Mariana Moreira IDENTIFICAÇÃO DE CONSÓRCIO BACTERIANO

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
EM ENGENHARIA AMBIENTAL
Mariana Moreira
IDENTIFICAÇÃO DE CONSÓRCIO BACTERIANO COM POTENCIAL
PARA BIORREMEDIAÇÃO DE ARSÊNIO E SULFATO.
Autora: Mariana Moreira
Orientadora: Profa. Dra. Mônica Cristina Teixeira
Co-orientadora: Profa. Dra.Silvana de Queiroz Silva
Ouro Preto, MG
Abril de 2013
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO ENGENHARIA
EM ENGENHARIA AMBIENTAL
IDENTIFICAÇÃO DE CONSÓRCIO BACTERIANO COM POTENCIAL
PARA BIORREMEDIAÇÃO DE ARSÊNIO E SULFATO.
Dissertação
apresentada
ao
Programa
de
Pós-
Graduação em Engenharia Ambiental da Universidade
Federal de Ouro Preto, como parte dos requisitos
necessários para a obtenção do título: “Mestre em
Engenharia Ambiental – Área de Concentração:
Tecnologia Ambiental”.
Ouro Preto, MG
Abril de 2013
i
M838i
Moreira, Mariana.
Identificação de consórcio bacteriano com potencial biotecnológico para
biorremediação de arsênio e sulfato [manuscrito] / Mariana Moreira – 2013.
x, 70 f. : il., color.; tab.; mapas.
Orientadora: Profª Drª Mônica Cristina Teixeira.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto
de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas e Pós-Graduação em
Recursos Hídricos. Programa de Pós-graduação em Engenharia Ambiental.
Área de concentração: Tecnologias Ambientais.
1. Biorremediação - Teses. 2. Arsênio - Teses. 3. Sulfatos - Teses.
4. Bactérias - Teses. I. Teixeira, Mônica Cristina. II. Universidade Federal de
Ouro Preto. III. Título.
CDU: 628:579.846.2
Catalogação: [email protected]
CDU: 669.162.16
“Enquanto estivermos tentando, estaremos felizes, lutando pela
definição do indefinido, pela conquista do impossível, pelo limite
do ilimitado, pela ilusão de viver. Quando o impossível torna-se
um desafio, a satisfação está no esforço, e não apenas na
realização final”
Gandhi.
ii
A Deus e a tudo o que Ele representa em minha vida.
Aos meus queridos pais, Elenita e Adelson,
ao meu irmão Júnior e ao meu esposo Carlos meus maiores
tesouros, exemplos de simplicidade, força de
vontade e luta. A vocês todo meu trabalho,
dedicação e amor.
iii
Agradecimentos
Primeiramente gostaria de agradecer a Deus por proporcionar inúmeras
oportunidades, por iluminar meus passos e facilitar minha trajetória dentro da
universidade, sempre apresentado solução nos momentos difíceis.
A professora orientadora Mônica Cristina Teixeira por ter me acolhido em seu
laboratório, por toda confiança depositada em mim nestes anos de trabalho. Obrigada
pela orientação, pelas excelentes discussões científicas e profissionais, pelos conselhos,
pelo apoio intelectual e profissional. Obrigada por acreditar em mim e no meu trabalho.
A professora co-orientadora Silvana de Queiroz Silva por me receber em seu
Laboratório. Obrigada pelas excelentes discussões, e por ter me ensinado a fazer alguns
experimentos.
Agradeço as minhas colegas de trabalho do laboratório de Biotecnologia
Ambiental, Patrícia Freitas e Letícia Paiva pela amizade construída e pela ajuda
incondicional. Obrigada por terem me ajudado nos primeiros experimentos, pelas
constates discussões a cerca dos resultados.
A toda equipe do Laboratório de Biologia e Tecnologia de Micro-organismos DECBI/UFOP: professores, alunos e técnicos. Em especial a aluna Júlia por ter
dedicado parte do seu tempo para me ajuda nos experimentos, na produção dos
reagentes, pelo companheirismo, enfim, obrigada por tudo.
Agradeço também a Keice, Natália e a Izabel pela amizade construída, e por ter
de alguma forma me ajudado, seja com os ensinamentos repassados, ou com os
reagentes emprestados.
A toda minha família, que sempre me apoiaram e em particular aos meus pais
Adelson e Elenita e ao meu irmão Júnior pelo apoio e carinho em todos os momentos.
Agradeço também o meu marido Carlos César pelo incentivo, atenção, e pela ajuda
constante nas horas difíceis.
Agradeço também ao Programa de Pós Graduação em Engenharia Ambiental,
PROAMB, e a todos os professores pelo suporte e por complementar minha formação.
À Capes, pela concessão da bolsa e à Fapemig e ao CNPq pelos financiamentos
do projeto.
iv
Sumário
AGRADECIMENTO
iv
SUMÁRIO
v
LISTA DE FIGURAS
vii
LISTA DE TABELAS
viii
RESUMO
ix
ABSTRACT
x
1.
Introdução
1
2.
Objetivos
3
2.1
Objetivos Gerais
3
2.2
Objetivos Específicos
3
3.0
Revisão Bibliográfica
4
3.1
Arsênio
4
3.2
Tratamento de águas contaminadas por arsênio
7
3.3
Remoção do sulfato de águas contaminadas
9
3.4
Bactérias redutoras de sulfato
17
3.5
Biorremediação de áreas contaminadas por metais
20
3.6
Identificação molecular de micro-organismos
21
4.
Materiais e Métodos
25
4.1
Área de coleta
25
4.2
Cultivo das amostras
26
4.3
Avaliação da resistência da composição microbiológica do sedimento
27
coletado ao arsênio
4.4
Identificação microbiana pelo método PCR-DGGE
30
4.4.1Preparação das amostras
30
4.4.2 Extração de DNA das amostras
30
4.4.3 Amplificação do DNA por PCR
31
4.4.4 Eletroforese em Gel de Gradiente Desnaturante (DGGE)
32
4.4.5 Análise das sequências genômicas
34
4.5
Caracterização e identificação dos precipitados formados
34
5.
Resultados e Discussão
37
5.1
Enriquecimento e adaptação das amostras
37
5.2
Efeito da concentração do arsênio no crescimento do consórcio bacteriano
39
v
5.3
Variação do Potencial de redução e pH inicial do meio
41
5.4
Identificação microbiana
42
5.4.1. Eletroforese de gel de agarose (DGGE)
43
5.5
Caracterização do precipitado formado
51
6.
Conclusões
55
7.
Perspectivas futuras
57
8.
Referências Bibliográficas
58
9
Apêndices
69
vi
Lista de Figuras
Figura 3.1
Representação esquemática do ciclo do enxofre.
10
Figura 3.2
Representação esquemática da redução assimilativa do sulfato.
15
Figura 3.3
Representação esquemática da transferência de elétrons na 16
redução dissimilativa do sulfato, com compostos carbônicos como
fonte de energia e sulfato como aceptor de elétrons.
Figura 4.1.
Vista da lagoa do Gambá, cidade de Ouro Preto – MG.
Figura 4.2.
Esquema envolvendo os processos de enriquecimento, adaptação e 28
fase dos ensaios de remoção de sulfato e arsênio, realizados neste
trabalho.
Figura 5.1.
Ensaio de adaptação do consórcio bacteriano ao cultivo. (a) Início 38
do cultivo e (b) meio de cultura enegrecido devido à formação de
sulfeto ferroso, resultado do crescimento da cultura.
Figura 5.2.
Enriquecimento do consórcio bacteriano nas amostras em meio 39
líquido Postgate C“modificado”. (a) Enriquecimento e cultivo das
amostras e (b) crescimento das culturas de BRS.
Figura 5.3.
Variação do potencial de redução do meio no cultivo em presença
de arsênio.
Figura 5.4.
Gel de DGGE, com gradiente desnaturante de 40%-60%, corado em 44
brometo de etídio contendo fragmentos de DNA ribossomal 16S
amplificados com primer universal 968FCG/1392R domínio
Bacteria.
Figura 5.5
Árvore filogenética contendo sequências do gene DNAr 16S (1376 48
pb) construída pelo método Neighbor-Joining e modelo Maximum
Composite Likelihood no programa Mega 4.1. Análise de Bootstrap
com 1000 réplicas.
Figura 5.6
Imagem no MEV do precipitado presente nas amostras. A) Amostra 54
1 com 0,0 g/L-1 de arsênio. B) Amostra 3 com 1,0 g/L-1 de arsênio.
C) Amostra 4 com 2,0 g/L1 de arsênio. D) Amostra 5 com 4,0 g/L-1
de arsênio, E) Amostra 6 com 8,0 g/L-1 de arsênio. F) Amostra 7
com 16,0 g/L-1 de arsênio.
25
42
vii
Lista de Tabelas
Tabela 4.1.
Composição do meio de cultura Postgate C modificado por Cheung 26
e Gu (2003).
Tabela 4.2.
Concentração de As3+ em diferentes amostras
28
Tabela 4.3.
Componentes utilizados na reação de PCR
32
Tabela 5.1.
Tempo de escurecimento do meio em relação à concentração de 40
As(III)
Tabela 5.2.
Distribuição das bandas de material genômico em diferentes 45
condições experimentais.
Tabela 5.3.
Alinhamento das bandas com as sequências depositadas no 46
GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov) para os fragmentos amplificados
pelos primers bacterianos universais (968F-GC 1392R).
Tabela 5.4.
Propriedades das espécies identificadas
47
viii
Resumo
A contaminação ambiental por metais pesados e sulfato tem sido objeto de diversas
discussões e iniciativas. O arsênio é tóxico para a maioria dos seres vivos e pode
provocar intoxicações agudas e crônicas em função do tempo de exposição. Dessa
forma é necessário o desenvolvimento de metodologias eficientes e economicamente
viáveis para a remoção desse elemento em efluentes ou águas residuais. Os métodos
biológicos surgem como uma alternativa aos métodos convencionais. O objetivo do
trabalho é identificar o consórcio bacteriano, presente em amostras de bactérias
coletadas na Lagoa Gambá no município de Ouro Preto capazes de metabolizar o
sulfato e arsênio. Após a coleta, as amostras foram cultivadas em frascos contendo meio
de cultura líquido Postgate C modificado apropriado para cultivo de bactérias redutoras
de sulfato (BRS). Para avaliar a resistência dos consórcios bacterianos ao arsênio, foram
utilizadas seis concentrações diferentes: 0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 8,0 e 16 mg.L-1 de arsênio
trivalente. O potencial de oxi-redução (Eh) do meio foi escolhido como parâmetro de
acompanhamento indireto do crescimento das culturas. Alíquotas de 100 ml de cada
amostra foram centrifugadas e armazenadas a -20° C para extração de DNA pelo
método fenol/clorofórmio. Para amplificação do DNA ribossomal 16S foram utilizados
os primers universais com iniciadores 968F-GC 1392R para o Domínio Bacteria. Para
análise da diversidade microbiana presente nas amostras, utilizou-se a técnica de
DGGE. Em todas as amostras foi possível observar o crescimento de micro-organismos
e redução do sulfato evidenciada pela formação de precipitado negro de sulfeto de ferro
e diminuição dos valores do Eh. Foi possível obter extração de DNA a partir de todas as
amostras estudadas. O resultado do DGGE com os produtos de amplificação geraram 7
bandas diferentes, que foram recortadas, sequenciadas e analisadas no Ribossomal
Database Project Release. Os micro-organismos identificados apresentaram 100% de
similaridade com as espécies de Pantoea agglomerans, Enterobacter sp e Citrobacter
sp, e 99% de similaridade com as espécies Cupriavidus metallidurans, Ralstonia sp e
Burkholderia cepacia. Dessa forma o consórcio microbiano identificado neste estudo é
bom candidato para o emprego em processos de biorremediação de áreas e efluentes
contaminados por arsênio, uma vez que possui resistência ao arsênio e é capaz de
promover a redução de sulfato a sulfeto e, em consequência, a precipitação do As.
ix
ABSTRACT
Environmental contamination by heavy metals and sulphate has been the subject of
many discussions and initiatives. Contamination by arsenic can cause gastrointestinal
problems such as nausea. Additionally, the arsenate competes with phosphate for the
active sites of enzymes fosforilatives, common to all living beings and is essential to the
metabolism of glucose. Thus it is necessary to develop efficient and economically
viable methodologies for removal of this element. Biological methods appear as an
alternative to conventional methods. The objective was to identify one bacterial
consortium adapted to the culture in the presence of trivalent arsenic (AsIII). Samples
were cultured in flasks containing modified Postgate C liquid medium (selective for
sulfate-reducing bacteria, SRB). Six different concentrations of As were used: 0.5, 1.0,
2.0, 4.0, 8.0 and 16 mg l-1. The redox potential (Eh) of the medium was chosen as an
indirect growth parameter. 100 ml aliquots of cultured media were centrifuged and
stored
at
-20°C
for
DNA
extraction.
DNA
extraction
was
obtained
by
phenol/chloroform method. Universal primers 968F-GC 1392R (Bacteria domain) were
used for 16S ribosomal DNA amplification. Microbial diversity was evaluated by
DGGE. The growth of sulfate reducing microorganisms was indirectly observed by the
formation of a black precipitate of iron sulfide and also by the decreasing on Eh. After
DGGE analysis 7 different bands were selected, cut, sequenced and analyzed in the
Ribosomal Database Project Release. Consortium microorganisms identified were:
Pantoea agglomerans, Enterobacter sp and Citrobacter sp (100% similarity); and also
Cupriavidusmetallidurans, Ralstonia sp and Burkholderia cepacia (99% similarity).
Thus the microbial consortium identified here is a good candidate for bioremediation of
arsenic contaminated areas and effluents, since they possess resistance to this element
and are capable of promoting the reduction of sulfate to sulfide and, consequently, the
precipitation of As(III).
x
1. Introdução
Diversas indústrias, como as de processamento de metais, geram efluentes
contendo metais e outros poluentes inorgânicos como o sulfato. Estes efluentes são
altamente prejudiciais para o ambiente e para o homem, dado que os metais podem
acumular ao longo das cadeias alimentares. Sendo assim, devem ser tratados antes de
serem lançados no ambiente (HIGGINS et al., 2003). Os processos de remoção de
metais pesados geralmente utilizados, como a precipitação química, a troca iônica ou a
separação por membranas apresentam por vezes restrições de ordem técnica (não sendo
eficazes para a diminuição do sulfato) ou econômica pelo elevado custo. Desta forma,
os processos biotecnológicos representam uma alternativa de tratamento com custos
mais reduzidos e mais eficientes na remoção destes compostos (CARLOS et al., 2007).
Nas últimas décadas, houve uma crescente conscientização, a nível global, sobre
o uso racional dos recursos naturais e o desenvolvimento de tecnologias menos
impactantes ao meio ambiente. O modelo atual de “desenvolvimento sustentável” tem
gerado uma série de discussões multidisciplinares entre pesquisadores, acadêmicos e
sociedade devido à dificuldade em se estabelecer um equilíbrio entre o crescimento
econômico e populacional sem comprometer o ambiente natural (BARBOSA, 2009). A
contaminação ambiental por metais e sulfato tem sido objeto de diversas discussões e
iniciativas. As águas residuais das indústrias de mineração e metalurgia são
consideradas como as principais fontes de contaminação ambiental por metais como o
arsênio (SMEDLEY & KINNIBURGH, 2002). Níveis de arsênio relativamente altos
são também encontrados ocasionalmente em fontes de água de abastecimento
municipais superficiais e subterrâneas, possivelmente devido à lixiviação de minerais
associados aos depósitos minerais. O íon sulfato ocorre na natureza em decorrência de
processos biogeoquímicos e também pelo lançamento de efluentes de diversos
processos industriais, uma vez que vários processos produtivos são responsáveis por
altas cargas de sulfato em seus efluentes (LENS, 1998).
A maior parte dos compostos contendo arsênio, sejam eles orgânicos ou
inorgânicos, acaba sendo convertida em trióxido de arsênio, o qual reage muito
rapidamente com os grupos sulfidrilas (-SH) de proteínas, inibindo a ação de enzimas
1
que contenham estes grupamentos em seus sítios ativos, bloqueando a respiração celular
(TSALEV & ZAPRIANOV, 1985). Segundo Hughes (HUGHES 2002) a contaminação
por arsênio pode provocar problemas gastrointestinais como naúseas. Além disso, o
arsenato compete com fosfato pelos sítios ativos das enzimas fosforilativas, comuns a
todos os seres vivos e essenciais ao metabolismo da glicose.
Com relação ao sulfato, sua presença na água pode causar gosto amargo,
provocar diarreia e desidratação, tanto no homem quanto nos animais e ainda causar
problemas de corrosão em tubulações (LENS, 1998).
Em vista disso, torna-se necessário o desenvolvimento de metodologias
eficientes e economicamente viáveis para o tratamento e remoção desses elementos.
Garantir a qualidade da água de consumo, no que diz respeito aos teores de arsênio e
demais metais tóxicos é, portanto, condição necessária à manutenção da saúde das
populações.
A utilização de técnicas de biologia molecular na identificação de microorganismos para estudos de biotecnologia e biorremediação vem se destacando na
última década. Os micro-organismos representam o maior reservatório de diversidade
genética e bioquímica do planeta. Apesar de sua grande importância na manutenção da
biosfera, estima-se que menos de 10% dos micro-organismos existentes no planeta
tenham sido caracterizados e descritos (STALEY, 1998).
O grupo das bactérias redutoras de sulfato é bastante difundido na natureza
podendo ser encontrado tanto no ambiente aquático quanto no ambiente terrestre, mas
ocorre principalmente em sedimentos, onde as condições redutoras são mais favoráveis.
Estas oxidam compostos orgânicos simples (CH2O), acetato e lactato e reduzem
compostos oxidados de enxofre produzindo sulfeto de hidrogênio e íons bicarbonato
causando, em geral, a precipitação dos metais e a neutralização do pH do meio aquoso
(LENS, 1998).
Neste contexto, o presente trabalho buscou identificar micro-organismos
coletados em sedimentos da Lagoa do Gambá no município de Ouro Preto–MG,
capazes de remover simultaneamente sulfato e arsênio em ensaios de laboratórios.
Dessa forma os métodos biológicos surgem como uma alternativa aos métodos
convencionais, físico-químicos no tratamento de águas subterrâneas, superficiais e
efluentes industriais que apresentam arsênio e sulfato.
2
2. Objetivos
2.1 Gerais
Cultivo e identificação de um consórcio bacteriano tolerante ao arsênio e capaz
de reduzir sulfato.
2.2 Específicos

Avaliar a capacidade de crescimento do consórcio bacteriano em
diferentes concentrações de arsênio utilizando meio Postgate C modificado, e como
fonte de carbono o lactato de sódio.

Verificar a influência da adição de um meio suporte sólido no (pó de
penas de galinhas) no crescimento microbiano

Comparar e identificar as bactérias nos diferentes ensaios pela técnica
PCR-DGGE.

Caracterizar o perfil filogenético dos fragmentos amplificados 16s DNA
do consórcio bacteriano obtido.

Avaliar a dinâmica bacteriana em ensaios com adições crescentes de
arsênio pela técnica PCR-DGGE

Identificar os precipitados formados e os possíveis mecanismos de
bioimobilização a partir da análise dos precipitados por meio de microscopia
eletrônica de varredura.
3
3. Revisão bibliográfica
3.1 Arsênio
A despeito das fontes naturais de contaminação por arsênio, como, os fenômenos
geotermais e vulcânicos, a poluição por metais é causada principalmente pelas
atividades industriais e da agricultura (BORBA et al., 2004), e pela própria atividade de
mineração. No Brasil, o arsênio é amplamente encontrado no meio industrial, como
resíduo, especialmente das indústrias de processamento metalúrgico de ouro, cobre,
prata, zinco e cobalto. Este elemento é empregado ainda como matéria-prima na
manufatura de vidros, esmaltes, tintas, tecidos e couros e na produção de insumos
agrícolas tais como inseticidas, formicidas, herbicidas e preservativos de madeira. O
consumo de arsênio pela indústria é, entretanto, insignificante diante das enormes
quantidades desse elemento produzidas como resíduos industriais (TEIXEIRA, 2005).
O arsênio ocorre no meio ambiente nos estados de oxidação -3, 0,+3 e +5, sendo
a forma trivalente dez vezes mais tóxica que sua forma pentavalente, e ainda apresenta
uma mobilidade no meio ambiente significativamente maior (RAWLINS et al., 1997).
O arsênio é altamente tóxico, mesmo em baixas concentrações para plantas e
mamíferos (MCBRIDE, 1989). A exposição humana a arsênio pode resultar em
desenvolvimento de câncer de pele, de pulmão, de fígado, de bexiga e rins (BASU et
al., 2001).
A inalação de arsênio pode causar principalmente carcinomas de pulmão. Uma
vez ingerido, produz sintomas de irritação gastrointestinal e náuseas. Em longo prazo, a
ingestão continuada, ainda que de pequenas quantidades deste elemento, leva a
manifestações crônicas cutâneas, doenças do aparelho respiratório, diabetes, distúrbios
vasculares, neurológicos e câncer (TEIXEIRA, 2005).
De maneira geral, cátions de metais pesados interagem com íons ditos
fisiológicos, por exemplo, Cd²+, Ca²+; Ni²+, Co²+, Fe²+ e Zn²+ inibindo a função desses
no organismo. Os oxiânions de metais pesados por sua vez, interferem com o
metabolismo dos íons não metálicos estruturalmente semelhantes, cromato com sulfato
e arsenato com fosfato. O arsenato é, estruturalmente, muito semelhante ao fosfato
4
(PO4³-) e assim, sua principal toxicidade resulta da interferência com o metabolismo
desse maior bioelemento, que é o fósforo. O arsenato compete com fosfato pelos sítios
ativos das enzimas fosforilativas, comuns a todos os seres vivos e essenciais ao
metabolismo da glicose, causando bloqueio ou perda de produtividade em diversas rotas
metabólicas, através da formação de compostos de carboidrato “arsenilados” ao invés
dos intermediários fosfatados esperados. Do ponto de vista funcional, o efeito tóxico do
arsenato, equivale à supressão do aporte nutricional de fosfato (KAUR & ROSEN,
1992).
Com base em todas as evidências que relacionam a ocorrência de efeitos
toxicológicos crônicos e a ingestão de água contaminada por arsênio, vários órgãos
governamentais de controle ambiental recomendam a redução nos limites máximos
admissíveis para arsênio em água potável. A Organização Mundial da Saúde (OMS)
recomendou, em 1993, que o limite de 50 μg.L-1 fosse reduzido para 10μg.L-1. No caso
da Comunidade Européia e do Japão, estes novos valores foram adotados. No Canadá o
limite é de 25μg.L-1 e nos Estados Unidos, após uma resistência inicial em adotar as
recomendações da OMS em função dos custos financeiros envolvidos (SMEDLEY et
al., 2002), a legislação foi alterada. A legislação ambiental brasileira também adotou a
recomendação da OMS e os novos limites passaram a vigorar a partir de dezembro de
2003, (Portaria MS 2.914/2011). O contato direto com água potável contendo
concentrações de arsênio inferior a 50 μg.L-1 foram associados a percussores de câncer
de pele, enquanto que concentrações superiores a este valor têm sido associadas ao
aumento do risco de câncer na bexiga e pulmão. (IPCS, 2001). A dose de Arsênio letal
para
humanos
é
da
ordem
de
0,6
mg/kg/dia
(http:
http://rais.ornl.gov/tox/profiles/arsenic.html) ou de 1-3 mg/kg, em se tratando
exclusivamente de As inorgânico (HUGHES, 2002)
No solo, o arsênio pode ser originário de fontes naturais ou antropogênicas
(pesticidas, herbicidas, fertilizantes), pode ser liberado durante a mineração e fundição
do ouro, chumbo, cobre e níquel, produção de ferro e aço, combustão de carvão
(SMITH et al., 1998); (BAIRD, 2002) e irrigação com água contaminada
(ROYCHOWDHURY et al., 2002).
No Brasil, a mineração de ouro e ferro tem contribuído para a dispersão de
arsênio e sua entrada na cadeia alimentar. Pesquisas realizadas com amostras de água
coletadas em minas subterrâneas, poços artesianos e nascentes das regiões de Ouro
5
Preto e Mariana, apresentaram concentrações de arsênio variando entre 2 a 2.980 µg.L-1,
sendo que, na maioria das amostras, os valores são superiores ao valor máximo
permitido para consumo humano que é de 10 µg.L-1 (BRASIL, 2005) de arsênio
(PIMENTEL et al., 2003). É, portanto, necessária uma avaliação em longo prazo dos
efeitos resultantes dessa contaminação sobre as populações dessas regiões que utilizam,
direta ou indiretamente, água contaminada por arsênio e que estão constantemente
submetidas à absorção, por meio da aspiração, de partículas finas dispersas na poeira.
Do ponto de vista da saúde das populações, em trabalho recente e pioneiro, um grupo de
pesquisadores, brasileiros e alemães, (MATSCHULLAT et al., 2000) realizou um
levantamento epidemiológico sobre os índices de contaminação arsenical em material
biológico, principalmente, urina, de crianças residentes dos municípios de Santa
Bárbara e Nova Lima. Os resultados obtidos indicavam que aproximadamente 45% das
crianças examinadas, com idades ente 7-14 anos, apresentavam níveis de arsênio na
urina de 15-40 μL.L-1, sendo que 20% delas apresentavam índices maiores que
40 μL.L - 1 podendo, portanto, serem classificadas, respectivamente, dentro dos grupos
considerados de médio e alto risco, embora ainda não tenham sido observados os efeitos
fisiopatológicos da intoxicação por esse elemento.
No que concerne à bioquímica do arsênio, sabe-se que o arsênio inorgânico
ingerido é rapidamente absorvido pelo trato gastrointestinal. O As absorvido é
transportado através do sangue, ligado a grupamentos SH das proteínas ou compostos
de baixo peso molecular como a glutationa e a cisteína até os órgãos do corpo,
principalmente o fígado, onde sofre reações de metilação que diminuem sua toxicidade.
A metilação envolve a adição de grupamentos metila, doados pela S-adenosilmetionina,
ao arsênio, apenas em seu estado trivalente.
Os metais representam um fator de estresse à comunidade microbiana presente
no ambiente impactado, podendo, inibir completamente as atividades metabólicas dos
organismos. O arsênio ocorre em diversos estados de oxidação -3, 0, +3 e +5. Em águas
naturais, o arsênio está presente principalmente na forma de compostos inorgânicos,
com valências 3+ e 5+ (LIÈVREMONT et al., 2009). Em meio aquoso, o As pode ser
encontrado sob a forma de arsenito (AsO33-) e arsenato (AsO43-), referindo-se,
respectivamente a espécies trivalentes e pentavalentes. No caso específico do arsênio, os
íons arsenicais tri ou pentavalentes atravessam as barreiras celulares e, ao atingir o
6
interior das células podem interferir em atividades metabólicas essenciais para os
organismos.
Bactérias resistentes ao arsênio possuem um complexo genético de resistência, o
gene arsC, que codifica a enzima As5+ redutase, responsável pela biotransformação de
As5+ em As3+, que por sua vez é transportado para o meio extracelular pela ação das
proteínas transportadoras ArsA e ArsB, codificada pelos seus respectivos genes de
resistência. Como exemplo de micro-organismos que apresentam tais genes, podemos
citar, as espécies Desulfotomaculum auripigmentum que reduz o As5+ em As3+
(NEWMAN et al., 1997), as espécies Staphylococcus aureus e Escherichia coli que
apresentam o gene que confere resistência ao arsênio e capacidade de reduzir o As5+, (JI
et al., 1992). Algumas bactérias têm seus mecanismos de oxidação do As3+ ou redução
do As5+ conhecidos, bem como a geração de energia envolvida nesses processos (LIAO
et al., 2011).
As bactérias que utilizam os íons arsenato no processo de respiração anaeróbia,
(bactérias redutoras de arsenato) apresentam o gene arr que codifica a enzima As5+
redutase que reduz o As5+ a As3+. As bactérias oxidantes de arsenito possuem o gene
aox que codifica a enzima As3+ oxidase, responsável pela oxidação do As3+ a As5+
(LIÈVREMONT, 2009). Recentemente, outro gene que codifica uma As3+ oxidase foi
identificado no micro-organismo Alkalilimnicola ehrlichii, um quimiolitoautótrofo que
oxida arsenito e reduz nitrato simultaneamente (ZARGAR et al., 2010). Muitos estudos
mostraram o sucesso no uso de marcadores genéticos para o estudo dos mecanismos de
transformação do arsênio, como: os genes arsB e arsC contidos no operon que garante a
resistência ao metalóide (ACHOUR et al., 2007), o gene arrA na respiração dissimilatória
do As 5+ e o gene aoxB para oxidação do As 3+ (HAMAMURA et al., 2009).
Dessa maneira pode-se perceber que na natureza, os micro-organismos podem
lidar com toxicidade do arsênio de várias maneiras diferentes, dentre as quais podemos
citar: precipitação, quelação, transformação bioquímica, (TSAI et al., 2009).
3.2 Tratamento de águas contaminadas por Arsênio
As técnicas convencionais empregadas na remoção de metais de efluentes,
industriais são baseadas em precipitação química, trocas iônicas (KEFALA et al.,
7
1999); (KAPPOR & VIRARAGHAVAN, 1995), osmose reversa (KAPPOR &
VIRARAGHAVAN, 1995), oxidação e redução, filtração, tratamento eletroquímico,
evaporação ou, extração por solventes. No entanto, o custo destes processos é muito
elevado (VEGLIO & BEOLCHINI, 1997). Métodos como, precipitação química e
extrações por solventes, empregam uma grande quantidade de reagentes químicos que,
se por um lado solucionam um problema, por outro criam outro relativo aos rejeitos
gerados. Os processos de precipitação química são amplamente utilizados
industrialmente e desempenhados à temperatura e pressão ambientes. Os íons metálicos
em solução são convertidos a hidróxidos insolúveis após a adição de agentes
precipitantes como, os hidróxidos de cálcio ou sódio. Eficiências elevadas de remoção
de metais, na faixa de 94 a 99%, são obtidas no tratamento de despejos contendo íons
cádmio, cobre, cromo trivalente, ferro, manganês, níquel, chumbo e zinco (PALMER,
1988), porém este processo não apresenta capacidade satisfatória de remoção de íons
sulfato.
Outros processos empregados na remoção de metais são a floculação e a
coagulação, nos quais ocorre a adição de um composto químico a fim de facilitar a
sedimentação das partículas sólidas presentes em suspensão. O sucesso do processo está
intimamente relacionado às características de floculação e sedimentação das partículas.
Este processo é amplamente empregado, apresentando eficiências na faixa de 50 a 98%
para remoção de chumbo, zinco, cádmio, manganês, cobre e níquel (PALMER, 1988).
Os processos físicos químicos citados anteriormente na remoção do arsênio,
além de apresentarem alto custo, na maioria das vezes geram outros resíduos sólidos e
por isso há um grande interesse nos processos biotecnológicos que utilizam as bactérias
redutoras de sulfato (BRS) visto que o sulfeto produzido pelo metabolismo desses
microrganismos é capaz de se ligar à cátions metálicos, bi e trivalentes produzindo os
sulfetos metálicos correspondentes.
Dentre as bactérias capazes de sobreviver em ambientes com alta concentração
de arsênio, podemos citar as que pertencem ao gênero Desulfosporosinus,
(BATTAGLIA-BRUNET et al., 2012). Pseudomonas mendocina, Pseudomonas
stutzeri, Pseudomonas pseudoalcaligenes, Pseudomonas aeruginosa e Azoarcus sp, são
resistentes a alta concentração de arsenito, bem como são capazes de oxidá-lo,
(KRUMOVA et al., 2008). Bactérias do gênero Clostridium sp. são tolerantes a
concentrações de arsênio superiores a 40mM, (STOLZ et al., 2006).
8
A utilização dos micro-organismos apresentam vantagens em relação às
propriedades químicas dos hidróxidos metálicos (LENS et al., 2007), pois os sulfetos
metálicos, em geral, tem solubilidade muito limitada e podem ser recuperados e
reutilizados. Algumas indústrias já vêm aplicando a imobilização de metais através da
formação de sulfetos metálicos após a redução de sulfato.
A precipitação do arsênio na forma de sulfetos pelas BRS vem sendo estudada com
o objetivo de retirar este elemento perigoso de efluentes. ( TECLU et al., 2008), em seu
trabalho de biorremediação de águas contaminadas por arsênio, obteve crescimento de
BRS utilizando o melaço como fonte de matéria orgânica necessária para o seu
crescimento. A tolerância ao arsênio pelas BRS foi testada utilizando-se soluções de
arsenito e arsenato.
Outras alternativas para remoção de arsênio em águas contaminadas são
discutidas pro Lizama (LIZAMA et al., 2011) e Neculita (NECULITA et al.,2007), O
primeiro discutea construção de “Wetlands” (alagados artificiais) que apresentam um
grande potencial para remoção de metais, em geral, e arsênio. A remoção pode ocorrer
por precipitação e adsorção sendo influenciada por fatores ambientais tais como pH,
presença de outros constituintes químicas e a presença de micro-organismos redutores,
responsáveis por manter um valor de potencial redox do meio menor que – 200mV
levando à precipitação do arsênio sob a forma de sulfetos arsenicais insolúveis. O
segundo autor discute a remoção do arsênio de drenagens ácidas de minas (DAM)
utilizando biorreatores e suas limitações devido ao fato de ainda não ter sido
devidamente elucidado o mecanismo de remoção poderia se dar tanto por adsorção
quanto por co-precipitação com outros metais, ou ainda pela remoção na forma de
sulfetos de arsênio que pode ocorrer em ambientes redutores.
3.3 Remoção do sulfato de águas contaminadas.
As BRS são responsáveis por reduzir, metabolicamente, íons sulfato ou outras
espécies oxidadas do enxofre (sulfito, tiosulfato ou enxofre elementar), a sulfeto de
hidrogênio, (GIBSON, 1990). A redução biológica do enxofre pode estar associada à
respiração anaeróbia do sulfato, havendo armazenamento de energia celular a partir da
oxidação de um substrato (MADIGAN et al., 2004). Durante seu metabolismo, o sulfato
é transportado para o interior da célula através da membrana citoplasmática, (KRAMER
9
& CYPIONKA, 1995), um esquema resumindo o ciclo do enxofre e a participação dessas
bactérias está representado na figura 3.1.
Figura 3.1. Representação esquemática do ciclo do enxofre.
Fonte: Extraído e adaptado de Tang et al. (2009).
Os compostos orgânicos, podem tanto ser utilizados como fontes de elétrons, ou
seja, fonte de energia, quanto como fonte de carbono para a biossíntese celular pelos
micro-organismos heterotróficos, aqueles que necessitam de fontes orgânicas de
carbono e energia. A grande maioria das Bactérias Redutoras de Sulfato (BRS) é
heterotrófica entretanto, algumas espécies utilizam H2 como fonte de energia e podem
ainda utilizar o CO2 dissolvido no meio como fonte de carbono, sendo consideradas,
portanto, autótrofas (MADIGAN et al., 2004).
A utilização de substratos orgânicos por estes micro-organismos pode se dar de
duas formas distintas, levando a sua oxidação completa ou incompleta. Assim o lactato
10
de sódio, um substrato amplamente utilizado pelas BRS, pode seguir duas vias de
oxidação representadas pelas reações 3.5 e 3.6, (GIBSON, 1990). Algumas espécies
podem oxidá-lo completamente até CO2, mineralizando-o, ou parcialmente,
convertendo-o a acetato. Essas distinções se referem a grupos fisiológicos e não
sistemáticos (MARTIN et al., 2009).
2CH3CHOHCOO- + SO42-
2CH3CHOO- + 2HCO3 + HS- + H+
(Reações. 3.5)
ΔG0´= - 160kJ/mol sulfato
2CH3CHOHCOO- + 3SO42-
6HCO3 + 3HS- + H+
(Reações. 3.6)
ΔG0´= - 85kJ/mol sulfato
O íon sulfato ocorre na natureza em decorrência de processos biogeoquímicos
que fazem parte do ciclo do enxofre e também em efluentes resultantes de diversos
processos industriais, uma vez que vários processos produtivos como, galvanoplastia,
indústria de papel e celulose, pigmentos industriais, borracha, explosivos, fertilizantes e
a mineração/metalurgia são responsáveis por altas cargas de sulfato em seus efluentes.
(LENS, 1998); (SARTI et al., 2008).
A resolução CONAMA 357/2005 (BRASIL, 2005) não determina padrões de
lançamento de sulfato em corpos hídricos, dispõem apenas sobre o os teores deste íon
nos corpos receptores, os quais não devem apresentar concentração de sulfato maior que
250mg.L-1. Lembrando que o lançamento de efluentes não deve descaracterizar o corpo
receptor, portanto, um efluente contendo sulfato quando lançado em um corpo hídrico
não deve torná-lo com uma concentração maior que 250mg.L-1. Os processos físicoquímicos utilizados para remoção de sulfato incluem desde alternativas de baixo custo,
como a precipitação com sais de cálcio, a processos mais caros como osmose reversa,
eletrodiálise e nanofiltração (SARTI et al., 2008). Os processos de precipitação podem
ser executados com compostos de cálcio, chumbo, bário, alumínio, entre outros.
Entretanto, estas opções podem apresentar sérios problemas. A utilização de chumbo e
bário, dois metais pesados, para remover sulfato é claramente desaconselhada. A
precipitação com cálcio forma gesso (CaSO4.2H2O), que é relativamente solúvel em
água. Além disso, estes processos geram grande quantidade de resíduos sólidos (lodo),
devido à quantidade de reagente empregada e os resíduos devem ser adequadamente
dispostos, gerando outro problema ambiental (SILVA et al., 2002). Os demais
11
processos têm o custo proporcional à concentração de sulfato, de forma que altas
concentrações chegam a inviabilizá-los. Em vista disto, os processos biológicos de
remoção de sulfato têm se tornado bastante atrativos (KAKSONEN et al., 2003).
A principal rota de remoção de enxofre em ambientes aquáticos ou alagados é por meio
da redução biológica do sulfato a sulfeto, processo realizado pelas Bactérias Redutoras
de Sulfato (BRS) (GIBSON, 1990), dentre elas a espécie Geobacter metallireducens
(NEVIN et al., 2000). Além dessa espécie alguns dos membros da família
Enterobacteriaceae, já foram identificados como sendo capazes de realizar o
metabolismo de redução de sulfato (QIU et al., 2008) e (SAHRANI et al., 2008) .
Cabrera et al. (2006) descreveram uma cepa de D. vulgaris com potencial de 40% de
redução de sulfato. A família Thermodesulfobiacea apresenta um único gênero,
Thermodesulfobium, capaz de crescer quimioautotroficamente com H2/CO2 com
sulfato como aceptor de elétrons (Mori et al., 2003). As Archaeas termófilas constituem
dois grupos de microrganismos redutores de sulfato, classificados como filos
Euryarchaeota
e
Crenarchaeota.
Porém
as
famílias
Desulfovibrionaceae
e
Desulfobacteriaceae agrupam a maioria das espécies que fazem a redução do sulfato e o
gênero mais estudado deste grupo é o Desulfovibrio, devido principalmente a sua ampla
distribuição geográfica e facilidade de cultivo em condições laboratoriais (Scheid e
Stubner, 2001).
O metabolismo das BRS é dependente da redução de sulfato, e este processo
inicia-se após a entrada do sulfato endógeno no interior da célula. Uma vez dentro da
célula a redução do sulfato se dá pela ação da ATP sulfurilase que se liga ao sulfato e
ao ATP produzindo adenosina fosfossulfato (APS), bem como pirofosfato, que pode ser
clivado posteriormente a fosfato inorgânico. O APS é então rapidamente convertido em
sulfito (SO3-) pela enzima citoplasmática APS redutase (CYPIONKA, 1995).
O sulfito pode ser reduzido a sulfeto por diferentes sulfito redutases. Dentre as
enzimas mais conhecidas estão bissulfito redutase, desulfoviridina e desulforubina (LEE
et al., 2008). A redução assimilativa do sulfato, na qual ocorre o transporte do sulfato
pela membrana para o interior da célula, apresenta as seguintes etapas descritos abaixo e
ilustrados na figura 3.2.

Inicialmente o sulfato é transportado unidirecionalmente para o
citoplasma a partir de proteínas de membranas localizadas no periplasma bacteriano
(SIRKO et al., 1990).
12

Este transporte de sulfato intracelular é facilitado por um sistema de
transporte tipo ABC, que requer gasto energético, envolvendo a utilização de 1 mol de
ATP por mol de sulfato transportado. O sulfato é fosforilado a adenosina-5`fosfosulfato (APS) pela ATP sulfurilase, consumindo energia (ATP) e produzindo
pirofosfato (PPi) (KRAMER & CYPIONKA, 1995).

A APS formada pode ser reduzida a sulfeto por duas vias, dependendo
das características bioquímicas do organismo (GILMORE et al., 1989): uma via de
redução direta de APS (via APS) e uma via de fosforização a 3’-fosfoadenosina -5´fosfosulfato (via PAPS) . A via para síntese de cisteína a partir da APS pelos
procariotas, fungos e organismos fotossintetizante é peculiar a cada grupo, em algumas
espécies podem ser empregadas ambas as vias (KOPRIVA & KOPRIVOVA, 2005).
Contudo, a via PAPS é comumente utilizada pelos procariotas para a assimilação de
sulfato (BICK et al., 2000).

A redução direta de APS a sulfito é realizada a partir da doação de
elétrons de um grupo tiolato. Neste mecanismo, um ânion tiolato (glutationina ou
tireodoxina) se liga ao grupo sulfonato da APS, para produzir tiossulfonato orgânico e
AMP (RABUS, 2006). O tiosulfonato orgânico é reduzido a sulfito e posteriormente a
sulfeto por uma sulfito redutase (KOPRIVA & KOPRIVOVA, 2005).

Na via de formação de PAPS um grupo fosforila é envolvido em uma
reação catalisada por uma APS quinase, produzindo PAPS e ADP . A PAPS é reduzida
a sulfito pela PAPS redutase, produzindo adenosina-3’-5’-difosfato (PAP como
subproduto) (SEKOWSKA et al., 2000).

Subsequentemente, o sulfito é reduzido a sulfeto por um sulfito redutase
dependente de NADPH. O sulfeto gerado é imediatamente incorporado a síntese do
aminoácido cisteína pela Oacetilserina sulfidrilase, sem perda de sulfeto para o meio
extracelular (SHEN & BUICK, 2004). A cisteína formada será precursora do
aminoácido metionina e de alguns cofatores enzimáticos (como coenzima A), de acordo
com as características metabólicas do organismo.
Já a redução dissimilativa do sulfato, apresenta as seguintes etapas:

Inicialmente ocorre o transporte transmenbrana do sulfato para dentro da
célula a partir de um gradiente iônico, havendo evidências para um sistema de troca
iônica com H+/Na+, a partir de um gradiente de sódio ao longo da membrana celular
13
das BRS (CYPIONKA, 1995). Neste processo não há gasto energético, contudo quando
em baixas concentrações de sulfato no meio, ATP pode ser consumido para produzir um
gradiente iônico favorável para o transporte de sulfato (KREKELER & CYPIONKA,
1995).

A ativação do sulfato ocorre da mesma forma como ocorreu na redução
assimilativa. Havendo produção de adenosina-5’-fosfosulfato (APS), e produção de
pirofostato, que será hidrolisado por uma pirofosfatase. Essa enzima interfere na
atividade da ATP sulfurilase, favorecendo a formação de APS (CYPIONKA, 1995).
Enquanto que APS formado é o aceptor de elétrons imediato, sendo convertido a sulfito
e AMP. Esta reação é catalisada por uma redutase (APS redutase), encontrada em várias
espécies de BRS (KRAMER & CYPIONKA, 1995). O AMP formado é convertido em
duas moléculas de ADP por uma adenil quinase dependente de ATP.
O mecanismo de transferência de elétrons ao sulfito para a formação de sulfeto
pode ocorrer por dois caminhos pela via do tritionato ou pela redução direta de sulfito a
sulfeto (THEBRATH et al., 1989). A via do tritionato promove a redução do sulfito por
três reduções progressivas de 2 elétrons, formando tritionato e tiosulfato como
intermediários. Na redução direta, 6 elétrons são transferidos para sulfito sem formação
de algum intermediário. A redução de sulfito a sulfeto pode estar acoplada a síntese de 3
ATPs (BADZIONG & THAUER, 1978), como ilustrado na figura 3.3.
14
Figura 3.2 – Representação esquemática da redução assimilativa do sulfato.
SHEN E BUICK, 2004.
15
Figura 3.3 – Representação esquemática da transferência de elétrons na redução
dissimilativa do sulfato, com compostos carbônicos como fonte de energia e sulfato
como aceptor de elétrons.
Fonte: Adaptado de MATIAS et al., 2005.
16
3.4 Bactérias redutoras de sulfato
As bactérias redutoras de sulfato (BRS) constituem um grupo morfologicamente
e filogeneticamente heterogêneo que inclui bactérias e arqueobactérias. São bactérias
anaeróbias, mas conseguem sobreviver na presença de oxigênio, maioritariamente gram
negativas, mesofílicas e algumas termofílicas, geralmente não formadoras de esporos.
Segundo (RABUS et al., 2006) existem cinco importantes atributos referentes ao
metabolismo das BRS que são explorados na maioria dos estudos realizados atualmente:
1. O metabolismo de sulfato a sulfeto que é bioquimicamente mais complexo do
que a redução do oxigênio pelas bactérias aeróbias;
2. A ampla variedade de compostos orgânicos que podem ser utilizados pelas
BRS como fontes de carbono e energia;
3. O fluxo que ocorre entre doadores e aceptores de elétrons associado à cadeia
respiratória e que envolve uma grande quantidade de carreadores;
4. A capacidade de alguns grupos de síntese celular utilizando CO₂ durante seu
crescimento na presença de H₂ e sulfato;
5. A regulação do metabolismo, que é o aspecto menos explorado entre os
grupos de BRS.
Bactérias Redutoras de Sulfato é uma designação usual para alguns grupos
bacterianos de vida livre. São organismos que utilizam formas oxidadas de enxofre, ao
invés do oxigênio, como aceptor final de elétrons, produzindo com esta reação o sulfeto,
tal processo é denominado de “respiração do sulfato” ou também de redução
dissimilativa do enxofre (MADIGAN et al., 2009). Essas bactérias fazem parte de um
grupo distinto de micro-organismos presentes em uma grande variedade de ambientes
anaeróbios (KRUMHOLZ et al., 2002).
Estes micro-organismos apresentam características particulares que merecem ser
destacadas tais como: (a) o fato de crescerem em ampla faixa de pH, entre 5,0 e 9,0; (b)
serem, em sua maioria mesófilas, ou seja, sua temperatura ideal de crescimento
encontra-se na faixa de 20ºC a 40ºC; (c) capacidade de utilizar substratos orgânicos
simples como fontes de carbono (etanol, propionato e lactato de sódio). Algumas
espécies podem também utilizar alguns constituintes do petróleo como os alcanos,
17
tolueno, benzeno e hidrocarbonetos poliaromáticos e (d) apresentarem alguma
tolerância ao oxigênio, apesar de serem anaeróbias (LENS, 1998).
A participação das BRS é indispensável nos processos de alteração dos
compostos orgânicos no ciclo geoquímico do carbono (BAUMGARTNER, 2006). As
BRS são as principais responsáveis pela mineralização da matéria orgânica em
sedimentos marinhos, respondendo por aproximadamente 80% da oxidação do carbono
(CANFIELD & THAMDRUP, 1996). A oxidação desses compostos está vinculada a
redução do sulfato nos processos bacterianos de respiração anaeróbia. A presença de
BRS com alta atividade metabólica é facilmente reconhecida pelo enegrecimento da
água ou dos sedimentos devido a precipitação do sulfeto de ferro (FeS), e pelo odor
característico de sulfeto de hidrogênio (H2S).
O crescimento dessas bactérias em cultivos laboratoriais em regime de batelada
é frequentemente não exponencial, raramente referencia-se na literatura seu tempo de
duplicação. No entanto, existem alguns trabalhos, que relatam que micro-organismos
produtores de acetato, como é o caso da maioria das espécies de Desulfovibrio e
Desulfotomaculum, parecem ser capazes de apresentar tempos de duplicação em torno
de 3 a 6 horas ou até menos a 30oC, enquanto aqueles consumidores de acetato, como as
espécies de Desulfobacter, crescem mais lentamente, com tempos de duplicação em
torno de 20 horas (POSTGATE, 1984).
As BRS em condições anaeróbias reduzem o sulfato, presente nos efluentes a
sulfeto que reage com os metais precipitando-os em sulfetos metálicos insolúveis. Este
processo favorece a remoção dos metais pesados numa forma mais estável, juntamente
com a diminuição do sulfato e dos compostos orgânicos dos efluentes, sendo um
processo com baixo consumo energético (HIGGINS et al., 2003; CARLOS et al.,
2007). As BRS contribuem para manutenção da baixa pressão de hidrogênio, pois
podem utilizá-lo como fonte de elétrons podendo favorecer a atividade das bactérias
fermentativas e acetogênicas.
Com a crescente preocupação com relação às questões ambientais, a
investigação de vários aspectos das BRS tornou-se relevante, uma vez que estas são
importantes no ciclo do carbono e do enxofre, em condições anaeróbias (MUYZER &
STAMS, 2008).
18
As BRS apresentam ubiquidade. Essas bactérias são facilmente encontradas em
ambientes marinhos, estuários, sedimentos e lagos salinos ou hipersalinos, por conterem
altas concentrações de sulfato. Porém, já foram encontradas BRS ativas em ambientes
não salinos e em água doce. Também é relatada a presença de BRS em ambientes
poluídos como, plantas de purificação anaeróbia, alimentos deteriorados, plantas de
lodo, águas de campos de exploração de óleo, ambientes contaminados com
hidrocarbonetos e com compostos halogenados, etc, (POSTGATE, 1984; BARTON,
1995). É possível encontrar BRS em ambientes considerados inóspitos como, fontes
hidrotermais e domo de lama vulcânica, onde as temperaturas são bem elevadas
(ELSGAARD et al., 1994); em locais com alta pressão como as fendas oceânicas e
sedimentos marinhos (JEANTHON et al., 2002); em ambientes ácidos como as
drenagens ácidas de mina (JOHNSON, 1995) ou em locais extremamente alcalinos,
como em lagos de soda (PIKUTA et al., 1997). Além de estarem presentes nos
ambientes marinhos, as BRS foram também encontradas em outros ambientes, tais
como, sedimentos de lagos de água doce, apesar de normalmente limitados em sulfato
(SASS et al..,1996; Li et al., 1998). Também têm sido detectadas em ambientes
industriais (JAN-ROBLERO et al., 2004), tratamentos de águas (ITO et al., 2002;
ICGEN et al., 2006; BEN-DOV et al., 2007), em sistemas de aquecimento
(KJELLERUP et al., 2005) e arrefecimento de água de reatores nucleares Estão
presentes também na boca e no intestino de animais (LOUBINOUX et al., 2003). Dada
a sua natureza anaeróbia, normalmente as BRS estão associados a biofilmes anaeróbios
(DAVEY et al., 2000; BEECH, 2003), no entanto foram também detectadas em
ambientes aeróbios, tais como em zonas oxigenadas em comunidades de cianobactérias
(DAR et al., 2008) e em biofilmes que crescem em condições oxigenadas, nos dutos de
tratamento de água (ITO et al., 2002). Esta "tolerância” ao oxigênio é possível devido a
uma variedade de mecanismos, que embora inicialmente descritos apenas para as BRS,
mais tarde se provaram existir na maioria dos organismos anaeróbios. Foi verificado
que as BRS possuem todas as enzimas necessárias para viver em condições de
aerobiose, isto é, em determinadas condições de crescimento, estas bactérias expressam
todos os componentes necessários para a formação de uma cadeia respiratória
membranar, capaz de reduzir completamente o oxigénio a água (MADIGAN et al.,
1997).
19
3.5 Biorremediação de áreas contaminadas por metais.
A biorremediação se baseia num processo tecnológico de remoção da poluição e
restauração da qualidade ambiental por meio da degradação dos poluentes utilizando
micro-organismos de ocorrência natural, como bactérias e fungos (Espósito, 2004).
Várias técnicas de biorremediação têm sido desenvolvidas, e estas técnicas podem ser
classificadas segundo o tratamento e a fase utilizada.
De acordo com o tipo de tratamento, as técnicas de biorremediação são
denominadas in situ, o processo de biodegradação ocorre no local contaminado, e ex
situ o solo ou outro material é retirado e transferido até a unidade de tratamento. Essas
técnicas devem levar em conta os poluentes, o custo dos processos e, principalmente, a
concentração final do contaminante, no término do tratamento, como aceitável para o
tipo de resíduo e para o uso futuro da área (MANCERA-LÓPEZ et al., 2007),
Dentre as várias técnicas de biorremediação desenvolvidas, a bioestimulação é a
mais frequente. Esta técnica consiste na ativação dos micro-organismos nativos por
meio da adição de nutrientes (MANCERA-LÓPEZ et al., 2007), aumentando sua
população, promovendo o crescimento e, consequentemente, o aumento da atividade
metabólica na degradação de contaminantes. Esta técnica tem por objetivo aumentar o
número ou estimular a atividade dos micro-organismos degradadores da comunidade
indígena de uma determinada região contaminada, via adição de receptores de elétrons,
nutrientes ou doadores de elétrons (MANCERA-LÓPEZ et al., 2007).
Paredes celulares de procariontes e de Eucariontes contêm diferentes
polissacarídeos e estruturas aniônicas devido à presença de grupos ionizáveis tais como
carboxilas, hidroxilas e fosfatos. Desta forma a parede celular apresenta grande
potencial para captação de metais pesados. (BEVERIDGE & MURRAY, 1980)
examinaram a captação de uma variedade de metais pela parede celular de Bacillus
subtilis, modificada quimicamente pela adição de grupos ionizáveis, sendo constatada a
complexação, a troca iônica e a precipitação de hidróxidos ou sais na parede celular.
As bactérias possuem uma versatilidade muito grande no que diz respeito aos
processos metabólicos e os ambientes onde vivem. Esses microrganismos são capazes
de sobreviver em condições químicas e físicas extremas, sendo possível encontrá-los
nos mais variados meios (WARREN & HAAK, 2001). Por serem capazes de utilizar
20
outros compostos além do O2 para o processo de respiração, as bactérias influenciam o
comportamento de elementos químicos; como moléculas orgânicas e os metais. Assim,
elas podem ser consideradas como agentes primários das mudanças geoquímicas,
devido ao seu alto potencial metabólico e grande capacidade de adaptação que lhe
confere uma larga e abundante distribuição (WARREN & HAAK, 2001).
O uso de processos biológicos como uma alternativa para o tratamento de águas
residuárias vem ganhando interesse crescente principalmente devido à qualidade do
efluente final tanto para ser descartado no ambiente como para o reuso. Dessa forma as
BRS, quando utilizadas de maneira adequada, podem se tornar grandes aliadas para
tratamento de águas residuárias ricas em sulfato e metais ou águas subterrâneas
contaminadas com metais, dentre eles o arsênio trivalente.
Com o objetivo de avaliar o tratamento de efluentes moderadamente ácidos
contaminados por arsênio, utilizando micro-organismos capazes de reduzir o sulfato
(BATTAGLIA-BRUNET et al., 2012) avaliou um reator de fluxo contínuo, com valor
de pH do meio variando entre 2,5 a 5 que utilizava como doadores de elétrons o glicerol
e o hidrogênio. Foi observada durante o experimento, a precipitação de arsênio
trivalente na forma de sulfetos arsenicais gerados a partir da reação com o sulfeto
produzido pela redução do sulfato pelos micro-organismos presentes no meio de
cultura.
3.6 Identificação molecular de micro-organismos
Nos últimos anos foram feitos esforços consideráveis para o desenvolvimento de
métodos rápidos para a detecção e enumeração de bactérias em ambientes naturais e
industriais. Geralmente esses métodos são divididos em duas categorias: métodos
clássicos e métodos moleculares (BEN-DOV et al., 2007).
Os métodos clássicos, baseados no cultivo de micro-organismos, recorrem à
realização de testes bioquímicos e fenotípicos que auxiliam na identificação das
espécies (AMANN et al., 2001). Esses testes, apesar de terem um custo relativamente
baixo, apresentam algumas desvantagens: i) são demorados devido às taxas lentas de
crescimento bacteriano (BEN-DOV et al., 2007); ii) a necessidade de meios seletivos
para o cultivo e muitas vezes os meios de crescimento laboratoriais não conseguirem
21
refletir exatamente as condições dos locais onde estas bactérias crescem (ZHU et al.,
2003; ICGEN et al., 2006) iii) além disso, a caracterização fenotípica, não fornece
informações sobre as relações evolutivas entre os organismos. Os métodos moleculares,
em oposição aos métodos clássicos, utilizam a caracterização de certos genes do
genoma bacteriano, permitindo a identificação mais eficaz dos microrganismos
responsáveis por determinado processo. Em síntese, os métodos moleculares
apresentam algumas vantagens sobre os clássicos:
a) São as únicas tecnologias que permitem estudar os micro-organismos
não cultiváveis presentes numa comunidade microbiana, sendo mais
sensíveis (KNIGHT, 2000).
b) Em termos moleculares, a diversidade é caracterizada pelo número de
diferentes tipos de sequências de DNA encontradas no ambiente.
c) Os métodos moleculares fornecem informações sobre as relações
evolutivas entre os microrganismos (CASTRO et al., 2000).
O desenvolvimento de novas ferramentas moleculares revolucionou a taxonomia
dos micro-organismos. Segundo (AMMAN et al., 1992), o estudo do gene RNA 16S
ribossomal, apresenta algumas vantagens consideráveis, por exemplo: (i) estar presentes
em todos os organismos, pois são genes essenciais para a síntese de proteínas; (ii) ser
conservados estrutural e funcionalmente; (iii) apresentar tanto regiões conservadas,
como variáveis e altamente variáveis; (iv) apresentar aparente ausência de transferência
gênica horizontal e (v) possuir tamanho satisfatório com cerca de 1.500 nucleotídeos,
suficientes para fazer inferências filogenéticas. Mais recentemente, estudos têm sido
conduzidos utilizando genes funcionais, como o gene dsr que codifica para a enzima
sulfito redutase dissimilatória das BRS (TALBOT et al., 2008), no sentido de resolver
possíveis falhas nas análises filogenéticas oriundas da alta conservação do gene 16S
rRNA entre as classes de micro-organismos.
A ecologia microbiana está se consolidando como uma das áreas da
microbiologia que expande os horizontes do conhecimento de forma inovadora,
desenvolvendo e aprimorando métodos moleculares para identificação e o
monitoramento de micro-organismos em ecossistemas naturais, com vista em estudos
do papel funcional dessa microbiota. Sabe-se que as técnicas tradicionais dependentes
de cultivo não são as mais adequadas, uma vez que menos de 1% dos organismos
encontrados na natureza podem ser cultivados (MUYZER & STAMS, 2008). Dessa
22
forma, as técnicas moleculares têm contribuído para a construção do conhecimento
sobre a estrutura e a funcionalidade das comunidades microbianas propiciando
importantes informações sobre um número muito maior de espécies, sua distribuição
geográfica, as relações ecológicas, a atividade celular e a proporção numérica entre
diferentes populações em seus ambientes naturais e em biorreatores (DOMINGUES,
2007).
O método molecular utilizado neste estudo para identificação do consórcio
bacteriano capaz de reduzir o sulfato e crescer em diferentes concentrações de arsênio
foi à eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE). É uma das técnicas
moleculares mais utilizadas e adequadas para avaliar as comunidades microbianas da
área ambiental (TESKE et al., 1996); pois é confiável, reprodutível, rápida e de custo
relativamente baixo. Além disso, permite analisar várias amostras ao mesmo tempo,
inclusive de micro-organismos não cultiváveis (MUYZER et al., 1993) obtendo uma
representação qualitativa da presença e abundância de diferentes filotipos na amostra
Em consequência, oferece oportunidade de se efetuar estimativas mais reais da
diversidade microbiana existente (MUYER & SMALLA, 1998). Esta técnica se baseia
na separação eletroforética diferencial de amplicons, obtidos por reação de amplificação
em cadeia da DNA polimerase (PCR), quanto à susceptibilidade da molécula de DNA à
desnaturação parcial promovida por agentes desnaturantes, e discrimina amplicons de
tamanhos similares, de acordo com suas sequências de pares de bases (MUYZER et
al.,1993). O comportamento de migração dos fragmentos no gel é governado pelas
variações nas composições dos nucleotídeos (conteúdo CG), como também pelas
interações destes dentro da molécula (MUYZER, 1999), resultando no posicionamento
de bandas em diferentes pontos da matriz de poliacrilamida, (LECKIE, 2005).
A técnica de DGGE oferece algumas limitações como (i) a dificuldade de
separar as bandas no gel de genes ricos em CG (ii) baixo poder de detecção (apenas
espécies com dominância acima de 1% no meio) (iii) diferentes fragmentos de DNA
com conteúdo nucleotídico igual apresentam sobreposição de bandas (AMANN &
LUDWIG, 2000). Teoricamente, cada banda obtida representa uma população
microbiana (FERRIS et al., 1996). Porém já foram relatadas duas ou mais bandas
representando a mesma população, devido à heterogeneidade de sequências de operons
rRNA (LECKIE, 2005). Além disso, a técnica é qualitativa e separa apenas fragmentos
amplificados com tamanhos entre 100 e 500pb. Apesar dessas limitações a técnica de
23
DGGE tem sido cada vez mais aplicada para estudar a biodiversidade genética em
amostras ambientais e, quando associada à técnica de sequenciamento, fornece
importantes informações sobre a composição das comunidades microbianas LECKIE,
2005).
24
4. Materiais e Métodos
4.1 Área de coleta
A Lagoa do Gambá está localizada no centro de um loteamento na cidade de
Ouro Preto, em Minas Gerais, a 20°43’51.11’’ de latitude S e 43°30’0.63’’ de longitude
O (figura 4.1). Esta lagoa recebe grande quantidade de esgoto residencial e do
escoamento superficial de áreas periféricas. A borda da lagoa apresenta cobertura
vegetal marginal de espécies botânicas exóticas. A coleta foi feita por meio de
metodologia padrão, na qual frascos de vidro estéreis foram levados até o local onde as
amostras foram recolhidas. Uma porção de sedimento foi coletada em dois pontos
diferentes no interior da lagoa á uma distância de aproximadamente 200 metros. Após
este procedimento o material foi levado ao Laboratório de Biotecnologia Ambiental da
Escola de Farmácia/UFOP.
Figura 4.1 Ponto de coleta - Lagoa do Gambá, cidade de Ouro Preto – MG 20°43’51.11’’ de latitude S e 43°30’0.63’’ de longitude O.
Fonte: Google Maps 12/11/2012
25
4.2 Cultivo das amostras
As amostras foram cultivadas em batelada em frascos de 500 ml utilizando meio
de cultura líquido seletivo Postgate C modificado por (CHEUNG E GU, 2003) cuja
composição é apresentada na Tabela 4.1. O pH foi ajustado para 7,0 ± 0,2, utilizando
NaOH em seguida, a solução foi esterilizada em autoclave a 120° C, 1,5 atm, por 20
minutos. A solução de sulfato ferroso foi autoclavada separadamente e depois
adicionada à solução de sais na proporção 1:10. A concentração de sulfato no meio foi
fixada em 2g.L-1 para todos os experimentos e a fonte de carbono utilizada foi lactato de
sódio 6g.L-1. Com o objetivo de diminuir a disponibilidade de oxigênio no meio foi
adicionado 0,5g.L-1 de tioglicolato de sódio como agente redutor.
Como meio suporte para o crescimento microbiano, biomassa orgânica e
biossorvente para ânions arsenicais, foi adicionado ao meio o pó de penas de galinha
(PP) na proporção de 4% (p/v) em alguns ensaios. O pó de penas de galinhas comercial
utilizado neste trabalho foi gentilmente cedido por uma empresa de alimentos da região.
Trata-se de uma mistura de penas e vísceras trituradas, acrescida de sangue cozido
(SCAPIM et al.,2003). O material sólido, pulverizado, é constituído basicamente por
proteínas estruturais e insolúveis, principalmente queratina. O teor bruto de proteínas do
material é em torno de 80%, sendo os teores de aminoácidos, contendo grupamentos
sulfeto em sua estrutura, de aproximadamente 0,67 e 3,68% para metionina e cisteína,
respectivamente (SCAPIM et al., 2003).
26
Tabela 4.1-Composição do meio de cultura Postgate C modificado por (CHEUNG E
GU, 2003).
Composição
Quantidade (g.L-1)
Lactato de sódio
6,0
Citrato de sódio
0,3
KH2PO4
0,5
NH4Cl
1,0
Na2SO4
3,0
CaCl2 2H2O
0,006
MgSO4.7H2O
1,28
Extrato de levedura
1,0
EDTA
0,3
Tioglicolato de sódio
0,5
FeSO4. 7H2O
0,17
Ágar
0,5
4.3 Avaliação da resistência dos enriquecimentos microbianos ao
arsênio
Inicialmente, alíquotas de 100ml de sedimento coletadas na lagoa do Gambá em
Ouro Preto-MG foram enriquecidas utilizando-se 300 ml de meio Postgate C
modificado. As amostras foram incubadas por 10 dias a 35°C (Amostra 1). Após este
período, 5ml de cada amostra foram transferidos para frascos contendo 50 ml de meio
Postgate C modificado suplementado de 0,5g.L-1 de arsênio, acrescidos ou não de PP
4% (p/v) (Amostra 2). As amostras foram incubadas a 35°C por cinco dias. Alíquotas de
5 ml das amostras crescidas foram novamente repicadas nas mesmas condições visando
adaptar o consórcio bacteriano às condições de cultivo. Para avaliar a resistência do
consórcio bacteriano ao arsênio trivalente (AsIII) foram utilizados seis diferentes
concentrações do elemento (Tabela 4.2), obtida de uma solução estoque, na qual foi
preparada utilizando NaAsO2, a concentração de As3+nessa solução era de 1000mg.L-1.
Depois de autoclavada (120ºC; 1,0 atm; 20 min), a solução foi mantida estéril e
acondicionada em geladeira.
27
Tabela 4.2– Concentração de As (III) em diferentes amostras.
1
Concentração de As (III)
(mg.L-1)
0,0
2
0,5
3
1,0
4
2,0
5
4,0
6
8,0
7
16,0
Amostras
No final do processo de adaptação, aproximadamente 15 dias, a amostra
adaptada foi inoculada na proporção de 5% (v/v) em frascos contendo 300 ml de meio
Postgate C modificado sem o sulfato ferroso para que este não interferisse nas análises
posteriores, com 0,5 ml de arsênio retirado da solução estoque de arsênio de 1g.L-¹,
acrescido ou não de PP, 4% (p/v). Os frascos foram mantidos a 35°C por 10 dias. A
partir da amostra 2 repetiu-se todo o processo para ambas as amostras, variando apenas
a quantidade de arsênio que aumentava a cada amostra.
Para acompanhar o crescimento das culturas foi medido o potencial de redução
do meio (Eh) e o pH inicial e final, utilizando um potenciostato digital DIGIMED, com
eletrodo combinado de platina.
28
Figura 4.2 – Esquema envolvendo os processos de enriquecimento, adaptação e fase dos
ensaios de remoção de sulfato e arsênio, realizados neste trabalho. (Estes mesmos
processos foram realizados para as demais concentrações de arsênio: 1,0, 2,0, 4,0, 8,0 e
16,0 mg.L-1 , e um controle de 0,0 mg.L-1 de arsênio.
Com sulfato ferroso
Sem sulfato ferroso
As =0,5 mg.L-1
50 ml de meio
+
Sem pó de
penas
5ml
50 ml de meio
+
Sem pó de
penas
5ml
50 ml de meio
+
Sem pó de
penas
5ml
300 ml de meio
(Sem sulfato
ferroso)
+
Sem pó de
penas
300 ml de
meio
50 ml de meio
+
Com pó de
penas
5ml
50 ml de meio
+
Com pó de
penas
5ml
Processo de adaptação
50 ml de meio
+
Com pó de
penas
5ml
300 ml de meio
(Sem sulfato
ferroso)
+
Com pó de penas
Análise de biologia molecular
Fonte: próprio autor.
29
4.4. Identificação microbiana pelo método PCR-DGGE
4.4.1 Preparação das amostras
Alíquotas de 100 ml de cada amostra (1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7) representando seis
concentrações diferentes de arsênio (0,5,1,0,2,0,4,0,8,0 e 16,0mg.L-1) foram
inicialmente centrifugadas a 5.000 rotações.min-¹ utilizando uma Microcentrífuga
(Microcen 16 nº rotor 12154) por 15 minutos para separação da biomassa. A fração
líquida foi descartada e o material sedimentado (pellet) foi “lavado” em tampão fosfato
salino (PBS1X) para remoção de ácidos nucléicos extracelulares. Após a agitação a
amostra foi novamente centrifugada, conforme etapa anterior. Descartou-se o
sobrenadante novamente, e o pellet resultante (biomassa) foi armazenado a -20° C para
posterior extração de DNA.
4.4.2 Extração de DNA genômico
Para análise da diversidade bacteriana através da técnica PCR-DGGE, as
amostras foram inicialmente submetidas à extração de DNA pelo método
fenol/clorofórmio modificado por (GRIFFTITHS et al., 2000). Para cada amostra
crescida foram feitas as extrações em duplicata a fim de se obter uma quantidade
suficiente de DNA para a etapa de amplificação.
Para cada extração, 0,5g da biomassa foram colocados em um microtubo
contendo 0,5g de pérolas de vidros estéreis, 10 µl de SDS 20% (pH 7,2), 0,3 ml de
solução de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (24:24:1) e 0,3 ml de PBS 1X com 1%
de PVPP (Polivinilpolipirrolidona). Para lisar as células microbianas, promoveram-se
três agitações de 1 minuto em agitador de tubos tipo Vortex. As amostras eram imersas
em banho de gelo no intervalo entre agitações. Após a lise, as amostras foram
centrifugadas a 14.000 rotações.min-¹ por 5 minutos, utilizando uma Microcentrífuga
(Microcen 16 nº rotor 12154) . O sobrenadante foi transferido para novo microtubo, o
material sedimentado foi lavado novamente com 0,3 mL de PBS 1X e centrifugado, e os
30
sobrenadantes foram misturados. Ao sobrenadante adicionou-se igual volume de
solução de clorofórmio/álcool isoamílico (24:1) e agitou-se manualmente por 10
minutos. Uma nova centrifugação foi realizada por 5 minutos a 14.000 rotações.min-¹.
Para cada volume de sobrenadante, adicionou-se 2,5 volumes de etanol 100% gelado e
0,1 volume de acetado de sódio (3M, pH 5,2). Essa solução foi incubada por 1 hora a –
20°C, e em seguida, submetida à nova centrifugação por 10 minutos a 14.000 rotações.
min-¹. O sobrenadante foi descartado cuidadosamente. Adicionaram-se 200 µl de etanol
70% (v/v) para ressuspensão do pellet e novamente a solução foi centrifugada a 14.000
rotações.min-¹ por 3 minutos. Descartou-se o sobrenadante e deixou-se o pellet secar a
temperatura ambiente por aproximadamente 12 horas. O pellet contendo ácidos
nucleicos foi ressuspendido em 50µl de Tris (10mM e pH8). Para a avaliação da
qualidade da extração, cerca de 5μL de DNA genômico extraído foi analisado em gel de
agarose a 1%, corado com brometo de etídio e visualizado com auxílio de um
transiluminador (Vilber Lourmat em UV). O DNA foi estocado à -20°C para posterior
amplificação do gene DNA ribossomal 16S.
4.4.3 Amplificação do DNA por PCR
Para verificar a comunidade total de bactérias inicialmente foi realizado
amplificação dos fragmentos de DNA ribossomal 16S utilizando-se primers universais
968F (5’-AACGCGAAGAACCTTAC-3’) com cauda GC (5’-CGCCCGGGG CGC
GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGGGGGG-3’) e 1392 R (5’-ACGGGC
GGTGTG TAC-3’) para o Domínio Bacteria (NIELSEN et al., 1999).
Os componentes da reação de amplificação em cadeia da DNA polimerase PCR
e seus volumes empregados estão apresentados na tabela 4.3.
31
Tabela 4.3 - Componentes utilizados na reação de PCR (volume final igual a 25μL)
Componentes
Volume (μL)
Água
17,5
Tampão da reação (10x)
2,5
MgCl2 (25mM)
1,5
dNTP (10mM)
0,5
Iniciador 1 (10μM)
0,5
Iniciador 2 (10μM)
0,5
Taq DNA polimerase (5U/uL)
0,125
DNA
2,0
Volume Total
25
As reações de PCR foram realizadas utilizando o termociclador MJ96G
(Biocycler). O programa consistiu de uma desnaturação inicial a 94ºC por 5 minutos,
seguido por 35 ciclos de 45 segundos de desnaturação a 94ºC, 1 minuto de anelamento a
63ºC e 2 minutos de extensão a 72ºC, e uma extensão final por 10 minutos a 72ºC. Os
produtos de PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1%, em tampão
tris-acetato-EDTA (TAE) 1X, durante aproximadamente 30 minutos a 100V. Para a
avaliação da qualidade de amplicons, cerca de 5μL da amostra foram analisados em gel
de agarose a 1%, corados com brometo de etídio e visualizados com auxílio de um
transiluminador (Vilber Lourmat) em UV.
É importante ressaltar que para todas as reações de PCR foi realizado, em
paralelo, um teste controle negativo que contava com a adição de todos os reagentes,
exceto DNA, para descartar qualquer tipo de contaminação externa.
4.4.4 Eletroforese em Gel de Gradiente Desnaturante (DGGE)
Confirmada a presença de produtos de PCR pela eletroforese em gel de agarose,
estes foram submetidos à técnica de DGGE conforme descrito por (MUYZER et al.,
1993). A solução estoque de acrilamida a 30% (m/v) foi previamente preparada e
estocada a 4°C. A percentagem de acrilamida utilizada no preparo das soluções estoques
desnaturantes (0% e 80% de ureia/formamida) e na confecção dos géis foi de 6%. Para a
32
formação de 12 mL de gel, utilizaram-se duas soluções denominadas de low (com baixa
porcentagem de desnaturante) e High (com alta porcentagem de desnaturante). Para a
formação de cada solução, as soluções desnaturantes 80% e 0% eram misturadas em
proporções pré-estabelecidas. A polimerização de cada solução foi obtida com a adição
de
persulfato
de
amônio
(APS)
a
10%
e
catalisação
da
reação
com
tetrametiletilenodiamina (TEMED).
No presente trabalho, a faixa de gradiente desnaturante escolhida para a
confecção dos géis para a DGGE foi de 40% a 60%, para o Domínio Bacteria. Para o
estabelecimento destes gradientes desnaturantes as soluções Low e High foram
misturadas em um dispositivo formador de gradientes de duas câmaras, com agitação
magnética na câmara de saída e distribuição por bomba peristáltica em placas de vidro,
operado de acordo com o manual do equipamento (Dcode Mutation System, Biorad).
Foram empregados 10 µL de produto de PCR e 5 µL de tampão em cada poço
do gel polimerizado. As condições da corrida foram: 60 ou 100V, tampão de corrida
TAE 0,5X, aproximadamente por 16 horas.
Ao final da eletroforese, os géis foram imersos em tampão e corados com a
adição de 10 µl de solução de brometo de etídio, por 60 min. A seguir foram lavados em
água destilada e observados com auxílio de um transiluminador com luz ultravioleta e
fotodocumentados. As bandas de interesse foram excisadas dos géis com auxilio de uma
lamina de bisturi estéril e transferidas para microtubos contendo 200 µL de Tris (10mM
e pH 8) e 0,3g de pérolas de vidro estéreis. Para a eluição do DNA das bandas do gel
para a solução, promoveu-se uma agitação de 30 segundos em agitador e, em seguida,
os microtubos foram armazenados a 4°C por no mínimo 48 horas. Após este período, os
microtubos foram centrifugados a 13.000 rpm e o sobrenadante, contendo os fragmentos
de DNA, foi transferido para novo microtubo e armazenado a -20°C para posterior
reamplificação.
Os sobrenadantes, contendo os fragmentos de DNA, foram reamplificados
utilizando o primer 968FGC/1392 para o Domínio Bacteria nas mesmas condições
descritas anteriormente. Os produtos de PCR foram analisados por eletroforese em gel
de agarose 1%, em tampão TAE 1X, durante aproximadamente 30 minutos a 100V.
Confirmada a presença de DNA nos produtos de PCR, promoveu-se a diluição das
amostras em água estéril (1µl de DNA para 9 µl de água) para posterior
sequenciamento.
33
O sequenciamento do DNA referente às bandas excisadas e purificadas do gel de
DGGE foi realizado a partir dos produtos das amplificações (PCR), pela empresa
Genomic Engenharia Molecular (São Paulo) bem como a purificação e quantificação de
DNA presente nas amostras.
4.4.5. Análise das sequências genômicas.
Após a reação de sequenciamento, as sequências obtidas foram analisadas nos
programas BLASTn (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) e RDP X (Ribossomal Database
Project Release 10) (COLE et al., 2009) para o alinhamento das mesmas com
sequências do DNAr 16S depositadas no banco de dados utilizando o modelo de JukesCantor. A árvore filogenética contendo sequências do gene 16S DNAr alinhadas foi
construída pelo método Neighbor-Joining modificado disponível no RDP (BRUNO et
al., 2000), com auxilio do software mega 4.1.
4.5 Caracterização e identificação dos precipitados formados
Para avaliar o efeito da atividade microbiana na formação do precipitado, e
consequente remoção do As (III), foi preparada uma amostra apresentando todos os
constituintes do meio descritas anteriormente, sem adição de inóculo.
E para caracterização do precipitado utilizou-se 30 ml de todas as amostras
crescidas em diferentes concentrações de arsênio e na ausência do meio suporte. Foram
centrifugadas 5.000 rotações.min-¹ utilizando uma Microcentrífuga (Microcen 16 n,º
rotor 12154) por 10 minutos para separação da biomassa. A fração líquida foi
descartada e o material sedimentado (pellet) foi seco em uma estufa, em temperatura de
35°C, por 3 dias.
O material seco foi analisado por meio das seguintes técnicas:
a) Espectroscopia Raman - A espectroscopia Raman é uma técnica de alta resolução de
fótons que fornece informação química e estrutural de qualquer material ou materiais
compósitos orgânicos e/ou inorgânicos permitindo a sua identificação. A Análise por
34
espectroscopia de Raman baseia-se na análise da luz dispersa a partir da incidência de
um feixe de luz monocromática (laser) sobre um dado material. Uma pequena porção da
luz é dispersa inelasticamente, com mudanças sutis que são características do material
analisado e independente da frequência da luz incidente. É uma técnica de análise que é
efetuada diretamente sobre o material a ser analisado, seja ele sólido ou líquido, sem
exigir preparação especial e sem implicar em alteração da superfície sobre a qual a
análise é realizada, isto é, trata-se de análise não-destrutiva. As análises foram
realizadas no Departamento de química da UFOP utilizando-se equipamento Labran HR
800 (Jobin Yvon/Horiba) com feixe de laser de He-Ne, com 632.8 nm de comprimento
de onda e potência de 20 mW. O sinal Raman foi coletado com objetivas Olympus (50
X 0.75 e 100 X 0.90) usando a configuração “back scattering”. O detector utilizado foi
do tipo CCD resfriado por nitrogênio.
b) Difração de Raios-X: A análise por difração de raios X é um método utilizado para a
determinação da estrutura atômica e molecular de materiais, preferencialmente
cristalinos. Os átomos em uma estrutura cristalina difratam o feixe de Raios-X que
incidem sobre eles em diferentes direções. Ao medir os ângulos e intensidades destes
feixes difratados é possível determinar a estrutura do composto e identificá-lo com base
em comparações entre os espectros obtidos e os depositados em bancos de dados. As
análises de Difração de Raios-X foram realizadas no laboratório de Química dos
materiais o Departamento de Química da UFOP. Para caracterização dos possíveis
sulfetos formados as amostras foram analisadas no difratômetro (Shimadzu-XRD 6000),
acoplado com tubo de ferro e monocromador de grafite.
c) Microscopia eletrônica de varredura (MEV) e Espectroscopia de Energia
Dispersiva (EDS)
O princípio da microscopia eletrônica de varredura consiste na emissão de um
feixe de elétrons sobre uma amostra sólida provocando uma série de emissões de sinais
relacionados com a interação do feixe de elétrons incidente na amostra. Os sinais
emitidos encontram-se sob a forma de elétrons (secundários, retroespalhados,
absorvidos, transmitidos, difratados, etc.) e de fótons (fotoluminescentes e raios-X), os
quais são captados por detectores apropriados, sendo amplificados e processados num
sistema analisador específico para cada tipo de sinal. A técnica de microscopia
eletrônica de varredura (MEV) permite a obtenção de uma imagem ampliada e tridimensional da amostra. Espectroscopia de Energia Dispersiva (EDS) é uma técnica
35
espectrofotométrica que pode ser executada junto com a microscopia eletrônica de
varredura. É realizada uma microanálise da superfície do material permitindo a
obtenção de informações químicas em áreas da ordem de micrometros. As informações,
qualitativas e quantitativas, sobre os elementos presentes são obtidas pela captação dos
raios-X característicos resultantes da interação do feixe primário com a amostra.
Essa técnica foi utilizada para se ter uma melhor resolução da formados
precipitados. As lâminas foram preparadas a fresco secadas ao ar. Em seguida, foi feita
a metalização das lâminas com grafite, para observação no MEV (20.0 kv, magnificação
de 5000 X e detector Pioneer). Estes experimentos foram realizados em colaboração
com o Laboratório de Microscopia Eletrônica do Departamento de Geologia da UFOP.
Dessa forma sabendo a estrutura do resíduo sólido formado é possível inferir no
mecanismo de remoção dos metais, redução do sulfato a sulfeto e sua precipitação com
os metais.
36
5. Resultados e Discussão
5.1 Enriquecimento e adaptação das amostras
O desenvolvimento de micro-organismos, bem como a redução de sulfato a
sulfeto foi evidenciada em todas as amostras com o emprego do meio líquido Postgate
C modificado (figura 5.1). Tais resultados estão de acordo com aqueles obtidos
previamente em nosso grupo de pesquisa, quando comparados àqueles obtido
empregando-se o meio líquido Postgate B (BARBOSA, 2009).
O meio de cultivo Postgate C “modificado” apresenta uma coloração inicial
avermelhada, devido à presença de sulfato ferroso (FeSO4.7H2O). Durante o
metabolismo das BRS, o íon sulfato é reduzido a sulfeto que, em presença de ferro
ferroso (Fe2+) reage levando à formação de um precipitado negro de sulfeto de ferro
(FeS). O escurecimento do meio de cultivo pela formação de FeS é um indicativo da
atividade metabólica das BRS. Tal escurecimento não foi observado nos frascos
controle com ausência de inóculos. Nos frascos aos quais foi adicionado o PP, a
coloração enegrecida foi observada cerca de 42 horas após o inóculo. Já os frascos que
não apresentavam adição de PP demandaram cerca de 120 horas até que o crescimento
microbiano pudesse ser observado. Além disso, a fonte de carbono selecionada para os
experimentos permitiu um eficiente aporte nutricional para o crescimento dos microorganismos, o que corrobora com os estudos realizados por Barbosa (BARBOSA,
2009), que relata ser o lactato uma fonte de carbono e energia mais eficiente do que o
etanol, para uma mesma amostra de micro-organismo. Ademais, a degradação do lactato
no meio de cultivo produz vários intermediários, entre eles hidrogênio, acetato, etanol e
propionato, que podem favorecer o desenvolvimento de BRS, metanogênicas e
acetogênicas (WIDDEL& PFENNING, 1982).
A quantidade de lactato de sódio (6g.L-1) e sulfato de sódio (2g.L-1) empregadas
no enriquecimento e cultivo foram suficientes para produzir uma razão de DQO/sulfato
igual a 3,0 (não considerando a participação da matéria orgânica fornecida pela adição
de PP), sendo esta a razão considerada adequada para se atingir bons resultados no que
diz respeito à remoção biológica de sulfato (COSTA, 2011).
37
A temperatura de crescimento escolhida (35°C) foi satisfatória, permitindo o
crescimento microbiano. Considerando-se que a maioria das BRS é mesófila e apresenta
crescimento lento, o tempo de crescimento observado encontrava-se dentro da faixa
esperada.
Diferentemente da maioria das bactérias anaeróbias, bactérias que reduzem o
sulfato são capazes de sobreviver na presença de quantidade limitada de oxigênio, fato
este observado em nosso trabalho, uma vez que os experimentos não foram realizados
em condições com baixa pressão de oxigênio. Esta tolerância ao O2 pode ser atribuída à
presença das enzimas catalase e superóxido dismutase (BARTON, 1995). Diversos
estudos têm relatado a capacidade destes micro-organismos em sobreviver em
condições aeróbias e metabolizar sulfato na presença de oxigênio (MARSCHALL et al.,
1993) o que torna o seu emprego em processos de biorremediação ainda mais promissor
devido às dificuldades de manter condições estritamente anaeróbias durante os
processos industriais.
Figura 5.1- Ensaio de adaptação do consórcio bacteriano ao cultivo. (A) Início do
cultivo e (B) meio de cultura enegrecido devido à formação de sulfeto ferroso, resultado
do crescimento das culturas.
A
B
Fonte: próprio autor.
Para os experimentos de extração de DNA e identificação molecular de microorganismos não houve a adição de sulfato ferroso ao meio para se evitar interferência
nas reações enzimáticas utilizadas na análise de biologia molecular. Nestas situações o
monitoramento do crescimento microbiano foi realizado observando-se visualmente o
aumento da turbidez do meio, indicativo do crescimento microbiano evidenciado na
38
figura 5.2. Além disso, o decréscimo do potencial de redução do meio, também
indicativo de atividade microbiana, foi determinado com o emprego de um
potenciometro modelo digital marca DIGIMED, utilizando-se o eletrodo combinado de
platina e os resultados obtidos serão relatados a seguir (item 5.3).
Figura 5.2 - Enriquecimento do consórcio bacteriano nas amostras em meio líquido
Postgate C modificado. (A) Meio límpido, início do cultivo. (B) Meio turvo, indicativo
do crescimento das culturas.
A
10/08/2011
B
20/08/2011
Fonte: próprio autor.
5.2 Efeito da concentração do arsênio no crescimento do consórcio
bacteriano
Segundo LIZAMA e seus colaboradores (2011), a concentração do arsênio no
meio é um fator determinante para a inibição do metabolismo dos micro-organismos.
Para que os micro-organismos sejam capazes de sobreviver em ambientes com
condições diferentes das ideais, muitos possuem mecanismos genéticos que lhes
garantem resistência a componentes que podem causar stress. Algumas bactérias
possuem genes específicos que possibilitam que essas sobrevivam em ambientes
contendo altas concentrações de metais, como, o arsênio (LIAO et al., 2011). Esta
resistência ao arsênio está relacionada à presença do gene que codifica o operon ars,
este é composto por três a cinco genes (arsR, arsD, arsA, arsB e arsC), os quais estão
localizados em plasmídeos (OWOLABI & ROSEN, 1990) ou no cromossomo (DIORIO
et al.,1995). Os genes arsR e arsD são reguladores, enquanto arsA e arsB são
39
responsáveis pela codificação de proteínas que, por sua vez irão participar de um
processo de transporte transmembrana que permite o fluxo dos ânions arsenicais do
citoplasma para o meio extracelular, reduzindo sua concentração intracelular
(MUKHOPADHYAY et al., 2002)
O crescimento de micro-organismos em todas as amostras contendo diferentes
concentrações de As(III) (0,5; 1,0; 2,0: 4,0; 8,0 e 16mg.L-1) demonstra a resistência
destes ao elemento tóxico embora tenha sido observado o efeito inibitório do As ao
crescimento microbiano. À medida que o arsênio aumentava no meio de cultura, o
crescimento microbiano tornava-se mais lento, principalmente no meio sem a presença
do PP.
Tabela 5.1 Tempo de crescimento percebido pelo escurecimento do meio na ausência do
sulfato ferroso, em relação à concentração de As(III).
Concentração de As(III)
(mg.L )
Tempo de escurecimento do
meio (dias)
2*
0,5
2
2
0,5
3
3*
1,0
2
3
1,0
4
4*
2,0
2
4
2,0
4
5*
4,0
4
5
4,0
5
6*
8,0
5
6
8,0
9
7*
16,0
5
7
16,0
Amostras
-1
12
*Amostras acrescidas de pó de penas de galinha
Em relação à presença do meio suporte PP, este diminui a concentração do
As(III), por ser um material biossorvente para o As(III) devido às interações entre os
grupos sulfidrila, presentes na superfície do pó de penas como observado por Teixeira e
40
colaboradores (TEIXEIRA et al., 2007). Consequentemente, nos cultivos com presença
de PP observou-se menor efeito inibitório do As(III) ao crescimento microbiano. Dessa
forma nos testes com a presença de meio suporte observou-se menor tempo de
crescimento de micro-organismos, quando comparado às amostras sem adição de PP.
Visto que as metodologias disponíveis para remediação de arsênio sejam elas
convencionais ou alternativas, apresentam uma limitação comum: removem,
eficientemente, as espécies pentavalentes do As, mas geralmente falham na
remoção/imobilização das espécies trivalentes, o que implica na necessidade de
oxidação prévia do arsenito a arsenato como etapa intermediária do processo
(TEIXEIRA et al., 2007) a abordagem aqui proposta torna-se interessante pois todo o
processo se dá em condições redutoras. No trabalho de BATTAGLIA-BRUNET (2012)
foi observado que bactérias do gênero Desulfosporosinus são capazes de reduzir o
arsênio (V). Newman e seus colaboradores (NEWMAN et al., 1997) em seus estudos
reportaram que a espécie Desulfotomaculum auripigmentum, também é capaz de reduzir
o arsênio (V).
5.3 Variação do Potencial de oxi-redução e pH inicial do meio
O valor do potencial de oxi-redução (Eh) do meio é de extrema importância para
o cultivo de BRS, uma vez que esse grupo microbiano requer um ambiente redutor para
seu crescimento, valores de Eh em torno de -100 a -300mV (POSTGATE et al., 1984).
Assim, havendo ocorrência de redução de sulfato em um cultivo microbiano espera-se
observar uma diminuição gradativa do Eh do meio em função do tempo de cultivo.
Neste trabalho os valores de Eh observados para todas as amostras, independentemente
da condição de cultivo empregada variaram entre -65,0 e -360,0mV (Figura 5.3). Além
disso, independentemente da adição de As, a redução do Eh do meio foi sempre mais
marcante nos frascos contendo PP. Por se tratar de uma fonte de energia, a adição deste
material ao meio de cultura pode promover maior crescimento microbiano e,
consequentemente, maior abaixamento do Eh do meio.
No que diz respeito ao pH, é sabido que as BRS apesar de apresentarem
capacidade de crescer em ampla faixa de pH, são preferencialmente neutrófilas,
(POSTGATE et al., 1984). BARBOSA (2009) ao utilizar uma cultura mista contendo
41
BRS (enriquecida a partir de amostras de material coletado no mesmo ambiente objeto
de estudo deste trabalho, Lagoa do Gambá), obteve remoções de sulfato mais
satisfatórias em meio neutro (pH 7,0) do que em meio levemente ácido (pH 5,5).
Em vista disto, foi utilizado o valor inicial de pH 7,0 nos ensaios, a fim de
garantir um ambiente favorável à atividade metabólica desses micro-organismos.
Entretanto, durante os três primeiros dias de cultivo, foi observado um decréscimo no
valor do pH do meio em todas as amostras, com os valores de pH variando entre 7 e 5.
Tal decréscimo deve-se principalmente a formação dos ácidos orgânicos gerados a
partir da decomposição do lactato, por bactérias fermentativas. Contudo, o metabolismo
da BRS através da oxidação do lactato, além de gerar o íon sulfato produz alcalinidade
(HCO3-), responsável pelo tamponamento do meio.
Figura 5.3 Variação do potencial de redução do meio no cultivo em presença de
arsênio: 0,5 (2 e 2*); 1,0 (3 e3*); 2,0 (4 e 4*); 4,0 (5 e 5*); 8,0 (6 e 6*) e
16,0mg.L-1 (7 e 7*) . O sinal * representa a presença de pó de penas de galinha
(PP) no meio.
Valores do Eh (mV).
Variações do Eh
100
50
0
-50
-100
-150
-200
-250
-300
-350
-400
2*
2
3*
3
4*
4
5*
5
6* 6* 7*
7
Eh Inicial
Eh Final
Fonte: próprio autor
5.4 Identificação microbiana
As extrações de DNA, das treze amostras (1, 2, 2*, 3, 3*, 4, 4*,5, 5*,6, 6*,7 e
7*) crescidas em meio Postgate C modificado acrescido ou não de PP e As foram
42
eficientemente realizadas. Para todas as amostras obtiveram-se quantidades de DNA
suficientes para realização de PCR.
A reação de amplificação foi realizada com todos os extratos genômicos das
amostras de bactérias adaptadas em diferentes concentrações de arsênio. A amplificação
do material genômico utilizando o primer 968FGC/1392 para o Domínio Bacteria foi
obtida para todas as 13 amostras. A observação dos géis de agarose a 1,0%, após
coloração com Brometo de Etídio indicou o resultado positivo da reação de
amplificação de fragmentos do RNA ribossomal 16S.
5.4.1. Eletroforese em Gel de Gradiente Desnaturante (DGGE)
A análise eletroforética (DGGE) foi realizada utilizando-se os produtos
amplificados dos fragmentos de DNA ribossomal 16S que revelou o padrão de bandas
representada na Figura 5.4, o número de bandas corresponde ao número dos membros
predominantes na comunidade bacteriana o que permite inferir sobre a diversidade
global de bactérias dentro de cada amostra. Para obter estes resultados diversos
experimentos de DGGE foram realizados em diferentes gradientes de desnaturação a
fim de obter-se um perfil representativo da diversidade microbiana do Domínio Bacteria
das amostras. O melhor perfil de bandas foi obtido no gradiente desnaturante de uréia
formamida de 40-60% como representado na figura 5.4. Um total de 7 bandas foram
selecionadas, excisadas e sequenciadas a fim de identificar as espécies bacterianas
presentes no ambiente.
43
Figura 5.4 - Gel de DGGE, com gradiente desnaturante de 40%-60%, corado em
brometo de etídio contendo fragmentos de DNA ribossomal 16S amplificados com
primer universal 968FCG/1392R domínio Bacteria. O número 1 representa a amostra
sem arsênio, (2 e 2*), 0,5, (3 e 3*), 1,0; (4 e 4*), 2,0; (5 e 5*), 4,0; (6 e 6*) , 8,0 e (7 e
7*) 16,0mg.L-1 de arsênio. O sinal * representa a presença de pó de penas de galinha
(PP) no meio.
Fonte: próprio autor
44
Os perfis de bandas presentes no gel obtido durante a análise por DGGE em função da
concentração de arsênio e à presença de biomassa PP nos cultivos estão representados
na tabela 5.2 abaixo.
Tabela 5.2. Distribuição das bandas de material genômico em diferentes condições
experimentais.
Amostras
1
2*
2
3*
3
4*
4
5*
5
6*
6
7*
7
Concentração de As (III) (mg.L-1)
Espécies
Bandas
0
0,5
0,5
1,0
1,0
2,0
2,0
4,0
4,0
8,0
8,0
16,0
16,0
Cupriavidus
metallidurans
B1
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Clostridium sp
B2
+
+
+
+
+
Pantoea
agglomerans
B3
+
+
+
Citrobacter sp
B4
+
+
+
+
+
Enterobacter
sp
B5
+
+
+
+
+
Burkholderia
cepacia
B6
+
+
+
Bacillus sp
B7
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
*Indica adição de biomassa PP ao cultivo
Todas as sete bandas foram excisadas do gel DGGE e reamplificadas novamente
utilizando primers para o domínio Bacteria, purificadas e levadas para o
sequenciamento. As sequências obtidas foram analisadas nos programas BLASTn
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) e RDP X (Ribossomal Database Project Release 10)
(COLE et al., 2009) utilizadas para busca de homologia, similaridade e identidade. O
sequenciamento revelou a presença de membros dos filos Proteobacteria e Firmicutes. O
primeiro é constituído por organismos que apresentam grande diversidade metabólica e
correspondem á maioria das bactérias gram-negativas conhecidas, tendo importância
médica, industrial e agrícola. O filo Firmicutes é representado por bactérias na qual a
45
maioria é gram-positiva, Bacillus e Clostridium são os dois gêneros mais estudados,
TORTORA, 2005). Os resultados de similaridade das bandas obtidas estão apresentados
na tabela 5.3.
Tabela 5.3: Alinhamento das bandas com as sequências depositadas no GenBank
(www.ncbi.nlm.nih.gov) para os fragmentos amplificados pelos primers bacterianos
universais (968F-GC 1392R).
Bandas Similaridade
Espécie
Número de
Acesso
B1
99%
Cupriavidus metallidurans
CP000352
B2
100%
Clostridium sp
X80841
B3
100%
Pantoea agglomerans
AM184212
B4
100%
Citrobacter sp
DQ133536
B5
100%
Enterobacter sp
EF138627
B6
99%
Burkholderia cepacia
AY741335
B7
100%
Bacillus sp
EU584532
Para construção da árvore (Figura 5.5), foram consideradas as espécies que
apresentavam maior porcentagem de similaridade com as sequências obtidas. De
maneira geral, os indivíduos sequenciados foram posicionados considerando seus
parentes filogenéticos.
46
As propriedades de todos os micro-organismos identificados estão presentes na tabela
5.4.
Tabela 5.4. Propriedades das espécies identificadas.
Sequências
Espécies
Cupriavidus
B1
metallidurans
CP000352
Clostridium
B2
spX80841
Pantoea
B3
agglomerans
AM184212
Citrobacter sp
B4
DQ133536
Enterobacter sp
B5
EF138627
Burkholderia
B6
cepacia
AY741335
Bacillus sp
B7
EU584532
Características
Beta Proteobacteria, gram-negativas,
elevado número de genes de
resistência a metais pesados. É um
organismo modelo interessante para
estudar as respostas microbianas a
metais pesados.
Referência
(MONSIEUS
et al, .2011).
Bactérias Firmicutes, Gram-positivas,
forma de bastonete, anaeróbios estritos
(ANDERSON
e
aerotolerantes.
Produzem et al., 2003).
endósporos, são ubiquitários,
Família Enterobacteriaceae, Gramnegativas, anaeróbias facultativas
capazes de realizar o metabolismo de
redução de sulfato.
(QIU et al.,
2008).
Gram-negativas, fermentadoras da
família
Enterobacteriaceae.
(AICKIN &
Observáveis nos solos, águas, DEAN, 1977)
alimentos e esgotos.
Família Enterobacteriaceae, Gramnegativas, anaeróbias facultativas.
Utilizam lactato de sódio como fonte
de carbono, ou mesmo o citrato.
(GRIMONT
&
GRIMONT,
2006).
Beta Proteobacterias, gram-negativas,
forma de bastonetes. Possuem um
extraordinário espectro nutricional, (YABUUCHI
capazes de degradar mais de 100 et al.,1992).
moléculas orgânicas diferentes.
Bactérias Firmicutes, Gram-positivas,
aeróbias ou anaeróbias facultativas.
Alta taxa de crescimento, capacidade
de secretar enzimas para o meio
extracelular.
(SCHALLMY,
2004).
47
Figura 5.5. Árvores filogenéticas contendo sequências do gene DNAr 16S, construídas
pelo método Neighbor-Joining e modelo Maximum Composite Likelihood no programa
Mega 4.1. Análise de Bootstrap com 1000 réplicas.
B1
70
Cupriavidus metallidurans CP000352
98
B6
69 Burkholderia cepacia| AY741335
100
Bacillus sp EU584532
98 B7
B2
100
Clostridium sp. X80841
Desulfovibrio Mlhm; AF193026
0.02
0
B5
Enterobacter sp EF139627
00
B4
100
Citrobacter sp DQ133536
B7
Pantoea agglomerans AM184212
Desulfovibrio AF193026
0.02
Fonte: próprio autor
As espécies Cupriavidus metallidurans e Citrobacter sp. estão presentes em
todas as amostras, independentemente da concentração de arsênio empregada,
apresentando portanto, resistência considerável a este elemento. Estes organismos são
capazes de produzir sulfeto de hidrogênio (BARBOSA, 2009), principal produto no
processo de redução dissimilativa de sulfato, corroborando, portanto, para a atividade
sulfato redutora das amostras estudadas. Como o sulfeto de hidrogênio é um composto
tóxico para muitos micro-organismos, até mesmo para várias espécies de BRS como, as
espécies do gênero Desulfotomaculum, que são sensíveis a concentrações de 4 a 7 mM
de H2S.L-1 (WIDDEL & PFENNIG,1977; KLEMPS et al., 1985) a presença de H2S no
meio pode funcionar como uma estratégia para eliminar outros grupos microbianos,
48
sendo portanto responsável pela seletividade de grupos microbianos, resistentes a este
composto (MARTIN et al., 2009), diminuindo assim a competição pelos nutrientes.
A espécie Cupriavidus metallidurans é uma beta proteobacteria capaz de manter
em homeostase com os metais sob uma variedade de condições ambientais adversas
(MONCHY et al., 2007). Este organismo pode ser encontrado em ambientes com
temperatura moderada, contaminados com metais pesados, tais como desertos de zinco
da Bélgica
(DIELS & MERGEAY, 1990). A espécie Citrobacter sp. pode ser
observada nos solos, águas, alimentos e esgotos. Em 1977, Aickin e Dean (AICKIN &
DEAN, 1977) descreveram o sistema fosfatase das bactérias do gênero Citrobacter
utilizadas em processos biológicos de precipitação dos metais. As espécies Clostridium
sp e Burkholderia cepacia, embora não estejam presentes em todas as amostras
analisadas, cresceram em alguns frascos contendo baixas, médias e altas concentrações
de arsênio no meio. O gênero Burkholderia foi descrito em 1992 por Yabuuchi como
parte do Filo Proteobacteria. O gênero ainda precisa ser mais bem caracterizado, pois
sua taxonomia vem sendo modificada de tal forma que novos componentes estão sendo
frequentemente propostos, especialmente pela identificação de novos nichos ecológicos
e sua ação no ambiente.
Estes micro-organismos fazem parte do grupo das Beta Proteobacterias, sendo a
espécie Burkholderia cepacia (anteriormente conhecida como Pseudomonas cepacia) a
mais conhecida. As bactérias do gênero Burkholderia tornam-se interessantes por
possuírem amplo potencial de uso em atividades agrícolas e biotecnológicas. Possuem
capacidade de atuarem como promotoras de crescimento em plantas dadas as suas
atividades de fixação biológica do nitrogênio e produção de fitormônios; além disso,
participam de processos de biorremediação de hidrocarbonetos de petróleo,
hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, componentes nitroaromáticos solventes
industriais, pesticidas e metais (DUA et al., 2002).
As espécies de Clostridium podem ser anaeróbias estritas ou aerotolerantes. São
ubiquitários, vivendo no solo, água, flora do trato gastrointestinal do homem e diversos
animais, são produtores de amilases para degradação de polissacarídeos a açúcares
menores (ANDERSON et al., 2003). A alta resistência destas espécies às condições
ambientais extremas pode justificar sua ocorrência na condição de cultivo na qual as
maiores concentrações de As (III) foram empregadas. Esta espécie preferencialmente
oxida o lactato formando o acetato juntamente com o propionato (BERTOLINI, 2012).
49
O gênero Bacillus sp. foi encontrado somente na amostra com maior
concentração de arsênio, 16mg.L-1. Por possuírem muitas características vantajosas,
como sua alta taxa de crescimento, menor tempo da fermentação, e principalmente
capacidade de secretar enzimas para o meio extracelular, esse gênero vem se tornando
bastante importante e atrativo para o setor industrial. Sendo assim, estes microorganismos constituem uma fonte importante de enzimas extracelulares, dentre elas
proteases, amilase e lípases (SCHALLMEY, 2004).
A presença de micro-organismos das espécies Enterobacter sp. e Pantoea
agglomerans foi confirmada nas amostras com baixa, média e alta concentração de
arsênio no meio. Embora não haja muitos estudos em relação à redução de sulfato por
membros da família Enterobacteriaceae, sabe-se que representantes desta família já
foram identificados como capazes de realizar o metabolismo de redução de sulfato (QIU
et al., 2008) e como, o grupo das BRS é polifilético, fazendo parte do mesmo
representantes de diferentes famílias do domínio Bacteria; além de algumas do domínio
Archaea é possível que representantes ainda não catalogados de grupos distintos
também possuam a capacidade metabólica de reduzir o sulfato à sulfeto.
É valido acrescentar que, devido ao metabolismo de grande parte dos
representantes
da
família
Enterobacteriaceae
ser
anaeróbio
facultativo,
os
enriquecimentos utilizados neste trabalho não seriam capazes de excluí-los. Portanto
esses micro-organismos poderiam estar fazendo parte do processo de redução de sulfato.
Além disso, representantes do gênero Enterobacter, já foram relatados como capazes de
utilizar o lactato de sódio como fonte de carbono, ou mesmo o citrato (GRIMONT &
GRIMONT, 2006) presentes no meio de cultivo utilizado. Outra questão importante é a
taxonomia deste gênero que é considerada como altamente heterogênea ao se considerar
outros representantes da família Enterobacteriaceae (GRIMONT & GRIMONT, 2006).
Pode-se citar como exemplo as espécies do gênero Pantoea, que possui várias espécies
endofíticas, até pouco tempo identificadas como pertencentes ao gênero Enterobacter,
(JANDA, 2006).
Fundamentado nas características metabólicas e enzimáticas dos microorganismos identificados, é possível inferir que as espécies Pantoea agglomerans,
Enterobacter sp. e Citrobacter sp, pertencentes a família Enterobacteriaceae,
participaram da oxidação incompleta do lactato, composto orgânico adicionado ao meio
de cultura, produzindo ácidos orgânicos voláteis (AGV), possivelmente o ácido acético.
50
A produção desses ácidos causou o decréscimo do pH do meio logo nos primeiros dias
de inoculação dos micro-organismos. A partir daí entram em ação os micro-organimos
acidogênicos, neste trabalho representado pelo gênero Clostridium, que utilizam os
produtos anteriormente citados produzindo o acetato.
Os micro-organismos pertencentes ao gênero Bacillus e a espécie Burkholderia
cepacia crescem em meios contendo diferentes fontes de carbono, uma vez que
apresentam a capacidade de produzirem enzimas hidrolíticas extracelulares,
apresentando extrema versatilidade nutricional, podendo participar em mais de uma
etapa da oxidação do lactato.
É importante acrescentar que as espécies que se esperava identificar, são as
clássicas bactérias redutoras de sulfato que pertencem ao grupo delta proteobactéria,
visto que o meio utilizado assim como as condições de cultivo são propícios para o
crescimento destas. Porém os resultados da análise da biologia molecular demostrou a
presença de outros micro-organismos como citado anteriormente, mas que apresentam
características de redução de sulfato e resistência ao arsênio.
5.5 Caracterização do precipitado formado
Para avaliar a correlação da remoção do As(III) na presença de inóculo e na
ausência deste (considerando-se apenas a possibilidade de uma interação química entre
o arsênio trivalente e os constituintes do meio de cultura) foram utilizados frascos
controles, cultivados em condições semelhantes, autoclavados, porém sem a adição de
inóculo (BRS). Os testes controles não apresentaram sequer precipitado após 10 dias na
estufa. Dessa forma a remoção de As(III) foi insignificante na ausência do inóculo,
descartando-se a possibilidade do processo estar relacionado apenas a uma reação
química que dispensa a presença de micro-organismos. Este fato evidencia a
importância dessas bactérias para o processo de imobilização de As(III). Possivelmente,
os processos envolvidos na precipitação do As(III) podem acontecer isoladamente ou
em conjunto, sendo eles: adsorção dos metais na superfície da célula ou em substâncias
exopolissacarídicas (EPS) por elas produzidas e secretadas; pela sua bioacumulação no
interior da célula (KIM et al., 2007) e pela precipitação dos metais com o sulfeto
51
produzido no metabolismo do sulfato gerando sulfetos metálicos insolúveis
(WIDDELL, 1988). Neste trabalho devido os altos picos de carbono encontrado em
todas as amostras, evidencia que o processo de imobilização que esta acontecendo é o
de adsorção do arsênio na superfície da célula. Este processo se refere à remoção de
íons ou outras espécies dissolvidas, de líquidos ou gases pela acumulação na superfície
de um material sólido (LIZAMA et al., 2011). O processo de adsorção mais comum
envolve a troca iônica. O sucesso do processo de adsorção depende das propriedades da
superfície do adsorvente, da concentração e da especiação das espécies químicas
presentes, da competição entre espécies químicas e do pH do meio (STOLLENWERK,
2003).
Em ambientes reduzidos e na presença de S e Fe, o As pode ser precipitado
como composto insolúvel como a orpimenta As2S3, no qual o As está presente como As
trivalente, e arsenopirita (AsFeS). A Orpimenta (Ouro-pigmento) precipita em
ambientes contendo pouco Fe, porém ricos em S, especialmente sob condições ácidas
(LIZAMA et al., 2011).
Os precipitados formados nas amostras 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7 correspondendo
respectivamente às concentrações de arsênio (0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 8,0 e 16,0g.L-1), obtidos
após cultivo microbiano em meio Postgate C modificado (sem PP) apresentaram um
aumento na cristalinidade à medida que a concentração de arsênio se elevava, como
pode ser observado na figura 5.6. Resultados semelhantes foram encontrados por outros
autores (TECLU et al., 2008), sendo que também foi observado que a cristalinidade do
material sólido produzido aumentava à medida que se aumentava a concentração de
arsênio no meio.
É importante observar, que o material utilizado com suporte sólido (PP) é
amorfo, característica esta que impossibilitou alcançar sucesso na análise da estrutura
dos resíduos sólidos presentes no precipitado por espectroscopia Raman. A técnica de
Difração de raios-X também não apresentou resultados significativos pelo mesmo
motivo, não sendo possível, através desta técnica, a identificação de fases minerais
correspondentes aos sulfetos de arsênio. Esperava-se identificar esta fase mineral visto
que, durante os cultivos, ocorreu a redução do sulfato a sulfeto, evidenciada pelo
enegrecimento do meio e este, por sua vez seria, termodinamicamente capaz de reagir
com cátion bi e trivalentes, dentre eles o arsenito (As3+), formando sulfetos insolúveis.
A baixa cristalinidade do material associada ao fato da concentração do sulfeto de
52
arsênio formado no meio ser inferior a 3% do total de sólidos presentes, inferior,
portanto, aos valores limites de detecção do equipamento, podem ter contribuído para o
insucesso desta abordagem.
Com relação às análises de MEV/EDS, a presença de As nos produtos sólidos
produzidos pelo crescimento microbiano pode ser comprovada. Na figura 5.6 é possível
perceber o aumento da intensidade dos picos relativos ao arsênio à medida que aumenta
a concentração deste elemento na amostra. É importante ressaltar que o mesmo não foi
observado na ausência de micro-organismos, ficando assim descartada a possibilidade
de simples precipitação química. A participação microbiana no processo fica desta
maneira comprovada, mas os mecanismos (biogeoquímicos) ainda precisam ser
investigados. A presença de picos de carbono como pode ser visto na figura 5.3,
corrobora com a hipótese da biossorção do arsênio na parede celular, local onde se
encontram os principais sítios de biossorção que correspondem aos grupos funcionais
amina, amida, hidroxilo, carboxilo e fosfato entre outros (VIDOTTI E ROLLEMBERG,
2004). Além disso, a conversão de arsenito em arsenato pode ser realizada por enzimas
extracelulares, sendo as formas oxidadas adsorvidas ou precipitadas no filme biológico
como visto em trabalho previamente publicados (KOSTAL et al., 2004). Dessa forma, o
consórcio bacteriano apresentado neste trabalho poderia ser utilizado, com sucesso, por
pequenas indústrias, num processo biológico, de baixo custo, para o tratamento de
efluentes contaminados por arsênio.
53
Figura. 5.6. Imagem de análise de MEV/EDS do precipitado presente nas amostras: A)
Amostra 1 com 0,0 g.L-1 de As; B) Amostra 3 com 1,0 g.L-1 de As; C) Amostra 4 com
2,0 g.L1 de As; D) Amostra 5 com 4,0 g.L-1 de arsênio, E) Amostra 6 com 8,0 g.L-1 de
arsênio. F) Amostra 7 com 16,0 g.L-1 de arsênio.
A
B
C
D
E
F
Fonte: próprio autor
54
6. Conclusões
Foi possível observar o crescimento bacteriano utilizando meio Postgate C
modificado em todas as diferentes concentrações de As (III) empregadas, tanto nos
cultivos contendo PP quanto na ausência deste composto. Ficou demonstrada a
resistência da cultura bacteriana ao elemento. A concentração de As(III) no meio
influenciou a cinética do crescimento microbiano pois, à medida que as concentrações
de arsênio aumentavam, maior tempo para crescimento era demandado, principalmente
no meio sem a presença do material suporte (pó de pena de galinhas). Tal fenômeno
pode estar associado às propriedades adsorventes de As do material, que implicariam na
diminuição da concentração de As(III) solúvel no sistema, facilitando a adaptação da
cultura ao meio e a consequente, proliferação celular. Além disso, o mesmo material
pode ser utilizado como fonte de matéria orgânica pelos micro-organismos, facilitando
seu crescimento.
A identificação do perfil de DGGE do consórcio microbiano revelou a presença
dos seguintes organismos: Pantoea agglomerans, Enterobacter sp, Citrobacter sp,
Cupriavidus metallidurans, Ralstonia sp Burkholderia cepacia e Clostridium sp.
Ainda que os componentes do consórcio microbiano identificados não sejam
pertencentes aos grupos clássicos de BRS, a cultura apresentou capacidade de redução
de sulfato.
A capacidade de reduzir o sulfato de algumas das espécies constituintes do
consorcio associada à resistência ao arsênio indica que o mesmo possui potencial de uso
na biorremediação de resíduos líquidos contaminados com sulfato e As o que justifica a
continuação dos estudos aqui iniciados.
A atividade metabólica das bactérias componentes deste consórcio influenciou
diretamente na imobilização do arsênio trivalente sendo a cristalinidade do material
diretamente proporcional à sua concentração no meio.
A diversidade metabólica do consórcio e sua capacidade de precipitar metais e
metaloides o capacita para o uso em processos de biorremediação e imobilização de
metais. Dessa forma todas as bactérias identificadas neste estudo, são boas candidatas
para o processo de biorremediação de áreas contaminadas com arsênio, no tratamento
55
de efluentes industriais que apresentam arsênio, visto se tratar de um processo de baixo
custo.
56
7. SUGESTÕES DE TRABALHOS FUTUROS.
- Identificar a presença de genes associados à redução de sulfato, nos micro-organismos
identificados neste estudo.
- Avaliar a capacidade de degradação de sulfato em reatores utilizando o consórcio
microbiano descrito neste trabalho.
- Testar o uso destas BRS para o tratamento de águas de drenagem ácida de mina.
57
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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9. Apêndices
Apêndice I-Produção bibliográfica.
M. MOREIRA, P. F. COSTA, M. C. TEIXEIRA
Identification of a bacterial consortium with biotechnological potential for arsenic
bioremediation. 20th Interanational Biohydrometallurgy Symposium,Hotel del Desierto
Enjoy, Antofagasta, Chile, 8-11 October 2013
M. MOREIRA, P. F. COSTA, M. C. TEIXEIRA
Arsenite (bio) immobilization using Sulfur Reducing Bacteria (SRB). 4th international
congress: arsenic in the environment, Sebel Cairns International Hotel, Cairns,
Australia, 22–27 July 2012
MOREIRA,M;SILVA,S.Q;TEIXEIRA,M.C
Identificação Molecular de Bactérias Redutoras de Sulfato (BRS) Coletadas na Lagoa
do Gambá em Ouro Preto-MG. XXL Congresso Latino-americano de Microbiologia,
Santos, 2012.
MOREIRA,M & TEIXEIRA,M.C.
Utilização da Técnica de DGGE (Eletroforese em Gel de Gradiente Desnaturante), na
Identificação da Diversidade Microbiana. I Workshop on Bioprocess for the Mining
Industry and Environment, Araraquara, 2011.
69
Apêndice II - Soluções e reagentes para extração de DNA.
TAMPÃO FOSFATO SALINO (PBS 10X concentrado)
Adicionar em um béquer os seguintes constituintes: NaCl - 80,0g;
KCl - 2,0g;
Na2HPO4 - 14,4g (se hidratado, usar 18g) e KH2PO4 - 2,4g. Adicionar 800 mL de água
mili-Q aos poucos até dissolver. Depois de dissolvido transferir a solução para uma
proveta e completar o volume para 1000 mL e ajustar o pH 7,2 para sando soluções de
NaOH ou HCl. Colocar em um frasco com tampa e autoclavar à 120°C por 20 minutos,
depois de autoclavado, esperar esfriar e estocar em geladeira.
SOLUÇÃO DE SDS10% concentrado.
Adicionar em um proveta 10,0g de SDS (dodecil sulfato de sódio) e 100mL de água
milli-Q. Agitar até completa dissolução. Ajustar o pH para 7,2 usando solução de NaOH
ou HCl e armazenar à temperatura ambiente.
SOLUÇÃO DE FENOL/CLOROFÓRMIO/ÁLCOOL ISOAMÍLICO (24:24:1)
Em um frasco adicionar 24mL de Fenol, 24mL de Clorofórmio e 1mL de Álcool
isoamílico. Estocar em freezer à -20°C.
CLOROFÓRMIO/ÁLCOOL ISOAMÍLICO (24:1)
Em um frasco adicionar 24mL de Clorofórmio e 1mL de Álcool isoamílico. Estocar em
freezer à -20°C.
SOLUÇÃO PBS 10X CONCENTRADO.
Em uma balão volumétrico misturar os seguintes constituintes: 16 g de NaCl, 4g de
Na2HPO4.7H2O; 0,7g de NaH2PO4.H2O e completar para volume de 2L com água
destilada. Armazenar na geladeira a
SOLUÇÃO PBS 1X CONCENTRADO + PVPP 1%.
Misturar os seguintes constituintes em um frasco: 2mL de tampão fosfato salino PBS
10X concentrado,1g de Polivinilpolipirrolidona (PVPP) e 100mL de Água mili-Q .
Estocar à temperatura ambiente.
70
SOLUÇÃO DE ACETATO DE SÓDIO 3M.
Dissolver 24,6g de Acetato de sódio em água milli-Q, colocar em um balão volumétrico
e completar o volume para 100mL. Estocar à temperatura ambiente.
TRIS (tris-hiroximetilaminometano) (2mMolar).
Misturar em um balão volumétrico 24,225g de Tris e completar com H2O milli-Q até
volume de 100mL. Armazenar em um frasco à temperatura ambiente.
TAE (TAMPÃO TRIS-ACETATO-EDTA, PH7,5) 50X CONCENTRADO.
Colocar em um balão volumétrico os seguintes constituintes: 121,0g de Tris-Base,
28,55mL de Ácido acético glacial, 50mL de EDTA 0,5 Molar, em seguida acertar o
volume para 500mL utilizado água destilada e ajustar o pH para 7,5 usando soluções de
NaOH ou HCl. Armazenar em um frasco à temperatura ambiente.
EDTA 0,5MOLAR.
Em um frasco misturar 93,06g de EDTA e 500mL de Água destilada. Ajustar o pH para
8,0 usando soluções de NaOH ou HCl. Estocar à temperatura ambiente.
ANEXO II – Soluções e reagentes para eletroforese (DGGE)
SOLUÇÃO DE ACRILAMIDA 30%.
Colocar em um béquer 58,0g de Acrilamida e 2,0g de Bisacrilamida. Dissolver com a
ajuda de um agitador magnético a uma temperatura de 20°C e adicionar aos poucos a
água destilada, até a completa dissolução. Após dissolução, completar o volume para
100 mL utilizando água destilada. Colocar em um frasco fechado e envolto por um
papel alumínio e armazenar à 4°C.
SOLUÇÃO 0% DESNATURANTE.
Misturar 40mL de Acrilaminda 30%, 1 mL de TAE 50X concentrado e 159mL de Água
mili-Q. Colocar em um frasco fechado e envolto por um papel alumínio e armazenar à
4°C.
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SOLUÇÃO 80% DESNATURANTE
Misturar em um béquer 40mL de Acrilamida 30%, 1mL de TAE 50X concentrado,
67,6g de uréia e64mLde Formamida. Dissolver com a ajuda de um agitador magnético a
uma temperatura de 20°C e adicionar aos poucos água destilada, até a completa
dissolução. Após dissolução, completar o volume para 200 mL utilizando água
destilada. Colocar em um frasco fechado e envolto por um papel alumínio e armazenar à
4°C.
APS (PERSULFATO DE AMÔNIO) 10%.
Misturar em um frasco envolto por um papel alumínio 0,2g de APS e2mL de Água miliQ . Armazenar a 4°C.
PREPARO DE GRADIENTE 40– 60% DO GEL DE POLICRILAMIDA.
Gradiente 40%.
Adicione em um tubo falcon 8mL de Solução 0%, 8 mL de Solução 80%, 100µL de
APS 10% e, por último, acrescente 7µL de TEMED e misture ligeiramente.
Gradiente 60%
Adicione em um tubo tipo falcon 4mL de Solução 0%, 12 mL de Solução 80%, 100µL
de APS 10% e, por último, acrescente 7µL de TEMED e misture ligeiramente.
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