MODELO DE CAPA PARA TESE DE MESTRADO

ISSAMIR FARIAS SAFFAR
POLIMORFISMOS EM GENES DE REPARO DO DNA (XPC, ERCC1,
XRCC7) EM MULHERES COM CÂNCER DO COLO DO ÚTERO
Tese apresentada à Universidade
Federal de São Paulo - Escola
Paulista de Medicina para obtenção
do Título de Mestre em Ciências
SÃO PAULO
2010
ISSAMIR FARIAS SAFFAR
POLIMORFISMOS EM GENES DE REPARO DO DNA (XPC, ERCC1,
XRCC7) EM MULHERES COM CÂNCER DO COLO DO ÚTERO
Tese apresentada à Universidade
Federal de São Paulo - Escola
Paulista de Medicina para obtenção
do Título de Mestre em Ciências
Orientador:
Co-orientadores:
Prof. Dr. Ismael Dale Cotrim Guerreiro da Silva
Prof. Dr. Adalberto Abrão Siufi
Dr. Paulo D’Amora
SÃO PAULO
2010
Farias Saffar, Issamir
Polimorfismos em genes de reparo do DNA (XPC, ERCC1, XRCC7) em
mulheres com câncer do colo do útero. Issamir Farias Saffar. --São Paulo, 2010.
x, 50f.
Tese (Mestrado) Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de
Medicina. Programa de Pós-Graduação em Saúde da Mulher (Ginecologia).
Título em inglês: DNA repair gene variants XPC, ERCC1, XRCC7 in women with
cervical cancer.
1. Câncer 2. Colo do útero 3. Genes de reparo 4. Polimorfismos.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE GINECOLOGIA
Chefe do Departamento de Ginecologia
Prof. Dr. Afonso Celso Pinto Nazário
Coordenador do Programa de Pós-Graduação
Prof. Dr. Manoel João Batista Castello Girão
SÃO PAULO
2010
BANCA EXAMINADORA
PRESIDENTE DA BANCA
Prof. Dr. Ismael Dale Cotrim Guerreiro da Silva
Professor Associado do Departamento de Ginecologia da Universidade Federal de
São Paulo, Escola Paulista de Medicina – UNIFESP-EPM.
TITULARES
Prof. Dr. Sergio Mancini Nicolau
Professor Associado do Departamento de Ginecologia da Universidade Federal de
São Paulo, Escola Paulista de Medicina – UNIFESP-EPM.
Prof. Dr. Paulo D’Amora
Doutor pelo Departamento de Ginecologia da Universidade Federal de São Paulo,
Escola Paulista de Medicina – UNIFESP-EPM.
Profa. Dra. Regina Affonso
Doutora pelo Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares da Universidade de
São Paulo – IPEN-USP.
SUPLENTE
Prof. Dr. Roberto Euzébio dos Santos
Professor Adjunto do Departamento de Obstetrícia e Ginecologia da Faculdade de
Ciências Medicas da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo - FCMSCSP.
Dedicatória
Este trabalho é dedicado...
À minha família, minha esposa Maria Leticia,
nossos filhos Luis Eduardo, Luis Augusto e Maria Luisa,
e à minha Mãe Undina.
vi
Agradecimentos
À DEUS, por me mostrar sempre a direção para seguir em frente.
PROF. DR. ISMAEL DALE COTRIM GUERREIRO DA SILVA, Professor
Associado e Livre Docente do Departamento de Ginecologia da Escola Paulista de
Medicina da Universidade Federal de São Paulo (EPM-UNIFESP), pelo incentivo e
orientação, de modo especial, em todos os momentos da realização deste
trabalho.
PROF. DR. ADALBERTO ABRÃO SIUFI, Professor Adjunto do Departamento de
Clínica Cirúrgica da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, pelo
companheirismo e incentivo para a realização deste trabalho.
Prof.
DR.
LUIZ
FELIPE
TERRAZAS
MENDES,
Professor
Adjunto
do
Departamento de Clínica Cirúrgica da Universidade Federal de Mato Grosso do
Sul, como grande incentivador da minha carreira.
Ao DR. PAULO D’AMORA, Pesquisador do Laboratório de Ginecologia Molecular
da EPM-UNIFESP, pela co-orientação, auxílio e dedicação para elaboração deste
trabalho.
Ao mestrando JOÃO PAULO FERREIRA DE OLIVEIRA KLEINE, colaborador para
realização deste trabalho.
A todos os médicos e residentes do Hospital do Câncer Prof. Dr Alfredo Abrão,
pelo auxílio no encaminhamento e atendimento aos enfermos.
À Fundação Carmen Prudente de Mato Grosso do Sul pelas condições
proporcionadas para a coleta de dados nessa instituição.
vii
Agradecimentos
À ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA da Universidade de Federal de São Paulo,
especialmente ao Laboratório de Ginecologia Molecular, um agradecimento aos
meus conhecidos e amigos que me ajudaram nesta empreitada.
A todos as pacientes que em mim confiaram, meus sinceros agradecimentos.
viii
Índice
DEDICATÓRIA......................................................................................................................
vi
AGRADECIMENTOS.............................................................................................................
vii
RESUMO.............................................................................................................................
x
INTRODUÇÃO......................................................................................................................
1
PROPOSIÇÃO.......................................................................................................................
7
ARTIGO SUBMETIDO À REVISTA INTERNATIONAL JOURNAL OF GYNECOLOGICAL
CANCER...............................................................................................................................
8
DISCUSSÃO..........................................................................................................................
30
CONCLUSÕES......................................................................................................................
33
BIBLIOGRAFIA DA INTRODUÇÃO E DISCUSSÃO..................................................................
34
ANEXOS...............................................................................................................................
42
ix
Resumo
Estudos demonstram que polimorfismos em genes relacionados ao reparo do
DNA estão envolvidos na patogênese de diversas doenças neoplásicas, como
o câncer ginecológico, particularmente o câncer do colo do útero. O presente
estudo, caso-controle, compara os polimorfismos dos genes XPC, ERCC1 e
XRCC7 em 77 mulheres com câncer cervical (70 casos de carcinoma
espinocelular e 7 casos de adenocarcinoma do colo do útero) e 73 mulheres
saudáveis atendidas no Hospital do Câncer Alfredo Abrão, entre Junho de 2007
e Maio de 2009. No Laboratório de Ginecologia Molecular da EPM-UNIFESP,
os polimorfismos desses genes foram detectados pela técnica de reação em
cadeia da polimerase seguida da análise do polimorfismo do fragmento de
restrição (PCR-RFLP). As distribuições genotípicas dos polimorfismos no grupo
de casos e controle estavam em Equilíbrio de Hardy-Weinberg (p>0,05). Pelo
teste exato de Fisher as distribuições genotípicas dos polimorfismos (XRCC7
(G-C): GG (11,7%), GC (41,6%) e CC (46,8%) no grupo de casos e GG
(20,5%), GC (41,1%) e CC (38,4%) no grupo controle (p=0,31); ERCC1 (C-T):
CC (39,0%), CT (51,9%) e TT (9,1%) no grupo de casos e CC (53,4%), CT
(38,4%) e TT (8,2%) no grupo controle (p=0,20); XPC (A-C): AA (50,6%), AC
(41,6%) e AA (7,8%) no grupo de casos e AA (45,2%), AC (37,0%) e CC
(17,8%) no grupo controle, p=0,19) não apresentaram diferença estatística
significante. Nossos resultados mostram que os polimorfismos XPC, ERCC1 e
XRCC7 não são correlacionados ao risco para desenvolvimento do câncer do
colo do útero na população estudada.
x
Introdução
Câncer do colo do útero
O Câncer do colo do útero é um importante problema de saúde pública,
correspondendo à segunda causa de câncer em mulheres no mundo, perdendo
apenas para o câncer de mama. Anualmente são registrados cerca de 500.000
casos
novos
e
250.000
mortes
em
decorrência
da
doença
[1-3].
Aproximadamente 80% dos casos desse tipo de câncer ocorrem nos países em
desenvolvimento, com coeficientes de incidência maiores na America Latina,
Caribe, Àfrica sub-saariana e sul e sudeste da Ásia [1-4]. As maiores
incidências no Brasil foram, respectivamente em Cuiabá (37,7%), Brasília
(37,7%) e Goiânia (33,9%). São Paulo ocupou a 13ª posição, com coeficiente
padronizado de 21,1% [5].
No Brasil há cerca de 69 milhões de mulheres com 15 anos ou mais sob o risco
de desenvolverem câncer do colo do útero [6]. Segundo dados do IARC
(International Agency for Research on Cancer), o câncer do colo do útero é o
segundo maior tumor com maior incidência e mortalidade nas mulheres
brasileiras, estando atrás somente do câncer de mama [6,7]. O Ministério da
Saúde estimou cerca de 19.000 casos da doença para o ano de 2008 no Brasil,
dos quais 3.500 no Estado de São Paulo. A incidência do câncer do colo do
útero varia conforme faixa etária, sendo progressivamente maior a partir dos 20
– 29 anos e atingindo o pico em torno dos 45 – 49 anos de idade [7].
Em relação aos fatores de risco no aparecimento do câncer do colo do útero,
atualmente se considera o papiloma vírus humano (HPV) como o principal
agente associado à doença, sendo classificado pelo IARC como carcinógeno
1
Introdução
do grupo I. Os tipos 16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52, 58 e 59 são considerados de
alto risco para o desenvolvimento do câncer do colo do útero [8].
O risco de câncer do colo do útero em decorrência da infecção pelo HPV foi
analisado em diversos estudos caso-controle, com odds ratio variando de 18 a
200.
Outros fatores de risco associados à doença são: o inicio da atividade sexual
precoce, número elevado de parceiros sexuais, multiparidade, uso de
contraceptivos orais, tabagismo, deficiências nutricionais de beta-caroteno,
vitamina C e de folato e exposição materna ao dietilestilbestrol, estando este
último relacionado ao adenocarcinoma de células claras [9-14].
O sistema de estadiamento mais utilizado para o câncer do colo do útero é o
proposto pela Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia (FIGO). O
estadiamento
é
essencialmente
clínico,
empregando-se
no
estudo
histopatológico somente nos casos onde os tumores são microscópicos [15].
Segundo a ultima revisão do estadiamento de 1994, o tumor microscópico de
até 7mm de extensão e com profundidade de invasão do colo do útero de até
3mm é classificado como 1AI. Se a profundidade de invasão for maior do que
3mm, mas não superior a 5mm, o tumor pertence ao estádio IA2. Quando o
tumor for microscópico, mas tiver profundidade de invasão superior a 5mm ou
extansão maior do que 7mm, é estadiado como IB.
Os tumores macroscópicos são todos estadiados clinicamente, levando-se em
consideração apenas o exame físico e os exames subsidiários. No estádio IB
(macroscópico) o tumor infiltrativo e está ao colo do útero (IB1 se o tumor tiver
até 4cm e IB2 quando maior). Se o exame especular vaginal nota-se
acometimento do terço superior e médio da vagina, estadia-se o tumor como
2
Introdução
IIA, mas se houver infiltração de pelo menos um dos ligamentos cervicais
laterais (paramétrios), como IIB. No estádio III, o tumor acomete até o terço
inferior da vagina (IIIA) ou estende-se até a parede pélvica lateral (IIIB). Se
houver infiltração da parede do reto ou da bexiga os tumores são estadiados
como IVA e se houver metástases à distância, IVB [15].
O tratamento do câncer do colo do útero é baseado no estadiamento clínico.
Na maioria dos centros de tratamento de câncer ginecológico, adota-se como
padrão o estadiamento preconizado pela FIGO. Tanto a radioterapia como a
cirurgia podem ser utilizadas para o tratamento do câncer do colo de útero [16].
Nos estádios IIB a IV, a radioterapia exclusiva é o tratamento de escolha e,
pelo menos, cinco estudos prospectivos mostraram superioridade da
associação da radioterapia à quimioterapia comparada à radioterapia isolada
[17-22].
Genes envolvidos no reparo do DNA
Os polimorfismos, variações genéticas herdadas que ocorrem naturalmente,
estão presentes em pelo menos 1% da população geral, são encontrados com
certa freqüência e dependendo da sua localização no gene podem modificar a
função da proteína codificada por esse gene e com isso podem vir a modular a
interação entre os fatores exógenos ou endógenos com alvos celulares
específicos [23]. O tipo de variação mais comumente encontrada na seqüência
de DNA são os polimorfismos de um único nucleotídeo (SNP, do inglês, single
nucleotide polymorphism). A determinação de SNP tem se tornado um
importante método de caracterização de diferenças individuais no mapeamento
genético, quando comparado a seqüência genômica padrão [24]. As
3
Introdução
estratégias para a obtenção do genótipo das amostras que apresentam SNPs
têm seu foco nas regiões que codificam possíveis alterações na seqüência de
aminoácidos, no processo de divisão entre introns e exons ou nas regiões
promotoras dos genes [25].
A resposta individual ao estresse químico ou físico pode variar de acordo com
a função de determinado gene em particular, ou de uma combinação entre os
genes
que
regulam
a
absorção,
metabolismo,
morte
celular
(apoptose/necrose), sistema imune e reparo do DNA [26]. As enzimas de
reparo do DNA estão associadas com a susceptibilidade a reconhecidos
agentes genotóxicos que agridem os cromossomos, tais como os fármacos
antitumorais e radiações ionizantes [27-29].
Atualmente, é reconhecido que a reparação do DNA não envolve somente a
reversão direta do dano, mas também outros dois distintos mecanismos,
chamados de reparo por excisão (de base, BER, do inglês: base excision
repair, e de nucleotídeo, NER, do inglês: nucleotide excision repair) e reparo de
quebras de fita dupla do DNA (recombinação homóloga, HR, do inglês:
homologous recombination; e reparação não-homóloga: NEHJ, do inglês: nonhomologous end joining) [30]. As mutações em genes envolvidos no reparo do
DNA são responsáveis pelo desenvolvimento de tumores e por várias doenças
hereditárias caracterizadas por alterações metabólicas complexas [31].
O NER é considerado como o mais flexível de todos os mecanismos de
reparação devido a sua capacidade de eliminar uma variedade de lesões que
distorcem a hélice e provocam mudança na estrutura química do DNA. Após a
excisão do oligonucleotídeo contendo o dano, o intervalo é preenchido através
da síntese de DNA, seguindo a ligação entre as extremidades. A via NER
4
Introdução
repara preferencialmente os genes que estão sendo transcritos, isto é, a
reparação de uma lesão que bloqueia a transcrição e inibe a produção de um
RNA e de uma proteína é realizada com maior eficiência e mais rapidamente
comparada com outras partes do genoma que estão sendo usadas pela célula
[32].
Recentes estudos demonstraram que o aumento dos níveis de expressão do
gene ERCC1 (Excision Repair Cross Complementing Group 1), um dos genes
envolvidos na via do NER, está associado ao acréscimo da atividade da
proteína endonuclease que atua no processo celular de reparo do DNA em
diferentes tecidos [33]. Mais ainda, a expressão do ERCC1 vem sendo
associada à resistência celular e clínica a quimioterapia em pacientes com
neoplasia pulmonar, gástrica, mamária e ovariana [34-37].
O polimorfismo no códon 118 do gene ERCC1 é caracterizado por uma troca
de uma citosina (AAC) por uma timina (AAT) e testes in vitro descrevem que
este SNP pode ser responsável por alterações no RNA mensageiro (RNAm) e
da proteína levando a alteração na sensibilidade a alguns quimioterápicos. Este
polimorfismo tem sido estudado em pacientes com câncer de pulmão, colo-retal
e gástrico, sendo que vários autores demonstraram o valor preditivo desse
marcador como parâmetro de resposta a quimioterapia [38-42].
O gene XRCC7 (Cross-Complementing Group7) é um gene que também está
envolvido nas vias de reparo de quebra e de recombinação do DNA. O SNP
intrônico, G6721T, no gene XRCC7 foi descrito como fator determinante e
causador de instabilidade do seu respectivo RNA mensageiro em indivíduos
que apresentam maior sensibilidade para radiações ionizantes, entretanto há
poucos estudos na literatura correlacionando esse SNP e o câncer [43,44].
5
Introdução
O gene XPC (Xeroderma Pigmentosum Group C) produz uma proteína que
possui uma interação física e funcional com a timina-DNA do grupo BER. O
polimorfismo Lys939Gln localiza-se no exon 15, é um dos polimorfismos do
gene XPC que está envolvido em diferentes tipos de câncer tais como de
mama, de bexiga, de cabeça e pescoço e de pulmão [45].
Frente a evidências de que alterações em mecanismos de reparo do DNA
possam de alguma maneira, estar envolvidas na etiopatogenia ou fisiopatologia
do câncer do colo do útero, e que os genes reparo constituem importantes
reguladores da homeostase gênica, propusemo-nos estudar polimorfismos dos
genes ERCC1, XRCC7 e XPC em mulheres com e sem câncer do colo do
útero.
6
Proposição
Propõe-se, no presente trabalho, o estudo da prevalência dos polimorfismos
presentes nos genes de reparo do DNA, XPC, ERCC1, e XRCC7 em mulheres
com e sem câncer do colo do útero.
7
Artigo Submetido à Revista International Journal of Gynecological Cancer
8
Title Page
Polymorphic DNA repair genes XPC, ERCC1, XRCC7 and the Risk for
Cervical Cancer
Authors:
Issamir Farias Saffar1,2, MD; Paulo D’Amora3, PhD; Fabricio Colacino Silva1,2, MD;
Adalberto Abrão Siufi1,2 MD, PhD; João Paulo Ferreira de Oliveira Kleine3; Jefersson
Baggio Cavalcante1,2 MD; Leandro Rodrigo Acosta1, MD; Guido Marks1, MD; Cristina
Valleta de Carvalho3, PhD; Ana Maria Massad-Costa3 MD, PhD; and Ismael Dale
Cotrim Guerreiro da Silva3, MD, PhD.
Citation:
Saffar IF, D’Amora P, Silva FC, Siufi AA, Kleine JP, Cavalcante JB, Acosta LR, Marks
G, Carvalho CV, Massad-Costa AN, and Silva ID.
Affiliations:
1. Department of Surgery, Universidade Federal do Mato Grosso do Sul (UFMS),
Campo Grande, Mato Grosso do Sul, Brazil;
2. Alfredo Abrão Cancer Hospital, Campo Grande, Mato Grosso do Sul, Brazil;
3. Molecular Gynecology Laboratory, Gynecology Department, Escola Paulista de
Medicina da Universidade Federal de São Paulo (EPM-UNIFESP), São Paulo,
Brazil.
Running Title:
DNA repair genes and cervical cancer.
Key words:
XPC, ERCC1, XRCC7, polymorphisms, cervical cancer.
Disclosure information:
The authors have nothing to disclose.
Financial Support:
This work was supported by grants from Fundação Carmem Prudente and Hospital do
Câncer Alfredo Abrão in Campo Grande, Mato Grosso do Sul State, Brazil.
Correspondence should be address to:
Issamir Farias Saffar
Rua Pedro de Toledo, 781, 4ºandar - frente
Molecular Gynecology Laboratory
The Federal University of São Paulo
04039-032, São Paulo, Brazil.
Phone: +55-11-5579-1534 fax: +55-11-5579-3321
E-mail: [email protected]
*Manuscript (All Manuscript Text Pages in MS Word format, including References and Figure Legends)
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1
Polymorphic DNA repair genes XPC, ERCC1, XRCC7 and the Risk for
2
Cervical Cancer
3
ABSTRACT
4
5
Objective: DNA repair genes play a key role in maintaining genomic stability and integrity.
6
DNA repair gene polymorphisms, such as those of Xeroderma pigmentosum complementation
7
group C (XPC), excision repair cross-complementing gene (ERCC1), and X-ray repair cross-
8
complementing group 7 gene (XRCC7), contribute to carcinogenesis. In this study, we
9
investigated the correlation between cervical cancer risk and XPC, ERCC1, XRCC7 genetic
10
variants. Methods: A case-control study of 77 cases of cervical cancer (including 70
11
carcinoma and 7 adenocarcinoma) and 73 normal women was performed. Three single
12
nucleotide polymorphisms (SNPs) (XRCC7, XPC, ERCC1) were genotyped by polymerase
13
chain reaction and restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP). Results:
14
Genotype frequencies of were similar between cases and controls: XRCC7 (G→C): GG
15
(11,7%), GC (41,6%), CC (46,8%) in cases vs. GG (20,5%), GC (41,1%), CC (38,4%)
16
controls (p=0,31); ERCC1 (C→T): CC (39,0%), CT (51,9%), TT (9,1%) in cases and CC
17
(53,4%), CT (38,4%), TT (8,2%) in controls (p=0,20); XPC (A→C): AA (50,6%), AC
18
(41,6%), AA (7,8%) in cases and AA (45,2%), AC (37,0%), CC (17,8%) in controls,
19
(p=0,19). No association of XPC, ERCC1 or XRCC7 and cervical cancer was found, and none
20
of the 3 SNPs influenced the risk of cervical cancer in our study. Conclusion: Our results
21
showed that there were no correlations between the genetic variations in DNA repair genes
22
and the susceptibility to cervical carcinoma in the studied population.
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INTRODUCTION
26
27
Cervical cancer is one of the most frequent cancers in women. It is well established that the
28
human papillomavirus (HPV) is imputed as a prime etiologic factor of cervical carcinoma and
29
its precursor lesion, cervical intraepithelial neoplasia (CIN). Around 30% of women with
30
sexual experience are infected with high-risk HPV. However, only 1% of these women will
31
develop CIN and cervical carcinoma. This indicates that HPV infection is not sufficient to
32
develop CIN or cancer, and other cofactors, such as polymorphisms in DNA repair genes,
33
should be considered [1].
34
DNA repair genes play a key role in maintaining genomic stability and integrity. It is now
35
thought that an individual’s DNA repair capacity is genetically determined, and is the result
36
of a combination of multiple genes that display subtle differences in their activity. Single
37
nucleotide polymorphisms (SNPs) may cause subtle structural alterations in repair enzymes,
38
and subsequent modulation of cancer susceptibility. In humans, more than 100 genes are
39
involved in the 5 major DNA repair pathways, including nucleotide excision repair (NER)
40
and homologous recombinational repair [2].
41
A number of SNPs in DNA repair genes have been identified. Defects in DNA repair
42
pathways are found to be associated with many types of cancer, including cervical carcinoma
43
[3]. The X-ray repair cross-complementing group 7 (XRCC7) gene encodes the catalytic
44
subunit of a DNA-activated protein kinase, which is involved in the nonhomologous end
45
joining repair pathway in murine cells and humans. Defects in the XRCC7 gene make the
46
DNA-activated protein kinase activity undetectable in murine mutants and these cells
47
sensitive to ionizing radiation [4].
48
Xeroderma pigmentosum complementation group C, also known as XPC, is a protein which
49
in humans is encoded by the XPC gene. XPC us involved in the recognition of bulky DNA
2