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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CARATINA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS GENÉTICOS VEGETAIS CONSERVAÇÃO E DINÂMICA DA DIVERSIDADE GENÉTICA DE Butia eriospatha (MARTIUS EX DRUDE) BECCARI (ARECACEAE): UMA ESPÉCIE DA FLORA BRASILEIRA AMEAÇADA DE EXTINÇÃO Alison Gonçalves Nazareno Orientador: Dr. Maurício Sedrez dos Reis Florianópolis, SC 2010 ÍNDICE GERAL SUMÁRIO EXECUTIVO............................................................................................................... 3 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................................ 4 2. JUSTIFICATIVA......................................................................................................................... 8 3. HIPÓTESES ................................................................................................................................. 9 4. OBJETIVOS ............................................................................................................................... 11 4.1 Objetivo geral.........................................................................................................................11 4.2 Objetivos específicos .............................................................................................................11 5. MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................................... 13 5.1 Áreas de estudo ......................................................................................................................13 5.2 Estudos genéticos...................................................................................................................13 5.2.1 Extração de DNA .............................................................................................................14 5.2.2 Desenvolvimento de marcadores microssatélites...........................................................15 5.2.2.1 Banco enriquecido em microssatélites .....................................................................15 5.2.2.2 Seqüenciamento .........................................................................................................16 5.2.2.3 Identificação dos marcadores....................................................................................16 5.2.2.4 Alinhamento...............................................................................................................16 5.2.2.5 Desenho dos iniciadores............................................................................................16 5.2.3 Marcadores cpDNA..........................................................................................................17 5.2.4 Amplificação e eletroforese do DNA nuclear ................................................................19 5.2.5 Amplificação e eletroforese de cpDNA ..........................................................................19 5.2.6 Análises genéticas ............................................................................................................20 5.2.6.1 Locos SSR nuclear ....................................................................................................20 5.2.6.1.1 Análise da herança e análise de desequilíbrio de ligação ................................20 5.2.6.1.2 Análise da diversidade e estrutura genética, endogamia, parentesco, tamanho efetivo e equilíbrio de Hardy-Weinberg ...........................................................................21 5.2.6.1.3 Análise da distribuição espacial dos genótipos ................................................22 5.2.6.1.4 Sistema reprodutivo............................................................................................23 5.2.6.1.5 Fluxo gênico histórico ........................................................................................24 5.2.6.1.6 Fluxo gênico contemporâneo.............................................................................24 5.2.6.2 Locos cpSSR..............................................................................................................25 5.2.6.2.1 Teste da herança do cloroplasto.........................................................................25 5.2.6.2.1 Diversidade genética e análise da distribuição espacial dos genótipos...........26 5.2.6.2.2 Estrutura genética e fluxo gênico histórico.......................................................27 5.2.6.2.4 Fluxo gênico contemporâneo .............................................................................28 5.3 Demografia .............................................................................................................................28 5.4 Fenologia reprodutiva ..........................................................................................................29 6. RESULTADOS ESPERADOS................................................................................................. 30 7. PLANO DE TRABALHO......................................................................................................... 31 8. CRONOGRAMA DE EXECUÇÃO DAS ATIVIDADES ................................................... 32 9. ORÇAMENTO ........................................................................................................................... 33 10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 34 2 SUMÁRIO EXECUTIVO Em vista das atuais taxas de destruição e perda de habitats florestais, populações vegetais estão experimentando contrações em seus tamanhos populacionais e algumas espécies podem ser mais susceptíveis a estocasticidade demográfica e genética que outras. Butia eriospatha (Martius ex Drude) Beccari (Arecaceae) é uma espécie nativa do sul do Brasil que se encontra sob ameaça de extinção devido à exploração insustentável, à presença do gado nas áreas de ocorrência, à degradação e redução de seus ambientes naturais, resultando em declínio populacional. Os efeitos genéticos associados à redução do tamanho populacional são, primordialmente, a restrição no fluxo gênico, à deriva genética e o endocruzamento, o que geralmente resulta na diminuição da diversidade genética. Informações quanto ao grau de organização e dinâmica da variabilidade genética em populações, bem como o entendimento da demografia e biologia reprodutiva das espécies são fundamentais para o delineamento de estratégias de conservação. Neste contexto, o objetivo do trabalho é fornecer informações que possam ser utilizadas para a conservação e manutenção da diversidade genética de B. eriospatha. Com base em análises de DNA nuclear e cpDNA, o presente trabalho avaliará (1) a diversidade genética, (2) a estrutura genética espacial, (3) o fluxo gênico contemporâneo e histórico e, (4) o sistema reprodutivo de populações naturais de B. eriospatha. Para investigar sobre a demografia e biologia reprodutiva, populações de B. eriospatha serão monitoradas no decorrer de dois eventos reprodutivos. Os resultados obtidos permitirão compreender o cenário evolutivo da espécie e será base para o estabelecimento de estratégias efetivas para a conservação desta e de outras espécies ecologicamente relacionadas. Palavras-chave: cpDNA; demografia; diversidade genética; microssatélites; sistema reprodutivo 3 1. INTRODUÇÃO A conservação dos recursos genéticos florestais tem se tornado prioridade, principalmente, pelos impactos negativos na funcionalidade e composição dos ecossistemas ocasionados pelo aumento da população humana e de suas atividades econômicas (Laurance et al., 2006). No Brasil, cerca de 1,7 milhões de hectares de florestas são perdidos anualmente (Wright, 2005). A degradação e a redução de habitat resultando em remanescentes florestais menores e isolados representam uma séria ameaça à biodiversidade (Young et al., 1996). Em vista das atuais taxas de destruição e perda das florestas tropicais, as populações vegetais estão experimentando contrações em seus tamanhos populacionais e algumas espécies podem ser mais afetadas pela estocasticidade demográfica e deriva genética do que outras (Dick et al., 2008). Padrões alterados de fluxo gênico e estrutura genética têm implicações para o sistema reprodutivo, níveis de endogamia e para a manutenção da diversidade genética. Hamrick (2004) argumentou que em função da extensão do fluxo gênico, do ciclo de vida e da diversidade genética, árvores podem ser menos vulneráveis as mudanças antrópicas do que outros organismos. No entanto, isto pode não se aplicar as espécies da flora tropical que são, em geral, dependentes de animais para se reproduzirem e dispersarem (Pacheco & Simonetti, 2000; Wang et al., 2007). A importância do fluxo gênico está em contrapor os efeitos da deriva genética, podendo ser quantificado através de medidas indiretas e diretas. Os métodos indiretos estimam o fluxo gênico histórico e baseiam-se na distribuição da diversidade genética entre populações (Hamrick & Nason, 2000). Segundo Reis (1996) os métodos indiretos fundamentam-se na relação entre a taxa de migração e a divergência entre populações, indicando uma relação inversa entre a divergência e a migração. Os métodos diretos 4 estimam o fluxo gênico contemporâneo e são baseados em observações no movimento dos vetores de pólen e sementes, na marcação do pólen e sementes, ou na identificação de alelos ou genótipos migrantes, fazendo o uso de corantes, marcadores morfológicos e análise de paternidade. Um dos métodos mais robustos para o estudo de fluxo gênico contemporâneo consiste na realização de testes de paternidade usando marcadores altamente informativos como os microssatélites (Gaiotto et al., 2003). Os microssatélites (Seqüências Simples Repetidas - SSR) são marcadores ideais para estudos genéticos em plantas por possuírem uma série de características desejáveis como: distribuição ao acaso e ocorrência em grande quantidade em genomas de eucariotos; codominância dos alelos; facilidade de detecção via PCR e alta diversidade alélica (Chase et al., 1996; Dayanandan et al., 1997; Rossetto et al., 1999). A determinação do fluxo gênico contemporâneo, no entanto, pode ser mais acurada pela incorporação de dados sobre o genoma de organelas citoplasmáticas, como o DNA de mitocôndria (mtDNA) ou de cloroplasto (cpDNA) (Cain et al., 2001). O DNA do cloroplasto é uma molécula peculiar por apresentar herança uniparental (geralmente materna em angiospermas e paterna em gimnospermas), ausência de recombinação e conteúdo gênico conservado (Moritz et al., 1987). Por apresentar herança uniparental, o cpDNA é uma ferramenta atrativa em estudos genéticos, pois, permite elucidar as contribuições relativas do fluxo de sementes e pólen na estrutura genética de populações naturais pela comparação de marcadores nuclear e de cloroplasto (Provan et al., 2001). Muitos estudos têm investigado o fluxo de pólen (via indireta) por ser mais fácil de ser detectado (Sork et al., 1999; Smouse & Sork, 2004) e pelo fato desse fluxo apresentar, freqüentemente, uma maior escala espacial do que a dispersão de sementes (Ennos, 1994). Alguns estudos têm demonstrado que o fluxo gênico aumenta entre paisagens fragmentadas, como foi detectado para espécies de Ficus, que apresentam 5 sistema de polinização especializado (Nason & Hamrick, 1997; Nazareno, 2006), e para Dinizia excelsa, onde a fragmentação de habitat acarretou em mudanças na composição e no comportamento de seus polinizadores (Dick et al., 2003). Em contraste, outros estudos têm observado que a fragmentação pode aumentar a endogamia e, ou reduzir o fluxo gênico entre indivíduos em remanescentes florestais (Rocha & Aguilar, 2001; Lowe et al., 2005). Em todos estes casos, a ação antrópica tem causado mudanças nos padrões de fluxo gênico contemporâneo que, no futuro, podem influenciar a estrutura genética das populações. Butia eriospatha (Martius ex Drude) Beccari (Arecaceae) é uma espécie nativa do sul do Brasil, sob grande pressão antrópica, que se encontra sobre ameaça de extinção (Port.37N-IBAMA 1992, 2008) devido à exploração insustentável, à presença do gado nas áreas de ocorrência e, à degradação e redução de seus ambientes naturais. Butia eriospatha (Figura 1), popularmente conhecido como butiá-da-serra, é uma espécie nativa da América do Sul que ocorre no sul do Brasil em zonas de campos no Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do (Reitz, 1974). De acordo com Reitz (1974) e Henderson et al. (1995), B. eriospatha caracteriza-se por apresentar estipe ereto, com 3 a 6 metros de altura e diâmetro de aproximadamente 50 cm. As frondes são pinadas, azulesverdeadas, apresentando 1 metro ou mais de comprimento, e os pecíolos munidos de dentes ou espinhos relativamente fracos ou estreitos (Reitz, 1974). As inflorescências são densamente ramificadas, com flores masculinas e femininas. Os frutos são globosos, com mesocarpo carnoso e adocicado, amarelos, contendo de 1-3 sementes. Os frutos maduros podem ser consumidos in natura ou usados na elaboração de sucos, geléias e bebidas alcoólicas (Mentz et al., 1997). Da semente, extrai-se um tipo de azeite comestível. Seu estipe é usado em construções rústicas e as fibras das frondes, para 6 Figura 1. Indivíduo reprodutivo de Butia eriospatha (Martius ex Drude) Beccari. 7 fabricação de chapéus, cestos, cordas e enchimentos de colchões e estofados (Reitz et al., 1978). A espécie é muito cultivada no paisagismo, inclusive no mercado internacional de plantas ornamentais (Fischer, 2007). Espécies vulneráveis de extinção, como B. eriospatha, necessitam de ações mitigadoras para sua conservação. Estudos de genética molecular têm se tornado parte integrante de diversos estudos de conservação. Informações quanto ao grau de organização e dinâmica da variabilidade genética em populações, bem como o entendimento da demografia e biologia reprodutiva das espécies são fundamentais para o delineamento de estratégias de conservação. No entanto, há carência de trabalhos científicos que investiguem a biologia de B. eriospatha. Portanto, para que um programa efetivo de conservação seja estabelecido para B. eriospatha, o entendimento do grau e organização genética, dos padrões espaciais de fluxo gênico, do sistema reprodutivo e da estrutura demográfica é fundamental para a tomada de ações efetivas que permitam a continuidade do processo evolutivo da espécie. 2. JUSTIFICATIVA Populações naturais do Butia eriospatha estão sofrendo as conseqüências da perda de habitats e de atividades antrópicas relacionadas ao uso da terra, especialmente em função da monocultura e da pecuária. O pastoreio nas populações de Butia spp. vem agravando o processo de redução da regeneração natural (Chebataroff, 1971; Cardoso, 1995; Azambuja, 2009). Devido a isso, 43% de todas as espécies do gênero Butia (B. capitata, B. purpurascens e B. eriospatha) estão sob a ameaça de extinção (IUCN, 2009; IBAMA, 2008; Rio Grande do Sul, 2002). De acordo com os critérios da Lista Vermelha da IUCN, B. eriospatha está vulnerável `a extinção (Noblick, 1998). Embora 8 pouco se conheça sobre a ecologia da espécie, existe um consenso de que as populações selvagens de B. eriospatha estão em declínio, e a taxa de recrutamento de indivíduos reprodutivos das populações parece ser nula. Como outras espécies do gênero Butia, os indivíduos de B. eriospatha apresentam distribuição espacial agregada, às vezes densa e extensa, na forma de “populaçõesilhas” conhecidas como butiazais. A maioria dos butiazais ocorre em áreas de Campos de Altitude (um subtipo do Domínio da Mata Atlântica), que vêem sendo progressivamente transformadas ou degradadas por atividades relacionadas ao uso do solo (Bilenca & Miñarro, 2004; Pillar, 2006). Em comparação com as florestas, a conservação dos Campos de Altitude tem sido negligenciada pelas leis ambientais, havendo poucas unidades de conservação que os contemplam (Ministério do Meio Ambiente, 2002; Oliveira 2002). Haja vista a realidade de conservação dos Campos de Altitude, o risco de extinção de B. eriospatha aumenta, sendo necessárias estratégias eficazes de conservação para a espécie. No entanto, para a definição de estratégias de conservação são imprescindíveis estudos genéticos, demográficos e biológicos, em nível populacional, das espécies que compõem tais ecossistemas. Dessa forma, por meio deste trabalho subsídios consistentes poderão ser obtidos para definir estratégias de conservação de B. eriospatha. 3. HIPÓTESES 1) Por ocorrer na forma de “populações-ilhas” - i.e., butiazais - Butia eriospatha deve apresentar baixo nível de diversidade genética dentro das populações e alta 9 diferenciação interpopulacional em função do fluxo gênico restrito decorrente do isolamento produzido pela paisagem; 2) Devido à dispersão de sementes nas vizinhanças de árvores-matrizes, deve haver uma estruturação genética espacial a curta distância em decorrência de arvores próximas serem geneticamente relacionadas por ancestral comum; 3) O nível e a distribuição espacial da diversidade genética atual das populações de Butia eriospatha deve ser em decorrência do seu processo de dispersão estar associado a ocupação humana; 4) Para as “populações-ilhas” pequenas, o parentesco entre os indivíduos de Butia eriospatha dentro de progênies deve ser maior que o esperado em “populações-ilhas” maiores; 5) O sistema reprodutivo e o fluxo gênico nas populações de Butia eriospatha devem ser alterados pelo tamanho efetivo populacional e, devem variar no tempo em detrimento de fatores estocásticos (e.g., disponibilidade de recursos florais e polinizadores); 6) Butia eriospatha apresenta cpDNA de herança materna e sua taxa de migração deve ser menor que a de genes nucleares, uma vez que se dispersam apenas nas sementes; 7) Análises com marcadores cpDNA devem indicar estrutura genética populacional em Butia eriospatha mais forte que as com marcadores nucleares em função das diferenças 10 do tamanho efetivo populacional; mesmo se as taxas de fluxo de pólen e sementes forem iguais; 8) Em decorrência de pressões antrópicas (e.g., presença do gado, extrativismo de frutos e de indivíduos reprodutivos), as populações de Butia eriospatha devem apresentar uma estrutura demográfica sem a presença de coortes jovens; 9) Como outras espécies do gênero, Butia eriospatha deve apresentar mecanismos (e.g., dicogamia) que evitam a auto-fecundação. 4. OBJETIVOS 4.1 Objetivo geral Estabelecer estratégias de conservação a partir de informações da organização e distribuição da variabilidade genética, da biologia reprodutiva e da dinâmica populacional de Butia eriospatha. 4.2 Objetivos específicos (1) Desenvolver marcadores microssatélites (SSR nuclear) e padronizar marcadores cpDNA para estudos populacionais de Butia eriospatha; (2) Descrever os níveis de diversidade genética em populações naturais de Butia eriospatha; 11 (3) Caracterizar a diversidade genética interpopulacional de Butia eriospatha por marcadores nucleares e cloroplastidiais; (4) Investigar a existência de estruturação genética matrilinear, i.e., com base no genoma de herança materna, em populações de Butia eriospatha; (5) Estimar a contribuição relativa da migração de pólen e sementes na definição da estrutura genética de Butia eriospatha por meio de análise comparativa de marcadores nucleares e cloroplastidiais; (6) Estimar o fluxo gênico histórico e contemporâneo em populações de Butia eriospatha; (7) Estimar parâmetros do sistema de reprodução como taxas de cruzamento, autofecundação, endogamia biparental e cruzamentos correlacionados em populações naturais de Butia eriospatha; (8) Avaliar a estrutura demográfica de populações naturais de Butia eriospatha; (9) Avaliar o padrão reprodutivo de Butia eriospatha; (10) Propor estratégias de conservação com base em indicadores genéticos e ecológicos de Butia eriospatha 12 5. MATERIAL E MÉTODOS 5.1 Áreas de estudo Quinze populações naturais de Butia eriospatha, localizadas no Estado de Santa Catarina, serão selecionadas para os estudos de genética, estrutura demográfica e padrão reprodutivo. As populações serão escolhidas em função do tamanho e do grau de isolamento na paisagem. 5.2 Estudos genéticos Para caracterizar a diversidade, a estrutura genética e estimar o fluxo gênico histórico de Butia eriospatha serão coletados um mínimo de 50 indivíduos reprodutivos das 15 populações de B. eriospatha selecionadas. Todos os indivíduos coletados serão marcados com placa de alumínio numerada e sua posição geográfica registrada com auxilio de GPS (GPSmap 76 CSx). As frondes dos indivíduos de B. eriospatha serão coletadas e armazenadas em deep freezer até o momento de extração do DNA. Para os estudos de fluxo gênico contemporâneo via pólen e do sistema reprodutivo de Butia eriospatha serão analisados, por dois eventos reprodutivos consecutivos, todos os indivíduos reprodutivos oriundos de duas populações diferenciadas pelo tamanho populacional (população A formada por mais de 500 indivíduos reprodutivos e, população B formada por menos de 50 indivíduos reprodutivos). Todos os indivíduos serão marcados com placa de alumínio numerada e georreferenciados utilizando o sistema de posicionamento global (GPS). Nessas populações, as frondes de todos os indivíduos serão coletadas para extração de DNA. Sementes de vinte indivíduos 13 reprodutivos (matrizes) escolhidos aleatoriamente, nas populações A e B, serão coletadas. As sementes serão identificadas por matriz, plantadas e, após germinação, realizar-se-á a extração de DNA foliar de 20 plântulas por matriz. Utilizando marcadores nucleares (SSR) será possível determinar (1) a taxa de cruzamento, (2) a endogamia biparental, (3) a correlação de paternidade (4) a taxa de auto-fecundação, (5) a taxa de imigração de pólen, (6) a distância física entre as efetivas árvores polinizadoras e as árvores maternas, (7) o tamanho da vizinhança reprodutiva (número de doadores de pólen), e a (8) área de vizinhança efetiva de polinização. Além disso, verificar-se-á se o sistema reprodutivo e o fluxo gênico de B. eriospatha são alterados em função do tempo e do tamanho populacional. Para estudar o fluxo gênico contemporâneo via sementes, serão coletados tecidos foliares de todos os indivíduos reprodutivos e cerca de 150 regenerantes das populações A e B. A contribuição da dispersão de sementes na definição da estrutura genética de Butia eriospatha será avaliada nas 15 populações estudadas, com um número de indivíduos por população não excendo a 50. Com base na análise de cpDNA será possível verificar a existência de estruturação genética matrilinear nas populações de B. eriospatha. Além disso, com base na comparação de polimorfismos nucleares e cloroplastidiais será possível fazer inferências sobre o passado evolutivo da espécie, e definir se o nível e a distribuição espacial da diversidade genética observada atualmente representam um processo recente ou se são característicos da espécie em longo prazo. 5.2.1 Extração de DNA As condições da extração de DNA das amostras foliares serão efetuadas com base na metodologia de Doyle e Doyle (1990) modificada por Alzate-Marin et al. (2005). 14 5.2.2 Desenvolvimento de marcadores microssatélites Para a realização desta etapa será necessário extrair o DNA das folhas de um único indivíduo de Butia eriospatha, que será coletado na área de estudo. A seguir, serão descritas sucintamente as etapas necessárias para construção da biblioteca enriquecida em SSR para a espécie B. eriospatha. 5.2.2.1 Banco enriquecido em microssatélites Inicialmente, o DNA de Butia eriospatha será extraído e quantificado (~5 µg). Subseqüentemente, será realizada a digestão do DNA com uma enzima de restrição de corte freqüente (RsaI, Invitrogen) de forma que sejam obtidos fragmentos entre 300 e 600 pb. Em seguida, os fragmentos obtidos serão ligados à adaptadores com seqüências conhecidas de 21 e 25 pb (Rsa21 - 5´CTCTTGCTTACGCGTGGACTA3´ e Rsa25 5’TAGTCCACGCGTAAGCAAGAGCACA3’) e uma pré-amplificação usando como primer o oligonucleotídeo Rsa21 será realizada. O produto de amplificação será purificado (Quiaquick PCR Purification Kit, Quiagen) e submetido ao passo de enriquecimento da biblioteca para fragmentos contendo microssatélites: por meio da hibridização com os oligonucleotídeos biotinilados (GT)8 e (CT)8 . Esses fragmentos serão recuperados pela ligação entre as moléculas de biotina e as moléculas de streptavidina associadas com partículas magnéticas (Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles, Promega). Os fragmentos selecionados serão então amplificados novamente usando o oligonucleotídeo Rsa21, e posteriormente, serão ligados à um vetor de clonagem (pGEM-T Vector System, Promega). Essa construção será utilizada para transformar células competentes de E. coli XL1-Blue de acordo com a metodologia de 15 Avi Levy (1991). As colônias recombinantes serão selecionadas para resistência ao antibiótico ampicilina e pelo sistema branco-azul, transferidas para placas ELISA e mantidas em culturas gliceroladas com meio 2YT-HMFM à -80 °C. 5.2.2.2 Seqüenciamento Após a construção do banco com fragmentos enriquecidos em microssatélites será realizada a etapa de seqüenciamento dos clones. Para tanto, será isolado o DNA plasmidial de cada um dos clones por meio da metodologia de lise alcalina. A obtenção das seqüências será realizada com o kit DYEnamic TM ET dye terminator (GE Healthcare) no seqüenciador automático MegaBACE TM 1000. 5.2.2.3 Identificação dos marcadores Para identificação dos microssatélites dentro das seqüências obtidas será utilizada a ferramenta de busca Webtroll disponível na página <http://wsmartins.net/websat/>. 5.2.2.4 Alinhamento Após a seleção das seqüências que contêm microssatélites, o programa SeqMan Lasergene (DNAStar Inc.) será utilizado para avaliar o nível de redundância entre elas. Locos de microssatélites encontrados em mais de uma seqüência serão descartados e apenas os marcadores não ambíguos serão avaliados. 5.2.2.5 Desenho dos iniciadores 16 Os iniciadores direto (foward) e reverso (reverse) de cada SSR serão desenhados com o auxílio do programa Primer3, disponibilizado na internet, de acordo com os seguintes critérios: não conter bases redundantes; estar a uma distância adequada dos SSRs (entre 20 a 60 pb); ser constituídos por 18 a 22 nucleotídeos sem seqüências repetitivas; conter uma porcentagem de bases G e C entre 40 a 60%; começar em 5’ e terminar em 3’ com duas bases G, ou C, ou G e C, se possível; e ter temperatura de anelamento entre 45 e 60 °C, com diferença máxima de 1 ºC entre as temperaturas dos iniciadores direto e reverso, de modo que possam ser usados na mesma reação e não hibridizarem entre si, ou se autohibridizarem. 5.2.3 Marcadores cpDNA Nove iniciadores SSR universais de cpDNA (Tabela 1) sintetizados com base no genoma de tabaco (Weising & Gardner, 1993), todos de repetições de uma base, serão testados em reações de PCR com DNA de 10 árvores de Butia eriospatha, a fim de se obter a temperatura de anelamento ideal para cada par de iniciadores. Em cada par de iniciadores, o forward será marcado com fluorescência para leitura em analisador automático de fragmento (MegaBACE ™ 1000). 17 Tabela 1. Locos de microssatélites cloroplastidiais universais com as seqüências e amplitude alélica esperada (em pares de base, pb) dos iniciadores desenvolvidos por Weising & Gardner (1999) em Nicotiana tabacum. Iniciadores ccmp01 Seqüências (5’ – 3’) F: CAGGTAAACTTCTCAACGGA pb 122-143 R: CCGAAGTCAAAAGAGCGATT ccmp02 F: GATCCCGGACGTAATCCTG 166-234 R: ATCGTACCGAGGGTTCGAAT ccmp03 F: CAGACCAAAAGCTGACATAG 89-119 R: GTTTCATTCGGCTCCTTTAT ccmp04 F: AATGCTGAATCGAYGACCTA 115-220 R: CCAAAATATTBGGAGGACTCT ccmp05 F: TGTTCCAATATCTTCTTGTCATTT 77-145 R: AGGTTCCATCGGAACAATTAT ccmp06 F: CATGCATATGTAGAAAGCC 93-111 R: CATTACGTGCGACTATCTCC ccmp07 F: CAACATATACCACTGTCAAG 129-151 R: ACATCATTATTGTATACTCTTTC ccmp09 F: GGATTTGTACATATAGGACA 96-104 R: CTCAACTCTAAGAAATACTTG ccmp10 F: TTTTTTTTTAGTGAACGTGTCA 91-300 R: TTCGTCGDCGTAGTAAATAG 18 5.2.4 Amplificação e eletroforese do DNA nuclear Para cada reação de PCR dos locos SSR, 10 ng/µL de DNA genômico serão utilizados em um volume total de 10 µL contendo 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8.9, 1,5 mM MgCl2, 200 µM de cada um dos desoxirribonucleotídeos (dATP, dCTP, dGTP e d TTP), 0,20 µL de cada primer microssatélite 3’ e 5’ (forward e reverse) e 0,12 unidades de Taq polimerase. O protocolo de PCR consistirá de uma desnaturação inicial a 96° C por 3 minutos, seguidos por 30 ciclos a 94° C por 30 segundos, Ta °C (temperatura de anelamento dos iniciadores) por 1 minuto, 72° C por 1 minuto e extensão final a 72° C por 7 minutos. Os produtos da amplificação para os SSR serão separados por eletroforese sob condições não-desnaturante e desnaturante em géis de poliacrilamida 10%, e os fragmentos obtidos serão detectados em coloração com nitrato de prata (20%) segundo protocolo de Sanguineti et al. (1994). O tamanho dos alelos será determinado utilizando como padrão de peso molecular, o marcador Ladder 10 pb (Invitrogen™). 5.2.5 Amplificação e eletroforese de cpDNA As reações de PCR serão padronizadas para cada par de iniciador. Os produtos amplificados serão visualizados em gel de agarose e corados com brometo de etídio. Devido ao tamanho pequeno e número limitado de alelos na maioria dos SSR de cloroplasto, os tamanhos dos alelos serão obtidos por seqüenciamento. A partir dos resultados das amplificações, as detecções de polimorfismo serão realizadas em analisador automático de fragmentos (MegaBACE™ 1000). 19 Para as reações de seqüenciamento, o produto de PCR será purificado com o uso de exonucleaseI e SAP (0,25 U de cada enzima em 5µL de reação), por 1 hora a 37º C. Apos esse tempo, a atividade enzimática será neutralizada expondo a reação a 80º C por 30 minutos. Para as reações de seqüenciamento, será utilizado o Kit DYEnamic TM ET dye terminator e iniciadores descritos na Tabela 1. Para cada reação de Seqüenciamento de 10 µL, serão utilizados 4,0 µL [(20 ng de DNA) produto da PCR], 0,6 µL (5µM) de iniciador forward ou reverse, 4,0 µL de solução pré-mix do kit de seqüenciamento e água ultra pura. A reação será realizada de acordo com o programa: 30 ciclos a 95º C por 20 segundos, temperatura de anelamento específico por 15 segundos, 60 º C por 1 minuto. O protocolo de purificação de seqüenciamento será o da precipitação por etanol/acetato de amônio 7,5 M. 5.2.6 Análises genéticas 5.2.6.1 Locos SSR nuclear 5.2.6.1.1 Análise da herança e análise de desequilíbrio de ligação O estudo da herança dos locos SSR desenvolvidos será realizado com base no modelo descrito por Gillet & Hattemer (1989), que compara o genótipo de árvores maternas heterozigóticas com a segregação de suas progênies de polinização aberta. Os genótipos observados em cada progênie, de cada árvore materna heterozigota serão comparados com o esperado pela hipótese de segregação regular 1:1. A hipótese de segregação regular será aceita ou descartada com base em um teste G padrão calculado para cada progênie individualmente, soma dos testes G individuais ( ! GTotal _ 1:1 ), agrupando as progênies de árvores maternas de mesmo genótipo para o loco sob 20 consideração ( G1:1 _ agrupado ) e para a hipótese de homogeneidade de segregação entre progênies, usando-se um teste G de heterogeneidade ( G Heterogeneidade ), com n, n-1 e 1 grau de liberdade, respectivamente. O teste de desequilíbrio de ligação será realizado com base na medida composta de desequilíbrio de ligação de Burrows ( ! ij ) usando o programa GDA (Lewis & Zaykin, 2002). Esse método é o mais adequado para populações onde existem indícios de desvios de cruzamentos aleatórios, como é muitas vezes observado em espécies arbóreas. Esses testes permitirão determinar quais os locos são adequados para as análises genéticas populacionais. 5.2.6.1.2 Análise da diversidade e estrutura genética, endogamia, parentesco, tamanho efetivo e equilíbrio de Hardy-Weinberg A diversidade genética e as estatísticas F serão estimadas sob modelo aleatório de acordo com Weir (1996), em que as populações amostradas serão consideradas como representativas da espécie e com uma história evolutiva comum. As freqüências alélicas, o número de alelos por loco (A), a heterozigosidade observada (Ho) e esperada (He) e as estatísticas F de Wright (FIS, FST e FIT), serão estimadas usando o programa GDA (Lewis & Zaykin, 2002). Também se utilizará uma estatística análoga a FST , denominada de RST, desenvolvida especificamente para dados microssatélites (Slatkin et al., 1995). O parâmetro RST será estimado com o auxílio do programa RSTCal (Goodman, 1997). O coeficiente de coancestria ! xy para cada par de árvores adultas e jovens será calculado usando o programa SPAGeDi versão 1.1b (Hardy & Vekemans, 2003) e o tamanho N e (v ) segundo metodologia proposta por Sebbenn & Seoane (2005) para dados 21 de marcadores genéticos. O tamanho efetivo populacional (Ne) será estimado para cada população de acordo com Vencovsky (1987), por Ne = n/(1+ƒ), em que n é o tamanho amostral e ƒ é o índice de fixação. Os parâmetros estimados serão: θP = divergência genética entre populações, F = índice de fixação médio para o conjunto das populações, ƒ = índice de fixação médio dentro de populações. Para verificar se as estimativas médias de θP, F e ƒ serão estatisticamente diferentes de zero, se estimará o intervalo de confiança a 95% de probabilidade pelo método de reamostragem bootstrap. As análises de variâncias e os bootstraps serão realizados no programa GDA (Lewis & Zaykin, 2002). A estruturação da variabilidade será visualizada através de dendrogramas construídos pela matriz de distâncias genéticas não viezadas de Nei (1978) e pelo critério de agrupamento Como as amostras vão incluir três gerações (adultos, progênies e jovens), serão testadas a aderência das freqüências gênicas e genotípicas ao modelo de equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW), usando o teste exato de Fisher, calculado usando-se o programa GDA (Lewis & Zaykin, 2002). 5.2.6.1.3 Análise da distribuição espacial dos genótipos Esta análise será realizada com base na estimativa do coeficiente de coancestria ( ! xy ) entre pares de árvores dentro de classes de distância previamente determinadas, usando o estimador de coancestria proposto por Loiselle et al. (1995). A significância estatística do coeficiente ! xy será obtida comparando os limites do intervalo de confiança a 95% de probabilidade da estimativa média ! xy para cada classe de distância, calculado por 10.000 reamostragens bootstrap, em relação a hipótese de 22 ausência de coancestria (H0: ! xy = 0). O coeficiente de coancestria será estimado usando o programa SPAGeDi versão 1.1b. 5.2.6.1.4 Sistema reprodutivo O sistema de reprodução será caracterizado pelos modelos misto de reprodução (Ritland & Jain, 1981) e cruzamentos correlacionados (Ritland, 1989), utilizando o programa MLTR (Ritland, 2004). Os parâmetros estimados serão: a) taxa de cruzamento multiloco ( t m ); b) taxa de cruzamento uniloco ( t s ); c) taxa de cruzamento entre aparentados ( t m ! t s ); d) freqüências alélicas dos óvulos e do pólen (o e p); e) taxa de cruzamento multiloco individual por árvore materna; f) a correlação de autofecundação ( rS ); g) a correlação multiloco de paternidade ( rp (m ) ) e; h) correlação uniloco de paternidade ( rp (s ) ). O erro padrão dos parâmetros será estimado por 500 reamostragens bootstrap. Com o intuito de verificar se a taxa de cruzamento é uniforme entre os eventos reprodutivos das populações de B. eriospatha com tamanho populacional diferenciado nos habitats de ocorrência, será realizada uma análise de variância. A fim de conhecer a estrutura genética das progênies será estimado o coeficiente médio de coancestria ( ! xy ) entre plantas dentro de progênies, calculado de parâmetros do sistema de reprodução, conforme derivações de Ritland (1989). A representatividade genética dentro das progênies será medida pelo tamanho efetivo de variância ( N e (v ) ) de cada progênie com base na variância amostral das freqüências alélicas (Cockerham, 1969). 23 5.2.6.1.5 Fluxo gênico histórico As estimativas de fluxo gênico entre as populações basear-se-ão na metodologia proposta por Wright (1943), que considera a quantidade de migrantes (Nm) e a divergência genética entre populações (FST). Utilizar-se-á a equação proposta por Crow & Aoki (1984): Nm = 1/4α [(1/FST) – 1] em que: α = (n/(n-1))2 n = número de populações No entanto, Cockerham & Weir (1993) consideram que o emprego do θP como estimador da divergência entre populações é mais adequado, e por isso, ele foi utilizado, ao invés do FST. No caso do modelo de ilhas, o Nm mede o número de gametas que se movem, enquanto que, nos modelos contínuos, como o isolamento por distância, utilizase o Nb que representa o tamanho de vizinhança ou a área onde ocorre panmixia. De acordo com Slatkin & Barton (1989), se assumirmos que a dispersão ocorre de forma homogênea ao redor de uma árvore, a área de vizinhança pode ser dada por: Nb = 2πNm 5.2.6.1.6 Fluxo gênico contemporâneo As estimativas do fluxo gênico contemporâneo, via pólen, serão obtidas usando análise de paternidade com o auxílio do programa CERVUS 3.0 (Marshall et al., 1998; 24 Kalinovski et al., 2007). As análises serão conduzidas a partir dos genótipos de árvores maternas e suas progênies e, das demais árvores adultas reprodutivas da população (candidatos a parentais paternos). Isto permitirá determinar a taxa de imigração de pólen e a distância física entre as efetivas árvores doadoras de pólen e as árvores maternas, o tamanho da vizinhança reprodutiva (número de doadores de pólen) e a área de vizinhança efetiva de polinização (área que ocorre os cruzamentos). 5.2.6.2 Locos cpSSR As análises dos produtos de seqüenciamento serão realizados com o programa BioEdit. As seqüências serão alinhadas e, a variação de seqüências será avaliada em relação à deleção, inserção ou substituição de nucleotídeos e, desta forma, os alelos em cada loco serão determinados. 5.2.6.2.1 Teste da herança do cloroplasto A probabilidade de transmissão paterna do cloroplasto será estimada com os genótipos das progênies coletadas para os estudos do sistema reprodutivo e fluxo gênico contemporâneo via pólen. Utilizar-se-á o procedimento descrito em Milligan (1992), para estimar a probabilidade de transmissão paterna do cloroplasto (P), separadamente para as progênies coletadas nas populações estudadas. A probabilidade de observar K progênies contendo organelas derivadas do pai em conjunto de N progênies é dada pela distribuição binomial: Pr(K/N,P) = N! / K!(N-K)! Pk . (1-P)N – K (1) 25 A equação fornece a probabilidade, dado um determinado tamanho amostral, de reconhecer herança paterna, quando a taxa de transmissão é dada por P. O poder do teste de hipótese (ß) deve ser grande oi suficiente para assegurar que a hipótese de herança estritamente materna não seja falsamente aceita. Será considerado o poder do teste com ß ≥ 0,95. Como ß = 1 – Pr(K/N,P) , sendo o valor de ß substituído na equação (1). Em progênies de polinização aberta, apenas um subconjunto das progênies é informativo. Isso porque pode ocorrer auto-fecundação e, mesmo que as sementes sejam resultantes de fecundação cruzada, o pai pode ter o mesmo haplótipo da mãe (OddouMuratorio et al., 2001). O número de cruzamentos informativos (Ninf), aqueles em que os dois parentais são esperados por carregar haplótipos diferentes, assumindo cruzamentos aleatórios, é estimado por: Ninf = ∑ N(1- pi)(1- s) (2) Em que é a freqüência do haplótipo i na população, s é a taxa de auto-fecundação e N é o número de plântulas com o haplótipo i. Substitui-se N por Ninf na eq. (1), como sugerido por Oddou & Muratorio et al. (2001). 5.2.6.2.1 Diversidade genética e análise da distribuição espacial dos genótipos Uma vez que os polimorfismos do genoma do cloroplasto são herdados sem recombinação, cada combinação alélica única entre os locos microssatélites será considerada um haplótipo. Cada haplótipo, por sua vez, será analisado como um alelo 26 diferente de um único loco haplóide. Serão computados: (1) o número de haplótipos, (2) a quantidade de haplótipos privados por população e (3) a proporção de alelos privados. As freqüências dos haplótipos em cada população e nos indivíduos amostrados serão utilizadas para estimar (a) a diversidade haplotípica e (b) o numero efetivo de haplótipos. Com o intuito de tornar comparáveis os resultados da distribuição espacial dos genótipos por marcadores cloriplastidiais e nucleares, utilizar-se-á mesma metodologia já descrita no item 5.2.6.1.3. 5.2.6.2.2 Estrutura genética e fluxo gênico histórico Para genes nucleares, a estimativa de diferenciação genética, derivado do modelo de ilhas infinitas de Wright (1931), é calculada com base no tamanho efetivo populacional Ne e a taxa de migração m expresso por Fst (n) = 1/(4 Nem + 1). O genoma de organelas pode ser tratado como haplóide (replicação do DNA e divisão celular pode levar a uniformidade dentro de células e entre indivíduos) e, neste caso, considerando os mesmos pressupostos do modelo de ilhas infinitas de Wright, e ignorando as taxas de mutação, a estimativa de diferenciação genética com base no genoma de organela Fst (o) para as populações de Butia eriospatha será obtida pela relação Fst (o) ≈ 2 Fst (n). Esta relação se baseia na probabilidade de autozigose para haplótipos de organelas em plantas hermafroditas como demonstrado por Hamilton & Miller (2002). O fluxo gênico será calculado como proposto por McCauley (1995): Nm = 1/2 [(θPc) – 1] em que, 27 θPc é a divergência genética calculada com marcadores cloroplastidiais. Essa estimativa e o intervalo de confiança serão obtidos por reamostragens bootstrap sobre populações, com o uso do programa EG (Coelho, 2000). A razão de migração de pólen e sementes será calculada de acordo com Ennos (1994). Baseado na razão do fluxo de pólen e sementes e, nas taxas de cruzamento e de transmissão materna, a hipótese alternativa de que há diferença nas estimativas de divergência genética baseadas em marcadores nucleares e cloroplastidiais será testada pelo modelo descrito por Hamilton & Miller (2002). 5.2.6.2.4 Fluxo gênico contemporâneo Como todas as árvores adultas reprodutivas e os regenerantes amostrados nas populações terão sua localização geográfica conhecida, será possível determinar o padrão de dispersão de sementes, calculando a distância física entre os regenerantes e os putativos parentais. Adicionalmente, será calculado o fluxo gênico crítico - que reflete a probabilidade de um regenerante, com um dos parentais identificado, ser descentente de uma árvore fora da população - com base no método proposto por Westneat & Webster (1994). 5.3 Demografia Propõe-se um estudo integrado da estrutura demográfica, da regeneração natural e herbivoria para subsidiar o conhecimento da espécie nas áreas de ocorrência. A estrutura demográfica e a distribuição espacial serão realizadas nas 15 populações em estudo. Todos os indivíduos serão classificados por estádios de desenvolvimento e, a 28 altura e a circunferência a altura do peito (CAP) serão mensuradas. A regeneração natural e taxa de herbivoria do componente regenerante serão avaliadas em cinco das 15 populações, em parcelas circulares de raio de 2 m, num total de 30 parcelas por população. Essas parcelas serão distribuídas equitativamente entre áreas com e sem influencia de copa do butiá. A estrutura populacional será delineada com base na densidade total de indivíduos registrados em cada estádio observado em cada população. O padrão de distribuição do componente regenerante será calculado pelo índice de Payandeh (1970), assim determinado: P=1, a distribuição da população é do tipo aleatória; P<1, a distribuição é uniforme e P>1, é agregada. A herbivoria será expressa pelo número de regenerantes com o eófilo predado. Os dados de herbivoria serão analisados usando tabelas de contingência, e a significância estatística será testada com o teste qui-quadrado de Pearson para verificar se há diferenças: (1) no número de regenerantes predados e não predados entre parcelas com e sem influencia da copa do butiá e, (2) na herbivoria dentro e entre populações. Para testar se a herbivoria é dependente da densidade, a relação entre densidade e a taxa de plantas predadas será realizada. Todas as análises estatísticas serão realizadas com o uso do programa R, versão 2.9.0 (2009). 5.4 Fenologia reprodutiva As avaliações fenológicas serão realizadas em todas as plantas de Butia eriospatha das populações A e B, no decorrer de dois ciclos reprodutivos da espécie. Os registros das variações fenológicas referentes à floração e frutificação serão realizadas quinzenalmente. Serão determinados: (1) o potencial reprodutivo das populações calculado com base no número de indivíduos que reproduziram nos dois ciclos 29 reprodutivos estudados, (2) a capacidade reprodutiva, onde se correlacionará a quantidade de unidades reprodutivas (inflorescência) por planta com a altura e CAP, (3) as fenofases, (4) a duração média, em dias, das fenofases, (5) se há sobreposição de fenofases em um mesmo indivíduo e, (6) os picos de floração e frutificação. 6. RESULTADOS ESPERADOS Aprimorar os conhecimentos na temática dos Recursos Genéticos Vegetais. Gerar uma tese e artigos de relevância científica. Contribuir com a conservação da espécie Butia eriospatha. Compartilhar novas metodologias com o grupo de pesquisa. Capacitar alunos de iniciação científica nas técnicas empregadas neste estudo. Participar de congressos e workshops. 30 7. PLANO DE TRABALHO 1. Extrair DNA foliar de um indivíduo de B. eriospatha para realizar o desenvolvimento dos marcadores microssatélites; 2. Padronizar as condições de amplificação para todos os iniciadores SSR desenvolvidos e realizar análises de herança mendeliana, desequilíbrio de ligação e polimorfismo para todos os locos SSR que serão empregados nos estudos genéticos propostos neste projeto; 3. Padronizar as condições de amplificação para os marcadores cpDNA; 4. Fazer o censo e mapear todas as árvores adultas e regenerantes de B. eriospatha encontrados nas áreas estudadas; 5. Amostrar tecidos de folhas de todas as árvores adultas reprodutivas de B. eriospatha e de regenerantes nas populações selecionadas; 6. Coletar sementes de árvores matrizes de B. eriospatha nas populações selecionadas. Plantar as sementes de cada matriz e, posteriormente, amostrar tecido foliar; 7. Extrair DNA das folhas de matrizes, progênies e regenerantes da espécie B. eriospatha e avaliar todo o material amostrado com marcadores genéticos; 8. Realizar análises de diversidade genética, fluxo gênico histórico, estrutura genética espacial, sistema de reprodução e análise de paternidade com a estrutura de progênies. 31 8. CRONOGRAMA DE EXECUÇÃO DAS ATIVIDADES Atividade 1◦ sem. 2◦ sem. 3◦ sem. 4◦ sem. 5◦ sem. Créditos X X Desenvolvimento e caracterização dos marcadores SSR X X Padronização dos marcadores cpDNA 6◦ sem. X X Seleção das populações X X X Mapeamento das árvores X X X Amostragem de tecidos foliares de árvores adultas X X X X X X Amostragem de tecidos foliares dos regenerantes Coleta de sementes*, plantio e amostragem de tecidos X foliares Extração do DNA das amostras X X X X X X X X X X X X X X Análises estatísticas X X X X Defesa do projeto X Apresentação de resultados em congressos X X X X Eletroforese Levantamento bibliográfico X X Qualificação Redação de artigos científicos Redação da Tese X X X X X X X X *A coleta de sementes seguirá o comportamento fenológico de frutificação da espécie em estudo. 32 9. ORÇAMENTO ITENS Valor em R$ LABORATÓRIO Desenvolvimento marcadores SSR nuclear 8.000,00 Caracterização genética SSR nuclear 50.000,00 Caracterização genética SSR cloroplastidiais 25.000,00 Material de consumo (plásticos/vidrarias) Material permanente (cuba + fonte eletroforese) 8.000,00 10.000,00 CAMPO Viagens a campo (despesas gerais) Aluguel de carro 14.000,00 8.100,00 RECURSOS HUMANOS Bolsa de doutorado (CNPq) 86.400,00 Taxa de bancada (CNPq) 14.256,00 OUTROS Correção artigos científicos (inglês) 1.500,00 Pranchas científicas 1.000,00 TOTAL 226.256,00 33 10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALZATE-MARIN, A. L. et al. 2005. Otimização de um método econômico e rápido de extração de DNA para quatro espécies de árvores tropicais. In: Congresso Brasileiro de Genética, 51. Águas de Lindóia. p. 510. AZAMBUJA, A.C. 2009. Demografia e fenologia reprodutiva de Butia capitata (Mart.) Becc. (Arecaceae) em Arambaré, Rio Grande do Sul. 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