Universidade Estadual Paulista“Júlio de Mesquita - FCFAR

Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara
Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas
Syngonanthus nitens (Bong.) Ruhland: Caracterização biológica e
prospecção terapêutica do extrato metanólico incorporado ou não
em sistema nanoestruturado para aplicação no tratamento da
candidíase vulvovaginal.
Matheus Aparecido dos Santos Ramos
Profa. Dra. Taís Maria Bauab
Orientadora
Araraquara
2015
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara
Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas
Syngonanthus nitens (Bong.) Ruhland: Caracterização biológica e
prospecção terapêutica do extrato metanólico incorporado ou não
em sistema nanoestruturado para aplicação no tratamento da
candidíase vulvovaginal.
Matheus Aparecido dos Santos Ramos
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciências Farmacêuticas, Área
de Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos e
Medicamentos, da Faculdade de Ciências
Farmacêuticas, UNESP, como parte dos
requisitos necessários para a obtenção do Título
de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Profa. Dra. Taís Maria Bauab
Orientadora
Araraquara
2015
Dedicatória
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Dedicatória
Aqui quero dedicar não só este trabalho, mas todas as lutas, todas as
glórias e todo meu amor à mulher que representa o mais belo dos
sentimentos, o amor. Quero dedicar todos os sorrisos, todas as bênçãos e
tudo que ainda está por vir. Dedico este trabalho a mais guerreira de todas
as mulheres, a mais sensata e a mais humana que já conheci. Aquela que
consegue olhar no fundo dos meus olhos e ver além daquilo que é
transparecido. Com muito amor no coração e em minha alma, digo com
toda certeza do mundo que tudo isso é para você minha MÃE (Fátima
Ramos), e aproveito para agradecer a Deus me dar o privilégio de me fazer
seu filho.
Eu amo você mamãe!!!
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Matheus Ap. Santos Ramos
Agradecimento Especial
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Agradecimento especial
Repleto de uma emoção sem tamanho sentida ao escrever este
agradecimento, quero dizer que hoje eu acredito com toda a certeza do
mundo que existem anjos sem asas que habitam a terra, anjos que fazem
dos nossos dias mais intensos, mais produtivos e cheios de vitórias.
Aqui quero deixar toda minha gratidão a peça chave deste trabalho,
a mulher responsável por todo meu crescimento profissional e pessoal,
simplesmente por me fazer crescer mais e mais a cada dia, além disso,
aquela que representa o meu espelho de um profissional do futuro. Com um
imenso respeito e admiração agradeço a minha orientadora (professora,
amiga...mãe), Profa. Dra. Taís Maria Bauab, que desde o primeiro dia me
aceitou não só como mais um orientado, mas como um merecedor de tudo
aquilo que me proporcionou e continua me proporcionando a cada dia.
É quase impossível descrever toda gratidão que sinto, uma vez que
neste trabalho estão minhas lutas, glórias e desejos, mas apesar de tudo isso
existe algo maior, algo que me impulsionou a enxergar além daquilo que se
pode ver, sendo assim, este trabalho representa o sonho da minha vida,
aquilo que dá essência a todos os dias de luta e perseverança e nada disso
teria acontecido sem uma sábia orientação amor e confiança.
Deixo o meu muito obrigado a esta profissional que abriu todas as
portas e deu todas as possibilidades para tornar meu sonho realidade.
Obrigado por me fazer um aluno melhor a cada dia e sempre confiar
naquilo que faço.
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Matheus Ap. Santos Ramos
Agradecimentos
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Agradecimentos
Acredito que ninguém consegue nada sozinho. Todas as conquistas
são acompanhadas de pessoas que contribuem para sua concretização,
sejam elas de maneira direta ou indireta. Aqui quero agradecer todas as
pessoas que fizeram do meu sonho a realidade que vivo hoje!
Dou início agradecendo toda proteção espiritual e tudo que sou.
Virtudes oriundas de três elementos muito importantes em minha vida, Deus,
Jesus Cristo e Nossa Senhora de Aparecida. Obrigado por sempre estarem
presentes em todos os momentos me dando coragem e força para não
desistir daquilo que sempre acreditei e alimentei em meu coração.
Agradeço as quatro partes que compõem o meu coração e minha alma...
(1) A minha mãe Fátima Ramos por todo amor, amizade e compreensão.
Novamente repito, você é a luz da minha vida e a força que me leva além
daquilo que eu posso ver e imaginar. Amo-te mais que a mim mesmo.
(2) Ao meu pai Edivaldo Ramos, aquele que acredito ser o responsável por
toda minha garra e determinação, uma vez que geneticamente transferiu
isso a mim. Obrigado pelo apoio e respeito ao meu sonho.
(3) A minha irmã, Natalia Ramos, por sempre estar ao meu lado e dar conta
do recado perante toda a minha ausência. Obrigado por ser quem é e por
dar sentido a minha vida. Obrigado por fazer parte da minha história e do
meu dia a dia. Não consigo imaginar um futuro sem você por perto, sendo
assim,
te
levo
sempre
comigo
ande
quer
que
eu
vá.
Amo-te
incondicionalmente.
(4) Ao meu sobrinho Pedro Henrique Ramos Araújo, que banhado de
inocência de criança me traz força para querer ainda mais alcançar todos
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Matheus Ap. Santos Ramos
Agradecimentos
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os meus objetivos. O futuro nos pertence meu anjinho e o titio sempre estará
lutando por você. Amo você meu pedacinho de chão.
Aos meus avós José Joaquim Santos e Matilde Santos. O amor e
simplicidade de vocês me dão força para crescer e lutar por aquilo que
quero. Amo cada um de vocês da forma mais bonita e transparente que
existe.
Ao meu avô Guilhermino Ramos (in memorian), que aonde quer que
esteja me transmite a certeza da sua proteção e amor em todos os
momentos. Tantos anos se passaram e sua presença ainda é constante na
minha vida e sei que me protege de todos os perigos e me dá forças para
buscar tudo aquilo que almejo. Saudades do seu carinho!
Agradeço com o coração repleto de amor e extrema gratidão a
pessoa que me mostrou que eu sou capaz de fazer tudo o que faço. A
pessoa que me olhou nos olhos e disse “vai, você é capaz e tem potencial”,
aquela que sempre está ao meu lado em todos os momentos e todas as
ocasiões, que dança, ri, chora e sofre comigo. Todo o meu agradecimento a
você, Luciani Gaspar de Toledo, minha amiga, irmã de alma e minha
protetora incondicional. Obrigado por sempre estar presente e fazer essa
caminhada algo mais fácil, com mais sentido. Obrigado por permanecer
firme na nossa promessa de nunca nos separarmos por onde quer que
qualquer um esteja. Agradeço-te não só por ser quem é, mas por me deixar
fazer parte da sua vida e partilharmos juntos os mesmos sonhos. Amo você
minha loirinha.
Ao meu amigo, companheiro e inseparável parceiro Felipe Guioti que
tem um papel de extrema importância na minha vida e no meu dia a dia.
Obrigado por estar sempre comigo, por partilhar meus problemas e
simplesmente por ser assim como é. Acredito que aqui não conseguirei
explicar a dimensão do que você representa para mim, mas tenha certeza
de uma coisa, você fez e faz toda diferença na minha vida.
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Matheus Ap. Santos Ramos
Agradecimentos
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Ao meu primo e melhor amigo, Robson Zanovello simplesmente por ser
parte de mim e meu porto seguro. Obrigado por todo amor, todo carinho e
companheirismo de sempre. Amo você!
À Profa. Dra. Margarete Teresa Gottardo de Almeida simplesmente por
ter sido a primeira a acreditar na minha capacidade e me dar a
oportunidade de mostrar aquilo que eu sou e posso ser ao me receber em
seu laboratório. Agradeço-a de todo o meu coração por sempre estar
disposta a ajudar e contribuir para o meu conhecimento profissional.
Aos integrantes do “quinteto fantástico”, meus amigos de infância, de
longas datas e que sempre estão ao meu lado mesmo com toda distância e
ausência: Ana Paula Barreto, Giovani Jacomini, Amábili Souza e Bruno
Pelegrini. Sem o apoio, amizade e amor de todos vocês essa jornada seria
muito mais difícil e cheia de saudade. Amo vocês de uma forma
inexplicável.
Na mesma intensidade que acima descrevi, agradeço minha amiga e
mãe postiça Silvana Barreto (Balaco), por sempre me receber com um sorriso
no rosto e fazer de todas as minhas voltas para casa muito mais especiais.
Aos amigos que conquistei ao longo desta caminhada: Sérgio
Muknicka (Celini), Leandro Lopes (Lebito), Camila Benjamim, Fábio Garcia,
Hércules Dias, Carlos Eduardo Brantis (MK) e Alex Canavesi,. Vocês fizeram e
fazem toda diferença todos os dias. Obrigado pelo carinho e todos os finais
de semana rindo e curtindo juntos. Cada um tem um significado muito
importante para mim.
A Larissa Sposito (Laruxa), que em tão pouco tempo já tem um espaço
todo especial dentro do meu coração. Obrigado por tudo que sempre está
disposta a fazer por mim.
Um grande obrigado a todos os funcionários do Departamento de
Ciências Biológicas (DCB) da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de
Araraquara (minha morada), em especial à equipe técnica da disciplina
microbiologia, Ednéia, Débora, Marisa e Silvia, por sempre estarem dispostas
a ajudar e dar todo suporte necessário.
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Matheus Ap. Santos Ramos
Agradecimentos
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A toda equipe do meu local de trabalho, segunda casa e meu lugar
predileto de Araraquara, “Laboratório de Fiosiologia de Micro-organismos”.
Cada um de vocês (Bruna Bonifácio, Kamila Negri, Victor Lucena (Mano),
Angélica Dias (Anchélica), Felipe Hilário (Fililipinho), Patricia Bento, Isadora
Masiero, Raquel Martins (Rouge), Maria Luiza Duarte (Malu), Erina Samezima,
Tais Jovenazzo, Beatriz Souto, Julia Hunger e a mais nova integrante Larissa
Sposito) tem uma grande contribuição em tudo o que foi feito até agora,
agradeço-os
de
todo
o
meu coração.
Obrigado
pelas
amizades,
brincadeiras e por me deixarem fazer parte do dia a dia de vocês.
A toda equipe do Laboratório de Microbiologia da Faculdade de
Medicina de São José do Rio Preto-FAMERP, meu primeiro contato com a
pesquisa. Natália Seron, Eduardo Reis, Mayara Gambellini, Mayra Arroyo e
Luis Paulo Teixeira, obrigado por me ajudar a dar os primeiros passos e fazer
da minha iniciação científica uma das melhores épocas da minha vida. Na
mesma intensidade de amor, quero agradecer a super técnica deste
laboratório, Luceli Ferreira. Obrigado por sempre estar disposta a ajudar
quem quer que seja e por ter pegado na minha mão a primeira vez que eu
entrei no laboratório, você foi uma peça indispensável para o início da
minha jornada.
A todos os amigos do Laboratório de Micobacteriologia da FCFAR,
Érica Lopes, Leonardo Marinho, Paula Souza, Isabel Silva, Joas Silva, Camila
Maringolo, Débora e Cesar (mini), por partilharem de um companheirismo
saudável e cheio bons momentos. Agradeço também ao responsável pelo
laboratório, Prof. Dr. Fernando Pavan por toda prestatividade para a
realização dos ensaios de citotoxicidade.
A
doutoranda
Giovana
Calixto
por
toda
ajuda
com
o
desenvolvimento farmacotécnico deste trabalho. Obrigado por me dar todo
o suporte e prestatividade de sempre.
Agradeço ao Prof. Dr. Marlus Chorilli por me dar a chance de trabalhar
sob sua supervisão na área de nanotecnologia farmacêutica, além de
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Matheus Ap. Santos Ramos
Agradecimentos
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sempre estar disponível para ajudar em tudo que fosse necessário. Obrigado
por me dar a chance de continuar nesta área durante o meu doutorado.
À Profa. Dra. Lourdes Campaner dos Santos pela doação da planta
para que este trabalho pudesse ser realizado.
Agradeço a secretária do DCB Margarete Rossi, não só por sempre
estar disposta a me ajudar em tudo o que for preciso e também pela sua
risada contagiante e cheia de alegria, mas também por ter se tornado uma
amiga, a qual tenho muito estima e quero que esteja sempre comigo.
Marga, você fez toda a diferença nestes anos.
A Joselma Duque (Jojoca), técnica do Laboratório de Saúde Pública,
por todo carinho e amor que sempre teve comigo e com todos os que estão
ao seu redor. Nossos almoços ao seu lado são inigualáveis!
Com muito carinho agradeço a toda equipe da limpeza da FCFAR,
em especial, agradeço as funcionárias Nice e Edna por sempre cuidarem
muito bem não só do meu local de trabalho, mas por se importarem comigo
e transmitir a mim um amor puro e livre de pretensões. Amo vocês meninas!
Às meninas da portaria, Olivia e Tiana, por sempre me receberem com
um sorriso no rosto desejando coisas boas para o dia.
Ao Prof. Dr. Leonardo Gorla, que mesmo ausente do laboratório tem
colaborado para o meu crescimento profissional.
Ao Prof. Dr. Marcelo Araújo por todo suporte para o desenvolvimento
dos ensaios in vivo.
Às meninas da seção técnica de Pós-graduação, Claudia, Joyce,
Daniela e Flávia, agradeço por toda a prestatividade de sempre. Vocês são
demais.
A todos da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de AraraquaraUNESP/FCFAR.
A biblioteca da FCFAR pela disponibilidade de ajuda nas correções
das referências bibliográficas desta dissertação.
A CAPES pelo auxílio financeiro concedido.
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Matheus Ap. Santos Ramos
RESUMO
O uso indiscriminado e generalizado de drogas antifúngicas levou a um rápido
desenvolvimento de cepas resistentes aos medicamentos empregados na
terapêutica clínica, caracterizando-se como a principal causa de inúmeros casos de
inadequação do pacienta à terapia medicamentosa disponível. Os produtos naturais
vêm ganhando destaque nos últimos anos por fornecer uma nova abordagem
medicamentosa para o tratamento de processos patológicos, dentre esses, os
infecciosos. No decorrer da evolução genética e fisiológica dos micro-organismos, as
ciências microbiológicas encontram-se em expansão, preocupando-se em introduzir
novas triagens terapêuticas frente às afecções fúngicas, com especial atenção
àquelas adquiridas por espécies do gênero Candida. Isto se deve das Candidas
serem as leveduras mais frequentemente envolvidas nas infecções micóticas
capazes de causar dano ao organismo humano, como a candidíase vulvovaginal. O
uso de produtos naturais na descoberta de novos antifúngicos mostra-se de extrema
importância, a exemplo, destaca-se a espécie Syngonanthus nitens que vem se
mostrando ativa na descoberta do potencial antifúngico contra Candida spp. A
nanotecnologia farmacêutica apresenta-se como uma importante ferramenta para
aprimorar a biodisponibilidade de produtos de origem natural, ao oferecer sistemas
de liberação de fármacos modernos como os sistemas precursores de cristais
líquidos mucoadesivos (SPCLM) empregados para veiculação de extratos vegetais.
As plantas pertencentes a família Eriocaulaceae mostram-se promissoras na
atividade antifúngica, o que instiga o aprofundamento destas investigações, assim
como a descoberta de novos métodos de aplicabilidade. Frente ao atual cenário,
este trabalho teve o objetivo de avaliar o potencial antifúngico do extrato metanólico
de escapos de Syngonanthus nitens incorporado e não incorporado em SPCLM
voltado ao tratamento da candidíase vulvovaginal. O estudo foi desenvolvido
aplicando-se metodologias in vitro e in vivo para elucidar o perfil antifúngico
pretendido, tendo-se obtidos resultados satisfatórios no que se diz respeito à
aplicabilidade do mesmo no tratamento e prevenção da CVV. Nos resultados foram
observados que o extrato vegetal mostrou-se ativo contra todas as cepas
empregadas no estudo além de mostrar-se satisfatório nos testes biológicos
realizados, todavia, apresentou ação superior quando foi incorporado no sistema de
liberação de fármacos, mostrando que a incorporação no sistema apresenta
vantagens em relação ao extrato na forma não incorporada. Como conclusão,
observou-se que o extrato é ativo contra as espécies de Candida, além de que a
incorporação do mesmo no SPCLM desenvolvido potencializou suas propriedades
antifúngicas, uma vez que foi evidenciado aumento da atividade sobre todas as
linhagens de Candida analisadas, além disso, pode-se concluir que o sistema pode
ser um importante veículo para aplicação de princípios ativos por via intravaginal.
Palavras-chave:; Syngonanthus nitens; Candida sp.; Candidíase vulvovaginal;
Nanotecnologia farmacêutica; Sistema precursor de cristais líquidos mucoadesivos.
ABSTRACT
The indiscriminate and widespread use of antifungal drugs with potential led to a
rapid development of resistant strains to drugs used in clinical, therapeutic and this is
characterized as the main cause of numerous cases of inappropriate patient to drug
therapy available. Natural products have been gaining prominence in recent years for
providing a new drug therapy for the treatment of pathological processes, among
these, infectious. During the genetic and physiological evolution of micro-organisms,
microbiological sciences are expanding, worrying to introduce new therapeutic trials
ahead to fungal diseases, with special attention to those acquired by Candida
species, this being one of yeasts more often involved in mycotic infections can cause
harm to human body, such as vulvovaginal candidiasis. The use of natural products
in the discovery of new antifungal is extremely important, the example, is the
Syngonanthus nitens species (gold grass) that has proved active in the discovery of
antifungal potential against Candida spp. The pharmaceutical nanotechnology
presents itself as an important tool to improve the bioavailability of natural product
origin, offering modern drug release systems as precursors of mucoadhesive liquid
crystal systems (PMLCS) employees for placement of plant extracts. The plants
belonging to family Eriocaulaceae show promise in antifungal activity, which
encourages the deepening of these investigations, as well as the discovery of new
methods of applicability. Front of the current scenario, this work aimed to evaluate the
antifungal potential of the methanol extract of Syngonanthus nitens scapes
incorporated and not incorporated in PMLCS focusing on the treatment of
vulvovaginal candidiasis. The study was conducted by applying in vitro and in vivo
antifungal methods intended to elucidate the profile, having obtained satisfactory
results as regards the applicability thereof in the treatment and prevention of VVC.
The results were observed that the herbal extract was shown to be active against all
strains used in the study as well as prove satisfactory in biological tests, in addition to
presenting top action when it was incorporated into the drug delivery system. In
conclusion, it was observed that the extract is active against Candida species,
besides the incorporation of even PMLCS developed improved its antifungal
properties, since an improvement in activity was observed in all the strains of
Candida analyzed further , one can conclude that the system can be an important
vehicle for the application of active ingredients intravaginally
Keywords: Syngonanthus nitens; Candida species; Vulvovaginal candidiasis;
Pharmaceutical Nanotechnology; Precursor mucoadhesive liquid crystal systems
Lista de Figuras
Figura 1. Fotomicrografia de C. albicans (8500x) .................................................................. 29
Figura 2. C. krusei observada sob microscopia óptica (100x)................................................ 30
Figura 3. Fotomicrografia de Candida glabrata (8500x) ......................................................... 32
Figura 4. C. tropicalis observada sob microscopia óptica (100x) ........................................... 33
Figura 5. C. parapasilosis observada por microscopia óptica (100x)..................................... 35
Figura 6. Estruturas de naftopiranonas e xantonas comuns em plantas da .......................... 44
Figura 7. Syngonanthus nitens (Bong.) Ruhlland – “capim dourado” .................................... 45
Figura 8. Artesanato produzido com os escapos de S. nitens ............................................... 46
Figura 9. Representação esquemática o arranjo dos cristais líquidos em função da ........... 54
Figura 10. Constituintes do SPCLM ........................................................................................ 65
Figura 11.Ensaio de microdiluição com levedura revelado com TCC.................................... 70
Figura 12. Reação de oxidação do TTC ................................................................................. 71
Figura 13. Ensaio do biofilme in vitro revelado com XTT ....................................................... 73
Figura 14.Reação de redução do XTT .................................................................................... 74
Figura 15. Diagrama de fases pontual do SPCLM constituído de AO (fase oleosa), PRO
(tensoativo) e DP (fase aquosa). ............................................................................................. 83
Figura 16. Fotomicrografia do ensaio com MVA por microscopia de luz polarizada sob
aumento de 20x ........................................................................................................................ 87
Figura 17. Formulações submetidas à análises reológicas contínuas ................................... 87
Figura 18. Reograma da formulação 25 (F25)........................................................................ 88
Figura 19. Reograma da formulação 26 (F26)........................................................................ 88
Figura 20. Trabalho da força bioadesiva................................................................................. 90
Figura 22. Trabalho da força mucoadesiva F26 ..................................................................... 91
Figura 23. Força mucoadesiva de F26..................................................................................79
Figura 24. Formulação 25* com o extrato incorporado ......................................................... 92
Figura 25. Formulação 26* com o extrato incorporado .......................................................... 92
Figura 26. Formulação 25 antes e após a incorporação do extrato ....................................... 92
Figura 27. Formulação 26 antes e após a incorporação do extrato ....................................... 93
Figura 28. Fotomicrografia de 12 horas do ensaio de inibição de hifa de C. albicans (ATCC
10231) realizado com o extrato de S. nitens não incorporado sob aumento de 40X ............. 97
Figura 29. Fotomicrografia de 24 horas do ensaio de inibição de hifa de C. albicans (ATCC
10231) realizado com o extrato de S. nitens não incorporado sob aumento de 40X ............. 97
Figura 30. Fotomicrografia de 12 horas do ensaio de inibição de hifa de C. albicans (ATCC
10231) realizado com o extrato de S. nitens incorporado no SPCLM sob aumento de 40X . 98
Figura 31. Fotomicrografia de 24 horas do ensaio de inibição de hifa de C. albicans (ATCC
10231) realizado com o extrato de S. nitens incorporado no SPCLM sob aumento de 40X . 98
Figura 32. Time kill de C. albicans ATCC 10231………………..…………………………....…90
Figura 33. Time kill de C. albicans CAV 3............................................................................. 102
Figura 34. Time kill de C. krusei ATCC 6258.........................................................................91
Figura 35. Time kill de C. krusei CKV 3………………..……………………………………...…91
Figura 36.Time kill de C. glabrata ATCC 2001 ……………………..…………………………..91
Figura 37. Time kill de C. glabrata CGV 3 ............................................................................ 103
Figura 38.Time kill de C. tropicalis ATCC 750.......................................................................92
Figura 39. Time kill de C. tropicalis CTV 2.............................................................................92
Figura 40.Time kill C. parapsilosis ATCC22019……………..…………………………………..92
Figura 41. Time kill C. parapsilosis ....................................................................................... 104
Figura 42. Células do epitélio vaginal dos animais do ensaio anti-CVV com a cepa .......... 105
Figura 43. Células do epitélio vaginal dos animais do ensaio anti-CVV com a cepa .......... 106
Figura 44. Lavados vaginais do ensaio anti-CVV com a cepa ATCC após dois ................. 106
Figura 45. Lavados vaginais do ensaio anti-CVV com a cepa CAV 3 após dois................. 107
Figura 46. Comportamento dos grupos experimentais do ensaio terapêutico de CVV in vivo
com a cepa ATCC 10231 ....................................................................................................... 107
Figura 47. Comportamento dos grupos experimentais do ensaio terapêutico de CVV in vivo
com a cepa CAV 3.................................................................................................................. 108
Figura 48. Comportamento dos grupos experimentais do ensaio de profilaxia ................... 111
Lista de Tabelas
Tabela 1. Relação de cepas clínicas de Candida sp. ............................................................. 63
Tabela 2. Cepas fúngicas e concentração dos extratos usados no ensaio de time kill ........ 75
Tabela 3. Grupos experimentais e tratamentos do ensaio de tratamento da CVV causada
por C. albicans. ......................................................................................................................... 78
Tabela 4. Considerações gerais dos grupos experimentais do ensaio profilático ................. 80
Tabela 5. Formulações analisadas por MLP ........................................................................... 84
Tabela 6. Resultados da microscopia de luz polarizada para a avaliação do comportamento
precursor de cristais líquidos da formulação 25 ...................................................................... 85
Tabela 7. Resultados da microscopia de luz polarizada para a avaliação do comportamento
precursor de cristais líquidos da formulação 26 ...................................................................... 86
Tabela 8. Comportamento de fluxo (n) e índice de consistência (K) das formulações em
contato com MVA ..................................................................................................................... 89
Tabela 9. Comportamento de fluxo (n) e índice de consistência (K) das formulações sem a
adição de MVA ......................................................................................................................... 90
Tabela 10. Concentração inibitória mínima do extrato metanólico de escapos de S. nitens
não incorporado e incorporado no SPCLM frente a C. albicans ............................................. 93
Tabela 11. Concentração inibitória mínima do extrato metanólico de escapos de S. nitens
não incorporado e incorporado no SPCLM frente a C. krusei................................................. 94
Tabela 12. Concentração inibitória mínima do extrato metanólico de escapos de S. nitens
não incorporado e incorporado no SPCLM frente a C. glabrata ............................................. 94
Tabela 13. Concentração inibitória mínima do extrato metanólico de escapos de S. nitens
não incorporado e incorporado no SPCLM frente a C. tropicalis ............................................ 94
Tabela 14. Concentração inibitória mínima do extrato metanólico de escapos de S. nitens
não incorporado e incorporado no SPCLM frente a C. parapsilosis ....................................... 95
Tabela 15. Resultados da análise de citotoxicidade in vitro ................................................... 96
Tabela 16. Resultados da avaliação do perfil de inibição hifal exercido pelo extrato de S.
nitens não incorporado sobre C. albicans (ATCC 10231) ....................................................... 96
Tabela 17. Resultados da avaliação do perfil de inibição hifal exercido pelo extrato de S.
nitens incorporado no SPCLM sobre C. albicans (ATCC 10231) ........................................... 98
Tabela 18. Controles e ação do extrato não incorporado e incorporado no SPCLM frente aos
biofilmes de C. albicans ........................................................................................................... 99
Tabela 19. Controles e ação do extrato não incorporado e incorporado no SPCLM frente aos
biofilmes de C. krusei ............................................................................................................. 100
Tabela 20. Controles e ação do extrato não incorporado e incorporado no SPCLM frente aos
biofilmes de C. glabrata .......................................................................................................... 100
Tabela 21. Controles e ação do extrato não incorporado e incorporado no SPCLM frente aos
biofilmes de C. tropicalis ........................................................................................................ 101
Tabela 22. Controles e ação do extrato não incorporado e incorporado no SPCLM frente aos
biofilmes de C. parapsilosis .................................................................................................... 101
Tabela 23. Número de animais infectados e quantificação da carga fúngica em todos os
animais do ensaio experimental ............................................................................................. 110
Tabela 24. Número de animais infectados e quantificação da carga fúngica em todos os
grupos do ensaio experimental .............................................................................................. 113
Lista de abreviaturas e siglas
AO- Ácido Oleico
ASD- Ágar Sabouraud Dextrose
ASD+clo- Ágar Sabouraud Dextrose acrescido de cloranfenicol
ATCC- Americam Type Culture Collection
CE- Campo escuro
CEUA- Comitê de Ética do Uso de Animais
CFM- Concentração Fungicida Mínima
CIM- Concentração Inibitória Mínima
CL- Cristal Líquido
CLL- Cristais líquidos Liotrópicos
CLSI- Clinical Laboratory Standart Institute
CLT- Cristais Líquidos Termotrópicos
CM- Cruz de Malta
CP C974P- Carbopol®
CP- ciclofosfamida
CSD- Caldo Sabouraud Dextrose
CVV- Candidíase Vulvovaginal
CVVR- Candidíase Vulvovaginal Recorrente
DMSO- Dimetilsulfóxido
DP- Dispersão Polimérica
E- Estrias
E+CM- Estrias com Cruz de Malta
FA- Fase Aquosa
FO- Fase Oleosa
HPV- Human Papiloma Virus
MLP- Microscopia de Luz Polarizada
MOPS-Ácido 3-[N-morfino] propanossulfônico
MVA- Muco Vaginal Artificial
OMS- Organização Mundial da Saúde
PBS- Phosphate Buffered Saline (Tampão Fosfato de Sódio)
PP- Policarbofil®
PRO- Procetyl® AWS
RPMI 1640- Roswell Park Memorial Institute medium
SIDA- Síndrome de Imunodeficiência Adquirida
SLC- Sistema Líquido Cristalino
SLT- Sistema Líquido Transparente
SLTr- Sistema Líqiuido Translúcido
SPCL- Sistema Precursor de Cristais Líquidos
SPCLM- Sistema Precursor de Cristais Líquidos Mucoadesivos
SUS- Sistema Único de Saúde
SVO- Sistema Viscoso Opaco
SVT- Sistema Viscoso Transparente
SVTr- Sistema Viscoso Translúcido
T- Tensoativo
TTC- Cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio
UFC- Unidade Formadora de Colônia
UFC/mL- Unidade Formadora de Colônia por mililitro
VB- Vaginose Bacteriana
XTT- 2,3-bis (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil) -5- [carbonilo (fenilamino)]-2H-tetrazóliohidróxido
Sumário
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 20
2. REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................ 24
2.1. Principais doenças infecciosas vaginais ............................................................ 24
2.1.2. Candidíase vulvovaginal ................................................................................ 25
2.1.2.1. Principais espécies de Candida envolvidas na candidíase vulvovaginal ..... 27
2.1.2.1.1. Candida albicans (C. albicans) ................................................................. 28
2.1.2.1.2. Candida krusei (C. krusei) ........................................................................ 29
2.1.2.1.3. Candida glabrata (C. glabrata) ................................................................. 31
2.1.2.1.4. Candida tropicalis (C. tropicalis) ............................................................... 32
2.1.2.1.5. Candida parapsilosis (C. parapsilosis) ...................................................... 34
2.1.2.2. Principais fatores de virulência de Candida spp. ......................................... 35
2.2. Plantas medicinais e Fitoterápicos .................................................................... 37
2.2.1. Produtos naturais como novos agentes antimicrobianos ................................ 40
2.2.3. A família Eriocaulaceae .................................................................................. 43
2.2.3.1. O gênero Syngonanthus............................................................................. 44
2.2.3.1.1. Syngonanthus nitens (Bong.) Rulland ...................................................... 44
2.2.3. Determinação da atividade antimicrobiana de produtos naturais .................... 47
2.2.4. Ensaios experimentais in vivo de candidíase vulvovaginal ............................. 48
2.3. Nanotecnologia farmacêutica como ferramenta para o aprimoramento de
princípios bioativos naturais ..................................................................................... 50
2.3.1. Sistemas líquido-cristalinos ............................................................................ 53
3. OBJETIVOS ......................................................................................................... 60
3.1. Objetivo geral .................................................................................................... 60
3.2. Objetivos específicos ........................................................................................ 60
4. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 62
4.1 Procedência e preparação do extrato vegetal .................................................... 62
4.2. Cepas fúngicas ................................................................................................. 63
4.2.1. Preparo das suspensões fúngicas .................................................................. 64
4.3. Desenvolvimento do sistema precursor de cristais líquidos mucoadesivos
(SPCLM) .................................................................................................................. 64
4.3.1. Elaboração do diagrama de fases ternário ..................................................... 65
4.3.1.1. Análise por microscopia de luz polarizada (MLP) ........................................ 66
4.3.1.2. Seleção das formulações para análises farmacotécnicas e biológicas ........ 66
4.3.1.3. Ensaio do efeito muco nos sistemas ........................................................... 66
4.3.1.4. Análises reológicas contínuas (curva de fluxo) ............................................ 67
4.3.1.5. Avaliação in vitro da força mucoadesiva...................................................... 68
4.3.2. Incorporação do extrato vegetal no SPCLM ................................................... 68
4.4. Ensaios antifúngicos in vitro .............................................................................. 69
4.4.1. Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) ................................. 69
4.4.1.1. Determinação da concentração fungicida mínima (CFM) ............................ 69
4.4.1.2. Leitura com revelador .................................................................................. 70
4.4.3. Análise citotóxica in vitro ................................................................................ 71
4.4.4. Análise do perfil inibitório sobre a formação de hifas em C. albicans ............. 72
4.4.5. Formação de biofilme in vitro ......................................................................... 72
4.4.6. Ensaio Time kill .............................................................................................. 74
4.5. Ensaios experimentais de CVV in vivo .............................................................. 75
4.5.1. Ensaio terapêutico experimental in vivo de CVV causada por C. albicans ..... 76
4.5.1.1. Grupos experimentais e tratamento terapêutico .......................................... 77
4.5.1.2. Análise da eficácia do tratamento ................................................................ 78
4.5.1.3. Análise da recidiva de infecção e eutanásia ................................................ 79
4.5.1.4. Análises estatísticas .................................................................................... 79
4.5.2. Ensaio in vivo de profilaxia de CVV causada por C. krusei ............................ 79
5. RESULTADOS ..................................................................................................... 83
5.1. Desenvolvimento do sistema precursor de cristais líquidos mucoadesivos ....... 83
5.1.1. Elaboração do diagrama de fases ternário ..................................................... 83
5.1.1.1. Microscopia de luz polarizada (MLP) ........................................................... 84
5.1.2. Escolha da formulação para análises farmacotécnicas e biológicas ............... 84
5.1.3. Ensaio de efeito muco nos sistemas .............................................................. 85
5.1.4. Análises reológicas contínuas (Curva de fluxo) .............................................. 87
5.1.5. Avaliação in vitro da força mucoadesiva (mucoadesão) ................................. 90
5.1.6. Incorporação do extrato vegetal no SPCLM ................................................... 91
5.2. Análises antifúngicas in vitro ............................................................................. 93
5.2.1. Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) ................................. 93
5.2.2. Determinação da concentração fungicida mínima (CFM) ............................... 95
5.2.3. Análise citotóxica in vitro ................................................................................ 96
5.2.4. Análise do perfil inibitório sobre a formação de hifas em C. albicans ............. 96
5.2.5. Ensaio de inibição do biofilme in vitro ............................................................. 99
5.2.6. Ensaio Time kill ............................................................................................ 102
5.3. Análises antifúngicas in vivo............................................................................ 105
5.3.1. Ensaio terapêutico de CVV causada por C. albicans ................................... 105
5.3.2. Ensaio profilático de CVV causada por C. krusei ......................................... 111
6. DISCUSSÃO ...................................................................................................... 115
7. CONCLUSÃO .................................................................................................... 146
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................... 148
9. Anexos ............................................................................................................... 166
__________________________________________________
1. Introdução
Não faças de ti um sonho a realizar. Vai. Sem caminho marcado.
Tu és o de todos os caminhos.
(Cecília Meireles)
__________________________________________________
Matheus Aparecido dos Santos Ramos
Introdução 20
__________________________________________________
1. INTRODUÇÃO
Dentre os micro-organismos responsáveis por promover estados patológicos
que levam ao declínio da saúde humana, encontra-se àqueles pertencentes ao
gênero Candida, estando associados a casos de infecções superficiais, profundas e
sistêmicas, com destaque aos portadores de doenças de base como o diabetes, e
também em imunossuprimidos, neutropênicos e transplantados. (KIM e SUDBERY,
2011). A patogenicidade das espécies de Candida envolve mecanismos atribuídos
aos fatores de virulência, como a capacidade de se defender do sistema imunológico
do hospedeiro, aderência, formação de biofilme em tecidos ou em dispositivos
médicos, e produção de enzimas hidrolíticas prejudiciais como proteases,
fosfolipases e hemolisina (SARDI et al., 2013).
Nos últimos anos tem-se observado um expressivo aumento de infecções
fúngicas causadas por espécies não-albicans, como Candida tropicalis, Candida
glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida lusitaniae,
o que se
classifica como um problema, visto que espécies pertencentes a esta classe
apresentam-se, em sua maioria, resistentes aos principais fármacos empregados na
terapêutica clínica (BARBEDO e SGARBI, 2010).
Embora seja um micro-organismo comensal da biota humana, trato
gastrintestinal e mucosas oral e vaginal, a espécie C. albicans apresenta-se como o
principal agente etiológico de doenças fúngicas oportunistas que acometem
mulheres de todas as faixas etárias, principalmente a candidíase vulvovaginal
(CVV), sendo encontrada em 85% a 95% dos casos de infecções. Desordens
vaginais ocasionadas por Candida spp atingem cerca de 70-75% das mulheres
prevalentemente jovens e com idade fértil ao menos uma vez durante a vida. Casos
de recorrência também são observados, classificando-se como o desencadeamento
de quatro ou mais episódios infecciosos durante o ano, necessitando, assim, de
políticas cujas abordagens medicamentosas sejam mais rigorosas e assíduas, nas
quais se observam efeitos colaterais capazes de gerar uma série de desconfortos a
paciente (TIYYAGURA et al., 2013).
A terapia medicamentosa em casos de infecções fúngicas apresenta
limitações, como o alto custo dos fármacos disponíveis na clínica, toxicidade
elevada, interações medicamentosas, biodisponibilidade insuficiente do princípio
ativo e emergência de cepas resistentes (ENDO et al. 2010; TYAGI e MALIK, 2010).
__________________________________________________
Matheus Ap. Santos Ramos
Introdução 21
__________________________________________________
Diversos antifúngicos têm sido indicados no tratamento destas infecções, como os
pertencentes as classes de poliênicos, azólicos, equinocandinas, entre outros,
todavia,
com
o
uso
indiscriminado
destes
antimicrobianos
associado
as
características genéticas e fisiológicas do fungo, nota-se um expressivo aumento do
perfil de resistência aos fármacos integrantes destas classes (CALABRESE et al.,
2013; WEI et al., 2011). Neste sentido, as ciências da saúde têm se preocupado
cada vez mais com o exacerbado crescimento do número de cepas multirresistentes
aos antimicrobianos atualmente empregados na prática clínica, e em decorrencia
deste fato, as plantas medicinais emergem na pesquisa de novos fármacos
antifúngicos,
apresentando
propriedades
bioativas
importantes,
justificada
principalmente pela presença de metabólitos secundários como taninos, flavonoides
e fenóis (CRAGG e NEWMAN, 2013).
Diversas plantas têm sido estudadas a fim de evidenciar o potencial
antimicrobiano. Neste sentido, algumas famílias de espécies vegetais encontram-se
em destaque na área científica, como a Eriocaulaceae. Possui 11 gêneros e
aproximadamente 1400 espécies. A maioria das plantas desta família são
conhecidas como “sempre-vivas” de acordo com o conhecimento popular brasileiro.
Esta denominação é justificada por possuírem escapos inflorescentes que se
mantêm íntegros por longos períodos e devido a isso são utilizados na confecção de
ornamentos decorativos e acessórios (ANDRADE et al., 2010). A maioria das
espécies comercializadas como “sempre vivas” pertencem ao gênero Syngonanthus,
sendo encontradas no Brasil, principalmente nas regiões do estado de Goiás e na
Serra do Jalapão no estado do Tocantins, onde é conhecida como “capim dourado”
(SCHMIDT et al., 2007). A espécie Syngonanthus nitens (Bong.) Ruhland encontrase em expressiva evidência nos últimos anos. Pacífico et al. (2011) ao analisarem os
escapos e capítulos da mesma, encontraram cerca de 17 compostos derivados de
flavonas e apigenina, além de seis moléculas inéditas. Araújo et al. (2013)
detectaram um importante potencial antifúngico presente nos escapos de S. nitens
frente a quatro espécies do gênero Candida, sendo ainda elucidado um importante
perfil terapêutico do composto herbal em questão, quando submetido a modelo
experimental de CVV que confirmou seu potencia anti-Candida.
Embora
a
utilização
de
produtos
naturais
na
triagem
de
novos
medicamentos seja apreciável e de grande importância, algumas desvantagens são
__________________________________________________
Matheus Ap. Santos Ramos
Introdução 22
__________________________________________________
observadas quanto ao desenvolvimento de investigações clínicas e farmacológicas,
como por exemplo, a dificuldade de solubilização da amostra vegetal, e até mesmo
pela baixa disponibilidade naturalmente apresentada pelo composto. Neste sentido,
a nanotecnologia farmacêutica abre novos horizontes na otimização da veiculação
destes compostos, a fim de promover uma melhor interação entre o princípio
medicamentoso com o sítio de ação, visando a eliminação de efeitos colaterais e
otimização do potencial terapêutico (SINGH et al., 2013; BONIFÁCIO et al., 2014).
Ferramentas nanotecnológicas são muito utilizadas no estabelecimento de
plataformas seguras de veiculação de drogas com o objetivo de desenvolver
sistemas de liberação de fármacos, a exemplo encontra-se as microemulsões,
nanopartículas poliméricas, naopartículas lipídicas sólidas, lipossomas, e mais
recentemente, observa-se a utilização de cristais líquidos com a finalidade de
aprimorar a ação terapêutica e seletividade da droga (CHORILLI et al., 2011).
Os sistemas precursores de cristais líquidos mucoadesivos (SPCLM)
classificam-se como uma promissora alternativa no tratamento da candidíase
vulvovaginal. Suas características são interessantes para administração vaginal,
pois podem se apresentar líquidos, facilitando a administração da formulação, por
exemplo, por seringa. Contudo, ao entrar em contato com a mucosa vaginal, o SPCL
tem a capacidade de incorporar água, se tornando uma mesofase líquido-cristalina
mais viscosa, o que pode promover liberação controlada e, consequentemente,
resultar em maior substantividade dos componentes do extrato vegetal (SILVA et al.,
2014).
__________________________________________________
Matheus Ap. Santos Ramos
__________________________________________________
2. Revisão da
Literatura
“Se podemos sonhar, também podemos tornar nossos sonhos realidade”.
(Walt Disney)
__________________________________________________
Matheus Aparecido dos Santos Ramos
Revisão da Literatura
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2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Principais doenças infecciosas vaginais
Em termos gerais, mulheres de todas as faixas etárias estão propensas a
desenvolverem algum tipo de infecção em seu sistema reprodutor, onde fatores
como alterações imunológicas, falta de higiene adequada, aspectos genéticos e
doenças de origem sexualmente transmissíveis caracterizam-se como os fatores
primordiais para o desencadeamento de enfermidades severas que colocam a
saúde da mulher em um elevado grau de risco e complexidade, levando em muitos
casos ao óbito das mesmas (BROCKLEHURST et al., 2013).
As vaginites ocasionadas por micro-organismos são muito comuns, e na
maioria das vezes são estabelecidas após contaminação por protozoários, fungos,
bactérias e até mesmo vírus (CAMARGO et al., 2011)
A vaginite bacteriana (VB) é classificada como uma perturbação da microbiota
vaginal onde os lactobacilos normalmente habitantes comensais da região vaginal
são substituídos por um aumento expressivo de bactérias, como Gardnerella
vaginalis, Mobiluncus sp., e micoplasmas genitais. Em muitos casos a VB
é
caracterizada por um aumento do pH vaginal e também por um elevado aumento do
odor fétido nesta região. As VB podem ser transmitidas sexualmente, todavia
interações imunológicas e contaminações diretas são as mais frequentes (GALLO et
al., 2012).
Outros micro-organismos encontrados em casos de infecções vaginais são
os pertencentes ao gênero Candida. Tratam-se de fungos leveduriformes comensais
da microbiota vaginal que podem desencadear a candidíase vulvovaginal (CVV), que
se caracteriza por inflamação verdadeira de vulva e vagina. (ZIARRUSTA, 2002;
LINHARES et al., 2005; BARBEDO e SGARBI, 2010).
Levando em consideração o elevado patamar em que as doenças de origem
sexualmente transmissíveis se encontram, faz-se notória intensificação de políticas
de controle da proliferação de DSTs em mulheres, visto ao exacerbado número de
casos de estabelecimento de doenças como a sífilis, gonorreia, infecção pelo vírus
papiloma humano (HPV) dentre outros tipos de injúrias originadas por este tipo de
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Matheus Ap. Santos Ramos
24
Revisão da Literatura
__________________________________________________
via de transmissão, podendo desencadear patologias de grande complexidade como
o câncer (WORKOWSKI et al., 2010; SIEGEL, 2012).
2.1.2. Candidíase vulvovaginal
Considerada uma infecção de complexidade relativa na maioria dos casos, a
CVV classifica-se como um importante problema de saúde pública, neste sentido,
torna-se indispensável que profissionais atuantes em áreas como a ginecologia,
micologia e infectologia conheçam sua patogenia de maneira atualizada para que
dessa forma auxiliem no manejo da infecção (GAZETA-JÚNIOR et al., 2011).
O gênero Candida constitui-se de aproximadamente 200 diferentes espécies
de fungos leveduriformes, que vivem como comensais nos mais diversos nichos
corporais, como orofaringe, cavidade bucal, dobras da pele, secreções brônquicas,
vagina, urina e fezes (BARBEDO e SGARBI, 2010). Em termos clínicos, a
candidíase pode ser cutânea, mucosa, mucocutânea ou visceral. O fungo possui
preferência de crescimento e proliferação em contato com superfícies quentes e
úmidas, gerando frequentemente as vaginites, e em neonatos a chamada “dermatite
das fraldas” e a candidíase oral (NYIRJESY, 2008). Estas são as manifestações
mais usuais do estado infeccioso e, embora normalmente não apresentem ameaça à
vida do hospedeiro, em casos graves a infecção pode adquirir nível sistêmico
colocando o paciente em risco. As formas cutaneomucosas severas são menos
comuns e subdivide-se em duas categorias: candidíase cutaneomucosa crônica,
com prevalência em pacientes que possuem disfunções de caráter imunológico
como àqueles portadores da síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA) e
portadores de doenças crônicas hereditárias como o lúpus, e, a candidíase vaginal
crônica, desencadeada principalmente por fatores de risco como a gravidez, uso de
contraceptivos orais, antibioticoterapia e o diabetes mellitus dos tipos 1 e 2
A sintomatologia da CVV depende do nível de infecção e da localização do
tecido inflamado, podendo apresentar-se de forma isolada ou associada com outros
tecidos, com principal sintoma o prurido vulvovaginal que pode variar como ardor ou
dor à micção, corrimento branco, grumoso, inodoro e com aspecto caseoso
(semelhante ao aspecto físico da coalhada); hiperemia, edema vulvar, fissuras e
maceração da vulva; dispareunia e vagina e colo do útero recoberto por placas
__________________________________________________
Matheus Ap. Santos Ramos
25
Revisão da Literatura
__________________________________________________
brancas ou branco-acinzentadas, aderidas à mucosa. (ARAÚJO, 2011; GAZETAJÚNIOR et al., 2011).
Em geral, a maioria das pacientes deve responder prontamente ao tratamento
realizado com antifúngicos disponíveis em prática clínica, como o fluconazol,
miconazol e nistatina, todavia, nos últimos anos este o tratamento vem mostrandose ineficaz principalmente pelo alto índice de resistência dos fungos aos derivados
azólicos. Nestes casos, a nistatina é muito empregada, mas a aplicação local de
uma solução fraca de ácido bórico ou e principalmente o uso de creme vaginal a
base de anfotericina B e introdução de óvulos de flucitosina são alternativas
empregadas atualmente (DENNING e HOPE, 2010). Os fármacos azólicos são
contra indicados durante a gravidez devido ao risco de desenvolvimento de
teratogênese fetal, portanto, torna-se altamente prejudicial para mulheres que
estejam em idade fértil e que queiram engravidar (SOBEL, 2007). Nestes casos,
cremes vaginais a base de anfotericina B são empregados, porém, a utilização a
longo prazo apresenta riscos à saúde mulher visto os efeitos nefrotóxicos atribuídos
a este fármaco (CHAI et al., 2013).
Algumas mulheres que possuem sintomatologia positiva de CVV podem
apresentar um ou mais episódios infecciosos de forma esporádica ou ocasional,
podendo estes estar diretamente relacionados aos fatores imunológicos e
nutricionais da paciente, enquanto outras podem ter sintomas frequentes ou graves
classificando-as em um patamar de risco elevado, onde a patogênese passa a ser
chamada de candidíase vulvovaginal recorrente (CVVR). A CVVR classifica-se como
a eventualidade de três ou mais episódios de CVV durante um ano, aonde as
principais causas podem estar ligadas à resistência do fungo aos fármacos
empregados no tratamento, predisposição genética, interferência da prostaglandina
E2 presente no sêmen masculino, aumento da produção de citoquinas Th2 e
produção insatisfatórias de Th1, visto que mulheres que possuem uma alta produção
de Th1 estão menos propensas a desenvolverem casos de CVVR (LINHARES et al.,
2005).
Neste caso, o tratamento deve portar-se de forma diferente aos casos de CVV
de caráter simples, pois a maioria dos antifúngicos utilizados nestes casos
infecciosos possuem ação fungistática, ou seja, inibem o crescimento fúngico mas
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Matheus Ap. Santos Ramos
26
Revisão da Literatura
__________________________________________________
não o elimina por completo. Em CVVR o emprego de fármacos fungistáticos mostrase insatisfatório, visto que a presença de células leveduriformes mesmo estando em
menores
quantidades
são
suficientemente
capazes
de
promover
o
desencadeamento do estado infeccioso novamente. Como solução, especialistas
indicam um tratamento mais intenso como frenquentes aplicações de fármacos por
via intravaginal, adminstração oral de antifúngico, dieta com baixa quantidade de
acúcares,
suplementação
vitamínica
afim
de
fortalecer
o
hospedeiro
e,
principalmente, a elucidação da espécie leveduriforme para que o tratamento seja
mais preciso e direto, visto a suscetibilidade distintas aos fármacos empregados em
prática clínica (LINHARES et al., 2005; POWELL e NYRJESY, 2014).
2.1.2.1. Principais espécies de Candida envolvidas na candidíase vulvovaginal
Em pacientes que possuem algum tipo de imunodeficiência, principalmente
aqueles portadores do vírus HIV (Human Immunodeficiency Virus), têm-se dado uma
expressiva atenção às doenças causadas por fungos, já que a redução de linfócitos
CD4+ predispõe o paciente a diversas infecções fúngicas, sejam elas de origem
patogênica ou relacionadas ao comensalismo entre o hospedeiro e o microorganismo,
principalmente
aquelas
causadas
por
fungos
leveduriformes
pertencentes ao gênero Candida, como a candidíase vulvovaginal (BARBEDO e
SGARBI, 2010).
Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), a candidíase vulvovaginal
compreende cerca de 95% das infecções do trato genital feminino, caracterizandose como uma patologia de grande importância, sendo indispensável a realização do
diagnóstico para a melhor adequação do paciente ao tratamento (MORALES e
YANETH, 2012). Estima-se que 80 a 90% dos casos desta patologia são
ocasionados pela espécie Candida albicans e cerca de 10% a 20% e não menos
importantes, a outras espécies chamadas de não albicans (Candida tropicalis,
Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida lusitaniae)
(CONSOLARO et al., 2004; BARBEDO e SGARBI, 2010; LINHARES et al., 2005).
Embora a maioria dos casos de CVV sejam desencadeados pela espécie C.
albicans, nos últimos anos tem-se observado um expressivo aumento de infecções
causadas por espécies não albicans, o que se classifica como um problema, visto
__________________________________________________
Matheus Ap. Santos Ramos
27
Revisão da Literatura
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que espécies pertencentes a esta classe apresentam-se em sua maioria, resistentes
aos principais fármacos empregados na terapêutica clínica, como exemplo, a
espécie C. krusei por apresentar naturalmente um perfil de resistência intrínseca ao
fluconazol (MONTERO et al., 2010).
2.1.2.1.1. Candida albicans (C. albicans)
C. albicans (Figura 1) é classificada como um fungo dimórfico (leveduriforme)
comensal de caráter oportunista, habitante de nichos corporais de humanos, como
orofaringe, trato gastrointestinal, mucosa oral e principalmente vaginal; podendo
também ser encontrada em animais habitando-os de forma comensal assim como
nos seres humanos. (MOLERO et al., 1998).
Considerada como o agente etiológico de diversas doenças de origem
fúngica, esta caracteriza-se como a espécie mais prevalente em casos de CVV, e
está diretamente relacionada com os casos de recorrência de infecção (SOBEL,
2010).
C. albicans é a espécie mais abundante e significativa que coloniza de forma
comensal todos os seres humanos. Eventualmente, pode causar infecções
potencialmente letais, especialmente em pacientes imunocomprometidos ou
criticamente doentes. Quanto à sua colonização, esta pode acontecer em qualquer
fase da vida do indivíduo, a qual varia desde o momento do nascimento, ocorrência
de transmissão relacionada com a contaminação dentro do ambiente familiar, até ao
contato direto com determinado sítio contaminado, como exemplo ressalta-se o ato
sexual como o principal fator de desencadeamento de infecções. Por sua vez,
reporta-se a expressiva capacidade de infestação que esta levedura possui, no
sentido de que um número limitado de estirpes de C. albicans podem colonizar ao
mesmo tempo, uma, ou várias membranas e mucosas de um mesmo indivíduo (KIM
et al., 2011).
A rápida proliferação e fixação em tecidos e mucosas é um fator preocupante,
pois esta levedura possui considerável plasticidade morfogênica. Neste sentido,
podem desenvolver-se tanto na forma leveduriforme com na forma de hifas. A
disseminação hifal denomina-se como um fator de risco em casos de infecções, visto
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Matheus Ap. Santos Ramos
28
Revisão da Literatura
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que a ocupação e proliferação em tecidos do corpo humano ocorrem de forma mais
abrangente, atingindo principalmente as mucosas e órgãos como fígado, pele e
útero (ANGEBALT et al., 2013)
Figura 1. Fotomicrografia de C. albicans (8500x)
Fonte: Science Photo Library, 2014a.
Outro fator agravante e que leva a falhas no tratamento medicamentoso, dáse principalmente à característica de C. albicans ser a espécie frequentemente
associada com a formação de biofilme, especialmente em implantes médicos, e isso
tem um impacto significativo sobre a morbidade e mortalidade dos pacientes. A
formação do biofilme fúngico é importante para a patogenia da levedura, sendo
considerada como sendo uma característica de virulência e de resistência do microorganismo (HERWALD e KUMAMOTO, 2014). Por apresentar tal característica, C.
albicans tornou-se o principal modelo para o estudo dos mecanismos que
fundamentam a formação de biofilmes de fungos morfologicamente complexos, e
compostos de formas de leveduriformes, pseudo-hifas e hifas verdadeiras
(BONHOMME e ENFERT, 2013).
2.1.2.1.2. Candida krusei (C. krusei)
A espécie C. krusei (Figura 2), caracteriza-se como um fungo leveduriforme
com células em formato ovóide e quando cultivada em meio de cultura sólido exibe
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Matheus Ap. Santos Ramos
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Revisão da Literatura
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colônias espessas, largas, de coloração branca ou levemente amarelada com
aspecto físico rugoso (LACAZ et al., 2012).
Figura 2. C. krusei observada sob microscopia óptica (100x)
Fonte: O autor
Esta espécie emerge nos últimos anos como um fungo oportunista de alto
grau de complexidade na terapêutica antifúngica frente aos pacientes infectados,
principalmente em imunocomprometidos. Isto justifica-se pelo fato de apresentar
perfil de resistência intrínseca aos fármacos derivados de azóis, como o fluconazol,
principal medicamento utilizado em casos de infecções fúngicas (ABBAS et al.,
2000). Neste sentido, a terapêutica nos casos de infecções por esta levedura muitas
vezes é insatisfatória e de pouca adesão do paciente ao tratamento, gerando custos
elevados à terapia e expondo os hospedeiros a drogas que apresentam efeitos
colaterais superiores, como os fármacos anfotericina B, voriconazol, posaconazol e
ravuconazol, utilizados em terapias onde o agente infeccioso possui resistência ao
fluconazol (KATHIRAVAN et al., 2012).
Estudos têm demonstrado infecções desencadeadas por C. krusei em
pacientes que receberam fluconazol e anfotericina B em terapias contra infecções
causadas por outras espécies de Candida (PFALLER et al., 2008). Schuster et al.
(2013) confirmaram esta ocorrência ao investigarem os fatores de risco ao
desenvolvimento de candidemias ocasionadas por C. krusei, reportando a provável
contribuição do fluconazol de forma sinérgica no desencadeamento do estado
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Matheus Ap. Santos Ramos
30
Revisão da Literatura
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patológico em hospedeiros vulneráveis, que na maioria das vezes são portadores de
algum tipo de câncer, neutropenia, pós-cirúrgicos, tratado com hemodiálise.
Embora os episódios de CVV causadas por C. krusei estejam presentes nos
10% dos casos de infecções por espécies não albicans, a eventualidade do estado
patológico mostra-se preocupante, visto a incidência elevada nas falhas terapêuticas
uma vez que esta espécie tende a apresentar um declínio da suscetibilidade aos
antifúngicos empregados na rotina clínica, e esta afirmação vai além da inatividade
do fluconazol no tratamento, no sentido de que resistência aos fármacos derivados
de poliênios (ex. anfotericina B) e equinocandinas (ex. caspofungina) vem sendo
citadas na literatura (MONTERO et al., 2010). Em relação aos sinais e sintomas de
vaginites por C. krusei, estes parecem ser indistinguíveis dos casos de CVVs
causadas por outras espécies de Candida. Apesar de rara, a CVVR causada por C.
krusei é uma causa considerada intratável (PFALLER et al., 2008; GUZEL et al.,
2013).
2.1.2.1.3. Candida glabrata (C. glabrata)
C. glabrata (Figura 3) é uma espécie de fungo leveduriforme que coloniza
comensalmente o trato gastrointestinal e genitourinário, e até algum tempo atrás
acreditava-se possuir caráter patogênico, no entanto, inofensivo ao ser humano
(LACAZ et al., 2012). A crescente utilização da terapia imunossupressora em
conjunto com a utilização de fármacos antifúngicos de amplo espectro, observou-se
um aumento expressivo das infecções por esta espécie, o que mudou o cenário
clínico dos episódios infecciosos, assim como as abordagens medicinais.
Trata-se da única espécie de Candida que não apresenta pseudo-filamentos,
o que transmite a errônea idéia da mesma apresentar um perfil de virulência menor
em relação a outras espécies (LACAZ et al., 2012).
As infecções por C. glabrata mostram-se de grande complexidade em
quadros clínicos diversos, onde podem-se apresentar como superficiais (infecções
cutâneas e mucosas) e também em casos extremos de infecção generalizadas de
alta complexidade como é o caso das candidíases invasivas (SARDI et al., 2013).
Na atualidade, C. glabrata é considerada a segunda levedura mais patogênica
que atinge os seres humanos, ficando atrás somente da C. albicans (QUINTIN et al.,
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Revisão da Literatura
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2013). Esta espécie está envolvida diretamente em infecções fúngicas invasivas que
vão desde as infecções locais até níveis sanguíneos. Nos casos de infecções
sistêmicas, o tratamento torna-se difícil, devido ao alto índice de casos de
resistência aos derivados de azóis, com destaque ao fluconazol.
Figura 3. Fotomicrografia de Candida glabrata (8500x)
Fonte: CORMACK et al. (1999).
Em relação aos episódios de CVV, C. glabrata é considerada como o agente
etiológico mais frequente em casos infecciosos com espécies não albicans isoladas,
representando cerca de 34,5% dos casos, assim como nos casos de candidúria, o
que classifica-se como um problema devido ao alto padrão de resistência aos o que
gera dificuldades na abordagem terapêutica para a eliminação dos sinais e sintomas
da doença (SOBEL, 2010; HETTICARACHCHI et al., 2010).
Apesar de C. glabrata ser classificada como a segunda ou terceira espécie
mais frequente de isolados clínicos em todo mundo, as infecções causadas por essa
espécie no Brasil, são considerados episódios raros em comparação com outras
espécies (LOPES, 2010).
2.1.2.1.4. Candida tropicalis (C. tropicalis)
A espécie leveduriforme C. tropicalis (Figura 4) caracteriza-se como um dos
principais agentes etiológicos das candidíases invasivas. As altas taxas de
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Revisão da Literatura
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incidências são observadas (assim como a maioria das espécies do gênero
Candida) em pacientes que possuam algum tipo de distúrbio imunológico,
neutropênicos,
portadores
do
diabetes
e
também
em
indivíduos
idosos
(KOTHAVADE et al., 2010).
Figura 4. C. tropicalis observada sob microscopia óptica (100x)
Fonte: O autor
Caracteriza-se como agente etiológico frequente em casos de candidemia em
muitos hospitais brasileiros, sendo a segunda espécie mais comumente isolada.
Casuísticas do Brasil confirmam que as três espécies mais prevalentes isoladas de
urina em pacientes hospitalizados são: Candida albicans, Candida tropicalis e
Candida glabrata. Estes estudos demonstram prevalências de 35,5 a 70% para
Candida albicans; 4,6 a 52,5% para Candida tropicalis e 7 a 8,8% para Candida
glabrata
(MENEZES
et
al.,
2009).
Embora
apresente
a
capacidade
de
disseminações invasivas, C. tropicalis é geralmente suscetível a todos os
antifúngicos, todavia, vários casos de resistência cruzada entre fluconazol e outros
derivados de azois em isolados clínicos foram relatados, especialmente na região da
Ásia-Pacífico (FORASTIERO et al., 2013). Por outro lado, a resistência à anfotericina
B exercido por esta espécie é considerado raro.
A preocupação em casos de infecções por esta espécie vai além da sua
participação nos episódios de CVV, ela está relacionada com as incidências de
infecções sistêmicas, como as meningites (BAGHERI et al., 2010).
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Revisão da Literatura
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Jiang et al. (2013) consideram a C. tropicalis resistente a 5-fluorocitosina e
nível moderado de resistência ao fluconazol, todavia, com o aumento do consumo
desenfreado de fármacos antifúngicos principalmente nos casos de profilaxia à
pacientes portadores de imunodeficiências, estas espécies estão propensas a
desenvolverem resistência aos antifúngicos usuais.
2.1.2.1.5. Candida parapsilosis (C. parapsilosis)
C. parapsilosis (Figura 5) compreende-se como um fungo leveduriforme,
diplóide e sem reprodução sexual conhecida. Suas colônias são claras, de
morfologia variável, células arredondadas, ovais a alongadas que formam
ocasionalmente os pseudomicélios. C. parapsilosis é encontrada naturalmente como
um fungo comensal na pele humana, sendo frequentemente isolado das mãos e
trato gastrointestinal. (LAFFEY et al., 2005).
Inicialmente, assim como C. glabrata, esta espécie foi considerada como não
patogênica, e somente em 1940 foi considerada um micro-organismo patogênico a
partir de um caso de endocardite grave em um paciente usuário de droga injetável,
desde então este patógeno mostrou-se diretamente ligado a diversos tipos de
infecções, o que o classifica nos dias de hoje como um agente patogênico
emergente (SINGARAVELU et al., 2014).
As
taxas
de
infecções
causadas
por
C.
parapsilosis
aumentou
consideravelmente, sendo evidenciada por relatos que as indicam como a segunda
mais comumente espécie de Candida isolada de hemoculturas e, em alguns países
europeus e hospitais sul-americanos, supera até mesmo C. albicans (SILVA et al.,
2012). Esse fenômeno tem sido atribuído a uma variedade de fatores de risco,
incluindo capacidade de crescimento tanto em meios de hiperalimentação com altas
concentrações de glicose até mesmo em dispositivos médicos intravasculares
(cateteres venosos, central e periférico, cateteres de hemodiálise e diálise
peritoneal), dispositivos protéticos (prótese intracardíaca e de articulações), além de
que a doença invasiva pode ocorrer sem colonização prévia, sendo transmitida
horizontalmente através de contaminação de fontes externas ou pelas mãos dos
profissionais de saúde antes ou durante o manuseio do paciente (RIBAS, 2012).
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Revisão da Literatura
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Figura 5. C. parapasilosis observada por microscopia óptica (100x)
Fonte: Science Photo Library, 2014b.
Os determinantes da virulência da candidíase causada por C. parapsilosis
incluem a capacidade de adesão com formação de biofilmes, de alternar entre a
morfologia de levedura e o crescimento filamentoso, e secreção de enzimas
hidrolíticas
extracelulares,
tais
como
lipases,
fosfolipases
ou
proteinases
(SINGARAVELU et al., 2014).
Em relação aos processos infecciosos, uma atenção maior é dada em casos
de infecções em neonatos, pois a presença desta espécie em mãos humanas pode
contribuir para a transmissão horizontal deste organismo em unidades de terapia
intensiva neonatal. Fatores de risco para as infecções neonatais por C. parapsilosis
invasivas são o peso do neonato (<1.500 g), prematuridade, colonização prévia,
nutrição parenteral, cateteres, e uso de antibióticos e esteróides. Fontes exógenas
de infecção podem ser importantes, mas a colonização da pele, trato gastrointestinal
e respiratório frequentemente precedem infecções invasivas neonatais (PAMMI et
al., 2013).
2.1.2.2. Principais fatores de virulência de Candida spp.
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Revisão da Literatura
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A capacidade das espécies de Candida ocasionar doenças está relacionada
com mecanismos que envolvem diversos fatores de virulência, que incluem a
transição morfológica entre levedura e hifa, capacidade de se defender contra o
sistema imunológico do hospedeiro, aderência, formação de biofilme no tecido do
hospedeiro ou em dispositivos médicos, e produção de enzimas hidrolíticas
prejudiciais como proteases, fosfolipases e hemolisina (SARDI et al., 2013;
HOLLAND et al, 2014).
A resistência aos azólicos entre as espécies de Candida causada por
mutações genéticas, a supra-expressão do alvo da droga e a regulação dos seus
métodos de transporte são cada vez mais comuns e mecanismos alternativos, tais
como a formação de biofilme e de defeitos mitocondriais, têm sido recentemente
relatadas (SILVA et al., 2012).
A formação de hifa desempenha função importante na invasão de tecidos. As
formas filamentosas (hifa e pseudohifa) das espécies de Candida tem demonstrado
aumento da resistência à fagocitose quando comparado com a levedura. A virulência
de C. albicans está estritamente relacionada com a capacidade de formação de
hifas, sendo esta transição levedura-hifa crucial para o desenvolvimento da infecção
(TSANG; BANDARE; FONG, 2012). A morfologia hifal de C. tropicalis é similar a de
C. albicans e está relacionada com a invasão de epitélio oral. Entretanto, a
capacidade de C. parapsilosis invadir epitélio oral não está relacionado com
produção de pseudohifa (SILVA et al, 2012). As hifas promovem ao fungo a
capacidade de sobrepor da defesa do hospedeiro e também constituem um fator
essencial para a patogenicidade por formar biofilmes (VYLKOVA, LORENZ, 2014).
O evento primário da infecção por Candida é a aderência aos tecidos do
hospedeiro, após uma colonização inicial. A aderência contribui para a permanência
da levedura dentro do hospedeiro e é considerada essencial para o estabelecimento
da doença e também em dispositivos médicos formando biofilme (SILVA et al.,
2012). A formação de biofilme é um processo sequencial incluindo a aderência da
levedura, proliferação das células, formação de hifas na parte superior do biofilme,
acúmulo de material de matriz extracelular e dispersão das células a partir do
biofilme. (MAYER et al., 2013).
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Muitas espécies de Candida apresentam capacidade de formar biofilme,
entretanto ocorrem amplas variações estruturais de espécie para espécie
(PANNANUSSORN et al., 2013). O biofilme de C. albicans é formado por uma
camada basal compacta de células leveduriformes e uma camada mais espessa e
menos compacta de hifa, envolvidos por uma matriz extracelular composta
principalmente de carboidratos, proteínas, fósforo e hexosamina. Por outro lado, C.
parapsilosis não tem a capacidade de formar hifas verdadeiras e o biofilme é
composto somente de células leveduriformes e pseudohifas, altos níveis de
carboidrato e quantidade baixa de proteína (MAYER; WILSON; HUBE, 2013; SILVA
et al, 2012). Todavia, a matriz extracelular do biofilme de C. glabrata apresenta altos
níveis de carboidratos e proteínas, enquanto para C. tropicalis as quantidades de
carboidratos e proteínas são baixas (SILVA et al., 2012).
2.2. Plantas medicinais e Fitoterápicos
O uso de produtos oriundos de fontes naturais na terapêutica medicamentosa
é conhecido desde os primórdios da humanidade. A Etnofarmacologia, classifica-se
como a principal ferramenta de análise de novos fármacos na terapêutica moderna,
visto que o conhecimento popular denomina-se como um suporte promissor na
investigação de plantas com princípios biológicos medicinais (CRAGG e NEWMAN,
2013). Desde 1976 a OMS busca promover o uso de terapias alternativas levando
em consideração o conhecimento técnico da medicina ocidental quanto ao emprego
dos produtos naturais na terapêutica. Cerca de 85% da população mundial utiliza
medicamentos fitoterápicos, neste sentido, desde meados da década de 80
estudiosos brasileiros tentam quantificar o uso de plantas medicinais pela
população, tendo como principal alvo de estudo as mulheres grávidas e mães de
crianças com até 5 anos de idade, levando em consideração de que a cultura do uso
de terapias naturais é passada de geração em geração (FERREIRA et al., 2014).
Em tese, a OMS define o conceito de planta medicinal como qualquer planta
que possui em um dos órgãos ou em toda sua composição, substâncias com
propriedades terapêuticas que sejam ponto de partida na síntese de produtos
químicos ou farmacêuticos (LIMA et al., 2010). Recentemente a indústria
farmacêutica tem dado atenção aos fármacos oriundos de produtos naturais
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Revisão da Literatura
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associado à vasta aplicabilidade na investigação de diversos tipos de tratamentos de
doenças de caráter agudo, crônico e até mesmo cumulativo, além do baixo custo, o
qual se torna um atrativo à população em geral (CRAGG e NEWMAN, 2013).
As plantas medicinais denominam-se como sendo uma parte importante da
riqueza natural brasileira. Elas servem como importantes agentes terapêuticos, bem
como valiosas matérias-primas para a fabricação de numerosas soluções
tradicionais e modernas que visam o bem estar e manutenção da saúde do homem.
Podem ser utilizados na síntese de produtos farmacêuticos e cosméticos, na
indústria de alimentos e em muitos outros campos da ciência moderna, como a
veterinária e a estética (YADAV et al., 2010).
É valido salientar que as plantas medicinais foram durante muito tempo, o
único, e principal recurso terapêutico no tratamento de enfermidades de alto risco à
saúde do homem. Com o avanço da medicina alopática de origem sintética cada vez
mais numerosa e moderna, principalmente nos países mais desenvolvidos,
resultaram-se os tratamentos medicamentosos realizados a partir de drogas
sintéticas, onde gradativamente foram introduzidos no cotidiano da população por
meio de propagandas que prometiam a cura das mais diversas doenças em um
curto período de tempo de tratamento (BADKE et al., 2011). Neste sentido, com o
aumento do número de doenças e o desencadeamento de estados patológicos cada
vez mais resistentes à terapia convencional, a fitoterapia ganhou força no Brasil nos
últimos anos, apresentando-se como fonte promissora na descoberta de novos
princípios biologicamente ativos.
A produção de plantas medicinais, aromáticas e o processamento das
mesmas, são atividades econômicas que contribuem para o desenvolvimento social
e econômico do país, além de servir de aporte para o desenvolvimento de novas
pesquisas de caráter crítico e investigativo para a busca de novos fármacos
fitoterápicos (MATEESCU et al., 2014).
Por definição, os fármacos fitoterápicos são aqueles provenientes de plantas
medicinais cujos seus princípios ativos podem aliviar os sintomas e até mesmo curar
doenças, além de serem prioritariamente dotados de menores efeitos secundários
quando comparados aos fármacos de origem sintética (TROJAN-RODRIGUES et al.,
2012). Estima-se que 25% do faturamento da indústria farmacêutica brasileira são
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Revisão da Literatura
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obtidos pelas vendas de derivados de plantas medicinais, observando-se um
aumento substancial a cada ano (FERREIRA et al., 2014) . A fim de controlar o
consumo desses produtos, muitos países criaram seus próprios regulamentos, no
Brasil, os critérios médicos, antropológicos, sociais, botânicos e econômicos são
coordenados pela Comissão de Seleção de Plantas, aonde é possível encontrar
todos os parâmetros necessários para o desenvolvimento de pesquisas e
normatização dos medicamentos fitoterápicos para implementação no Sistema
Único de Sáude (SUS), a fim de implementar o uso destes medicamentos na rede
de saúde pública brasileira (MINISTÉRIO DE SAÚDE, 2006). O uso tradicional de
plantas para o tratamento de doenças por parte do público e da confirmação do seu
efeito biológico têm estimulado o seu uso terapêutico. No entanto, o avanço da
pesquisa sobre os componentes em tais plantas demonstra que o uso destas é para
além da sua utilização medicina popular. Neste sentido, é necessária a maior
integração entre os pesquisadores, as instituições e o seguimento industrial privado
e público (FERREIRA et al., 2014).
Apesar do uso disseminado de plantas medicinais para muitas funções, é de
extrema importância frisar que muitos efeitos colaterais adversos são evidenciados,
sendo alguns deles considerados muito graves, tais como reações alérgicas,
mutações genéticas, intoxicação, teratogenicidade, carcinogênese e interações
medicamentosas, os quais podem limitar o uso dos produtos naturais na terapêutica.
O uso indiscriminado destes produtos por falta de informação da população, no
sentido de que existe uma falsa idéia de que determinada planta pode ser utilizada
para o tratamento de inúmeros processos patológicos (panacéia), gera uma série de
problemas à saúde do paciente. A falta de um controle de qualidade mais rigoroso
destes medicamentos também é um fator de risco no sucesso da terapia
medicamentosa e está diretamente relacionado com a promoção de efeitos
colaterais, como as contaminações por metais pesados, herbicidas ou pesticidas
utilizados na lavoura das matérias primas (NIGGEMANN e GRUBER, 2003;
ALMEIDA et al., 2005).
Diversas áreas da medicina estão se tornando adeptas ao uso de plantas
medicinais ou fármacos fitoterápicos propriamente ditos, para o tratamento de
diversos tipos de patologias, como o diabetes mellitus (CHANG et al., 2013), vários
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tipos de câncer (CRAGG et al., 2009) e com mais frequência, a microbiologia busca
a atualização do arsenal terapêutico antimicrobiano empregando produtos naturais
como fonte primária de investigação (GYAWALI e IBRAHIM, 2014).
2.2.1. Produtos naturais como novos agentes antimicrobianos
Os antimicrobianos constituem um grupo especial de agentes terapêuticos,
geralmente produzidos e obtidos a partir de organismos vivos. Embora o avanço
técnico e científico da síntese de novos medicamentos seja observado nos últimos
anos, a medicina moderna encontra-se em expressiva busca por novos fármacos
capazes de atuarem efetivamente no controle de doenças causadas por microorganismos de caráter patogênico e oportunista. Ultimamente observa-se que a
procura por novas abordagens medicamentosas frente a diversos tipos de doenças
oriundas de processos infecciosos encontra-se em declínio e desatualização
(CRAGG e NEWMAN, 2012). Na última década, apenas sete novos fármacos foram
aprovados para a terapia do tratamento de infecções bacterianas. O número de
aprovações de novos medicamentos utilizados neste tipo de terapêutica caiu
substancialmente em relação ao observado em meados da década de 1980, onde,
em média quatro novas drogas eram introduzidas no mercado a cada ano. Não se
sabe ao certo quais são as principais causas de tal eventualidade, todavia as razões
mais plausíveis que justificam tal declínio são dadas a uma combinação de fatores,
como aqueles oriundos de uma mudança do sistema de regularização de novas
drogas, o aumento das normas de segurança de medicamentos, bem como falha de
técnicas de descoberta de medicamentos modernos, como o processo “High
throughput screening” (triagem de alta produtividade), um método computadorizado
ultramoderno abrangendo testes em série utilizando sistemas robóticos, amplamente
empregado por centro de pesquisas de indústrias farmacêuticas a nível mundial
(BROWN et al., 2014).
Algumas famílias botânicas possuem naturalmente constituintes químicos
importantes que podem ser utilizados na investigação de novos compostos com
atividade antimicrobiana, neste sentido, o conhecimento prévio adquirido, desde
conceitos etnofarmacológicos e até mesmo de dados apresentados à comunidade
científica são de extrema importância para o desenvolvimento de investigações
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Revisão da Literatura
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científicas que busquem a inovação na área quimioterápica com foco nas doenças
infecciosas (VIEIRA et al., 2014).
Em relação ao tratamento de afecções causadas por fungos, observa-se
significativa escassez de fármacos que possuam efetividade elevada e baixos
índices de efeitos colaterais. Os fármacos mais empregados são àqueles derivados
de azóis, como o cetoconazol, itraconazol e com mais frequência e aplicabilidade o
fluconazol. Embora sejam princípios ativos capazes de atuarem contra fungos
filamentosos e leveduriformes, o índice de multirresistência a estes tipos de drogas
exercidos por inúmeros gêneros fúngicos é proporcionalmente crescente à elevada
taxa de hospedeiros acometidos ou até mesmo aos óbitos causados pela infecção
(PFALLER, 2012). Os efeitos colaterais desencadeados por antifúngicos sintéticos é
na maioria das vezes um cofator de agravamento do estado patológico do paciente,
visto que reações relacionadas com hepatoxicidade e principalmente disfunções
renais estão diretamente ligados ao consumo de medicamentos pertencentes a esta
classe, como por exemplo, o uso da anfotericina B, rotineiramente empregado em
casos de resistência à azóis, onde o uso prolongado deste tipo de medicamento leva
a reações nefrotóxicas (CHAI et al., 2013).
Os produtos naturais vem se mostrando atrativos no desenvolvimento de
pesquisas clínico-farmacológicas com o objetivo de controlar e até mesmo erradicar
formas microbianas associadas com o desenvolvimento de patologias que atingem o
homem moderno (SALEEM, 2010). Neste sentido, as plantas medicinais são o
principal foco de investigação na área antimicrobiana, justificado pela variedade de
componentes ativos e principalmente à abrangência da aplicabilidade sob vários
tipos de doenças infecciosas, sendo esta capacidade atribuída principalmente à
presença de metabólitos secundários (SIMÕES et al., 2007).
Os metabolitos secundários compreendem-se como compostos orgânicos que
não estão diretamente envolvidos nos processos de crescimento, desenvolvimento e
reprodução dos organismos vegetais, mas desempenham um papel importante nas
defesas vegetais contra a herbivoria e outras defesas relacionadas ao meio de
desenvolvimento e sobrevivência. (SIMÕES et al., 2007; GARCIA
e
2009).
antioxidante,
Estes
compostos
possuem
atividade
antimicrobiana,
CARRIL,
antiproliferativo de células tumorais além de serem amplamente empregados na
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Revisão da Literatura
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indústria de cosméticos. Os principais grupos destes compostos que são
responsáveis pela atividade antimicrobiana de plantas incluem compostos fenólicos,
àcidos fenólicos, quinonas, saponinas, flavonóides, taninos, fenazinas, cumarinas,
lignanas, neolignanas, terpenóides e principalmente os alcalóides (HAYEK et al.,
2013).
A atividade antimicrobiana dos metabólitos oriundos de compostos naturais
pode ser influenciada por vários fatores incluindo a fonte botânica, tempo de
colheita, o estágio de desenvolvimento da planta, método de extração, composição
química, estrutura, e os grupos funcionais. Além disso, os componentes de
alimentos e aditivos, que podem interagir com os compostos antimicrobianos
desempenham um papel importante na utilização de compostos naturais como
conservantes de alimentos, por exemplo, a ligação não específica do peptídeo
antimicrobiano catiônico de partículas de alimentos carregados negativamente
podem reduzir o efeito do peptídeo antimicrobiano em sistemas alimentares
(JUNEJA et al., 2012).
Os mecanismos de ação dos produtos naturais são diversos e distintos. A
membrana citoplasmática classifica-se como o sítio de ação mais comum dos
metabólitos secundários, eles atuam tanto na lise da estrutura desencadeando o
extravasamento do conteúdo celular e consequentemente a morte, quanto na
formação da mesma. A interação com o material genético e síntese de proteínas
também é uma fator predisponente na promoção da ação terapêutica, neste caso,
quando em contato com o material genético é capaz de promover alterações na
codificação do DNA microbiano, resultado em ineficazes transcrições promovendo a
desorganização de funções vitais para a célula (HAYEK et al., 2013; GYAWALI e
IBRAHIM, 2014).
È importante salientar que variações na estrutura química e composição dos
compostos naturais empregados como fármacos resultam em diferenças na ação
antimicrobiana e na diversidade estrutural de compostos derivados de plantas. O
impacto da ação antimicrobiana exercida contra diversos tipos de micro-organismos
depende da sua configuração estrutural. Como exemplo, os compostos fenólicos
possuem grandes variações estruturais e são um dos mais diversos grupos de
metabólitos secundários. Os grupos hidroxílicos (OH) presentes nestes compostos
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podem ser a causa de ação inibidora uma vez que estes podem interagir com a
membrana celular dos micro-organismos, para desestabilizar as estruturas de
membranas e como consequência promovem a lise celular (XUE et al., 2013).
2.2.3. A família Eriocaulaceae
Composta por 10 gêneros e 1200 espécies, as Eriocaulaceaes destacam-se
por serem uma das famílias de monocotiledôneas incomuns mais representativas
dos campos rupestres da Cadeia do Espinhaço – no estado de Minas Gerais e
também da Serra do Jalapão no Estado do Tocantins, não só pela grande riqueza
especificamente observada, mas também pelo elevado número de táxons
endêmicos desta formação geológica (COSTA et al., 2008; ANDRADE et al., 2011).
A família se divide em duas subfamílias: Eriocauloidae Ruhland e Paepalanthoideae
Ruhland. Com relação à distribuição geográfica de Eriocaulaceae no mundo,
espécies desta família ocorrem em sua maioria em regiões pantropicais. No Brasil,
observa-se espécies dos gêneros Eriocaulon, Paepalanthus, Syngonanthus,
Leiothrix, Tonina, Comanthera e Actinocephalus, ou seja, dos 10 gêneros presentes
na família, 8 são de ocorrência brasileira, sendo alguns deles endêmicos a uma
determinada região do território nacional (EICHEMBERG e SCATENA, 2011;
GIULIETTI et al., 2012).
São conhecidas como “sempre-vivas”, por possuírem escapos inflorescentes
que se mantém íntegros por longos períodos, e neste sentido, são muito utilizadas
na confecção de ornamentos e acessórios. A atividade biológica destas plantas
iniciou com a descoberta do metabólito paepalantina, classificada como uma
naftopiranona (Figura 6), que rotineiramente não é encontrado em plantas mas sim
em micro-organismos fúngicos como aqueles do gênero Penicillium spp. (ZANUTTO,
2013).
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Figura 6. Estruturas de naftopiranonas e xantonas comuns em plantas da
família Eriocaulace
Fonte: ZANUTTO, 2013.
Embora a maioria das Eriocaulaceas ainda não serem muito usadas na
prática medicinal e sim artesanal, espécies desta família possuem uma grande
diversidade química, e portanto, fonte de novas moléculas que possuam atividade
biológica.
2.2.3.1. O gênero Syngonanthus
O gênero Syngonanthus inclui aproximadamente 200 espécies, distribuídas
nas Américas e África. O maior número encontra-se na América do Sul,
principalmente
no
Brasil,
nos
estados
de
Minas
Gerais
e
Bahia,
com
aproximadamente 180 espécies (PACÍFICO et al., 2011).
Em relação à química do gênero, 25 espécies representativas já foram
estudadas, e nelas foram identificadas grandes quantidades de flavonas, com
predominância de O-glicosídeos e C-glicosideos derivados do flavonóide luteolina, e
com menor frequência O-glicosideos derivados da apigenina (RAMOS et al., 2005).
Ricci et al. (1996) estudaram a taxonomia de 13 espécies de Syngonanthus, e
detectaram a presença de 24 flavonas, sobretudo derivados 7-O-glicosilados da
luteolina e 6-hidroxiluteolina, além de O-glicosídeos da apigenina.
2.2.3.1.1. Syngonanthus nitens (Bong.) Rulland
Conhecida popularmente como “capim dourado” (Figura 7), esta espécie
pertencente à família Eriocaulaceae classifica-se como uma importante fonte de
renda para muitas famílias da região da Serra do Jalapão no estado do Tocantins,
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Brasil. Os escapos inflorescentes desta planta são utilizados como matéria prima na
confecção de ornamentos decorativos e acessórios, e neste sentido movimentam a
economia local incentivando a exportação de vários tipos de produtos (GIULIETTI et
al., 2012; BERLIM et al., 2014).
Figura 7. Syngonanthus nitens (Bong.) Ruhlland – “capim dourado”
Fonte: SAMPAIO et al., 2010.
O artesanato de capim-dourado inicialmente era feito somente por indígenas
da etnia Xerente do estado do Tocantins. As peças produzidas por eles eram usadas
em casa ou trocadas por outros produtos a fim de manter seu consumo próprio. Por
volta de 1930, a arte de tecer o capim dourado foi aprendida por famílias do povoado
da Mumbuca, na região do Jalapão. Desde o final da década de 1990 as peças
feitas com os escapos de capim-dourado (Figura 8) tornaram-se bastante
conhecidas e vendidas em todo o Brasil e no mundo a fora, principalmente em
países como os Estados Unidos e Alemanha (SAMPAIO et al., 2010; OLIVEIRA e
GARCIA, 2011;FICHINO et al., 2012).
Nos últimos anos nota-se uma expressiva utilização de S. nitens em
investigações químicas e biológicas a fim de verificar a aplicabilidade desta na
triagem de novos quimioterápicos, colocando a espécie em um patamar de destaque
na comunidade científica. Pacifico et al. (2011) identificaram 17 compostos, entre
flavonas e xantonas, incluindo 6 novas moléculas, em extratos de S. nitens, o que
colaborou para a ampliação de estudos biológicos da espécie.
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Matheus Ap. Santos Ramos
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Revisão da Literatura
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Figura 8. Artesanato produzido com os escapos de S. nitens
Fonte: SAMPAIO et al., 2010.
A presença de fenóis, flavonoides e xantonas nesta planta é um indicativo de
um promissor perfil antimicrobiano. Cardoso et al. (2012) em um estudo quantitativo
de flavonoides, naftopiranonas e xantonas de espécies da família Eriocaulaceae
observaram a presença de luteolina no extrato metanólico dos capítulos e escapos
de S. nitens e a 3,6-dimetoxi-1,5,7-trihidroxixantona presente apenas no extrato
metanólico dos capítulos.
Araújo et al. (2013) determinaram o potencial biológico dos escapos de S.
nitens
contra
bactérias
e
fungos
patogênicos,
elucidando
parâmetros
antimicrobianos importantes, além disto, evidenciaram o potencial terapêutico do
extrato metanólico desta planta no tratamento da candidíase vulvovaginal causada
por Candida albicans.
O perfil estrogênico e mutagênico da espécie em questão foi avaliado por
Oliveira et. al. (2013). Os autores relataram que as xantonas isoladas do extrato
metanólico de S. nitens podem ser úteis como fitoestrógenos, fornecendo uma nova
oportunidade para desenvolver agentes hormonais, além disto, a presença de
flavonas e xantonas, também poderiam ser utilizadas como um novo agente
antimutagênico, visto que apresentou resultados satisfatórios na investigação.
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Matheus Ap. Santos Ramos
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Revisão da Literatura
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2.2.3. Determinação da atividade antimicrobiana de produtos naturais
A determinação da atividade antimicrobiana de produtos vegetais caracterizase como uma etapa importante na caracterização do potencial biológico de qualquer
substância que esteja destinada à aplicabilidade na área medicamentosa
antimicrobiana (DAS et al., 2010).
Diversas metodologias podem ser utilizadas para a determinação da atividade
antimicrobiana in vitro, sendo aplicados em estudos de triagem de novas
substâncias ativas. O método de difusão em ágar avalia a capacidade do composto
testado em impedir o crescimento de um micro-organismo sob um meio de cultura
sólido (BONEV et al., 2008). O método de diluição em microplacas ou também
conhecida como microdiluição, é por sua vez o que há de mais viável na triagem de
novos fármacos antimicrobianos com a vantagem de se trabalhar com pequenas
quantidade de compostos, como os extratos vegetais. Com ela é possível determinar
a concentração inibitória mínima (CIM), sendo esta denominada como a menor
concentração capaz de inibir o crescimento microbiano que representa a
concentração em que o medicamento precisa estar para que desempenhe a ação
terapêutica (DAS et al., 2010). A bioautografia, com a qual é possível verificar a
capacidade de inibição dos componentes presentes por exemplo em extratos,
partindo-se de ensaios cromatográficos realizados em placas de cromatografia de
camada delgada (CHOMA e GRZELAK, 2011). O ensaio de tempo de morte (Time
kill) possibilita avaliar a influencia do composto testado sob o crescimento
microbiano, com este método de triagem é possível descobrir qual o tempo
necessário para que o composto testado promova a diminuição, ou total paralisação
do crescimento e também a morte do micro-organismo, com isso determina-se o
tempo em que o agente quimioterápico precisa ser readministrado para controlar o
estado infeccioso (DAS et al., 2010).
Metodologias in vivo também podem ser empregadas para analisar o
potencial antimicrobiano de produtos de origem vegetal, uma vez que um modelo
animal é estabelecido porque se acredita replicar de forma adequada a condição sob
investigação objetivando estabelecerem-se respostas e manifestações clínicas da
mesma forma que são observadas com os seres humanos em casos de infecção
(OZ e PULEO, 2011; DELOGU et al., 2011).
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Matheus Ap. Santos Ramos
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Revisão da Literatura
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2.2.4. Ensaios experimentais in vivo de candidíase vulvovaginal
Com a finalidade de promover uma plataforma segura de testes avaliativos de
drogas potencialmente promissoras em casos de infecções fúngicas, os modelos
experimentais in vivo vem sendo empregados.
Diversos modelos clinicamente
relevantes vem sendo desenvolvidos com a finalidade de avaliar interações
patógeno-hospedeiro, eficácia e farmacocinética de fármacos antifúngicos, e vacinas
para candidíases sistêmicas e de mucosa. Os modelos experimentais in vivo de CVV
têm sido úteis na identificação de fatores sobre a influência hormonal na infecção, a
virulência das leveduras,
a susceptibilidade e o tratamento da
infecção
(REPENTIGNY, 2004; ARAÚJO, 2011).
A capacidade de exercer controle sobre as variáveis experimentais que
incluem a cepa do fungo, espécie hospedeira, concentração do inóculo, via de
administração, e administração da farmacoterapia, representam grandes vantagens
da experimentação animal, especialmente quando combinada com modelos
validados estatisticamente onde o estado clínico da patologia mimetiza os mesmos
sinais e sintomas observados em humanos. Os animais de laboratório mais
utilizados são os ratos consanguíneos, embora os modelos de infecção por fungos
fossem desenvolvidos em primatas, coelhos, cobaias, ratos, hamsters, pássaros,
peixe-zebra, e caninos. A ampla disponibilidade de reagentes imunológicos definidos
e linhagens murinas, e o baixo custo e espaço relativo associado com a manutenção
de colônias em comparação com espécies hospedeiras maiores, tem impulsionado o
uso do rato de laboratório frente à modelos de infecção por fungos (HOHL, 2014).
Ensaios experimentais de CVV in vivo permitem avaliar o desempenho de
novos antifúngicos de uma forma mais precisa e confiável, uma vez que se trabalha
com um organismo vivo. Todavia, algumas considerações a respeito das
características dos animais utilizados no desenvolvimento de protocolos de infecção
devem ser levadas em conta, como a viabilidade do animal ao estado infeccioso,
defesa imunológica e principalmente as características relacionadas com o ciclo
hormonal do animal.
Os roedores, com destaque as ratas fêmeas, mostram-se animais aplicáveis
ao desenvolvimento de modelos de infecção por Candida albicans. Todavia,
diferentemente dos seres humanos, esta espécie não é habitante comensal de
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Revisão da Literatura
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mucosa vaginal, o que torna necessário criar condições adequadas para que a
mesma possa se desenvolver e proliferar-se na vagina dos animais. Assim, o uso de
agentes quimioterápicos é muito utilizado para promover o desencadeamento de
imunossupressão nos animais (ROMANI et al., 2011; ARAÚJO et al., 2013;
CASSONE et al., 2014).
A imunossupressão de animais é muito importante no desencadeamento de
diversos tipos de infecções, em especial, as infecções fúngicas que em sua maioria
possuem caráter oportunista e necessitam que o sistema imunológico do hospedeiro
esteja comprometido para seu desenvolvimento e proliferação (HUYAN et al., 2011).
O agente quimioterápico ciclofosfamida (CP) vem sendo muito empregado
como agente imunossupressor no desenvolvimento de protocolos experimentais de
infecções fúngicas (ARAÚJO et al., 2013; SVEKO et al., 2013). Influencia as células
de tecidos normais, incluindo células do sistema imunológico, células de medula
óssea (em especial o desenvolvimento de células sanguíneas), promovem a
ativação de linfócitos (que se proliferam e produzem anticorpos), células fetais,
células foliculares do cabelo e as células epiteliais do intestino delgado. CP
enfraquece tanto a resposta imune celular e humoral. Seu efeito é dose-dependente,
mas até mesmo uma única administração pode prejudicar temporariamente o
sistema imunológico (WÓJCIK, 2014).
Outro requisito indispensável para o desenvolvimento de CVV em roedores é
a adequação do ciclo estral dos mesmos. O requisito essencial para o
estabelecimento da infecção por fungos pertencentes ao gênero Candida, é a
indução de um estado de pseudo-estro (falso cio). Neste sentido, em modelos
experimentais in vivo de CVV têm sido útil na identificação de fatores relativos às
influências hormonais sobre a infecção, a virulência das leveduras, e a
susceptibilidade ao tratamento da infecção. Nestes modelos, a chave para
estabelecer uma infecção persistente é o estado de pseudo-estro prolongado. Este
estado é, muitas vezes, induzido pela administração subcutânea de estradiol, por
sua vez, na ausência de tratamento com estrógeno, a infecção é de curta duração,
com pouca secreção vaginal, que dificultam as análises dos resultados (CARRARA
et al., 2010).
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Revisão da Literatura
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O tratamento com estrogênio induz a formação de um epitélio escamoso no
ambiente vaginal. Além disso, inibe a resposta imune do hospedeiro e aumenta o
conteúdo de glicogênio, os substratos de pH e de crescimento que facilitam a
adesão de Candida no tecido epitelial. Também tem sido relatado que o estrogênio
pode afetar diretamente as células fúngicas, aumentando o número de células
leveduriformes que possuam formação de tubos germinais, as quais estão
relacionadas diretamente com o seu aumento e proliferação (CHENG et al., 2006;
MOSCI et al., 2013).
2.3. Nanotecnologia farmacêutica como ferramenta para o aprimoramento de
princípios bioativos naturais
A nanotecnologia caracteriza-se como uma importante ciência para alavancar
os avanços das aplicações de nanomateriais em todos os campos da medicina
tradicional. Neste sentido, inúmeras aplicações de nanomateriais para diagnóstico e
tratamento têm sido descritas na literatura desde seu surgimento. O emprego desta
ferramenta na área farmacêutica como plataformas veiculadoras de princípios
bioativos foi uma das primeiras áreas a crescer neste cenário, e uma das que mais
se desenvolveu ao longo dos anos (SINGH et al., 2013; CANCINO et al., 2014).
A ação de muitos fármacos no organismo muitas vezes é limitada pela baixa
solubilidade dos princípios ativos naturais ou sintéticos, altas dosagens, toxicidade
elevada, tempo de meia vida insuficiente e principalmente elevados índices de
degradação in vivo. Por sua vez, a liberação controlada de drogas é um campo da
pesquisa científica moderna que tem despertado interesse de pesquisadores, pois, a
liberação de um fármaco no local específico da ação terapêutica é uma das
limitações das indústrias biotecnológicas e farmacêuticas (SILVA et al., 2014). Essa
liberação consiste em deixar que o fármaco atue no sítio específico e em uma
concentração segura (YADAV et al., 2011).
A nanotecnologia tem contribuído em diversas áreas médicas, entretanto, têm
algumas desvantagens. Um dos principais fatores negativos apontados por
pesquisadores clínicos além do alto custo e da dificuldade da implementação da
escala industrial, é a facilidade da inalação de partículas nanométricas, ocasionando
doenças pulmonares com alto grau de periculosidade levando muitas vezes a óbito o
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Revisão da Literatura
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paciente, dentre outras doenças que levam a severos comprometimentos a
homeostasia do corpo humano. Por se tratar de partículas em escala nano, há um
elevado risco de envenenamento em massa, ou seja, há um acúmulo de substâncias
bioativas que podem desencadear efeitos toxicológicos a nível sistêmico,
principalmente em casos de nanopartículas tóxicas que possuem afinidade pelo
cérebro (YADAV et al., 2011; SINGH et al., 2013). Em termos de análises biológicas
das nanopartículas, há um grande avanço de técnicas quantitativas para elucidações
morfológicas e estruturais, porém, existem deficiências em métodos de análises
qualitativas acessíveis e padronizados que oferecem suporte confiável e eficaz, o
que dificulta o exato entendimento e elucidações de mecanismos de ação entre
outros fatores que venham a auxiliar a compreensão a nível biológico (ELSAESSER
et al., 2010).
A nanotecnologia farmacêutica busca cada vez mais inserir novas
abordagens tecnológicas para a ampliação dos benefícios apresentados por
sistemas carreadores de fármacos. Neste sentido, nos últimos anos tem-se
observado um aumento da utilização de produtos naturais em sistemas carreadores
de fármacos, visto que medicamentos de origem natural apresentam vantagens em
relação aos fármacos sintéticos, isso porque esses compostos possuem menores
efeitos colaterais quando sua atividade farmacológica e toxicológica é comparada
aos sintéticos (MASSON et al., 2005; SIMÕES et al., 2007; BONIFÁCIO et al., 2014).
Um exemplo de componente vegetal útil no desenvolvimento de emulsões em
escala nanotecnológica é o óleo vegetal, isto se deve às suas propriedades
favoráveis no que se diz respeito à baixa viscosidade e peso molecular. O seu uso é
justificado devido ao menor poder de oclusão quando comparado aos óleos
minerais, o que permite uma maior capacidade de penetração na pele e como
consequência o aumento da veiculação de agentes terapêuticos (CHANDLER, 2002;
BERNARDI et al., 2011).
A utilização de produtos naturais como os extratos vegetais são de extrema
importância
e
aplicabilidade
principalmente
na
terapêutica
antimicrobiana,
entretanto, alguns problemas são observados. A maioria dos constituintes
biologicamente ativos dos extratos, como os flavonoides, taninos e terpenoides são
altamente hidrossolúveis, mas apresentam baixa absorção, ou por serem incapazes
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Revisão da Literatura
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de atravessar a membrana lipídica das células ou por apresentarem tamanho
molecular elevado, dificultando sua absorção e consequentemente promovendo a
perda de parâmetros relacionados com a eficácia dos mesmos (KESARWANI e
GUPTA, 2013). Este problema justifica o fato de uma série de plantas medicinais
apresentarem potencial in vitro satisfatório, e pouca ou nenhuma ação in vivo. Além
disso, algumas substâncias consideradas essenciais à formulação acabam muitas
vezes não sendo utilizadas simplesmente por apresentar-se incompatível juntamente
com os demais componentes da formulação ou até mesmo por apresentar
propriedades indesejáveis (BONIFÁCIO, 2014).
O uso da nanotecnologia farmacêutica na veiculação de extratos medicinais
tem aberto novos horizontes para uma melhor atividade e promoção da liberação de
nanopartículas. Neste sentido, a estratégia de aplicação da nanotecnologia em
extratos vegetais, em especial, vem sendo bastante citada na literatura uma vez que
os sistemas nanoestruturados demonstram ser capazes de potencializar a ação de
extratos de plantas, reduzindo a dose necessária e os efeitos colaterais, e
melhorando sua atividade biológica (GHOSH et al., 2013; RAJENDRAN et al., 2013).
Bonifácio et al. (2014) publicaram uma revisão bibliográfica enfatizando a
utilização de sistemas de liberação de fármacos para a incorporação de produtos de
origem natural com a finalidade de promover o aumento da biodisponibilidade dos
mesmos. Os autores apresentaram sistemas de grande importância e muito
utilizados na terapêutica moderna, sendo eles: nanopartículas poliméricas,
nanopartículas lipídicas sólidas, sistemas líquidos cristalinos, lipossomas e
microemulsão. Seguindo a mesma tendência, Kesarwani e Gupta (2013)
apresentaram uma revisão onde é possível verificar a utilização de vários sistemas
nanotecnológicos de liberação de fármacos empregando plantas medicinais. As
pesquisas apresentadas pelos autores demonstram que a veiculação em bases
nanotecnológicas promoveu a melhora da ação farmacológica em todos os casos
analisados.
O desempenho ideal de princípios ativos sintéticos ou oriundos de fontes
naturais é dependente principalmente do fornecimento de quantidades suficientes
dos mesmos. Para isso, os novos sistemas de liberação de drogas devem promover
a deposição do princípio bioativo em quantidades e concentrações suficientes
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Revisão da Literatura
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durante o período de tratamento, e por sua vez, promover perfeito direcionamento
para o sítio de ação desejado. A perda parcial ou total de uma atividade específica
pode ser observada quando o extrato recebe tratamentos do tipo isolação ou
purificação dos constituintes. Além disso, alguns componentes são altamente
sensíveis ao pH ácido do estômago, promovendo sua destruição e posterior perda
do efeito desejado, neste sentido, alguns compostos como os extratos vegetais não
são utilizados clinicamente justamente pelo fato de apresentarem perda da atividade
terapêutica, simplesmente por apresentarem empecilhos como estes (AJAZUDDIN,
2010; BONIFÁCIO et al., 2014).
2.3.1. Sistemas líquido-cristalinos
Os cristais líquidos (CL) foram descobertos a mais de 100 anos pelo botânico
austríaco Friederich Renitzer ao observar a presença de dois pontos de fusão no
benzoato de colesterilo, mas, somente depois da década de 60 é que estudos a fim
de avaliar suas propriedades e aplicações foram relatados, sendo assim, há uma
expansão da utilização de CLs nas mais variadas áreas da ciência para diversos
fins, que vai desde a expansão tecnológica de produtos de cunho eletrônico a
veiculação de fármacos insolúveis em água (HIRD, 2007; HEGGMAN et al., 2007).
Por definição um cristal líquido é caracterizado como sendo um fluído
intermediário entre a fase sólida cristalina, ordenada tridimensionalmente, e a fase
líquida isotrópica desordenada, onde a temperatura exerce um papel fundamental
para a formação das estruturas que constituem cada tipo de fase, a Figura 9 ilustra
esta informação (BONIFÁCIO et al., 2014).
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Figura 9. Representação esquemática o arranjo dos cristais líquidos em função da
temperatura
Fonte: Adaptado de Bonifácio et al. (2014).
Em um sólido cristalino as unidades da fase (íons, moléculas, por exemplo)
estão em um arranjo ordenado em três dimensões, ou seja, possuem uma
orientação e uma posição dentro de uma célula unitária de longo alcance. Em um
líquido isotrópico as unidades perdem tal arranjo e se encontram aleatoriamente
dispersas no espaço. Nesta fase as propriedades ópticas, elétricas, magnéticas, são
invariáveis. Para um CL a ordem posicional é parcial ou totalmente perdida, porém a
ordem orientacional é mantida. Devido a tal arranjo, os CLs apresentam
propriedades físicas típicas do estado sólido cristalino e propriedades mecânicas
semelhantes às do estado líquido, o que caracteriza sua fluidez. Possue
conformações anatômicas que os classificam como sendo ordenados ou
desordenados, sendo assim evidenciadas pela sua facilidade de efluxo, e, por este
aspecto, podem ser nomeados de mesofases e suas moléculas constituintes como
mesógenos (BONIFÁCIO et al., 2014).
Os sistemas líquido-cristalinos são formados por moléculas de tensoativo que
se autoagregam na presença de água, formando uma variedade de estruturas.
Quando esses tensoativos são incorporados em uma mistura imiscível de óleo e
água, eles podem se situar na interface entre o óleo e a água, resultando em
diferentes estruturas líquido-cristalinas (SILVA et al., 2014). As fases líquido-
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Revisão da Literatura
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cristalinas são divididas em duas grandes categorias, sendo uma delas os cristais
líquidos liotrópicos (CLL) e a outra os cristais líquidos termotrópicos (CLT). Os CLL
são constituídos por moléculas anfifílicas (ex. tensoativos), as quais apresentam
duas regiões distintas: uma parte polar (hidrofílica, iônica) também chamada de
cabeça e uma parte apolar (hidrofóbica, hidrocarboneto) conhecida por cadeia. A
parte polar é solúvel em água e a parte da cadeia, apolar, se auto-associa em uma
unidade geradora da mesofase, a micela. Nos CLLs, a fase líquido-cristalina é
dependente da concentração do solvente e da temperatura (LIU et al., 2013). As
mesofases de CLLs podem ser consideradas como micelas ordenadas com arranjo
molecular caracterizado por regiões hidrofóbicas e hidrofílicas de maneira alternada.
Conforme o aumento da concentração de tensoativo, diferentes formas líquidocristalinas podem ser obtidas, como as hexagonais, cúbicas e lamelares (CHORILLI
et al., 2011).
A mesofase hexagonal apresenta-se como micelas empacotadas em arranjo
hexagonal e são separadas por uma região contínua de água. Este tipo de mesofase
pode ser classificado em fase reversa, onde é formada por canais aquosos
circundando as extremidades polares do tensoativo, com a porção apolar localizada
ao redor dos cilindros, ou pode ser classificada em fase normal, onde as cabeças
polares do tensoativo localizam-se na região externa dos cilindros. Por meio de
microscopia de luz polarizada observa-se anisotropia, com estruturas estriadas e
sua menor viscosidade em relação à fase cúbica, portando-se como uma importante
propriedade que facilita suas aplicações práticas (YARIV et al., 2010).
A mesofase cúbica, ou também chamada de isotrópica viscosa, é formada por
micelas normais (fase contínua polar) ou reversas (fase contínua apolar)
empacotadas em arranjo característico cúbico. Não é birrefringente quando
observada em microscópio de luz polarizada como as fases lamelar e hexagonal
(CALIXTO, 2013).
As mesofases lamelares são bicamadas alternadas de moléculas ordenadas
de tensoativo e de solvente, de modo que as cadeias hidrofóbicas do mesmo são o
centro da lamela e sua parte hidrofílica está em contato com a camada de solvente.
Essa fase é caracterizada por sua fluidez e anisotropia na forma de cruz de malta
(WANG e ZHOU, 2009).
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Em relação aos CLT, são designados assim em função de seu
comportamento mesomórfico a ser induzido por meio da variação de temperatura. A
presença da mesofase pode ser observada quando se funde um sólido cristalino ou
mesmo quando se resfria um líquido isotrópico, na ausência de solvente. Os CLT
são formados por moléculas com forte anisometria geométrica, sendo a unidade
geradora do mesomorfismo (perfil líquido-cristalino) a própria molécula (BISOYI e
KUMAR, 2011).
A presença de orientações ordenadas das interfaces classifica-se como um
fenômeno comum e essencial aos estados líquidos cristalinos. No entanto, quando
se tem o objetivo de caracterizar os comportamentos das fases de sistemas líquidos
cristalinos é de extrema importância que se conheça a existências de outros tipos de
mesofases, as quais não são CL. Sendo assim, é comum se deparar com
microemulsões isotrópicas, mesofases esponjosas e emulsões, cujas interfaces não
possuem qualquer tipo de ordem com propriedade orientacional (TAHAR-DJEBBAR
et al., 2011).
O desenvolvimento de um sistema de liberação de fármacos confiável e
eficaz, focando no estabelecimento de tratamentos seguros e potencialmente
favoráveis contra patologias, instiga diversos pesquisadores a pleitearem uma
plataforma veiculadora de fármacos que possibilite a distribuição do mesmo na via
de administração pretendida, priorizando a melhor interação fármaco-receptor e a
redução de efeitos deletérios. Sendo assim, a escolha de um sistema que atenda a
todas as necessidades faz-se de extrema valia, principalmente em sistemas
carreadores de fármacos incorporados em CLs (PRAÇA et al., 2012).
Os sistemas líquidos cristalinos (LCs) têm atraído grande atenção devido à
possibilidade de se obter partículas estruturadas com o uso de métodos
instantâneos e modular as forças formadas com estímulos fisiológicos, tais como,
pH, temperatura e força iônica (KRAINEVA et al., 2005). De acordo com Formariz et.
al (2005) os LCs podem ser administradas através de diversas vias, como oral, retal,
subcutânea, tópica, transdérmica, intramuscular e endovenosa, sendo que os
critérios para a escolha dos componentes para cada um desses fins devem ser
estabelecidos de acordo com características próprias de cada uma dessas, levando
em consideração fatores como viscosidade, pH, interação entre as moléculas e o
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solvente empregado, dentre outros, para que assim, haja perfeita harmonia entre o
fármaco e o sistema, sendo que esta desempenha um importante papel no controle
da liberação do princípio ativo. Gabboun et al. (2001) confirmam essa alegação ao
ressaltarem que a razão de liberação de fármacos incorporados em LCs dependerá
da estrutura da mesofase e os componentes que as formam, assim como as
características físico-químicas do fármaco, tornando possível o emprego de CLs
como veículos carreadores de fármacos, os quais podem ser capazes de controlar a
liberação das substâncias neles incorporados havendo consonância entre este e a
via de administração (STEVENSON et al., 2005).
A grande vantagem de se fazer o uso de CLs como sistema de liberação de
fármacos é promover uma melhor estabilidade física e um amplo potencial de
solubilização dos fármacos (CHORILLI et al., 2011). A incorporação de princípios
bioativos pode ser realizada tanto na parte polar quanto na apolar do sistema,
dependendo de sua solubilidade, além da possibilidade de incorporação entre as
moléculas de tensoativo (CHORILLI et al., 2013).
O desenvolvimento de formulações a base de CLs, para aplicações em
diversas vias de administração, inclusive a via vaginal, apresenta-se como
promissor. O tratamento de patologias por via intravaginal utilizando CLs como
plataforma promissora de veiculação de fármacos, ainda é recente e necessita de
implementações em termos de desenvolvimento científico e tecnológico (SILVA et
al., 2014).
A alta viscosidade de algumas mesofases líquido-cristalinas como as cúbicas
torna difícil a sua administração, pois, a aplicação de um sistema precursor de
cristais líquidos mucoadesivos pode levar à formação da rede líquido-cristalina após
o contato com o substrato biológico, através de estímulo orgânico, como
temperatura ou fluído biológico, por exemplo, a saliva ou muco (CALIXTO, 2013). O
interessante é que pelo fato de apresentarem-se líquidos em estado de repouso ou
em temperaturas ambientes, os SPCL podem mudar sua conformação no local de
aplicação, por exemplo, em uma aplicação intravaginal, ao entrar em contato com o
muco ou corrimento vaginal ocorre à incorporação da água existente, sendo assim,
assume um caráter mais viscoso, assumindo um novo perfil estrutural (SILVA et al.,
2014).
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Além da possibilidade da mudança estrutural do sistema, a adição de
componentes bioadesivos à formulação pode gerar uma melhora do perfil biológico
do mesmo, ou seja, estes produtos promovem um maior tempo de contato com a via
de administração e neste sentido desencadeiam uma liberação mais intensa e direta
no local de ação, além de promover total aproveitamento do princípio ativo, pois não
ocorre o escoamento do mesmo, e em contrapartida proporciona um conforto maior
ao indivíduo que o utiliza (BRUSCHI et al., 2007). Sistemas de liberação de
fármacos que possuem característica bioadesiva podem ser planejados para serem
aderidos não só em mucosas que contenham grandes quantidades de água, como a
vaginal, mas também em substratos como a pele e as mucosas nasal, ocular, bucal,
respiratória, urinária e gastrintestinal, melhorando, dessa forma, a biodisponibilidade,
a absorção e o transporte de fármacos, assim como, reduzindo os efeitos sistêmicos
indesejáveis e a necessidade de repetidas doses, o que pode aumentar a adesão do
paciente ao tratamento (CALIXTO, 2013).
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3. Objetivos
Gosto daquele que sonha o impossível.
(Johann Goethe)
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Objetivos 60
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3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo geral
Determinar o potencial antifúngico do extrato metanólico de escapos de
Syngonanthus nitens (Bong.) Ruhlland incorporado ou não incorporado em um
sistema de liberação de fármacos precursor de cristais líquidos mucoadesivos, com
enfoque no tratamento da candidíase vulvovaginal.
3.2. Objetivos específicos
 Avaliar in vitro a ação antifúngica do extrato metanólico de escapos de S. nitens
contra cepas clínicas e padrão (ATCC) de Candida spp.
 Desenvolver e caracteriza, sob o aspecto físico-químico um sistema nanoestruturado
de liberação de fármacos (cristais líquidos mucoadesivos) aplicável na incorporação
do extrato vegetal.
 Avaliar in vitro a ação antifúngica do extrato vegetal após a incorporação no sistema
de liberação de fármacos contra cepas clínicas e padrão (ATCC) de Candida spp.
 Determinar o perfil de virulência in vitro da cepas de Candida spp. pelos testes de
capacidade de inibição de hifas, formação de biofilme e Time kill.
 Avaliar a citotoxicidade in vitro do extrato vegetal antes e após a incorporação no
sistema de liberação de fármacos.
 Avaliar a ação profilática do extrato vegetal incorporado ou nao no sistema de
liberação de fármacos frente a modelo experimental in vivo de CVV causada pela
Candida krusei (modelo com não-albicans).
 Avaliar a ação terapêutica do extrato vegetal incorporado e não incorporado no
sistema de liberação de fármacos frente a modelo experimental in vivo de CVV
causada por Candida albicans (modelo com a espécie prevalente na CVV).
 Comparar a aplicabilidade do extrato vegetal incorporado ou não no sistema de
liberação de fármacos voltando-se ao tratamento da candidíase vulvovaginal.
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4. Material e Métodos
Sonhos determinam o que você quer. Ação determina o que você
conquista.
(Aldo Novak)
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Material e Métodos 62
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4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Procedência e preparação do extrato vegetal
O extrato metanólico dos escapos de Syngonanthus nitens foi obtido a partir da
amostra vegetal cedida pelo Laboratório de Fitoquímica, do Departamento de
Química Orgânica do Instituto de Química de Araraquara - Universidade Estadual
Paulista “Julio de Mesquita Filho” (UNESP), sob coordenação da Profa. Dra.Lourdes
Campaner dos Santos.
A coleta do material vegetal foi realizada por Crysthiano Borges Pereira na
Serra do Jalapão no estado do Tocantins, Brasil. A identificação do mesmo foi
realizada pelo Prof. Dr. Paulo Takeo Sano (USP/SP). Uma exsicata de número SPF
189975 foi depositada no IB-USP São Paulo.
O extrato vegetal foi preparado pelo método de extração exaustiva de
percolação simples (FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 2010). O processo de extração
foi iniciado com o intumescimento prévio dos escapos da planta triturados, (500 g)
em contato com o solvente (metanol), por duas horas antes do início da percolação.
Após o tempo de intumescimento, o conjunto (metanol + planta vegetal) foi colcado
no percolador e devidamente preenchido com papel de filtro, de maneira rápida e
uniforme para que não houvesse a formação de bolha no interior do mesmo. O início
do processo de percolação deu-se após a deposição de mais metanol dentro do
percolador. A percolação teve duração de 21 dias. O extrato percolado foi
novamente filtrado em papel de filtro e concentrado em rotaevaporador sob pressão
reduzida em temperatura inferior a 40ºC.
Após, iniciou-se o processo de eliminação da quantidade de residual de
solvente (metanol) em capela de exaustão. O extrato foi submetido à liofilização.
Para o uso nos ensaios biológicos, foi preparado uma solução do extrato a
2000 μg/mL em DMSO a 20% e q.s.p. 1 mL de meio de cultura RPMI estéril, e
solubilizado em banho maria por ultrasson. A
solução obtida foi mantida como
estoque até o início dos experimentos em temperatura de -20 ºC (ARAÚJO et al.,
2013).
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Matheus Ap. Santos Ramos
Material e Métodos 63
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4.2. Cepas fúngicas
As cepas clínicas utilizadas são parte da coleção micológica do Laboratório
de Microbiologia do Departamento de Doenças Dermatológicas, Infecciosas e
Parasitárias da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto – FAMERP,
cedidas pela Profa. Dra. Margarete Teresa Gottardo de Almeida, responsável pelo
laboratório.
Foram utilizadas 22 cepas de Candida spp., sendo 17 de origem clínica e 5
ATCC. As características das cepas clínicas das espécies C. albicans (5), C.
glabrata (3), C. krusei (3), C. tropicalis (3) e C. parapsilosis (3) são apresentadas na
Tabela 1.
Tabela 1. Relação de cepas clínicas de Candida sp.
Amostra
Espécie
Origem
Clínica
Resistência
CAV 1
C. albicans
Secreção
vaginal
Sintomática
Itraconazol, cetoconazol,
fluconazol
CAV 2
C. albicans
Secreção
vaginal
Sintomática
Cetoconazol, itraconazol,
fluconazol
CAV 3
C. albicans
Secreção
vaginal
Sintomática
Cetoconazol, itraconazol,
fluconazol
CAV 4
C. albicans
Secreção
vaginal
Sintomática
Cetoconazol, itraconazol,
fluconazol
CAV 5
C. albicans
Secreção
vaginal
Sintomática
Cetoconazol, itraconazol,
fluconazol
CGV 1
C. glabrata
Secreção
vaginal
Sintomática
cetoconazol,
Itraconazol, fluconazol
CGV 2
C. glabrata
Secreção
vaginal
Assintomática
cetoconazol,
Itraconazol, fluconazol
CGV 3
C. glabrata
Secreção
vaginal
Assintomática
CKV 1
C. krusei
Secreção
vaginal
Sintomática
cetoconazol,
Itraconazol, fluconazol
cetoconazol,
Itraconazol, fluconazol*
CKV 2
C. krusei
Urina
Não descrita
cetoconazol,
Itraconazol, fluconazol*
Sensibilidade
anfotericina B,
anfotericina B,
anfotericina B,
anfotericina B,
anfotericina B,
anfotericina B,
cetoconazol, itraconazol
anfotericina B,
cetoconazol, itraconazol,
anfotericina B,
cetoconazol, itraconazol,
anfotericina B
anfotericina B
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Material e Métodos 64
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cetoconazol,
Itraconazol, fluconazol*
CKV 2
C. krusei
Unha do pé
Não descrita
CTV 1
C. tropicalis
Secreção
vaginal
Assintomática
cetoconazol,
Itraconazol, fluconazol
CTV 2
C. tropicalis
Secreção
vaginal
Sintomática
cetoconazol,
Itraconazol, fluconazol
CTV 3
C. tropicalis
Secreção
vaginal
Sintomática
Cetoconazol,
Itraconazol, fluconazol
CPV 1
C.parapsilosis
Secreção
vaginal
Assintomática
cetoconazol,
Itraconazol, fluconazol
CPV 2
C.parapsilosis
Secreção
vaginal
Sintomática
cetoconazol,
Itraconazol, fluconazol
CPV 3
C.parapsilosis
Secreção
vaginal
Sintomática
cetoconazol,
Itraconazol, fluconazol
anfotericina B
Anfotericina B,
fluconazol
Anfotericina B,
cetoconazol
Anfotericina B,
cetoconazol
anfotericina B,
cetoconazol, itraconazol,
fluconazol
anfotericina B,
cetoconazol, itraconazol,
fluconazol.
anfotericina B,
cetoconazol, itraconazol.
*Resistência natural
Adicionalmente, foram utilizadas 1 cepa ATCC de cada espécie clínica;
As cepas padrão (ATCC) foram: C. albicans (ATCC 10231), C. krusei (ATCC
6258), C. glabrata (ATCC 2001), C. tropicalis (ATCC 750), e C. parapsilosis (ATCC
22019), da micoteca do Laboratório de Fisiologia de Micro-organismos da Faculdade
de Ciências Farmacêuticas de Araraqura-UNESP.
Todas as leveduras foram mantidas em caldo sabouraud dextrose (ASD)
acrescido de 20% de glicerol e congeladas à temperatura de - 20ºC. Para o uso, as
mesmas foram repicadas em 2 mL de caldo sabouraud dextrose e incubadas à 37ºC
em estufa microbiológica por 48 horas.
4.2.1. Preparo das suspensões fúngicas
Após o crescimento das leveduras em ASD foram transferidas para PBS
estéril e diluídas até escala 0,5 de McFarland (106 UFC/mL). A concentração das
leveduras foi confirmada por leitura espectrofotométrica a 620 nm e contagem em
Câmara de Neubauer. Desta suspensão foi realizada uma diluição 1/1000 obtendose uma suspensão de 103 UFC/mL utilizada nos experimentos (GABRIELSON et al.,
2002;CLSI, 2008).
4.3. Desenvolvimento do sistema precursor de cristais líquidos mucoadesivos
(SPCLM)
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Material e Métodos 65
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Para a elaboração do SPCLM empregou-se o ácido oleico (AO) como fase
oleosa e álcool cetílicoetoxilado e propoxilado – Procetyl® AWS (PRO) como
tensoativo. A fase aquosa foi constituída de uma dispersão polimérica (DP) à 5%
sintetizada a partir de dois polímeros, Policarbofil ® -2,5% (PP) e Carbopol® C974P 2,5% (CP), suspensos em água Mili-Q® por meio de agitação mecânica e com o pH
ajustado à 7,0 com trietanolamina.
A Figura 10 apresenta os constituintes utilizados para o desenvolvimento das
formulações.
Figura 10. Constituintes do SPCLM
a= Procetyl® ; b= Dispersão polimérica; c= Ácido oléico
4.3.1. Elaboração do diagrama de fases ternário
À temperatura ambiente, diferentes proporções (0 a 100% m/m) de cada fase
dos sistemas foram homogeneizadas por meio de agitação em vórtex resultando
desse modo na construção do diagrama de fase ternário composto por 36
formulações. Todas as formulações que não estavam em pH 7,0 foram ajustadas
com trietanolamina (base fraca). Todas as formulações foram classificadas
visualmente como sistemas viscosos transparentes (SVT), sistema viscoso
translúcido (SVTr), sistema viscoso opaco (SVO), sistema líquido transparente
(SLT), sistema líquido translúcido (SLTr), sistema líquido opaco (SLO) ou sistemas
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Material e Métodos 66
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que apresentaram separação de fases (SF). Desse modo, foi possível delimitar as
diferentes regiões no diagrama de fases.
4.3.1.1. Análise por microscopia de luz polarizada (MLP)
A partir das 36 formulações obtidas no diagrama de fases, excluíram-se
aquelas regiões que se apresentaram opacos ou com separação de fases. Deste
modo, 22 pontos foram eleitos para a realização da observação por MLP.
Uma gota de cada formulação foi colocado em uma lâmina de vidro coberta
com uma lamínula e, em seguida, examinada através do microscópio de luz
polarizada Olympus® BX41 acoplado com Seção QColor3 (Olympus America Inc.), a
25 ± 0,5 º C. Deste modo comportamento isotrópico ou anisotrópico das amostras foi
obtido, onde os pontos puderam ser classificados em cruz de malta (CM); estrias (E);
estrias + cruz de malta (E+CM) e campo escuro (CE).
4.3.1.2. Seleção das formulações para análises farmacotécnicas e biológicas
A escolha da formulação ideal para a realização das triagens antifúngicas in
vivo e in vitro, assim como as caracterizações farmacotécnicas por microscopia de
luz polarizada, reologia e bioadesão in vitro, basearam-se nas características
observadas em cada uma das formulações obtidas, selecionando aquelas líquidas e
localizadas numa região de transição para cristal líquido para poderem atuar como
sistema precursor de cristal líquido, neste sentido, foram eleitas duas formulações.
Após a incorporação do extrato, as formulações foram novamente
analisadas por MLP a fim de investigas possíveis alterações estruturais.
4.3.1.3. Ensaio do efeito muco nos sistemas
A fim de verificar in vitro a propriedade precursora de cristais líquidos,
foi desenvolvido um muco vaginal artificial preparado como descrito por Owen e
Katz. (2000). Para a preparação de 1L da formulação, pesou-se 3,51g de NaCl,
1,40g de KOH, 0,222g de Ca(OH)2, 0,018g de albumina de soro bovino, 2,00g de
ácido láctico, 1,00g de ácido acético, 0,16 g de glicerol, 0,4 g de ureia, 5,0g de
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Material e Métodos 67
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glucose e 15g de mucina. Após a completa mistura, o pH foi ajustado para 4,2
utilizando HCl 0,1%. Para avaliar o efeito do muco nas formulações (incorporadas /
não incorporadas com o extrato), foram acrescentados 5, 10, 30, 50 e 100% do
fluido vaginal simulado em relação à massa inicial (2g). Este ensaio foi realizado
com o SPCLM sem e com o extrato vegetal incorporado (2000 µg/mL). Amostras
representativas de cada porcentagem adicionada foram analisadas através da MLP,
para que possíveis mudanças estruturais fossem elucidadas. Uma gota de cada
formulação foi colocada numa lâmina de vidro coberta com uma lamínula e, em
seguida, examinada através do microscópio de luz polarizada Olympus BX41
acoplado com Seção QColor3 Olympus America Inc., a 25 ± 0,5 º C. Este ensaio
permitiu avaliar de modo in vitro, o comportamento exercido pelo sistema
desenvolvido quanto à formação de cristais líquidos em contato com muco vaginal.
4.3.1.4. Análises reológicas contínuas (curva de fluxo)
As formulações selecionadas (25 e 26) foram submetidas à análise reológica
com e sem a incorporação do extrato vegetal, e também do MVA incorporado na
proporção 1:1, para que se observassem quaisquer alterações antes e após a
incorporação do extrato de S. nitens e também do MVA.
O fluxo contínuo foi analisada numa tensão controlada através do reômetro
AR2000 ® (TA Instruments, New Castle, DE, EUA), equipado com uma geometria de
placas paralelas (40 mm de diâmetro) e com gap de 200 µm, a 37 ± 0,1 °C, em três
replicatas. Amostras das formulações foram cuidadosamente aplicada sobre a placa
inferior, assegurando o mínimo de contato e deixou-se equilibrar durante 3 minutos
antes da análise. A taxa de cisalhamento utilizada foi de 0, 01 a 100s -1 para a curva
ascendente e de 100 a 0, 01s-1 para a curva descendente, durante 120 segundos
cada. O teste foi realizado em triplicata.
O índice de índice de consistência e fluxo foram determinados a partir da Lei
de potência como descrito na Equação 1 para a análise quantitativa de
comportamento de fluxo.
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Matheus Ap. Santos Ramos
Material e Métodos 68
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Equação 1.
onde: "τ" é a tensão de cisalhamento; "ɤ" é a taxa de cisalhamento; "K" é o índice de
consistência e "η" é índice de fluxo.
4.3.1.5. Avaliação in vitro da força mucoadesiva
Para a realização deste ensaio foi utilizada a mucosa vaginal de suíno, cedida
por um frigorífico local. A força necessária para remover o sistema selecionado da
superfície da mucosa vaginal foi avaliada in vitro, utilizando o analisador de textura
TA-XT plus® (Stable Micro Systems, Surrey Inglaterra), no modo Adhesion Test.
Todas as amostras foram testadas com e sem MVA na forma não incorporada e
incorporada com o extrato vegetal à 37 ± 0.5 ºC.
Uma região com 2 mm de espessura mucosa vaginal foi fixada na parte
inferior da sonda do equipamento e hidratada com MVA por 30s. Após, o teste foi
iniciado abaixando a sonda do equipamento a uma velocidade constante (1mm s-1)
até entrar em contato com a superfície da amostra (formulação). A mucosa e a
amostra foram mantidas em contato durante 60 segundos e nenhuma força foi
aplicada durante este intervalo. Após 60 segundos, a sonda subiu a uma velocidade
de 0.5mm.s-1 até que o contato entre as superfícies da mucosa e da formulação
fosse cessado, e então essa força mucoadesiva necessária para ocorrer o
destacamento foi medida, refletindo a característica mucoadesão . Este ensaio foi
desenvolvido em sete repetições as quais fora foram analisados a 37 ± 0,5 ° C.
4.3.2. Incorporação do extrato vegetal no SPCLM
Em relação ao extrato incorporado, a concentração de 4x o valor da CIM do
extrato não incorporado obtida sobre cada espécie de Candida foi utilizada pra a
incorporação no SPCLM e posterior análise através deste e dos outros métodos de
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Material e Métodos 69
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análise desenvolvido neste estudo. O extrato foi adicionado diretamente no SPCLM
onde o conjunto (SPCLM+extrato) foi submetido à sonicação para completa
solubilização no meio.
4.4. Ensaios antifúngicos in vitro
4.4.1. Determinação da concentração inibitória mínima (CIM)
A avaliação da atividade antifúngica e determinação da CIM foi realizada
pela técnica de microdiluição de acordo com a metodologia descrita segundo o
documento M27-A3 da CLSI (2008), com modificações.
Em cada orifício das microplacas (96 poços) foi acrescentado meio de
cultura RPMI 1640, ajustado ao pH7,0 com tampão MOPs (ácido 3-[N-morfolino]
propanossulfônico) e esterilizado por membrana filtrante.
Adicionalmente foram acrescentados 100 μL das soluções dos extrativos
vegetais e realizada a diluição seriada de 1000 a 7,8 μg/mL. Em seguida foram
distribuídos 100 μL das suspensões dos micro-organismos (item 4.2.1.) em cada
orifício das microplacas.
Como controle positivo foi utilizado anfotericina B (16,0 a 0,06 µg/mL) e o
fluconazol (512 a 1,0 µg/mL). Também foi realizado o controle do meio de cultura, do
crescimento leveduriforme, esterilidade dos extratos vegetais e solvente. As
microplacas foram incubadas em estufa microbiológica à 37ºC por 48 horas. Os
testes foram realizados em triplicata.
4.4.1.1. Determinação da concentração fungicida mínima (CFM)
Após incubação das microplacas, foi realizada a determinação da CFM com
o objetivo de avaliar a capacidade do reestabecimento do crescimento fúngico após
48 horas de contato com a substância teste. Com o auxílio de palitos de madeira
estéreis, a mistura de cada poço foi repicada em Agar sabourand dextrose. As
placas foram incubadas à 37ºC por 48 horas e após a incubação, foi observado o
crescimento ou não das colônias leveduriformes.
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Matheus Ap. Santos Ramos
Material e Métodos 70
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4.4.1.2. Leitura com revelador
Foram adicionados 20 μL de solução aquosa de 2% de cloreto de 2,3,5trifeniltetrazólio (TTC), e incubação a 37ºC por 3 horas. A ausência de crescimento
do micro-organismo mantém as soluções dos poços incolores, enquanto a coloração
vermelha representa crescimento do mesmo (DUARTE et al., 2005). A Figura 11
ilustra um teste realizado com cepas de Candida sp revelado com o TTC.
Figura 11.Ensaio de microdiluição com levedura revelado com TCC
Fonte: O autor
O TTC é um indicador de oxirredução utilizado para diferenciar tecidos
metabolicamente ativos daqueles não ativos, principalmente relacionado com a
viabilidade celular. O mecanismo baseia-se na redução enzimática do 2,3,5trifeniltetrazólio (incolor) em 1,3,5-trifenilformazan (cor avermelhada) em tecidos
vivos devido à atividade de várias desidrogenases, enzimas importantes na oxidação
de compostos orgânicos e portanto no metabolismo celular (GABRIELSON et al.,
2002). A Figura 12 representa a reação de oxidação do TTC.
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Material e Métodos 71
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Figura 12. Reação de redução do TTC
desidrogenases
NH
N
N
N
+
N
Cl
N
-
N
N
2,3,5 trifeniltetrazólico
1,3,5 trifenilformazan
(incolor)
(avermelhado)
Fonte: O autor
4.4.3. Análise citotóxica in vitro
As linhagens VERO (ATCC® CCL-81™) e HeLa foram utilizadas na
determinação da citotoxicidade (IC50). As células foram mantidas em garrafas de
cultura com 5% de CO2, contendo 10 mL de cultura DMEM (Vitrocell®) enriquecido
com 10% de soro fetal bovino, sulfato de gentamicina (50 mg/L) e anfotericina B (2
mg/L), a 37ºC. As células utilizando uma solução de tripsina/EDTA (Vitrocell®),
centrifugadas (2000 rpm por 5 min) e contadas em câmara de Neaubauer ajustando
para 3,4 x 105 células/mL em meio DMEM. Desta suspensão, foram depositados 200
µL em cada orifício de uma microplaca de 96 orifícios obtendo uma concentração
celular de 6,8x104 células/poço e incubadas a 37°C em atmosfera de 5% de CO 2 por
24 horas para aderência celular a microplaca. A seguir foram preparadas diluições
seriadas do extrato metanólico de escapos de S. nitens incorporado e não
incorporado no SPCLM, de maneira a se obter concentrações de 1000 a 3,90 µg/mL.
Foram adicionadas aos poços das microplaca após a retirada de todo o meio e das
células que não aderiram, sendo novamente incubadas por 24 horas. A
citotoxicidade dos compostos foi determinada pela adição de 30 µL do revelador
resazurina (0,01%) e leitura após 6 horas de incubação. A leitura foi realizada no
leitor de microplacas SpectraFluor Plus (TECAN®), utilizando-se filtros de excitação
e emissão nos comprimentos de ondas de 530 e 590 nm respectivamente. A
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Material e Métodos 72
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citotoxicidade (IC50) foi definida como a maior concentração do composto capaz de
permitir a viabilidade de pelo menos 50% das células (O'BRIEN et al., 2000).
Estes ensaios foram realizados no Laboratório de Micobacteriologia da
Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara-UNESP, sob supervisão do
Prof. Dr. Fernando Rogério Pavan.
4.4.4. Análise do perfil inibitório sobre a formação de hifas em C. albicans
Este ensaio foi desenvolvido segundo Araújo et al. (2013). Para análise da
atividade sobre a inibição de formação de hifas, uma suspensão previamente
preparada foi cultivada por 24 horas para se obter C. albicans (ATCC 10231) em
filamentação. A cepa fúngica foi ressuspensa a uma concentração de 2,5 x
10³cél/mL em solução de PBS pH 7,2 e a partir daí, uma alíquota de 20 μL deste
crescimento foi adicionado a poços contendo meio RPMI 1640 acrescido de soro
fetal bovino (10%) e gentamicina (1%) e a solução do extrato de S. nitens
incorporado/não incorporado no SPCL, avaliada nas concentrações de 2000 ug/mL
a 7,81 ug/mL. Ao final de 12 e 24 horas, foi analisada a inibição da formação das
hifas em microscópio de luz invertida com aumento de 400 x e registrada uma
imagem do campo observado para cada concentração. Anfotericina B à 16μg/mL foi
utilizada como controle positivo. Também foram realizados os controles do
crescimento fúngico, esterilidade do solvente e meio de cultura.
4.4.5. Formação de biofilme in vitro
O método de formação do biofilme foi realizado como descrito por Pitangui et
al. (2013) com modificações. Inicialmente 100μL das suspensões dos inóculos (5,0 x
108 cel/mL-1) preparadas em solução salina estéril (0,9%) foram adicionados em
placas de microdiluição com 96 poços. As mesmas foram incubadas sob rotação a
37 ºC durante 2 horas a 80 rpm para a pré-adesão do biofilme. O sobrenadante foi
removido de cada poço e, em seguida, 100 μL de meio RPMI foram adicionados e
procedeu-se a incubação das mesmas à 37° C por 48 horas, incluindo troca do meio
RPMI depois de transcorridas 24 horas. Após todo o período de incubação, o
sobrenadante foi removido e os poços foram lavados com 100μL de solução salina
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Material e Métodos 73
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estéril (0,9%). Foram adicionados 100μL do material vegetal incorporado e não
incorporado, nas concentrações de 20, 10, 5, 2.5, 1.2 e 0.6 mg/mL. As microplacas
foram novamente incubadas durante 24 horas a 37 °C. Como controle positivo foi
utilizado anfotericina B nas concentrações de 16, 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.2 e 0.1 mg/mL.
Também foram realizados controles com o SPCLM puro e com o DMSO à 20%. Os
ensaios foram executados em triplicata e a revelação dos mesmos foi feita pela
redução do 2,3-bis (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil) -5- [carbonilo (fenilamino)]-2Htetrazólio-hidróxido (XTT ®). A presença de viabilidade fúngica foi representada pela
coloração vermelha e ausência da mesma manteve os poços incolores.
A Figura 13 apresenta um teste revelado com o XTT aonde é possível
observar a viabilidade celular (coloração vermelha) e a ausência da mesma
(ausência de coloração).
Figura 13. Ensaio do biofilme in vitro revelado com XTT
Fonte: O autor
Este teste parte do princípio de que quando o XTT entra em contato com as
células vivas do fungo produtor de biofilme é reduzido por desidrogenases
mitocondriais metabolicamente ativas o que gera o desenvolvimento da coloração
laranja, característica da substância Formazan. A Figura 14 apresenta a reação de
redução do XTT.
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Matheus Ap. Santos Ramos
Material e Métodos 74
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Figura 14.Reação de redução do XTT
Fonte: Klein, 2012.
4.4.6. Ensaio Time kill
A fim de verificar o tempo que o extrato (incorporado e não incorporado)
necessita para promover a morte ou diminuição do crescimento fúngico, o ensaio foi
realizado segundo Zore et al., 2011. A Tabela 2 apresenta as cepas utilizadas no
estudo.
Em um tubo de ensaio contendo 9mL meio de cultura RPMI 1640 com a
levedura previamente padronizada (2,5x103 células/mL) foi adicionado 1mL do
extrato vegetal não incorporado e incorporado no SPCLM na concentração de 2x o
valor de CIM obtido (item 4.4.1.).
A mistura foi incubada a 37 ºC e, a partir daí, nos tempos 0 min, 30 min, 1, 2,
4, 8, 12, 24, 36 e 48 horas, foram retirados 500µL do conteúdo do mesmo e diluídos
em solução tamponada de PBS estéril na proporção 1:1. Foram submetidos à
centrifugação a 5.000 rpm por 2 minutos e após, todo o sobrenadante foi descartado
e o precipitado ressuspendido em 1 mL de PBS estéril. A partir desta suspensão, foi
realizado uma diluição 1:10 novamente com o tampão PBS e uma alíquota de 100µL
foi semeada na superfície de placas de ASD com auxílio de uma alça de Drigalski
estéril. Após 48 horas de incubação, procedeu-se a contagem das colônias.
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Matheus Ap. Santos Ramos
Material e Métodos 75
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Tabela 2. Cepas fúngicas e concentração dos extratos usados no ensaio de time kill
Cepas fúngicas
Espécie
Extrato não
Extrato
incorporado*
incorporado
ATCC 10231
C. albicans
500µg/mL
125µg/mL
CAV 3
C. albicans
500µg/mL
62,5µg/mL
ATCC 6258
C. krusei
250µg/mL
125µg/mL
CKV 3
C. krusei
125µg/mL
62,5µg/mL
ATCC 2001
C. glabrata
125µg/mL
7,8µg/mL
CGV 2
C. glabrata
125µg/mL
15,6µg/mL
ATCC 750
C. tropicalis
500µg/mL
250µg/mL
CTV 2
C. tropicalis
500µg/mL
250µg/mL
ATCC 22019
C. parapsilosis
500µg/mL
15,6µg/mL
CPV 1
C. parapsilosis
500µg/mL
62,5µg/mL
4.5. Ensaios experimentais de CVV in vivo
Os ensaios experimentais de CVV in vivo (profilático e terapêutico) foram
submetidos ao Conselho de Ética do Uso de Animais (CEUA) da Faculdade de
Ciências Farmacêuticas de Araraquara (UNESP/FCFAR), tendo obtido o número de
protocolo: CEUA 34/2013 (Anexo 1).
Os animais foram mantidos no biotério do Departamento de Ciências
Biológicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara – UNESP, com
temperatura e ventilação adequada, 12 horas de ciclo claro/escuro e, fez-se livre o
consumo de água e alimento durante o decorrer de todo o experimento. Os animais
foram alojados em gaiolas com dimensões de 50x60x22cm forradas com maravalha
esterilizada, e permaneceram durante 7 dias na sala experimental antes do início
dos procedimentos.
O ensaio terapêutico de CVV foi realizado com a espécie C. albicans como
agente patológico visto à prevalência da mesma nos casos de infecções. Já o ensaio
de profilaxia objetivou empregar uma cepa de linhagem não-albicans, sendo assim,
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Matheus Ap. Santos Ramos
Material e Métodos 76
__________________________________________________
foi encolhida a espécie C. krusei devido sua resistência intrínseca ao fluconazol e
ser considerada de difícil tratamento nos casos de CVV.
4.5.1. Ensaio terapêutico experimental in vivo de CVV causada por C. albicans
Foram realizados ensaios com 2 cepas de C. albicans, uma de origem clínica
(CAV 3) e outra padrão (ATCC 10231), nos quais, foram empregadas ratas fêmeas
da linhagem Wistar (Rattus novergicus) com 8 semanas de idade, pesando entre
150-200 g.
O ensaio foi desenvolvido de acordo com Araújo et al. (2013), com
modificações. Inicialmente, os animais foram submetidos a um estado de
imunossupressão através da administração de 0,3 mL de ciclofosfamida – SIGMA®
(50 mg/p.c.) em dose única por via intraperitoneal e, para que houvesse a obtenção
do estado pseudo-estro, foi injetado 0,1 mL de solução de estradiol – SIGMA® (20
mg/mL) por via subcutânea no dia da imunossupressão, e nos 10 dias
subsequentes. O estado hormonal foi verificado de acordo com as considerações de
Marcondes et al. (2002), através de análises microscópicas da morfologia celular
encontrada no fluido vaginal dos animais, obtido através da lavagem com 0,1 mL de
solução PBS tamponada estéril, onde a presença de células epiteliais cornificadas e
anucleadas indicaram a fase pseudo-estro.
Após o a adequação do ciclo estral dos animais de cada grupo específico,
procedeu-se a infecção intravaginal com uma suspensão de 5.0x107 células/mL de
C. albicans (ATCC 10231 e CAV 3) preparadas em solução PBS tamponada estéril.
através da injeção de 0,1mL da suspensão fúngica com auxílio de um
micropipetador . Para verificação da infecção, após dois dias da inoculação foram
realizadas lavagens vaginais com 0,1 mL de solução tamponada de PBS estéril,
submetidas a análise microscópica e cultivadas em Ágar Sabouraud Dextrose
acrescido de cloranfenicol (ASD+clo). As placas foram incubadas a 37º C durante 48
horas. A presença de células leveduriformes livres ou em brotamento observadas
sob microscopia óptica e o crescimento de unidades formadoras de colônias (UFC)
no meio de cultura foi considerado positivo para a infecção.
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Matheus Ap. Santos Ramos
Material e Métodos 77
__________________________________________________
4.5.1.1. Grupos experimentais e tratamento terapêutico
Foram empregados 13 grupos experimentais constituídos de 6 animais
(n=78). A Tabela 3 apresenta os grupos experimentais e seus respectivos
parâmetros de tratamentos estabelecidos para a determinação do potencial
antifúngico do extrato metanólico dos escapos de S. nitens.
Os tratamentos empregados nos ensaios foram realizados duas vezes ao dia
durante 8 dias. Os grupos 3 e 9, utilizados como controle com antifúngico, foram
procedidos com o emprego de um creme vaginal a base de cloridrato de tetraciclina
(25 mg/g) + anfotericina B (12,5 mg/g) (EMS ® São Paulo, Brasil). Os grupos 5,7, 11
e 13 (tratamento com S. nitens incorporado/não incorporado) tiveram a
administração do extrato na concentração de 2 vezes o valor da CIM do extrato não
incorporado, obtida na triagem in vitro (500 ug/mL). Os grupos 4, 6, 10 e 12 foram
constituídos dos veículos/ solventes utilizados para a administração do extrato.
Todos os animais foram submetidos a pesagem diária durante o período de
tratamento, os valores encontrados foram comparados àqueles pertencentes ao
grupo controle negativo de infecção (não infectados - Grupo 1). Estes dados
permitiram observar fatores como a desnutrição e/ou obesidade que por ventura
foram ocasionados pela administração do extrato ou ao estabelecimento do estado
patológico.
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Matheus Ap. Santos Ramos
Material e Métodos 78
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Tabela 3. Grupos experimentais e tratamentos do ensaio de tratamento da CVV causada
por C. albicans.
Grupo experimental
Especificação
Tratamento
Grupo 1*
Controle negativo de
infecção
Solução de PBS estéril
Grupo 2*
Controle de infeção
Solução de PBS estéril
Grupo 3*
Controle positivo com
antifúngico
0,1 mL de creme antifúngico
Grupo 4*
Controle do solvente
0,1 mL de solução à 20% de
DMSO
Grupo 5*
Tratamento 1
0,1 mL do extrato puro (500
ug/mL)
Grupo 6*
Controle do SPCL
0,1 mL do SPCL sem o
extrato
Grupo 7*
Tratamento 2
0,1 mL do SPCL com o
extrato (500 ug/mL)
Grupo 8**
Controle de infecção
Solução de PBS estéril
Grupo 9**
Controle positivo com
antifúngico
0,1 mL de creme antifúngico
Grupo 10**
Controle do Solvente
0,1 mL de solução à 20% de
DMSO
Grupo 11**
Tratamento 3
0,1 mL do extrato puro (500
ug/mL)
Grupo 12**
Controle do SPCL
0,1 mL do SPCL sem o
extrato
Grupo 13**
Tratamento 4
0,1 mL do SPCL com o
extrato (500 ug/mL)
* C. albicans ATCC 10231; ** C. albicans CAV 3
4.5.1.2. Análise da eficácia do tratamento
Para a verificação da eficácia dos compostos empregados em estudo, foram
realizadas análises microscópicas e cultura dos fluidos vaginais com o intuito de
determinar a carga fúngica vaginal. Nos dias 2, 4, 6 e 8 do período de tratamento, os
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Matheus Ap. Santos Ramos
Material e Métodos 79
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animais foram submetidos à coleta dos fluidos vaginais para que pudessem ser
procedidas as análises, os mesmos foram obtidos através de lavagem intravaginal
com 0,1 mL de solução tamponada de PBS (pH 7,4) estéril com auxílio de um
micropipetador. Após a obtenção do fluido, foram realizadas análises microscópicas
afim de verificar a presença ou ausência de leveduras no ambiente vaginal e,
também foi realizado a semeadura do mesmo em ASD+clo, e incubação a 37ºC em
48 horas, para que fosse quantificado o número de UFC em cada dia da análise do
tratamento.
4.5.1.3. Análise da recidiva de infecção e eutanásia
Após os 8 dias do término do período de tratamento, os animais foram
submetidos ao controle de recidiva da infecção afim de identificar e diagnosticar
posteriores estados infecciosos. Para este fim, foram procedidas análises
microscópicas e culturas dos fluidos vaginais coletados diariamente da mesma
maneira que foram coletados e analisados durante o período de análise da eficácia
do tratamento por um período de 7 dias. Os animais foram eutanasiados em câmara
de CO2.
4.5.1.4. Análises estatísticas
Os dados estatísticos foram analisados por ANOVA. Para a comparação dos
resultados dos tratamentos foi utilizado o teste de Tukey e para a comparação dos
resultados do tratamento e o controle foi empregando o teste de Dunnett.
4.5.2. Ensaio in vivo de profilaxia de CVV causada por C. krusei
Este ensaio foi desenvolvido de acordo com Araújo et al. (2013) e Zeng et al.
(2011). Foram empregadas ratas fêmeas da linhagem Wistar (Rattus novergicus)
com 8 semanas de idade e peso entre 150-200 g. Os animais foram distribuídos em
seis grupos experimentais compostos por 4 animais em cada. A Tabela 4 apresenta
todas as considerações referentes aos grupos experimentais.
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Matheus Ap. Santos Ramos
Material e Métodos 80
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Inicialmente, os animais dos grupos 3, 4, 5 e 6 foram levados a um estado de
imunossupressão com a aplicação intraperitoneal de solução de ciclofosfamida –
SIGMA® (50 mg/ p.c.) no primeiro dia do experimento, para que pudessem se tornar
susceptíveis ao desenvolvimento do estado patológico posteriormente.
Todos os animais foram tratados duas vezes ao dia com seus respectivos
agentes terapêuticos durante 10 dias que antecederam a infecção.O tempo deste
tratamento baseou-se no tempo de morte e/ou declínio do crescimento fúngico
obtido no ensaio time kill. Do 5º ao 10º dia de tratamento pré-infecção, os animais
foram submetidos à indução do estado pseudo-estro com aplicação subcutânea de
solução de estradiol – SIGMA® (0,2 mg/mL.) uma vez ao dia. O percurso da
mudança do ciclo estral dos animais foram observados por microscopia óptica a
partir de lavagens vaginais com solução tamponada de PBS estéril (100µL),
segundo Marcondes et al. (2002) onde a presença de células epiteliais cornificadas
e anucleadas representou a fase estral pretendida.
Tabela 4. Considerações gerais dos grupos experimentais do ensaio profilático
Grupo experimental
Número de animais
Condições de
experimento
Negativo de infecção
Tratamento
desenvolvido*
Solução de PBS estéril
Grupo 1
4
Grupo 2
4
Infectados sem
imunossupressão
Solução de PBS estéril
Grupo 3
4
Infectados com
imunossupressão
Solução de PBS estéril
Grupo 4
4
Infectados e tratados
com antifúngico
Creme vaginal de
anfotericina B
Grupo 5
4
Infectados e tratados
com o extrato não
incorporado
Extrato não
incorporado a 250
µg/mL
Grupo 6
4
Infectados e tratados
com o extrato
incorporado
Extrato incorporado a
250 µg/mL
* realizado 2 vezes ao dia
Após 10 dias de tratamento pré-infecção e da prévia indução do estado
pseudo-estro, os animais foram infectados com uma suspensão de C. krusei
(5,0x106 células/mL) por via intravaginal (100µL) com auxílio de um micropipetador.
__________________________________________________
Matheus Ap. Santos Ramos
Material e Métodos 81
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Os animais foram mantidos em repouso durante 2 dias que procedeu-se a infecção
para a fixação do inoculo e, somente depois deste período, foram realizadas
lavagens vaginais com PBS estéril para a verificação da carga fúngica vaginal,
sendo esta realizada com a observação microscópica do lavado vaginal à fresco e
também com a cultura do mesmo em ASD acrescido de cloranfenicol (ASD+clo).
O tratamento teve duração de mais 10 dias após a infecção dos animais,
onde foram coletados os lavados vaginais nos dias 2, 4, 6, 8, e 10, para a verificação
microscópica da presença de células fúngicas e também a cultura do mesmo em
ASD+clo.
Após o período de análise dos resultados, os animais foram eutanasiados em
câmera de CO2.
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Matheus Ap. Santos Ramos
__________________________________________________
5. Resultados
“O mundo está nas mãos daqueles que tem a coragem de sonhar e
correr o risco de viver seus sonhos”
(Paulo Coelho)
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Matheus Aparecido dos Santos Ramos
Resultados 83
__________________________________________________
5. RESULTADOS
5.1. Desenvolvimento do sistema precursor de cristais líquidos mucoadesivos
5.1.1. Elaboração do diagrama de fases ternário
A leitura do diagrama foi realizada no sentido horário, onde o lado direito
refere-se ao tensoativo, o esquerdo à fase aquosa e a base à fase oleosa. A Figura
15 apresenta as 36 formulações obtidas a partir da mistura dos constituintes do
sistema, o qual foi classificado visualmente sob auxílio de luz direta em: sistema
opaco, sistema líquido transparente, sistema líquido translúcido, sistema viscoso
transparente, sistema viscoso translúcido e sistemas que apresentaram separação
entre as fases.
Figura 15. Diagrama de fases pontual do SPCLM constituído de AO (fase oleosa), PRO
(tensoativo) e DP (fase aquosa).
PRO
0
10
100
90
20
80
30
70
40
60
50
50
60
40
70
30
80
20
90
10
100
0
DP
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
AO
Sistema Viscoso Opaco
Separação de Fases
Sistema Líquido Translúcido
Sistema Viscoso Translúcido
Sistema Líquido Transpente
Sistema Viscoso Transparente
__________________________________________________
Matheus Ap. Santos Ramos
Resultados 84
__________________________________________________
De acordo com os dados observados no diagrama de fases desenvolvido,
houve uma maior prevalência de pontos com aparência líquida transparente
(30,5%), em seguida, aqueles que mostraram-se viscosos e opacos (22,2%) e, em
ordem decrescente: separação de fases (16,7%), viscosos translúcidos (13,9%),
líquidos translúcidos (11,1%) e por fim os viscosos porém transparentes (5,6%).
5.1.1.1. Microscopia de luz polarizada (MLP)
A Tabela 5 apresenta os resultados das amostras selecionadas para serem
analisadas por microscopia de luz polarizada, assim como as mesofases
correspondentes de cada formulação de acordo com as características visualizadas.
Tabela 5. Formulações analisadas por MLP
Amostra
Estrutura Visualizada
Mesofase
F14 E F16
Campo escuro
Microemulsão
F17
Estrias
Hexagonal
F18
Cruz de malta
Lamelar
F19, F20 E F21
Campo escuro
Microemulsão
F22
Estrias
Hexagonal
F23
Estrias + Cruz de malta
Transição p/ fase cúbica
F24, F25 E F26
Campo escuro
Microemulsão
F27
Estrias
Hexagonal
F28
Estrias + Cruz de malta
Transição p/ fase cúbica
F29
Campo escuro
Microemulsão
F30 E F31
Estrias
Hexagonal
F32, F33, F34, F35 E F36
Campo escuro
Microemulsão
As estruturas visualizadas: Estrias, Cruz de Malta, Campo escuro e
Estrias+Cruz de Malta, comprovam a presença de mesofases que correspondem
aos sistemas líquido-cristalinos (CHORILLI et al., 2011).
5.1.2. Escolha da formulação para análises farmacotécnicas e biológicas
__________________________________________________
Matheus Ap. Santos Ramos
Resultados 85
__________________________________________________
Após a análise de todas as formulações obtidas por meio do diagrama de
fases ternário foram escolhidas as formulações 25 e 26 para prosseguir a
investigação. As formulações apresentaram-se como campo escuro na análise por
MLP o que o que as classifica como um provável SPCLM.
A Formulação 25, eleita por possuir todos os critérios necessários para sua
aplicabilidade, foi composta de 40% de fase oleosa (AO), 20% de fase aquosa (DP)
e 40% de tensoativo (PRO). Esta formulação foi empregadas em todas análises
antifúngicas in vitro e in vivo desenvolvidas com as cepas de C. albicans.
A Formulação 26, também eleita por possuir todos os critérios necessários
para sua aplicabilidade, foi composta de 50% de fase oleosa (AO), 10% de fase
aquosa (DP) e 40% de tensoativo (PRO). Esta formulação foi empregadas em todas
análises antifúngicas in vitro de C. krusei, C. glabrata, C. tropicalis e C. parapsilosis,
assim como no ensaio profilático in vivo com C. krusei.
5.1.3. Ensaio de efeito muco nos sistemas
Após a incorporação do extrato (2000 µg/mL), as formulações foram
submetidas à adição do muco vaginal artificial (MVA), a fim de verificar o
comportamento precursor de cristais líquidos das mesmas. As Tabelas 6 e 7
apresentam os resultados da análise por microscopia de luz polarizada para as
formulações F25 e F26 respectivamente.
Tabela 6. Resultados da microscopia de luz polarizada para a avaliação do comportamento
precursor de cristais líquidos da formulação 25
Teste
Viscosidade
Estrutura
visualizada
Mesofase
F25+5% de MVA
+
Campo escuro
Microemulsão
F25+10% de MVA
++
Campo escuro
Microemulsão
F25+30% de MVA
+++
Cruz de Malta
Lamelar
F25+50% de MVA
++++
Estrias
Hexagonal
F25+100% de MVA
+++++
Campo escuro
Cúbica
+= viscosidade
__________________________________________________
Matheus Ap. Santos Ramos
Resultados 86
__________________________________________________
Tabela 7. Resultados da microscopia de luz polarizada para a avaliação do
comportamento precursor de cristais líquidos da formulação 26
Teste
Viscosidade
Estrutura
visualizada
Mesofase
F26+5% de MVA
+
Campo Escuro
Microemulsão
F26+10% de MVA
++
Campo escuro
Microemulsão
F26+30% de MVA
+++
Cruz de Malta
Lamelar
F26+50% de MVA
++++
Estrias
Hexagonal
F26+100% de MVA
+++++
Campo Escuro
Cúbica
+ =viscosidade
Nota-se que ambas as formulações comportaram-se de maneira idêntica,
apresentado os mesmos resultados em todas as concentrações de MVA avaliadas.
A viscosidade das formulações cresce diretamente proporcional à concentração de
MVA, o que demonstra que quanto maior a quantidade de MVA, maior é a
viscosidade do sistema. O mesmo procedimento foi repetido com as formulações
puras (sem extrato), sendo encontrados os mesmos resultados, o que pode afirmar
que a introdução do extrato no sistema não interfere estruturalmente no seu
comportamento precursor de cristais líquidos.
As formulações acrescidas de 5 e 10% de MVA apresentaram-se líquidas e
campo escuro pela análise por MLP, característico de microemulsão. As com 30 e
50% mostraram-se bem delimitadas com a presença de cruz de malta (30%) e
estrias (50%), o que caracteriza as fases lamelar e hexagonal respectivamente.
Apesar da formulação acrescida de 100% de MVA também apresentar a mesma
característica (campo escuro) que àquelas com 5 e 10%, a alta viscosidade em que
o conjunto (SPCLM+MVA) apresentou-se, classifica-o como característico de fase
cúbica.
A Figura 16 representa o teste desenvolvido em ambas as formulações, com
a presença do MVA nas suas respectivas concentrações avaliadas (5, 10, 30, 50 e
100%) através de MLP.
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Matheus Ap. Santos Ramos
Resultados 87
__________________________________________________
Figura 16. Fotomicrografia do ensaio com MVA por microscopia de luz polarizada (20x) das
formulações F25 e F26
a - e: SPCLM com 5, 10, 30, 50 e 100% de MVA respectivamente / f - j: SPCLM+extrato com 5, 10,
30, 50 e 100% de MVA respectivamente
5.1.4. Análises reológicas contínuas (Curva de fluxo)
A Figura 17 representa a as formulações 25 e 26 que foram submetidas às
análises reológicas contínuas.
Figura 17. Formulações submetidas à análises reológicas contínuas
a= formulações sem o extrato, com e sem a presença de MVA; b= formulações com o extrato, com
e sem a presença de MVA.
Os gráficos apresentando os resultados das análises reológicas das
formulações 25 (P25) e 26 (P26) incorporado e não incorporado com e sem a adição
de MVA estão expressos nas Figuras 18 e 19.
__________________________________________________
Matheus Ap. Santos Ramos
Resultados 88
__________________________________________________
Figura 18. Reograma da formulação 25 (F25)
200
P25 + muco + extrato
P25 + muco
P25
P25 + extrato
Tensão de Cisalhamento (Pa)
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
0
50
100
Taxa de Cisalhamento (1/s)
Símbolos cheios curva ascendente, símbolos vazios curva descendente.
Figura 19. Reograma da formulação 26 (F26)
Tensão de cisalhamento (Pa)
60
F26 + EXTRATO + MUCO
F26 + MUCO
F26 + EXTRATO
F26
40
20
0
0
20
40
60
80
100
Taxa de cisalhamento (1/s)
Símbolos cheios curva ascendente, símbolos vazios curva descendente.
__________________________________________________
Matheus Ap. Santos Ramos
Resultados 89
__________________________________________________
A partir das curvas de fluxo observadas é possível supor que ambas as
formulações submetidas à adição de MVA independente de conter o extrato
incorporado, se comportaram como fluidos não newtonianos, do tipo pseudoplástico
com tixotropia, uma vez que a curva de volta não sobrepõe a de ida. . Porém,
observou-se diminuição na área de histerese das formulações, revelando que o
retorno à reestruturação acontece de maneira mais rápida, ou seja, possui a
capacidade de retornar a sua forma original quando a tensão é diminuída, o que é
desejado para a aplicação proposta.
Em relação às formulações sem a presença de MVA observou-se
comportamento idêntico entre as mesmas, onde pode-se classificá-las como
sistemas Newtonianos independentemente da presença ou não do extrato vegetal.
A Tabela 8 apresenta os dados matemáticos referentes ao comportamento de
fluxo obtido no ensaio reológico com as formulações acrescidas de MVA.
Tabela 8. Comportamento de fluxo (n) e índice de consistência (K) das formulações em
contato com MVA
Formulações
n*
K*
F25 + EXT + MUCO
0,30
17,64
F25 + MUCO
0,23
55,11
F26 + EXT + MUCO
0,27
10,88
F26 + MUCO
0,01
29,36
*valores representado pelas médias (±DP) obtidas a partir de três replicatas.
Através dos valores observados conclui-se que as formulações apresentam
um comportamento pseudoplástico, pois apresentaram valores de n <1 e com
tixotropia, ou seja, eles foram capazes de retornar para a sua estrutura original
quando a tensão de corte foi removida, a qual se mostrou com um aumento do seu
índice de consistência (k). Este comportamento é característico dos sistemas de
líquido-cristalinos, devido à formação da estrutura cristalina semi-sólida ( REN et al.,
2012).
Em relação às formulações sem a presença do MVA conclui-se através dos
dados matemáticos (Tabela 9) que ambas mostraram-se comportamento de fluxo
__________________________________________________
Matheus Ap. Santos Ramos
Resultados 90
__________________________________________________
característico de um líquido Newtoniano, ou seja, as formulações não sofrem
nenhuma intervenção sobre a imposição e a retirada da taxa de cisalhamento, os
valores de n próximo a 1 e o declínio “K” são as principais características deste
tipos de sistemas (BERNEGOSSI, 2013).
Tabela 9. Comportamento de fluxo (n) e índice de consistência (K) das formulações sem a
adição de MVA
Formulações
n*
K*
F25
1.0
0.059
F25 +EXTRATO
1.0
0.069
F26
0,991
0,033
F26 + Extrato
0,900
0.031
*valores representado pelas médias (±DP) obtidas a partir de três replicatas.
5.1.5. Avaliação in vitro da força mucoadesiva (mucoadesão)
As Figuras 20 a 23 apresentam os resultados obtidos no teste de
mucoadesão in vitro referentes ao trabalho e a força bioadesiva que as formulações
exerceram sobre a mucosa vaginal.
Figura 21. Força bioadesiva de F25
30
18
25
15
Força Mucoadesiva (mN)
Trabalho da Força Mucoadesiva (mN.s)
Figura 20. Trabalho da força bioadesiva
de F25
20
15
10
5
0
F25
ATO
ATO
UCO
+M
XTR
XTR
+E
+E
F25
5
O
2
F
UC
+M
F25
Formulações
12
9
6
3
0
F25
ATO
ATO
UCO
+M
XTR
XTR
+E
+E
F25
5
O
2
F
UC
+M
F25
Formulações
__________________________________________________
Matheus Ap. Santos Ramos
Resultados 91
__________________________________________________
Figura 22. Força mucoadesiva de F26
Figura 23. Trabalho da força mucoadesiva F26
Trabalho da Força Mucoadesiva (mN.s)
14
Força mucoadesiva (mN)
12
10
8
6
4
2
0
P2
6
TO
A
TR
X
P2
E
6+
TO
O
6
P2
+
+
26
C
MU
2000
1500
1000
500
0
6
P2
A
TR
EX
O+
6
P2
C
MU
R
XT
+E
O
TO
UC
RA
+M
XT
E
+
CO
MU
6+
O
AT
6
P2
P
P2
Formulações
Formulações
Os resultados mostraram que a incorporação de extrato não causou
alterações significativas no mucoadesão das formulações (p> 0,05), mas quando foi
adicionado o MVA na proporção 1:1, houve um significativo aumento dos parâmetros
mucoadesivos. Estes resultados podem pressupor que quando as formulações
entrarem em contato com o muco vaginal poderão ser capazes de aderir mais
fortemente com a mucosa e, consequentemente, irão permanecer durante mais
tempo no ambiente vaginal devido à característica de mucoadesividade.
5.1.6. Incorporação do extrato vegetal no SPCLM
Após os resultados preliminares da CIM do extrato não incorporado frente a
todas as cepas empregadas no estudo, partiu-se para a incorporação do mesmo na
concentração de 4x o valor obtido.
A incorporação foi realizada inicialmente com a incorporação do extrato
vegetal
diretamente
no
SPCLM
puro
e,
após
esta
adição,
o
conjunto
(SPCLM+extrato) foi submetido à sonicação por meio de banho ultrassônico em
temperatura ambiente não excedendo o tempo de 30 minutos, para que não
houvesse possíveis degradações tanto do sistema quanto do extrato. As Figuras 24
e 25 apresentam as formulações com os extratos incorporados em suas respectivas
concentrações.
__________________________________________________
Matheus Ap. Santos Ramos
Resultados 92
__________________________________________________
Figura 24. Formulação 25* com o extrato incorporado
*empregada na avaliação antifúngica in vitro com as cepas de C. albicans
Figura 25. Formulação 26* com o extrato incorporado
*empregada na avaliação antifúngica in vitro com as cepas não-albicans.
Após a incorporação do extrato, as formulações foram submetidas à análise
por microscopia de luz polarizada sob aumento de 20x, a fim verificar se a
introdução do extrato interferiu na estrutura do SPCLM. As Figuras 26 e 27
apresentam as formulações antes e após (escolhida a maior concentração para a
análise) a incorporação do extrato vegetal.
Figura 26. Formulação 25 antes e após a incorporação do extrato
a= SPCLM puro; b= SPCL+extrato
__________________________________________________
Matheus Ap. Santos Ramos
Resultados 93
__________________________________________________
Figura 27. Formulação 26 antes e após a incorporação do extrato
a= SPCLM puro; b= SPCL+extrato
Através das análises por MLP possível confirmar que o extrato vegetal não
interferiu na estrutura do sistema, sendo observado campo escuro antes e após a
incorporação, característico da mesofase microemulsão, portanto, esta análise
comprovou que mesmo após a incorporação do extrato o sistema permaneceu com
a propriedade precursora de cristais líquidos.
5.2. Análises antifúngicas in vitro
5.2.1. Determinação da concentração inibitória mínima (CIM)
As Tabelas 10 a 14 apresentam os resultados de CIM obtidos na avaliação da
atividade antifúngica do extrato frente a todas as cepas empregadas no estudo,
assim como seus respectivos resultados da avaliação com os antifúngicos
empregados como controles positivos.
Tabela 10. Concentração inibitória mínima do extrato metanólico de escapos de S. nitens
não incorporado e incorporado no SPCLM frente a C. albicans
CIM (µg/mL)
Amostra
S. nitens
não
incorporado
S. nitens
incorporado
fluconazol
anfotericina B
ATCC 10231
250
62,5
R
0,12
CAV 1
125
62,5
R
0,12
CAV 2
250
62,5
R
0,12
CAV 3
125
31,2
R
0,12
CAV4
125
62,5
R
0,50
CAV5
250
62,5
R
0,25
(R) resistência
__________________________________________________
Matheus Ap. Santos Ramos
Resultados 94
__________________________________________________
Tabela 11. Concentração inibitória mínima do extrato metanólico de escapos de S. nitens
não incorporado e incorporado no SPCLM frente a C. krusei
CIM (µg/mL)
Amostra
S. nitens
não
incorporado
S. nitens
incorporado
fluconazol
anfotericina B
ATCC 6258
125
62,5
R
0,50
CKV 1
125
31,2
R
1,00
CKV 2
125
31,2
R
1,00
CKV 3
62,5
31,2
R
1,00
(R) resistência
Tabela 12. Concentração inibitória mínima do extrato metanólico de escapos de S. nitens
não incorporado e incorporado no SPCLM frente a C. glabrata
CIM (µg/mL)
Amostra
S. nitens
não
incorporado
S. nitens
incorporado
fluconazol
anfotericina B
ATCC 2001
62,5
3,9
R
0,25
CGV 1
62,5
7,8
R
0,50
CGV 2
62.5
7,8
R
0,50
CGV 3
125
15,6
R
1,00
(R) resistência
Tabela 13. Concentração inibitória mínima do extrato metanólico de escapos de S. nitens
não incorporado e incorporado no SPCLM frente a C. tropicalis
CIM (µg/mL)
Amostra
analisada
S. nitens
não
incorporado
S. nitens
incorporado
fluconazol
anfotericina B
ATCC 2001
250
125
128
0,50
CTV 1
500
250
R
0,25
CTV 2
250
125
R
2,00
CTV 3
500
125
R
4,00
(R) resistência
__________________________________________________
Matheus Ap. Santos Ramos
Resultados 95
__________________________________________________
Tabela 14. Concentração inibitória mínima do extrato metanólico de escapos de S. nitens
não incorporado e incorporado no SPCLM frente a C. parapsilosis
CIM (µg/mL)
Amostra
S. nitens
não
incorporado
S. nitens
incorporado
fluconazol
anfotericina B
ATCC 2001
250
7,8
16
0,50
CPV 1
250
62,5
R
0,25
CPV 2
500
62,5
R
0,50
CPV 3
500
31,2
R
0,50
(R) resistência
Os resultados obtidos comprovaram a ação antifúngica exercida pelo extrato
vegetal, visto que o mesmo mostrou-se ativo para todas as cepas de Candida spp.
estudo. A melhor atividade foi demonstrada para C. glabrata (CIM entre 62,5-125
µg/mL), C. krusei (CIM entre 62,5-125 µg/mL), C. albicans (CIM entre 125-250
µg/mL), C. tropicalis (CIM entre 250-500µg/mL) e C. parapsilosis (CIM entre 250500µg/mL), em ordem decrescente.
Para o extrato incorporado os resultados mostraram-se mais promissores,
visto que promoveu a diminuição da CIM de todas as cepas testadas como foram
apresentadas nas Tabelas 10 a 14. Ressaltamos os resultados obtidos coms as
cepas de C. albicans onde a CIM do extrato incorporado passou de 250 para 62,5
µg/mL em 3 cepas, de 125 para 62,5 µg/mL em outras 2 cepas e de 125 para 31,2
µg/mL na outra cepa. As linhagens não-albicans apresentaram resultados de
extrema importância, nas cepas de C. krusei foram evidenciados valores de 31,552,5 após a incoporação do extrato, C. glabrata: 3,9 a 15,6 µg/mL, C. tropicalis: 125250 e C. parapsilosis: 7,8 a 62,5 µg/mL.
5.2.2. Determinação da concentração fungicida mínima (CFM)
As cepas de Candida apresentaram comportamento fungistático, ou seja,
após a retirada de uma alíquota de todos os poços da microplaca houve crescimento
fúngico em todas as concentrações testadas (>1000 µg/mL).
__________________________________________________
Matheus Ap. Santos Ramos
Resultados 96
__________________________________________________
5.2.3. Análise citotóxica in vitro
A Tabela 15 apresenta os resultados de citotoxicidade in vitro obtidos com o
extrato incorporado e não incorporado.
Tabela 15. Resultados da análise de citotoxicidade in vitro
Amostras analisadas
*IC 50* Vero®
*IC 50* HeLa®
F25 com extrato incorporado
<3,90
<3,90
F25 pura
<3,90
<3,90
Extrato em DMSO 20%
943,6
>1000
DMSO 20%
Sem toxicidade a partir de
1,25%
Sem toxicidade a partir de
1,25%
*valores em µg/mL
O extrato não incorporado não apresentou toxicidade em ambas a linhagens
avaliadas, já quando incorporado no SPCLM houve significativo aumento do perfil de
toxicidade, o que mostra-se importante quando avaliados sobre a linhagem HeLa,
devido ao seu perfil tumoral.
5.2.4. Análise do perfil inibitório sobre a formação de hifas em C. albicans
Os resultados encontrados na avaliação do efeito inibitório do crescimento
hifal do extrato não incorporado sobre C. albicans (ATCC 10231) estão
apresentados na Tabela 16. As Figuras 28 e 29 apresentam as imagens do teste
através das fotomicrografias obtidas da microscopia de luz invertida sob aumento de
40x.
Tabela 16. Resultados da avaliação do perfil de inibição hifal exercido pelo extrato de S.
nitens não incorporado sobre C. albicans (ATCC 10231)
Tempo
Concentrações avaliadas
Extrato não incorporadoa
AMB
a
1000 500
250
125
62,5
31,2
15,6
7,8
12horas
-
-
-
-
+
+
+
+
+
24 horas
-
-
-
+
+
+
+
+
+
valores em µg/mL; (-) ausência de crescimento hifal; (+) crescimento hifal
__________________________________________________
Matheus Ap. Santos Ramos
Resultados 97
__________________________________________________
Figura 28. Fotomicrografia de 12 horas do ensaio de inibição de hifa de C. albicans (ATCC
10231) realizado com o extrato de S. nitens não incorporado sob aumento de 40X
a=controle de crescimento; b=anfotericina 16 µg/mL; c – j= SPCLM+extrato nas concentrações de
1000 à 7,8 µg/mL em ordem decrescente.
Figura 29. Fotomicrografia de 24 horas do ensaio de inibição de hifa de C. albicans (ATCC
10231) realizado com o extrato de S. nitens não incorporado sob aumento de 40X
a=controle de crescimento; b=anfotericina 16 µg/mL; c – j= SPCLM+extrato nas concentrações de
1000 à 7,8 µg/mL em ordem decrescente.
As análises realizadas com o extrato incorporado no SPCLM estão
apresentadas na Tabela 17, e as imagens do ensaio estão apresentadas nas
Figuras 30 e 31.
__________________________________________________
Matheus Ap. Santos Ramos
Resultados 98
__________________________________________________
Tabela 17. Resultados da avaliação do perfil de inibição hifal exercido pelo extrato de S.
nitens incorporado no SPCLM sobre C. albicans (ATCC 10231)
Concentrações avaliadasa
Tempo
Extrato incorporado no SPCLM
AMB
1000
500
250
125
62,5
31,2
15,6
7,8
12horas
-
-
-
-
-
-
+
+
+
24 horas
-
-
-
-
-
-
+
+
+
a
valores em µg/mL; (-) ausência de crescimento hifal; (+) crescimento hifal
Figura 30. Fotomicrografia de 12 horas do ensaio de inibição de hifa de C. albicans (ATCC
10231) realizado com o extrato de S. nitens incorporado no SPCLM sob aumento de 40X
a=controle de crescimento; b=anfotericina 16 µg/mL; c – j= SPCLM+extrato nas concentrações de
1000 à 7,8 µg/mL em ordem decrescente
Figura 31. Fotomicrografia de 24 horas do ensaio de inibição de hifa de C. albicans (ATCC
10231) realizado com o extrato de S. nitens incorporado no SPCLM sob aumento de 40X
a=controle de crescimento; b=anfotericina 16 µg/mL; c – j= SPCLM+extrato nas concentrações de
1000 à 7,8 µg/mL em ordem decrescente
__________________________________________________
Matheus Ap. Santos Ramos
Resultados 99
__________________________________________________
Em relação ao extrato incorporado no SPCLM, a inibição de hifas se deu à
concentração de 31,2 após 12 e 24 horas de ensaio.
5.2.5. Ensaio de inibição do biofilme in vitro
A Tabela 18 apresenta os resultados do ensaio in vitro de inibição do biofilme
frente a todas as cepas de C. albicans empregadas no estudo.
Tabela 18. Controles e ação do extrato não incorporado e incorporado no SPCLM frente aos
biofilmes de C. albicans
Amostras analisadasa
Biofilme de
C. albicans
ATCC 10231
Extrato
incorporado
1,25
Extrato não
incorporado
> 20,0
anfotericina B
CAV 1
10,0
CAV 2
4,0
DMSO
20%
-
SPCLM sem
incorporação
-
> 20,0
8,0
-
-
20,0
> 20,0
4,0
-
-
CAV 3
10,0
> 20,0
8,0
-
-
CAV 4
1,25
> 20,0
16,0
-
-
CAV 5
1,25
> 20,0
16,0
-
-
a
valores em mg/mL; (-) sem inibição.
O extrato não incorporado não possui a capacidade de inibição do biofilme de
todas as cepas fúngicas, já o extrato na forma incorporada exerceu notório potencial
de inibição.
As Tabelas 19 a 21 apresentam os resultados do teste de inibição do biofilme
frente às linhagens não-albicans.
__________________________________________________
Matheus Ap. Santos Ramos
Resultados 100
__________________________________________________
Tabela 19. Controles e ação do extrato não incorporado e incorporado no SPCLM frente aos
biofilmes de C. krusei
Amostras analisadasa
Biofilme de
C. krusei
ATCC 6258
Extrato
incorporado
> 20,0
Extrato não
incorporado
> 20,0
anfotericina B
CKV 1
> 20,0
CKV 2
CKV 3
16,0
DMSO
20%
-
SPCLM sem
incorporação
-
> 20,0
8,0
-
-
10,0
> 20,0
8,0
-
-
> 20,0
> 20,0
4,0
-
-
a
valores em mg/mL; (-) sem inibição.
Em C. krusei nota-se que novamente o extrato não incorporado não exerceu
ação sobre o biofilme fúngico e, em relação a sua atividade quando incorporado no
SPCLM se observa atividade frente a uma única cepa fúngica (CKV 2), neste
sentido, esta espécie comportou-se como a linhagem de biofilme mais resistente
neste estudo.
Tabela 20. Controles e ação do extrato não incorporado e incorporado no SPCLM frente aos
biofilmes de C. glabrata
Amostras analisadasa
Biofilme de
C. glabrata
ATCC 2001
Extrato
incorporado
10,0
Extrato não
incorporado
> 20,0
anfotericina B
CGV 1
> 20,0
CGV 2
CGV 3
0,5
DMSO
20%
-
SPCLM sem
incorporação
-
> 20,0
2,0
-
-
20,0
> 20,0
4,0
-
-
> 20,0
> 20,0
1,0
-
-
a
valores em mg/mL; (-) sem inibição.
Já em C. glabrata foi observado atividade anti-biofilme do extrato incorporado
no SPCLM em duas cepas (ATCC e CGV 2), todavia o assim como C. albicans e C.
krusei, o extrato não incorporado não foi capaz de desenvolver atividade inibitória.
__________________________________________________
Matheus Ap. Santos Ramos
Resultados 101
__________________________________________________
Tabela 21. Controles e ação do extrato não incorporado e incorporado no SPCLM frente aos
biofilmes de C. tropicalis
Amostras analisadasa
Biofilme de
C. tropicalis
ATCC 750
Extrato
incorporado
> 20,0
Extrato não
incorporado
> 20,0
anfotericina B
CTV 1
20,0
CTV 2
CTV 3
0,5
DMSO
20%
-
SPCLM sem
incorporação
-
> 20,0
0,2
-
-
2,5
> 20,0
2,0
-
-
20,0
> 20,0
2,0
-
-
a
valores em mg/mL; (-) sem inibição.
Os resultados obtidos com a linhagem da espécie C. tropicalis mostraram-se
superiores aos das espécies anteriormente analisadas. O extrato incorporado
desempenhou ação frente ao biofilme de todas as cepas clínicas analisadas
mostrando-se inativo apenas para aquele desenvolvido com a cepa ATCC. Em
relação à atividade do extrato não incorporado, novamente não foi observado
capacidade inibitória.
Tabela 22. Controles e ação do extrato não incorporado e incorporado no SPCLM frente aos
biofilmes de C. parapsilosis
Amostras analisadasa
Biofilme de
C.
parapsilosis
ATCC 22019
Extrato
incorporado
Extrato não
incorporado
anfotericina B
DMSO
20%
SPCLM sem
incorporação
1,2
> 20,0
0,2
-
-
CPV 1
1,2
> 20,0
0,5
-
-
CPV 2
0,6
10,0
1,0
-
-
CPV 3
20,0
> 20,0
0,5
-
-
a
valores em mg/mL; (-) sem inibição.
Como apresentado pela Tabela 22, os efeitos inibitórios exercidos pelo extrato
incorporado frente aos biofilmes das cepas de C. parapsilosis foram os mais
promissores. A atividade foi evidenciada em todas as cepas empregadas, embora
__________________________________________________
Matheus Ap. Santos Ramos
Resultados 102
__________________________________________________
CPV 3 tenha se mostrado mais resistente, as demais cepas apresentaram
sensibilidade ao composto relativamente baixa. Em relação aos efeitos inibitórios do
extrato não incorporado, foi evidenciada atividade frente a uma cepa clínica (CPV 2).
5.2.6. Ensaio Time kill
As Figuras 32 a 41 apresentam o comportamento do crescimento das cepas
em contato com o extrato vegetal não incorporado e incorporado, assim como o
controle de crescimento e com o fármaco anfotericina B.
Confirmando as análises de CFM, o extrato vegetal não possui a capacidade
de promover a morte do micro-organismo, ele apenas promove a sua diminuição de
crescimento e proliferação.
Figura 32. Time kill de C. albicans ATCC 10231
Figura 33. Time kill de C. albicans CAV 3
50x103
50x103
40x103
40x103
30x103
20x103
Crescimento
anfotericina B
Extrato
SPCLM+Extrato
10x103
0
UFC/mL
UFC/mL
30x103
20x103
Crescimento
anfotericina B
Extrato
SPCLM+Extrato
10x103
0
0
500
1000
1500
2000
Tempo em minutos
2500
3000
3500
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Tempo em minutos
Nota-se que em ambas as cepas houve semelhança em relação ao tempo de
crescimento fúngico, o qual manteve-se equilibrado até o tempo de 8 horas, após
esse período a proliferação de UFC manteve-se mais constante em maior
quantidade.
__________________________________________________
Matheus Ap. Santos Ramos
Resultados 103
__________________________________________________
Figura 34. Time kill de C. krusei ATCC 6258
Figura 35. Time kill de C. krusei CKV 3
120x103
100x103
100x103
80x103
80x103
Crescimento
anfotericina B
Extrato
SPCLM+Extrato
40x103
20x103
UFC/mL
UFC/mL
60x103
60x103
40x103
Crescimento
anfotericina B
Extrato
SPCLM+Extrato
20x103
0
0
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0
500
Tempo em minutos
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Tempo em minutos
No estudo com as cepas de C. krusei os resultados foram distintos.
Comparando os resultados entre o extrato incorporado e não incorporado, no ensaio
com a cepa ATCC a ação inibitória de crescimento do SPCLM+extrato foi superior
ao extrato não incorporado, onde o crescimento manteve-se controlado e constante
até o tempo de 8 horas e, após esse período, aumentou em maior intensidade,
todavia, se manteve menor em relação ao controle de crescimento ao final de 48
horas. A cepa CAV 3 mostrou-se mais resistente a ambas as formas de
administração do extrato. A forma não incorporada controlou o crescimento fúngico
de forma mais eficaz que o extrato incorporado. Com relação ao SPCLM+extrato,
embora seu crescimento tenha sido controlado até o tempo de 8 horas, após esse
período, este se mostrou altamente intenso a ponto de igualar-se ao controle de
crescimento no final do experimento.
Figura 36.Time kill de C. glabrata ATCC 2001
Figura 37. Time kill de C. glabrata CGV 3
160x103
180x103
140x103
160x103
120x103
140x103
120x103
80x103
Crescimento
anfotericina B
Extrato
SPCLM+Extrato
60x103
40x103
20x103
UFC/mL
UFC/mL
100x103
100x103
80x103
Crescimento
anfotericina B
Extrato
SPCLM+Extrato
60x103
40x103
20x103
0
0
0
500
1000
1500
2000
Tempo em minutos
2500
3000
3500
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Tempo em minutos
Em C. glabrata os resultados foram potencialmente promissores. Embora em
concentrações distintas, ambas as formas de administração do extrato foram
__________________________________________________
Matheus Ap. Santos Ramos
Resultados 104
__________________________________________________
capazes de equilibrar o crescimento fúngico até o tempo de 8 horas, assim como as
espécies anteriormente analisadas. O diferencial do ensaio com esta espécie é dado
quando a ação inibitória de crescimento do extrato incorporado e não incorporado é
comparada à anfotericina B. Com a cepa ATCC, a ação do extrato não incorporado
foi semelhante ao fármaco utilizado como controle até o tempo de 24 horas, já com a
cepa CGV 3, notou-se ação superior, pois anfotericina B mostrou-se menos ativa
que ambas as formas de administração do extrato.
Figura 38.Time kill de C. tropicalis ATCC 750
Figura 39. Time kill de C. tropicalis CTV 2
250x103
160x103
140x103
200x103
120x103
100x103
100x103
Crescimento
anfotericina B
Extrato
SPCLM+Extrato
50x103
UFC/mL
UFC/mL
150x103
80x103
Crescimento
anfotericina B
Extrato
SPCLM+Extrato
60x103
40x103
20x103
0
0
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0
500
Tempo em minutos
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Tempo em minutos
As cepas de C. tropicalis mostram também que ambas as formas de
administração do extrato foram capazes de controlar o crescimento fúngico, todavia,
o extrato incorporado mostrou-se mais ativo para a cepa clínica, ação semelhante à
anfotericina B, já o extrato não incorporado comportou-se de maneira semelhante
em ambas as cepas.
Figura 40.Time kill de C. parapsilosis ATCC22019
70x103
Figura 41. Time kill de C. parapsilosis
CPV1
100x103
60x103
80x103
50x103
60x103
30x103
Crescimento
anfotericina B
Extrato
SPCLM+Extrato
20x103
UFC/mL
UFC/mL
40x103
40x103
Crescimento
anfotericina B
Extrato
SPCLM+Extrato
20x103
10x103
0
0
0
500
1000
1500
2000
Tempo em minutos
2500
3000
3500
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Tempo em minutos
__________________________________________________
Matheus Ap. Santos Ramos
Resultados 105
__________________________________________________
Já os resultados com as cepas da espécie C. parapsilosis nota-se que foram
os mais distintos, especialmente com a cepa padrão, onde o crescimento do fungo
em contato com o extrato não incorporado manteve-se totalmente equilibrado até o
tempo de 8 horas e, após este, período aumentou de forma abundante, superando
até mesmo o controle de crescimento. Em relação ao extrato incorporado, a ação foi
melhor quanto à anfotericina B e ao extrato não incporporado. Na cepa clínica os
resultados do extrato incorporado também seguiram este mesmo padrão de
ação,todavia, a ação do mesmo foi superior quando comparados com todas as
cepas empregadas no estudo. Já o extrato não incorporado se mostrou mais ativo
em relação à cepa padrão. Nota-se que em todas as cepas empregadas nesta
investigação, tanto o extrato na forma incorporada e não incorporada mantiveram o
crescimento fúngico em equilíbrio de crescimento até o tempo de 8 horas.
5.3. Análises antifúngicas in vivo
5.3.1. Ensaio terapêutico de CVV causada por C. albicans
Todos os animais foram induzidos ao estado pseudo-estro com dez dias de
aplicação de solução de estradiol por via subcutânea duas vezes ao dia, onde foram
considerados preparados para receberem a suspensão fúngica. As Figuras 42 e 43
apresentam as células do epitélio vaginal dos grupos experimentais obtidas através
do lavado vaginal com solução estéril de PBS e coradas pelo método de Giemsa,
onde é possível observar a predominância de células cornificadas e anucleadas, as
quais correspondem ao ciclo estral pseudo-estro.
Figura 42. Células do epitélio vaginal dos animais do ensaio anti-CVV com a cepa
ATCC após 10 dias de aplicação de estradiol por via subcutânea.
a= grupo 2; b= grupo 3; c= grupo 4; d= grupo 5; e= grupo 6; f= grupo 7
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Matheus Ap. Santos Ramos
Resultados 106
__________________________________________________
Figura 43. Células do epitélio vaginal dos animais do ensaio anti-CVV com a cepa
CAV 3 após 10 dias de aplicação de estradiol por via subcutânea.
a= grupo 8; b= grupo 9; c= grupo 10; d= grupo 11; e= grupo 12; f= grupo 13
Após dois dias da inoculação fúngica os animais foram submetidos à lavagem
vaginal com tampão PBS estéril, e os lavados obtidos foram semeados em ASD+clo
e também submetidos à análise microscópica para a verificação da presença de
células fúngicas. As Figuras 44 e 45 apresentam as imagens dos lavados vaginais
nos grupos submetidos à infecção, corados por meio da coloração de Giemsa e
analisados sob aumento de 20x. Nota-se que em todos os lavados há presença de
células fúngicas leveduriformes (indicadas pela seta) em meio às células epiteliais
cornificadas e anucleadas, indicando que os animais encontravam-se infectados
com o patógeno e também que todos estavam no estado pseudo-estro quando a
infecção foi estabelecida.
Figura 44. Lavados vaginais do ensaio anti-CVV com a cepa ATCC após dois
dias de infecção
a= grupo 2; b= grupo 3; c= grupo 4; d= grupo 5; e= grupo 6; f= grupo 7
__________________________________________________
Matheus Ap. Santos Ramos
Resultados 107
__________________________________________________
Figura 45. Lavados vaginais do ensaio anti-CVV com a cepa CAV 3 após dois
dias de infecção
a= grupo 2; b= grupo 3; c= grupo 4; d= grupo 5; e= grupo 6; f= grupo 7
A Figura 46 apresenta o comportamento dos grupos experimentais nos dias
de tratamento do ensaio realizado com a cepa ATCC 10231.
Figura 46. Comportamento dos grupos experimentais do ensaio terapêutico de CVV in vivo
com a cepa ATCC 10231
5
Log UFC/mL
4
3
Grupo 1
Grupo 2
Grupo 3
Grupo 4
Grupo 5
Grupo 6
Grupo 7
2
1
0
DIA 2
DIA 4
DIA 6
DIA 8
Dias de Tratamento
Grupo 1: negativo de infecção; Grupo 2: positivo de infecção;Grupo 3: tratados com anfotericina B;
Grupo 4: trados com DMSO 20%; Grupo 5: tratados com o extrato não incorporado; Grupo 6: tratados
com o o SPCLM; Grupo 7: tratados com o extrato incorporado.
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Matheus Ap. Santos Ramos
Resultados 108
__________________________________________________
Em relação ao grupo controle positivo de infecção (grupo 2) nota-se que todos
os animais mantiveram-se infectados até o final do experimento. Os grupos 4 e 6
mostraram que tanto o solvente utilizado para solubilizar o extrato quanto o SPCLM
não possuem ação terapêutica, neste sentido, comprova que a ação antifúngica é
atribuída ao extrato vegetal.
O extrato vegetal incorporado no SPCLM exerceu perfil de cura logo no
segundo dia de tratamento frente aos animais do grupo 7, já aqueles tratados com o
extrato não incorporado foram considerados curados no quarto dia de tratamento,
todavia, estes resultados foram superiores ao tratamento observado nos animais do
grupo controle positivo com anfotericina B (grupo 3), onde foram considerados
curados apenas no 8º dia de tratamento.
A Figura 47 apresenta o comportamento dos grupos experimentais nos dias
de tratamento do ensaio realizado com a cepa clínica CAV 3.
Figura 47. Comportamento dos grupos experimentais do ensaio terapêutico de CVV in vivo
com a cepa CAV 3
5
Log UFC/mL
4
3
Grupo 1
Grupo 8
Grupo 9
Grupo 10
Grupo 11
Grupo 12
Grupo 13
2
1
0
DIA 2
DIA 4
DIA 6
DIA 8
Dias de Tratamento
Grupo 1: negativo de infecção; Grupo 8: positivo de infecção;Grupo 9: tratados com anfotericina B;
Grupo 10: trados com DMSO 20%; Grupo 11: tratados com o extrato não incorporado; Grupo 12:
tratadoscom o o SPCLM; Grupo 13: tratados com o extrato incorporado.
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Matheus Ap. Santos Ramos
Resultados 109
__________________________________________________
Embora em concentrações fúngicas superiores, os grupos controles 8, 10 e
12 mostraram comportamento idêntico ao observado no ensaio com a cepa ATCC
10231. Da mesma forma, o grupo 9, tratado com anfotericina B, foi considerado
curado somente no 8º dia de tratamento.
Novamente, os animais tratados com o extrato incorporado no SPCLM foram
curados após 2 dias de tratamento, já os que foram tratados com o extrato não
incorporado apenas no 6º dia.
A Tabela 23 apresenta características gerais observadas no ensaio
experimental, como o número de animais infectados, assim como a carga fúngica de
todos os grupos experimentais durante o período de análise do tratamento realizado
no experimento.
__________________________________________________
Matheus Ap. Santos Ramos
Resultados 110
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Tabela 23. Número de animais infectados e quantificação da carga fúngica em todos os animais do ensaio experimental
Dia 2
Dia 4
Dia 6
Dia 8
Grupo
experimental
Animais
infectados
(%)
Log UFC/mL
±DP
Animais
infectados
(%)
Log
UFC/mL
±DP
Animais
infectados
(%)
Log UFC/mL
±DP
Animais
infectados
(%)
Log UFC/mL
±DP
Grupo 1
0/6 (0)
0±0,00
0/6 (0)
0±0,00
0/6 (0)
0±0,00
0/6 (0)
0±0,00
Grupo 2
6/6 (100)
3,88±0,16
6/6 (100)
3,75±0,08
6/6 (100)
3,81±0,09
6/6 (100)
3,90±0,09
Grupo 3
6/6 (100)
3,39±0,08
6/6 (100)
2,95±0,05
5/6 (83)
1,77±1,37
0/6 (0)
0±0,00
Grupo 4
6/6 (100)
3,74±0,20
6/6 (100)
3,80±0,16
6/6 (100)
3,70±0,14
6/6 (100)
3,89±0,08
Grupo 5
6/6 (100)
2,39±0,07
0/6 (0)
0±0,00
0/6 (0)
0±0,00
0/6 (0)
0±0,00
Grupo 6
6/6 (100)
3,65±0,06
6/6 (100)
3,74±0,14
6/6 (100)
3,81±0,07
6/6 (100)
3,79±0,09
Grupo 7
0/6 (0)
0±0,00
0/6 (0)
0±0,00
0/6 (0)
0±0,00
0/6 (0)
0±0,00
Grupo 8
6/6 (100)
3,85±0,03
6/6 (100)
4,22±0,03
6/6 (100)
4,22±0,02
6/6 (100)
4,20±0,06
Grupo 9
6/6 (100)
3,85±0,05
6/6 (100)
3,62±0,33
4/6 (66)
3,48±0,20
0/6 (0)
0±0,00
Grupo 10
6/6 (100)
3,75±0,03
6/6 (100)
3,89±0,16
6/6 (100)
3,93±0,12
6/6 (100)
3,93±0,06
Grupo 11
6/6 (100)
3,16±0,07
4/6 (66)
2,32±0,19
0/6 (0)
0±0,00
0/6 (0)
0±0,00
Grupo 12
6/6 (100)
3,72±0,06
6/6 (100)
4,01±0,06
6/6 (100)
4,02±0,07
6/6 (100)
3,87±0,12
Grupo 13
0/6 (0)
0±0,00
0/6 (0)
0±0,00
0/6 (0)
0±0,00
0/6 (0)
0±0,00
__________________________________________________
Matheus Ap. Santos Ramos
Resultados 111
__________________________________________________
5.3.2. Ensaio profilático de CVV causada por C. krusei
As análises microbiológicas da morfologia das células do epitélio vaginal dos
animais para comprovar que todos os animais estavam na fase pseudo-estro
mostraram-se satisfatórias após 5 dias de aplicação de solução de estradiol por via
subcutânea 2x ao dia, apresentando células anucleadas e cornificadas. As culturas
do fluido vaginal dos grupos positivos de infecção mostraram-se positivas. Estes
dados confirmaram que todos os animais encontravam-se nas mesmas condições
antes do período de tratamento pós-infecção. A
Figura
48
apresenta
o
comportamento dos grupos experimentais do ensaio de profilaxia analisado a partir
de dois dias após a infecção (dia 0) e nos dez dias de tratamento subsequentes
(dias 2, 4, 6, 8 e 10).
Figura 48. Comportamento dos grupos experimentais do ensaio de profilaxia
4
Log UFC/mL
3
2
Grupo 1
Grupo 2
Grupo 3
Grupo 4
Grupo 5
Grupo 6
1
0
0
2
4
6
8
10
12
Dias de análise após infecção
De acordo com o dados é possível observar que o tratamento realizado com
extrato incorporado (grupo 6) antes da infecção com a cepa fúngica foi capaz de
impedir o desencadeamento do estado infeccioso. Os animais deste grupo
experimental não apresentaram carga fúngica vaginal após dois dias de inoculação
de C. krusei e este padrão permaneceu fixo até o final do experimento.
__________________________________________________
Matheus Ap. Santos Ramos
Resultados 112
__________________________________________________
O grupo experimental 5 (tratados com o não extrato incorporado)
desenvolveram infecção após a inoculação da suspensão fúngica, todavia, a carga
fúngica evidenciada mostrou-se menor em comparação aos controles positivos de
infecção (grupo 2 e 3). Os animais foram considerados curados após 4 dias de
tratamento pós-infecção, igualmente ao comportamento do grupo experimental 4
(tratados com anfotericina B).
Em relação ao comportamento dos controles positivos de infecção (grupo 2 e
3) notou-se expressiva diferença. Como esperado, os animais do grupo 2 (infectados
sem indução do estado imunossupressivo) desenvolveram uma infecção fraca com
duração de apenas 4 dias, todavia estes resultados eram previstos já que a CVV é
considerada uma doença oportunista. Já os animais do grupo positivo de infecção
imunossuprimidos antes da infecção (grupo 3) mantiveram-se infectados até o final
do experimento.
A Tabela 24 apresenta características gerais observadas no ensaio
experimental como o número de animais infectados, assim como a carga fúngica de
todos os grupos experimentais durante o experimento.
__________________________________________________
Matheus Ap. Santos Ramos
Resultados 113
__________________________________________________
Tabela 24. Número de animais infectados e quantificação da carga fúngica em todos os grupos do ensaio experimental
Grupo 1
Dia 0
Animais
Log
infectados UFC/mL
(%)
±DP
0/4 (0)
0±0,00
Dia 2
Animais
Log
infectados UFC/mL
(%)
±DP
0/4 (0)
0±0,00
Grupo 2
4/4 (100)
2,96±0,03
4/4 (100)
2,87±0,06
0/4 (0)
0±0,00
0/4 (0)
0±0,00
0/4 (0)
0±0,00
0/4 (0)
0±0,00
Grupo 3
4/4 (100)
3,37±0,07
4/4 (100)
3,45±0,05
4/4 (100)
3,35±0,17
4/4 (100)
3,35±0,17
4/4 (100)
3,70±0,14
4/4 (100)
3,26±0,10
Grupo 4
3/4 (75)
2,08±1,39
2/4 (50)
1,17±1,35
0/4 (0)
0±0,00
0/4 (0)
0±0,00
0/4 (0)
0±0,00
0/4 (0)
0±0,00
Grupo 5
3/4 (75)
1,72±1,15
3/4 (75)
1,73±1,18
0/4 (0)
0±0,00
0/4 (0)
0±0,00
0/4 (0)
0±0,00
0/4 (0)
0±0,00
Grupo 6
0/4 (0)
0±0,00
0/4 (100)
3,74±0,14
0/4 (0)
0±0,00
0/4 (0)
0±0,00
0/4 (0)
0±0,00
0/4 (0)
0±0,00
Grupo
experimental
Dia 4
Animais
Log
infectados UFC/mL
(%)
±DP
0/4 (0)
0±0,00
Dia 6
Animais
Log
infectados
UFC/mL
(%)
±DP
0/4 (0)
0±0,00
__________________________________________________
Dia 8
Animais
Log
infectados UFC/mL
(%)
±DP
0/4 (0)
0±0,00
Dia 10
Animais
Log
infectados UFC/mL
(%)
±DP
0/4 (0)
0±0,00
Matheus Ap. Santos Ramos
__________________________________________________
6. discussão
O impossível só existe para aqueles que não acreditam na possibilidade
de realizar seus sonhos.
(Danielle Oliveira)
__________________________________________________
Matheus Aparecido dos Santos Ramos
Discussão
__________________________________________________
6. DISCUSSÃO
Classificada como uma infecção verdadeira de vulva e vagina, a CVV
desperta interesse na busca de novos compostos com ação antifúngica que visem
controlar ou eliminar os seus sinais e sintomas, uma vez que quadros infecciosos
estão diretamente ligados ao aprofundamento de efeitos maléficos à saúde da
mulher uma vez que são capazes de desencadear episódios mais agressivos da
doença, como a CVVR que por sua vez pode evoluir para o desenvolvimento de
neoplasias (SOBEL, 2010).
Neste estudo avaliou-se a atividade antifúngica do extrato metanólico de
escapos de S. nitens incorporado ou não incorporado em um sistema de liberação
de fármacos precursor de cristais líquidos mucoadesivos. A investigação da ação
antifúngica envolvendo este extrato foi realizada por Araújo et al (2013), que avaliou
a atividade terapêutica de um creme vaginal contendo o extrato de S. nitens na
prospecção do tratamento da CVV. A atividade antifúngica envolvendo o sistema de
liberação de fármacos precursor de cristais líquidos mucoadesivos é inexistente na
literatura, que da a este trabalho o caráter inovador no estudo de atividade
antifúngica utilizando o extrato vegetal.
A investigação da potencialidade antifúngica de Syngonanthus nitens
investigada neste trabalho é justificada pelos resultados obtidos em estudos
anteriores por nosso grupo de pesquisa, onde foi comprovada a ação desta planta
frente às espécies de Candida através de diferentes abordagens investigativas,
incluindo desde a quantificação química dos componentes presentes na mesma até
ensaios biológicos com relevância para a área farmacêutica (ARAÚJO, 2011;
ARAÚJO et al., 2013), que nos estimularam a continuidade destes estudos.
Considerando os resultados de CIM obitos neste estudo, foi possível
classificar o extrato metanólico de escapos de S. nitens como potencialmente
promissor na atividade antifúngica frente às cepas leveduriformes de diferentes
espécies de Candida.
A literatura não apresenta uma classificação consensual em relação aos
valores de CIM obtida por produtos naturais. Aligiannis et al. (2001) consideram
CIMs com valores iguais ou menores que 500 μg/mL como inibidores potentes; CIMs
entre 600 e 1500 μg/mL como inibidores moderados e CIMs acima de 1600 μg/mL
__________________________________________________
Matheus Ap. Santos Ramos
115
Discussão
__________________________________________________
como inibidores fracos. Webster et al. (2008) estabeleceram como satisfatório outro
valor de CIM igual ou menor que 1000 μg/mL. Neste sentido, os resultados
reportados nesta investigação mostram-se promissores.
A investigação de novas moléculas com perfil antifúngico frente a cepas
leveduriformes não-albicans classifica-se como uma abordagem de extrema
importância para a pesquisa farmacêutica que busca a manutenção e bem estar da
saúde do homem moderno, visto que a incidência de infecções por espécies deste
perfil encontram-se em expansão nos últimos anos, o que se classifica como um
fator de risco devido ao índice de resistência intrínseca aos fármacos empregados
na prática clínica, principalmente ao fluconazol (DEORUKHKAR e SAINI, 2013).
A resistência intrínseca ao fluconazol e o aumento do índice de ineficiência da
anfotericina B apresentada em casos de infecções por C. krusei é um fator
preocupante, neste sentido a busca por novas abordagens medicamentosas que
promovam a inibição do fungo em questão é de extrema relevância (LI et al., 2014).
Portanto, na triagem antifúngica deste estudo os resultados encontrados na
determinação da CIM mostraram-se inovadoras, visto que o extrato vegetal
apresentou capacidade inibitória frente a todas as cepas empregadas com
concentrações do extrato capazes de inibir o crescimento das linhagens que
variaram de 125 a 62,5 µg/mL.
A atividade de outros extratos vegetais pertencentes à família Eriocaulaceae
contra linhagens de fungos leveduriformes não-albicans vem sendo observada nos
últimos anos. Araújo et al. (2011) evidenciaram a ação do extrato de Leiothrix spiralis
(Eriocaulaceae) frente a diversas espécies de Candida spp., (a mesma cepa padrão
de C. krusei empregada neste estudo, ATCC 6258).
Os resultados encontrados frente às cepas de C. glabrata mostram que o
extrato de S. nitens se comportou como mais promissor no desempenho da
atividade antifúngica sobre a espécie leveduriforme. Com exceção da cepa clínica
CGV 3, que obteve CIM de 125 µg/mL, as demais linhagens empregas no estudo
foram sensíveis ao extrato vegetal a partir de 62,5 µg/mL, neste sentido o extrato,
vegetal foi considerado como forte agente inibidor devido as características de
multirresistência das cepas utilizadas nesta investigação.
__________________________________________________
Matheus Ap. Santos Ramos
116
Discussão
__________________________________________________
As espécies C. tropicalis e C. parapsilosis também mostraram-se sensíveis ao
extrato vegetal, embora em maiores concentrações (500 a 250 µg/mL).
A espécie C. albicans foi avaliada neste presente estudo com um número
maior de cepas, justificada por ser a espécie mais frequente em infecções, e
considerado o patógeno oportunista mais comum na espécie humana. Em relação
aos valores de CIM encontrados, estes se mostraram promissores considerando o
perfil resistente aos fármacos fluconazol, itracolnazol, cetoconazol e outros
derivados de azóis. A comprovação de que o extrato é ativo contra a espécie em
questão pode ser obtida com as observações feitas por Araújo et al. (2013) que além
de investigar o potencial contra uma linhagem padrão (ATCC), também evidenciou
ação em cepas de origem clínica, o que mostra semelhança com os resultados
observados com as linhagens isoladas de região vaginal deste estudo. Quanto à
concentração do extrato que inibiu o crescimento fúngico descrita por Araújo e
colaboradores com a espécie leveduriforme em questão, esta se mostrou diferente
das observadas neste estudo, o que é esperado, visto diferença entre as cepas
empregadas na investigação uma vez que são de procedência distinta.
A resistência às drogas antifúngicas tem sido monitorada principalmente em
cepas de Candida spp. em quadros infecciosos humanos, além disso, o tratamento
das infecções causadas por fungos pertencentes a este gênero é limitado a um
número pequeno de agentes antifúngicos, o que inclui poliênicos como nistatina e
anfotericina B; azólicos, entre eles o cetoconazol, itraconazol e fluconazol; e
derivados azólicos recentes, como o voriconazol e o posaconazol (RIDDELL et al.,
2011).
Os fármacos utilizados na terapêutica antifúngica apresentam importantes
efeitos colaterais. O fluconazol, um dos controles positivos utilizados na
determinação da CIM deste estudo, é um antifúngico triazólico de amplo espectro
com atividade fungistática tempo-dependente. O tratamento utilizando esse fármaco
requer que a concentração sérica do mesmo se mantenha em níveis mais elevados
no organismo, acima da CIM, em maior parte do intervalo de dosagem. Clinicamente
falando, o uso indiscriminado deste fármaco pode levar a reações adversas
significativas, sendo que a mais importante destas é hepatotoxicidade, onde o
espectro de toxicidade pode variar de leve elevações transitórias dos níveis de
__________________________________________________
Matheus Ap. Santos Ramos
117
Discussão
__________________________________________________
transaminases à hepatite, colestase e insuficiência hepática fulminante (BEN-AMI et
al., 2012). Neste estudo, todas as cepas clínicas empregadas mostaram-se
resistente a esse fármaco, o que mostra a importância de todos os resultados de
CIM obtidos com o extrato vegetal. As únicas que foram sensíveis foram as cepas
padrão de C. tropicalis e C. parapsilosis.
O fármaco anfotericina B, também utilizado como controle positivo nesta
investigação, apresentou atividade contra todas as cepas testadas em baixas
concentrações. Todavia, embora os resultados tenham sido promissores, o uso
deste fármaco na terapêutica clínica de doenças oportunistas está associado a
efeitos adversos como a nefrotoxicidade e febre com calafrios, reação aguda à
infusão intravenosa, já que os parâmetros farmacocinéticos deste fármaco não
permitem a administração oral (KLEPSER, 2011).
Ambos os fármacos tem sido usados como primeira escolha na terapêutica de
doenças fúngicas por terem como alvo de ação a membrana celular dos mesmos,
reportando-se
como
aplicável
no
tratamento
de
patologias
oportunistas,
principalmente aquelas causadas por fungos leveduriformes do gênero Candida,
como a CVV. Os derivados de azóis são compostos sintéticos onde seu mecanismo
baseia-se na inibição da
esterol-14-α-desmetilase, um sistema enzimático
microssomal que esta diretamente relacionada com a dependência do citocromo
P450, promovendo defeitos na síntese do ergosterol na membrana citoplasmática e
levando ao acúmulo de 14-α-metilesteróis. Esses metilesteróis não possuem a
mesma forma e propriedades físicas que o ergosterol e levam à formação da
membrana com propriedades alteradas, que não desempenha as funções básicas
necessárias ao desenvolvimento do fungo (HEGAZY et al., 2012). Os polienos (ex.
anfotericina B) ligam-se a uma porção esterol, basicamente ergosterol, sendo este
um componente essencial presente na membrana das leveduras, onde formam-se
poros ou canais, ocasionando um aumento na permeabilidade da membrana que
gera o extravasamento de constituintes celulares, levando à sua morte (GRAY et al.,
2012).
Os fármacos derivados de azóis causam menos reações adversas que a
anfotericina B, porém são menos potentes que a mesma. Podem ter ação
fungistática ou fungicida. O uso excessivo dos azóis levou ao aparecimento de
__________________________________________________
Matheus Ap. Santos Ramos
118
Discussão
__________________________________________________
resistência em espécies suscetíveis. Além disso, os azóis ainda apresentam a
desvantagem da resistência cruzada. Portanto, a busca de novos compostos
antifúngicos são objetos de investigação contínua (NOGUEIRA, 2012).
Algumas abordagens terapêuticas são empregadas para combater a
patogenicidade apresentada por C. albicans, sendo as principais a indução da
secreção de proteases, fosfolipases e a capacidade de alterar a morfologia das
células leveduriformes de brotamento na forma de hifas ou filamentos (AGEBAULT
et al., 2013). A transformação da fase leveduriforme para a fase de hifas é
influenciada principalmente por condições ambientais, caracterizando-se como a
mais patogênica. As hifas são túbulos longos, delgados e contínuos com septos que
separam cada núcleo e são estruturas que exercem importante papel na invasão da
mucosa e as torna resistentes a ação de células de defesa como macrófagos e
neutrófilos que, além das formas leveduriformes, estão presentes tanto em relação
de comensalismo quanto no processo patogênico com o hospedeiro (LACAZ et al.,
2012). A capacidade de formação de hifas atribuída por C. albicans é um fator de
risco em casos de infecções, visto a capacidade de proliferação em tecidos,
desencadeando em muitos casos o estabelecimento de infecções sistêmicas, sendo
assim, diversos estudos com o objetivo de impedir o crescimento hifal de C. albicans
vêm sendo observado nos últimos anos. Chevalier et al. (2012) avaliaram a
capacidade de inibição de hifas utilizando o extrato aquoso de Solidago virgaurea
frente a mesma cepa padrão de C. albicans empregada neste estudo (ATCC 10231)
e comprovaram que o extrato vegetal foi capaz de inibir a proliferação hifal. Em
estudos realizados por Vediyappan et al. (2013) com uma fração de Gymnema
sylvestres, foi identificado um promissor efeito inibitório (50 µg/mL) de hifas em C.
albicans
em 24 horas de contato. Araújo et. al (2013) constataram a ação do
mesmo extrato metanólico de escapos de S. nitens nas concentrações de 500, 250 e
125 µg/mL empregando a cepa de C. albicans NCPF 3153 nos tempos de 12 e 24
horas.
Neste estudo, a inibição e a redução da formação de hifas foram observadas
pelo extrato de escapos de S. nitens nas concentrações de 1000 a 250 µg/mL após
12 horas e, de 1000 a 500 µg/mL após 24 horas, o que pode sugerir que a atividade
antifúngica verificada pelo extrato vegetal atribui-se tanto à inibição da formação
__________________________________________________
Matheus Ap. Santos Ramos
119
Discussão
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como à redução da concentração hifal. Estes dados classificam-se como uma
referência importante para a caracterização do mecanismo de ação antifúngico do
extrato estudado.
Assim, as principais razões para o interesse em investigar e identificar
compostos de origem vegetal e suas atividades biológicas são justificadas pela
ampla gama de substâncias presentes nas plantas que podem ser utilizadas no
tratamento de infecções crônicas bem como doenças infecciosas, aumento da
resistência microbiana aos medicamentos, alta taxa de efeitos colaterais nos
medicamentos sintéticos, segurança e eficácia com menor efeito adverso de
medicamentos produzidos a partir de fontes naturais, o custo da terapia bem como o
aumento de doenças emergentes (ABDOLLAHZADEH et al., 2011; SASIDHARAN et
al., 2011).
Na pesquisa de novos medicamentos fitoterápicos, os flavonóides presentes
nas plantas medicinais são considerados como fortes agentes terapêuticos em
casos de doenças de origem microbiana, além disso, atividades antivirais,
antiproliferativas, antimutagênicas, antitrombótica e antioxidante também são
atribuídas a estes compostos (ORHAN et al., 2010). Neste sentido, a presença de
compostos fenólicos em espécies da família Eriocaulaceae se caracteriza como um
modelo
promissor
na
avaliação
de
mecanismos
envolvidos
na
atividade
antimicrobiana (CUSHNIE e LAMB, 2011). Em relação aos efeitos antimicrobianos
exercidos pelos flavonóides, as ações resultam de uma interação destes compostos
com a membrana celular dos micro-organismos alvo, provavelmente devido à sua
capacidade de complexar com proteínas extracelulares e com a parede celular
(SAVOIA, 2012).
Candiracci et al. (2012) investigaram a ação antifúngica de flavonóides
extraídos de um extrato de mel italiano frente a espécie C. albicans, tendo
demonstrado que os flavonóides foram capazes de atuar fortemente contra a cepa,
além de exercer um importante perfil inibidor de hifas.
Em estudo realizado por Araújo (2011), foi observada a presença de
flavonóides em quantidades significativas (36,7%) no extrato metanólico dos
escapos de S. nitens, no entanto, os resultados da presente investigação podem ser
justificados à presença destes compostos nesta concentração, além disso, as
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xantonas e flavonas presentes no extrato (PACÍFICO et al., 2011; ZANUTTO, 2013)
também podem estar relacionadas com o sucesso da atividade antifúngica.
A formação de biofilme é um importante marcador de virulência atribuído à
espécie C. albicans. O evento inicial na patogênese de doenças infecciosas fúngicas
é a adesão microbiana aos tecidos dos hospedeiros, sendo estas mediadas por
macromoléculas denominadas adesinas, as quais caracterizam-se em estruturas da
superfície do micro-organismo que interagem com receptores específicos nas
células do hospedeiro (NOBILE et al., 2012).
Existe uma grande dificuldade na descoberta de novos compostos que
possuam ação contra biofilmes fúngicos, visto a complexidade dos mecanismos de
ação atribuídos e principalmente à alta concentração da carga fúngica presente,
neste sentido, a busca por novas moléculas para a eliminação do mesmo é
constante e permanece em extrema expansão nos dias atuais (BLANKENSHIP e
MITCHELL, 2006; FANNING e MITCHELL, 2012).
Em relação aos resultados encontrados neste estudo, com exceção de uma
cepa clínica de C. parapsilosis (CPV 2), não foram evidenciados ações inibitórias do
extrato vegetal nas análises de inibição do biofilme in vitro frente as espécies
estudadas em todas as concentrações avaliadas (20, 10, 5, 2.5, 1.2 e 0.6 mg/mL).
A capacidade de um composto inibir o crescimento de um micro-organismo é
uma etapa fundamental na elucidação do potencial antimicrobiano do mesmo. O
ensaio Time-Kill é um método empregado para se determinar o tempo em que a
substância-teste impede o desenvolvimento do micro-organismo a ser testado. Ele
fornece a dinâmica de ação desta substância e sua interação com o tempo, sendo
assim, fornece a informação necessária de quanto tempo é preciso para realizar-se
a administração do antibiótico novamente. Normalmente, as investigações de novos
compostos antimicrobianos utilizam este método de análise para complementar os
resultados obtidos na determinação da CIM do composto avaliado (NÓBREGA et al.,
2013).
Neste estudo foi realizado o ensaio de Time-Kill do extrato de escapos de S.
nitens na concentração de 2x a CIM obtida para todas as cepas padrão (ATCC) das
cinco espécies estudas assim como a cepa clínica que apresentou melhor atividade
na determinação da CIM. Como controle positivo de inibição foi utilizado o fármaco
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anfotericina B na concentração de 32 µg/mL, a escolha deste fármaco se deu por ser
o antibiótico de primeira escolha no tratamento de doenças relacionadas a cepas de
Candida que possuam resistência aos fármacos derivados de azóis, o que é o caso
de todas as cepas clínicas deste estudo, assim como três das cinco espécies das
cepas padrões.
Os resultados encontrados confirmaram a ação fungistática observada no
ensaio de determinação da CFM, ou seja, quando as células leveduriformes são
retiradas de um meio de stress (meio de cultura+extrato) e repicadas em um meio de
cultura rico e livre de interferentes, há o desenvolvimento do crescimento fúngico
novamente, o que indica que não houve morte celular (ação fungicida) e sim a
diminuição do crescimento e proliferação da cepa. Alguns estudos utilizam o ensaio
de Time kill para avaliar a ação antifúngica de produtos vegetais frente a espécies
de Candida spp. adotando fármacos antifúngicos como controles positivos de
inibição do crescimento.
Neste estudo observou-se que em todas as cepas o extrato vegetal promove
o controle do crescimento fúngico, sem a morte celular. Até o tempo de 8 horas foi
observado um equilíbrio no crescimento e, após esse período, todas as cepas
proliferaram-se de forma constante e mais acentuada.
Ao final de 48 horas foi
possível confirmar que o extrato vegetal mantém o crescimento em menor proporção
em relação ao controle de crescimento. Como exceção, da a cepa padrão de C.
parapsilosis, apresentou equilíbrio no crescimento do fungo em presença do extrato
vegetal até o tempo de 8 horas e, após este, período aumentou de forma abundante,
superando até mesmo o controle de crescimento. Em relação ao controle com o
fármaco anfotericina B, foi evidenciada ação fungistática em todas as cepas
estudadas com a concentração utilizada (32 µg/mL), confirmando também os
resultados obtidos no ensaio de determinação da CFM.
Recentemente, um estudo realizado por Alshami et al. (2014) também
evidenciou um comportamento fungistático do extrato vegetal de Hibiscus sabdariffa
frente a cepas clínicas de C. albicans resistentes ao fluconazol isoladas de pacientes
com infecção no trato urinário. Ao avaliarem a ação do extrato frente ao crescimento
leveduriforme pelo método de Time kill não foi evidenciada a morte celular de todas
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as cepas empregadas, todavia, houve uma expressiva diminuição do crescimento no
decorrer do tempo de 48 horas.
Ali et al., 2010 avaliaram a ação antifúngica de uma substância isolada
(hidroxicavicol) do extrato aquoso das folhas de Piper betle contra as espécies C.
albicans e C. glabrata. Os autores demonstraram que a concentração de 4x o CIM,
testada pelo Time kill, foi capaz de inibir o crescimento de C. albicans no tempo de
10 horas e a de 8x inibiu o crescimento fúngico com 1 hora. Em C. glabrata, foi
evidenciado inibição com a concentração de 4x a CIM no tempo de 8 horas, e na de
8x o tempo necessário foi de 4 horas.
Kaomongkolgit et al., (2009) avaliaram a ação antifúngica de uma fração
hexânica (alfa-mangostin)
do extrato de pericarpos de mangostão (Ganrcinia
mangostana), uma fruta popularmente conhecida da Indonésia, muito utilizada em
casos de diarréia e tratamento de doenças de pele. Os autores avaliaram a ação
frente à espécie C. albicans inicialmente pelo método de microdiluição e o valor de
CIM obtido foi utilizado na concentração de 2x e 4x para o desenvolvimento do
ensaio de Time kill. Os resultados mostraram que o composto vegetal apresentou
atividade superior aos antifíngicos nistatina e cloritromazol, sendo observada a
morte das leveduras a partir do tempo de 10 minutos de contato com o composto
testado em ambas as concentrações avaliadas.
Os testes de citotoxicidade in vitro são amplamente empregados na
investigação de novos compostos. São os primeiros testes utilizados para avaliar a
toxicidade das substâncias para a aplicação, e vêm sendo empregados como
adjuvante dos testes in vivo, possibilitando a substituição ao uso de animais na
avaliação da toxicidade de substâncias e preparações (KEEP et al., 2011). Neste
trabalho, não foi observada a toxicidade do extrato de S. nitens frente às linhagens
celulares testadas, o que pode indicar que o extrato vegetal não interfere na
viabilidade das células do hospedeiro e, sua ação se dá atuando somente sobre o
micro-organismo causador da doença.
Como demonstrado, os resultados com o extrato vegetal foram inovadores e
de grande relevância, neste sentido, a investigação do potencial antifúngico do
extrato após a incorporação em um sistema de liberação de fármacos foi aplicável
na elucidação da caracterização biológica do mesmo.
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A
importância
de
se
incorporar
extratos
vegetais
em
sistemas
nanotecnológicos de liberação esta ligada principalmente ao aumento da atividade
biológica dos mesmos, e isto é extremamente válido para o desenvolvimento de
pesquisa de novos fármacos antimicrobianos (BONIFÁCIO et al., 2014). Além disso,
alguns problemas relacionados com a solubilidade destes compostos a serem
analisados biologicamente levam à utilização de plataformas nanotecnológicas de
liberação. A vantagem de utilizar um sistema de liberação de fármaco para a
veiculação de princípios ativos se faz na idéia de uma síntese programada do
sistema, ou seja, é possível desenvolver um sistema que possua características
favoráveis com o local de aplicação pretendido, neste sentido, a escolha dos
componentes das fases do mesmo é de extrema importância (PETROS e
DESIMONE, 2010).
Embora nos últimos anos seja visto a utilização de produtos oriundos de
fontes naturais na produção de sistemas nanoestruturados para a veiculação de
fármacos, ou até mesmo na elaboração de cosméticos de alto grau tecnológico, não
há relatos na literatura da incorporação destes compostos em sistemas líquidocristalinos emprego na terapêutica de doenças fúngicas, o que torna este trabalho
promissor.
A nanotecnologia farmacêutica utiliza matérias primas naturais como
componentes de formulações de alto padrão tecnológico, neste sentido, tem-se
observado cada vez mais a utilização de óleos vegetais na produção de sistemas de
liberação de fármacos, incluindo dos sistemas líquido cristalinos. Santos et al. (2011)
propuseram a elaboração de emulsões contendo óleos oriundos de plantas vegetais
nativas do Brasil, a fim de avaliar o potencial de formação de fases líquidas
cristalinas
lamelares.
Foram
utilizados
óleos
vegetais
de
Andiroba
(CarapaguyanensisAubl. – Meliaceae), damasco (Prunusarmenioca L. - Rosaceae),
abacate (Persea americana Mill. - Lauraceae), castanha do Brasil (Bertholletia
excelsa Bonpl. - Lecythidaceae), buriti (Mauritia flexuosa L. - Arecaceae), cupuassu
(TheobromagrandiflorumWilld.
(calendulaofficinalis
Passifloraceae)
e
L.
pequi
-
exSpreng.Schum
Asteraceae),
(Caryocar
- Sterculiaceae),
maracujá
brasiliense Camb.
(Passiflora
-
calêndula
edulisSims.
Caryocaraceae)
-
como
constituintes da fase oleosa, além destes, também foram empregados o óleo mineral
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e parafina líquida. Todas as emulsões formadas foram consideradas estáveis com
exceção apenas daquela que foi preparada a partir de óleo mineral. Os autores
evidenciaram ainda que a mistura de diferentes surfactantes com cargas diferentes
de HLB não interferem na promoção de um sistema nanoestruturado onde há
formação de cristais líquidos contendo óleos vegetais como constituinte de fase
oleosa.
Neste trabalho foram desenvolvidos ensaios biológicos com dois sistemas
nanotecnológicos de liberação de fármacos empregando cristais líquidos, sendo
estes sistemas precursores de cristais líquidos mucoadesivos (SPCLM) constituídos
de ácido oleico como fase oleosa, PEG-5 Ceteth-20 (Procetyl-AWS®) como
tensoativo mucoadesivo e uma dispersão polimérica sintetizada a partir de dois
polímeros em proporções iguais (Policarbophyl+Carbophol ®) como fase aquosa. A
escolha deste sistema se deu pelo fato do mesmo mostrar-se favorável na
incorporação de extratos vegetais, além de apresentar-se como uma plataforma
segura de veiculação de fármacos para a via intravaginal (SILVA et al., 2014), sendo
esta o principal foco de investigação deste trabalho.
A escolha dos constituintes de um sistema de liberação de fármacos deve
basear-se em características que sejam favoráveis com o local de aplicação, sendo
assim, neste trabalho foi empregado o ácido oléico como a fase oleosa da
formulação por apresentar parâmetros favoráveis em relação à interação com a
membrana fúngica das espécies de Candida utilizadas nesta investigação. O Ácido
Oléico classifica-se como um ácido graxo essencial (Ômega 9), que por sua vez
participa diretamente no metabolismo do homem, desempenhando um papel
fundamental na síntese de hormônios. Em termos estruturais, é um ácido graxo de
cadeia longa que possui 18 carbonos na sua estrutura e por possuir uma dupla
ligação entre os carbonos, é considerado como um ácido graxo insaturado. Por tais
características apresentadas, é considerado um importante componente de
formulações farmacêuticas, sendo muito usado na produção de cosméticos por
apresentar emoliência favorável (MENDES et al., 2012). Além destes parâmetros, o
ácido oléico vem sendo muito utilizado em sistemas de liberação de fármacos para
promover o aprimoramento dos princípios ativos no que se diz respeito à sua
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interação com as membranas, principalmente as da pele (WILLIAMS e BARRY,
2004).
O sistema desenvolvido baseou-se na característica de mucoadesividade no
ambiente vaginal, neste sentido, foram empregados materiais com propriedades
adesivas. A vantagem de se trabalhar com sistemas de liberação de fármacos com
propriedade mucoadesiva se faz na idéia de uma liberação mais intensa, ou seja, a
adesividade promove um contato direto com o local de aplicação fazendo com que
haja uma liberação por completo, além de impedir que o paciente venha a expelir o
conteúdo administrado, característica esta importante para um sistema de liberação
para via intravaginal. A escolha do tensoativo (PEG-5 Ceteth-20) nos sistemas
desenvolvidos baseou-se nestas características, uma vez que possui um expressivo
padrão de adesividade quando em contato com água, sendo assim, objetivou-se o
desencadeamento da adesão quando o sistema entrasse em contato com o muco
vaginal da mulher.
Os materiais adesivos incorporados nas formulações farmacêuticas podem
ser moléculas hidrofílicas de origem natural ou sintéticas, contendo numerosas
funções orgânicas, tais como grupos carboxilas, hidroxilas e aminas, que geram
ligações químicas com a superfície biológica (CALIXTO, 2013).
As fases aquosas dos sistemas (DP) também foram desenvolvidas com o
objetivo de promover a mucoadesão do mesmo. O carbohpol C974P e o
policarbophyl, constituintes da DP, são exemplos de polímeros sintéticos carregados
negativamente e são derivados do ácido poliacrílico. O comportamento bioadesivo é
justificado a processos físico-químicos, como interações hidrofóbicas, ligações de
hidrogênio e de van der Waals, que são controladas pelo pH e composição iônica
(KHUTORYANSKIY, 2011). Além desta característica, a utilização de polímeros na
fase aquosa teve como intenção promover uma liberação prolongada do extrato
vegetal, uma vez que o mesmo é retido na rede polimérica e tem sua liberação de
forma mais lenta e controlada. Nos sistemas que possuem alguma rede polimérica
em sua composição o fármaco pode estar homogeneamente disperso na matriz
polimérica, adsorvido em sua superfície ou dentro de um reservatório, onde a
liberação do mesmo envolve processos físicos e químicos, tais como: penetração de
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água na matriz, difusão do fármaco pelos poros da matriz, degradação do polímero
ou por combinação dos últimos dois mecanismos (LAGES et al., 2014).
A partir do desenvolvimento do diagrama de fases nota-se que houve uma
maior prevalência de formulações com aparência líquida transparente (30,5%), em
seguida, aquelas que mostraram-se viscosas e opacas (22,2%) e, em ordem
decrescente: separação de fases (16,7%), viscosas translúcidas (13,9%), líquidas
translúcidas (11,1%) e por fim as viscosas porém transparentes (5,6%). A
caracterização farmacotécnica das formulações selecionadas para a análise de
microscopia por luz polarizada evidenciou estruturas que correspondem às
mesofases de cristais líquidos.
As formulações liquidas transparentes que apresentaram campo escuro
(63,6%) nas análises por MLP são correspondente à mesofase de microemulsão.
Nesta mesofase não há a presença de estruturas tridimensionais, porém, podem
comportar-se como sistemas precursores de cristais líquidos, onde em contato com
alguma substância aquosa se estruturam e formam fases mais rígidas. A formulação
(F18) que apresentou a estrutura de cruz de malta (4,5%) nas análises de MLP é
característica de mesofase lamelar. Nesta fase, as moléculas consistem em
bicamadas alternadas de moléculas de tensoativo e de solvente, de modo que as
cadeias hidrofóbicas do tensoativo são o centro da lamela e sua parte hidrofílica está
em contato com a camada de solvente (WANG e ZHOU, 2009).
Já aquelas que apresentaram estrias na MLP (22,7%) são características de
mesofases hexagonais, nestas mesofases, as micelas estão empacotadas em
arranjo hexagonal e são separadas por uma região contínua de água. Esta fase
pode ser classificada em fase reversa, formada por canais aquosos circundados
pelas cabeças polares do tensoativo, com a porção apolar localizada ao redor dos
cilindros, ou pode ser classificada em fase normal, onde as cabeças polares do
tensoativo localizam-se na região externa dos cilindros (YARIV et al., 2010).
Em relação às formulações que apresentaram estruturas de estrias e cruz de
malta (9,0%) nas análises, classificou-as como características de formulações que
estão em transição para a fase cúbica, ou seja, são formulações que estão em
partindo de uma característica mais líquida para se tornarem mais viscosas. A fase
cúbica, também conhecida como fase isotrópica viscosa, é formada por micelas
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normais (fase contínua polar) ou reversas (fase contínua apolar) empacotadas em
arranjo cúbico (CALIXTO, 2013).
Também foram realizadas análises por MLP nas formulações utilizadas nos
ensaios biológicos após a incorporações dos extratos vegetais onde foi constatado
que a incorporação do mesmo não modificou a conformação estrutural do mesmo,
sendo assim, antes e após a incorporação ambas as formulações permaneceram
com a característica de mesofase microemulsão.
O ensaio do efeito muco nos sistemas revelou que a presença de MVA nas
formulações exerce expressiva interferência na mudança de conformação do
SPCLM. A viscosidade das formulações foi crescendo proporcionalmente à medida
que ocorreu a introdução de MVA o que indica que quanto mais muco, maior é a
estruturação do sistema.
A partir das análises por MLP foi possível comprovar o perfil precursor de
cristais líquidos das formulações, onde a presença de estruturas como cruz de
malta, estrias e campo escuro foram indicativas para tal (CHORILLI et al., 2011).
Com relação à formulação que continha 100% de MVA, sua mesofase se distingue
daquelas com 5 e 10%, embora tenham apresentado a mesma estrutura na MLP, e
isso é justificado a alta viscosidade que esta formulação se encontrou, o que a
classificou como mesofase cúbica, ou seja, a presença de campo escuro por MLP
mostrou que as moléculas estavam altamente complexadas e estruturadas que
impediram a passagem da luz.
No trabalho realizado por Calixto (2013) a fim de desenvolver uma formulação
precursora de cristais líquidos mucoadesivos com constituintes iguais aos utilizados
neste trabalho visando à veiculação de um peptídeo sintético para administração
oral, onde foi avaliado o efeito da adição de saliva em contato com o sistema,
também foi evidenciado que a medida em que se aumenta a quantidade de uma
substancia aquosa no sistema, no caso a saliva humana, há uma expressiva
mudança estrutural no mesmo e isso reflete diretamente na sua anisotropia.
As análises reológicas contínuas realizadas em sistemas precursores de
cristais líquidos permitem o estudo do comportamento de fluxo que o material em
análise apresenta quando este sofre uma determinada tensão, neste sentido, o que
define o comportamento de fluxo do material estudado é a correlação entre a tensão
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de cisalhamento e a taxa de cisalhamento analisada, que é representada
graficamente em diagramas denominados de curvas de fluxo (SAVIC et al., 2011).
Essas curvas nada mais são do que reflexos de duas etapas do estudo, no qual o
aumento da taxa de cisalhamento é revelado pela curva ascendente e a diminuição
da taxa desta é representada pela curva descendente (BERNEGOSSI, 2013). De
acordo com os dados obtidos por estas análises, classifica-se a partir da curva
ascendente, o material em análise, como newtoniano ou não newtoniano. Em
contrapartida, caso sejam não newtonianos, os materiais podem ser classificados
ainda como pseudoplásticos, plásticos ou dilatantes. Em relação à curva
descendente, os materiais podem ser diferenciados em tixotrópicos ou reopéticos
(CALIXTO, 2013). As formulações classificadas como não-newtonianos com
comportamento plástico necessitam de uma força prévia para iniciar o processo de
tensão de cedência. Já aquelas com comportamento pseudoplástico fornecem um
reograma onde a curva, da mesma forma que com os fluidos newtonianos, tem
como origem o zero; entretanto, a relação entre a taxa de cisalhamento e a
velocidade de cisalhamento não são lineares, ou seja, ao se aumentar a velocidade
de cisalhamento, diminui-se a viscosidade. Os fluidos não newtonianos com
comportamento dilatante é o inverso do pseudoplástico, ou seja, ao se aumentar a
velocidade de cisalhamento, observa-se aumento da viscosidade (LAHOUD e
CAMPOS, 2010).
No que se diz respeito às análises reológicas contínuas das duas formulações
eleitas para o desenvolvimento dos ensaios biológicos (F25 e F26) estas mostraram
características distintas.
Ambas as formulações que foram analisadas com a presença de MVA
independentemente de estarem incorporadas ou não, comportaram-se como
materiais não-newtonianos com perfil pseudoplástico na curva crescente e
tixotrópico na curva decrescente. Estes resultados mostram-se importantes visto que
a utilização de formulações que possuem estas características são muito
interessantes para a administração de fármacos por via vaginal, uma vez
apresentando este comportamento pseudoplástico são capazes de aumentar sua
viscosidade em função da força exercida sobre a mesma, neste sentido, as
formulações que foram desenvolvidas neste estudo podem desempenhar um papel
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importante, visto que após a incorporação do muco naturalmente presente na
secreção genital, é possível obter-se um sistema com tal característica.
Outro fato importante a ser mencionado é a tixotropia elucidada na curva
decrescente, uma vez que materiais que possuem esta característica têm a
capacidade de reestruturar-se rapidamente após a aplicação (LEE et AL., 2009).
Dados da literatura mostram que a utilização de formulações vaginais com
características pseudoplásticas são amplamente empregadas. As observações feitas
por Narayana et al. (2009) demonstraram o mesmo comportamento das formulações
deste estudo (pseudoplastica e tixotrópica) sobre uma formulação de gel
de
secnidazol preparada para administração vaginal. Os autores confirmaram que a
característica pseudoplástica da formulação foi interessante para o desenvolvimento
da aplicação proposta. Recentemente, Tuğcu-Demiröz et al. (2013) desenvolveram
um gel vaginal bioadesivo contendo oxibutinina e elucidaram os mesmos parâmetros
observados neste estudo.
Em relação às formulações isentas de MVA, as mesmas foram classificadas
como
Newtonianas,
sendo
assim,
comportaram-se
de
forma
idêntica
independentemente da presença do extrato vegetal incorporado. As formulações
newtonianas são aquelas onde seus comportamentos de fluxo não se modificam a
medida que uma tensão é aplicada, neste sentido, mantém-se integras durante a
aplicação.
No que se diz respeito às estratégias empregadas no desenvolvimento de
sistemas de liberação de fármacos com propriedades mucoadesivas, estas estão
relacionadas com a habilidade do polímero ou sistema ficar aderido ao muco ou à
pele. Neste sentido, o material deve interagir com os componentes do muco ou
alterar sua estrutura por estímulos fisiológicos como pH, força iônica e temperatura.
O uso de formulações nanotecnológicas com propriedades mucoadesivas vem
sendo evidenciadas nos últimos anos e a presença de polímeros e agentes
tensoativos que promovam adesividade no local de aplicação estão diretamente
ligados ao sucesso do desenvolvimento e caracterização farmacotécnica da
propriedade esperada (CARVALHO et al., 2014). A vantagem encontrada em se
administrar fármacos por meio de formulações mucoadesivas se dá no sentido de
promover um contato direto com o sítio de aplicação e com isso gerar uma liberação
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mais intensa e completa. Entretanto, no sistema desenvolvido nesse estudo, a
presença dos polímeros Carbophol® e Policarbopyl®, além do agente tensoativo
Procetyl-AWS forneceram uma característica adesiva ao sistema, a qual foi
confirmada com o teste de mucoadesão in vitro.
Sendo assim, nos ensaios de mucoadesão deste estudo foram reportados
parâmetros importantes nos dois sistemas (F25 e F26) submetidos à análise
bioadesiva in vitro utilizando mucosa vaginal de suíno. Primeiramente, constata-se
que a adição MVA nos sistemas aumentou significativamente a força bioadesiva em
relação aos sistemas sem a presença do mesmo, o que era esperado. A maior
bioadesão dos sistemas líquido-cristalinos pode ser explicada por suas propriedades
reológicas, ou seja, a elevação da sua viscosidade e sua característica elástica
contribui com o aumento do tempo de permanência da formulação na membrana
empregada no teste, neste sentido, o perfil pseudoplástico das formulações com a
presença de MVA está diretamente ligado aos resultados observados neste estudo.
Os valores de bioadesão das formulações incorporadas e não incorporadas com o
extrato vegetal e com a presença de MVA não demonstraram diferença significativa.
Como já mencionado, as razões dadas às propriedades mucoadesivas
observadas estão diretamente relacionadas com os polímeros e o tensoativo
empregados, todavia, uma atenção maior é dada aos polímeros, uma vez que a
intensidade da adesão é influenciada principalmente pela capacidade de interação
dos mesmos com a superfície administrada, em contrapartida, se a capacidade de
interação for demasiadamente elevada, a película formada pode ser muito
bioadesiva, e a sua remoção do substrato biológico pode ser muito difícil, o que
pode levar à danificação do epitélio vaginal. Além disso, a secreção contínua de
muco conduz à diluição subsequente do fármaco, e um longo tempo de adesão pode
levar à degradação enzimática do mesmo (KHUTORYANSKIY, 2011). Entretanto, a
concentração de polímeros nas formulações deste estudo (5%) é considerada baixa
e não possui a capacidade de promover a super adesão na mucosa vaginal, o que é
de extrema importância para a aplicação proposta.
Como demostrado, todas as análises farmacotécnicas dos sistemas foram
satisfatórias, neste sentido, mostrou-se aplicável na investigação do seu potencial
biológico sobre os testes empregados neste estudo para a elucidação do perfil
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antifúngico do extrato vegetal de S. nitens. Todas as análises que foram
desenvolvidas para o extrato não incorporado foram repetidas após a incorporação
do mesmo no SPCLM.
Em relação aos resultados observados na determinação da CIM foram
encontrados valores satisfatórios após a incorporação do extrato no SPCLM. Nos
ensaios desenvolvidos com as cepas de C. albicans foi observada significativa
diminuição dos valores de CIM após a incorporação do extrato no SPCLM, onde os
mesmos que anteriormente apresentavam-se entre 250 a 125 µg/mL passaram a
exibir valores de 31,2 a 62,5 µg/mL.
Nos ensaios realizados com as linhagens não-albicans os resultados
seguiram as mesmas considerações no que se diz respeito à diminuição da CIM. A
espécie C. krusei que apresentaram valores entre as cepas de 125 a 62,5 µg/mL
para o extrato não incorporado passaram a apresentar sensibilidade nas
concentrações de 31,2 a 63,5 após a incorporação do extrato no SPCLM. Em C.
glabrata, os resultados obtidos sobre as cepas passaram de 125 a 62,5 µg/mL
(extrato não incorporado) para 3,9 a 15,6 µg/mL após a incorporação, classificandose como os resultados mais promissores da investigação. Com as cepas de C.
tropicalis os resultados seguiram as mesmas tendências, sendo observada a
diminuição da CIM entre as cepas de 500 a 250 µg/mL para 125 a 250 µg/mL após a
incorporação, todavia, esta foi a espécie mais resistente observada no estudo. Em
relação aos resultados com as cepas de C. parapsilosis os valores encontrados
foram extremamente promissores. A espécie que anteriormente apresentou
concentrações de CIM mais elevadas em relação às outras linhagens empregadas
no estudo (500-250) assim como C. tropicalis, passou a mostrar sensibilidade a
partir da concentração de 7,8 a 62,5 após a incorporação do extrato no SPCLM.
Nas análises realizadas a fim de elucidar a concentração fungicida mínima
(CFM) observou-se que mesmo após a incorporação do extrato no SPCLM não foi
observada a morte dos micro-organismos, ou seja, o padrão de inibição do extrato
permaneceu como um suposto agente fungistático, promovendo a diminuição do
crescimento e proliferação do fungo, mas não o matando. Estes resultados
demonstram que embora os resultados obtidos na determinação da CIM tenham
sido promissores, o sistema nanoestruturado de liberação de fármacos não foi capaz
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de mudar o perfil de ação exercido pelo extrato. No entanto, uma ação fungistática é
considerada como eficaz no tratamento de doenças fúngicas, uma vez que se
espera que o sistema imunológico do hospedeiro atue sinergicamente na ação
eliminatória do fungo, além de que, muitos fármacos com ação fungicida são tóxicos
e atingem células humanas saudáveis. Em contrapartida, levando em consideração
que o perfil fungistático necessita de ação complementar do sistema imunológico,
em casos onde o paciente é portador de alguma disfunção imunológica como
àqueles soropositivos para o HIV, a terapia com agentes fungistáticos pode mostrarse ineficaz.
Nos resultados de inibição de hifas de C. albicans os resultados também
seguiram as tendências de melhora de atividade como observado nos dados da
determinação da CIM. Após a incorporação do extrato no SPCLM a concentração
necessária para inibir o crescimento das hifas foi de 31,2 µg/mL, mostrando-se como
um valor fixo nos tempos de 12 e 24 horas, diferentemente dos resultados
encontrados com o extrato não incorporado, onde houveram variações da
concentração do extrato nos tempos de análise.
Nos resultados obtidos nos ensaio de tempo de morte (Time kill) nota-se que
o extrato incorporado no SPCLM exerceu ação inibitória sobre o crescimento de
todas as espécies (com exceção para C. krusei CAV 3) superiormente aos
resultados obtidos com o extrato não incorporado, embora tenha permanecido o
tempo de 8 horas de equilíbrio do crescimento. Em relação à concentração final de
micro-organismos no tempo de 48 horas foi observado que o extrato incorporado foi
capaz de manter um equilíbrio mais intenso, e em alguns casos igualando-se aos
resultados com o fármaco padrão anfotericina B. Apesar da incorporação, o extrato
incorporado não foi capaz de promover a morte dos fungos, o que confirma a
possível ação fungistática estabelecida nos resultados observados na determinação
da CFM.
A hipótese de que o extrato vegetal passou a mostrar-se mais ativo nos
ensaios de determinação da CIM, inibição de hifas e Time kill, parte do emprego dos
componentes do sistema de liberação de fármacos empregados, principalmente à
atuação do ácido oleico. Em relação a isso, estima-se que esse componente
exerceu uma função direta sobre a permeabilidade da membrana dos fungos, por
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ser uma substancia de caráter lipofílico e de constituição celular, ou seja, a afinidade
entre a formulação e as células fúngicas podem ter promovido o aumento da
permeabilidade da membrana e com isso ter permitido a passagem do extrato para o
meio extracelular favorecendo sua ação no citosol, além disso, pode-se levar em
consideração uma ação exercida também na própria membrana, sendo esta o alvo
de inúmeros agentes antimicrobianos. Todavia, não se sabe ao certo quais são os
verdadeiros motivos que comprovem melhora tão significativa da ação antifúngica
observada, e isso justifica o desenvolvimento de uma investigação mais profunda do
mecanismo de ação do extrato na forma não incorporada e incorporada sobre as
espécies empregadas nesta investigação, entretanto, este não foi o objetivo deste
estudo.
A permeabilidade celular exercida pelo ácido oleico foi observada por Rowat
et al. (2006) ao investigarem a capacidade de permeação de um sistema liquidocristalino de fase lamelar em membranas de extrato córneo através de análise por
ressonância magnética nuclear, tendo atribuído que esse componente foi promissor
no aumento da permeabilidade da membrana e desempenhou papel fundamental
para a permanência da conformação do cristal líquido após a administração.
Nas análises realizadas com o extrato incorporado no SPCLM sobre a
inibição do biofilme in vitro foram evidenciados resultados de extrema importância,
uma vez que após a incorporação do extrato foi observada ação inibitória sobre as
espécies avaliadas, o que não foi evidenciado anteriormente em nenhuma linhagem.
Nos biofilmes com as cepas de C. albicans foram evidenciadas inibições do extrato
incorporado variando entre as concentrações de 1,25 a 20,0 mg/mL as cepas
clínicas e da ATCC. Em relação aos resultados de inibição do biofilme de C. krusei
foi evidenciado que o padrão de resistência ao extrato permaneceu sobre quase
todas as cepas, excluindo-se uma cepa clínica (CKV 2) apresentando inibição na
concentração de 10,0 mg/mL. Nos biofilmes de C. glabrata foi observada atividade
inibitória após incorporação do extrato no SPCLM sobre duas cepas, ATCC 2001 e
CGV 2, apresentando concentrações inibitórias de 10,0 e 20,0 respectivamente. Em
C. tropicalis os resultados mostraram-se mais promissores que os observados nos
biofilmes de C. krusei e C. glabrata, onde foram evidenciados inibições sobre as três
cepas clínicas empregadas com concentração variando de 2,5 a 20 mg/mL. Por fim,
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os biofilmes de C. parapsilosis foram os mais sensíveis ao extrato incorporado no
SPCLM, nestas cepas o padrão inibitório variou de 0,6 a 20,0 mg/mL, onde o menor
valor obtido foi contra a cepa que anteriormente mostrou-se sensível ao extrato na
forma não incorporada na concentração de 10,0 mg/mL (CPV 2), o que comprova
mais uma vez que a incorporação do extrato no SPCLM foi capaz de promover um
aumento da atividade antifúngica do mesmo.
De maneira semelhante aos ensaios de CIM e inibição de hifas, é
supostamente possível que ação observada esteja ligada ao aumento da
permeabilidade na membrana fúngica a qual promoveu um aumento da
substantividade do extrato vegetal. Igualmente, é possível também que a
propriedade mucoadesiva tenha interferido diretamente na inibição dos biofilmes,
uma vez que os mesmo mantiveram um contato direto com o sistema contendo o
extrato, de maneira constante e com liberação mais intensa e fixa no local. Os
componentes mucoadesivos (dispersão polimérica e tensoativo) podem ter sido os
principais adjuvantes desta etapa da ação, uma vez que foram capazes de fixar a
formulação contendo o extrato diretamente sobre o biofilme formado no poço da
microplaca, que, por sua vez, apresentava-se como uma película fixa e uniforme.
Williams e Barry (2004) afirmam em seu trabalho sobre as principais formas
de penetração de sistemas de liberação de fármacos em membranas e superfícies
corpóreas são relatadas para aquelas com propriedades adesivas. Shaikh et al.
(2011) afirmam que a utilização de sistemas de liberação de fármacos
mucoadesivos sobre biofilmes é prevalentemente mais propícia quando se emprega
algum agente capaz de promover uma adesão direta com o mesmo, citando os
polímeros como os mais promissores e eficazes para tal fim, o que demonstra mais
uma vez o papel mucoadesivo da dispersão polimérica utilizada como fase aquosa
da formulação.
Em um estudo realizado por Donnelly et al (2007) os autores avaliaram a
ação do azul de toluidina em um sistema mucoadesivo frente a aplicabilidade do
mesmo em casos de biofilme de orofaringe causado por espécies de Candida, tendo
observado que o perfil adesivo direto exercido sobre o biofilme foi o fator primordial
para a ação observada.
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Nos ensaios de citotoxicidade com a linhagens HeLa e Vero foi constatado
que o SPCLM promoveu a inviabilidade celular, e esse padrão se manteve nos
ensaios com o sistema puro e incorporado. Não se sabe ao certo quais foram os
mecanismos envolvidos no processo de citotoxicidade, no entanto, não há relatos na
literatura que mostram este perfil tóxico.
Todos os resultados encontrados nas investigações antifúngicas in vitro
estabeleceram uma plataforma segura quanto a possível potencialidade do extrato
vegetal na terapêutica de afecções fúngicas oportunistas, sendo assim, foram
estabelecidos protocolos experimentais in vivo frente à análise da eficácia do extrato
incorporado e não incorporado no tratamento e profilaxia da CVV.
O diferencial de se trabalhar com modelos experimentais in vivo é promover
uma plataforma segura quanto à aplicabilidade do possível composto terapêutico a
ser analisado, uma vez que procura-se mimetizar os mesmos parâmetros
observados em casos de doenças humanas. Os roedores, principalmente aqueles
pertencentes à espécie Rattus novergicus, comportam-se como uma excelente
ferramenta para o desenvolvimento de infecções fúngicas vaginais por possuírem
epitélio parecido com o do ser humano, todavia, é necessário criar condições para o
desenvolvimento de CVV nestes animais, uma vez que espécies de Candida, com
especial atenção a Candida albicans não são colonizadoras comensais de ambiente
vaginal como em seres humanos (CASSONE et al., 2014).
Em termos gerais, para um desenvolvimento eficaz da patogenia da CVV é
necessário que haja uma aderência inicial da cepa leveduriforme na mucosa vaginal.
A partir daí iniciam-se os processos referentes à infecção, sendo inicialmente
assintomáticos caminhando para o desenvolvimento de sinais e sintomas, os quais
caracterizarão a veracidade do estado patológico no qual a paciente se encontra. Os
fatores predisponentes para o desencadeamento da infecção fúngica vaginal estão
ligados principalmente a condições relacionadas com a imunidade do hospedeiro,
além do mais, doenças como o diabetes mellitus, uso de corticóides de forma
crônica, antibioticoterapia, terapia estrogência e até mesmo a gravidez, são fatores
desencadeadores da CVV. Além destes, mulheres em fase luteal (fase da ovulação)
do ciclo menstrual são fortes candidatas ao desenvolvimento da CVV, e isso se
justifica pelo aumento dos níveis de estrógeno e progesterona e também a
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diminuição do pH no ambiente vaginal, sendo estes os principais fatores que
contribuem diretamente para o desenvolvimento da infecção, além de que, o
aumento dos níveis de estrógenos deixa o epitélio vaginal escamoso e aumenta os
níveis de glicogênios (SOBEL, 2010; BARBEDO e SGARBI, 2010).
No
entanto,
foi
necessário
criar
condições
favoráveis
para
o
desencadeamento do estado patológico nos animais. Inicialmente foi realizada a
imunossupressão dos mesmos utilizando o fármaco ciclofosfamida (50mg/ p.c.) por
via intraperitoneal. Esta etapa foi de total importância, uma vez que a CVV é
classificada como uma doença oportunista. Araújo et al. (2013) também realizaram o
estabelecimento da imunossupressão com a mesma droga e da mesma maneira
que foi realizado neste estudo tendo obtidos resultados favoráveis à infecção. Na
ausência de alguma forma de imunossupressão ou outro tipo de protocolo que
resulte neste fim, a carga fúngica no ambiente vaginal é variável e frequentemente
declina rapidamente.
Naglik et al. (2008) demonstraram através do emprego de ratos e
camundongos que após a infecção inicial, previamente estabelecida sem o uso de
agentes imunossupressores, decorrido uma semana é observado o declínio da
carga fúngica, a qual reduz-se naturalmente para um estado de portador, ou seja,
são observadas concentrações semelhantes àquelas encontradas em mulheres
sadias que não possuem CVV, apenas C. albicans em comensalismo no ambiente
vaginal. Angulo et al. (2002) utilizaram a ciclofosfamida para abordar o impacto da
infecção sistêmica subletal por Candida albicans por imunossupressão induzida em
um curso de tratamento intensivo com o agente imunossupressor. Os autores
observaram que na mesma concentração avaliada neste estudo (50 mg/ p. c.) não
há o risco de desenvolvimento de morte nos animais, porém, há o perfeito
desenvolvimento da infecção.
Como já mencionado, o desenvolvimento de uma infecção eficaz em roedores
se dá além da imunossupressão, uma vez que é necessário adequar o ciclo estral
de cada animal para criar condições hormonais favoráveis ao estabelecimento do
estado patológico, sendo assim, o estado pseudo-estro (falso cio) é o mais indicado
para tal fim. Neste estudo, todos os animais foram induzidos a este estado a partir
10 dias de aplicações subcutâneas (0,1 mL) de solução de estradiol (20 mg/mL)
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duas vezes ao dia, onde fase foi avaliada segundo lavagens vaginais com solução
tamponada (pH 7,4) de PBS estéril para coleta de células epiteliais da mucosa
vaginal. Através de análises microscópicas da morfologia destas células foi possível
determinar a fase estral de todos animais, onde a ausência de núcleo e a forma
cornificada das mesmas indicaram que todos os animais encontravam-se no estado
pseudo-estro (Maecondes et al., 2002).
No estudo de Araújo et al. (2013) também foi utilizado o mesmo método de
confirmação, todavia, os animais empregados foram levados a este estado com
apenas 5 dias de aplicação de estradiol, o que se difere deste estudo, entretanto,
mesmo se tratando da mesma espécie empregada em ambos os ensaios
experimentais, é praticamente impossível reproduzir os mesmos resultados, uma vez
que a variação genética, mudança de local de experimento e procedência dos
animais interferem diretamente na fisiologia e comportamento dos mesmos (HOHL
et al., 2014).
Após a confirmação da do estabelecimento do ciclo estral em todos os
animais, procedeu-se o estabelecimento do estado infeccioso com inoculação de
uma suspensão fúngica das cepas a serem estudadas. Foi observado que as
suspensões de C. albicans contendo 5 x 107 Cél/mL (0,1 mL) foi capaz de
estabelecer o processo de infecção quando adminstrada intravaginalmente, em
todas as ratas que encontravam-se em estado pseudo-estro e imunossuprimidas.
Carrara et al. (2010) confirmaram em sua investigação de um novo modelo de
infecção por C. albicans em ratas, que com a mesma concentração de suspensão
fúngica utilizada neste estudo, todos os animais desenvolveram e mantiveram a
infecção durante 3 semanas de experimento. A infecção foi monitorada 2 dias após
inoculação para verificação da carga fúngica, através de cultivo do fluido vaginal
obtido por lavagem com solução tamponada estéril de PBS e análise microscópica
do mesmo para visualização de células fúngicas no ambiente vaginal. Foi
previamente estabelecido que a infecção fosse considerada positiva e suficiente
para iniciar o tratamento apresentando no mínimo 102 UFC/mL. Dessa forma, os
animais que não apresentaram colonização suficiente de C. albicans foram
novamente infectados com a mesma suspensão da levedura até apresentarem
carga fúngica favorável para o desenvolvimento da infecção.
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A partir dos dados obtidos pode-se confirmar a suscetibilidade de ratas da
linhagem Wistar no desenvolvimento da CVV causada por C. albicans, além de
demonstrar que todas foram bem adaptadas para o desenvolvimento e manutenção
da CVV. A vantagem de se trabalhar com estes animais é que os mesmo são de
fácil manuseio e extremamente úteis como modelos experimentais in vivo para o
sistema genital feminino.
Ensaios experimentais in vivo de CVV desenvolvidos da mesma forma que
neste estudo são muito empregados pela comunidade científica para avaliar a
eficácia de produtos naturais no tratamento da infecção. Damke et al. (2011)
avaliaram de modo in vivo a utilização do extrato hidroalcoólico dos frutos de
Sapindus saponaria além de uma fração obtida desta espécie frente à infecções
estabelecidas em ratas com as espécies C. albicans e C. glabrata, empregando o
mesmo tratamento imunossupressivo e hormonal utilizado neste estudo, onde foi
possível evidenciar a ação terapêutica de ambos compostos no tratamento da
doença.
Zeng et al. (2011) também desenvolveram um ensaio experimental de CVV
causada por C. albicans utilizando terapia imunossupressora e indução do estado
pseudo-estro com a utilização de estradiol, para que pudesse ser avaliado o
emprego do óleo essencial de Anethum graveolens como agente terapêutico. Neste
estudo, foi constatado uma expressiva ação do óleo essencial frente à cura dos
animais infectados, comparando-se aos resultados obtidos com fármaco fluconazol,
empregado como controle positivo de tratamento.
Neste trabalho foram desenvolvidos infecções com duas diferentes cepas de
C. albicans, uma de origem padrão (ATCC 10231) e outra de origem clínica (CAV 3)
isolada da região vaginal de uma paciente sintomática e com diagnóstico positivo
para CVV. Foi avaliada especificamente a atividade terapêutica de extrato
metanólico de escapos de S. nitens, incorporado e não incorporado em um sistema
nanoestruturado precursor de cristais líquidos mucoadesivos desenvolvido com a
finalidade de promover o aprimoramento da atividade biológica do extrato.
Foi observado que em ambas as infecções (ATCC e CAV 3) o extrato vegetal
não incorporado e incorporado no SPCLM desempenhou perfil terapêutico em todos
animais que foram submetidos ao tratamento. Em relação ao extrato não
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incorporado, foi constatada a cura dos animais infectados com a cepa ATCC após 4
dias de administração, já aqueles infectados com a cepa clínica CAV 3 foram
considerados curados no sexto dia de tratamento, o que é esperado, visto ao perfil
mais virulento que cepas de origem clínica apresentam.
Em relação ao tratamento com o extrato incorporado no SPCLM, concluiu-se
um importante perfil de cura em ambas as infecções (ATCC e CAV 3), uma vez que
todos os animais submetidos ao a administração do mesmo foram considerados
curados logo no segundo dia de análise da eficácia do tratamento. Os motivos desta
importante ação podem ser explicados segundo os mesmos parâmetros que foram
discutidos nos ensaios de determinação antifúngica in vitro, uma vez que a
formulação empregada exerceu papel fundamental no desempenho da eficácia do
tratamento, todavia, é justificável atribuir o padrão mucoadesivo como um forte
coadjuvante da atividade observada, uma vez que promoveu um contato íntimo com
o local infectado liberando o extrato vegetal de uma forma mais precisa e direta.
Fazendo-se uma relação entres os resultados do tratamento com o extrato não
incorporado é possível dar mais justificativa a esta afirmação, uma vez que no ato da
administração
do
extrato
por
via
intravaginal
os
animais
ejaculavam
automaticamente material depositado, fazendo com que uma quantidade mínima
permanecesse no ambiente para desempenhar a ação terapêutica.
O aperfeiçoamento do potencial antifúngico do extrato após a incorporação no
sistema de liberação de fármacos pode também ser confirmado quando se analisa
os dados apresentados pelos tratamentos realizados com a formulação sem a
presença do mesmo, uma vez que não exerceu perfil de cura nos animais
infectados, observado-se que o curso da infecção foi mantido íntegro até o final do
experimento.
O único dado literário que se refere à ação do extrato metanólico dos escapos
de S. nitens no tratamento da CVV são os desenvolvidos por Araújo et al. (2013),
que por sua vez, podem também confirmar a potencialidade do mesmo na terapia
antifúngica além de comprovar que a ação do extrato é aprimorada quando o
mesmo é veiculado por uma base nanotecnológica de liberação de fármacos, visto
que em seu estudo incorporou seu extrato em uma formulação convencional e
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obteve a cura dos animais após 4 dias de tratamento, sendo esta mais tardia que a
observada na presente investigação.
É importante levar em consideração os resultados obtidos com o creme
vaginal de anfotericina B, uma vez que foi observada a cura dos animais apenas no
oitavo dia de análise, o que o mostra fraco perante os resultados com o extrato
incorporado e não incorporado. Estes dados são de extrema relevância, uma vez
que o extrato vegetal pode ser um possível candidato à substituição do fármaco na
terapêutica deste tipo de infecção.
A profilaxia de doenças fúngica é sem sombra de dúvida um item relevante na
pesquisa de novos fármacos. A terapêutica de doenças de caráter imunossupressor
em pacientes que estão em tratamento, como aqueles sujeitos a hemodiálise,
envolvem a utilização de fármacos antifúngicos como coadjuvantes complementares
do tratamento realizado, uma vez que são empregados como preventivos do
desencadeamento de eventos patológicos de caráter fúngico oportunista, como
aqueles oriundos de espécies do gênero Candida. Esta abordagem apresenta-se
como um fator de risco para o desenvolvimento da multirresistência ao fármaco
utilizado, o que torna ineficaz a eliminação do agente infeccioso, necessitando assim
de uma nova abordagem medicamentosa com a utilização de outras classes de
fármacos muitas vezes dotados de efeitos deletérios que dificulta a adesão do
paciente ao tratamento, principalmente quando isso ocorre em portadores de
disfunções imunológicas severas como a AIDS e outras doenças relacionadas
(PFALLER, 2012).
No sentido de promover uma melhor adequação do paciente ao tratamento,
as plantas podem oferecer um suporte seguro para controle e prevenção de
doenças infecciosas, uma vez que são dotadas de propriedades antimicrobianas
muitas vezes desconhecidas. Realizar uma terapia antifúngica com produtos de
origem natural classifica-se como uma importante ferramenta que visa eliminar
efeitos colaterais e com isso promover o bem estar e manutenção da qualidade de
vida do hospedeiro acometido (SALEEM, 2010).
Em razão da preocupação com o alto índice de doenças fúngicas, e da
eficácia observada no ensaio terapêutico de CVV causada por C. albicans, nesta
etapa do presente estudo foi avaliado o potencial profilático do extrato metanólico de
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escapos de S. nitens incorporado ou não no SPCLM desenvolvido sobre uma
linhagem não-albicans, a fim de evidenciar se ambas as formas do extrato são
capazes de prevenir o desencadeamento da infecção. A espécie C. krusei (ATCC
6258) foi eleita como o agente patológico desta investigação por ser uma espécie
que apresenta resistência intrínseca ao fluconazol e estar relacionada com altos
índices de ineficácia dos agentes antifúngicos empregados em prática clínica.
A literatura apresenta importantes dados referentes à utilização de terapias
profiláticas voltadas à prevenção de doenças fúngicas causadas por Candida spp.
desenvolvidos com animais.
O Estudo realizado por Dai et al. (2011) avaliou o perfil profilático da terapia
fotodinâmica utilizando-se luz vermelha sobre corantes fenotiazínicos [azul de
metileno, azul de toluidina e um novo composto à base de azul de metileno (NMB)]
frente à prevenção do desenvolvimento da candidíase causada por C. albicans
sobre a pele de roedores saudáveis. Os dados obtidos no estudo demonstraram que
a terapia fotodinâmica em combinação com o corante azul (NMB) e luz vermelha,
pode reduzir significativamente a carga do fungo nas feridas de abrasão da pele
infectada.
Focando na busca de novos fármacos antifúngicos, Chami et al. (2004)
avaliaram o perfil profilático do carvacrol e eugenol frente à prevenção do
desenvolvimento da CVV causada por C. albicans em um modelo experimental in
vivo utilizando ratas ovariectomizadas da linhagem Wistar (Rattus novergicus). Os
autores evidenciaram que a utilização de ambos os compostos antes da introdução
da carga fúngica por via vaginal impediu o estabelecimento do estado infeccioso.
Os ensaios in vivo de profilaxia empregando produtos naturais voltados ao
combate do desenvolvimento da CVV causada por espécies não-albicans parece ser
uma etapa importante para a caracterização do potencial antifúngico de extratos
vegetais, visto que em muitos casos de infecções por esta classe de agentes
patogênicos são evidenciados episódios de multirresistência e alto índice de
disseminação para outras estruturas do corpo, o que dificulta ainda mais a adesão
do paciente ao tratamento (CORNELY et al., 2011).
O desenvolvimento do ensaio teve como principal objetivo tratar os animais
antes de receberem a carga fúngica por via vaginal. Inicialmente, com exceção de
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Matheus Ap. Santos Ramos
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um dos grupos positivos de infecção, foi realizada a imunossupressão com
ciclofosfamida (mesma quantidade e dosagem utilizada no ensaio terapêutico de
CVV). A razão de não se imunossuprimir um dos grupos positivos de infecção foi no
sentido de verificar o impacto da imunossupressão no desenvolvimento da infecção.
Anteriormente ao desenvolvimento da infecção procedeu-se a indução do estado
pseudo-estro em todos os animais através da aplicação de solução de estradiol (20
mg/mL) por via subcutânea (0,1 mL), da mesma forma que foi realizado no ensaio
terapêutico, diferenciando apenas na quantidade de dias de administração, uma vez
que os animais empregados neste estudo chegaram à fase estral pretendida com
cinco dias de tratamento com o hormônio. Os animais foram tratados por dez dias
com seus respectivos tratamentos antes da infecção duas vezes ao dia.
De acordo com as análises realizadas dois dias após a inoculação da
suspensão fúngica, foi possível constatar que os animais tratados com o extrato
incorporado no sistema nanoestruturado não desenvolveram a infecção, já aqueles
que foram tratados com o extrato não incorporado desenvolveram o estado
infeccioso, embora em menor concentração quando comparado ao grupo positivo de
infecção, igualmente aos resultados observados no grupo tratado com anfotericina
B. Esta infecção perdurou até o quarto dia de análise pós-infecção, onde todos os
animais foram considerados curados.
Em relação ao não desenvolvimento da infecção por parte do grupo tratado
com o extrato incorporado no SPCLM, conclui-se que a veiculação do composto
herbal não é somente capaz de tratar a patogenia desenvolvida em casos de
infecções por vaginais por C. albicans, mas também é extremamente promissor no
desempenho da prevenção de infecção por C. krusei. Estes dados refletem mais
uma vez que o sistema de liberação de fármacos é um potencializador da ação
biológica do extrato vegetal, onde as razões para tal eventualidade podem ser dadas
também às propriedades físicas e biológicas atribuídas ao SPCLM utilizado no
ensaio terapêutico de CVV, sendo elas, a mucoadesividade e a interação direta com
as células fúngicas leveduriformes.
Embora os resultados tenham sido importantes, faz-se necessário o
aprofundamento de investigações clínicas e farmacológicas voltadas à elucidação do
mecanismo de ação exercido pelo extrato vegetal não incorporado e incorporado no
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Matheus Ap. Santos Ramos
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Discussão
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SPCLM desenvolvido, uma vez que estas informações servirão de base para o
entendimento concreto e mais direto dos efeitos de tais compostos no organismo
humano, fornecendo assim uma plataforma segura para a incorporação dos mesmos
no arsenal terapêutico antifúngico.
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Matheus Ap. Santos Ramos
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7. Conclusão
Entretanto, há algo a mais para se concluir...
...Deus não alimentaria em meu coração um sonho impossível de ser
realizado!
(Matheus Ap. Santos Ramos)
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Matheus Aparecido dos Santos Ramos
Conclusão 146
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7. CONCLUSÃO
A partir de todas as análises realizadas neste estudo foi possível evidenciar a
prospecção biológica do extrato metanólico de escapos de Syngonanthus nitens
chegando-se as seguintes conclusões:
 O extrato metanólico de escapos de S. nitens foi ativo contra as todas as cepas de
Candida empregadas no estudo.
 O extrato vegetal mostrou-se promissor no desempenho da atividade antifúngica
frente aos principais fatores de virulência de Candida spp.
 O sistema precursor de cristais líquidos mucoadesivos desenvolvido mostrou-se
favorável para a incorporação do extrato vegetal.
 O potencial antifúngico do extrato de S. nitens foi aprimorado quando o mesmo foi
incorporado no SPCLM.
 O SPCLM mostrou-se tóxico sobre linhagens celulares normais e tumorais de acordo
com as análises realizadas in vitro.
 O extrato de S. nitens mostrou-se ativo no tratamento da CVV causada por C.
albicans e sua ação foi superior quando foi veiculado no SPCLM.
 O extrato incorporado no SPCLM pode ser utilizado como agente profilático em
infecções vaginais por C. krusei.
 O SPCLM desenvolvido pode ser empregado como veiculo para a administração de
fármacos por via intravaginal.
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Matheus Ap. Santos Ramos
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8. Referências
Bibliográficas
O espelho e os sonhos são coisas semelhantes, é como a imagem do
homem diante de si próprio.
(José Saramago)
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Matheus Aparecido dos Santos Ramos
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8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABBAS, J.; BODEY, G. P.; HANNA, H. A.; MARDANI, M.; GIRGAWY, E.; ABI-SAID,
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ABDOLLAHZADEH, S.; MASHOUF, R. Y.; MORTAZAVI, H.; MOGHADDAM, M. H.;
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2011.
AJAZUDDIN, S. S. Applications of novels drug delivery system for herbal
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Matheus Ap. Santos Ramos
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9. Anexos
Se você acredita que está no caminho certo, não pare. Não desista,
aguente firme. Não existe cedo ou tarde, tempo certo ou tempo
errado... As coisas acontecem quando tem que acontecer.
(Laura Gusmão Ferraz)
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Matheus Aparecido dos Santos Ramos
Anexos 167
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Matheus Ap. Santos Ramos