRAZTSOVA, 1998), Cheung e Gu (2003), realizaram
estudos com BRS em relação à redução de cromo hexavalente (Cr6-). O cromo oxidado é
considerado altamente tóxico e cancerígeno, sendo este oriundo de vários tipos de
indústrias, demonstrando como pode ser de grande valia o uso destas bactérias na
biotecnologia industrial. Assim, a gama de possíveis compostos que estas bactérias podem
utilizar em diferentes etapas de seu metabolismo, mostram como as mesmas podem
participar dos diferentes processos bioquímicos presentes nos mais diversos ambientes.
Em relação ao seu crescimento, as BRS mostram em vários estudos uma grande
diversidade de dados, tendo sido relatados tempos de geração (Tg) de 1,5 dias (d) com
velocidade máxima de crescimento (µmax) de 0,5 dias-1 (d-1) para espécies de
Desulfoharbdus amnigenus (OUDE ELFERINK et al., 1995); 5,3 horas (h) e 0,13 horas-1
(h-1); 8,6 h e 0,08 h-1, e 6,9 h e 0,10 h-1, respectivamente para Desulfobacter postgatei,
Desulfobulbus propionicus e Desulfovibrio bacuolatus (LAAMBROEK et al., 1984); 7 d e
0,004 h-1 para uma cultura degradadora de naftaleno (HaphS1) (GALUSHKO et al., 1999);
e, por fim; 5,33 d e 0,13 d-1, e 2,47 d e 0,28 d-1 para uma cultura de Desulfovibrio sp. em
cultivo controlado com lactato sem agitação e com agitação, respectivamente (SILVA,
1999).
2.4 Utilização das BRS para Imobilização de Metais e Biorremediação
Devido à produção do H2S em seu metabolismo final as BRS têm a capacidade de
complexar metais em ambientes aquáticos, já que o mesmo reage rapidamente com os íons
metálicos formando sulfetos insolúveis, sendo muito utilizadas para remediar drenagens
ácidas de minas (DAM) em barragens de resíduos (WEEB et al., 1998). Tais
características, e também a enorme capacidade metabólica destas bactérias as tornam hoje
de grande importância econômica, ecológica e para a biotecnologia industrial.
23
Huisman et al. (2006) evidenciaram muito bem a utilidade destas bactérias para as
indústrias de mineração e metalurgia, pois, a excreção de H2S pelas BRS, permite a
recuperação de metais de importância econômica, na forma de sulfetos, liberados nas
DAM destas atividades. Prática que é mais vantajosa do que a precipitação em forma de
hidróxidos. Além disso, relata que o uso destas bactérias tem maior vantagem econômica,
uma vez que o uso de reagentes para esse fim, como o NaHS ou H2S industrializados, têm
custo muito elevado. Um bom exemplo é fornecido por Lengke e Southam (2006) que
demonstraram o uso das BRS na recuperação de ouro por bioacumulação.
Em relação ao uso das BRS em biorremediação, as mesmas já foram identificadas
atuando como reguladoras de uma variedade de processos que ocorrem em solos inundados
incluindo a reciclagem de matéria orgânica, biodegradação de diversos poluentes
aromáticos clorados em anaerobiose e a metilação do mercúrio (CASTRO et al., 2000).
A este respeito, Teclu et al. (2008) evidenciaram que as BRS podem ser utilizadas
como ferramentas úteis para inativar um rejeito muito comum em algumas atividades de
mineração, os arsênicos tri e pentavalentes, que podem ser precipitados em formas menos
tóxicas e praticamente insolúveis como por exemplo o trisulfeto de arsênico (As2S3).
Além disso, Kleikemper et al. (2004) reforçaram, em seu estudo, como as BRS têm
sido altamente utilizadas em áreas contaminadas por hidrocarbonetos de petróleo, sendo a
degradação de sulfato considerada um importante processo nestes locais, Robertson et al.
(2000), também citam esta capacidade das BRS, tendo relacionado em seu trabalho a
degradação de certos hidrocarbonetos como naftaleno, 1,3,5-trimetilbenzeno (TMB),
tolueno, p-xileno e etilbenzeno à degradação de sulfato por associações bacterianas, uma
vez que nesta investigação culturas puras não foram capazes de degradar todos os
compostos sozinhas como, por exemplo, o benzeno. Resultado parecido foi observado por
Dou et al. (2008) que, por meio de um consórcio formado por BRS e por bactérias
redutoras de nitrato coletado e enriquecido de um ambiente contaminado por combustíveis,
foi capaz de realizar a degradação biológica do BTEX (benzeno, tolueno, etilbenzeno e
xileno), um conjunto de poluentes comuns de vários tipos combustíveis e cuja presença no
ambiente é muito preocupante devido aos seus potenciais tóxico e cancerígeno.
Tsai et al. (2008) também evidenciaram a capacidade de associações de BRS em
utilizar PAH’s (Polycyclic Aromatic Hydrocarbons = Hidrocarbonetos Aromáticos
Policíclicos) para suas biossínteses, o que segundo os mesmos, é de grande valia para o
ambiente já que tais compostos são potencialmente cancerígenos e muito estáveis à
degradação ambiental. Além disso, o trabalho propõe uma possível rota metabólica pela
24
qual um consórcio de BRS degradou dois tipos diferentes PAH’s, o fluoreno e o fenantreno
(FIGURA 2-5), que são comumente encontrados em diversos locais contaminados e, assim
como todos PAH’s compostos de 2 ou 3 anéis aromáticos, perfazem um grande perigo para
os humanos devido à sua solubilidade em água e, logo, fácil dispersão no ambiente.
FIGURA 2-5: Rota de biodegradação proposta para (A) Fluoreno e (B) Fenantreno por BRS segundo TSAI
et al. (2008).
25
Consórcios de BRS (inclusive associados a outros grupos de bactérias) também já
foram identificados como responsáveis pela degradação de compostos nitroaromáticos
presentes no ambiente como, por exemplo, os encontrados em solos e sedimentos de
corpos d’água próximos a fábricas de explosivos, pesticidas, herbicidas e produtos
farmacêuticos (KULKARNI e CHAUDHARI, 2007). Como tais rejeitos são considerados
altamente prejudiciais, visto sua grande estabilidade ambiental e capacidade cancerígena
comprovada, a sua degradação visando a remediação do ambiente é altamente prioritária
em diversos países, visto o uso desenfreado dos mesmos ao longo dos anos (LEWIS et al.,
2004).
Embora grande parte dos estudos cite a biodegradação de compostos aromáticos de
carbono como realizadas principalmente por consórcios microbianos, visto a complexidade
da estrutura dos mesmos, Wilkes et al. (2000) evidenciaram em seu trabalho como muitos
estudos têm identificado culturas puras de bactérias anaeróbias capazes de utilizar tais
compostos como, por exemplo, duas culturas de BRS isoladas em seu trabalho capazes de
degradar alquil-benzenos na presença de petróleo. Outro exemplo pode ser observado no
trabalho de Galushko et al. (1999), que identificaram uma cultura pura de BRS isolada de
sedimento marinho com a capacidade de degradar naftaleno.
Ao se considerar contaminantes presentes no ambiente, as BRS também apresentam
grande atuação. Azabou et al. (2005) em um estudo sobre a degradação por BRS do
“Phosphogypsum” (CaSO4), um subproduto potencialmente tóxico advindo da produção
industrial do ácido fosfórico ou por meio da reação entre o fosfato de cálcio [Ca3(PO4)2]
das rochas e o ácido sulfúrico (H2SO4) das chuvas ácidas, identificaram a possibilidade de
uso das mesmas para a degradação deste composto e seu tratamento industrial antes do
despejo. Em trabalho semelhante Schröder-Wolthoorn et al. (2008) demonstraram que
BRS podem ser utilizadas para conversão de anglesita (PbSO4) para galena (PbS), que é
um composto bem menos solúvel e de fácil remoção por processos eletroquímicos,
evidenciando que tal processo não pode ser apenas utilizado em solos ricos em anglesita e,
por conseguinte, contaminados por chumbo, mas também para tratamento de despejos
ricos em anglesita de diversas indústrias, como as de baterias.
26
2.5 Estudo de BRS em Biorreatores
Como tratado anteriormente as BRS possuem muitos possíveis usos industriais em
relação à biorremediação e imobilização de metais, sendo que não apenas as indústrias de
mineração podem ser beneficiadas pelo seu estudo, como também várias outras cujos
despejos sejam ricos em sulfatos e metais a exemplo de processos galvânicos, baterias,
tintas e várias outras manufaturas químicas (BASKARAN e NEMATI, 2006), além de
indústrias com despejos ricos em diferentes formas de compostos de enxofre como, por
exemplo, curtumes, fábricas de papel, óleos comestíveis, fermentações e produtos de
amido (HIRASAWA et al., 2008). Assim, visando esta capacidade das BRS, muitos
trabalhos têm atualmente se dedicado ao estudo da utilização das mesmas em condições
controladas como os biorreatores, o que pode ser muito útil para atingir o seu melhor
potencial em processos industriais, já que se podem definir as melhores formas para seu
cultivo.
Embora as BRS já tenham sido utilizadas em biorreatores com resultados positivos
para o aumento da capacidade de degradação de sulfato para diversos tipos de rejeitos
(GROUDEV et al., 2008; MOHAN et al., 2005; ELLIOTT et al., 1998), sabe-se que as
condições de tais despejos muitas vezes não são favoráveis para as mesmas.
Xin et al. (2008), por exemplo, mostraram que vários estudos não atingiram bons
resultados para tratamento de DAM utilizando BRS, e demonstra que para garantir um
bom rendimento em relação à redução de sulfato, biorreatores que utilizam BRS podem ser
enriquecidos com ferro metálico, já que o mesmo aumenta o pH do meio além de fornecer
hidrogênio ao sistema pela Equação 2-1. Isso é importante porque a grande maioria das
BRS não suportam valores muito baixos de pH (WILLOW e COHEN, 2003) e algumas
espécies podem utilizar o hidrogênio gasoso para a redução do sulfato. Assim, os baixos
valores de pH presentes em alguns sistemas, como as DAM, podem ser o motivo pelo qual
o uso de BRS para remediar estes locais não tenha tido sucesso efetivo em alguns
trabalhos.
Equação 2-1
Feº + 2H₂O = Fe²⁺ + 2OH⁻ + H₂ Além da limitação do pH, Martins et al. (2009) citam como outro grande empecilho
do uso das BRS a toxicidade dos metais pesados presentes em DAM que são alvo de
27
biorremediação, já que compostos de metais pesados podem bloquear muitas enzimas do
metabolismo celular; o que evidencia a necessidade de selecionar cepas resistentes para
tais situações, uma vez que BRS crescendo em condições teoricamente adversas como
baixos valores de pH e temperatura já foram identificadas (TSUKAMOTO et al., 2004).
Outra possibilidade para o uso das BRS em biorreatores, visando a imobilização de
metais, foi proposta no trabalho de Luptakova e Kusmierova (2005) que compararam um
sistema comum utilizando apenas um biorreator com um sistema de biorreatores duplos
para redução de sulfato pelas BRS e concomitante precipitação de cobre. No sistema
comum as bactérias se encontravam junto ao rejeito e no sistema duplo a redução de
sulfato acontecia no primeiro reator e o gás sulfídrico era lançado dentro do segundo
reator. O sistema duplo mostrou uma precipitação mais rápida do cobre presente na
amostra além de uma maior facilidade de recuperá-lo do meio. Assim, como as bactérias
não precisariam entrar em contato com o rejeito, este sistema poderia ser uma alternativa
para a utilização das BRS em rejeitos onde as mesmas não apresentam um bom
crescimento devido a condições adversas do ambiente.
Outra questão que deve ser considerada em se tratando do uso de BRS em
biorreatores é a necessidade de se complementar os despejos com uma fonte de carbono
para as mesmas, já que muitos rejeitos industriais, embora ricos em sulfato, são deficientes
em possíveis doadores de elétrons que as BRS possam utilizar para suas biossínteses
(LIAMLEAM e ANNACHHATRE, 2007).
Segundo van Houten et al. apud Liamleam e Annachhatre (2007 - pag. 461), a
seleção de um doador de elétrons deve ser baseada em duas considerações:
1. A eficiência do tratamento ou habilidade do doador de elétrons para completamente
reduzir e remover sulfato enquanto minimiza a ocorrência de outros poluentes no
efluente e;
2. O custo do doador de elétrons por unidade de sulfato convertida.
Como evidenciado anteriormente são muitos os doadores de elétrons que podem ser
utilizados pelas BRS, o que providencia uma enorme gama de possíveis compostos que
podem ser utilizados para biorremediação, devendo apenas ser observados os critérios
citados.
Assim, levando-se em consideração a importância em se determinar as fontes de
carbono apropriadas para um melhor desempenho ao se utilizar biorreatores, é proposta a
28
TABELA 2-1 que apresenta além das reações estequiométricas de utilização de alguns dos
principais doadores de elétrons já identificados como de uso comum pelas BRS, como
também a relação entre a quantidade de cada substrato necessária para a utilização de certa
quantidade de sulfato. Tal tabela foi baseada em dados compilados por Liamleam e
Annachhatre (2007) em seu excelente trabalho de revisão.
TABELA 2-1: Equações estequiométricas dos principais doadores de elétrons utilizados pelas BRS. Baseada
no trabalho de Liamleam e Annachhatre (2007).
Substrato
Equação Estequiométrica
Formiato
SO42- + 4HCOO- + H+ → HS- + 4HCO3-
Relação
Substrato/Sulfato
Reduzido (Mol)
4/1
Metanol
4CH3OH + 3SO42- → 4HCO3- + 3HS- + 4H2O + H+
4/3
Etanol
2C2H5OH + 5SO42- + 8H2 + 1H+ → 4HCO3- +
5HS- + 10H2O
2/5
Lactato
2CH3CHOHCOOH + H2SO4 → 2CH3COOH +
2CO2 + H2S + 2H2O
2/1
Acetato
CH3COO- + SO42- → HS- + 2HCO3-
1/1
Propionato
CH3CH2COO- + 2SO42- + H2 → 2HS- + 3HCO3- +
H2O
1/2
Butirato
CH3CH2CH2COO- + 3SO42- + 2H2 → 3HS- +
4HCO3- + 2H2O
1/3
Além da possibilidade de se utilizar qualquer um dos compostos citados é válido
ressaltar que muitos trabalhos têm obtido bons resultados empregando soluções mistas de
doadores de elétrons em estudos de redução de sulfato, o que não só pode ser usado como
forma de diminuir custos como abrange uma maior diversidade bacteriana já que diferentes
espécies de BRS podem não ser capazes de utilizar o mesmo tipo de substrato
(WAYBRANT et al., 1998 e CHRISTENSEN et al., 1996).
Assim, ao se observar estas questões, um trabalho indicando características de
interesse para o uso de BRS em biorreatores pode ser altamente vantajoso para tratamentos
de resíduos dos mais diversos tipos.
29
2.6 BRS Associadas à Biocorrosão
A capacidade das BRS de ampliar a corrosão de vários tipos de ligas metálicas tem
levado a muitos estudos visando o melhor entendimento deste processo e possíveis ações
para o seu controle, uma vez que a corrosão causa grandes danos à estruturas metálicas em
ambientes marinhos a exemplo de pontes, cais, plataformas e tubulações (DUAN et al.,
2008).
Devido à produção do gás sulfídrico, a maioria dos metais é susceptível à ação das
BRS (FIGURA 2-6). Javaherdashti et al. (2006) demonstraram em seu trabalho como as
BRS participam da transformação de metais em ambientes aquáticos, relatando a grande
perda de ductibilidade e quebra de amostras de aço muito mais elevadas em condições
bióticas quando comparado as abióticas, resultado também relatado por Liu et al. (2008),
que evidenciaram como as BRS aumentaram visivelmente a corrosão de ligas de magnésio,
sendo observada a formação ativa de biofilmes sobre as mesmas, o que é um aspecto muito
interessante visto que biofilmes já foram relatados como causadores de cavidades em ligas
metálicas devido à biocorrosão (DUAN et al., 2008).
FIGURA 2-6: Modelo da corrosão do aço por BRS segundo Barton e Fauque (2009).
È importante ressaltar que, além de sua grande afinidade por metais, o gás
sulfídrico já foi identificado causando corrosões em outros tipos de materiais como, por
exemplo, o concreto (ABDELMSEEH et al., 2008), sendo reportado por Postgate (1979)
que estátuas de pedra do Camboja tem sido sujeitas à corrosão envolvendo atividades de
BRS.
30
A indústria petrolífera é uma das mais preocupadas com esta questão já que BRS
termofílicas já foram reconhecidas como uma importante fonte de gás sulfídrico em
reservatórios de petróleo (LEU et al. 1998), sendo encontradas participando da corrosão de
equipamentos nas próprias indústrias como, por exemplo, os tanques para separação de
óleo (MIRANDA et al., 2006) além da corrosão de diferentes tipos de peças metálicas em
ambientes marinhos (PINEAU et al., 2008).
Em observação à corrosão de metais por BRS em ambientes aquáticos, Dinh et al.
(2004), propuseram dois mecanismos que podem vir a ocorrer em relação ao ferro (Fe),
sendo um indireto pelo ataque químico do sulfito de hidrogênio (H2S) produzido pelas
BRS e representado pela Equação 2-2, e outro direto por meio da formação de um “filme
de hidrogênio” sobre o ferro exposto à água representado pela Equação 2-3. A formação
deste filme despolariza o ferro e estimula a sua corrosão. Além disso, cita a capacidade de
algumas BRS em corroer o ferro por utilizá-lo como suplemento energético através de uma
rota bioquímica envolvendo um citocromo associado à membrana celular e um sistema de
transferência de elétrons mediado por uma hidrogenase intracelular (Esquema 2-1).
Equação 2-2 2[CH2O] + 11/3Fe + 11/3SO42- + 2/3H+ → 2HCO3- + 11/3FeS + 11/3H2O
4Fe + SO42- + 4H2O → FeS + 3Fe2+ + 8HO-
Equação 2-3
Esquema 2-1
Fe → Citocromo → Hidrogenase (1) → H2 → Hidrogenase (2) →
→ Sistema de transporte de elétrons → Enzimas de redução de sulfato
Além de mostrar possíveis caminhos para a corrosão de um metal amplamente
utilizado, estes mecanismos nos fornecem dados que podem ser utilizados na elucidação de
certas vias bioquímicas pelas quais estes organismos utilizam seu substrato, uma vez que,
como discutido anteriormente, as capacidades metabólicas destas bactérias se mostram
altamente variáveis.
Em relação às alternativas para o controle da ação das BRS, Haveman et al. (2005)
demonstraram em seu trabalho que o nitrito produzido por bactérias redutoras de nitrato
(BRN) age como um inibidor para as enzimas que atuam na redução do sulfato, sendo que
Barton e Fauque (2009) propuseram que a simples adição de nitrato à reservatórios de
petróleo pode controlar a ação das BRS já que o mesmo seria posteriormente convertido a
nitrito pelas BRN que são amplamente difundidas nestes locais. Além disso, Greene et al.
31
(2006) mostra em seu trabalho que uma melhor atividade inibitória do nitrito em relação à
redução de sulfato pode ser obtida se o mesmo for combinado com diversos tipos de
biocidas como, por exemplo, glutaraldeído, formaldeído, bronopol, etc.
32
3
MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Área de Estudo e de Amostragem
As amostras foram coletadas no mês de Abril do ano de 2004 em trabalho
associativo com pesquisadores do Departamento de Geologia/DEGEO/UFOP em pontos
escolhidos aleatoriamente na extensão do Rio Conceição situado na região do Reserva
Particular de Patrimônio Natural (RPPN) Santuário do Caraça, MG (FIGURA 3-1).
FIGURA 3-1: Região do Rio Conceição, MG. Locais de coleta e principais atividades humanas próximas.
A coleta foi feita por meio de metodologia padrão (CLESCERI et al., 1999), na
qual frascos de vidro estéreis foram levados até o local onde as amostras foram recolhidas.
Após este procedimento o material levado ao Laboratório de Microbiologia do Instituto de
Ciências Exatas e Biológicas/ICEB/UFOP. Os pontos de coleta foram um total de dois
33
identificados como: R1A e R3A (FIGURA 3-1). De cada um deles foi retirada uma
amostra de sedimento.
3.2 Cultivo Inicial das Amostras
As amostras foram enriquecidas com o objetivo de aumentar o número de bactérias,
além de selecionar o tipo de bactéria de interesse (BRS) aumentando assim a efetividade
dos passos posteriores do experimento. Para este fim foi escolhido um meio de cultura
específico: Meio de cultura modificado de Postgate C segundo Cheung e Gu (2003) que se
mostrou muito eficiente em trabalhos anteriores realizados no Laboratório de
Microbiologia do DECBI-ICEB/UFOP (RAMPINELLI, 2004).
O enriquecimento das amostras, utilizando-se do meio de cultura citado, foi feito da
seguinte forma: uma alíquota de 10g de cada amostra de sedimento foi transferida para um
Erlenmeyer diferente contendo o meio de cultura citado em uma proporção de 1:25
(amostra: meio). Os frascos foram incubados a 32ºC, durante uma semana, após a qual foi
verificada a redução do sulfato por meio da formação de sulfeto de ferro (FeS), resultando
em um precipitado negro característico. Como estas bactérias são anaeróbias, um ambiente
próprio foi necessário para seu enriquecimento, assim as mesmas foram incubadas em
cubas de anaerobiose que eram na verdade confeccionadas a partir de dessecadores de
vidro hermeticamente fechados. Segundo o procedimento adotado, o oxigênio presente no
interior do dessecador era esgotado utilizando-se uma chama de vela e, após a mesma se
apagar, era retirada uma parte da atmosfera do dessecador com a ajuda de uma bomba de
vácuo previamente acoplada á sua tampa. O vácuo formado ajudava a selar o ambiente
interno do dessecador garantindo a anaerobiose, sendo adicionada também sílica para
remover a umidade, por fim, o dessecador era fechado e incubado em estufa segundo as
necessidades do experimento.
Após o período citado, objetivando um maior enriquecimento e seleção do referido
grupo, uma alíquota de 10mL cada cultura enriquecida que apresentou formação de
precipitado negro foi transferida para um novo Erlenmeyer contendo o mesmo meio de
cultura, seguido do mesmo tratamento descrito acima, resultando assim o segundo
enriquecimento. Passados os dias de incubação, o terceiro enriquecimento foi realizado de
34
maneira similar. As amostras que não apresentaram precipitação foram submetidas a novo
enriquecimento com nova alíquota buscando uma melhor varredura das BRS.
3.3 Isolamento das Culturas Puras de Bactérias Redutoras de Sulfato
Após as etapas descritas de enriquecimento, realizou-se o isolamento das bactérias
pelo método espalhamento em placa, que consiste na diluição seriada (10-1 a 10-5) do
material enriquecido das amostras de água e sedimento. De cada diluição foram colhidos
0,1mL e aplicados sobre placa de Petri contendo o meio sólido modificado de Postgate C
(CHEUNG e GU, 2003), totalizando cinco placas por amostra (uma para cada diluição). A
solução foi espalhada com o uso de uma alça de vidro estéril (alça de Drigalski) para
contagem das colônias isoladas. As placas foram então incubadas a uma temperatura de
32ºC, durante 24 horas, em ambiente anaeróbio segundo metodologia utilizada por
Rampinelli (2004). A metodologia de espalhamento foi aplicada visando uma maior
facilidade em se coletar as colônias isoladas, visto que as mesmas crescem em sua
totalidade na superfície do meio o que não ocorre no método de pour plate onde colônias
crescem no interior do meio sólido, dificultando assim a sua obtenção.
Destes procedimentos resultaram colônias isoladas em algumas diluições. As placas
que apresentavam colônias mais diversas e bem definidas foram separadas para que as
mesmas fossem obtidas com agulha bacteriológica e inoculadas, separadamente em frascos
de 2mL contendo o mesmo meio de cultura em sua forma líquida. Como estas bactérias são
anaeróbias, o uso dos tubos foi de grande ajuda já que são herméticos e propiciam bem esta
condição.
Para a confirmação de BRS, as culturas puras inoculadas foram incubadas a
temperatura de 32ºC, durante uma semana. Os inóculos que apresentaram a formação de
precipitado negro de sulfeto de ferro foram separados e identificados com números
começando por 01.
De cada isolado que apresentou teste positivo para BRS foi feita uma cultura de
estoque em frascos herméticos, tipo penicilina, contendo o meio sólido descrito
anteriormente picado com agulha de repicagem, incubado nas condições descritas para
crescimento e, após verificação de redução de sulfato, conservado em geladeira no
Laboratório de Microbiologia do DECBI-ICEB/UFOP.
35
3.4 Caracterização dos Isolados Obtidos
Após obtenção das culturas puras de BRS, prosseguiram-se os trabalhos com os
testes para a identificação do gênero e/ou espécies das mesmas. A identificação foi
realizada observando-se as características morfológicas tanto das células (forma, arranjo,
entre outras) quanto das colônias (tamanho, cor, entre outras); além das bioquímicas,
relacionadas com a capacidade das bactérias de sintetizar enzimas, assimilarem diferentes
substratos e gerar produtos metabólicos específicos.
Por fim, procurando resultados mais seguros para a identificação dos isolados e
assim inferir mais características sobre os mesmos, foi realizada a sua caracterização
molecular.
3.4.1 Caracterização Morfológica
As
características
de
cada
colônia
foram
descritas
observando-se
macroscopicamente as mesmas após o crescimento dos isolados em meio sólido. Em
seguida utilizou-se o Método de Coloração de Gram para a identificação da forma, arranjo
celular bacteriano como também sua definição de Gram positivo ou Gram negativo como
parâmetros usuais para etapa inicial de classificação taxonômica (RABUS et al., 2006). As
observações de morfologia foram reforçadas com a sua visualização por meio de exame à
fresco utilizando microscopia de contraste de fase. Todos os testes citados foram realizados
com a utilização de Microscópio ótico marca Olympus (Modelo BX41).
Para melhor avaliação morfológica das referidas células dos isolados utilizou-se o
Microscópio Eletrônico de Varredura, Marca Jeol, Modelo JSM-5510 (MEV),
equipamento do Laboratório de Microscopia e Microanálise (Microlab) do Departamento
de Geologia (DEGEO)-UFOP. Para esta análise seguiu-se o protocolo padronizado do
Microlab/DEGEO-UFOP (GOLDSTEIN et al., 2003).
36
3.4.2 Caracterização Bioquímica Visando a Identificação Taxonômica
Para esta caracterização metabólica realizou-se uma série de testes bioquímicos a
fim de avaliar a fermentação de glicose e de lactose pela produção de ácido e/ou gás.
Também foi utilizado citrato como única fonte de carbono e uréia como única fonte de
nitrogênio além da produção de indol e ácido sulfídrico a partir de triptofano e
aminoácidos sulfurados, respectivamente. A motilidade foi também avaliada pela
visualização do padrão de crescimento em meio semi-sólido, sendo posteriormente
confirmada por meio do método da gota pendente em lâmina escavada (MILOSTAN,
2006).
Após a incubação dos tubos a 32ºC, durante 48 horas em condições anóxicas, foi
feita a leitura das reações bioquímicas dos testes supracitados. Para certificação foram
feitos controles positivos e negativos para os meios.
A verificação da capacidade das culturas puras para a utilização de diversos
compostos orgânicos como fontes de carbono e energia foi também realizada utilizando o
meio de cultura modificado de Postgate C contendo cada um dos compostos, citados à
seguir, como única fonte de carbono, estando todos à uma concentração de 5g/L no meio
de cultivo. Como dito anteriormente, este parâmetro é muito importante para uma melhor
identificação dos isolados, além de fornecer importantes informações sobre as capacidades
metabólicas dos mesmos. Assim, verificou-se o grau de oxidação dos seguintes compostos:
acetato, lactose, glicose, lactato, etanol, acetona, benzeno, propionato e butirato,
observando-se a formação de precipitado negro de FeS e produção de gás em tubo de
Durhan, esta última evidencia uma oxidação completa do composto à CO2. Para realização
deste teste foram utilizados tubos de ensaio herméticos com rosca, contendo o meio dotado
de apenas um dos compostos citados como fonte de carbono disponível, para cada
composto testado foi feita uma bateria de tubos em duplicatas para maior certeza dos
testes. Foram utilizados controles negativos, ou seja, um tubo contendo o meio sem as
bactérias e com a fonte de carbono, e outro contendo as bactérias, mas sem a fonte de
carbono.
O último teste realizado visando à identificação taxonômica dos isolados, o teste
que indica a presença da enzima desulfoviridina, é muito importante uma vez que esta
enzima (um tipo de sulfato redutase) está presente em apenas alguns grupos de BRS
(RABUS et al., 2006).
37
Este teste seguiu uma metodologia citada por Silva (1999) pela qual o isolado, após
seu crescimento em meio de cultura apropriado, é colocado em uma lâmina e tem sua
células lisadas com a utilização de algumas gotas de NaOH 2N, em seguida a lâmina é
observada ao microscópio óptico sob luz fluorescente de comprimento de onda de 365nm
onde se nota a formação de manchas avermelhadas caso haja a presença da enzima em
questão, uma vez que, o cromóforo sirohidroclorina presente na mesma reage desta
maneira à este tipo de luz (POSTGATE, 1979). Este teste teve o seu resultado confirmado
posteriormente pela metodologia citada por Postgate (1979) onde os isolados tem suas
células lisadas ao se adicionar o NaOH 2N em tubos de ensaios fechados hermeticamente
contendo os mesmos após incubação, neste caso a formação das manchas avermelhadas é
confirmada ao se observar os tubos junto a uma lâmpada teste com luz de comprimento de
onda de 365nm. Para as duas metodologias utilizaram-se controles negativos.
3.4.3 Caracterização Bioquímica Visando a Identificação de Processos
Por fim, foram realizados outros 2 testes: a presença da enzima catalase e a
capacidade dos isolados em realizar a desnitrificação.
Os testes de catalase e desnitrificação foram feitos por meio de metodologias
padrão (CLESCERI et al., 1999) utilizando-se, respectivamente, a reação das células com
água oxigenada 30V (trinta volumes) e reação dos isolados com soluções de naftiamina e
ácido sulfanílico após o seu crescimento em meio de cultura peptonado. Nos testes, foram
utilizados controles positivo e negativo, de bactérias de referência pertencentes ao
laboratório.
De posse dos resultados destes testes os mesmos foram utilizados, juntamente com
os testes bioquímicos de caracterização taxonômica, para a construção de um dendrograma
indicando a variabilidade bioquímica entre as bactérias. Este teste permite determinar com
maior nível de confiabilidade quais bactérias possuem maior semelhança bioquímica o que
facilita a escolha das cepas que devem ser usadas para os experimentos de fisiologia. Os
dendrogramas foram confeccionados por meio do programa Minitab 15.1.30.0., da Minitab
Inc..
38
3.4.4 Caracterização Taxonômica Presuntiva dos Isolados
Para proceder-se à identificação presuntiva dos isolados após a realização destes
testes foram utilizadas três fontes como referência: os trabalhos de Castro et al. (2000);
Rabus et al. (2006), e Thauer et al. (2007). A escolha destas referências em questão se deu
devido ao fato dos mesmos indicarem características diferentes como forma de
identificação dos grupos de BRS, o que torna suas chaves úteis, uma vez sendo
complementares. Além disso, Rabus et al. (2006) e Thauer et al. (2007) foram trabalhos
publicados em livros conceituados em relação à descrição de características tanto
morfológicas quanto bioquímicas dos grupos descritos de bactérias, incluindo as redutoras
de sulfato, além disso, se tratam de edições muito recentes e de ampla revisão
bibliográfica.
3.4.5 Caracterização Molecular dos Isolados
Primeiramente, os isolados foram inoculados em placas de Petri visando à obtenção
de colônias visíveis. Após este passo as colônias foram colhidas das placas com a ajuda de
alça bacteriológica e solubilizadas em água própria para a realização da extração de DNA
(ultra-pura) segundo protocolo de lise térmica citado por Moore et al. (2004).
Em seguida, os produtos obtidos pela extração de DNA foram amplificados por
meio de reação de polimerase em cadeia (PCR) que ocorreram na presença dos primers
EpsilonF(5`-GAGASTTGATCMTGGCTCAG-3`) e 1541R(5`-AGGAGGTGATCAGCC3`) (EMBLEY, 1991), específicos para amplificação do gene DNAr 16S de
microrganismos do domínio Bacteria. As condições de amplificação por reação foram:
Tampão de reação (1x), MgCl2 (2,0mM), dNTP (0,8mM), primer 1 (500nM), primer 2
(500nM), BSA (0,2mg/L), Taq polimerase (1,25u/mL). As reações foram incubadas em um
termociclador Biocycler modelo MJ96+, e o programa de amplificação consistiu das
seguintes etapas: 3 minutos a 94ºC (desnaturação inicial); 30 ciclos de 60 segundos a 94ºC
(desnaturação), 1 minuto a 55ºC (anelamento dos primers) e 1 minuto a 72ºC (extensão); 7
minutos a 72º C (extensão final). O resultado das amplificações foram analisadas em gel de
39
agarose 1% em TAE 1x (Tris, Ácido acético glacial, EDTA) corados com SybrSafe DNA
gel stain (Invitrogen) e visualizados em um transiluminador de luz UV. Várias reações de
amplificação foram feitas até uma única banda de aproximadamente 1500 pb ser
visualizada.
Obtendo-se resultado positivo na observação do gel de agarose os produtos de PCR
foram purificados utilizando-se o DNA Purification Kit da marca MO BIO, segundo
protocolo presente no mesmo e, em seguida, procedeu-se à determinação da concentração
de DNA presente nos produtos purificados utilizando-se de análise em gel de agarose e
comparação com o Low DNA Mass Ladder (Ladder Massa) da Invitrogen, sendo os
mesmos posteriormente enviados para procedimento de seqüenciamento utilizando ambos
os primers a fim de se obter uma seqüência de aproximadamente 1.400 pb. A empresa
GENOMIC – Engenharia molecular foi a responsável pelo seqüenciamento sendo as
amostras enviadas segundo as suas especificações.
Após recebimento do resultado, os fragmentos de bases obtidos foram comparados
aos previamente depositados no GenBank do National Center for Biotechnology
Information (NCBI), sendo assim determinado o seu nível de similaridade com vários
isolados bacterianos descritos na literatura o que possibilitaria a construção de uma árvore
filogenética por meio do programa MEGA versão 4 (TAMURA et al., 2007) indicando a
posição taxonômica dos mesmos dentre os vários grupos descritos de BRS.
3.5 Métodos para Escolha de Linhagens para Testes Fisiológicos
Após a realização de todos os testes citados, já se possuía uma boa idéia das
características dos isolados o que foi muito útil para a sua identificação. Contudo, o
número de isolados, mesmo após a sua separação em grupos segundo os testes
bioquímicos, se mostrou muito grande e percebeu-se que a utilização de todos para os
testes de cinética de crescimento tornaria o experimento altamente dispendioso com muita
dificuldade em se organizar e comparar os dados. Assim, decidiu-se pela eliminação de
algumas culturas por meio de testes que permitiriam observar quais são as que apresentam
características mais interessantes para o trabalho, incluindo o crescimento em condições
variáveis de pH e produção de H₂S em curtos períodos de tempo. Deve-se observar que os
40
resultados dos testes bioquímicos também foram levados em conta, pois se decidiu não
utilizar isolados que tivessem alta similaridade entre si para os testes de cinética.
3.5.1 Determinação do Tempo de Redução de Sulfato em Relação ao pH
Neste experimento foi determinado o tempo em que cada isolado apresentava um
resultado visível de redução de sulfato, levando-se em conta diferentes valores de pH.
Segundo Willow e Cohen (2003), as BRS mostram um crescimento mais acentuado no
meio ambiente na faixa de pH entre 5 e 9, assim a escolha deste intervalo de pH se mostrou
muito apropriada para o teste. Logo, 5 alíquotas de 0,1mL de cada isolado foram
inoculadas cada uma em um frasco de 2mL contendo meio modificado de Postgate C.
Cada frasco possuía o meio com um valor diferente de pH, a saber: pH’s 5, 6, 7, 8 e 9; e
foram incubados em estufa de cultura regulada à 32°C. Após este procedimento, a cada 12
horas era feita uma leitura dos isolados para observação da formação de precipitado negro
de sulfeto de ferro, que caracteriza a redução do sulfato no meio. O tempo de 12 horas foi
escolhido devido á observações do crescimento dos isolados nos testes anteriores, onde a
redução de sulfato só se tornava aparente após alguns dias de incubação.
Ao se observar a primeira formação de precipitado no tubo o tempo era anotado e o
isolado era mantido em incubação até a precipitação total do ferro na forma de sulfeto
ferroso. Após esta etapa, este tempo também era anotado e os isolados eram mantidos em
geladeira para experimento posterior.
3.5.2 Determinação do Número de Células dos Isolados após Redução de
Sulfato em Diferentes Valores de pH
Para a realização deste experimento foi utilizada uma metodologia de contagem por
meio da câmara de Neubauer (BAIN, 2006), segundo a qual alíquotas de 0,1mL de uma
diluição de 1:10 de cada tubo, os quais foram utilizados no experimento anterior, foi
inoculada na câmara para a contagem das unidades celulares em microscópio óptico.
Depois de realizada a contagem foi feita a determinação do número total de células por
41
mililitro de amostra utilizando-se os fatores de conversão próprios da câmara. Os
resultados puderam ser utilizados como uma forma de comparar o número de células
presente em cada isolado segundo o pH do mesmo. Além disso, foi possível fazer um
paralelo entre o número de células de cada amostra e o tempo em que a redução do sulfato
pelas cepas se tornou visível no meio de cultivo.
Comparando-se os resultados dos testes de cada isolado foi possível escolher
aqueles que apresentavam características que poderiam ser de melhor valia para o trabalho,
como dito anteriormente, e com eles prosseguiu para os experimentos seguintes.
3.6 Determinação das Curvas de Crescimento e Tempo de Geração dos
Isolados
Os isolados escolhidos foram inoculados em frascos testes de vidro herméticos de
1L vedados com septos de silicone e tampas vazadas, garantindo assim um meio
anaeróbico próprio para os mesmos, e incubados a uma temperatura de 32ºC.
A retirada de alíquotas de 5mL para realização do teste foi feita a cada dois dias
durante um período de dez dias totalizando seis leituras por amostra (incluindo medição do
tempo 0), para retirada das alíquotas foi utilizada uma seringa estéril para perfurar os
septos evitando assim possíveis problemas com contaminações externas. O crescimento
das amostras ao passar do tempo foi determinado segundo a medida da absorbância do
meio em fotocolorímetro Metronic (Modelo M2) utilizando-se o meio de cultivo estéril
como branco e filtro na cor laranja (620nm).
Buscando os melhores resultados possíveis para o crescimento dos isolados
também se procurou diminuir a fase de adaptação dos mesmos, isso foi feito por meio da
inoculação dos isolados nos frascos de teste após os mesmos serem incubados por uma
semana em tubos Falcon com volume de quinze mililitros. Depois do período de incubação
o meio foi centrifugado e o sobrenadante descartado, assim, após ressuspender a massa de
células resultante com salina estéril, a mesma foi adicionada aos frascos testes respeitando
uma inoculação de 5% do volume total.
Quanto ao meio utilizado, foi observado que o Postgate C modificado não seria de
valia para o teste por dois motivos:
42
•
A precipitação do ferro contido no meio na forma de sulfetos não permitiria uma leitura
correta da absorbância das células, e;
•
Os sulfetos metálicos podem agir como inibidores para as BRS, pois a sua precipitação
nas paredes das células bloqueia o acesso das mesmas aos substratos e a outros
nutrientes presentes no meio (UTGIKAR et al. apud TANG et al., 2009 – pag. 77).
Tendo em vista estas questões, foi inicialmente proposta a retirada dos compostos
de ferro do meio de cultivo visando impedir a sua precipitação e assim poder realizar o
experimento. Porém foi observado também que muitas BRS dependem de ferro no meio
para o seu crescimento, já que o mesmo é requerido como micronutriente por muitas delas
(POSTGATE, 1965), tornando inviável que o mesmo seja totalmente eliminado do
experimento.
Para solucionar este problema escolheu-se utilizar outro meio de cultivo para este
experimento: o meio Postgate C original, que possui uma quantidade bem inferior de ferro
em sua composição além de uma quantidade maior de citrato de sódio que impede que
ocorra a precipitação do mesmo na forma de sulfetos (POSTGATE, 1979); porém, como
este meio possui em sua composição o extrato de levedura, optou-se por modificar a sua
fórmula retirando-o visando assim impedir a proliferação de bactérias indesejadas que
podem agir como contaminantes como, por exemplo, as bactérias fermentativas (WIDDEL
e BAK, 1992); para compensar esta fonte de carbono utilizou-se uma maior concentração
de lactato.
Como última observação em relação ao meio, sabe-se que a presença de sulfeto em
excesso no meio pode inibir o crescimento das BRS (ZAGURI et al., 2007) o que poderia
acontecer ao meio utilizado já que o sulfeto não estaria reagindo com o ferro formando o
sal insolúvel; optou-se por sanar este problema com a utilização de um maior espaço vazio
nos frascos (headspace) onde o crescimento das bactérias ocorria, permitindo assim que o
sulfeto migrasse do meio para a atmosfera do frasco onde não afetaria os isolados.
Com a determinação das curvas de crescimento, os resultados foram interpretados
graficamente por meio do programa ORIGIN 8 Pro (OriginLab) e os tempos de geração de
cada um dos isolado foram determinados segundo metodologia padrão (VARESCHE apud
SILVA, 1999 – pag. 49), segundo a qual o tempo de geração (Tg) de uma cultura
bacteriana pode ser calculado segundo a seguinte equação:
43
Equação 3.1
Tg =
µ
Sendo µmax determinado pelo valor do coeficiente angular da equação da reta que
representa a fase exponencial de crescimento da cultura bacteriana (GOMES apud SILVA,
1999 – pag. 49).
Logo, com estes dados em mãos pode-se determinar com grande precisão quais dos
isolados possuíam crescimento mais rápido.
3.7 Quantificação do Consumo de Sulfato pelos Isolados
A quantificação do sulfato foi realizada segundo metodologia padrão (CLESCERI
et al., 1999), pela qual a concentração de sulfato no meio é determinada por meio da
formação de cristais insolúveis de sulfato de bário medidos por método turbidimétrico.
Para a realização deste método em particular, foi inicialmente feita uma curva padrão
utilizando-se soluções com concentrações conhecidas de sulfato (FIGURA 9-1) medidas,
segundo o método citado, em um turbidímetro da marca DEL LAB (Modelo DLM-2000B).
A curva não apenas foi importante para a determinação do sulfato no meio de cultivo,
como também serviu para demonstrar o grau de confiabilidade do aparelho utilizado, ou
seja, a maior concentração de sulfato que o meio poderia conter para que houvesse uma
medida confiável. Assim, neste experimento, o meio Postgate C modificado teve uma
redução na sua concentração de sulfato para 4g/L se adequando assim ao nível necessário
para uma leitura confiável. Maiores informações sobre o procedimento para quantificação
de sulfato encontram-se no ANEXO 1, onde o mesmo é descrito.
O procedimento de incubação e coleta de alíquotas dos isolados para o teste foi o
mesmo utilizado para o experimento de determinação da curva de crescimento e tempo de
geração dos isolados, diferenciando-se pela utilização do meio de Postgate C modificado e
pelo número de alíquotas para análise que, neste caso, foram um total de 10. Além disso,
para se evitar que o sulfeto de ferro formado interferisse na leitura turbidimétrica, as
alíquotas colhidas eram centrifugadas por 5 minutos a 10.000 RPM, sendo utilizado para
leitura apenas o sobrenadante livre de sulfeto de ferro. Assim, para cada isolado foi
determinada uma curva de consumo de sulfato.
44
3.8 Quantificação da Produção de Sulfeto pelos Isolados
A quantificação da produção de sulfeto foi feita também segundo metodologia
padrão (CLESCERI et al., 1999) onde a concentração foi obtida através da reação do meio
com soluções de acetato de zinco, dimetil-p-fenilenodiamina e sulfato férrico amoniacal.
Novamente foi feita uma curva de calibração (FIGURA 9-2) visando os mesmos objetivos
da realizada no experimento de quantificação de consumo de sulfato. As leituras foram
feitas por meio de fotocolorímetro Metronic (Modelo M2) utilizando-se de filtro de cor
laranja (620nm) e água mili-Q desoxigenada como branco. O procedimento é descrito com
maiores detalhes no ANEXO 2 do presente trabalho.
O procedimento para incubação dos isolados foi o mesmo utilizado no experimento
de quantificação de sulfato e se mostrou muito vantajoso, uma vez que os frascos
herméticos impediam que o sulfeto se difundisse para o ambiente, sendo que a coleta
realizada com as seringas descartáveis também contribuiu para este fim.
Ao final das leituras as curvas de produção de sulfeto de cada isolado foram
comparadas com as suas respectivas curvas consumo do sulfato determinadas
anteriormente, o que permitiu que se inferissem importantes conclusões sobre a fisiologia
dos mesmos.
45
4
RESULTADOS
4.1 Amostras Positivas para Redução de Sulfato
No experimento de enriquecimento as amostras de sedimento apresentaram
resultado positivo para a redução do sulfato, ou seja, foram capazes de precipitar sulfeto de
ferro por meio da produção de sulfetos.
Assim, para cada amostra positiva foi feito o espalhamento em placa (FIGURA
4-1) e das melhores placas realizou-se a contagem do número de colônias para quantificar
as bactérias presentes após enriquecimento, determinando assim o número de UFC/mL
(Unidades Formadoras de Colônias) como apresentado na TABELA 4-1.
FIGURA 4-1: Crescimento dos organismos em meio sólido de Postgate C após enriquecimento e
espalhamento das amostras. Incubação em anaerobiose por 24 horas.
A: Amostra R1A e B: Amostra R3A.
TABELA 4-1: Número médio de UFC´s entre as amostras positivas para redução de sulfato.
Amostra
No de Colônias / Diluição
-1
UFC/mL (média)
-2
R1A
100/10 e 85/10
R3A
292/10-3 e 29/10-4
Colônias Positivas*
4
12
2,91x106
14
4,75x10
*: Precipitado negro em meio modificado de Postgate C.
46
4.2 Linhagens Isoladas
Depois da contagem de colônias procedeu-se à obtenção de culturas puras das
amostras positivas para redução de sulfato. Neste estágio as amostras apresentaram um
número satisfatório de isolados positivos após incubação (TABELA 4-1) que
demonstraram capacidade de redução de sulfato (FIGURA 4-2) o que indicou serem
apropriados para os demais experimentos.
FIGURA 4-2: Isolados de BRS das amostras apresentando diferenças na redução de sulfato (visualmente) em meio
Postgate C após uma semana de incubação à 32 ºC em anaerobiose, o primeiro tubo (da esquerda para a
direita) demonstra um controle negativo.
47
4.3 Caracterização Morfológica dos Isolados
4.3.1 Morfologia das Colônias
Foi executada a caracterização morfológica dos isolados das amostras segundo a
metodologia citada. Os resultados obtidos em relação à observação macroscópica das
colônias podem ser observados no QUADRO 4-1 que demonstra pouca variabilidade entre
os mesmos.
QUADRO 4-1: Características das colônias das linhagens isoladas observadas em meio Postgate C sólido.
Isolado
R101A
R102A
R103A
R104A
R105A
R106A
Isolado
R301A
R302A
R303A
R304A
R305A
R306A
R307A
AMOSTRA - R1A
Características
Isolado
Pequenas e esbranquiçadas
R107A
Pequenas, esbranquiçadas e
R108A
levemente transparentes
Pequenas e esbranquiçadas
R109A
Médias e esbranquiçadas
R110A
Pequenas e esbranquiçadas
R111A
Médias e esbranquiçadas
R112A
AMOSTRA - R3A
Características
Isolado
Pequenas e esbranquiçadas
R308A
Pequenas e esbranquiçadas
R309A
Pequenas e esbranquiçadas
R310A
Pequenas e esbranquiçadas
R311A
Pequenas e esbranquiçadas
R312A
Pequenas e esbranquiçadas
R313A
Pequenas e esbranquiçadas
R314A
Características
Pequenas e esbranquiçadas
Pequenas e esbranquiçadas
Pequenas e esbranquiçadas
Pequenas e esbranquiçadas
Pequenas e esbranquiçadas
Médias e esbranquiçadas
Características
Pequenas e esbranquiçadas
Pequenas e esbranquiçadas
Pequenas e esbranquiçadas
Pequenas e esbranquiçadas
Pequenas e esbranquiçadas
Pequenas e esbranquiçadas
Pequenas e esbranquiçadas
4.3.2 Morfologia das Células Observadas ao Microscópio Ótico (M.O.)
Após a observação macroscópica foi executada a observação ao M.O. dos isolados.
Como pode ser visto no QUADRO 4-2, esta análise apresentou pouca variação entre os
isolados da amostra R1A, sendo que os isolados da amostra R3A foram mais diversos
morfologicamente. Os isolados R1A foram os únicos que apresentaram esporos
evidenciados por meio do procedimento de coloração com Verde Malachita.
48
Deve-se salientar que os resultados quanto à coloração de Gram e forma das células
são dados muito importantes para a taxonomia dos isolados (RABUS et al., 2006).
QUADRO 4-2: Características morfológicas ao M.O. das linhagens isoladas após técnica de coloração de
Gram.
Isolado
R101A
R102A
R103A
R104A
R105A
R106A
R107A
R108A
R109A
R110A
R111A
R112A
Forma
Bastonetes
Bastonetes
Bastonetes
Bastonetes
Bastonetes
Bastonetes
Bastonetes
Bastonetes
Bastonetes
Bastonetes
Bastonetes
Bastonetes
Isolado
R301A
R302A
R303A
R304A
R305A
R306A
R307A
R308A
R309A
R310A
R311A
R312A
R313A
R314A
Forma
Bastonete limão
Bastonete oval
Bastonete limão
Bastonete limão
Bastonete oval
Bastonete oval
Bastonete oval
Bastonete limão
Bastonete oval
Bastonete limão
Bastonete oval
Bastonete limão
Bastonete oval
Bastonete oval
AMOSTRA - R1A
Arranjo
Estreptobacilos
Estreptobacilos
Estreptobacilos
Estreptobacilos
Estreptobacilos
Estreptobacilos
Estreptobacilos
Estreptobacilos
Estreptobacilos
Estreptobacilos
Estreptobacilos
Estreptobacilos
AMOSTRA - R3A
Arranjo
Não possui
Não possui
Não possui
Não possui
Não possui
Não possui
Não possui
Não possui
Não possui
Não possui
Não possui
Não possui
Não possui
Não possui
GRAM
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Esporos
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
GRAM
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Esporos
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
4.3.3 Morfologia das Células ao Microscópio Eletrônico de Varredura
(MEV)
Após estes testes, alguns isolados selecionados foram conduzidos para análise em
MEV no Microlab (DEGEO-UFOP). O critério de escolha destes isolados considerou suas
características observadas ao microscópio óptico bem como as características coloniais.
49
Com essa técnica, por oferecer maior poder de resolução, confirmou-se às formas celulares
já observadas em microscopia ótica, bem como a aproximação de suas dimensões
celulares.
A
B
C
D
E
F
G
H
FIGURA 4-3: Isolados bacterianos ao microscópio eletrônico. A: R104A, B: R105A, C: R107A, D: R111A,
E: R301A, F: R305A, G: R307A e H: R310A.
50
A visualização em MEV confirmou a morfologia ovóide do isolado R307A
(FIGURA 4-3 - G), a morfologia semelhante a limão (bacilo com extremidades afinaladas)
do isolado R310A (FIGURA 4-3 - E) além da morfologia bacilar dos isolados R104A,
R105A, R107A e R111A (FIGURA 4-3 - A à D). Por meio das observações em MEV,
pode-se também comparar as dimensões celulares dos isolados com maior precisão do que
o previamente observado em microscopia ótica conforme se pode observar na FIGURA
4-3, apresentada acima, o isolado R107A (FIGURA 4-3 - C) possui dimensões maiores do
que 1μm; os isolados R104A e R105A (FIGURAS 4-3 – A e B) têm dimensões
aproximadamente de 1μm enquanto os isolados R111A, R301A, R305A, R307A e R310A
(FIGURA 4-3 – D, E, F, G e H), têm dimensões menores do que 1μm.
4.4 Caracterização Bioquímica dos Isolados
Os resultados dos testes metabólicos dos isolados de BRS estão apresentados nos
QUADROS 4-3, 4-4 e 4-5. Uma amostragem de um dos testes apresentados no QUADRO
4-5 pode ser observada na FIGURA 4-4. Deve-se salientar que o resultado positivo nestes
testes não significa a precipitação de sulfeto de ferro, mas sim á capacidade de cada isolado
em crescer nas condições de cada meio. Cada teste foi feito em duplicata.
QUADRO 4-3: Características metabólicas gerais dos isolados da Amostra R1A incubados em anaerobiose à
32ºC por 48 horas.
AMOSTRA - R1A
Isolado
R101A
R102A
R103A
R104A
R105A
R106A
R107A
R108A
R109A
R110A
R111A
R112A
Glicose
Ácido Gás
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Lactose
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Citrato Uréia
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Indol
+
-
SIM
H2S Motilidade
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
H2S: Ácido sulfídrico.
51
QUADRO 4-4: Características metabólicas gerais dos isolados da Amostra R3A incubados em anaerobiose à
32 ºC por 48 horas.
AMOSTRA - R3A
Isolado
R301A
R302A
R303A
R304A
R305A
R306A
R307A
R308A
R309A
R310A
R311A
R312A
R313A
R314A
Glicose
Ácido Gás
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Lactose
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Citrato Uréia
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Indol
-
SIM
H2S Motilidade
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
H2S: Ácido sulfídrico.
QUADRO 4-5: Diferenciação dos isolados quanto à atividade de catalase e desnitrificação. Teste de
desnitrificação realizado após incubação à 32 ºC em anaerobiose por uma semana em meio
de cultura peptonado (CLESCERI et al., 1999).
Isolado
R101A
R102A
R103A
R104A
R105A
R106A
Catalase
+
+
+
+
+
-
Isolado
R301A
R302A
R303A
R304A
R305A
R306A
R307A
Catalase
-
AMOSTRA R1A
Desnitrificação Isolado
+
R107A
+
R108A
+
R109A
+
R110A
+
R111A
+
R112A
AMOSTRA R3A
Desnitrificação Isolado
+
R308A
+
R309A
+
R310A
+
R311A
+
R312A
+
R313A
R314A
Catalase
+
+
+
+
+
Desnitrificação
+
+
+
+
+
+
Catalase
-
Desnitrificação
+
+
+
+
+
+
+
52
FIGURA 4-4: Teste de desnitrificação de dois dos isolados. O primeiro e o segundo tubos (da esquerda para
a direita) representam, respectivamente, um controle negativo e um positivo utilizando E.
coli.
Os testes metabólicos referentes à utilização de diferentes fontes de carbono pelos
isolados podem ser conferidos por meio dos QUADROS 4-6 e 4-7.
O último teste bioquímico realizado foi o que indicaria a presença da enzima
desulfoviridina, tendo o mesmo apresentado resultados negativos para todos os isolados
presentes no trabalho mesmo após se realizarem novas análises segundo metodologia
proposta por POSTGATE (1979) que foi utilizada também como uma forma de
confirmação dos resultados da primeira análise.
53
QUADRO 4-6: Características dos isolados quanto à utilização de diferentes substratos como fonte de
carbono. Incubação à 32 ºC em anaerobiose por uma semana. Amostras R1A.
Isolado
R101A
R102A
R103A
R104A
R105A
R106A
R107A
R108A
R109A
R110A
R111A
R112A
Isolado
R101A
R102A
R103A
R104A
R105A
R106A
R107A
R108A
R109A
R110A
R111A
R112A
Isolado
R101A
R102A
R103A
R104A
R105A
R106A
R107A
R108A
R109A
R110A
R111A
R112A
AMOSTRA R1A
Acetato
Lactato
Gás
R. Sulf.
Gás
R. Sulf.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Etanol
Acetona
Gás
R. Sulf.
Gás
R. Sulf.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Lactose
Butirato
Gás
R. Sulf.
Gás
R. Sulf.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Glicose
Gás
R. Sulf.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Benzeno
Gás
R. Sulf.
Propionato
Gás
R. Sulf.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
R. Sulf.: Redução de sulfato evidenciada por formação de precipitado negro de sulfeto de ferro.
54
QUADRO 4-7: Características dos isolados quanto à utilização de diferentes substratos como fonte de
carbono. Incubação a 32 ºC em anaerobiose por uma semana. Amostras R3A.
AMOSTRA R3A
Isolado
R301A
R302A
R303A
R304A
R305A
R306A
R307A
R308A
R309A
R310A
R311A
R312A
R313A
R314A
Isolado
R301A
R302A
R303A
R304A
R305A
R306A
R307A
R308A
R309A
R310A
R311A
R312A
R313A
R314A
Isolado
R301A
R302A
R303A
R304A
R305A
R306A
R307A
R308A
R309A
R310A
R311A
R312A
R313A
R314A
Gás
Gás
Gás
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Acetato
R. Sulf.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Etanol
R. Sulf.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Lactose
R. Sulf.
-
Lactato
Gás
R. Sulf.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Acetona
Gás
R. Sulf.
+
+
+
+
+
+
+
+
Butirato
Gás
R. Sulf.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Glicose
Gás
R. Sulf.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Benzeno
Gás
R. Sulf.
Propionato
Gás
R. Sulf.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
R. Sulf.: Redução de sulfato evidenciada por formação de precipitado negro de sulfeto de ferro.
55
Utilizando os dados obtidos foram confeccionados 2 dendrogramas indicando a
diferenciação bioquímica entre os isolados das amostras de solo R1A e R3A que podem ser
observados, respectivamente nas FIGURAS 4-5 e 4-6.
Dendrograma - R1A
Similaridade
0,00
33,33
66,67
100,00
1
5
12
8
10
6
4
Isolados
7
9
11
2
3
FIGURA 4-5: Dendrograma indicando a diferenciação bioquímica entre os isolados da amostra R1A. Os
números de 1 à 12 representam, respectivamente, os isolados de R101A à R112A.
Dendrograma - R3A
Similaridade
0,00
33,33
66,67
100,00
1
4
8
11
14
13
7
2
Isolados
6
12
3
5
9
10
FIGURA 4-6: Dendrograma indicando a diferenciação bioquímica entre os isolados da amostra R3A. Os
números de 1 à 14 representam, respectivamente, os isolados de R301A à R314A.
56
Cada um dos dendrogramas permitiu a organização dos isolados de cada amostra
em grupos segundo a sua semelhança bioquímica. A organização dos isolados das amostras
R1A e R3A pode ser observada, respectivamente, nos QUADROS 4-8 e 4-9.
QUADRO 4-8: Similaridade bioquímica entre os isolados da amostra R1A.
GRUPO
1
4
3
5
6
2
ISOLADO (CÓDIGO)
R101A (1)
R105A (5)
R112A (12)
R108A (8)
R110A (10)
R106A (6)
R104A (4)
R107A (7)
R109A (9)
R111A (11)
R102A (2)
R103A (3)
SIMILARIDADE
100%
50%
38,77% (Grupo 1)
20,94% (Grupo 1)
29,30% (Grupo 6)
50%
38,77%
QUADRO 4-9: Similaridade bioquímica entre os isolados da amostra R3A.
GRUPO
1
4
7
6
2
3
5
ISOLADO (CÓDIGO)
R301A (1)
R304A (4)
R308A (8)
R311A (11)
R314A (14)
R313A (13)
R307A (7)
R302A (2)
R306A (6)
R312A (12)
R303A (3)
R305A (5)
R309A (9)
R310A (10)
SIMILARIDADE
22,54% (Grupo 4)
100%
100%
55,29%
10,57% (Grupo 1)
55,29%
100%
36,76 (Grupo 5)
100%
55,29%
4.5 Identificação Taxonômica Presuntiva dos Isolados
Os resultados dos testes bioquímicos e morfológicos dos isolados permitiram a
identificação presuntiva de vários deles, conforme referências publicadas a respeito das
BRS (THAUER et al., 2007, RABUS et al., 2006 e CASTRO et al., 2000).
57
Os isolados referentes à amostra R1A: R101A, R103A, R105A, R108A, R110A e
R112A mostraram grande probabilidade de pertencerem a dois dos três possíveis gêneros
presentes na família Firmicutes: Desulfotomaculum e Desulfosporosinus já que
apresentaram características comuns a este, tais como células Gram positivas formadoras
de esporos possuidoras ou não da capacidade de oxidar completamente o substrato
orgânico que utilizam à CO2, além de possuírem motilidade. No entanto, os demais
isolados apresentaram algumas características que destoam das descritas para os gêneros
desta família: os isolados R102A e R107A apresentaram teste negativo para a capacidade
de utilizar etanol como fonte de carbono; os isolados R104A e R106A apresentaram teste
negativo para a motilidade e os isolados R109A e R111A apresentaram resultados
negativos para etanol e motilidade. Assim, não foi possível a sua classificação precisa em
nenhum gênero, embora suas características morfológicas indiquem uma possível
proximidade aos gêneros descritos na família Firmicutes.
Já os isolados referentes à amostra R3A não puderam, em sua maioria, ter um
possível gênero determinado segundo os testes realizados. Assim, os isolados R301A,
R303A, R304A, R308A, R310A e R312A, demonstraram uma possível ligação ao gênero
Desulfobulbus, uma vez que apresentavam uma morfologia de bastonetes curtos em forma
de limão que é muito característica a este gênero. Da mesma forma os isolados R302A,
R306A e R307A demonstraram muitas características em comum ao gênero Desulfacinum,
como a sua forma oval e a capacidade de utilizar compostos como o acetato e o lactato
como fontes de carbono para biossínteses. Por fim, os isolados R305A, R309A, R311A,
R313A e R314A foram os únicos cujas características reveladas pelos testes de
caracterização morfológica e bioquímica demonstraram correspondência a um gênero em
particular, o Desulfacinum. Embora nenhum dos outros isolados tenham tido um possível
gênero identificado, é muito possível que eles tenham uma proximidade maior a algum
gênero da família Desulfobulbaceae, uma vez que demonstraram características muito
semelhantes aos dois gêneros citados que são descritos nesta família.
4.6 Caracterização Molecular dos Isolados
O procedimento adotado para extração do DNA genômico e amplificação do DNAr
16S forneceu os resultados esperados como pode ser observado na FIGURA 4-7, onde
nota-se a amplificação do fragmento de aproximadamente 1500 pb. No entanto, como
58
alguns isolados não apresentaram reação visível no gel o procedimento foi repetido
aumentando-se a quantidade de amostra (FIGURA 4-8). Os isolados foram numerados para
facilitar sua identificação de 1 a 6, sendo cada um deles, respectivamente, os isolados
R102A, R106A, R112A, R304A, R307A e R313A.
FIGURA 4-7: Gel de agarose mostrando a amplificação do DNA dos isolados.
L: Ladder, B: Branco, bp: Pares de base.
FIGURA 4-8: Gel de agarose mostrando a amplificação do DNA dos isolados.
L: Ladder, B: Branco, bp: Pares de base.
Como o isolado 1 (R102A) apresentou amplificações inespecíficas no gel
(FIGURA 4-8), apenas os demais isolados tiveram se DNA purificado e quantificado como
observado na FIGURA 4-9.
59
FIGURA 4-9: Gel de agarose mostrando a quantificação do DNA dos isolados.
LM: Ladder Massa, B: Branco, ng: Nanogramas.
Segundo observado no Ladder Massa (FIGURA 4-9), e sabendo-se que as
concentrações do mesmo são referentes à 5µL de amostra, foram propostas as
concentrações de DNA para cada reação segundo a TABELA 4-2.
TABELA 4-2: Concentração de DNA das amostras purificadas segundo leitura do Ladder Massa.
Reação
2
3
4
5
6
Isolado
R106A
R112A
R304A
R307A
R313A
Concentração (ng/µL)
6,5
16,5
13
10
2
De posse destes dados, as reações foram encaminhadas para seqüenciamento na
empresa GENOMIC – Engenharia molecular.
Com o recebimento do seqüenciamento, prosseguiu-se a confecção da árvore
filogenética dos isolados com base em seqüencias já depositadas no GenBank da NCBI,
para tanto os dados recebidos foram primeiramente observados por meio do programa
MEGA versão 4 (TAMURA et al., 2007) sendo então descartadas as regiões com
fragmentos contendo bases de identificação incerta que são muito comuns nas
extremidades das cadeias de DNA seqüenciadas; assim, as seqüências resultantes serviram
como base de consulta para o GenBank de onde novos dados de bactérias foram obtidos
para se realizar a análise filogenética.
Os isolados, segundo o GenBanK, apresentaram grande similaridade com alguns
grupos já descritos, como pode ser observado no QUADRO 4-10.
60
QUADRO 4-10: Proximidade taxonômica entre os isolados seqüenciados e os microrganismos catalogados
no GenBank.
E.
Similaridade
Isolado
Catalogados no GenBank
Código
Value
Máxima
Pantoea sp. y2 16S ribosomal RNA gene
GQ395336.1
0.0
99%
Pantoea sp. M1R3 16S ribosomal RNA gene
FJ560465.1
0.0
99%
R106A
Endophytic bacterium HA04 16S rib. RNA gene
FJ205656.1
0.0
99%
Uncultured bacterium clone Nan3 16S rib. RNA
EU862304.1
0.0
99%
Pantoea sp. y2 16S ribosomal RNA gene
GQ395336.1
0.0
98%
Pantoea sp. M1R3 16S ribosomal RNA gene
FJ560465.1
0.0
98%
R112A
Endophytic bacterium HA04 16S rib. RNA gene
FJ205656.1
0.0
98%
Uncultured bacterium clone Nan3 16S rib. RNA
EU862304.1
0.0
98%
Pantoea sp. y2 16S ribosomal RNA gene
GQ395336.1
0.0
99%
Pantoea sp. M1R3 16S ribosomal RNA gene
FJ560465.1
0.0
99%
R304A
Endophytic bacterium HA04 16S rib. RNA gene
FJ205656.1
0.0
99%
Uncultured bacterium clone Nan3 16S rib. RNA
EU862304.1
0.0
99%
Pantoea sp. y2 16S ribosomal RNA gene
GQ395336.1
0.0
98%
Pantoea sp. M1R3 16S ribosomal RNA gene
FJ560465.1
0.0
98%
R307A
Endophytic bacterium HA04 16S rib. RNA gene
FJ205656.1
0.0
98%
Uncultured bacterium clone Nan3 16S rib. RNA
EU862304.1
0.0
98%
Pantoea sp. M1R3 16S ribosomal RNA gene
FJ560465.1
0.0
98%
Endophytic bacterium HA04 16S rib. RNA gene
FJ205656.1
0.0
98%
R313A
Pantoea sp. y2 16S ribosomal RNA gene
GQ395336.1
0.0
98%
Uncultured bacterium, partial 16S rRNA gene
CU915123.1
0.0
98%
O Valor E. (E. Value), representa a possibilidade da busca por seqüências
semelhantes aos isolados, realizada no GenBanK, apresentar resultados obtidos ao acaso,
sendo que, quanto menor é este número, maior é esta probabilidade. O maior número
possível para o Valor E. é 0.0.
Por fim, gerou-se uma árvore filogenética, segundo observa-se na FIGURA 4-10.
R106A
R112A
R304A
63
R307A
Pantoea sp. (GQ395336.1)
22
26
R313A
NC. Enterobacter sp. (EU705171.1)
Enterobacter sp. (EF429007.1)
Pantoea sp. (FJ560465.1)
Enterobacter cloacae (AM778415.1)
Leclercia sp. (GQ856079.1)
0.001
FIGURA 4-10: Árvore filogenética contendo sequências do gene DNAr 16S (1.137 pb) construída pelo
método Neighbor-Joining e modelo Maximum Composite Likelihood no programa Mega
4.1. Análise de Bootstrap com 1000 réplicas. Números de referência no GenBank se
encontram entre parênteses. NC.: Não Cultivada.
61
4.7 Escolha de Linhagens para Testes Fisiológicos
Os testes realizados para escolha das cepas a serem utilizadas nos experimentos de
cinética estão listados nas TABELAS 4-3, 4-4 e 4-5.
TABELA 4-3: Determinação do tempo de início de redução do sulfato pelos isolados em diferentes valores
de pH.
Isolado
R101A
R102A
R103A
R104A
R105A
R106A
R107A
R108A
R109A
R110A
R111A
R112A
R301A
R302A
R303A
R304A
R305A
R306A
R307A
R308A
R309A
R310A
R311A
R312A
R313A
R314A
pH 5
96
48
48
36
36
84
84
60
156
60
60
60
84
36
36
60
48
96
36
84
156
72
96
84
156
60
Tempo de Início de Redução (Horas)
pH 6
pH 7
pH 8
36
240
36
36
36
24
36
36
84
36
24
24
36
24
36
60
36
48
60
48
60
36
24
24
36
156
36
60
156
36
36
24
36
36
36
36
120
24
12
36
24
12
156
36
36
36
24
12
36
24
72
72
24
24
156
24
60
120
24
12
48
36
24
36
24
12
48
24
36
36
36
12
36
240
24
48
36
12
pH 9
36
36
36
36
36
84
60
36
24
24
24
36
24
36
84
36
36
36
36
36
84
36
36
48
36
36
62
TABELA 4-4: Determinação do tempo de redução completa de sulfato pelos isolados em diferentes valores
de pH.
Amostra
R101A
R102A
R103A
R104A
R105A
R106A
R107A
R108A
R109A
R110A
R111A
R112A
R301A
R302A
R303A
R304A
R305A
R306A
R307A
R308A
R309A
R310A
R311A
R312A
R313A
R314A
pH 5
108
48
48
36
36
96
108
72
192
84
60
72
96
36
60
84
108
192
36
144
192
84
108
132
192
60
Tempo de Redução Completa (Horas)
pH 6
pH 7
pH 8
36
240
36
36
36
36
60
36
108
36
36
36
36
36
36
60
36
60
72
84
60
24
48
36
156
192
36
84
192
36
36
36
36
36
36
36
144
36
24
240
36
24
192
36
36
36
36
24
36
36
96
84
36
36
192
36
108
144
36
36
60
36
36
36
36
24
60
36
36
36
36
24
36
240
36
48
36
24
pH 9
36
36
36
36
36
120
84
36
36
36
36
36
36
36
108
36
36
36
36
36
132
36
36
60
36
36
63
TABELA 4-5: Determinação do número de células em cada isolado após redução total do sulfato nos
diferentes valores de pH testados.
Isolado
R101A
R102A
R103A
R104A
R105A
R106A
R107A
R108A
R109A
R110A
R111A
R112A
R301A
R302A
R303A
R304A
R305A
R306A
R307A
R308A
R309A
R310A
R311A
R312A
R313A
R314A
pH 5
4500
1500
3000
2000
4000
5500
11500
3000
3000
500
4500
6000
2500
6500
2500
1500
3000
5000
5500
8000
1500
3500
3500
2500
2500
4000
Número de Células por Mililitro de Amostra
pH 6
pH 7
pH 8
3000
2000
5500
8500
6000
1500
2000
3500
2000
7000
4500
13000
3500
7500
2500
1000
1500
1500
500
1500
1500
4000
5500
13500
7500
3000
4000
12000
6500
3000
5500
1500
1500
2500
500
6000
4000
6500
6500
6000
2000
11000
2000
1000
6500
2500
2500
9000
3500
5000
3000
5000
6000
1000
5000
3500
1500
6500
3500
10500
1500
1500
2000
7500
4500
13500
1000
3000
18000
17500
2000
5500
4000
2500
1000
1500
2000
6000
pH 9
19500
5500
7500
4000
3500
2000
3500
9000
9500
11500
4000
2500
2000
3500
500
1000
2000
3500
2500
9000
2500
4000
3500
2500
6500
4000
Após a observação dos resultados destes testes optou-se por selecionar os isolados
levando-se em conta as seguintes características: os que apresentaram menor número de
células quando foi verificada a redução total do sulfato, indicando um maior rendimento
por célula; aqueles que reduziram completamente o sulfato em um espaço de tempo mais
curto, também buscando melhor rendimento, além dos isolados que reuniram estas duas
características no maior número de diferentes valores de pH, demonstrando melhor
maleabilidade a esta mudança de ambiente. Também se levou em consideração o
agrupamento segundo as características bioquímicas.
Com estes parâmetros em mente os isolados R102A, R106A, R112A, R304A,
R307A e R313A foram definidas como as que seriam utilizadas nos experimentos
seguintes.
64
4.8 Curva de Crescimento e Tempo de Geração dos Isolados
A FIGURA 4-11 apresenta os resultados obtidos no experimento de determinação
da curva de crescimento dos isolados; deve-se salientar que todos os isolados tiveram as
mesmas condições de crescimento - incubação a 32ºC utilizando lactato como única fonte
de carbono disponível á uma concentração de 52 miliMolar (mM) e sulfato a uma
concentração de 32mM.
R102A
0,45
0.40
0,40
0.35
0,35
0.30
0,30
0.25
0.20
0.15
0.10
0,20
0,15
0,10
0.00
0,00
-0.05
-0,05
0
2
4
6
8
0
10
Tempo (Dias)
2
0,40
0,40
0,35
0,35
Absorbância
0,45
0,25
0,20
0,15
0,10
6
8
10
0,05
B
R304A
0,50
0,45
0,30
4
Tempo (Dias)
A
R112A
0,50
Absorbância
0,25
0,05
0.05
0,30
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
0,00
-0,05
-0,05
0
2
4
6
8
10
Tempo (Dias)
0
2
C
0,45
0,40
0,40
0,35
0,35
0,30
0,30
Absorbância
0,45
0,20
0,15
0,10
0,05
6
8
10
D
R313A
0,50
0,25
4
Tempo (Dias)
R307A
0,50
Absorbância
R106A
0,50
0.45
Absorbância
Absorbância
0.50
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
0,00
-0,05
-0,05
0
2
4
6
Tempo (Dias)
8
10
0
E
2
4
6
Tempo (Dias)
8
10
F
FIGURA 4-11: Curvas de crescimento dos isolados e equação de sua fase exponencial.
Como pode ser observado na FIGURA 4-11, os isolados apresentaram algumas
similaridades em suas curvas de crescimento, pode ser observado que, por exemplo, com
65
exceção do isolado R102A (FIGURA 4-11 – A), cujo período de crescimento exponencial
se situou entre os dias 0 e 2; todos os isolados apresentaram seu crescimento exponencial
situado entre os dias 0 e 4.
Mesmo com estas similaridades observam-se valores distintos no coeficiente
angular das retas geradas e, mesmo que alguns valores de R2 não tenham sido tão altos
como seria ideal, pôde-se ter uma boa idéia do tempo de geração dos isolados por meio
deles segundo observa-se na TABELA 4-6.
TABELA 4-6: Equação da fase exponencial, R2, µmax e Tg dos isolados calculados com base em suas curvas
de crescimento.
Isolado
R102A
R106A
R112A
R304A
R307A
R313A
Equação (Fase Exponencial)
y = 0,225x + 0,005
y = 0,079x + 0,044
y = 0,091x + 0,024
y = 0,087x + 0,027
y = 0,086x + 0,029
y = 0,091x + 0,012
Valores de R2
1,00
0,826
0,968
0,943
0,952
0,992
µmax (d-1)
0,225
0,079
0.091
0,087
0,086
0,091
Tg (d)
3,08
8,77
7.61
7,96
8,06
7,61
Assim, o isolado com o crescimento mais rápido é o R102A cujo Tg é 3,08 dias,
sendo que o isolado de crescimento mais lento é o R106A com o Tg de 8,77 dias. Os
outros isolados apresentaram tempos de geração variáveis.
4.9 Quantificação do Consumo de Sulfato e Produção de Sulfeto pelos
Isolados
Como dito anteriormente, para a determinação destes dados foram utilizadas curvas
padrões de sulfato e sulfeto que podem ser observadas nas FIGURAS 9-1 e 9-2,
respectivamente.
Assim, a FIGURA 4-12 mostra os resultados referentes às leituras de sulfato e
sulfeto de cada um dos isolados.
66
R102A
4,0
Sulfato
Sulfeto
3,5
200
2,0
100
1,5
500
400
3,0
Sulfeto (mg/L)
2,5
Sulfeto (mg/L)
300
3,0
600
Sulfato
Sulfeto
400
Sulfato (g/L)
3,5
Sulfato (g/L)
R106A
4,0
300
2,5
200
2,0
100
1,5
0
0
1,0
1,0
-2
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
-2
A
Tempo (Dias)
0
2
4
6
R112A
4,0
10
12
14
16
18
20
B
R304A
Sulfato
Sulfeto
3,5
8
Tempo (Dias)
500
4,0
400
3,5
Sulfato
Sulfeto
500
200
2,0
100
Sulfato (g/L)
2,5
1,5
3,0
300
2,5
200
2,0
100
1,5
0
0
1,0
1,0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
C
Tempo (Dias)
R307A
4,0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
D
Tempo (Dias)
300
Sulfato
Sulfeto
3,5
-2
R313A
4,0
400
Sulfato
Sulfeto
3,5
300
100
2,0
1,5
3,0
200
2,5
2,0
100
Sulfeto (mg/L)
2,5
Sulfeto (mg/L)
200
3,0
Sulfato (g/L)
-2
Sulfato (g/L)
Sulfeto (mg/L)
300
Sulfeto (mg/L)
Sulfato (g/L)
400
3,0
1,5
0
1,0
-2
0
2
4
6
8
10
12
Tempo (Dias)
14
16
18
20
0
E
1,0
-2
0
2
4
6
8
10
12
Tempo (Dias)
14
16
18
20
F
FIGURA 4-12: Valores das concentrações de sulfato e sulfeto acumulado dos isolados em crescimento
controlado.
Pela visualização da FIGURA 4-12 observa-se que o consumo de sulfato
determinado no isolado R304A (FIGURA 4-12 – D) foi mais acentuado em relação às
demais amostras, pois nota-se uma diminuição de 58,2% em relação às leituras inicial e
final do mesmo; sendo que o isolado R106A (FIGURA 4-12 – B) também conseguiu um
alto consumo de sulfato de 56,31% seguido pelos isolados R102A com 53,05% (FIGURA
4-12 – A), R313A com 50,45% (FIGURA 4-12 – F), R112A com 47,9% (FIGURA 4-12 –
C) e, por fim, pelo isolado R307A (FIGURA 4-12 – E) com a menor porcentagem de
consumo de 43,65%.
67
A relação sulfato consumido/sulfeto produzido por cada isolado pode ser conferida
na TABELA 4-7, a seguir.
TABELA 4-7: Relação entre o consumo de sulfato e a produção de sulfeto pelos isolados.
Isolado
R102A
R106A
R112A
R304A
R307A
R313A
Sulfato Consumido (mMol)
14,7
18,1
15,4
19,6
14,7
17,7
Sulfeto Produzido (mMol)
11,7
15,8
13,5
14
7,5
9,7
Relação
0,79
0,87
0,88
0,71
0,51
0,55
68
5
DISCUSSÃO
À semelhança do que já foi relatado por outros pesquisadores (CHEUNG e GU,
2003 e WIERINGA et al., 2000), na presente investigação foram isoladas das amostras de
sedimento linhagens bacterianas capazes de reduzir sulfato com diferentes perfis
metabólicos, como evidenciado nas FIGURAS 4-5 e 4-6, indicando, possivelmente,
diferentes espécies. Esta riqueza de grupos taxonômicos em um mesmo nicho indica a
provável interação metabólica destas espécies como relatado por Robertson et al. (2000).
A capacidade de reduzir o sulfato das linhagens isoladas indica que as mesmas
possuem potencial de uso na bioremediação de resíduos ricos em sulfato o que justifica a
continuação do seu estudo que é de grande valia pela abrangência em questões ambientais
tal como indicado por Huisman et al. (2006); Azabou et al. (2005); Cheung e Gu (2003);
Tebo e Obraztsova (1998), e Webb et al. (1998). Ainda sobre esta questão, os resultados
obtidos no presente trabalho referentes à utilização de diversos compostos como fontes de
carbono pelos isolados, a redução de sulfato na presença de tais compostos pelos mesmos,
assim como a sua capacidade de crescimento em diferentes pH’s, indicam que os isolados
podem ser usados nos mais diferentes tipos de resíduos, uma vez que, suas exigências
nutricionais e ambientais são muito variáveis podendo assim eliminar os mais diversos
contaminantes conforme evidenciado por Robertson et al. (2000). Além disso, o teste
referente à realização de desnitrificação mostrou uma interessante adaptação dos isolados,
pois, a desnitrificação é um importante processo realizado por várias bactérias do ambiente
sendo que, neste caso, indica outro possível aceptor final de elétrons além do sulfato.
Dentre os resultados dos testes realizados visando à classificação taxonômica dos
isolados, destaca-se que a maioria deles produziu gás apenas a partir de glicose ou lactose
como única fonte de carbono e nessa condição não ocorreu a redução do sulfato. Isso se
deve, provavelmente, a maior complexidade molecular da glicose e lactose em relação aos
demais substratos utilizados como fontes de carbono que foram acetato, lactato, etanol,
acetona, butirato e propionato facilitando, assim, preferencialmente a via fermentativa em
relação às vias usuais para a redução de sulfato. Entretanto, alguns isolados da amostra
R1A utilizaram lactose concomitantemente à redução de sulfato significando, assim, a
possível utilização de outras vias. Os isolados que apresentaram resultados negativos tanto
na redução de sulfato quanto na produção de gás para as diferentes fontes de carbono são,
provavelmente, incapazes de usá-las como doadores de elétrons e fonte de carbono. O fato
69
de nenhum teste ter apresentado a redução de sulfato ligada à produção de gás sugere que
nenhum dos isolados é capaz de oxidar completamente o seu substrato à CO2 por meio
desta via. Além dos substratos supracitados, o benzeno também foi testado como única
fonte de carbono, porém, nenhum isolado foi capaz de degradá-lo, a saber, pelo não
escurecimento do meio, mas isso já poderia ser esperado, considerando que alguns autores
demonstraram que a degradação bacteriana do benzeno por uma única espécie é rara, sendo
observada apenas pela interação de mais de uma espécie em consórcio conforme mostrado
por Robertson et al. (2000).
No presente trabalho, algumas linhagens, a semelhança de outras investigações
(WIERINGA et al., 2000), apresentaram atividade de catalase positiva ao se realizar o teste
em meio modificado de Postgate C indicando assim possível metabolismo oxidativo, o que
pode ser de grande valia em ambientes com nível alto de oxigênio como, por exemplo, as
camadas superficiais dos sedimentos. Também, a exemplo de outros trabalhos, a maioria
dos isolados foram capazes de realizar desnitrificação (MOURA et al., 1997), mostrando
assim a possibilidade de utilizar o nitrato, além do sulfato como aceptor final de elétrons,
na respiração anaeróbia. A presença deste tipo de metabolismo indica que estas bactérias
são capazes de mudar seu metabolismo, provavelmente, seguindo mudanças ambientais, ou
seja, o nitrato pode ser usado como aceptor de elétrons em ambientes onde o sulfato é
escasso. Dessa forma os referidos grupos taxonômicos mostram maior poder de adaptação
em diferentes nichos ecológicos e chance de participação em muitos ciclos naturais além
do ciclo do enxofre (CHEUNG E GU, 2003; LLOYD et al., 2001 e TEBO E
OBRAZTSOVA, 1998). A presença da enzima catalase apenas nos isolados da amostra
R1A mostra que, assim como a capacidade de esporulação comum das bactérias Gram
positivas, este grupo possui outras adaptações ambientais interessantes.
Para confirmação da morfologia e tamanho celular das linhagens isoladas a fim de
determinar de maneira mais segura a sua classificação taxonômica procedeu-se a
observação destas características em Microscopia Eletrônica de Varredura que oferece
maior poder de resolução e, portanto maior detalhamento de estruturas. A referida técnica
serviu também para comparar as dimensões celulares dos isolados com maior precisão do
que o previamente observado em microscopia ótica, informação esta importante na
confirmação da diversidade taxonômica dos isolados (GOLDSTEIN et al., 2003).
Quanto à identificação presuntiva dos isolados, as diversidades metabólicas e
morfológicas identificadas nos testes realizados indicaram que os isolados podem pertencer
a diferentes linhagens de bactérias. Sendo que os grupos taxonômicos presumidos foram
70
quatro gêneros, a saber, Desulfotomaculum, Desulfosporosinus, Desulfobulbus e
Desulfacinum. Dentre estes, Desulfotomaculum e Desulfosporosinus são alguns dos
gêneros mais citados na literatura, o que ocorre possivelmente pela sua ampla distribuição
explicada por maior estabilidade no ambiente devido a sua capacidade de esporulação
(STACKEBRANDT et al., 1997), além disso, é proposto para estes gêneros uma nova
divisão segundo técnicas moleculares (ROBERTSON et al., 2000 e STACKEBRANDT et
al., 1997). A elucidação da taxonomia desses grupos, bem como maior conhecimento de
seus processos metabólicos são fundamentais para o seu adequado manejo e aplicações
futuras, conforme preconizado por Cheung e Gu (2003).
Em relação à cinética dos isolados, pôde-se inferir o tempo de geração (Tg) de
todos e o isolado R102A apresentou um Tg menor em relação aos demais de 3,08 dias,
tendo chegado à valores próximos aos relatados por Silva (1999) de 2,47 dias. Os demais
isolados, no entanto tiveram tempos maiores em torno de 8 dias, sendo bem próximos aos
relatados por Galushko et al. (1999) de 7 dias, indicando assim que o isolado R102A
possui um crescimento mais acelerado o que também é evidenciado pelo seu decaimento
mais rápido quando observada a sua curva de crescimento (FIGURA 4-11 A).
Considerando as curvas de consumo de sulfato e produção de sulfeto, deve-se
salientar o fato de que, em todos os isolados incubados, a última leitura apresentou um pico
para as duas leituras (FIGURA 4-12). Este fato ocorreu porque, como as leituras das
amostras se apresentaram sem grandes modificações após um curto período de tempo, ou
seja, tanto o consumo de sulfato quanto a produção de sulfeto não apresentavam
modificações, tendendo assim a uma estabilidade, optou-se por adicionar mais lactato ao
meio para determinar se a fonte de energia das bactérias havia se esgotado. Isto foi feito
após a oitava leitura em todos os enriquecimentos e, como após este procedimento as
leituras voltaram a apresentar resultados positivos para o consumo de sulfato e produção de
sulfeto, pode-se afirmar que as análises não apresentavam variação de sulfato e sulfeto
devido ao fato das bactérias não possuírem uma fonte de carbono e doadores de elétrons
para suas biossínteses bloqueando assim o seu metabolismo.
Assim, levando-se em consideração que a quantidade de lactato de sódio presente
no meio no início do experimento era de 8g/L e que a de sulfato era em média de 3,27g/L,
a média da concentração de sulfato presente no meio quando as bactérias pararam a sua
biossíntese indica quanto do mesmo foi utilizado em função do lactato de sódio disponível.
Como a concentração de sulfato média dos meios neste período estacionário foi de
2,60g/L, pode-se inferir que em cada litro de meio de cultivo as bactérias utilizaram 8g de
71
lactato de sódio para reduzir 0,67g de sulfato a sulfeto, ou seja, 70mM de lactato foi
utilizado na redução de 7mM de sulfato. O único resultado que foi discrepante ocorreu no
isolado R106A onde a cultura atingiu estabilidade quando a concentração de sulfato no
meio chegou em média à 1,86g/L, mas como a concentração de lactato de sódio no meio
era a mesma, pode-se inferir que este isolado utiliza, para cada litro de meio, a mesma
quantidade de lactato que os outros para consumir uma maior quantia de sulfato, ou seja,
para cada 8g de lactato de sódio utilizados há um consumo de 1,41g de sulfato, o que em
mols seria 70mM de lactato utilizado para cada 15mM de sulfato consumido. Assim, o
isolado R106A se mostrou com melhor relação entre o substrato consumido e o sulfato
utilizado.
Tais dados não são correspondentes ao indicado na TABELA 2-1, derivada do
trabalho de Liamleam e Annachhatre (2007), que relata a utilização de 2M de lactato para
o consumo de 1M de sulfato pelas BRS, o que pode indicar que os isolados possivelmente
consomem o lactato seguindo outro tipo de reação estequiométrica. Ainda em relação aos
dados da TABELA 2-1, pode-se notar que o formiato apresenta o menor rendimento de
redução de sulfato em função da quantidade de substrato consumido, tendo o butirato, em
contrapartida, demonstrado a melhor relação, assim, mesmo que o lactato tenha sido
escolhido para o teste, por ser de fácil obtenção, deve-se observar que não apenas este
fator, mas também o preço e rendimento do substrato devem ser levados em conta para a
realização do experimento.
Em se tratando da relação consumo de sulfato/produção de sulfeto pelos isolados
pôde-se observar que nenhum deles demonstrou a relação citada por Postgate (1979) que
relata o consumo de 1M de sulfato para cada 1M de sulfeto produzido. No entanto os
isolados R106A e R112A se aproximaram muito desta relação (TABELA 4-7), sendo que
os isolados R102A e R304A também obtiveram valores relativamente próximos. Os
resultados mais discrepantes em relação à literatura citada foram encontrados nos isolados
R307A e R313A, que apresentaram o consumo de praticamente 2M de sulfato para cada
1M de sulfeto produzido. Tal fato pode ter ocorrido pelos seguintes motivos:
•
O sulfeto produzido pode ter se desprendido de forma mais ativa para o headspace dos
frascos, fazendo assim com que a análise do sulfeto dissolvido não demonstrasse a
totalidade do sulfeto presente no sistema já que análises da atmosfera dos frascos não
foram realizadas;
72
•
Os isolados podem ter usado o sulfeto para biossínteses ou mesmo armazená-lo em
forma de outros óxidos de enxofre que, por sua vez, não seriam detectados pelas
técnicas empregadas para o sulfeto e sulfato.
No entanto, levando em consideração a produção de sulfeto como uma
característica importante para que as BRS participem de processos de imobilização de
metais, os isolados R106A e R112A seriam os mais indicados por apresentarem uma
produção de sulfeto mais eficiente em relação ao sulfato consumido.
Os testes de identificação molecular dos isolados revelaram considerável
proximidade dos mesmos com vários grupos de bactérias tanto cultiváveis quanto nãocultiváveis (QUADRO 4-10), porém, os mesmos não corresponderam aos grupos
usualmente identificados como redutores de sulfato, uma vez que nota-se uma grande
proximidade com alguns grupos de bactérias da família Enterobacteriaceae, como
Enterobacter e Pantoea.
Embora não haja muitos estudos em relação à redução de sulfato por membros da
família Enterobacteriaceae, sabe-se que representantes desta família já foram identificados
como capazes de realizar o metabolismo de redução de sulfato (QIU et al., 2008 e
SAHRANI et al., 2008), e como o grupo das BRS é polifilético, fazendo parte do mesmo
representantes de diferentes famílias do domínio Bacteria; além de algumas do domínio
Archaea (FIGURA 2-1) é possível que representantes ainda não catalogados de grupos
distintos também possuam a capacidade metabólica de reduzir o sulfato à sulfeto.
É valido acrescentar que, devido ao metabolismo de grande parte dos representantes
da família Enterobacteriaceae ser anaeróbio facultativo, os enriquecimentos utilizados no
trabalho não seriam capazes excluí-los, contanto que fossem capazes de realizar o
metabolismo de redução de sulfato. Além disso, representantes do gênero Enterobacter, já
foram relatados como capazes de utilizar o lactato como fonte de carbono, ou mesmo o
citrato (GRIMONT e GRIMONT, 2006), que estavam entre os testes de caracterização
bioquímica realizados. Outra questão importante é a taxonomia deste gênero que é
considerada como altamente heterogênea ao se considerar outros representantes da família
Enterobacteriaceae (GRIMONT e GRIMONT, 2006) sendo inclusive as espécies do
gênero Pantoea, outro identificado como de grande proximidade com os isolados e que
possui várias espécies endofíticas, até pouco tempo identificadas como pertencentes ao
gênero Enterobacter (JANDA, 2006).
73
Já em relação aos isolados R106A e R112A, que mesmo sendo identificados como
bactérias Gram positivas, foram também classificados como similares às espécies da
família Enterobacteriaceae pela análise molecular, deve-se observar que no mesmo
experimento também foram observadas semelhanças entre eles e isolados não cultiváveis
registrados em outros trabalhos com amostras ambientais (QUADRO 4-10), assim há a
possibilidade destes isolados pertencerem a grupos ainda não descritos de BRS, ou mesmo
serem representantes cultiváveis destes grupos já identificados, devendo ser realizados
estudos mais aprofundados para esclarecer tais dúvidas.
É importante observar que, mesmo os isolados não sendo identificados como
pertencentes a grupos já descritos de BRS, diferentemente do indicado pelos testes
bioquímicos, os mesmos apresentaram visível capacidade de redução de sulfato,
evidenciada principalmente nos testes de cinética, sendo capazes de consumir sulfato e
precipitar metais na forma de sulfetos; características que, somadas a sua diversidade
metabólica e capacidade de precipitar metais em diferentes pHs, os capacitam como de
possível uso em processos ambientais de biorremediação e imobilização de metais.
74
6
CONCLUSÕES
O trabalho executado conduziu às seguintes conclusões:
1. O isolamento de culturas puras de bactérias com capacidade de reduzir sulfato
produzindo sulfeto foi bem sucedida, demonstrando que a metodologia utilizada foi
apropriada para as amostras de sedimento coletadas;
2. As metodologias realizadas visando à comprovação da presença de metabolismo de
redução de nitrato, assim como a presença de catalase, se mostraram muito eficientes, e
comprovaram que os isolados são capazes de se adaptar a certas condições adversas do
ambiente, sendo capazes de utilizar outros compostos como aceptores de elétrons e resistir
a certos níveis de oxigenação do meio;
3. Os testes metabólicos e morfológicos realizados mostraram considerável diversidade
de entre os isolados possibilitando indicar possíveis gêneros de alguns isolados baseado
nas características de grupos conhecidos de bactérias com capacidade de redução de
sulfato, tais como Desulfotomaculum, Desulfosporosinus, Desulfobulbus e Desulfacinum;
4. A variedade de substratos utilizáveis como também de vias metabólicas possíveis pelas
linhagens isoladas demonstram uma grande gama de possíveis ambientes onde estas
bactérias podem viver e os tipos de compostos que podem utilizar, podendo ser úteis em
processos de biorremediação;
5. O procedimento para escolha dos isolados bacterianos, os quais seriam utilizados nos
testes de cinética, proporcionou uma visão das capacidades de redução de sulfato e
crescimento em diferentes condições de pH do ambiente;
6. O experimento visando determinar o tempo de geração dos isolados, possibilitou inferir
a velocidade de crescimento dos mesmos;
7. Os experimentos para determinação da produção de sulfeto e concomitante consumo de
sulfato se mostraram eficientes para os isolados pesquisados, já que se pode acompanhar as
variações de concentração destes dois compostos durante todo o tempo de incubação;
75
8. Os isolados R106A e R112A apresentaram melhor relação entre as taxas de consumo
de sulfato e produção de sulfeto o que pode torná-los de grande valia para processos de
biorremediação e imobilização de metais;
9. Mesmo não apresentando correspondência dos isolados aos grupos usualmente
identificados como redutores de sulfato, as técnicas moleculares utilizadas foram capazes
de indicar a proximidade taxonômica dos mesmos com outros grupos já descritos.
76
7
PERSPECTIVAS
Considerando a potencial aplicabilidade dos grupos isolados no presente trabalho
considera-se relevante o seu prosseguimento quanto à melhor elucidação da sua taxonomia
pela utilização de técnicas de biologia molecular para futura criação de uma biblioteca
gênica para melhor estudar os processos envolvidos no metabolismo da redução do sulfato.
Além disso, tendo sido elucidados alguns aspectos de sua fisiologia, utilizá-los em testes
de biorremediação e imobilização de metais em condições práticas como biorreatores ou
barragens de contenção podem ser de grande valia para questões ambientais.
77
8
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85
9
ANEXOS
ANEXO 1: Método para dosagem de sulfato.
A determinação do sulfato foi Realizada pelo método turbidimétrico descrito por
Clesceri et al. (1999), no qul o íon sulfato é precipitado em um meio de ácido acético com
cloreto de bário (BaCl2) formando cristais de sulfato de bário. A concentração mínima
detectável é de aproximadamente 1mg/L. A absorbância da suspensão é lida em
turbidímetro ou espectrofotômetro (420nm) e a concentração determinada pela comparação
da leitura com a curva padrão com sulfato de sódio (FIGURA 9-1). O procedimento
utilizado para a dosagem de sulfato está descrito abaixo:
•
Mediu-se 100mL da amostra diluída 100x e transferiu-se este volume para um
erlenmeyer;
•
Adicionou-se 20mL da solução Tampão A (TABELA 9-1) e agitou-se;
•
Adicionou-se 0,26g de cloreto de bário e agitou-se em velocidade constante por 1
minuto;
•
O branco foi realizado com a amostra acrescida da solução tampão, sem a adição do
cloreto de bário;
•
Mediu-se a turbidez.
TABELA 9-1: Solução Tampão A para dosagem de sulfato, segundo Clesceri et al. (1999).
Solução Tampão A
30,0g Cloreto de magnésio (MgCl2.6H2O)
5,0g Acetato de sódio (CH3COONa.3H2O)
1,0g Nitrato de potássio (KNO3)
20,0mL Ácido acético (CH3COOH)
Completar o volume para 1000mL com água destilada
86
C u rva P ad rão d e S u lfato
45
40
Concentração (mg/L)
35
30
25
20
15
y = 0,378x + 2,85
2
R = 0,994
10
5
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
T urbidez (N T U )
FIGURA 9-1: Curva padrão de sulfato.
ANEXO 2: Método para dosagem de sulfeto total
Para o acompanhamento da produção de sulfeto foi utilizado o método descrito por
Clesceri et al. (1999). A concentração de sulfeto detectada por este método situa-se entre 0
e 1,5mM. A concentração é obtida através de curva padrão com sulfeto de sódio (FIGURA
9-2: Curva padrão de sulfeto.FIGURA 9-2). Cuidados para evitar perdas devem ser tomados,
como manter os tubos sempre fechados e utilizar água desoxigenada (fervida e resfriada).
Segue abaixo os procedimento para a dosagem de sulfeto:
•
Distribuiu-se um volume de 200µL da amostra em tubos com rolha de borracha
herméticos; água Milli-Q desoxigenada substituiu a amostra para o branco;
•
Adicionou-se um volume de 10mL da solução de acetato de zinco a 0,01M, 1mL da
solução dimetil-p-fenilenodiamina (DMPD) e 70µL da solução de sulfato férrico
amoniacal (todas as soluções descritas na TABELA 9-2);
•
Após o período de reação de 20 minutos, mediu-se a absorbância em filtro de cor
laranja (663nm).
87
TABELA 9-2: Soluções para dosagem de sulfeto total, segundo Clesceri et al. (1999).
Solução de Acetato de Zinco 0,01M
20g de acetato de zinco dihidratado
0,2mL de ácido acético P.A.
1000mL de água Milli-Q desoxigenada
Obs.: Armazenar sob refrigeração
Solução de sulfato férrico
2ml de ácido sulfúrico P.A. (gota a gota) em 50ml de água Milli-Q desoxigenada
10g de sulfato férrico amoniacal Fe(NH4).(SO4)2.12H2O
Completar o volume para 100mL com água Milli-Q desoxigenada
Obs.: Armazenar no escuro sob refrigeração
Solução de dimetil-p-fenilenodiamina (DMPD)
0,5g de DMPD em 50ml de água desoxigenada sob banho de gelo
50mL de ácido sulfúrico (96%) gota a gota
Completar o volume com água desoxigenada para 250mL
Obs.: Armazenar no escuro sob refrigeração por 30 dias
C u rv a P ad rã o d e S u lfeto
225
200
Concentração (mg/L)
175
150
125
100
75
y = 2 09 ,23 7x - 0 ,38 7
2
R = 0,9 98
50
25
0
0 ,0
0 ,1
0 ,2
0 ,3
0 ,4
0 ,5
0 ,6
0 ,7
0 ,8
0 ,9
1 ,0
1 ,1
A bso rb ância
FIGURA 9-2: Curva padrão de sulfeto.
88