ISOLAMENTO EM MEIO SELETIVO LGI

ISOLAMENTO EM MEIO SELETIVO LGI-P DE
BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS ASSOCIADAS À
CULTURA DA MANDIOCA (Manihot esculenta)
Maria Camila de Barros Silva1, Fernando José Freire2, Júlia Kuklinsky-Sobral3, Michelangelo de Oliveira
Silva4, Marisângela Viana Barbosa5, Diogo Paes da Costa5 & Pedro Avelino Maia de Andrade5

Introdução
A mandioca (Manihot esculenta Crantz) é uma
planta
originária
do
continente
americano,
provavelmente do Brasil, sendo a principal fonte de
carboidratos para milhões de pessoas, especialmente
nos países em desenvolvimento, além de ter grande
importância no setor industrial. De acordo com Suzuki
[1] a importância da cultura está na produção de raízes
tuberosas e feculentas que são utilizadas na
alimentação humana e animal, na fabricação de
produtos diversos e na produção de álcool.
O Brasil é o segundo produtor mundial desta cultura,
com cerca de dois milhões de hectares plantados,
estimando-se mais de 26 milhões de toneladas colhidas
para a safra 2009 [2].
Toda planta é um ambiente propicio a colonização
por microrganismos, alguns maléfico e outros
benéficos, destes um dos mais estudados são as
bactérias promotoras de crescimento vegetal, que
associadas às plantas hospedeiras aumentam o vigor da
planta e consequentemente o aumentam a produção.
Dentre estas, estão algumas bactérias endofíticas
promotoras de crescimento vegetal [3].
Além da forte atuação na produção agrícola, as
bactérias podem se tornar um grande potencial na
indústria alimentícia, cosmética e farmacêutica, já que
segundo Menéndez et al. [4] algumas linhagens
bacterianas são capazes de produzir levana, um
exopolissacarídeo constituído por unidades de frutose,
obtidas pela reação de transfrutosilação durante a
fermentação de microrganismos em meio rico em
sacarose, utilizado na indústria farmacêutica como
anticarcinógeno e na indústria cosmética e alimentícia
como agente espessante e adoçante.
Considerando-se
que
as
plantas
são
um
microecossistema complexo onde diferentes nichos são
explorados por uma extensa variedade de bactérias que
apresentam relações neutras e simbióticas com a planta
hospedeira [5], este trabalho teve como objetivos: isolar em
meio LGI-P, caracterizar morfologicamente e selecionar
linhagens bacterianas endofíticas produtoras de levana
(exopolissacarídeo que apresenta inúmeras aplicações
biotecnológicas) associadas a plantas de mandioca
cultivadas no Estado de Pernambuco.
Material e métodos
A. Amostra vegetal
Foram utilizadas amostras de caules e raízes de plantas
de mandioca cultivadas no município de Garanhuns, PE,
(latitude 8051’25’’S e longitude 36027’’31’’O), durante o
primeiro semestre de 2009. As amostras vegetais foram
coletadas 16 meses após o plantio, sendo identificadas e
levadas ao Laboratório de Genética e Biotecnologia
Microbiana (LGBM) da Unidade Acadêmica de Garanhuns
(UAG/UFRPE) para processamento das análises.
B. Isolamento de bactérias endofíticas
Após a coleta, as amostras vegetais foram lavadas para
retirada de resíduos de poeira e solo. Então foram cortadas
em segmentos de 08 a 12cm, sendo lavados em álcool 70%,
e, em seguida, retirada toda sua epiderme.
Aproximadamente 1g das amostras de raízes e 0,5g das
amostras de caules foram cortadas, assepticamente, em
pequenos fragmentos e triturados em 4ml de tampão PBS.
Após estas etapas, 100µL de cada solução foram
inoculados, em triplicatas, em meio semi-sólido LGI-P,
seletivo para Gluconacetobacter diazotrophicus, segundo
Dobereiner et al. [6], e incubados a 28ºC.
As películas formadas foram riscadas em meio LGI-P
sólido, acrescido 20mg/L de extrato de levedura, incubadas
________________
1. Aluna de Graduação em Agronomia da Unidade Acadêmica de Garanhuns, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Av. Bom Pastor, s/n, Boa
Vista, Garanhuns, PE, CEP 55296-901. E-mail: [email protected]
2. Professor Adjunto do Departamento de Agronomia, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Rua Dom Manuel de Medeiros, Dois Irmãos,
Recife, PE, CEP 52171-900.
3. Professora Adjunta da Unidade Acadêmica de Garanhuns, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Av. Bom Pastor, s/n, Boa Vista,
Garanhuns, PE, CEP 55296-901.
4. Doutorando do PPG em Ciência do Solo, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Rua Dom Manoel de Medeiros, s/n, Dois Irmãos, Recife,
PE, CEP 52171-900. E-mail: [email protected]
5. Alunos de Graduação em Agronomia da Unidade Acadêmica de Garanhuns, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Av. Bom Pastor, s/n,
Boa Vista, Garanhuns, PE, CEP 55296-901.
Apoio financeiro: CNPq e FACEPE.
a 28°C por 7-10 dias, em seguida realizou-se a
purificação das colônias pela técnica de esgotamento.
Colônias puras foram estocadas em meio Batata-P a
4ºC, além de serem estocadas a -20°C, em meio líquido
LGI-P com extrato de levedura, acrescido de glicerol
30%.
B. Caracterização morfológica
Para caracterização da morfologia, os isolados foram
estriados em placas de Petri com meio LGI-P sólido,
com extrato de levedura, e incubados a 28ºC. Após dez
dias de cultivo, os isolados foram avaliados quanto ao
aspecto morfológico, sendo considerado cor, brilho e
produção de goma.
C. Produção de levana
O teste para comprovar a produção de levana foi
realizado em meio ágar nutritivo-sacarose, como o
meio LGI-P sólido com extrato de levedura é um meio
nutritivo rico em sacarose, ele foi utilizado para esta
identificação, segundo Mariano [7]. Os isolados foram
repicados em forma de estrias e incubados a 28ºC por
dez dias, e, em seguida, avaliados.
Resultados
A. Isolamento
Durante os experimentos de isolamento em meio
LGI-P, seletivo para G. diazotrophicus, foram obtidos
52 isolados bacterianos de caules e raízes de plantas de
mandioca cultivada em Pernambuco, destes 22 foram
isolados do caule e 30 da raiz, como mostra a Figura 1A.
B. Caracterização morfológica
Quanto à morfologia, os isolados foram
classificados em dois grupos morfológicos: i) cor
laranja e aspecto brilhoso e gomoso; e ii) cor laranja
seco e sem goma, semelhante a G. diazotrophicus neste
meio de cultura.
C. Produção de levana
Foi observado que 46% das bactérias endofíticas da
mandioca, produziram levana, em diferentes
intensidades. Esta produção evidenciou-se pela
formação de colônias grandes, mucóides e elevadas,
colônias achatadas e secas caracterizaram o teste
negativo, como mostra a Figura 1-B e a Figura 1-C
mostra a freqüência de bactérias produtora e não
produtoras de levana.
Discussão
De acordo com Mendes [8], a densidade populacional
bacteriana no colmo de cana-de-açúcar é várias ordens de
magnitude menor do que em raízes, da mesma maneira isto
ocorre com relação aos isolados de mandioca, a freqüência
é maior na raiz qe no caule. Este fato na maioria dos casos
é devido ao maior contato raiz-solo, que facilita a entrada
das bactérias.
Como mostra Dobereiner et al. [6], a característica
morfológica de G. diazotrophicus são colônias pequenas,
de cor laranja e seca, indicando que os isolados com esta
característica provavelmente venham a ser esta espécie
bacteriana. É importante ressaltar que não foi encontrado,
até o momento, trabalhos que identifiquem a presença de
G. diazotrophicus em mandioca.
De acordo com Menéndez et al. [4], a produção de
levana é proporcionada pelo gene lsdB, que pode estar
inativo em alguns casos. Mostrando que os isolados
produtores de levana obtidos neste trabalho podem estar
com esse gene ativo.
Referências
[1]
[2]
[3]
[4]
[5]
[6]
[7]
[8]
SUZIKI, Marise Tanaka. 2006. Isolamento, identificação,e
caracterização de linhagens endofíticas de Bacillus thurnigiensis
de mandioca (Manihot esculenta Crantz). São Paulo. 102p.
Dissertação em Biotecnologia. Universidade de São Paulo –
Instituto Butantan – Instituto de Pesquisas Tecnológicas.
IBGE - Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística. 2009.
http://www.ibge.gov.br/home/estatistica/economia/agropecuaria/esta
tisticas_previsao_safras/default.shtm. (acessado em 10/09/09).
ROSENBLUETH, M.; MARTINEZ-ROMERO, E. 2006. Bacterial
endophytes and their interactions with hosts. Molecular Plant and
Microorganisms Interactions, 8: 827-837.
MENÉNDEZ, C.; HERNÁNDEZ, L.; BANGUELA, A.; PAÍS, J.
2004. Functional production and secretion of the Gluconacetobacter
diazotrophicus fructose-releasing exo-levanase (lsdB) in Pichia
pastoris. Enzyme and Microbial Technology, 34: 446–452.
STURZ, A.V.; CHRISTIE, B.R.; NOWAK, J. 2000. Bacterial
endophytes: potential role in developing sustainable systems of crop
production. Critical Reviews in Plant Sciences, 19: 1-30.
DÖBEREINER, J.; BALDANI, V.L.D.; BALDANI, J.I. 1995. Como
isolar e identificar bactérias diazotróficas de plantas nãoleguminosas. Brasília: EMBRAPA-CNPAB, Itaguaí-RJ, 60p.
MARIANO, R.L.R. 2000. Manual de práticas em fitobacteriologia.
Recife: O autor, p. 81-82.
MENDES, R. 2008. Diversidade e caracterização genética de
comunidades microbianas endofíticas associadas à cana-deaçúcar. Piracicaba, SP. 121p.:il. Tese (Doutorado em Agronomia).
Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz – Universidade de
São Paulo.
Figura 1. A) Freqüência relativa (%) de isolados bacterianos endofíticos em relação ao tecido vegetal de plantas de mandioca; B)
Padrões do teste de produção de levana, sendo I: Positivo; II: Negativo; C) Freqüência relativa (%) de isolados produtores de levana.