CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE ISOLADOS VIRAIS DA DENGUE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE GENÉTICA
CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE
ISOLADOS VIRAIS DA DENGUE
JULIANA MARIA AZEVEDO DE LYRA
Recife, PE
Setembro, 2006
JULIANA MARIA AZEVEDO DE LYRA
CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE
ISOLADOS VIRAIS DA DENGUE
Dissertação
apresentada
ao
Programa
de
Pós-
Graduação em Genética da Universidade Federal
de
Pernambuco,
como
parte
dos
requisitos
necessários para a obtenção do grau de Mestre em
Genética.
Orientadora: Profª Drª Norma Lucena Cavalcanti
Licínio da Silva, Depto. de Genética, Centro de
Ciências Biológicas, UFPE.
Recife, PE
Setembro, 2006
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a DEUS por ter me dado a vida e a possibilidade de
realizar este trabalho.
Em especial a Dra Norma Lucena do Centro de Pesquisas Aggeu
Magalhães pela paciência e confiança em mim depositadas e pelo
incentivo durante toda a minha trajetória no Mestrado.
Aos meus amigos e colegas de turma pela companhia e motivação e
pelos momentos de descontração ao longo desses dois anos.
Agradeço a todos os colegas do Laboratório de Biologia Molecular do
Serviço de Oncologia do IMIP que participaram de forma ativa na
realização deste trabalho.
Não poderia deixar de agradecer a minha família pela compreensão e incentivo
nos momentos necessários.
Muito Obrigada a Todos!
Aos meus pais,
dedico.
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
Sumário
Página
Lista de Tabelas
8
Lista de Figuras
9
Lista de abreviações
12
Resumo
13
1. Introdução
14
2. Objetivos
17
2.1 Geral
17
2.2. Específicos
17
3. Revisão da literatura:
18
3.1 Histórico da Dengue
18
3.2 Epidemiologia da Dengue
19
3.3 Aspectos Clínicos da Dengue
21
3.3.1 Dengue Clássica
21
3.3.2 Febre Hemorrágica da Dengue
22
3.4 Tratamento e Vacina
24
3.5 Agente Etiológico
25
3.6 Transmissão do Vírus Dengue
26
3.7 Diagnóstico Laboratorial da Dengue
27
3.7.1 Isolamento Viral
27
3.7.2 Diagnóstico Sorológico
27
3.7.3 Diagnóstico Molecular
28
3.8 Genômica do Vírus Dengue
29
6
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
3.9 Filogenia do Vírus Dengue
3.10 Bioinformática
31
32
3.10.1 Bancos de Dados
33
3.10.2 Mineração de Dados
34
4. Referências Bibliográficas
37
5. Manuscrito de Artigo Científico: Caracterização
genética do vírus dengue sorotipo 3 isolado de pacientes
com diferentes formas clínicas atendidos em Recife em
2003-2004.
41
6. Informações complementares
66
6.1 Detalhamento das metodologias utilizadas
67
6.2 Figuras adicionais
75
7. Abstract
88
8. Conclusões
89
9. Anexos
91
9.1 Instruções para Autores
92
7
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
LISTA DE TABELAS
Tabela
Página
Tabela 1. Primers utilizados na PCR e no seqüenciamento
das 14 amostras de DEN-3 selecionadas.
57
Tabela 2. Amostras com os genes Capsídeo (CAP)
Membrana (MEM) utilizadas, contendo o tamanho de cada
seqüência, o conteúdo de Guanina e Citosina e a identidade
(ID)
encontrada
quando
comparadas
com
outras
seqüências no banco de dados do NCBI.
58
Tabela 3. Grau de homologia entre as 14 seqüências de
nucleotídeos analisadas com os genes do capsídeo e da
membrana de DEN-3, dados em percentagem.
59
Tabela 4. Parte do gene do Envelope (ENV) nas 14
seqüências utilizadas no estudo, contendo o tamanho de
cada seqüência, o conteúdo de Guanina e Citosina e a
identidade (ID) encontrada quando comparadas com outras
seqüências no banco de dados do NCBI.
62
Tabela 5. Grau de homologia entre as 14 seqüências de
nucleotídeos analisadas com o gene do Envelope de DEN-3,
dados em percentagem.
63
8
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
LISTA DE FIGURAS
Figura
Página
Revisão da Literatura
Figura 1. Exantema da dengue.
22
Figura 2. Febre hemorrágica da dengue. Hemorragia
subcutânea.
23
Figura 3. Febre hemorrágica da dengue. Hemorragia
ocular.
23
Figura 4. Mosquito Aedes aegypti.
26
Manuscrito
Figura 1. Dendrograma gerado com os nucleotídeos das
14 amostras analisadas, referente aos genes do Capsídeo e
da Membrana, com base na utilização do método UPGMA
com 1000 repetições de bootstrap.
60
Figura 2. Dendrograma gerado com os aminoácidos das
14 amostras analisadas, codificados pelos genes do
Capisídeo e Membrana com base na utilização do método
UPGMA com 1000 repetições de bootstrap.
61
Figura 3. Dendrograma gerado com os nucleotídeos das
14 amostras analisadas, referente ao gene do Envelope
com base na utilização do método UPGMA com 1000
repetições de bootstrap.
64
Figura 4. Dendrograma gerado com os aminoácidos das
14 amostras analisadas, codificados pelo gene do Envelope
com base na utilização do método UPGMA com 1000
repetições de bootstrap.
65
Informações complementares
Figura 5. Foto de gel de agarose após eletroforese para
demonstração do padrão de bandas de 600 pb referentes
aos genes do Capsídeo e da Membrana de DEN-3. Poço 1,
75
9
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
Peso molecular ; Poço 2, controle negativo, Poços 3-10,
amostras de 8 pacientes usadas para o estudo.
Figura 6. Foto de resultado de seqüenciamento utilizando
os primers CAP F/ MEM R, com o fragmento referente aos
genes do capsídeo e da membrana de DEN-3, obtida com o
auxílio do programa BioEdit.
75
Figura 7. Resultado do alinhamento entre os genes do
Capsídeo e da Membrana de uma das amostras analisadas
de DEN-3 e seqüências similares no banco de nucleotídeos
do NCBI. Observa-se a conservação dos nucleotídeos entre
as seqüências depositadas no banco de dados público e a
seqüência obtida por seqüenciamento no presente estudo.
As barras em vermelho representam as regiões do gene
com similaridade às seqüências encontradas no banco de
dados.
76
Figura 8. Resultado do alinhamento entre os genes do
Capsídeo e da Membrana de DEN-3 de uma das seqüências
utilizadas na análise e seqüências do banco de aminoácidos
do NCBI. Observa-se a conservação das seqüências do
banco de dados com a seqüência analisada.
77
Figura 9. Alinhamento múltiplo das seqüências de
nucleotídeos das amostras estudadas, referente aos genes
do Capsídeo e da Membrana, realizado com o auxílio da
ferramenta Clustal X, integrante do pacote de programas
Seqtools.
80
Figura 10. Alinhamento múltiplo das seqüências de
aminoácidos das amostras estudadas, referente aos genes
do Capsídeo e da Membrana, realizado com o auxílio da
ferramenta Clustal X, integrante do pacote de programas
Seqtools.
81
Figura 11. Foto de resultado de sequenciamento utilizando
os primers MEM F/ ENV R, com o fragmento referente ao
gene do Envelope de DEN-3, obtida com o auxílio do
programa BioEdit.
82
Figura 12. Resultado do alinhamento entre o gene do
Envelope de uma das amostras analisadas de DEN-3 e
seqüências similares no banco de nucleotídeos do NCBI.
Observa-se a conservação dos nucleotídeos entre as
seqüências depositadas no banco de dados público e a
seqüência obtida por sequenciamento no presente estudo.
83
Figura 13. Resultado do alinhamento entre o gene do
Envelope de DEN-3 de uma das seqüências utilizadas na
análise e seqüências do banco de aminoácidos do NCBI.
84
10
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
Figura 14. Alinhamento múltiplo das seqüências de
nucleotídeos das amostras estudadas, referente ao gene do
Envelope, realizado com o auxílio da ferramenta Clustal X,
integrante do pacote de programas Seqtools.
86
Figura 15. Alinhamento múltiplo das seqüências de
aminoácidos das amostras estudadas, referente ao gene do
Envelope, realizado com o auxílio da ferramenta Clustal X,
integrante do pacote de programas Seqtools.
87
11
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
LISTA DE ABREVIATURAS
BLAST
bp
cDNA
DC
DEPC
DNA
dNTP
EDTA
FACEPE
FHD
GC%
kb
MEGA
NCBI
OMS
PCR
PL
RNA
RT-PCR
Taq
UFPE
Basic Local Aligment Search Tool
(Ferramenta básica de alinhamento local de seqüências)
Pares de Bases
DNA complementar
Dengue clássica
Dietil Pirocarbonato
Desoxiribonucleic Acid
(Ácido Desoxirribonucléico)
Dinucleotideo Trifosfato
EthyleneDiamineTetrAcetic acid
(Ácido etilenodiamino tetra-acético)
Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de Pernambuco
Febre hemorrágica da Dengue
Conteúdo de Guanina e Citosina
kilo bases (mil pares de bases)
Molecular Evolutionary Genetic Analysis
Nacional Center for Biotechnology Information
(Centro Nacional para Informação em Biotecnologia)
Organização Mundial de Saúde
Polymerase Chain Reaction
(Reação em Cadeia da Polimerase)
Plaquetopenia
Ácido Ribonucléico
transcriptase reversa PCR
Thermophylus aquaticus
Universidade Federal de Pernambuco
12
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
RESUMO
A caracterização molecular do vírus da dengue é útil na determinação da
origem de amostras e, principalmente, na tentativa de se estabelecer uma
correlação de virulência dos isolados e sua importância epidemiológica.
Embora os quatro sorotipos do vírus da dengue possam causar a febre
hemorrágica
da
dengue
considerando
a
infecção
primária,
alguns
sorotipos parecem estar associados a determinadas formas e a gravidade
da doença em diferentes localidades. Neste trabalho, 14 isolados do
sorotipo 3 do vírus da dengue foram obtidos de pacientes com diferentes
quadros clínicos em Recife entre 2003-2004: 10 pacientes com dengue
clássica sendo que cinco deles cursaram com plaquetopenia e outros
quatro com diagnóstico de febre hemorrágica da dengue. A extremidade
5’ dos genomas virais foi seqüenciada e foram comparadas às seqüências
nucleotídicas
e
polipeptídicas
correspondentes
às
do
capsídeo,
da
membrana e parte do envelope entre si. Os sítios variantes na porção Cterminal do primeiro ¼ da seqüência do envelope sugerem que a
apresentação clinica da doença pode estar relacionada à variabilidade do
genoma viral, visto que as análises dos dendrogramas gerados a partir
das seqüências dos aminoácidos do fragmento seqüenciado do gene do
Envelope, formam três clados distintos, um deles apenas com as
seqüências originadas de isolados de pacientes com febre hemorrágica da
dengue, outro com seqüências de pacientes com dengue clássica com ou
sem plaquetopenia e um clado intermediário onde ocorrem semelhanças
entre isolados de formas clínicas diferentes.
Palavras-chaves: Dengue clássica, dengue hemorrágica e Filogenia
13
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
1- INTRODUÇÃO
A dengue é uma das mais importantes doenças virais humanas
transmitidas por vetores artrópodes. Anualmente são estimados cerca de
50-100 milhões de casos de dengue clássica (DC) e 50.000 a 250.000
casos de febre hemorrágica da dengue (FHD) no mundo (Guzman e Kouri,
2003).
O vírus pertence à família Flaviviridae gênero Flavivirus. Este gênero
contém um certo número de patógenos humanos importantes, como o
vírus da encefalite Japonesa (JEV), vírus West Nile (WNV) e vírus da febre
amarela (YFV) (Kuhn et al., 2002). Assim como outros flavivirus, a
partícula viral é coberta por um envelope lipídico contendo proteínas do
envelope e da membrana. Medem cerca de 60 nm de diâmetro e possuem
10 genes que codificam três proteínas estruturais (C - capsídio, M membrana e E - envelope) e sete proteínas não-estruturais (NS1, NS2a,
NS2b, NS3, NS4a, NS4b e NS5). Seu genoma é uma fita de RNA com
polaridade positiva, de aproximadamente 10.200 nucleotídios (Leitmeyer
et al., 1999).
A dengue é causada por um de quatro sorotipos diferentes
denominados: DEN-1, DEN-2, DEN-3 e DEN-4 (Rigau-Pérez et al., 1998).
A infecção por qualquer um deles confere proteção permanente para o
mesmo sorotipo e imunidade parcial e temporária contra os outros três.
Trata-se, caracteristicamente, de enfermidade de áreas tropicais e
subtropicais,
onde
as
condições
do
ambiente
favorecem
o
desenvolvimento dos vetores (Fundação Nacional da Saúde, 2001).
O principal agente transmissor da dengue nas Américas é o Aedes
aegypti, um mosquito doméstico que ataca durante o dia e. Ele é
altamente urbanizado e realiza sua procriação em águas limpas estocadas
para consumo ou águas de chuvas empoçadas (Guzman et al., 2000).
Na forma clássica a doença é de baixa letalidade, mesmo sem
tratamento específico. Na febre hemorrágica da dengue a febre é alta,
com
manifestações
hemorrágicas,
hepatomegalia
e
insuficiência
14
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
circulatória. A letalidade é significativamente maior do que na forma
clássica (Fundação Nacional da Saúde, 2001).
A variação sorológica e genética entre linhagens virais são também
fatores de virulência. Embora os quatro sorotipos de dengue possam
causar
dengue
hemorrágica,
considerando
a
infecção
primária,
os
sorotipos 2 e 3 são predominantes na associação com FHD na Ásia e o
sorotipo 2 está associado as principais epidemias nas Américas parecem
estar associados a determinadas formas e gravidade da doença em
diferentes localidades (Pinheiro e Chuit, 1998).
Outros fatores individuais como idade, sexo, herança genética e
outras
doenças
anteriores
podem
ter
um
papel
importante
na
suscetibilidade à doença. Por exemplo, no Brasil, na Colômbia e em Porto
Rico a febre hemorrágica da dengue é mais comum em adultos, assim
como, de uma forma geral, esta forma da doença é mais comum em
brancos do que em negros (Pinheiro e Chuit, 1998).
A variação entre os vírus da dengue foi inicialmente estudada por
meio de técnicas sorológicas que demonstraram diferenças antigênicas e
biológicas entre amostras de um mesmo sorotipo (Russel e McCown,
1972). Outras metodologias, tais como hibridização de cDNA-RNA (Block,
1985) e análise com endonucleases de restrição de produtos de RT-PCR
(Vorndam et al., 1994), têm demonstrado a variabilidade antigênica e
genética entre os vírus da dengue.
Os métodos sorológicos de diagnóstico, como o ELISA, não fornecem
informações sobre o sorotipo do vírus além de apresentarem reações
cruzadas dos determinantes antigênicos compartilhados pelos quatro
sorotipos do vírus da dengue e outros membros da família Flaviviridae
(Harris et al., 1998). A determinação de um padrão de fingerprinting para
cada sorotipo de dengue (Vezza et al., 1980) permitiu a análise molecular
de variantes dentro de cada sorotipo. Assim, Kurstak et al. (1990)
definiram o termo “topotipo”, que representa variantes genéticas que
apresentam homologia em pelo menos 70% dos oligonucleotídeos.
15
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
Entretanto, a técnica de seqüenciamento do genoma viral substitui os
estudos com fingerprinting, uma vez que permite uma melhor análise das
relações genéticas entre as amostras (Rico-Hesse, 1990).
A caracterização molecular dos vírus da dengue tem sido útil para
determinar a origem das amostras, o impacto destas sobre a população e,
principalmente, na tentativa de se estabelecer uma correlação de
virulência das amostras e sua importância epidemiológica (Pinheiro e
Chuit, 1998).
Não existe vacina eficaz para a prevenção da dengue nem
tratamento específico antiviral que combata a viremia. Apesar do grande
esforço dos pesquisadores, uma vacina eficaz e segura ainda não foi
licenciada (Nogueira, 1999). A falta de vacina eficaz ou a cura da doença
torna um sistema de vigilância epidemiológica de base laboratorial um
ponto de grande importância no alerta de uma possível epidemia de
dengue, assim como para o fornecimento de informações de medidas
efetivas de controle do vetor. A vigilância dos locais de ocorrência
mediante a identificação dos sorotipos circulantes é de grande importância
na determinação de ocorrência de infecção prévia por um dos quatro
sorotipos que poderá ser um fator de risco para o desenvolvimento de
uma forma mais severa da doença após uma segunda infecção por
sorotipo antigenicamente distinto (Harris, 1998).
16
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
2- OBJETIVOS
2.1 GERAL
¾ Seqüenciar isolados de vírus DEN-3 de pacientes com diferentes
apresentações clínicas da dengue e comparar as seqüências dos
genes estruturais com as seqüências disponíveis em bancos de
dados públicos e entre si visando, através da análise filogenética,
verificar a origem e evolução das cepas estudadas, assim como,
identificar a relação entre diferenças no genoma viral e gravidade da
doença.
2.2 ESPECÍFICOS
¾ Seqüenciar 14 cepas do vírus DEN-3 coletadas na cidade de Recife,
sendo quatro obtidas de pacientes com a forma hemorrágica da
dengue (FHD), cinco com dengue clássica (DC) e cinco com dengue
clássica e plaquetopenia.
¾ Construir um banco de dados contendo as seqüências gênicas do
capsídeo, da membrana e do envelope das 14 cepas virais
analisadas.
¾ Verificar a existência de similaridades entre as seqüências de
nucleotídeos e de aminoácidos das cepas seqüenciadas com as de
outras cepas depositadas em bancos de dados públicos, através da
utilização de programas de alinhamento local.
¾ Determinar o conteúdo de GC% das seqüências gênicas dos isolados
virais da Dengue, observando a correlação c as seqüências dos
bancos de dados públicos.
¾ Construção
de
árvores
filogenéticas
indicando
as
posições
taxonômicas das cepas analisadas e das demais cepas descritas em
bancos de dados públicos.
¾ Verificar a existência de correlação entre alterações no genoma e
apresentação clínica da doença nos três grupos de cepas de DEN-3
analisados (FHD, DC e DC com plaquetopenia).
17
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
3- REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Histórico da Dengue
O primeiro relato de doença semelhante a dengue foi encontrado
numa enciclopédia chinesa da dinastia Chin (265 a 420 anos AC). Foi
denominada pelos chineses de veneno da água, pois achavam que de
alguma maneira estava associada a insetos voadores e a água (Nogueira,
1999).
A
origem
do
termo
dengue
é
desconhecida,
mas
algumas
especulações têm sido feitas. Há sugestões de que tenha uma origem
árabe arcaica significando fraqueza. Halstead sugere que o nome venha
de uma epidemia ocorrida em 1870, em Zanzibar e estaria ligada a frase
“Ki-dengua-pepo”, significando pancada ou golpe dado por um mal
espírito (Figueiredo, 1991). Outros nomes encontrados são: febre quebraossos, febre dandy, febre ramalhete, febre girafa e febre do quinto ou
sétimo dia (Henchal e Putnak, 1990).
Existem indícios de que uma primeira epidemia de dengue tenha
corrido entre os anos de 1779 e 1780 na ilha de Jakarta, na Ásia, no Cairo
e em Alexandria, no Egito simultaneamente (Henchal e Putnak, 1990).
Posteriormente epidemias da dengue foram descritas na Filadélfia
(1780), Zanzibar (1823 e 1870), Calcutá (1824, 1853, 1871 e 1905),
Oeste Indiano (1827) e Honk Kong (1901). Outras grandes epidemias
ocorreram, em intervalos irregulares, em locais onde os mosquitos
vetores podem ser achados. Algumas das maiores epidemias ocorreram
nos Estados Unidos (1922), Austrália (1925-1926, 1942), Grécia (19271928) e Japão (1942-1945) (Henchal e Putnak, 1990).
A primeira epidemia conhecida da febre hemorrágica da dengue
ocorreu em Manila, Filipinas, entre 1953 e 1954 tendo em seguida se
espalhado pelo sudeste da Ásia (Gubler,1998).
18
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
A primeira epidemia confirmada em laboratório nas Américas foi
associada ao sorotipo 3, isolado no Caribe e na Venezuela em 1964.
Anteriormente o sorotipo 2 havia sido isolado em 1953 na mesma região,
mas, em casos isolados. Em meados de 1970, grandes epidemias dos
sorotipos 2 e 3 ocorreram na Colômbia e tornaram-se endêmicas no
Caribe. Em 1977 o sorotipo 1 foi introduzido nas Américas, atingindo a
América Central, o México e a região norte da América do Sul (Nogueira,
1999).
No Brasil os primeiros relatos da dengue sorotipo 1 ocorreram em
1916 em São Paulo, mas com o início da campanha de erradicação do
vetor, em 1904, por Oswaldo Cruz para o combate da Febre Amarela,
houve uma queda no número de casos. Porém com o declínio da
campanha de erradicação, houve uma reinfestação do mosquito no início
dos anos 70.
Após cerca de 60 anos sem estar presente na literatura
médica, a Dengue ressurgiu em Boa Vista/Roraima entre 1981 e 1982,
com os sorotipos DEN-1 e DEN-4 (Figueiredo, 1991). Dengue sorotipo 1
ocorreu em 1987 em Pernambuco, com o sorotipo 2 tendo sido
introduzido no Rio de Janeiro em 1989 e em 1994 em Recife. O vírus 3 foi
detectado pela primeira vez em Pernambuco na epidemia de 2002 e foi o
responsável pela maioria dos casos daquela epidemia (Fundação Nacional
de Saúde, 1996).
3.2 Epidemiologia da Dengue
Cerca de 2/3 da população mundial vive em ambientes onde a
dengue/febre hemorrágica da dengue é uma das mais importantes
doenças humanas causada por vírus, sendo considerada endêmica ou
epidêmica. A OMS (Organização Mundial de Saúde) estima que 80 milhões
de pessoas sejam infectadas com o vírus da dengue a cada ano em todos
os continentes, com exceção da Europa. Dessas pessoas, cerca de 550 mil
19
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
necessitam de hospitalização e pelo menos 20 mil morrem da doença
(Ministério da Saúde, 2001).
Os quatro sorotipos (DEN1-4) têm sido associados a pandemias e
epidemias da febre hemorrágica da dengue nas Américas, podendo às
vezes ser uma doença fatal. Mais de 100 países tropicais têm infecções
endêmicas do vírus dengue e em mais de 60 desses países já foram
documentados casos de dengue hemorrágica (Pinheiro e Chuit, 1998).
A epidemiologia global e a dinâmica de transmissão do vírus da
dengue mudaram bastante desde a segunda guerra mundial. Há vários
fatores responsáveis pelo ressurgimento da epidemia de dengue/febre
hemorrágica da dengue nos últimos anos. Mesmo com fatores ainda não
muito bem compreendidos, é evidente que as mudanças demográficas e
sociais, o crescimento populacional, urbanização e transportes modernos
contribuíram fortemente para o aumento da incidência e expansão
geográfica da dengue (Gubler, 2002).
Um outro fator importante para a disseminação da doença é a falta
de medidas amplas e adequadas de controle do vetor nas áreas
endêmicas, onde muitas vezes as atividades de controle se restringem ao
uso de inseticidas com baixa eficácia lançados ao ar gerando apenas falsa
sensação de segurança (Sinniah e Igarashi, 1995).
Epidemias causadas pelos vários sorotipos virais possibilitaram o
aumento da taxa de variações genéticas das viroses e assim a
probabilidade de gerar linhagens ou genotipos de vírus com um maior
potencial de virulência (Gubler, 2002).
No Brasil o número de casos vem crescendo de forma alarmante.
Em 1986, foram notificados 46.309 casos de dengue. Na maior epidemia,
no ano de 2002, notificou-se 672.371, sendo 2.090 casos de febre
hemorrágica da dengue e 96 óbitos, considerando ainda que a prevalência
deve ser bem superior já que a sub-notificação é um problema no país
(Penna, 2003).
20
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
Outras epidemias provavelmente ocorrerão. O vírus DEN-4 já circula
no continente e provocará epidemia se o controle vetorial permanecer
insuficiente (Penna, 2003).
3.3 Aspectos Clínicos da Dengue
3.3.1 Dengue Clássica
O período de incubação varia de 4 a 14 dias. A dengue clássica dura
em geral um tempo limitado e raramente é fatal. A maioria das infecções
em crianças com menos de 15 anos apresenta-se de forma assintomática
ou minimamente sintomática (Rigau-Pérez, 1998).
Tipicamente a dengue clássica inicia-se subitamente com febre alta,
acompanhada de cefaléia intensa, que pode ser retro-orbital e/ou
holocraniana. Acompanham o quadro, mialgia intensa e generalizada e,
algumas vezes, artralgias. O exantema da dengue (Figura 1) surge por
volta do terceiro ou quarto dia da doença, sendo mais comum nas
extremidades, podendo apresentar-se em todo o corpo (Serufo et al.,
2000).
Mostra-se característico da doença o prurido intenso na fase de
remissão do exantema. A dor abdominal no hipocôndrio direito, raramente
acompanhada de hepatomegalia, ocorre em pequena parcela dos casos.
Náuseas e vômitos também podem surgir no início do quadro e algumas
vezes o paciente apresenta diarréia. Linfoadenomegalia e esplenomegalia
são raras. Na fase de convalescença o paciente pode apresentar astenia e
depressão por um período de um a dois meses. Há relatos também de
distúrbios psiquiátricos (Serufo et al., 2000).
Na dengue clássica, segundo os tratados e manuais, podem ocorrer
fenômenos hemorrágicos que geralmente são leves, do tipo epistaxe e
gengivorragia, mas que podem em alguns casos apresentar-se tão
intensos ao ponto de levar ao choque hipovolêmico ( OMS, 1997).
21
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
Figura 1. Exantema da dengue. Fonte: OMS/TDR IMAGES.(2001).
3.3.2 Febre Hemorrágica da Dengue
O quadro inicia-se de forma semelhante à dengue clássica, com
febre (ocasionalmente 40 a 41o C), mantendo-se elevada por período de 2
a 7 dias. Tem sido definida nas situações em que há febre com ou sem
manifestações hemorrágicas (Figuras 2 e 3) associadas a trombocitopenia
(< 100.000/mm3) e presença de um ou mais dos seguintes dados clínicos
que caracterizam o extravasamento plasmático: derrame pleural, ascite,
elevação do hematócrito em mais de 20% acima dos valores basais e/ou
choque, geralmente acompanhado de valores elevados do hematócrito
(Rigau-Pérez et al., 1998).
A Febre Hemorrágica da Dengue pode ou não se associar à síndrome
do choque da dengue. O choque nessa situação é conseqüente ao grande
aumento da permeabilidade vascular com extravasamento de plasma.
Consideram-se como sinais e sintomas preditores do choque da dengue a
dor abdominal contínua, vômitos persistentes, hepatomegalia dolorosa,
presença de derrames cavitários, sangramentos importantes, elevação
súbita do hematócrito (>20% no período de 24 horas). A insuficiência
circulatória manifesta-se pela presença de agitação ou letargia, pulso
22
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
rápido e fraco, taquicardia, hipotensão, cianose e choque grave (Serufo et
al., 2000).
FIGURA 2. FHD. Hemorragia subcutânea. Fonte: OMS/TDR IMAGES. (2001).
FIGURA 3. FHD. Hemorragia ocular. Fonte: OMS/TDR IMAGES. (2001).
A prova do laço, que indica um aumento na fragilidade capilar, pode
ser utilizada como reforço ao diagnóstico (Gubler, 1998).
A OMS, 1995 ressalta as infecções do Sistema Nervoso Central
(SNC) nos casos de dengue. Alguns pacientes apresentam manifestações
como convulsões, espasticidade ou uma fuga prolongada de consciência
(mais de oito horas). Cinco casos de paralisia transitória com hiporreflexia
foram relatados na Indonésia e Malasia. O líquido cerebroespinal nesses
casos foi normal. São necessários mais estudos para identificar os fatores
que contribuem para estas manifestações incomuns.
23
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
3.4 Tratamento e Vacina
Não se dispõe de tratamento específico para a dengue, resumindose ao sintomático ou preventivo das possíveis complicações. Por isso, os
pacientes são submetidos a uma terapia de suporte, mantendo-se em
repouso, recebendo analgésicos e antipiréticos, em caso de dores e febre
respectivamente (Henchal e Putnak, 1990). A terapia de prevenção de
complicações é feita com o objetivo de manter a hidratação, combater a
acidose e corrigir as anormalidades da coagulação (Durães et al., 2004).
Transfusões de sangue devem ser evitadas em pacientes com grave
extravasamento de plasma sem hemorragia, da mesma forma que deve
ser evitada a administração de aspirina e outros salicilatos (Henchal e
Putnak, 1990).
Se o tratamento contra a Febre Hemorrágica da Dengue não for
iniciado prontamente o óbito pode ocorrer em quatro a seis horas. Quando
o choque é superado, a recuperação do paciente ocorre em dois a três
dias (Serufo et al., 2000).
Por causa das dificuldades de controle do vetor, e sem drogas
antivirais efetivas, as pesquisas envolvendo a produção de uma vacina,
têm crescido no mundo inteiro. A vacina para o vírus da dengue apresenta
uma dificuldade adicional pelo fato de ter que ser tetravalente, ou seja, de
ser
capaz
de
simultaneamente,
proteger
sem
contra
aumentar
os
o
quatro
risco
de
sorotipos
do
vírus
ocorrência
da
febre
hemorrágica da dengue. Além disso, como para outras vacinas, não deve
produzir efeitos colaterais e deve apresentar baixo custo (Marques-Jr.,
2002).
Várias estratégias têm sido utilizadas nas pesquisas para a produção
de uma vacina: 1) vacinas com vírus vivos atenuados ou inativados; 2)
vacinas não recombinantes com proteínas estruturais e não-estruturais e
peptídios sintéticos; 3) vacinas com subunidades recombinantes usando
baculovirus, leveduras e Escherichia coli; 4) vacinas com vetores
24
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
recombinantes; 5) vacinas com clones de cDNA infecciosos e 6) vacinas
de DNA (Guzman e Kouri, 2002). As vacinas com vírus vivos são as mais
promissoras por possuírem um baixo custo efetivo, mas apresenta o risco
da recombinação de flavivírus, entre a cepa vacinal e o vírus selvagem,
resultando
num
vírus
híbrido
com
propriedades
potencialmente
indesejáveis (Selligman e Ernest, 2004).
Não existe vacina eficaz para a prevenção da dengue nem
tratamento específico antiviral que combata a viremia. Apesar do grande
esforço dos pesquisadores, uma vacina eficaz e segura ainda não foi
licenciada. Enquanto os estudos para uma vacina ainda estão em
desenvolvimento no mundo todo, as medidas de controle do vetor
continuam sendo a melhor maneira de deter a disseminação da doença
(Nogueira, 1999).
3.5 Agente Etiológico
O Aedes aegypti pertence ao ramo Arthropoda (pés articulados),
classe Hexapoda (três pares de patas), ordem Diptera (um par de asas
anterior funcional e um par posterior transformado em halteres), família
Stegomia, gênero Aedes (Figura 4). É uma espécie tropical e subtropical,
encontrada em todo o mundo, entre as latitudes 35ºN e 35ºS. Embora a
espécie tenha sido identificada até a latitude 45ºN, estes têm sido
encontrados
esporadicamente
normalmente não
apenas
durante
a
estação
quente,
sobrevivendo ao inverno. A distribuição do Aedes
aegypti também é limitada pela altitude. Embora não seja usualmente
encontrado acima dos 1.000 metros, já foi referida sua presença a 2.200
metros acima do nível do mar, na Índia e na Colômbia (Fundação Nacional
da Saúde, 2001).
25
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
Figura 4. Mosquito Aedes aegypti. Fonte: Leonard E. Copyright. (1995).
3.6 Transmissão do Vírus Dengue
O vírus é transmitido ao homem pela picada do mosquito fêmea,
que é hematófago, tem hábitos diurnos, domésticos e preferência por
depósitos de água limpa (Fundação Nacional da Saúde, 1996), havendo
dois picos de atividade do inseto: duas a três horas após o nascer do dia e
à tarde, por algumas horas antes do anoitecer (Nogueira, 1999). A
transmissão vertical tem sido descrita sob a forma de relatos de casos, em
mulheres grávidas que ao adoecer em período próximo ao parto tiveram
suas crianças com quadro clínico compatível com dengue ao nascer e
teste sorológico com anticopo IgM específico para dengue positivo, além
de isolamento viral no sangue dessas crianças (Chye e Lim,1997).
A
persistência
do
vírus
dengue
é
causada
por
expansão
demográfica, urbanização não controlada e situações climáticas favoráveis
à proliferação do vetor. Pode-se resumir sua distribuição geográfica como
pan-tropical. Nas Américas, o vírus dengue é transmitido pela cadeia
homem – Aedes aegypti – homem. Após um repasto com sangue
infectado, o mosquito poderá transmitir o agente após um período de oito
a doze dias, também chamado de período de incubação intrínseco.
(Nogueira, 1999).
26
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
3.7 Diagnóstico Laboratorial da Dengue
Várias técnicas têm sido utilizadas para o diagnóstico laboratorial do
vírus
dengue
e
envolvem
principalmente:
isolamento
do
vírus,
determinação do anticorpo vírus específico ou detecção do RNA viral de
amostras clínicas (Gubler, 1998).
3.7.1 Isolamento Viral
É
o
método
mais
específico
para
a
determinação
do
vírus
responsável pela infecção. É realizado em amostras selecionadas, colhidas
até o quinto dia da doença, pela inoculação em culturas de células de
Aedes
aegypti.
A
confirmação
do
imunofluorescência direta com conjugado
isolamento
é
anti-flavivírus.
feita
Dos
por
casos
positivos, é feita a tipagem do vírus por imunofluorescência indireta com
anticorpos monoclonais de tipos específicos. Entretanto, problemas com a
manutenção em laboratório de culturas de células ou colônias de
mosquitos podem dificultar este tipo de procedimento (Gubler, 1998).
3.7.2 Diagnóstico Sorológico
Os testes sorológicos complementam o isolamento do vírus ou,
quando isso não é possível, servem como um meio alternativo de
diagnóstico. Existem várias técnicas que podem ser utilizadas no
diagnóstico sorológico do vírus da dengue, incluindo os de inibição de
hemaglutinação (HI), fixação de complemento (FC), neutralização (N) e
ELISA
de
captura
(enzime-linked
immunosorbent
assay).
Os
três
primeiros exigem amostras pareadas de soro de casos suspeitos (da fase
aguda e de convalescença) e a confirmação é demorada (Gubler, 1998).
27
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
O MAC-ELISA é o exame mais apropriado para a vigilância, porque
requer somente uma amostra do soro na maioria dos casos, e o exame é
simples e rápido. Baseia-se na detecção de anticorpos IgM específicos aos
quatro subtipos do vírus da dengue. O anticorpo IgM anti-dengue se
desenvolve rapidamente após o quinto dia do início da doença. No
entanto, todas as flaviviroses possuem em comum, grupos de epitopos no
envelope protéico, o que resulta na existência de reações cruzadas em
testes como o ELISA, o que dificulta o diagnóstico dos quatro sorotipos do
vírus dengue e outros membros da família Flaviviridae (Gubler, 1998).
3.7.3 Diagnóstico Molecular
O diagnóstico molecular da dengue mais utilizado corresponde à
técnica do RT-PCR que detecta a doença e o sorotipo viral de forma
sensível,
específica,
rápida
e
apresenta
alta
reprodutibilidade
se
controlado, podendo ser usado para detecção do vírus em amostras
clínicas de humanos, tecidos de autópsias ou mosquitos (Gubler, 1998).
Lanciotti et al (1992) propuseram um teste de diagnóstico baseado
na técnica de Nested-PCR. O teste molecular do tipo nested (aninhados)
consiste de duas reações de PCR (Reação em cadeia Polimerase)
seqüenciadas que têm como objetivo aumentar a especificidade e a
sensibilidade da reação submetendo-se os produtos de uma PCR a uma
segunda amplificação utilizando primers que sejam homólogos a uma
região interna deste produto de PCR. Na primeira reação de PCR para o
diagnóstico da dengue utiliza-se um par de primers específicos para a
família Flaviridae e na segunda reação de PCR são utilizados primers
específicos para cada sorotipo da DEN1-4. A rápida identificação do vírus
dengue em amostras de soro usando a PCR com transcrição reversa (RTPCR) tem a desvantagem de não prover um vírus vivo para futuras
28
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
caracterizações biológicas, contudo, é um método rápido, que também
permite a identificação dos sorotipos.
3.8 Genômica do Vírus Dengue
O vírus causador da dengue exibe uma grande diversidade genética,
principalmente devido aos quatro diferentes sorotipos existentes (DEN 14). A diversidade genética é mais restrita dentro de cada sorotipo, mas já
é o suficiente para formar grupos de genótipos variantes, a serem
identificados (Holmes e Twiddy, 2003).
A família Flaviridae contém aproximadamente 70 vírus. Os Flavivirus
são relativamente pequenos (40-50nm), esféricos e apresentam um
envelope
lipídico
(Gubler,
1998).
O
genoma
dos
Flavivirus
é
de
aproximadamente 10.000 bases e composto por 10 proteínas, sendo três
estruturais e sete não estruturais. As proteínas estruturais são: a proteína
C do capsídeo, a proteína M de membrana e a proteína E do envelope; já
as não estruturais são: NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b e NS5
(Leitmeyer et al., 1999).
Os Flavivirus possuem no seu genoma uma molécula de RNA fita
única com a extremidade 5’ contendo uma estrutura cap e a extremidade
3’ sendo caracterizada pela ausência de uma cauda poli-A. Este genoma
apresenta uma organização relativamente simples. Uma única matriz
aberta de leitura (ORF) irá sintetizar uma única proteína que é processada
pelo vírus e por proteases da célula hospedeira para produzir as proteínas
virais (Henchal e Putnak, 1990). Os genes que codificam as proteínas C,
pre-M e E estão localizados na região 5’ do genoma viral. A partir desta
região, no sentido 3’, estão localizados os genes que codificam as
proteínas NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b e NS5 (Chambers et
al.,1990).
29
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
A replicação do RNA pode ser detectada cerca de três horas após a
infecção e parece ocorrer na região perinuclear da célula infectada.
Estudos sugerem que a replicação ocorre no comprimento total do RNA,
formando temporariamente uma fita positiva pareada a uma fita negativa
(Henchal e Putnak, 1990).
A tradução tem início no primeiro códon AUG do RNA genômico, e
proteínas virais individuais são formadas por processamento proteolítico
do peptídeo precursor. Seguindo a síntese de um polipetídio de cerca de
3300 aminioácidos residuais, as proteínas virais são individualizadas após
clivagem por proteases específicas e as primeiras proteínas liberadas são
as estruturais, seguidas pelas não estruturais (Rothman, 2004).
A proteína C é o primeiro polipeptídio sintetizado durante a etapa de
tradução, tendo o peso molecular de aproximadamente 13.500 Da e
sendo rica em resíduos de lisina e arginina (cerca de 25%). Esta
característica provavelmente permite sua interação com o RNA viral. Às
moléculas da proteína C falta uma região N-terminal, uma seqüência de
sinal hidrofóbico, o que sugere que a sua síntese ocorre em ribossomos
não ligados à membrana.
A síntese da proteína M (8.000 Daltons) ocorre através da clivagem
proteolítica de uma estrutura denominada de pré-M que é um precursor
da proteína M. A formação da proteína M parece ser crucial na
morfogênese do vírus, o que resulta em um grande aumento na sua
infectividade (Henchal e Putnak, 1990).
A glicoproteina E (51.000 a 60.000 Daltons) aparece como um
homotrímero na superfície dos vírus maduros e pode ser encontrada na
região intracelular assumindo a forma de um heterodímero E-preM.
Comparações realizadas entre diversos peptídeos codificados por genes E
de flavivirus têm mostrado uma alta conservação de 12 resíduos de
cisteína com a forma de pontes dissulfeto (Henchal e Putnak, 1990). Esta
proteína desempenha importantes funções como ligação ao receptor,
hemaglutinação de células sangüíneas, indução de resposta imune
30
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
protetora pela produção de anticorpos, fusão específica de membrana e
montagem viral (Leitmeyer et al, 1999; Guzman e Kouri, 2004)
As proteínas não estruturais NS1, NS3 e NS5 são as proteínas de
maior peso molecular e mais conservadas entre os flavivirus. As proteínas
NS2a, NS2b, NS4a e NS4b são pouco conservadas, mas possuem
domínios hidrofóbicos similares entre os Flavivirus (Chambers et al.,
1990).
3.9 Filogenia do Vírus Dengue
A evolução dos vírus não só inclui mutações pontuais – mudança em
apenas uma base nucleotídica - na seqüência genômica, como também
outras mudanças genéticas como recombinação e no caso de genomas
segmentados, a troca de fragmentos entre os vírus (Mahy, 1997).
Os vírus que possuem genoma de RNA apresentam grande
variabilidade genética, devido a altas taxas de mutação associadas com
RNA dependente de RNA polimerase, sua rápida taxa de replicação e seu
grande tamanho (Holmes e Twiddy, 2003).
O vírus dengue possui uma história evolutiva relativamente recente,
com os quatro sorotipos tendo sido originados a aproximadamente 1.000
anos e se estabelecendo como uma endemia em humanos a apenas
algumas centenas de anos (Holmes e Twiddy, 2003).
A extensão da diversidade genética é mais bem estudada para o
vírus DEN-2 para o qual existem mais seqüências analisadas. Genótipos
de vírus DEN-2 são encontrados em diferentes locais, ou melhor, alguns
genótipos são encontrados em amostras de vírus de diferentes locais
geográficos, sendo um poderoso indicador de como hospedeiros e vetores
podem espalhar os vírus. A importância de conhecer esse processo
evolutivo está em saber se há diferença entre os genótipos em termos de
potencial epidêmico que possa fazer com que eles desencadeiem surtos
31
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
em diferentes localizações geográficas, como também conhecer os
mecanismos envolvidos na geração dessa diversidade genética visando o
desenho de uma vacina mais estável e segura (Holmes e Twiddy, 2003).
O seqüenciamento de 240 nucleotídeos da região E/NS1, realizado
por Rico-Hesse (1990) caracterizou cinco grupos genômicos para os vírus
DEN-1 e cinco para os vírus DEN-2. Posteriormente, o seqüenciamento
completo do gene que codifica a proteína E do vírus DEN-2 (Lewis et al.,
1993) determinou cinco subtipos que correspondem, essencialmente, aos
sugeridos por Rico-Hesse (1990). O seqüenciamento parcial de diferentes
amostras de vírus DEN-3 e DEN-4 demostraram a existência de quatro e
dois subtipos genéticos, respectivamente (Lanciotti et al., 1994).
A caracterização molecular dos vírus dengue tem sido útil para
determinar a origem das amostras e, principalmente, na tentativa de se
estabelecer uma correlação de virulência das amostras e sua importância
epidemiológica. Um melhor entendimento a respeito da epidemiologia e
evolução do vírus da dengue irá requerer maiores estudos e uma análise
comparativa de seqüências de genomas completos (Holmes e Twiddy,
2003).
3.10 Bioinformática
A metodologia de seqüenciamento de nucleotídeos e a análise in
silico evoluíram de forma surpreendente nas últimas décadas. Graças a
simplificação destas técnicas, tornou-se possível o estabelecimento de
grandes programas de seqüenciamento genômico, que têm contribuído de
forma significativa para a melhor compreensão de vários processos
biológicos (Snustad e Simons, 2001). Com o aumento no número de
projetos de seqüenciamento genômico, tem-se revelado a importância dos
métodos computacionais para abreviar a caracterização funcional de
novos genes (Silva-Jr. et all., 2002).
32
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
A bioinformática é um novo e crescente ramo da ciência que tem
como
objetivo
responder
questões
biológicas
através
do
uso
de
ferramentas computacionais. O potencial desta abordagem tem mudado a
maneira de se fazer ciência básica e aplicada, ajudando a tornar mais
eficiente o “desenho” experimental de pesquisas realizadas em laboratório
(Baxevanis, 2001).
O termo bioinformática foi utilizado pela primeira vez em 1990 para
definir a utilização dos computadores em análises de seqüências de
nucleotídeos e de aminoácidos. Deve-se ter em mente que o emprego dos
computadores na análise de seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos
denota a utilização de algoritmos na criação de ferramentas e programas
computacionais para a compreensão de informações biológicas ao nível de
DNA e proteínas (Claviere, 2000).
3.10.1 Bancos de Dados
Um banco de dados pode ser considerado como sendo uma coleção
de dados inter-relacionados, projetado para suprir as necessidades de um
grupo específico de aplicações e usuários, organizando as informações de
modo a facilitar consultas, atualizações e deleções de dados. Os primeiros
esforços para a criação de bancos de dados de nucleotídeos foram
registrados em 1979, envolvendo pesquisadores dos Estados Unidos e da
Europa. Em 1982, foram criados os primeiros bancos de dados públicos de
seqüências de nucleotídeos, estabelecidos no Laboratório Nacional de Los
Alamos, nos Estados Unidos (GenBank - www.ncbi.nlm.nih.gov) e no
Laboratório de Biologia Molecular da Europa (EMBL - www.embl.ac.uk).
Em
1984,
o
Banco
de
Dados
de
DNA
do
Japão
(DDBJ
-
www.genome.ad.jp) passou a interagir com os bancos de dados pioneiros,
formando a Associação Internacional de Bancos de Dados de Seqüências
Nucleotídicas (Kanehisa, 2000).
33
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
Os bancos de dados envolvendo seqüências de nucleotídeos, de
aminoácidos ou estruturas de proteínas podem ser classificados em
bancos de seqüências primários e secundários. Os primeiros são formados
pela deposição direta de seqüências de nucleotídeos, aminoácidos ou
estruturas
protéicas,
sem
qualquer
processamento
ou
análise.
Os
principais bancos de dados primários são o GenBank, o EBI (European
Bioinformatics Institute), o DDBJ (DNA Data Bank of Japan) e o PDB
(Protein Data Bank).
Os bancos de dados secundários, como o PIR (Protein Information
Resource) ou o SWISS-PROT, são aqueles que derivam dos primários, ou
seja, foram formados usando as informações depositadas nos bancos
primários. São bancos de dados que fornecem informações sobre
seqüências de proteínas, domínios funcionais, proteínas homólogas e
outros (Prosdocimi et al., 2002).
Os bancos de seqüências também podem ser classificados como
bancos estruturais ou funcionais. Os bancos estruturais mantêm dados
relativos à estrutura de proteínas. Dos bancos funcionais, o KEGG (Kyoto
Encyclopedia of Genes and Genomes) é um dos mais utilizados.
Disponibiliza links para mapas metabólicos de organismos com genoma
completamente ou parcialmente seqüenciados a partir de seqüências e de
busca através palavras-chave (Prosdocimi et al.,2002).
3.10.2 Mineração de Dados
A anotação ou mineração de dados (data mining) consiste na análise
comparativa entre seqüências, onde o processo de estudo dos genes
compreende várias fases: remoção de seqüências vetoriais, resultantes do
processo de construção das bibliotecas de cDNA ou DNA genômico;
identificação das ORFs (Open Reading Frames) e alinhamento das
seqüências com outras depositadas em bancos de dados públicos, através
do programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (Altschul et al.,
34
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
1990). Havendo similaridade com outras seqüências é possível obter
informações a respeito de domínios conservados, posição taxonômica
relativa dos organismos, além de um gráfico indicando a qualidade do
alinhamento (Benson et al., 2000).
No alinhamento local os programas do BLAST buscam regiões
isoladas de similaridade entre a seqüência submetida e as seqüências do
banco, utilizando para isso um algorítmo heurístico (baseado num
processo de sucessivas aproximações) a fim de obter uma performance
rápida na busca, o que acaba resultando em algumas perdas no rigor da
comparação (Brown, 2000). Esse programa é subdividido de acordo com o
tipo de seqüência de entrada (nucleotídeo ou aminoácido) e com o tipo de
resultado esperado. Os principais tipos BLAST são:
•
BLASTn: compara seqüências de nucleotídeos com o banco de dados
de nucleotídeos.
•
BLASTp: compara seqüências de aminoácidos com o banco de dados
de proteínas.
•
BLASTx: compara seqüências de nucleotídeos com a base de dados
de proteínas.
•
tBLASTn: traduz uma seqüência de aminoácidos para nucleotídeo e
compara com o banco de dados de genes.
Para cada alinhamento realizado são obtidas estimativas dos níveis
de significância das similaridades observadas. O modelo estatístico
utilizado na determinação destes níveis de confiança é baseado em Karlin
e Altschul (1990), conhecido como “valor de distribuição extrema” ou evalue. Este parâmetro é interpretado como sendo a probabilidade de que
o nível de homologia (Score - S) entre duas seqüências quaisquer seja
determinado simplesmente pelo acaso. A significância de um alinhamento
também depende diretamente do tamanho amostral apresentado pelo
banco de dados, havendo uma tendência para que os bancos de dados
maiores exibam um maior número de alinhamentos aleatórios (Schuler,
2001).
35
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
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40
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
5. MANUSCRITO DE ARTIGO CIENTÍFICO
Associação de seqüências variantes de
dengue sorotipo 3 com diferentes formas
clínicas
Manuscrito a ser encaminhado à revista
Genetics and Molecular Biology
ISSN 1415-4757
(Ribeirão Preto, Brasil)
41
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
Associação de seqüências variantes de dengue sorotipo
3 com diferentes formas clínicas
Lyra, Juliana1, 2; Alves, Veruska1, 2; Brito, Carlos2; Tenório, Marli2;
Lucena-Silva, Norma1, 2.
1
Laboratório de Biologia Molecular do Serviço de Oncologia/IMIP, Rua dos
Coelhos, N. 300, Boa Vista, Recife, Cep:50050-050, Pernambuco, Brasil.
2
Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães/Fiocruz, Av. Profo Moraes Rego,
S/N, Campus da UFPE, Cidade Universitária, Recife, cep.: 50670-420,
Pernambuco, Brasil.
Autor de correspondência:
Juliana Lyra
e-mail: [email protected]
Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães/Fiocruz
Av. Moraes Rego, S/N, Campus da UFPE, Cidade Universitária,
Recife, cep.: 50670-420, Pernambuco, Brasil
Telefone: 81 21224764
FAX: 81 34532449
Keywords
Dengue, DEN-3, diversidade genética, FHD
42
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
RESUMO
A caracterização molecular do vírus da dengue é útil na determinação da
origem das amostras e, principalmente, na tentativa de se estabelecer
uma
correlação
de
virulência
dos
isolados
e
sua
importância
epidemiológica. Embora os quatro sorotipos do vírus possam causar a
febre hemorrágica da dengue considerando a infecção primária, alguns
sorotipos parecem estar associados a determinadas formas e gravidade da
doença em diferentes localidades.
Neste trabalho, 14 isolados do vírus
dengue sorotipo 3 foram obtidos de pacientes com diferentes quadros
clínicos em Recife entre 2003-2004: 10 pacientes com dengue clássica
sendo que cinco deles cursaram com plaquetopenia e outros quatro com
diagnóstico de febre hemorrágica do dengue. A extremidade 5’ dos
genomas virais foi seqüenciada e foram comparadas as seqüências
nucleotídicas e polipeptídicas correspondentes ao capsideo, membrana e
parte do envelope entre si. Os sítios variantes na porção C-terminal do
primeiro ¼ do Envelope sugerem que a apresentação clinica da doença
pode estar relacionada à variabilidade do genoma viral, visto que as
análises dos dendrogramas gerados com a seqüência dos aminoácidos do
fragmento correspondente ao gene do Envelope, formam três clados
distintos: um deles apenas com as seqüências originadas de isolados de
pacientes com febre hemorrágica da dengue, outro com seqüências de
pacientes com dengue clássica com ou sem plaquetopenia e um terceiro
clado intermediário onde ocorrem semelhanças entre isolados de formas
clínicas diferentes.
43
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
INTRODUÇÃO
A
caracterização
molecular
do
vírus
da
dengue
é
útil
para
determinar a origem das amostras e, principalmente, na tentativa de se
estabelecer uma correlação de virulência das amostras e sua importância
epidemiológica (Pinheiro e Chuit, 1998).
A dengue é uma das mais importantes doenças virais humanas
transmitidas por vetores artrópodes com duas formas clínicas bem
definidas (Fundação Nacional da Saúde, 2001).
A dengue clássica (DC) apresenta-se em geral de forma benigna e
autolimitada. Os principais sintomas da dengue clássica são: febre alta
acompanhada de cefaléia intensa, que pode ser retro-orbital e/ou
holocraniana, mialgia intensa e generalizada e, algumas vezes, artralgias,
podendo ocorrer exantema com prurido por volta do terceiro ou quarto dia
da
doença,
sendo
mais
comum
nas
extremidades,
e
sintomas
gastrointestinais (Serufo et al., 2000).
Na
febre
hemorrágica
da
dengue
(FHD),
a
sintomatologia
característica da dengue clássica (DC) evolui a partir do 5o - 7o dia da
doença
para
manifestações
hemorrágicas
de
gravidade
variável
(Leitmeyer et al., 1999). A FHD cursa com trombocitopenia (100.000
células/mm3 ou menos) e evidência de efusão de plasma devido ao
aumento da permeabilidade vascular manifestada por um aumento no
hematócrito em 20% ou mais, do valor encontrado inicialmente, ou,
derrame pleural, ascite e hipoproteinemia (Ministério da Saúde, 1996). A
FHD requer acompanhamento médico e apresenta um maior risco de
evoluir ao óbito se não controlada. Anualmente são estimados cerca de
50-100 milhões de casos de DC e 50.000 a 250.000 casos de FHD no
mundo (Guzman e Kouri, 2003). Não existe vacina eficaz para a
prevenção da dengue nem tratamento específico antiviral que combata a
viremia (Nogueira, 1999).
O vírus da dengue pertence ao gênero Flavivírus, da família
Flaviviridae, a qual pertencem aproximadamente 70 tipos de vírus,
44
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
incluindo o vírus causador da febre amarela e de várias encefalites
(Houmg
et
al.,2000).
O
genoma
dos
Flavivirus
consiste
de
aproximadamente 10.000 bases que codificam 10 proteínas, sendo três
estruturais e sete não estruturais. As proteínas estruturais são: a proteína
C do capsídeo, a proteína M de membrana e a proteína E do envelope; já
as não estruturais são: NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b e NS5
(Leitmeyer et al., 1999).
A evolução dos vírus não só inclui mutações pontuais na seqüência
genômica, como também outras mudanças genéticas como recombinação
e no caso de genomas segmentados, a troca de fragmentos entre os vírus
(Mahy, 1997). Os vírus que possuem genoma de RNA apresentam grande
variabilidade genética, devido a altas taxas de mutação associada com
RNA dependente de RNA polimerase, sua rápida taxa de replicação e seu
grande tamanho (Holmes e Twiddy, 2003).
Embora os quatro sorotipos de dengue possam causar dengue
hemorrágica considerando a infecção primária, alguns sorotipos parecem
estar associados a determinadas formas e gravidade da doença em
diferentes localidades (Holmes e Twiddy, 2003). Outros fatores individuais
como: idade, sexo, herança genética e outras doenças anteriores podem
ter um papel importante na suscetibilidade à doença. Por exemplo, no
Brasil, Colômbia e Porto Rico a febre hemorrágica da dengue é mais
comum em adultos, assim como de uma forma geral esta forma da
doença é mais comum em brancos do que em negros (Pinheiro e Chuit,
1998).
MATERIAIS E MÉTODOS
Amostras
Amostras de sangue de pacientes atendidos em três hospitais da
rede privada de saúde na cidade do Recife-PE com suspeita de infecção
por dengue entre maio de 2003 e maio de 2004 foram encaminhadas ao
45
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães, para comprovação diagnóstica
através da técnica de Nested-PCR proposta por Lanciotti et al., 1992.
Foram selecionadas aleatoriamente 14 amostras com PCR positiva para
dengue distribuídas em três grupos: 10 amostras obtidas de pacientes
com dengue clássica (DC) (5 sem e 5 com plaquetopenia) e quatro
amostras obtidas de pacientes com febre hemorrágica da dengue (FHD)
segundo critério da OMS. As 14 amostras selecionadas foram inoculadas
em cultura de células de mosquitos Aedes albopictus da linhagem C6/36
por 7-14 dias e estocadas em freezer – 80o até seu processamento.
Extração de RNA total e Síntese de cDNA
As culturas de células de mosquito infectadas pelos isolados virais
dos pacientes anteriormente selecionados foram submetidas à extração do
RNA viral pelo método da sílica proposto por Boom et al., 1990.
A síntese do cDNA utilizou 5µl do RNA extraído. A mistura da reação
foi preparada com 1µL (25pmol) do primer NS5 R (5´TCT AGA GCG GCC
GCT TGC CAA TGA GGG ATC T 3´), 5 µL do RNA e 6 µL de água DEPC e
aquecida a 650C por 5 min e em seguida depositada em gelo. Após a
adição de 0,5µl de dNTPs a 0,2mM, 4 µl de tampão 5x First Strand e 2µl
de DTT (ditiotreitol) a 0,1mM, a mistura foi incubada por 2 min a 420C
para então ser adicionado 0,5µl da enzima SuperScriptTM RNase Htranscriptase reversa (Invitrogen). A amostra foi incubada a 420C por 50
min e em seguida por 15 min a 700C para inativação da reação.
PCR
A PCR foi realizada com um volume final de 50 µl contendo, tampão
10X, 1.5 mM de MgCl2, 0,2mM de dNTP´s 25 pmoles de cada um dos
primers utilizados na reação, 0,5 unidade de Taq polimerase (Invitogen do
Brasil, São Paulo) e 2 µl do cDNA sintetizado. Os primers utilizados neste
estudo são específicos para o vírus DEN-3 (Tabela 1), e foram desenhados
46
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
a partir de seqüências publicadas e disponíveis em bancos de dados
públicos, utilizando o programa Fast-PCR. Cada par de primer utilizado
corresponde à região de um gene que codifica uma proteína no genoma
do vírus, não apresentando homologia com outras regiões. Foi usada
como controle negativo uma mistura da reação de PCR descrita acima sem
a amostra de cDNA. O programa de amplificação constituiu-se de 1 ciclo
de 94oC por 3 min seguidos de
30 ciclos de 94oC
por 1 min, um
gradiente de temperatura de anelamento de 48 a 63oC por 2 mim e 72oC
por 1 min. Finalmente, 72oC por 10 min e 4oC até utilização. Os produtos
de PCR foram submetidos a eletroforese em gel agarose a 1,0%
preparado com tampão TAE contendo 0,05 µg/ml de brometo de etídio,
visualizados com transiluminador de luz UV e digitalizados.
Purificação e seqüenciamento dos produtos de PCR
As bandas obtidas no gel de agarose pela separação dos produtos de
PCR foram cortadas e acondicionadas em tubos eppendorf 1,5 ml, para
em seguida serem submetidas à purificação com o kit SephaglasTM
BandPrep da Amersham Pharmacia Biotech conforme recomenda o
fornecedor. A quantificação das amostras purificadas foi realizada em gel
de agarose a 1,0% preparado com tampão TAE contendo 0,05 µg/ml de
brometo de etídio e a imagem captada com o auxílio de uma câmera
fotográfica digital. Para a quantificação foi utilizado 1µL do peso molecular
1kb plus ladder e 1µl de cada amostra. A banda usada como padrão do
peso molecular é a de 1650 pb, que corresponde a 40 ng.
O sequenciamento do produto de PCR foi realizado em um
seqüenciador Genetic Analysing ABI 3100 com 96 capilares. Para a reação
foi utilizado 1 µl de primer (3.2 pmol/µl), 0,5 µl de Bigdye, 1 µl de Save
money (Tris-HCl, pH 9.0 200mM, MgCl2 5mM), amostra (10 fL) e água
para completar o volume final de 10 µl. A desnaturação ocorreu com a
placa a 95 ºC durante 10 min seguida por um choque térmico à 0ºC
(gelo). O programa de amplificação constituiu-se de 1 ciclo a 96 oC por 2
47
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
min, seguidos de 35 ciclos de 96 ºC por 45 seg, 50 ºC por 30 seg e 60
ºC por 4 min e em seguida 4 ºC overnight. A precipitação foi realizada
para um volume final de 10 µl. As lavagens foram realizadas primeiro com
40µL de isopropanol 65% e depois com 150µl de etanol 60%. Após a
última lavagem as amostras foram ressuspendidas em 15µl de formamida
Hi-Di e em seguida colocadas no seqüenciador.
Análise computacional das seqüências obtidas
A comparação das seqüência obtidas com as depositadas no banco
de dados do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), foi realizada mediante a
utilização das versões on-line dos programas BLASTn e BLASTx (Altschul
et
al.,
1990),
disponíveis
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast.
Para
na
página
cada
eletrônica
alinhamento
realizado
foram obtidas estimativas dos níveis de significância das similaridades
observadas (Schuler, 2001).
A determinação do conteúdo de guanina e citosina (GC%)
realiizada
mediante
a
utilização
do
programa
foi
GeneRunner
(http://www.generunner.com).
Foi construído um banco de dados contendo informações a respeito
das bases de cada seqüência similar obtida, conteúdo de GC% e extensão
das seqüências. A partir das seqüências depositadas nos bancos de dados,
foram realizados alinhamentos múltiplos com uma versão do programa
Clustal W, integrada ao pacote de programas de análise de seqüências
Seqtools
8.0
(http:/www.seqtools.dk).
Os
alinhamentos
produzidos
resultaram em arquivos de entrada posteriormente utilizados na análise
filogenética, executada com o auxílio do programa PAUP 4.0b, utilizando o
método UPGMA com 1000 repetições de bootstrap.
RESULTADOS
48
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
O genoma dos catorze isolados do vírus da dengue obtidos de
pacientes com diferentes quadros clínicos, 10 de pacientes com dengue
clássica sendo que cinco deles cursaram com plaquetopenia e outros
quatro
com
diagnóstico
de
febre
hemorrágica
do
dengue
foram
seqüenciados. As análises das seqüências dos genes do capsídeo e
membrana foram realizadas separadas das do envelope.
Análise dos Genes do Capsídeo e Membrana.
A seqüência dos genes do Capsídeo e da Membrana apresenta cerca
de 520 pb, e em todas, o conteúdo de guanina e citosina (GC%) se
encontra entre 47,0% e 48,0%, estando de acordo com as seqüências
depositadas em bancos de dados públicos.
A comparação das seqüências dos genes do Capsídeo e da
Membrana dos isolados virais, com seqüências de nucleotídeos do vírus
DEN-3 depositadas nos banco de dados não redundante (NT) do
GENBANK, mostrou nível de similaridade existente entre elas de no
mínimo 98% (Tabela 2), independente da forma clínica (dengue clássica
com ou sem plaquetopenia ou dengue hemorrágica), apresentada pelo
paciente.
A comparação das seqüências dos genes do Capsídeo e da
Membrana dos catorze isolados virais estudados revelou poucas diferenças
que resultaram principalmente de deleções, transições ou transversões,
tendo sido constatado que os eventos de transição foram mais comuns
que os de transversão (dados não mostrados). O grau de similaridade
entre as seqüências estudadas foi de 98-100% (Tabela 3). A provável
seqüência de aminoácidos dos genes do Capsídeo e da Membrana dos
isolados virais estudados foi deduzida através da tradução simulada de
suas seqüências de nucleotídeos, tomando como base a tabela de código
genético universal. A comparação de um polipeptídeo de 173 aminoácidos,
49
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
referente ao capsídeo e membrana virais das amostras estudadas,
mostrou a existência de poucos sítios variantes, com a maioria deles
estando situados na posição N-terminal do polipeptídeo. A análise
comparativa das seqüências de nucleotídeos dos genes do capsídeo e da
membrana dos catorze isolados do vírus DEN-3 analisados (Figura 1), bem
como das seqüências de aminoácidos por eles codificados (Figura 2),
revelou a similaridade das seqüências analisadas e a impossibilidade da
utilização dessas seqüências no estudo de variabilidade genética como
marcador de virulência das cepas.
Análise do Gene do Envelope
As seqüências do gene do Envelope analisadas representam ¼ do
gene, ou seja, 284 pb a partir da extremidade 5’ do gene, e em todas, o
conteúdo de guanina e citosina (GC%) se encontra entre 48,6% e 50,4%,
estando de acordo com as seqüências depositadas em bancos de dados
públicos. Apenas três seqüências apresentaram GC% abaixo de 50% :
DC-3 com 49,6%; DC-5 com 48,6% e FHD-1 com 49,5 (Tabela 4).
A comparação das amostras aqui seqüenciadas do gene do
Envelope, com seqüências de nucleotídeos do vírus DEN-3 depositadas no
banco de dados não redundante (NR) do GENBANK, mostrou uma
similaridade de pelo menos 98%, independente da forma clínica (dengue
clássica com ou sem plaquetopenia ou dengue hemorrágica), apresentada
pelo paciente.
A comparação entre as 14 seqüências parciais do gene do envelope
estudadas mostrou um grau de similaridade entre 95-100% (Tabela 5). As
diferenças estavam concentradas no final da seqüência e, resultaram
principalmente de deleções, as que conseqüentemente alteraram a
seqüência de aminoácidos do gene estudado.
50
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
A provável seqüência de aminoácidos da extremidade amino do
Envelope do vírus DEN-3 deduzida com base na tabela de código genético
universal corresponde a 94 aminoácidos referentes a ¼ de aminoácidos da
proteína completa.
As análises comparativas dos isolados virais feitas com base na
variabilidade da seqüência parcial do gene (Figura 3) e do polipeptídeo
(Figura 4) do envelope do vírus DEN-3 das catorze amostras estudadas,
mostraram a formação de dois clados distintos, um deles apenas com as
seqüências originadas de isolados de pacientes com FHD e outro com
seqüências de pacientes com DC com ou sem plaquetopenia, mais
perceptível no dendrograma gerado com os aminoácidos. Além disso,
observa-se um clado intermediário onde ocorrem semelhanças entre as
seqüências de DC + PL com as seqüências de FHD. A amostra DC-5
mostrou-se bastante diferente das demais.
DISCUSSÃO
As seqüências de aminoácidos do envelope do vírus DEN-3 das
catorze
amostras
analisadas
foram
agrupadas
de
acordo
com
a
apresentação clínica dos pacientes e sugerem que a variabilidade do
genoma viral é um dos fatores relacionados à gravidade da doença.
As amostras selecionadas foram obtidas no período de maio de 2003
a maio de 2004, retratando a circulação do vírus de uma mesma época no
Estado de Pernambuco exceto uma paciente do estado da Paraíba (DC-4).
As seqüências de capsídeo e membrana do vírus DEN-3 mostram-se
pouco variáveis e, portanto, pouco informativa quanto à diversidade
genética dos isolados virais. Contudo, a variabilidade da seqüência do
envelope foi suficiente para a identificarmos grupamento de isolados virais
em pacientes com apresentação clínica diferente. Estudos têm relatado
uma maior variabilidade do vírus DEN-2 em relação aos outros sorotipos
(Rico–Hesse, 1990; Holmes e Twiddy, 2003), entretanto há poucas
51
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
seqüências do genoma do vírus DEN-3 disponíveis para uma análise mais
detalhada.
A distribuição geográfica de seqüências variantes do vírus da dengue
no Brasil ainda não é conhecida, de forma que foi investigado o
deslocamento dos pacientes selecionados no período de quinze dias antes
dos primeiros sintomas, correspondendo ao período de incubação. Todos
os pacientes com dengue clássica com plaquetopenia e febre hemorrágica
da dengue são residente da cidade do Recife, sendo que nos quinze dias
que antecederam a dengue, dois viajaram ao interior de Pernambuco
(Gravatá (FHD-3) e Caruaru (DC+PL-4)), dois ao Estado do Rio Grande do
Norte no Nordeste do Brasil (DC+PL-1 e DC+PL-2) e um a Europa
(DC+PL-5), os demais não referiram viagem recente (DC+PL-3; FHD-1,
FHD-2 e FHD-4). Os pacientes com dengue clássica são de Pesqueira (DC1), Cabo (DC-3), Recife (DC-2) e Olinda (DC-5) em Pernambuco e de João
Pessoa na Paraíba (DC-4). O paciente residente em Olinda (DC-5) referiu
viagem a Belém e Macapá nos quinze dias anteriores ao diagnóstico da
dengue, o que pode justificar a seqüência genômica do vírus isolado
apresentar pouca similaridade com qualquer uma das amostras restantes
analisadas.
A maioria dos estudos do genoma do vírus dengue tem como
objetivo a análise filogenética e o conhecimento da distribuição mundial
de subtipos dos diversos sorotipos virais, importantes na compreensão da
transmissão do vírus dengue (Rico-Hesse, 1990; Lewis et al., 1993;
Lanciotti et al., 1994). Mas, poucos estudos ainda têm sido feitos visando
a comparação genética de isolados virais de pacientes com diferentes
formas clínicas da dengue. Segundo Pinheiro e Chuit (1998), fatores
individuais como: idade, sexo, herança genética e outras doenças
anteriores podem ter um papel importante na suscetibilidade à doença.
Por exemplo, no Brasil, Colômbia e Porto Rico a febre hemorrágica do
dengue é mais comum em adultos, assim como de uma forma geral esta
forma da doença é mais comum em brancos do que em negros. A nossa
52
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
casuística é muito pequena para a inferência a fatores biológicos
relacionados ao paciente hospedeiro.
Os resultados apresentados reforçam que a gravidade da dengue
está também relacionada com a seqüência genômica dos isolados virais.
Estudos futuros de imunogenética poderão esclarecer a predisposição do
hospedeiro à infecção pelo dengue e ao desenvolvimento de quadros
graves
da
doença.
Os
resultados
advindos
da
comparação
entre
seqüências das proteínas virais dos vários subtipos e sorotipos do dengue
com a do complexo HLA, que está sendo utilizada para avaliar a maior
reatividade do hospedeiro para com o vírus da dengue, poderá trazer
subsídios para a compreensão do desenvolvimento de quadros graves da
dengue.
AGRADECIMENTOS
Agradecemos a Cristian Reis pelo apoio técnico no seqüenciamento dos
genes e ao Dr. Oswaldo Pompílio pelo acesso ao laboratório de
seqüências. O projeto teve o apoio financeiro parcial do Programa PDTIS
da Fiocruz e da FACEPE.
53
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
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uma nova abordagem. Revista da Sociedade Brasileira de
Medicina Topical. 33(5): 465-476.
55
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
Tabela 1. Primers utilizados na PCR e no sequenciamento das 14
amostras de DEN-3 selecionadas.
Nome do Primer
Seqüência do Primer
CAP F
5´CGC GTG AGA AAC CGT GTG 3´
MEM R
5´CCT GTC TCC AAG CTC CTT 3´
ENV F
5´GGA GCT ACG TGG GTT 3´
ENV R
5´CCC ATG TCA GCT TGC 3´
MEM F
5´AAC CTG GAT GTC GGC TGA 3´
ENVint R
5´ACC ACA ACC GTT TCC CCA 3´
56
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
Tabela 2. Amostras com os genes do capsídeo (CAP) e da membrana
(MEM) utilizadas, contendo o tamanho de cada seqüência, o conteúdo de
guanina e citosina e a identidade (ID) encontrada quando comparadas
com outras seqüências no banco de dados do NCBI.
AMOSTRA
TAMANHO
GC%
ID no BlastN
(NCBI)
DC - 1
519 pB
47,8 %
99%
DC - 2
519 pB
47,8 %
99%
DC - 3
519 pB
47,6 %
99%
DC - 4
519 pB
48,4 %
99%
DC - 5
521 pB
47,4 %
99%
DC + PL - 1
520 pB
47,7 %
100%
DC + PL - 2
519 pB
47,8 %
99%
DC + PL - 3
519 pB
47,8 %
100%
DC + PL - 4
520 pB
47,5 %
99%
DC + PL - 5
520 pB
48,3 %
99%
FHD - 1
519 pB
47,8 %
100%
FHD - 2
521 pB
47,2 %
99%
FHD - 3
520 pB
48,5 %
98%
FHD - 4
520 pB
47,7 %
99%
Obs.: DC - Dengue Clássica; DC+ PL – Dengue Clássica com plaquetopenia; FHD
– Febre Hemorrágica da Dengue.
57
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
Tabela 3. Grau de homologia entre as 14 seqüências de nucleotídeos
analisadas com os genes do capsídeo e da membrana de DEN-3, dados em
percentagem.
%
DC-1
FHD-1 DC+PL-1 FHD-2
DC-2
DC+PL-2 DC+PL-3
DC-3
DC-4
DC+PL-4 FHD-3
DC-5
DC+PL-5 FHD-4
-
99%
99%
99%
99%
100%
99%
99%
99%
99%
99%
99%
99%
99%
FHD-1
99%
-
100%
99%
100%
99%
100%
99%
99%
99%
99%
99%
99%
99%
DC+PL-1
99%
100%
-
99%
100%
99%
100%
99%
99%
99%
99%
99%
98%
99%
FHD-2
99%
99%
99%
-
99%
99%
99%
100%
99%
99%
99%
98%
98%
99%
DC-2
99%
100%
100%
99%
-
99%
100%
99%
98%
99%
99%
99%
99%
99%
DC+PL-2 100%
99%
99%
99%
99%
-
99%
99%
99%
99%
99%
99%
99%
99%
DC+PL-3
99%
100%
100%
99%
100%
99%
-
99%
99%
99%
98%
99%
99%
99%
DC-3
99%
99%
99%
100%
99%
99%
99%
-
99%
99%
98%
99%
98%
99%
DC-4
99%
99%
99%
99%
98%
99%
99%
99%
-
98%
99%
99%
99%
98%
DC+PL-4
99%
99%
99%
99%
99%
99%
99%
99%
98%
-
98%
99%
99%
99%
FHD-3
99%
98%
99%
99%
99%
99%
98%
98%
99%
98%
-
99%
98%
98%
DC-5
99%
99%
99%
98%
99%
99%
99%
99%
99%
99%
99%
-
98%
99%
DC+PL-5
99%
99%
98%
98%
99%
99%
99%
98%
99%
99%
98%
98%
-
99%
FHD-4
99%
99%
99%
99%
99%
99%
99%
99%
98%
99%
98%
99%
99%
-
DC-1
Obs.: DC - Dengue Clássica; DC+ PL – Dengue Clássica com plaquetopenia; FHD
– Febre Hemorrágica da Dengue.
58
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
F H D -1
27
D C + P L-3
D C -1
22
D C + P L-1
18
D C -3
36
D C + P L-2
D C + P L-4
18
69
F H D -4
D C -5
F H D -2
D C -2
46
F H D -3
D C -4
95
76
0 .0 0 5
0 .00 4
0 .0 0 3
0 .0 0 2
0 .0 0 1
D C + P L-5
0 .00 0
Figura 1. Dendrograma gerado com os nucleotídeos das 14 amostras
analisadas, referente aos genes do Capsídeo e da Membrana, com base na
utilização do método UPGMA com 1000 repetições de bootstrap.
59
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
DC-1
DC+ P L-3
52
FHD-1
DC-3
54
DC+ P L-2
20
DC-4
43
DC-2
DC-5
FHD-2
FHD-3
DC+ P L-1
32
30
DC+ P L-5
DC+ P L-4
15
FHD-4
40
0.010
0.008
0.006
0.004
0.002
0.000
Figura 2. Dendrograma gerado com os aminoácidos das 14 amostras
analisadas, codificados pelos genes do capisídeo e membrana com base
na utilização do método UPGMA com 1000 repetições de bootstrap.
60
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
Tabela 4. Parte do gene do Envelope (ENV) nas 14 seqüências utilizadas,
contendo o tamanho de cada seqüência, o conteúdo de Guanina e Citosina
e
a
identidade
(ID)
encontrada
quando
comparadas
com
outras
seqüências no banco de dados do NCBI.
AMOSTRA
TAMANHO
GC%
ID no BlastN
(NCBI)
DC - 1
284pB
50,0%
100%
DC - 2
284pB
50,0%
100%
284pB
49,6%
99%
DC - 4
284pB
50,4%
100%
DC - 5
284pB
48,6%
98%
DC + PL - 1
284pB
50,0%
100%
DC + PL - 2
284pB
50,0%
100%
DC + PL - 3
284pB
50,0%
99%
DC + PL - 4
284pB
50,0%
100%
DC + PL - 5
284pB
50,0%
99%
FHD - 1
284pB
49,5%
98%
FHD - 2
284pB
50,4%
99%
FHD - 3
284pB
50,4%
99%
FHD - 4
284pB
50,4%
99%
DC - 3
Obs.: DC - Dengue Clássica; DC+ PL – Dengue Clássica com plaquetopenia; FHD
– Febre Hemorrágica da Dengue.
61
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
Tabela 5. Grau de homologia entre as 14 seqüências de nucleotídeos
analisadas com o gene do Envelope de DEN-3, dados em percentagem.
%
DC-1
FHD-1 DC+PL-1 FHD-2
DC-2
DC+PL-2 DC+PL-3
DC-3
DC-4
DC+PL-4 FHD-3
DC-5
DC+PL-5
FHD4
-
98%
100%
99%
100%
100%
99%
99%
100%
100%
99%
96%
99%
99%
98%
-
98%
98%
98%
98%
98%
98%
98%
98%
98%
95%
98%
98%
DC+PL-1 100%
98%
-
99%
100%
100%
99%
99%
100%
100%
99%
96%
99%
99%
FHD-2
99%
98%
99%
-
99%
99%
99%
98%
98%
99%
99%
96%
99%
99%
DC-2
100%
98%
100%
99%
-
100%
99%
99%
100%
100%
99%
96%
99%
99%
DC+PL-2 100%
98%
100%
99%
100%
-
99%
99%
100%
100%
99%
96%
99%
99%
DC+PL-3
99%
98%
99%
99%
99%
99%
-
99%
100%
99%
99%
96%
100%
99%
DC-3
99%
98%
99%
98%
99%
99%
99%
-
99%
99%
98%
96%
99%
98%
DC-4
100%
98%
100%
98%
100%
100%
100%
99%
-
100%
98%
95%
99%
98%
DC+PL-4 100%
98%
100%
99%
100%
100%
99%
99%
100%
-
99%
96%
100%
99%
FHD-3
99%
98%
99%
99%
99%
99%
99%
98%
98%
99%
-
99%
99%
99%
DC-5
96%
95%
96%
96%
96%
96%
96%
95%
96%
96%
96%
-
96%
96%
DC+PL-5
99%
98%
99%
99%
99%
99%
100%
99%
100%
99%
99%
96%
-
99%
FHD-4
99%
98%
99%
99%
99%
99%
99%
98%
98%
99%
99%
96%
99%
-
DC-1
FHD-1
Obs.: DC - Dengue Clássica; DC+ PL – Dengue Clássica com plaquetopenia; FHD
– Febre Hemorrágica da Dengue.
62
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
D C + P L -3
D C + P L -1
D C P L -2
40
D C + P L -5
D C -1
40
D C -2
D C + P L -4
47
D C -3
50
D C -4
F H D -4
87
F H D -2
F H D -3
F H D -1
D C -5
0 .0 2 0
0 .0 1 5
0 .0 1 0
0 .0 0 5
0 .0 0 0
Figura 3. Dendrograma gerado com os nucleotídeos das 14 amostras
analisadas, referente ao gene do Envelope com base na utilização do
método UPGMA com 1000 repetições de bootstrap.
63
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
D C + P L -1
D C -4
D C P L -2
94
D C -1
D C -2
D C -3
D C + P L -4
66
63
D C + P L -3
D C + P L -5
F H D -1
F H D -2
63
87
F H D -3
F H D -4
D C -5
0 .0 8
0 .0 6
0 .0 4
0 .0 2
0 .0 0
Figura 4. Dendrograma gerado com os aminoácidos das 14 amostras
analisadas, codificados pelo gene do Envelope com base na utilização do
método UPGMA com 1000 repetições de bootstrap.
64
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
6. INFORMAÇÕES COMPLEMENTARES
65
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
6.1. DETALHAMENTO DAS METODOLOGIAS UTILIZADAS
Obtenção das Amostras
Neste trabalho foram utilizadas amostras clínicas (sangue) de
pacientes, oriundas de Centros Hospitalares de referência da cidade do
Recife-PE e encaminhadas ao Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães CPqAM, diagnosticados como positivos para dengue através da técnica de
Nested-PCR proposta por Lanciotti et al., 1992. Foram selecionadas 14
amostras distribuídas em 3 grupos: 4 amostras são da forma hemorrágica
da dengue (FHD), 5 amostras são de pacientes com dengue clássica (DC)
com rápida evolução e 5 amostras de pacientes diagnosticados como
dengue clássica com plaquetopenia positiva, todas colhidas entre os anos
de 2003 e 2004.
As 14 amostras selecionadas foram inoculadas em cultura de células
de mosquitos Aedes albopictus da linhagem C6/36 e estocadas em freezer
– 80o.
Extração de RNA total e Síntese de cDNA
Para a extração do RNA das amostras clínicas, foram utilizadas as
culturas de células de mosquito infectadas pelos isolados virais dos
pacientes anteriormente selecionados. A extração do RNA viral foi
realizada segundo o método da Sílica proposto por Boom et al., 1990,
onde uma alíquota de 100 µL da cultura de célula foi adicionada a uma
mistura contendo 860 µL de tampão L6 (Isotilcianato de Guanidina, TrisHCL e EDTA) e 40 µL de sílica (óxido de silício e água deionizada). Esta
solução
permaneceu
por
10
min
em
temperatura
ambiente,
com
homogeneização utilizando Vortex a cada 2-3 min. Em seguida a solução
foi centrifugada até atingir a velocidade de 13,000 x g, durante cerca de
10 seg, a 40C. O sobrenadante foi então desprezado por inversão do tubo
e o precipitado lavado 2 vezes com tampão L2 (Isotilcianato de Guanidina
66
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
e Tris-HCL), 2 vezes com etanol a 70% e 1 vez com acetona P.A. A cada
lavagem o precipitado é ressuspendido e centrifugado até atingir a
velocidade de 13,000 x g a 40C, e o sobrenadante descartado por
inversão do tubo. Para eliminar resíduos de acetona da sílica, o tubo
Eppendorf contendo o precipitado permaneceu a 56o C durante 10 min
com tampa aberta em um termobloco. O precipitado foi ressuspendido em
60 µL de água DEPC e mais 1 µL de RNase out (Invitrogen) utilizando um
Vortex. O tubo novamente colocado no bloco aquecido a 560C por 10 min
para então ser centrifugado a 13,200 x g por 2 min a 40C. Após a
centrifugação
o
RNA
que
está
no
sobrenadante
foi
retirado
cuidadosamente para não haver aspiração de sílica para ser colocado em
um novo tubo Eppendorf.
Logo após a extração do Rna foi realizada a síntese do cDNA
utilizando 5 µL do RNA extraído. Foram feitas mistura contendo: 1µL
(25pmol) do primer NS5 R (que irá proporcionar a amplificação de todo o
genoma do vírus), 5 µL do Rna e 6 µL de água DEPC. Esta mistura foi
aquecida a 650C por 5 min e em seguida depositada em gelo. Foram
adicionados a esta mistura 0,5 µL de dNTPs a 0,2mM, 4 µL de tampão 5x
First Strand e 2 µL de DTT (ditiotreitol) a 0,1mM, a mistura permanece
por 2 min a 420C para então serem adicionados 0,5 µL da enzima
SuperScriptTM RNase H- transcriptase reversa. A amostra fica incubada a
420C por 50 min e em seguida 15 min a 700C para inativação da reação.
PCR
A PCR foi realizada com um volume final de 50 µL contendo, tampão
10X, 1.5 mM de Mgcl2, 0,2mM de dNTP´s 25 pmoles de cada um dos
primers utilizados na reação, 0,5 unidade de Taq polimerase e 2 µL do
cDNA sintetizado a partir de 5 µL de Rna viral extraído de cultura de
células C6/36 de Aedes albopictus inoculadas com soro dos pacientes
positivos para Dengue 3 selecionados. Foi usada como controle negativo
uma mistura da reação de PCR descrita acima sem a amostra de cDNA. O
67
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
programa de amplificação constituiu-se de 1 ciclo a 94 oC por 3 min
seguidos de 30 ciclos de 94o C por 1 min, temperaturas de anelamento
específicas para cada primer e 72 oC com o tempo de extensão variando
dependente do número de bases da sequência a ser amplificada. Em
seguida 72o C por 10 min e 4oC. Os produtos de PCR foram submetidos a
uma eletroforese em gel agarose a 1,0% preparado com tampão TAE
contendo
0,05
µg/ml
de
brometo
de
etídio,
visualizados
com
transiluminador de luz UV e digitalizados.
Utilização de primers
Os primers utilizados neste estudo são específicos para o vírus
dengue 3 (Tabela 1), e foram desenhados a partir de seqüências
publicadas e disponíveis em bancos de dados públicos, utilizando o
programa Fast-PCR (disponível na internet para download) para a análise
das seqüências. Cada par de primer (Foward e Reverse) utilizado
corresponde à região de uma proteína no genoma do vírus, não
apresentando homologia com outras regiões.
Otimização da Temperatura de Anelamento dos primers CAP
F/MEM R
A reação foi testada sob 8 temperaturas de anelamento diferentes.
A PCR foi realizada com um volume final de 50 µL contendo, tampão 10X,
1.5 mM de Mgcl2, 0,2mM de dNTP´s 25 pmoles dos primers CAP F e MEM
R, 0,5 unidade de Taq polimerase e 2 µL do cDNA sintetizado a partir de 5
µL de Rna viral extraído de cultura de células dengue tipo 3 dos pacientes
selecionados. O controle negativo foi uma mistura da reação de PCR
descrita acima sem a amostra de cDNA. O programa de amplificação foi
constituído de 1 ciclo a 94 oC por 3 min seguidos de 30 ciclos de 94o C
por 1 min, diferentes temperaturas de anelamento por reação: 48 oC até
62 oC, com uma variação de 2o C entre as temperaturas por 2min e 72 oC
68
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
por 1 min. Em seguida 72o C por 10 min e 4oC. Os produtos de PCR foram
submetidos a uma eletroforese em gel agarose a 1,0% preparado com
tampão TAE contendo 0,05 µg/ml de brometo de etídio, visualizados com
transiluminador de luz UV e digitalizados.
A melhor temperatura de anelamento para este par de primers foi
de aproximadamente 62o C, pela diminuição do número de bandas
inespecíficas, apesar da obtenção de bons resultados em todas as
temperaturas testadas.
Otimização da Temperatura de Anelamento dos primers ENV
F/ENV R
A reação também foi testada sob as mesmas 8 temperaturas de
anelamento do experimento anterior e utilizou as mesmas concentrações
de reagentes; a única diferença consistiu na utilização dos primers, que
neste caso foram 25 pmoles dos primers ENV F e ENV R e do tempo do
anelamento: 1 mim e 30 seg.
A temperatura em que os primers anelaram de forma mais eficiente
também foi de aproximadamente 62o C. Mesmo assim, não foram obtidos
resultados eficientes para a etapa do sequenciamento. Com isso tornou-se
necessária a construção de um par de primers internos, abrangendo a
região do gene da Membrana e parte da região do gene do Envelope.
Otimização da Temperatura de Anelamento dos primers MEM F
F/ENVint R
A reação também foi testada sob as mesmas 8 temperaturas de
anelamento
dos
experimentos
anteriores
e
utilizou
as
mesmas
concentrações de reagentes; a única diferença consistiu na utilização dos
primers, que neste caso foram 25 pmoles dos primers MEM F e ENVint R e
do tempo do anelamento: 2 mim .
A temperatura em que os primers anelaram de forma mais eficiente
foi de aproximadamente 58o C.
69
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
Purificação dos produtos de PCR
As
bandas
obtidas
no
gel
de
agarose
foram
cortadas
e
acondicionadas em tubos eppendorf 1,5 ml, para em seguida serem
submetidas à purificação com o kit SephaglasTM BandPrep da Amersham
pharmacia biotech.
Na
etapa
da
purificação
foram
adicionados
250
µL
do
Gel
solubilizador ao eppendorf contendo a amostra, deixando-se a amostra à
temperatura de 60º C por cerca de 10 min, até o gel de agarose estar
totalmente dissolvido. A etapa seguinte consistiu na adição de 5 µL
Sephaglas BP, que é o componente responsável pela retenção do DNA da
amostra. Esta solução permaneceu por 5 min em temperatura ambiente,
com homogeneização utilizando Vortex a cada minuto. Em seguida a
solução foi centrifugada até atingir a velocidade de 13,000 x g, durante
cerca de 30 seg. O sobrenadante foi então desprezado por inversão do
tubo. Na etapa seguinte, o precipitado foi ressuspendido em 80 µL do
tampão de lavagem utilizando o vortex e em seguida a solução foi
centrifugada até atingir a velocidade de 13,000 x g, durante cerca de 30
seg. Esta etapa foi repetida 2 vezes, totalizando 3 lavagens com o
tampão. Em seguida a amostra permaneceu por 10 min a temperatura
ambiente até o precipitado estar completamente seco. Após esta etapa
foram
adicionados
20
µL
do
tampão
de
eluição,
a
amostra
foi
ressuspendida com o auxílio do vortex e permaneceu em temperatura
ambiente por 5 minutos com agitação periódica. A amostra foi depois
centrifugada a 13,000 x g, durante 1 minuto e o sobrenadante retirado e
colocado em um tubo eppendorf limpo.
Quantificação dos produtos de PCR purificados
A quantificação das amostras purificadas foi realizada em gel de
agarose a 1,0% preparado com tampão TAE contendo 0,05 µg/ml de
70
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
brometo de etídio e a imagem captada com o auxílio de uma câmera
fotográfica digital. Para a quantificação foi utilizado 1 µL do peso
molecular 1kb plus ladder e 1 µL de cada amostra. A banda usada como
padrão do peso molecular é a de 1650 pb, que corresponde a 40 ng.
Sequenciamento
A etapa de sequenciamento foi realizada em um seqüenciador
Genetic analysing ABI 3100 com 96 capilares. Para a reação foi utilizado 1
µL de primer (3.2 pmol/µL), 0,5 µL de Bigdye, 1 µL de Save money (TrisHCl, pH 9.0 200mM, MgCl2 5mM), amostra (10 fL) e água para completar
o volume final de 10 µL. A desnaturação ocorreu com a placa a 95 ºC
durante 10 min e seguido por um cheque térmico 0ºC (gelo). O programa
de amplificação constituiu-se de 1 ciclo a 96 oC por 2 min, seguidos de 35
ciclos de 96 ºC por 45 seg, 50 ºC por 30 seg e 60 ºC por 4 min e em
seguida 4 ºC overnight. A precipitação foi realizada para um volume final
de 10 µL. As lavagens foram realizadas primeiro com 40µL de isopropanol
65% e depois com 150µL de etanol 60%. Após a última lavagem as
amostras foram Resuspendidas em 15 µL de formamida Hi-Di e em
seguida colocadas no seqüenciador.
Análise computacional das seqüências obtidas
Após a etapa de sequenciamento, as seqüências obtidas foram
analisadas in silico com o auxílio de alguns programas computacionais.
Alinhamento das Seqüências
A comparação das seqüência obtidas mediante o sequenciamento
com
as
seqüências
depositadas
no
banco
de
dados
do
NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov), foi realizada mediante a utilização das
versões on-line dos programas BLASTn e BLASTx (Altschul et al., 1990),
disponíveis na página eletrônica http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast. Para
71
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
cada alinhamento realizado foram obtidas estimativas dos níveis de
significância das similaridades observadas. O modelo estatístico utilizado
na determinação destes níveis de confiança foi baseado em Karlin e
Altschul (1990), conhecido como “valor de distribuição extrema” ou evalue. Este parâmetro é interpretado como sendo a probabilidade de que
o nível de homologia (Score - S) entre duas seqüências quaisquer seja
determinado simplesmente pelo acaso. A significância de um alinhamento
também depende diretamente do tamanho amostral apresentado pelo
banco de dados, havendo uma tendência para que os bancos de dados
maiores exibam um maior número de alinhamentos aleatórios (Schuler,
2001).
Determinação do conteúdo de GC%
A determinação do conteúdo de guanina e citosina (GC%) realizouse
mediante
a
utilização
do
programa
GeneRunner
(http://www.generunner.com).
Construção de banco de dados
Foi realizada a construção de um banco de dados contendo
informações a respeito do das bases de cada seqüência similar obtida,
conteúdo de GC% e extensão das seqüências.
Construção de Árvores Filogenéticas
A partir das seqüências depositadas nos bancos de dados, foram
realizados alinhamentos globais com uma versão do programa Clustal W,
integrada ao pacote de programas de análise de seqüências Seqtools 8.0
(http:/www.seqtools.dk). Os alinhamentos produzidos resultaram na
72
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
produção dos arquivos de entrada utilizados na análise filogenética das
seqüências obtidas e das demais seqüências de vírus dengue tipo 3
disponibilizadas em bancos de dados públicos, executada com o auxílio do
programa PAUP 4.0b.
73
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
6.2. FIGURAS ADICIONAIS
Figura 5. Foto de gel de agarose após eletroforese para demonstração do
padrão de bandas de 600 pb referentes aos genes do capsídeo e da
membrana de Dengue-3. Poço 1, Peso molecular ; Poço 2, controle
negativo, Poços 3-10, amostras de 8 pacientes usadas para o estudo.
Figura 6. Foto de resultado de seqüenciamento utilizando os primers CAP
F/ MEM R, com o fragmento referente aos genes do capsídeo e da
membrana de Dengue-3, obtida com o auxílio do programa BioEdit.
74
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
Figura 7. Resultado do alinhamento entre os genes do Capsídeo e da
Membrana de uma das amostras analisadas de Dengue-3 e seqüências
similares no banco de nucleotídeos do NCBI. Observa-se a conservação
dos nucleotídeos entre as seqüências depositadas no banco de dados
público e a seqüência obtida por sequenciamento no presente estudo. As
barras em vermelho representam as regiões do gene com similaridade às
seqüências encontradas no banco de dados.
75
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
Figura 8. Resultado do alinhamento entre os genes do Capsídeo e da
Membrana de Dengue-3 de uma das seqüências utilizadas na análise e
seqüências do banco de aminoácidos do NCBI. Observa-se a conservação
das seqüências do banco de dados com a seqüência analisada.
76
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
FHD-1
DC+PL-1
DC+PL-4
FHD-4
DC+PL-3
DC-3
FHD-2
DC-2
DC-5
DC+PL-2
DC-1
DC-4
DC+PL-5
FHD-3
TTCTCAAAA-GGACTGCT-GAACGGCCAGGGACCAATGAAATTGGTTATGGCGTTCATAG
TTCTCAAAAAGGACTGCT-GAACGGCCAGGGACCAATGAAATTGGTTATGGCGTTCATAG
TTCTCAAAA-GGACTGCTTGAACGGCCAGGGACCAATGAAATTGGTTATGGCGTTCATAG
TTCTCAAAA-GGACTGCTGGAACGGCCAGGGACCAATGAAATTGGTTATGGCGTTCATAG
TTCTCAAAA-GGACTGCT-GAACGGCCAGGGACCAATGAAATTGGTTATGGCGTTCATAG
TTCTCAAAA-GGACTGCT-GAACGGCCAGGGACCAATGAAATTGGTTATGGCGTTCATAG
TTCTCAAAATTCTCTGCTGAAACGGCCAGGGACCAATGAAATTGGTTATGGCGTTCATAG
TTCTCAAA-TCCTCTGCTGAA-CGGCCAGGGACCAATGAAATTGGTTATGGCGTTCATAG
TTCTCAAATGGCTTTGCTTGAACGGCCAGGGACCAATGAAATTGGTTATGGCGTTCATAG
TTCTCAAA-AGGTCTGCTGAA-CGGCCAGGGACCAATGAAATTGGTTATGGCGTTCATAG
TTCTCAAAA-GGTCTGCT-GAACGGCCAGGGACCAATGAAATTGGTTATGGCGTTCATAG
TTCTCAAAAGGT-CTGCTGAA-CGGCCAGGGACCAATGAAATTGGTTATGGCGTTCATAG
TTCTCAAAAGGTTCTGCTGAA-CGGCCAGGGACCAATGAAATTGGTTATGGCGTTCATAG
TTCTCAAAAGGT-CCGCTGAAACGGCCAGGGACCAATGAAATTGGTTATGGCGTTCATAG
********
*** * **************************************
FHD-1
DC+PL-1
DC+PL-4
FHD-4
DC+PL-3
DC-3
FHD-2
DC-2
DC-5
DC+PL-2
DC-1
DC-4
DC+PL-5
FHD-3
CTTTCCTCAGATTTCTAGCCATTCCACCAACAGCAGGAGTCTTGGCTAGATGGGGAACCT
CTTTCCTCAGATTTCTAGCCATTCCACCAACAGCAGGAGTCTTGGCTAGATGGGGAACCT
CTTTCCTCAGATTTCTAGCCATTCCACCAACAGCAGGAGTCTTGGCTAGATGGGGAACCT
CTTTCCTCAGATTTCTAGCCATTCCACCAACAGCAGGAGTCTTGGCTAGATGGGGAACCT
CTTTCCTCAGATTTCTAGCCATTCCACCAACAGCAGGAGTCTTGGCTAGATGGGGAACCT
CTTTCCTCAGATTTCTAGCCATTCCACCAACAGCAGGAGTCTTGGCTAGATGGGGAACCT
CTTTCCTCAGATTTCTAGCCATTCCACCAACAGCAGGAGTCTTGGCTAGATGGGGAACCT
CTTTCCTCAGATTTCTAGCCATTCCACCAACAGCAGGAGTCTTGGCTAGATGGGGAACCT
CTTTCCTCAGATTTCTAGCCATTCCACCAACAGCAGGAGTCTTGGCTAGATGGGGAACCT
CTTTCCTCAGATTTCTAGCCATTCCACCAACAGCAGGAGTCTTGGCTAGATGGGGAACCT
CTTTCCTCAGATTTCTAGCCATTCCACCAACAGCAGGAGTCTTGGCTAGATGGGGAACCT
CTTTCCTCAGATTTCTAGCCATTCCACCAACAGCAGGAGTCTTGGCTAGATGGGGAACCT
CTTTCCTCAGATTTCTAGCCATTCCACCAACAGCAGGAGTCTTGGCTAGATGGGGAACCT
CTTTCCTCAGATTTCTAGCCATTCCACCAACAGCAGGAGTCTTGGCTAGATGGGGAACCT
************************************************************
FHD-1
DC+PL-1
DC+PL-4
FHD-4
DC+PL-3
DC-3
FHD-2
DC-2
DC-5
DC+PL-2
DC-1
DC-4
DC+PL-5
FHD-3
TCAAGAAGTCGGGGGCCATTAAGGTCCTGAAAGGCTTCAAGAAGGAGATCTCAAACATGC
TCAAGAAGTCGGGGGCCATTAAGGTCCTGAAAGGCTTCAAGAAGGAGATCTCAAACATGC
TCAAGAAGTCGGGGGCCATTAAGGTCCTGAAAGGCTTCAAGAAGGAGATTTCAAACATGC
TCAAGAAGTCGGGGGCCATTAAGGTCCTGAAAGGCTTCAAGAAGGAGATTTCAAACATGC
TCAAGAAGTCGGGGGCCATTAAGGTCCTGAAAGGCTTCAAGAAGGAGATCTCAAACATGC
TCAAGAAGTCGGGGGCCATTAAGGTCCTGAAAGGCTTCAAGAAGGAGATCTCAAATATGC
TCAAGAAGTCGGGGGCCATTAAGGTCCTGAAAGGCTTCAAGAAGGAGATCTCAAATATGC
TCAAGAAGTCGGGGGCCATTAAGGTCCTGAAAGGCTTCAAGAAGGAGATCTCAAACATGC
TCAAGAAGTCGGGGGCCATTAAGGTCCTGAAAGGCTTCAAGAAGGAGATCTCAAACATGC
TCAAGAAGTCGGGGGCCATTAAGGTCCTGAAAGGCTTCAAGAAGGAGATCTCAAACATGC
TCAAGAAGTCGGGGGCCATTAAGGTCCTGAAAGGCTTCAAGAAGGAGATCTCAAACATGC
TCAAGAAGTCGGGGGCCATCAAGGTCCTGAAAGGCTTCAAGAAGGAGATCTCAAACATGC
TCAAGAAGTCGGGGGCCATCAAGGTCCTGAAAGGCTTCAAGAAGGAGATCTCAAACATGC
TCAAGAAGTCGGGGGCCATCAAGGTCCTGAAAGGCTTCAAGAAGGAGATCTCAAACATGC
******************* ***************************** ***** ****
FHD-1
DC+PL-1
DC+PL-4
FHD-4
DC+PL-3
DC-3
FHD-2
DC-2
DC-5
DC+PL-2
DC-1
DC-4
DC+PL-5
FHD-3
TGAGCATAATCAACAAACGGAAAAAGACATCGCTCTGTCTCATGATGATATTGCCAGCAG
TGAGCATAATCAACAAACGGAAAAAGACATCGCTCTGTCTCATGATGATATTGCCAGCAG
TGAGCATAATCAACAAACGGAAAAAGACATCGCTCTGTCTCATGATGATATTGCCAGCAG
TGAGCATAATCAACAAACGGAAAAAGACATCGCTCTGTCTCATGATGATATTGCCAGCAG
TGAGCATAATCAACAAACGGAAAAAGACATCGCTCTGTCTCATGATGATATTGCCAGCAG
TGAGCATAATCAACAAACGGAAAAAGACATCGCTCTGTCTCATGATGATATTGCCAGCAG
TGAGCATAATCAACAAACGGAAAAAGACATCGCTCTGTCTCATGATGATATTGCCAGCAG
TGAGCATAATCAACAAACGGAAAAAGACATCGCTCTGTCTCATGATGATATTGCCAGCAG
TGAGCATAATCAACAAACGGAAAAAGACATCGCTCTGTCTCATGATGATATTGCCAGCAG
TGAGCATAATCAACAAACGGAAAAAGACATCGCTCTGTCTCATGATGATATTGCCAGCAG
TGAGCATAATCAACAAACGGAAAAAGACATCGCTCTGTCTCATGATGATATTGCCAGCAG
TGAGCATAATCAACAAACGGAAAAAGACATCGCTCTGTCTCATGATGATATTGCCAGCAG
TGAGCATAATCAACAAACGGAAAAAGACATCGCTCTGTCTCATGATGATATTGCCAGCAG
TGAGCATAATCAACAAACGGAAAAAGACATCGCTCTGTCTCATGATGATATTGCCAGCAG
************************************************************
77
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
FHD-1
DC+PL-1
DC+PL-4
FHD-4
DC+PL-3
DC-3
FHD-2
DC-2
DC-5
DC+PL-2
DC-1
DC-4
DC+PL-5
FHD-3
CACTTGCTTTCCACTTGACTTCACGAGATGGAGAGCCGCGCATGATTGTGGGGAAGAATG
CACTTGCTTTCCACTTGACTTCACGAGATGGAGAGCCGCGCATGATTGTGGGGAAGAATG
CACTTGCTTTCCACTTGACTTCACGAGATGGAGAGCCGCGCATGATTGTGGGGAAGAATG
CACTTGCTTTCCACTTGACTTCACGAGATGGAGAGCCGCGCATGATTGTGGGGAAGAATG
CACTTGCTTTCCACTTGACTTCACGAGATGGAGAGCCGCGCATGATTGTGGGGAAGAATG
CACTTGCTTTCCACTTGACTTCACGAGATGGAGAGCCGCGCATGATTGTGGGGAAGAATG
CACTTGCTTTCCACTTGACTTCACGAGATGGAGAGCCGCGCATGATTGTGGGGAAGAATG
CACTTGCTTTCCACTTGACTTCACGAGATGGAGAGCCGCGCATGATTGTGGGGAAGAATG
CACTTGCTTTCCACTTGACTTCACGAGATGGAGAGCCGCGCATGATTGTGGGGAAGAATG
CACTTGCTTTCCACTTGACTTCACGAGATGGAGAGCCGCGCATGATTGTGGGGAAGAATG
CACTTGCTTTCCACTTGACTTCACGAGATGGAGAGCCGCGCATGATTGTGGGGAAGAATG
CACTTGCTTTCCACTTGACTTCACGAGATGGAGAGCCGCGCATGATTGTGGGGAAGAATG
CACTTGCTTTCCACTTGACTTCACGAGATGGAGAGCCGCGCATGATTGTGGGGAAGAATG
CACTTGCTTTCCACTTGACTTCACGAGATGGAGAGCCGCGCATGATTGTGGGGAAGAATG
************************************************************
FHD-1
DC+PL-1
DC+PL-4
FHD-4
DC+PL-3
DC-3
FHD-2
DC-2
DC-5
DC+PL-2
DC-1
DC-4
DC+PL-5
FHD-3
AAAGAGGAAAATCCCTACTTTTTAAGACAGCCTCTGGAATCAACATGTGCACACTCATAG
AAAGAGGAAAATCCCTACTTTTTAAGACAGCCTCTGGAATCAACATGTGCACACTCATAG
AAAGAGGAAAATCCCTACTTTTTAAGACAGCCTCTGGAATCAACATGTGCACACTCATAG
AAAGAGGAAAATCCCTACTTTTTAAGACAGCCTCTGGAATCAACATGTGCACACTCATAG
AAAGAGGAAAATCCCTACTTTTTAAGACAGCCTCTGGAATCAACATGTGCACACTCATAG
AAAGAGGAAAATCCCTACTTTTTAAGACAGCCTCTGGAATCAACATGTGCACACTCATAG
AAAGAGGAAAATCCCTACTTTTTAAGACAGCCTCTGGAATCAACATGTGCACACTCATAG
AAAGAGGAAAATCCCTACTTTTTAAGACAGCCTCTGGAATCAACATGTGCACACTCATAG
AAAGAGGAAAATCCCTACTTTTTAAGACAGCCTCTGGAATTAACATGTGCACACTCATAG
AAAGAGGAAAATCCCTACTTTTTAAGACAGCCTCTGGAATCAACATGTGCACACTCATAG
AAAGAGGAAAATCCCTACTTTTTAAGACAGCCTCTGGAATCAACATGTGCACACTCATAG
AAAGAGGAAAATCCCTGCTTTTTAAGACAGCCTCTGGAATCAACATGTGCACACTCATAG
AAAGAGGAAAATCCCTGCTTTTTAAGACAGCCTCTGGAATCAACATGTGCACACTCATAG
AAAGAGGAAAATCCCTGCTTTTTAAGACAGCCTCTGGAATCAACATGTGCACACTCATAG
**************** *********************** *******************
FHD-1
DC+PL-1
DC+PL-4
FHD-4
DC+PL-3
DC-3
FHD-2
DC-2
DC-5
DC+PL-2
DC-1
DC-4
DC+PL-5
FHD-3
CCATGGACTTGGGAGAGATGTGTGATGACACGGTCACTTACAAATGCCCCCACATTACCG
CCATGGACTTGGGAGAGATGTGTGATGACACGGTCACTTACAAATGCCCCCACATTACCG
CCATGGACTTGGGAGAGATGTGTGATGACACGGTCACTTACAAATGCCCCCACATTACCG
CCATGGACTTGGGAGAGATGTGTGATGACACGGTCACTTACAAATGCCCCCACATTACCG
CCATGGACTTGGGAGAGATGTGTGATGACACGGTCACTTACAAATGCCCCCACATTACCG
CCATGGACTTGGGAGAGATGTGTGATGACACGGTCACTTACAAATGCCCCCACATTACCG
CCATGGACTTGGGAGAGATGTGTGATGACACGGTCACTTACAAATGCCCCCACATTACCG
CCATGGACTTGGGAGAGATGTGTGATGACACGGTCACTTACAAATGCCCCCACATTACCG
CCATGGACTTGGGAGAGATGTGTGATGACACGGTCACTTACAAATGCCCCCACATTACCG
CCATGGACTTGGGAGAGATGTGTGATGACACGGTCACTTACAAATGCCCCCACATTACCG
CCATGGACTTGGGAGAGATGTGTGATGACACGGTCACTTACAAATGCCCCCACATTACCG
CCATGGACTTGGGAGAGATGTGTGATGACACGGTCACTTACAAATGCCCCCACATTGCCG
CCATGGACTTGGGAGAGATGTGTGATGACACGGTCACTTACAAATGCCCCCACATTGCCG
CCATGGACTTGGGAGAGATGTGTGATGACACGGTCACTTACAAATGCCCCCACATTGCCG
******************************************************** ***
FHD-1
DC+PL-1
DC+PL-4
FHD-4
DC+PL-3
DC-3
FHD-2
DC-2
DC-5
DC+PL-2
DC-1
DC-4
DC+PL-5
FHD-3
AAGTGGAACCTGAAGACATTGACTGCTGGTGCAACCTTACATCAACATGGGTGACTTACG
AAGTGGAACCTGAAGACATTGACTGCTGGTGCAACCTTACATCAACATGGGTGACTTACG
AAGTGGAACCTGAAGACATTGACTGCTGGTGCAACCTTACATCAACATGGGTGACTTACG
AAGTGGAACCTGAAGACATTGACTGCTGGTGCAACCTTACATCAACATGGGTGACTTACG
AAGTGGAACCTGAAGACATTGACTGCTGGTGCAACCTTACATCAACATGGGTGACTTACG
AAGTGGAACCTGAAGACATTGACTGCTGGTGCAACCTTACATCAACATGGGTGACTTACG
AAGTGGAACCTGAAGACATTGACTGCTGGTGCAACCTTACATCAACATGGGTGACTTACG
AAGTGGAACCTGAAGACATTGACTGCTGGTGCAACCTTACATCAACATGGGTGACTTACG
AAGTGGAACCTGAAGACATTGACTGCTGGTGCAACCTTACATCAACATGGGTGACTTACG
AAGTGGAACCTGAAGACATTGACTGCTGGTGCAACCTTACATCAACATGGGTGACTTACG
AAGTGGAACCTGAAGACATTGACTGCTGGTGCAACCTTACATCAACATGGGTGACTTACG
AAGTGGAACCTGAAGACATTGACTGCTGGTGCAACCTTACATCAACATGGGTGACTTACG
AAGTGGAACCTGAAGACATTGACTGCTGGTGCAACCTTACATCAACATGGGTGACTTACG
AAGTGGAACCTGAAGACATTGACTGCTGGTGCAACCTTACATCAACATGGGTGACTTACG
************************************************************
FHD-1
DC+PL-1
GAACGTGCAATCAAGCCGGAGAGCGTAGACGCGACAAGAGA
GAACGTGCAATCAAGCCGGAGAGCGTAGACGCGACAAGAGA
78
Lyra, J M A
DC+PL-4
FHD-4
DC+PL-3
DC-3
FHD-2
DC-2
DC-5
DC+PL-2
DC-1
DC-4
DC+PL-5
FHD-3
Caracterização Genética de Isolados...
GAACGTGCAATCAAGCCGGAGAGCGTAGACGCGACAAGAGA
GAACGTGCAATCAAGCCGGAGAGCGTAGACGCGACAAGAGA
GAACGTGCAATCAAGCCGGAGAGCGTAGACGCGACAAGAGA
GAACGTGCAATCAAGCCGGAGAGCGTAGACGCGACAAGAGA
GAACGTGCAATCAAGCCGGAGAGCGTAGACGCGACAAGAGA
GAACGTGCAATCAAGCCGGAGAGCGTAGACGCGACAAGAGA
GAACGTGCAATCAAGCCGGAGAGCGTAGACGCGACAAGAGA
GAACGTGCAATCAAGCCGGAGAGCGTAGACGCGACAAGAGA
GAACGTGCAATCAAGCCGGAGAGCGTAGACGCGACAAGAGA
GAACGTGCAATCAAGCCGGAGAGCGTAGACGCGACAAGAGA
GAACGTGCAATCAAGCCGGAGAGCGTAGACGCGACAAGAGA
GAACGTGCAATCAAGCCGGAGAGCGTAGACGCGACAAGAGA
*****************************************
Figura 9. Alinhamento múltiplo das seqüências de nucleotídeos das
amostras estudadas, referente aos genes do Capsídeo e da Membrana,
realizado com o auxílio da ferramenta Clustal X, integrante do pacote de
programas Seqtools. Os asteriscos indicam nucleotídeos coincidentes. O
trecho em amarelo representa a área de maior variabilidade.
79
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
DC+PL-1
DC+PL-5
DC-1
FHD-1
DC+PL-2
DC+PL-3
DC-3
DC-4
DC-2
FHD-3
FHD-2
DC+PL-4
FHD-4
DC-5
-SQKGLLNGQGPMKLVMAFIAFLRFLAIPPTAGVLARWGTFKKSGAIKVLKGFKKEISNM
-SQKVLLNGQGPMKLVMAFIAFLRFLAIPPTAGVLARWGTFKKSGAIKVLKGFKKEISNM
FSKG-LLNGQGPMKLVMAFIAFLRFLAIPPTAGVLARWGTFKKSGAIKVLKGFKKEISNM
FSKG-LLNGQGPMKLVMAFIAFLRFLAIPPTAGVLARWGTFKKSGAIKVLKGFKKEISNM
FSKG-LLNGQGPMKLVMAFIAFLRFLAIPPTAGVLARWGTFKKSGAIKVLKGFKKEISNM
FSKG-LLNGQGPMKLVMAFIAFLRFLAIPPTAGVLARWGTFKKSGAIKVLKGFKKEISNM
FSKG-LLNGQGPMKLVMAFIAFLRFLAIPPTAGVLARWGTFKKSGAIKVLKGFKKEISNM
FSKG-LLNGQGPMKLVMAFIAFLRFLAIPPTAGVLARWGTFKKSGAIKVLKGFKKEISNM
FSNP-LLNGQGPMKLVMAFIAFLRFLAIPPTAGVLARWGTFKKSGAIKVLKGFKKEISNM
-SQK-VRNGQGPMKLVMAFIAFLRFLAIPPTAGVLARWGTFKKSGAIKVLKGFKKEISNM
--LKILCNGQGPMKLVMAFIAFLRFLAIPPTAGVLARWGTFKKSGAIKVLKGFKKEISNM
-SQKDCLNGQGPMKLVMAFIAFLRFLAIPPTAGVLARWGTFKKSGAIKVLKGFKKEISNM
-SQKDCWNGQGPMKLVMAFIAFLRFLAIPPTAGVLARWGTFKKSGAIKVLKGFKKEISNM
-LKWLCLNGQGPMKLVMAFIAFLRFLAIPPTAGVLARWGTFKKSGAIKVLKGFKKEISNM
*****************************************************
DC+PL-1
DC+PL-5
DC-1
FHD-1
DC+PL-2
DC+PL-3
DC-3
DC-4
DC-2
FHD-3
FHD-2
DC+PL-4
FHD-4
DC-5
LSIINKRKKTSLCLMMILPAALAFHLTSRDGEPRMIVGKNERGKSLLFKTASGINMCTLI
LSIINKRKKTSLCLMMILPAALAFHLTSRDGEPRMIVGKNERGKSLLFKTASGINMCTLI
LSIINKRKKTSLCLMMILPAALAFHLTSRDGEPRMIVGKNERGKSLLFKTASGINMCTLI
LSIINKRKKTSLCLMMILPAALAFHLTSRDGEPRMIVGKNERGKSLLFKTASGINMCTLI
LSIINKRKKTSLCLMMILPAALAFHLTSRDGEPRMIVGKNERGKSLLFKTASGINMCTLI
LSIINKRKKTSLCLMMILPAALAFHLTSRDGEPRMIVGKNERGKSLLFKTASGINMCTLI
LSIINKRKKTSLCLMMILPAALAFHLTSRDGEPRMIVGKNERGKSLLFKTASGINMCTLI
LSIINKRKKTSLCLMMILPAALAFHLTSRDGEPRMIVGKNERGKSLLFKTASGINMCTLI
LSIINKRKKTSLCLMMILPAALAFHLTSRDGEPRMIVGKNERGKSLLFKTASGINMCTLI
LSIINKRKKTSLCLMMILPAALAFHLTSRDGEPRMIVGKNERGKSLLFKTASGINMCTLI
LSIINKRKKTSLCLMMILPAALAFHLTSRDGEPRMIVGKNERGKSLLFKTASGINMCTLI
LSIINKRKKTSLCLMMILPAALAFHLTSRDGEPRMIVGKNERGKSLLFKTASGINMCTLI
LSIINKRKKTSLCLMMILPAALAFHLTSRDGEPRMIVGKNERGKSLLFKTASGINMCTLI
LSIINKRKKTSLCLMMILPAALAFHLTSRDGEPRMIVGKNERGKSLLFKTASGINMCTLI
************************************************************
DC+PL-1
DC+PL-5
DC-1
FHD-1
DC+PL-2
DC+PL-3
DC-3
DC-4
DC-2
FHD-3
FHD-2
DC+PL-4
FHD-4
DC-5
AMDLGEMCDDTVTYKCPHITEVEPEDIDCWCNLTSTWVTYGTCNQAGERRRDKR
AMDLGEMCDDTVTYKCPHIAEVEPEDIDCWCNLTSTWVTYGTCNQAGERRRDKR
AMDLGEMCDDTVTYKCPHITEVEPEDIDCWCNLTSTWVTYGTCNQAGERRRDKR
AMDLGEMCDDTVTYKCPHITEVEPEDIDCWCNLTSTWVTYGTCNQAGERRRDKR
AMDLGEMCDDTVTYKCPHITEVEPEDIDCWCNLTSTWVTYGTCNQAGERRRDKR
AMDLGEMCDDTVTYKCPHITEVEPEDIDCWCNLTSTWVTYGTCNQAGERRRDKR
AMDLGEMCDDTVTYKCPHITEVEPEDIDCWCNLTSTWVTYGTCNQAGERRRDKR
AMDLGEMCDDTVTYKCPHIAEVEPEDIDCWCNLTSTWVTYGTCNQAGERRRDKR
AMDLGEMCDDTVTYKCPHITEVEPEDIDCWCNLTSTWVTYGTCNQAGERRRDKR
AMDLGEMCDDTVTYKCPHIAEVEPEDIDCWCNLTSTWVTYGTCNQAGERRRDKR
AMDLGEMCDDTVTYKCPHITEVEPEDIDCWCNLTSTWVTYGTCNQAGERRRDKR
AMDLGEMCDDTVTYKCPHITEVEPEDIDCWCNLTSTWVTYGTCNQAGERRRDKR
AMDLGEMCDDTVTYKCPHITEVEPEDIDCWCNLTSTWVTYGTCNQAGERRRDKR
AMDLGEMCDDTVTYKCPHITEVEPEDIDCWCNLTSTWVTYGTCNQAGERRRDKR
*******************:**********************************
Figura 10. Alinhamento múltiplo das seqüências de aminoácidos das
amostras estudadas, referente aos genes do Capsídeo e da Membrana,
realizado com o auxílio da ferramenta Clustal X, integrante do pacote de
programas Seqtools. Os asteriscos indicam aminoácidos coincidentes. O
trecho em amarelo representa a área de maior variabilidade.
80
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
Figura 11. Foto de resultado de sequenciamento utilizando os primers
MEM P F/ ENV R, com o fragmento referente ao gene do Envelope de
Dengue-3, obtida com o auxílio do programa BioEdit.
81
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
Figura 12. Resultado do alinhamento entre o gene do Envelope de uma
das amostras analisadas de Dengue-3 e seqüências similares no banco de
nucleotídeos do NCBI. Observa-se a conservação dos nucleotídeos entre
as seqüências depositadas no banco de dados público e a seqüência obtida
por sequenciamento no presente estudo.
82
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
Figura 13. Resultado do alinhamento entre o gene do Envelope de
Dengue-3 de uma das seqüências utilizadas na análise e seqüências do
banco de aminoácidos do NCBI.
83
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
DC_PL-3
DC_PL-5
DC-1
DC-3
DC-2
DC_PL-1
DC_PL-4
DC_PL-2
DC-4
FHD-1
FHD-2
FHD-3
FHD-4
DC-5
AATGAGATGTGTGGGAGTAGGAAACAGAGATTTTGTGGAAGGTCTATCAGGAGCTACGTG
AATGAGATGTGTGGGAGTAGGAAACAGAGATTTTGTGGAAGGTCTATCAGGAGCTACGTG
AATGAGATGTGTGGGAGTAGGAAACAGAGATTTTGTGGAAGGTCTATCAGGAGCTACGTG
AATGAGATGTGTGGGAGTAGGAAACAGAGATTTTGTGGAAGGTCTATCAGGAGCTACGTG
AATGAGATGTGTGGGAGTAGGAAACAGAGATTTTGTGGAAGGTCTATCAGGAGCTACGTG
AATGAGATGTGTGGGAGTAGGAAACAGAGATTTTGTGGAAGGTCTATCAGGAGCTACGTG
AATGAGATGTGTGGGAGTAGGAAACAGAGATTTTGTGGAAGGTCTATCAGGAGCTACGTG
AATGAGATGTGTGGGAGTAGGAAACAGAGATTTTGTGGAAGGTCTATCAGGAGCTACGTG
AATGAGATGTGTGGGAGTAGGAAACAGAGATTTTGTGGAAGGTCTATCAGGAGCTACGTG
AATGAGATGTGTGGGAGTAGGAAACAGAGATTTTGTGGAAGGTCTATCAGGAGCTACGTG
AATGAGATGTGTGGGAGTAGGAAACAGAGATTTTGTGGAAGGTCTATCAGGAGCTACGTG
AATGAGATGTGTGGGAGTAGGAAACAGAGATTTTGTGGAAGGTCTATCAGGAGCTACGTG
AATGAGATGTGTGGGAGTAGGAAACAGAGATTTTGTGGAAGGTCTATCAGGAGCTACGTG
AATGAGATGTGTGGGAGTAGGAAACAGAGATTTTGTGGAAGTTTTATCAGGAGCTACGTG
***************************************** * ****************
DC_PL-3
DC_PL-5
DC-1
DC-3
DC-2
DC_PL-1
DC_PL-4
DC_PL-2
DC-4
FHD-1
FHD-2
FHD-3
FHD-4
DC-5
GGTTGACGTGGTGCTCGAGCACGGGGGGTGTGTGACTACCATGGCTAAGAACAAGCCAAC
GGTTGACGTGGTGCTCGAGCACGGGGGGTGTGTGACTACCATGGCTAAGAACAAGCCAAC
GGTTGACGTGGTGCTCGAGCACGGGGGGTGTGTGACTACCATGGCTAAGAACAAGCCAAC
GGTTGACGTGGTGCTCGAGCACGGGGGGTGTGTGACTACTATGGCTAAGAACAAGCCAAC
GGTTGACGTGGTGCTCGAGCACGGGGGGTGTGTGACTACCATGGCTAAGAACAAGCCAAC
GGTTGACGTGGTGCTCGAGCACGGGGGGTGTGTGACTACCATGGCTAAGAACAAGCCAAC
GGTTGACGTGGTGCTCGAGCACGGGGGGTGTGTGACTACCATGGCTAAGAACAAGCCAAC
GGTTGACGTGGTGCTCGAGCACGGGGGGTGTGTGACTACCATGGCTAAGAACAAGCCAAC
GGTTGACGTGGTGCTCGAGCACGGGGGGTGTGTGACTACCATGGCTAAGAACAAGCCAAC
GGTTGACGTGGTGCTCGAGCACGGGGGGTGTGTGACTACCATGGCTAAGAACAAGCCAAC
GGTTGACGTGGTGCTCGAGCACGGGGGGTGTGTGACTACCATGGCTAAGAACAAGCCAAC
GGTTGACGTGGTGCTCGAGCACGGGGGGTGTGTGACTACCATGGCTAAGAACAAGCCAAC
GGTTGACGTGGTGCTCGAGCACGGGGGGTGTGTGACTACCATGGCTAAGAACAAGCCAAC
GGTTGACGTGGTGCTCGAGCACGGGGGGTGTGTGACTACCATGGCTAAGAACAAGCCAAC
*************************************** ********************
DC_PL-3
DC_PL-5
DC-1
DC-3
DC-2
DC_PL-1
DC_PL-4
DC_PL-2
DC-4
FHD-1
FHD-2
FHD-3
FHD-4
DC-5
GTTGGATATAGAGCTTCAGAAGACCGAGGCCACCCAATTGGCGACCCTAAGGAAGCTATG
GTTGGATATAGAGCTTCAGAAGACCGAGGCCACCCAATTGGCGACCCTAAGGAAGCTATG
GTTGGATATAGAGCTTCAGAAGACCGAGGCCACCCAATTGGCGACCCTAAGGAAGCTATG
GTTGGATATAGAGCTTCAGAAGACCGAGGCCACCCAATTGGCGACCCTAAGGAAGCTATG
GTTGGATATAGAGCTTCAGAAGACCGAGGCCACCCAATTGGCGACCCTAAGGAAGCTATG
GTTGGATATAGAGCTTCAGAAGACCGAGGCCACCCAATTGGCGACCCTAAGGAAGCTATG
GTTGGATATAGAGCTTCAGAAGACCGAGGCCACCCAATTGGCGACCCTAAGGAAGCTATG
GTTGGATATAGAGCTTCAGAAGACCGAGGCCACCCAATTGGCGACCCTAAGGAAGCTATG
GTTGGATATAGAGCTTCAGAAGACCGAGGCCACCCAATTGGCGACCCTAAGGAAGCTATG
GTTGGATATAGAGCTTCAGAAGACCGAGGCCACACAATTGGCGACCCTAAGGAGGCTATG
GTTGGATATAGAGCTTCAGAAGACCGAGGCCACCCAATTGGCGACCCTAAGGAAGCTATG
GTTGGATATAGAGCTTCAGAAGACCGAGGCCACCCAATTGGCGACCCTAAGGAAGCTATG
GTTGGATATAGAGCTTCAGAAGACCGAGGCCACCCAATTGGCGACCCTAAGGAAGCTATG
GTTGGATATAGAGCTTCAGAAGACCGAGGCCACCCAATTGGCGACCCTAAGGAAGCTATG
********************************* ******************* ******
DC_PL-3
DC_PL-5
DC-1
DC-3
DC-2
DC_PL-1
DC_PL-4
DC_PL-2
DC-4
FHD-1
FHD-2
FHD-3
FHD-4
DC-5
CATTGAGGGGAAAATTACCAACATAACAACTGACTCAAGATGTCCTACCCAAGGGGAAGC
CATTGAGGGGAAAATTACCAACATAACAACTGACTCAAGATGTCCTACCCAAGGGGAAGC
CATTGAGGGGAAAATTACCAACATAACAACTGACTCAAGATGTCCTACCCAAGGGGAAGC
CATTGAGGGGAAAATTACCAACATAACAACTGACTCAAGATGTCCTACCCAAGGGGAAGC
CATTGAGGGGAAAATTACCAACATAACAACTGACTCAAGATGTCCTACCCAAGGGGAAGC
CATTGAGGGGAAAATTACCAACATAACAACTGACTCAAGATGTCCTACCCAAGGGGAAGC
CATTGAGGGGAAAATTACCAACATAACAACTGACTCAAGATGTCCTACCCAAGGGGAAGC
CATTGAGGGGAAAATTACCAACATAACAACTGACTCAAGATGTCCTACCCAAGGGGAAGC
CATTGAGGGGAAAATTACCAACATAACAACTGACTCAAGATGTCCTACCCAAGGGGAAGC
CATTGAGGGGAAAATTACCAACATAACAACTGACTCAAGATGTCCTACCCAAGGGGAAGC
CATTGAGGGGAAAATTACCAACATAACAACTGACTCAAGATGTCCTACCCAAGGGGAAGC
CATTGAGGGGAAAATTACCAACATAACAACTGACTCAAGATGTCCTACCCAAGGGGAAGC
CATTGAGGGGAAAATTACCAACATAACAACTGACTCAAGATGTCCTACCCAAGGGGAAGC
CATTGAGGGGAAAATTACCAACATAACAACTGACTCAAGATGTCCTACCCAAGGG-AAGC
******************************************************* ****
84
Lyra, J M A
DC_PL-3
DC_PL-5
DC-1
DC-3
DC-2
DC_PL-1
DC_PL-4
DC_PL-2
DC-4
FHD-1
FHD-2
FHD-3
FHD-4
DC-5
Caracterização Genética de Isolados...
GGTTTTGCCTGAGGAGCAGGACCAGAACTACGTGT-TAAGCATAC-GGTTTTGCCTGAGGAGCAGGACCAGAACTACGTGT-TAAGCATAC-GGTTTTGCCTGAGGAGCAGGACCAGAACTACGTGTGTAAGCATA--GGTTTTGCCTGAGGAGCAGGACCAGAACTACGTGTGTAAGCATA--GGTTTTGCCTGAGGAGCAGGACCAGAACTACGTGTGTAAGCATA--GGTTTTGCCTGAGGAGCAGGACCAGAACTACGTGTGTAAGCATA--GGTTTTGCCTGAGGAGCAGGACCAGAACTACGTGTGTAAGCATA--GGTTTTGCCTGAGGAGCAGGACCAGAACTACGTGTGTAAGCATA--GGTTTTGCCTGAGGAGCAGGACCAGAACTACGTGTGTAAGCACA--GGTTTTGCCTGAGGAGCAGGACCAGAATTACGTGT-TAAGCATA--GGTTTTGCCTGAGGAGCAGGACCAGGAATACGTGT-TAAGCACAC-GGTTTTGCCTGAGGAGCAGGACCAGGAATACGTGT-TAAGCACAC-GGTTTTGCCTGAGGAGCAGGACCAGGAATACGTGT-TAAGCACAC-GGTTTTGCCTTTTGCTCAGGACGAGGAATACGTGT--AAGCAACTAC
**********
* ****** ** * ******* *****
Figura 14. Alinhamento múltiplo das seqüências de nucleotídeos das
amostras estudadas, referente ao gene do Envelope, realizado com o
auxílio da ferramenta Clustal X, integrante do pacote de programas
Seqtools. Os asteriscos indicam nucleotídeos coincidentes. O trecho em
amarelo representa a área de maior variabilidade.
85
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
DC_PL-3
DC_PL-5
FHD-1
FHD-2
FHD-3
FHD-4
DC_PL-1
DC_PL-2
DC-1
DC-2
DC-3
DC-4
DC_PL-4
DC-5
MRCVGVGNRDFVEGLSGATWVDVVLEHGGCVTTMAKNKPTLDIELQKTEATQLATLRKLC
MRCVGVGNRDFVEGLSGATWVDVVLEHGGCVTTMAKNKPTLDIELQKTEATQLATLRKLC
MRCVGVGNRDFVEGLSGATWVDVVLEHGGCVTTMAKNKPTLDIELQKTEATQLATLRRLC
MRCVGVGNRDFVEGLSGATWVDVVLEHGGCVTTMAKNKPTLDIELQKTEATQLATLRKLC
MRCVGVGNRDFVEGLSGATWVDVVLEHGGCVTTMAKNKPTLDIELQKTEATQLATLRKLC
MRCVGVGNRDFVEGLSGATWVDVVLEHGGCVTTMAKNKPTLDIELQKTEATQLATLRKLC
MRCVGVGNRDFVEGLSGATWVDVVLEHGGCVTTMAKNKPTLDIELQKTEATQLATLRKLC
MRCVGVGNRDFVEGLSGATWVDVVLEHGGCVTTMAKNKPTLDIELQKTEATQLATLRKLC
MRCVGVGNRDFVEGLSGATWVDVVLEHGGCVTTMAKNKPTLDIELQKTEATQLATLRKLC
MRCVGVGNRDFVEGLSGATWVDVVLEHGGCVTTMAKNKPTLDIELQKTEATQLATLRKLC
MRCVGVGNRDFVEGLSGATWVDVVLEHGGCVTTMAKNKPTLDIELQKTEATQLATLRKLC
MRCVGVGNRDFVEGLSGATWVDVVLEHGGCVTTMAKNKPTLDIELQKTEATQLATLRKLC
MRCVGVGNRDFVEGLSGATWVDVVLEHGGCVTTMAKNKPTLDIELQKTEATQLATLRKLC
MRCVGVGNRDFVEVLSGATWVDVVLEHGGCVTTMAKNKPTLDIELQKTEATQLATLRKLC
************* *******************************************:**
DC_PL-3
DC_PL-5
FHD-1
FHD-2
FHD-3
FHD-4
DC_PL-1
DC_PL-2
DC-1
DC-2
DC-3
DC-4
DC_PL-4
DC-5
IEGKITNITTDSRCPTQGEAVLPEEQDQNYVLSI
IEGKITNITTDSRCPTQGEAVLPEEQDQNYVLSI
IEGKITNITTDSRCPTQGEAVLPEEQDQNYVLSI
IEGKITNITTDSRCPTQGEAVLPEEQDQEYVLST
IEGKITNITTDSRCPTQGEAVLPEEQDQEYVLST
IEGKITNITTDSRCPTQGEAVLPEEQDQEYVLST
IEGKITNITTDSRCPTQGEAVLPEEQDQNYVCKH
IEGKITNITTDSRCPTQGEAVLPEEQDQNYVCKH
IEGKITNITTDSRCPTQGEAVLPEEQDQNYVCKH
IEGKITNITTDSRCPTQGEAVLPEEQDQNYVCKH
IEGKITNITTDSRCPTQGEAVLPEEQDQNYVCKH
IEGKITNITTDSRCPTQGEAVLPEEQDQNYVCKH
IEGKITNITTDSRCPTQGEAVLPEEQDQNYVCKH
IEGKITNITTDSRCPTQGKRFCLLLRTRNTCKQL
******************: .
: ::
.
Figura 15. Alinhamento múltiplo das seqüências de aminoácidos das
amostras estudadas, referente ao gene do Envelope, realizado com o
auxílio da ferramenta Clustal X, integrante do pacote de programas
Seqtools. Os asteriscos indicam aminoácidos coincidentes. O trecho em
amarelo representa a área de maior variabilidade.
86
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
7. Abstract
The molecular characterization of the virus affection is useful in the
determination in the origin of the samples and, mainly, in the attempt of if
establishing a correlation of virulence of isolated and its importance
epidemiologist. Although the four serotypes of the virus affection can
cause the hemorrhagic fever of the affection considering the primary
infection, some serotypes seem to be associates the definitive forms and
gravity of the illness in different localities. In this work, 14 isolated of the
virus affection serotype 3 had been gotten of patients with different
clinical pictures in Recife between 2003-2004: 10 patients with classic
affection being that five of them had attended a course with plaquetopeny
and others four with diagnosis of hemorrhagic fever of the affection. The
extremity 5' of the genomes of capside was sequenced and had been
compared the nucleotides sequences and proteins correspondents with the
capside, membrane and part of the envelope between itself. The variant
small forms in the portion C-terminal of first ¼ of the Envelope suggest
that the clinic presentation of the illness can be related to the variability of
the viral genome, the analyses of the dendrograms generated with amino
acids sequences of the gene of the Envelope, forms three distincted
groups, one of them only with the sequences originated from isolated
from patients with hemorrhagic fever of the affection, another one with
sequences of patients with classic affection with or without plaquetopeny
and a intermediate group with isolated similarities between of forms
different clinics.
Key words: Classic dengue, hemorrhagic fever, phylogeny.
87
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
8. CONCLUSÕES
•
Existe um elevado nível de similaridade nas seqüências dos genes do
Capsídeo e da Membrana, quando comparados catorze isolados do
vírus
dengue
sorotipo
DEN-3
seqüenciados
com
seqüências
depositadas em bancos de dados públicos, assim como os aminoácidos
deduzidos;
mostrando
a
grande
conservação
destes
genes,
independente da forma clínica apresentada pelo paciente.
•
Os genes do Capsídeo e da Membrana seqüenciados apresentaram em
média o conteúdo de GC de 47,5%, estando de acordo com as
seqüências depositadas em bancos de dados públicos.
•
A maioria das alterações encontradas no genoma das amostras
estudadas com os genes do Capsídeo e da Membrana está na
extremidade 5’ do Capsídeo. As diferenças resultaram principalmente
de deleções, transições e transversões.
•
A seqüência parcial do gene do Envelope das catorze amostras
estudadas apresentou o conteúdo de GC entre 48,6% e 50,4%
estando coincidente com as amostras depositadas em bancos de dados
públicos e com a literatura.
•
A comparação entre as catorze seqüências do gene do Envelope
estudadas mostrou que existem alterações importantes resultantes,
principalmente, de deleções, o que altera a seqüência de aminoácidos
deste gene.
•
Os sítios variantes na porção C-terminal do primeiro ¼ do Envelope
sugerem que a apresentação clinica da doença pode estar relacionada
88
Lyra, J M A
à
variabilidade
Caracterização Genética de Isolados...
do
genoma
viral,
visto
que
as
análises
dos
dendrogramas gerados com os aminoácidos do fragmento seqüenciado
do gene do Envelope, forma três clados distintos, um deles apenas
com as seqüências originadas de isolados de pacientes com FHD, outro
com seqüências de pacientes com DC com ou sem plaquetopenia e um
clado intermediário onde ocorrem semelhanças entre as seqüências de
DC + PL com as seqüências de FHD.
89
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
9 . A NE X O S
90
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
9.1. Anexo 1
INSTRUÇÕES PARA AUTORES
Revista
GENETICS AND MOLECULAR BIOLOGY
ISSN 1415-4757
Ribeirão Preto, Brasil
91
Lyra, J M A
Caracterização Genética de Isolados...
Genetics and Molecular Biology - NOTICE TO CONTRIBUTORS
Scope and policy
Genetics and Molecular Biology (formerly
named Revista Brasileira de Genética/Brazilian
Journal of Genetics - ISSN 0100-8455) is published
quarterly by the Sociedade Brasileira de Genética
(Brazilian Society of Genetics).
The Journal considers contributions that present
the results of original research in genetics,
evolution and related scientific disciplines.
Although Genetics and Molecular Biology is an
official publication of the Brazilian Society of
Genetics, contributors are not required to be
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It is a fundamental condition that submitted
manuscripts have not been and will not be
published elsewhere. With the acceptance of a
manuscript for publication, the publishers acquire
full and exclusive copyright for all languages and
countries.
The use of registered names and trademarks does
not imply, even in the absence of a specific
statement, that such names are exempt from the
relevant protective laws and regulations and
therefore free for general use.
Submission of papers
1. Manuscripts should be submitted to:
Fábio de Melo Sene, Editor-in-Chief
Genetics and Molecular Biology
Rua Capitão Adelmio Norberto da Silva, 736
14025-670 Ribeirão Preto, SP - Brasil
2. A submission package sent to the Editorial
Office must contain:
a.
A cover letter signed by all authors stating that
they have approved the submission of the
manuscript and that the findings have not been
published or are not under consideration for
publication elsewhere;
b.
Three copies of the manuscript and figures.
c.
Two copies of any unpublished or in-press
companion articles referred to in the submission.
d.
A copy of the text, tables and figures on a
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protected; if a disk arrives damaged, a new disk
will be requested, causing delays in publication.
Formats for text are Word or RTF, in Windows
platform. Images in TIF or JPG formats should be
sent in separate files (For Figures, see detailed
instructions in 3.1.g). Disk must be labeled with
the first author’s last name, platform and
software. (See detailed instructions below).
Failure to adhere to these guidelines can delay
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your
contribution,
and
manuscripts may be returned before being
reviewed.
3. Categories of Contribution:
3.1.Research Articles
Manuscripts must be written in English in doublespaced, 12-point type throughout, including the
References Cited section, appendices, tables and
legends; printed on one side only of A4 paper with
2.5 cm margins; marked with consecutive page
numbers, beginning with the cover page.
The following elements must start on a new page
and be ordered as they are listed below:
a) The title page must contain: a concise and
informative title; the authors’ names (first name at
full length); the authors’ institutional affiliation,
including department, institution, and city, state or
province, and country; different affiliations
indicated with superscript numbers; a short
running title of about 35 characters, including
spaces; up to five key words; the corresponding
author’s name, postal address, phone and fax
numbers and email address. The corresponding
author is the person responsible for checking the
page proofs, and arranging for the payment of
color illustrations and author alterations charges.
b) The Abstract must be a single paragraph that
does not exceed 200 words and summarizes the
main results and conclusions of the study. It should
not contain references.
c) The text: must be as succinct as possible. Text
citations: articles should be referred to by authors’
surnames and date of publication; citations with
two authors must include both names; in citations
with three or more authors, name the first author
and use “et al”. Only articles that are published or
in press should be cited. In the case of personal
communications or unpublished results, all
contributors must be listed by initials and last
name (“et al” should not be used). Numbers: In
the text, numbers nine or less must be written out
except as part of a date, a fraction or decimal, a
percentage, or a unit of measurement. Use Arabic
numerals for numbers larger than nine. Avoid
starting a sentence with a number. Binomial
Names: Latin names of genera, species and
intraspecific taxa in the text must be printed in
italics; names of orders and families should be in
the Title.
The text includes the following elements:
Introduction – Description of the background that
led to the study.
Material (or Subjects) and Methods – Details
relevant to the conduct of the study. Statistical
methods should be explained at the end of this
section.
Results – Undue repetition in text and tables
should be avoided. Comment on significance of
results is appropriate but broader discussion should
be part of the Discussion section.
Discussion – The findings of the study should be
placed in context of relevant published data. Ideas
presented in other publications should not be
discussed
solely
to
make
an
exhaustive
presentation.
Some manuscripts may require different formats
appropriate to their content.
d) The Acknowledgments must be a single
paragraph that immediately follows the discussion
and includes references to grant support.
e) The References Section: citations must be
ordered alphabetically by the first author; only
articles that are published or in press should be
included; personal communications must be cited
within the text; journal titles must be abbreviated
according
to
Medline
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/jrbrowser.cgi).
92
Lyra, J M A
Genetics and Molecular Biology
Sample journal article citation:
Breuer ME and Pavan C (1955) Behaviour of
polytene chromosomes of Rhynchosciara angelae
at different stages of larval development.
Chromosoma 7:371-386.
Bertollo LAC, Takahashi CS and Moreira-Filho O
(1978) Cytotaxonomic consideration on Hoplias
lacerdae (Pisces, Erythrinidae). Rev Bras Genet
1:103-120.
Sample book citation
Salzano FM and Freire-Maia N (1967) Populações
Brasileiras. Companhia Editora Nacional and
EDUSP, São Paulo, 178 pp.
Dobzhansky T (1951) Genetics and Origin of
Species. 3rd edition. Columbia University Press,
New York, 364 pp.
Sample chapter-in-book citation:
Carvalho A, Monaco LC and Krug CA (1966)
Melhoramento genético das plantas e sua
repercussão econômica. In: Pavan C and da Cunha
AB (eds) Elementos de Genética. 2nd ed. EDUSP
and Companhia Editora Nacional, São Paulo, pp
587-653.
Sample abstracts in meeting citation:
Basile R (1973) Cromossomos Politênicos em
células nutritivas de ovócitos de ovário atrofiado de
Rhyncosciara. Ciênc e Cult 25 (suppl): 248. XXV
Reunião Anual da SBPC, Rio de Janeiro, Brazil.
Sample Thesis/Dissertation citation:
Frota-Pessoa O (1953) Revision of the Tripunctata
group of Drosophila with description of fifteen new
species. PhD Thesis, Universidade do Brasil, Rio de
Janeiro.
f) Tables each table must start on a new page. A
concise title should be provided above the table.
Tables must be numbered consecutively in Arabic
numerals. Each column must have a title in the box
head. Footnotes, typed directly below the table,
should be indicated in lowercase superscript
numbers.
g) Figures must be numbered consecutively in
Arabic numerals. Legends should be typed on a
separate sheet. Three sets of illustrations of the
highest quality must be provided, one original and
two copies in glossy paper. If you have created
figures electronically, submit them also as hard
copies. Scanned figures should not be submitted.
Images should be in TIF or JPG format and
provided in separate files. Figures in Word format
cannot be published. Journal quality reproduction
will require grayscale and color at resolution
yielding 300 ppi. Authors should submit bitmapped
line art at resolution yielding 600–1200 ppi. These
resolutions refer to the output size of the file; if it
is anticipated that images will be enlarged or
reduced, the resolutions should be adjusted
accordingly. Identify each illustration by affixing on
the back a label containing: the number of the
figure, the name of the first author, and an arrow
indicating top of illustration. Illustrations supplied
on disks must follow instructions in item 2
(Submission package). Color illustration can be
accepted, but authors are asked to defray the cost.
For costs of color figures, check with the Editorial
Office.
h) Nomenclature: current standard international
nomenclature should be adhered to.
Caracterização Genética de Isolados...
i) Sequences may appear in text or in figure. DNA
must be sequenced on both strands. DNA, RNA , or
protein sequences equal to or greater than 50 units
must be entered into appropriate data bank and
the accession number must be provided before
publication of the article. Long sequences requiring
more than two pages to reproduce will not be
published unless the Editorial decision is that the
publication
is
necessary.
Complete
mtDNA
sequence will not be published.
j) Data access: reference should be made to
availability of detailed data and materials used for
reported studies.
k) Ethical issues: Reports of experiments on live
vertebrates must include a brief statement that the
work was approved by the institutional review
board. For experiments involving human subjects,
authors must also include a statement that
informed consent was obtained from all subjects. If
photos or any other identifiable data are included,
a copy of the signed consent must accompany the
manuscript.
3.2 Short Communications present brief
observations that do not warrant full-length
articles. They should not be considered preliminary
communications. Their format is that of full-length
article. The text must be kept to a minimum.
3.3 Letters to the Editor relate or respond to
recent published items in the journal. Discussions
of political, social and ethical issues of interest to
geneticists are also welcome in this form.
3.4 Review Articles are welcome.
3.5 Book Reviews: publishers are invited to
submit books on Genetics, Evolution and related
disciplines, for review in the journal.
3.6 History, Story and Memories: accounts on
historical aspects of Genetics relating to Brazil.
4. Proofs: Page proofs will be sent to the
corresponding author. Changes made to page
proofs, apart from printer’s errors, will be charged
to the authors. Notes added in proof require
Editorial approval.
93
Lyra, Juliana Maria Azevedo de
Caracterização genética de isolados virais da dengue. /
Juliana Maria Azevedo de Lyra. – Recife: A Autora, 2008.
93 fls. .: il.
Dissertação (Mestrado em Genética) – UFPE. CCB
1. Dengue clássica 2. Dengue hemorrágica 3. Filogenia
I.Título
616.9
614.58852
CDU (2ª. Ed.)
CDD (22ª. Ed.)
UFPE
CCB – 2008 – 123