Texto Completo - Apresentação

CENTRO UNIVERSITÁRIO FRANCISCANO
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO
ÁREA DE CIÊNCIAS TECNOLÓGICAS
Curso de Mestrado em Nanociências
GABRIELA D’AVILA FARIAS
FORMULAÇÕES SEMISSÓLIDAS CONTENDO NANOCÁPSULAS DE
ADAPALENO: DETERMINAÇÃO DA ESTABILIDADE, AVALIAÇÃO DA
LIBERAÇÃO IN VITRO E ENSAIOS UTILIZANDO BIOMETRIA CUTÂNEA
Santa Maria, RS
2011
GABRIELA D’AVILA FARIAS
FORMULAÇÕES SEMISSÓLIDAS CONTENDO NANOCÁPSULAS DE
ADAPALENO: DETERMINAÇÃO DA ESTABILIDADE, AVALIAÇÃO DA
LIBERAÇÃO IN VITRO E ENSAIOS UTILIZANDO BIOMETRIA CUTÂNEA
Dissertação apresentada ao Curso de
Mestrado em Nanociências do Centro
Universitário Franciscano de Santa Maria
como requisito parcial para obtenção do
título de Mestre em Nanociências.
Orientador(a): Prof(a) Dr(a) MARTA PALMA ALVES
Santa Maria, RS
2011
Ficha Catalográfica
F224f
Farias, Gabriela D’Avila
Formulações semissólidas contendo nanocápsulas de
adapaleno: determinação da estabilidade, avaliação da liberação in
vitro e ensaios utilizando biométrica cutânea / Gabriela D’Avila
Farias ; orientação Marta Palma Alves. – Santa Maria: Centro
Universitário Franciscano, 2011.
107 f. : il.
Dissertação (Mestrado em Nanociências) – Centro Universitário
Franciscano, 2011.
1. Adapaleno 2. Nanocápsulas 3. Formulações semissólidas
4. Estabilidade 5. Biometria cutânea I. Alves, Marta Palma II.
Título
CDU 615.262.1:62-181.4
Elaborada pela Bibliotecária Zeneida Mello Britto CRB10/1374
“Os sonhos não determinam o lugar em que você vai estar,
mas produzem a força necessária para tirá-lo do lugar em que está”
Augusto Cury, em Nunca desista de seus sonhos
AGRADECIMENTOS
Agradeço aos meus pais, que sempre me incentivaram. A eles que acreditaram nos
meus sonhos e apoiaram cada iniciativa, investiram nos meus estudos e contribuíram para
minhas conquistas pessoais e profissionais.
À minha irmã Luciana, pela compreensão, paciência e carinho, sempre me estimulando e
encorajando a buscar os meus sonhos.
À minha querida avó Talita, pelo apoio incondicional.
Agradecimento especial à Professora Marta Palma Alves, pela dedicação, paciência,
amizade e incentivo durante todo o período de orientação.
Às Professoras Renata Raffin e Sandra Cadore, pelos seus ensinamentos e contribuições,
indispensáveis para a realização deste trabalho.
Às amigas e colegas Isabel e Marcinha, pela amizade e auxílio, crucial para o
desenvolvimento dessa dissertação.
Aos colegas de mestrado, pelo companheirismo e amizade ao longo do curso, Gabi Moraes,
Jerusa, Adrianne, Danieli, Danielle, Nara, Rafaeli, Thaís, Ricardo, Júnior e Michelli.
À Paola, Bibiana e Taiane por toda a ajuda prestada durante a realização desse estudo.
Às funcionárias Ana, Denise, Franciele e Rosane pelas conversas de descontração e pelo
constante bom humor.
À Professora Ivana Zanella, coordenadora do Mestrado, e à Professora Solange
Fagan pela ajuda durante o tempo em que foi coordenadora do mestrado, aos Professores
do programa de Pós Graduação da UNIFRA - Mestrado de Nanociências.
À CAPES pelo apoio financeiro prestado através da concessão de bolsa.
À Rede de Nanotecnologia/Nanocosméticos – CNPq/MCT – UFRGS, pelo apoio e
incentivo.
E a todos os amigos que direta ou indiretamente contribuíram para a elaboração desse
trabalho.
RESUMO
A acne vulgar é uma doença genética hormonal, de localização pilo-sebácea. O
adapaleno, retinóide de terceira geração, é uma alternativa tópica para o tratamento da acne,
podendo apresentar alguns efeitos indesejáveis, sendo a irritação e o ressecamento da pele
os mais comuns. Em vista disso, e conhecendo as potencialidades dos nanocarreadores, o
presente trabalho tem como objetivo determinar a estabilidade físico-química de
formulações semissólidas contendo adapaleno nanoestruturado incorporado em Aristoflex
AVL®, avaliar os perfis de liberação em formulações semissólidas contendo nanocápsulas
(NC) de adapaleno incorporadas em Carbopol 940® e verificar a segurança do fármaco
nanoencapsulado in vivo, através de análises biofísicas não invasivas. Para a determinação
da estabilidade as amostras foram submetidas ao ciclo gelo-degelo, completando-se um
ciclo de 21 dias. Os estudos de liberação in vitro foram realizados comparando-se as
formulações contendo nanocápsulas de adapaleno (GCNCA) com o gel contendo o fármaco
na forma livre (GCA). Para o ensaio utilizando biometria cutânea, foram selecionados vinte
voluntários saudáveis. A cada semana foram realizados testes de bioengenharia cutânea,
incluindo avaliação do conteúdo aquoso do estrato córneo (hidratação), pH, coloração,
eritema e perda transepidérmica de água durante 63 dias. Nos estudos de estabilidade,
observou-se que o diâmetro médio das partículas, índice de polidispersão e potencial zeta
do creme gel contendo NC sem adapaleno (CGNC) e do creme gel contendo NC de
adapaleno (CGNCA) não apresentaram alterações após serem submetidos ao ciclo gelodegelo. As formulações semissólidas independente da forma de dispersão do fármaco
apresentaram fluxo não-newtoniano e comportamento pseudoplástico durante todo o
período de análise. O teor inicial de adapaleno no CGNCA não sofreu alteração, quando
comparado com o teor obtido no término do experimento. Entretanto, para o creme gel
contendo adapaleno livre (CGA) houve uma redução na concentração de adapaleno, visto
que o teor inicial decaiu para valores abaixo de 90% após 21 dias de análise. Com relação
aos estudos de liberação, pode-se observar que o GCNCA apresentou concentração total e
taxa de liberação menor do que o GCA, o que demonstra a capacidade das nanopartículas
em controlar a liberação do fármaco. De acordo com os resultados observados para o ensaio
de bioengenharia cutânea, com relação à determinação do conteúdo de melanina, verificouse uma redução deste parâmetro no decorrer do experimento para ambas as formulações. O
GCNCA não causou eritema, configurando a segurança na utilização da formulação.
Entretanto, o GCA aumentou, de maneira estatisticamente significativa, o índice de eritema
da pele dos voluntários. Foi observado um aumento na perda transepidérmica de água para
o GCA enquanto no GCNCA observa-se uma redução deste parâmetro. Nos resultados
obtidos para hidratação cutânea, observou-se uma redução mais pronunciada dos valores do
conteúdo aquoso do estrato córneo nas regiões tratadas com GCA. Desta forma,
evidenciou-se que as nanocápsulas poliméricas são capazes de diminuir a perda
transepidérmica de água, favorecendo o grau de hidratação cutânea e mantendo a
integridade do estrato córneo.
Palavras-chave: adapaleno, nanocápsulas, formulações semissólidas, estabilidade,
biometria cutânea.
ABSTRACT
Acne vulgaris is a genetic hormone disease, located in the hair follicle. Adapalene a
third-generation retinoid, and it is a topical alternative for acne treatment, but may have
some adverse effects, irritation and dryness of the skin are the most common. Due to this,
and knowing the nanocarriers potential, the object of this study was determine the
physicochemical stability of semisolid formulations containing adapalene-loaded
nanocapsules (NC) incorporated in Aristoflex AVL®, evaluate the release profiles in
semisolid formulations containing nanocapsules containing adapalene incorporated in
Carbopol 940® and verify the safety of the formulation in vivo by noninvasive biophysical
analysis. For the determination of the stability, samples were subjected to freeze-thaw
cycle, completing a cycle of 21 days. The in vitro release studies were performed
comparing the drug-loaded NC (GCNCA) with the gel containing adapalene in its free form
(GCA). For the skin bioengineer techniques, twenty healthy volunteers were selected. Each
week were performed biometric skin tests including stratum corneum water content
(hydration), pH, color, erythema and transepidermal water loss for 63 days. In stability
studies, we observed that the average particle size, polydispersity and zeta potential of
cream gel containing NC without adapalene (CGNC) and cream gel containing adapaleneloaded NC (CGNCA) showed no change after being subjected to the freeze-thaw cycle.
Semisolid formulations showed non-Newtonian flow and pseudoplastic behavior during the
study period. The initial adapalene content in CGNCA did not change compared with the
result obtained at the end of the experiment. However, for the cream gel containing free
adapalene (CGA), there was a reduction in the drug concentration, whereas the initial
content decreased to below 90% after 21 days of analysis. According to release studies, we
can observe that the GCNCA showed total concentration and release rate less than the
GCA, which demonstrates the ability of nanoparticles to control the drug release.
According to the results observed for the non-invasive method in relation to the
determination of melanin content, there was a decrease in this parameter during the
experiment for both formulations. The GCNCA did not cause erythema, configuring
security in the use of the formulation. However, the GCA increased the index of erythema
of the skin of volunteers. We observed an increase in transepidermal water loss to the GCA
while in GCNCA there is a reduction of this parameter. The results obtained for skin
hydration, there was a more pronounced reduction of the values of the stratum corneum
water content in the treated areas with GCA. Thus, it was evident that the polymeric
nanocapsules are able to decrease transepidermal water loss, favoring the skin hydration
degree and keeping the stratum corneum integrity.
Keywords: adapalene, nanocapsules, semisolid formulations, stability and non-invasive
method.
LISTA DE ABREVIATURAS
ACN - Acetonitrila;
ANOVA - Análise de Variância;
CGA - Creme gel contendo adapaleno na forma livre;
CGNCA - Creme gel com nanocápsulas contendo adapaleno;
CGC - Creme gel controle;
CLAE - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência;
DP - Desvio Padrão;
DPR - Desvio Padrão Relativo;
FDA - Food and Drug Administration;
GCA - gel de Carbopol® contendo adapaleno na forma livre;
GCNCA - gel de Carbopol® contendo adapaleno nanoencapsulado;
Kp - Coeficiente de permeabilidade;
MSC - Critério de Seleção do Modelo;
NC - Nanocápsulas;
NLS - Nanopartículas Lipídicas Sólidas;
PCL - poli (ε-caprolactona);
PLA - ácido poli (lático);
PLAGA - ácido poli (lático-co-glicólico);
PTEA – Perda Transepidérmica de Água
r - Coeficiente de Correlação;
THF – Tetrahidrofurano;
UV- Radiação Ultravioleta;
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Composição das suspensões de nanocápsulas de poli(ε-caprolactona) contendo
adapaleno ............................................................................................................................. 34
Tabela 2 - Composição do gel hidrofílico contendo nanocápsulas de adapaleno ................ 36
Tabela 3. Composição do creme gel controle (CGC), creme gel contendo adapaleno na
forma livre (CGA) e creme gel com nanocápsulas contendo adapaleno (CGNCA) ........... 37
Tabela 4. Mecanismos de liberação de substâncias por difusão a partir de sistemas
poliméricos de diferentes geometrias (SIEPMANN e PEPPAS, 2001) .............................. 47
Tabela 5. Diâmetro médio, índice de polidispersão e potencial zeta das nanocápsulas
contendo adapaleno (CGNCA) e das nanocápsulas sem adapaleno (CGNC) incorporadas
em Aristoflex AVL® ............................................................................................................ 54
Tabela 6. Valores referentes à viscosidade, índice de plasticidade (n) e coeficiente de
consistência (K) apresentados pelas formulações semissólidas, contendo adapaleno na
forma livre (CGA) e nanoencapsulada (CGNCA) durante 21 dias de experimento ........... 58
Tabela 7. Valores referentes à espalhabilidade (mm²) das formulações semissólidas
contendo adapaleno na forma livre (CGA) e na forma nanoencapsulada (CGNCA) durante
21 dias de estudo ................................................................................................................. 61
Tabela 8. Determinação do conteúdo aquoso do estrato córneo realizado por biometria
cutânea utilizando gel de Carbopol® contendo adapaleno na forma livre (GCA) e na forma
nanoencapsulada (GCNCA) ................................................................................................ 67
Tabela 9. Determinação do pH realizado por biometria cutânea para avaliação do gel de
Carbopol® contendo adapaleno na forma livre (GCA) e na forma nanoencapsulada
(GCNCA) ............................................................................................................................ 69
Tabela 10. Determinação da perda transepidérmica de água realizada por biometria cutânea
utilizando o gel de Carbopol® contendo adapaleno na forma livre (GCA) e na forma
nanoencapsulada (GCNCA) ................................................................................................ 71
Tabela 11. Determinação do conteúdo de melanina realizado por biometria cutânea
utilizando o gel de Carbopol® contendo adapaleno na forma livre (GCA) e na forma
nanoencapsulada (GCNCA) ................................................................................................ 74
Tabela 12. Determinação da presença de eritema realizado por biometria cutânea utilizando
o gel de Carbopol® contendo adapaleno na forma livre (GCA) e na forma nanoencapsulada
(GCNCA) ............................................................................................................................ 76
Tabela 13. Valores referentes ao fluxo, coeficiente de regressão, coeficiente de
permeabilidade (Kp) e concentração total liberada de adapaleno para a forma
nanoencapsulada (GCNCA) e para a forma livre (GCA) (n=6) .......................................... 80
Tabela 14. Parâmetros do modelo monoexponencial para o gel hidrofílico contendo
adapaleno na forma livre (GCA) ......................................................................................... 84
Tabela 15. Parâmetros do modelo monoexponencial e biexponencial para o gel contendo
adapaleno nanoencapsulado (GCNCA) ............................................................................... 85
Tabela 16. Parâmetros obtidos pela aplicação da Lei da Potência à formulação contendo
adapaleno nanoencapsulado ............................................................................................... 87
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Ilustração da interdisciplinaridade entre as áreas de conhecimento utilizadas para
a realização deste trabalho.................................................................................................... 18
Figura 2. Representação esquemática da pele ...................................................................... 19
Figura 3. Processo patológico da acne ................................................................................ 21
Figura 4. Mecanismo de ação dos retinóides ....................................................................... 23
Figura 5. Estrutura molecular do adapaleno........................................................................ 24
Figura 6. Representação esquemática de nanoesferas e nanocápsulas ................................ 27
Figura 7. Formulações semissólidas contendo adapaleno nanoencapsulado em 0 dias (A) e
após 21 dias de experimento (B) ......................................................................................... 51
Figura 8. Formulações semissólidas contendo adapaleno na forma livre em 0 dias (A) e
após 21 dias de experimento (B) ......................................................................................... 52
Figura 9. Reograma para as formulações contendo adapaleno na forma livre ou
nanoencapsulada referentes aos valores iniciais e após 21 dias de estudo.......................... 60
Figura 10 - Valores referentes a espalhabilidade apresentada pelas formulações contendo
adapaleno na forma livre ou nanoencapsulado durante 21 dias de estudo .......................... 62
Figura 11. Curva padrão do adapaleno obtida por CLAE ................................................... 63
Figura 12. Representação gráfica dos valores médios obtidos no período de 63 dias, no
ensaio de biometria cutânea para perda transepidérmica de água ........................................ 72
Figura 13. Representação gráfica dos valores médios obtidos no período de 63 dias, no
ensaio de biometria cutânea para os valores de eritema ....................................................... 76
Figura 14. Curva de calibração do adapaleno obtida por CLAE ......................................... 78
Figura 15. Perfil de liberação do gel contendo adapaleno nanoencapsulado (GCNCA) e do
gel contendo o fármaco livre (GCA) até atingir o platô (48 horas) ..................................... 80
Figura 16. Ajuste gráfico do modelo monoexponencial para o gel contendo adapaleno na
forma livre ........................................................................................................................... 84
Figura 17. Ajuste gráfico do modelo monoexponencial (a) e biexponencial (b) para o gel
contendo nanocápsulas de adapaleno .................................................................................. 86
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 15
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ....................................................................................... 19
2.1 Pele ................................................................................................................................. 19
2.2 Acne ............................................................................................................................... 20
2.3 Retinóides ...................................................................................................................... 22
2.4 Adapaleno...................................................................................................................... 24
2.5 Nanotecnologia.............................................................................................................. 25
2.6 Nanocarreadores........................................................................................................... 26
2.7 Bioengenharia cutânea ................................................................................................. 28
3 METODOLOGIA............................................................................................................ 32
3.1 Materiais........................................................................................................................ 32
3.1.1 Matérias-primas, solventes e outros materiais............................................................. 32
3.1.2 Equipamentos .............................................................................................................. 32
3.2 Método ........................................................................................................................... 33
3.2.1 Preparação das suspensões .......................................................................................... 33
3.2.2 Avaliação físico-química das suspensões de nanocápsulas contendo adapaleno........ 34
3.2.2.1 Doseamento do adapaleno nas suspensões coloidais (taxa de recuperação) ............ 34
3.2.2.2 Determinação do diâmetro médio das partículas e índice de polidispersão ............. 35
3.2.2.3 Potencial zeta............................................................................................................ 35
3.2.2.4 Determinação do pH................................................................................................. 35
3.2.3 Preparação das formulações semissólidas contendo nanocápsulas de adapaleno ....... 36
3.2.3.1 Gel Hidrofílico.......................................................................................................... 36
3.2.3.2 Creme gel com Aristoflex AVL® ............................................................................. 37
3.2.4 Determinação dos parâmetros de estabilidade para as formulações semissólidas de
Aristoflex AVL® contendo adapaleno na forma nanoencapsulada e na forma livre ............ 38
3.2.4.1 Determinação das características organolépticas das formulações semissólidas
contendo adapaleno na forma livre e nanoencapsulada ....................................................... 38
3.2.4.2 Determinação da distribuição do diâmetro médio e índice de polidispersão das
nanocápsulas de adapaleno................................................................................................... 39
3.2.4.3 Determinação do potencial zeta das nanocápsulas ................................................... 39
3.2.4.4 Determinação do pH das formulações semissólidas ................................................ 39
3.2.4.5 Determinação das características reológicas para as formulações semissólidas
contendo adapaleno na forma livre e nanoencapsulada ....................................................... 39
3.2.4.5.1 Determinação da viscosidade ................................................................................ 39
3.2.4.5.2 Determinação da espalhabilidade .......................................................................... 40
3.2.4.6 Determinação do teor de adapaleno das formulações semissólidas ......................... 40
3.2.4.7 Teste de centrifugação .............................................................................................. 41
3.2.5 Avaliação dos efeitos das formulações na pele humana por Bioengenharia Cutânea. 41
3.2.5.1 Critérios de inclusão e exclusão para seleção de voluntários................................... 41
3.2.5.2 Condições experimentais.......................................................................................... 41
3.2.5.3 Estudos de biometria cutânea ................................................................................... 42
3.2.5.4 Determinação do conteúdo aquoso do estrato córneo (grau de hidratação cutânea) 43
3.2.5.5 Determinação do pH cutâneo ................................................................................... 43
3.2.5.6 Determinação da perda transepidérmica de água (PTEA)........................................ 43
3.2.5.7 Determinação da intensidade de melanina e eritema................................................ 44
3.2.6 Estudos de liberação in vitro ...................................................................................... 45
3.2.6.1 Análise dos resultados de liberação.......................................................................... 45
3.2.7 Ajuste de curvas dos perfis cinéticos........................................................................... 46
3.3 Análise estatística.......................................................................................................... 48
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................... 49
4.1 Avaliação físico-química das suspensões de nanocápsulas contendo adapaleno .... 49
4.2 Determinação dos parâmetros de estabilidade para as formulações semissólidas
contendo adapaleno na forma nanoencapsulada e na forma livre................................. 50
4.2.1 Determinação das características organolépticas das formulações semissólidas
contendo adapaleno na forma livre e nanoencapsulada ....................................................... 51
4.2.2 Determinação da distribuição do diâmetro médio, índice de polidispersão e potencial
zeta das nanocápsulas de adapaleno incorporadas nas formulações semissólidas ............... 53
4.2.3 Determinação do pH das formulações semissólidas contendo adapaleno na forma livre
e na forma nanoencapsulada................................................................................................. 55
4.2.4 Determinação das características reológicas para as formulações semissólidas
contendo adapaleno na forma livre e nanoencapsulada ....................................................... 57
4.2.5 Determinação do teor de adapaleno das formulações semissólidas ............................ 63
4.2.5.1 Construção da curva padrão para determinação do teor de adapaleno..................... 63
4.2.5.2 Doseamento do adapaleno na forma livre e nanoencapsulada e incorporado nas
formulações semissólidas ..................................................................................................... 64
4.2.6 Teste de centrifugação ................................................................................................. 65
4.3 Avaliação
dos efeitos
das
formulações na pele humana por Bioengenharia
Cutânea................................................................................................................................ 65
4.3.1 Determinação do conteúdo aquoso do estrato córneo ................................................. 66
4.3.2 Determinação do pH.................................................................................................... 69
4.3.3 Determinação da perda transepidérmica de água ........................................................ 70
4.3.4 Determinação do conteúdo de melanina...................................................................... 73
4.3.5 Determinação da presença de eritema ......................................................................... 75
4.4 Estudos de liberação in vitro ....................................................................................... 77
4.4.1 Construção da curva analítica para realização dos estudos de liberação..................... 77
4.4.2 Análise dos resultados de liberação............................................................................. 78
4.5 Ajuste de curvas dos perfis cinéticos .......................................................................... 83
5 CONCLUSÕES................................................................................................................ 89
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 92
1 INTRODUÇÃO
A pele é o maior órgão do nosso organismo e representa uma barreira importante à
penetração de substâncias, mantendo os fluidos corporais e eliminando substâncias nocivas.
Entretanto alguns compostos com características específicas podem ser absorvidos de
forma significativa. Esta barreira protetora age também impedindo que produtos químicos e
outras substâncias externas ao organismo interfiram em processos bioquímicos internos
(POET e MCDOUGAL, 2002; HADGRAFT, 2004).
A pele é composta por três camadas: epiderme, derme e hipoderme. O estrato
córneo é a camada mais externa da epiderme, representa uma barreira significativa de
proteção do ambiente externo e controla a perda de água, eletrólitos e outros constituintes
endógenos (BARRY in AULTON, 2005; RAWLINGS et al, 2008). O transporte de
substâncias através de membranas biológicas como a pele é um fenômeno complexo que
compreende interações físicas, químicas e biológicas (YAMASHITA e HASHIDA, 2003).
A acne é uma das condições inflamatórias crônicas mais comuns que acometem a
pele (VLACHOU e LICHYSHYN, 2006). O quadro patológico da acne afeta as unidades
pilossebáceas, e sua etiologia envolve 4 processos principais: hiperproliferação folicular,
excesso de produção de sebo, inflamação e proliferação do Propionibacterium acnes
(COLLIER, HARPER e CANTRELL, 2008). A infecção bacteriana contribui para a
ruptura da unidade pilossebácea dilatada, com extravasamento do conteúdo para a derme,
provocando as lesões inflamatórias da acne. As lesões clínicas variam de comedões não
inflamados a pápulas, pústulas e cistos inflamatórios. O sebo é substrato para a
Propionibacterium acnes, a qual produz lipase. Esta enzima forma ácidos graxos livres que
são irritantes. A bactéria também libera fatores quimiotáticos que são mediadores da
inflamação. As lesões da acne surgem principalmente na face, pescoço, ombros e dorso
(SILVA, 2002; IRBY, YENTZER e FELSMAN, 2008).
Os retinóides são uma alternativa tópica para tratamento da acne, porque eles agem
na lesão primária, o microcomedão (CHIVOT, 2005). O adapaleno, derivado do ácido
naftóico, é um retinóide de terceira geração, administrado por via tópica e que tornou-se
amplamente utilizado devido à sua eficácia. Este fármaco porém, apresenta ação irritante, o
que pode limitar o seu uso (SHALITA, 2001; CZERNIELEWSKI et al, 2001).
15
A nanotecnologia aplicada a produtos cosméticos e dermatológicos é uma área de
pesquisa e desenvolvimento tecnológico que vem crescendo significativamente nos últimos
anos (ALVAREZ-ROMÁN et al, 2004; BOWMAN e CALSTER, 2008). Refere-se a uma
tecnologia que manipula a matéria na escala de átomos e moléculas, ou seja, em uma escala
muito pequena, medida em nanômetros, onde um deles equivale a um bilionésimo do
metro. Sabe-se que toda a farmacologia pode obter avanços advindos da nanociência e
nanotecnologia. Assim sendo, muitos fármacos podem ser agregados à superfície ou
encapsulados no interior de nanoestruturas projetadas para serem absorvidas por órgãos
específicos do corpo, onde finalmente liberarão o ativo. Dessa forma, doses muito menores
do fármaco podem se tornar efetivas, com a conseqüente redução dos efeitos colaterais
(SAHOO, PARVEEN e PANDA, 2007; CEVC e VIERL, 2010).
Sistemas de liberação, como nanocarreadores, têm sido utilizados na tentativa de
modular a função barreira do estrato córneo e facilitar o transporte de fármacos na pele
(BARRY, 2001; PRAUSNITZ et al, 2004) assim, nanopartículas poliméricas têm sido
extensivamente estudadas como transportadoras de fármacos (GUTERRES et al, 1995;
ALVAREZ-ROMÁN et al, 2004; OURIQUE et al, 2008; MORA-HUERTAS, FESSI e
ELAISSARI, 2010).
Fármacos nanoencapsulados aplicados topicamente podem permanecer na pele por
um período de tempo prolongado (ALVAREZ-ROMÁN et al, 2004; CEVC e VIERL,
2010), aumentando a sua estabilidade química (ALLÉMANN, LEROUX e GURNY 1998;
VILA et al, 2002) e reduzindo sua toxicidade a fim de proporcionar índices terapêuticos
mais adequados (BARAN, ÖZER e HASIRCI, 2002; ALVAREZ-ROMÁN et al, 2004).
O termo nanopartículas poliméricas é usado para descrever nanoesferas e
nanocápsulas, as quais diferem pela presença do núcleo oleoso presente no sistema
(SCHAFFAZICK et al, 2003). Os principais modelos de nanocápsulas são vesículas finas
de polímero biodegradável e uma cavidade central com núcleo oleoso, podendo a
substância ativa estar dissolvida neste núcleo oleoso e/ou adsorvida na parede polimérica
(COUVREUR et al, 2002).
Para o desenvolvimento de novas formulações dermocosméticas, alguns critérios
importantes como efeitos sobre a hidratação da pele, pH, conteúdo de melanina, índice de
eritema e perda transepidérmica de água devem ser considerados. Estes efeitos podem ser
16
influenciados pela utilização de veículos adequados ou por ingredientes ativos, que são
incorporados na formulação. Antes do emprego de metodologias não invasivas, estes
parâmetros baseavam-se, na maioria das vezes, apenas na observação clínica, o que, devido
a sua subjetividade, pode ser considerado um método pouco preciso. Em vista disso, a
bioengenharia cutânea é um dos mais importantes avanços na área da dermatologia, pois
trata-se do estudo das características biológicas e funcionais da pele através da medição
rigorosa de determinadas variáveis por métodos cientificamente comprovados e nãoinvasivos (WIECHERS e BARLOW, 1999; LEONARDI, GASPAR e MAIA CAMPOS,
2002; WISSING e MÜLLER, 2003; KIM et al, 2009; CHENG et al, 2010).
Conhecendo-se as potencialidades dos nanocarreadores, a realização do presente
trabalho justifica-se através do estudo de formulações tópicas semissólidas contendo
nanocápsulas de adapaleno, propondo uma liberação controlada com redução dos efeitos
colaterais do fármaco. Estes experimentos tornam-se de grande importância, visto que os
retinóides quando usados topicamente têm efeito irritante, o que causa redução significativa
no seu uso. Além disso, será utilizado o óleo de melaleuca como núcleo oleoso na
preparação das suspensões coloidais, o qual apresenta várias propriedades medicinais
incluindo atividade antibacteriana e anti-inflamatória, o que poderá contribuir de forma
sinérgica no tratamento tópico da acne (REICHLING et al, 2006).
Quando se trata de nanotecnologia diversas áreas estão associadas como a física,
eletrônica, ciência da computação, química, biologia e farmácia, por meio de nanomateriais
e interações físico-químicas dos mesmos, o que gera propriedades específicas em função da
escala nanométrica. Essa união na pesquisa da nanoescala deve-se à necessidade de
partilhar conhecimento sobre ferramentas e técnicas, assim como sobre interações atômicas
e moleculares, nesta nova fronteira científica (DURAN, MATTOSO e MORAIS, 2006;
OBERDÖRSTER, STONE e DONALDSON, 2007; SUH et al, 2009; PASCHOALINO et
al, 2010). Portanto, este trabalho, abrange diferentes áreas do conhecimento, como pode ser
observado na Figura 1, refletindo muito bem o caráter interdisciplinar do curso de Mestrado
em Nanociências.
17
Figura 1. Ilustração da interdisciplinaridade entre as áreas de conhecimento utilizadas para a realização deste
trabalho
De acordo com o que foi observado anteriormente, este estudo teve como objetivo
determinar a estabilidade físico-química de formulações semissólidas contendo adapaleno
nanoencapsulado incorporado em um veículo inovador. Além disso, o presente experimento
visa avaliar os perfis de liberação em gel de Carbopol 940® contendo nanocápsulas de
adapaleno e verificar a segurança do fármaco nanoencapsulado in vivo, através de análises
biofísicas não invasivas.
Cale ressaltar que as suspensões de nanocápsulas contendo adapaleno foram
previamente desenvolvidas e incorporadas em gel de Carbopol 940® por Barrios et al
(2009) e Bruschi (2010).
18
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Pele
A administração tópica de fármacos ou ativos cosméticos possui como vantagens a
diminuição dos efeitos sistêmicos e a vetorização de substâncias à área lesada (GUTERRES
et al, 2007). A pele humana desenvolve diversas funções, dentre elas, barrar a entrada de
moléculas indesejadas do meio externo enquanto controla a perda de água, eletrólitos e
outros constituintes endógenos. Por outro lado, a pele é uma via para administração de
fármacos que utiliza a quimioterapia tópica ou sistêmica. Na indústria farmacêutica e
cosmética, portanto, é importante prever a taxa em que as substâncias penetram na pele
(YAMASHITA e HASHIDA, 2003). Entre os fatores que afetam a absorção cutânea estão
às propriedades físico-químicas do fármaco, propriedades do veículo, concentração do ativo
e o estado fisiológico da pele (ANSEL et al, 1999; SILVA, 2002).
A pele é composta de três camadas, epiderme, derme e hipoderme ou tecido
subcutâneo (Figura 2). O estrato córneo, a camada mais externa da epiderme, é a principal
barreira contra a permeação de fármacos aplicados topicamente (YAMASHITA e
HASHIDA, 2003).
Figura 2. Representação esquemática da pele. Adaptada de Prauznitz et al., 2004
Na epiderme, as células sofrem diferenciação, tornando-se queratinizadas à medida
que vão migrando para a superfície da pele. Quando se tornam totalmente queratinizadas,
19
as células passam a ser denominadas corneócitos e compõem o estrato córneo até que
ocorra a descamação. Em uma pele saudável este processo leva cerca de 24 dias (MENON,
2002).
O interior dos corneócitos consiste em filamentos de queratina, enquanto o espaço
intercelular é preenchido com uma matriz lipídica, organizada em bicamadas
multilamelares. Estes lipídios possuem uma estrutura altamente ordenada à temperatura
fisiológica e, portanto, desempenham um papel importante na função de barreira da pele
(YAMASHITA e HASHIDA, 2003).
Existem duas rotas de difusão para uma molécula penetrar a pele: uma rota é através
de folículos pilosos e glândulas representando 0,1% da superfície cutânea, e a outra é pela
transposição do estrato córneo. Desta forma o caminho da epiderme torna-se a principal
rota de penetração de compostos na pele (MOSER et al, 2001). Entretanto, quando trata-se
de estruturas nanoparticuladas, vale ressaltar que as mesmas tendem a acumularem-se nas
aberturas foliculares, visto que a localização folicular é favorecida pelo menor tamanho de
partícula (ALVAREZ-ROMÁN et al, 2004). Sendo assim, o estrato córneo e a unidade
folicular podem ser vistos como uma oportunidade para a administração de medicamentos
(PRAUSNITZ et al, 2004; BARRY, 2001).
A acne é uma das doenças de pele mais freqüentes em dermatologia. Alguns estudos
estimam que 90% de todos os jovens são afetados pela acne, e praticamente 100% dos
adolescentes afetados apresentam formação de comedões. Esta condição pode causar uma
mudança na qualidade da vida do paciente inclusive em relação ao seu ambiente social
(COLLIER, HARPER e CANTRELL, 2008; HASBÚN et al, 2008).
2.2 Acne
A acne vulgar é considerada como a doença multifatorial mais prevalente em
adolescentes e adultos jovens e tem excedido o seu significado histórico, de um simples
aborrecimento da adolescência para passar a ser vista entre os dermatologistas como uma
condição patológica que frequentemente leva a doenças psicológicas significantes
(OLUTUNMBI et al, 2008).
A acne é uma doença genética hormonal, de localização pilossebácea (RAMOS e
20
SILVA et al, 2003). Sua etiologia é múltipla, incluindo: (a) estimulação androgênica das
glândulas sebáceas, com aumento da produção de sebo; (b) obstrução pela queratina do
canal pilossebáceo; (c) acúmulo de resíduos sebáceo e ceratínico, provocado pela obstrução
e conseqüente formação de cravos; e (d) proliferação de bactérias anaeróbias com
conseqüente reação inflamatória no local (SILVA, 2002). Clinicamente a acne é graduada
de acordo com os tipos de lesões presentes: comedões abertos e fechados, pápulas
inflamatórias, pústulas, cistos, nódulos e cicatrizes (COLLIER, HARPER e CANTRELL,
2008).
Figura 3. Processo patológico da acne. Adaptado de SOUZA e JUNIOR, 2006.
O sebo é uma mistura de lipídios, principalmente, colesterol, esqualeno, cera,
ésteres esteróides e triglicérides. Alterações na composição e/ou quantidade da secreção
sebácea colaboram para o desenvolvimento da doença, por alterar a queratinização do ducto
glandular e a proliferação bacteriana do Propionebacterium acnes (GUEDES et al, 2009).
Quanto mais grave for a acne, menor a concentração de ácido linoléico no sebo. No período
da puberdade a taxa de ácido linoléico no sebo, diminui na proporção inversa do número de
lesões acnéicas. A redução dos níveis de ácido linoléico é o elemento primordial na
comedogênese (COSTA, ALCHORNE e GOLDSCHMIDT, 2008).
A comedogênese pode ser considerada como uma alteração no processo de
descamação que ocorre nos queratinócitos do ducto folicular. Considerada como um fator
21
central no desenvolvimento da acne. A denominação comedogênese se deve a formação de
microcomedões, que podem evoluir para comedões abertos (pontos pretos), quando o
orifício folicular se dilata e, geralmente, não inflama; ou fechados (pontos brancos), quando
o orifício não se dilata, e é o precursor das lesões inflamatórias (HARTMANN e PLEWIG,
1983; VAZ, 2003). Os retinóides provocam a lise do comedão e por este motivo são
amplamente utilizados no tratamento da acne (CHIVOT, 2005).
2.3 Retinóides
São derivados sintéticos da Vitamina A (retinol). Quando administrados
topicamente, atuam principalmente como comedolíticos. Porém, tem sido demonstrada
também sua resposta imunológica, anti-inflamatória e atividade anti-tumoral (CHIVOT,
2005).
Os retinóides também podem ser o tratamento de escolha em outras doenças
dermatológicas que não a acne, como psoríase, câncer de pele, rosácea, lupus eritematoso,
entre outras. Na forma tópica estão incluídas a tretinoína (ácido all-trans-retinóico),
isotretinoína (ácido 13-cis-retinóico), adapaleno (derivado do ácido naftóico) e tazaroteno
(retinóide acetilênico). Estruturalmente, o adapaleno e tazaroteno são distantes da Vitamina
A, mas eles têm capacidade de ligarem-se aos receptores do ácido retinóico, expandindo a
definição do termo “RETINÓIDES” para incluir tais agentes (AKYOL e OZÇELIK, 2005).
Os retinóides são classificados em gerações. Os retinóides de primeira geração, da
qual fazem parte o ácido trans-retinóico, ácido 9-cis retinóico e ácido 13-cis retinóico, são
isômeros. Eles ocorrem naturalmente no organismo e durante a metabolização sofrem
interconversão. Os retinóides de segunda geração, monoaromáticos, são o etretinato e a
acitretina e os de terceira geração, também conhecidos como arotenóides, incluem o
bexacaroteno, o adapaleno e o tazaroteno (PIQUERO, 2004).
Esta classe de fármacos age nos queratinócitos através da ligação e ativação de
receptores específicos no núcleo e assim regulam a transcrição de genes (Figura 4). Existem
dois tipos de receptores retinóicos: Receptores ácido retinóicos (RARs) e receptores X
retinóicos (RXRs), os quais são considerados proteínas-chave na regulação da transcrição
genética. Cada um tem três subtipos α, β e γ (figura 4). O RARγ é o que mais está presente
22
na pele humana e é o principal mediador dos efeitos retinóicos nos queratinócitos. Os
retinóides também têm grande afinidade por outra família de proteínas, as proteínas de
ligação do ácido retinóico tipos I e II, localizadas no citoplasma. A tretinoína e isotretinoína
são retinóides não-seletivos, enquanto o adapaleno e tazaroteno são seletivos. Sabe-se que a
irritação na pele é influenciada pela seletividade do receptor (SHROOT, 1998; CHIVOT,
2005).
Figura 4. Mecanismo de ação dos retinóides (SHROOT, 1998)
Após a ligação aos receptores, dímeros RXR-RAR são formados, os quais são
capazes de regular a expressão dos genes envolvidos no crescimento e diferenciação
celular. RARs são fatores ligantes, reguladores da transcrição, que fazem parte da grande
família de receptores nucleares. Enquanto os RXRs são parceiros de dimerização de vários
outros receptores nucleares. Os RARs são ativos in vivo somente quando associados com
RXRs (AKYOL e OZÇELIK, 2005).
Os retinóides não somente modulam a diferenciação e proliferação dos
queratinócitos, mas também regulam a adesão celular, a qual mantém a coesão normal dos
queratinócitos. Desta forma, eles agem diretamente na camada córnea, que é quebrada e
desaparece (CHIVOT, 2005).
23
2.4 Adapaleno
Com o nome químico ácido 6-[3-(1-adamantil)-4-metoxifenil]-2-naftóico e fórmula
molecular C28H28O3, o adapaleno (Figura 5) é um derivado aromático do ácido naftóico
(TRICHARD et al, 2008), e o grupamento fenoxi adamantil confere um alto ponto de fusão
à molécula (SHROOT, 1998). O adapaleno é um pó branco solúvel em tetraidrofurano,
ligeiramente solúvel em etanol e praticamente insolúvel em água (GALDERMA, 2003;
LIMA, 2004; PISKIN e UZUNALI, 2007).
Figura 5. Estrutura molecular do adapaleno (SHROOT, 1998)
Contrário à tretinoína, o adapaleno é estável à oxidação e à luz, (CHIVOT, 2005;
IRBY, YENTZER e FELSMAN, 2008). Em um estudo realizado in vitro comparando
adapaleno e tretinoína, 95% de tretinoína foi degradada no prazo de 24 horas e na presença
de luz solar, enquanto o adapaleno não teve nenhuma degradação nestas condições, mesmo
em 72 horas (MARTIN et al, 1998; CZERNIELEWSKI et al, 2001). Além de
fotoquimicamente estável, o adapaleno é menos irritante do que o ácido retinóico e mais
eficaz para pacientes com acne vulgar leve a moderada, podendo atingir concentrações
mais elevadas na unidade pilossebácea (RAMOS E SILVA et al, 2003; KATSUNG, 2003).
O adapaleno na forma tópica de gel age no fundo do folículo piloso para controlar o
acúmulo de sebo e células que levam à formação de acne. Este fármaco não só ajuda a
prevenir a formação de novas lesões de acne, mas também contribui para as lesões que já
estão presentes (PHARMACEUTICAL NEWS, 2007).
Um mecanismo proposto para a maior tolerância do adapaleno é a sua capacidade
de ligação seletiva. Visto que, o adapaleno, diferente da tretinoína, não se liga às proteínas
de ligação do ácido retinóico localizadas no citoplasma, mas liga-se seletivamente aos
24
subtipos α e γ do receptor nuclear ácido retinóico (RAR). Essa ligação seletiva pode
ocasionar uma maior regulação na diferenciação e proliferação dos queratinócitos do que a
tretinoína (CZERNIELEWSKI et al, 2001), o que é responsável pelo efeito comedolítico do
adapaleno (BOUCLIER et al, 1991).
JACYK e MPOFU (2001) ao estudarem a eficácia e segurança de um gel com
adapaleno a 0,1%, comparado com um gel de tretinoína a 0,25% aplicado em pacientes
africanos, observaram que além de ter sido mais eficaz no tratamento da acne e apresentar
maior tolerância que a tretinoína, o adapaleno também reduziu a hiperpigmentação em pele
negra.
O adapaleno usado pela via tópica está descrito como substância retinóica pela
ANVISA, e de acordo com a Portaria nº344 de 12 de maio de 1998, está sujeito a venda sob
prescrição médica sem retenção de receita. Esse fármaco penetra na unidade pilossebácea
podendo apresentar alguns efeitos indesejáveis, onde a irritação e o ressecamento da pele
são os mais comuns (KOROLKOVAS, 2002; LIMA, 2004; CHIVOT, 2005). Em vista
disso, busca-se com o desenvolvimento de sistemas nanoestruturados além de minimizar
esses efeitos adversos, aumentar a eficácia desse ativo direcionando-o ao seu local de ação,
ou seja, o núcleo celular dos queratinócitos.
Atualmente existe um grande interesse na liberação seletiva de fármacos aplicados
topicamente. Como conseqüência disso, a busca por novas técnicas para entrega de
fármacos tem evoluído muito ao longo dos anos, uma dessas técnicas emprega o conceito
de nanotecnologia, onde sistemas nanocarreadores são estudados com o objetivo de
melhorar a seletividade e a eficiência das formulações (MONACO, 2000).
2.5 Nanotecnologia
A nanotecnologia refere-se à tecnologia na qual a matéria é manipulada em escala
atômica e molecular, na faixa de 1 a 100 nanômetros, para criar novos materiais e processos
com características funcionais diferentes dos materiais comuns. A nanotecnologia não trata
apenas do estudo dessas entidades tão pequenas, mas da aplicação desse conhecimento
(DURAN et al, 2006; SUH et al, 2009).
O físico Richard Feynman é considerado o pai da nanotecnologia. Em 1959, em
25
uma conferência no encontro anual da Sociedade Americana de Física, Feynman falou pela
primeira vez do controle e da manipulação da matéria na escala atômica. Feynman
defendeu que não existia nenhum obstáculo teórico à construção de dispositivos diminutos
constituídos por elementos muito pequenos, no limite átomo a átomo. Com isso, poderiam
ser criados materiais com propriedades inteiramente novas.
A nanotecnologia é verdadeiramente uma ciência multidisciplinar. Engenheiros,
biólogos e médicos trabalham ao lado de físicos, químicos e farmacêuticos. Essa união na
pesquisa da nanoescala deve-se à necessidade de partilhar conhecimento sobre ferramentas
e técnicas, assim como sobre conhecimentos periciais em matéria de interações atômicas e
moleculares, nesta nova fronteira científica. Portanto, a nanotecnologia está associada a
diversas áreas, como medicina, eletrônica, ciência da computação, química, biologia e
mecânica, por meio dos nanomateriais, ou seja, materiais com propriedades específicas
devido à sua escala nanométrica (OBERDÖRSTER, STONE e DONALDSON, 2007;
PASCHOALINO et al, 2010).
Estes conceitos não são diferentes no que se refere à bionanotecnologia, onde
diversos centros de pesquisas têm buscado desenvolver dispositivos com capacidade para
direcionar substâncias na quantidade exata a pontos específicos do organismo. As
vantagens do uso da nanobiotecnologia na produção de formulações dermatológicas podem
incluir à proteção de ingredientes quanto à degradação química ou enzimática, o controle da
liberação (principalmente no caso de substâncias irritantes em altas doses) e o aumento do
tempo de retenção dos ativos cosméticos ou fármacos na camada córnea (FRONZA et al,
2007).
2.6 Nanocarreadores
Partículas usadas como transportadores de fármacos para aplicações terapêuticas
devem ser biocompatíveis, biodegradáveis e fisicamente estáveis (HODOSHIMA et al,
1997). O desenvolvimento tecnológico de novas formas farmacêuticas tem sido a estratégia
mais promissora para aumentar e controlar a penetração de fármacos através da pele.
Nanoemulsões, nanopartículas poliméricas (nanocápsulas e nanoesferas), lipossomas e os
complexos lipídicos, têm sido investigados como opção frente ao uso dos sistemas mais
26
clássicos, tais como os promotores químicos de penetração (SCHAFFAZICK et al, 2003;
VERMA, et al, 2003; ALVAREZ-ROMÁN et al, 2004).
Atualmente existe um interesse amplo na liberação seletiva de fármacos, em vista
disso, sistemas carreadores têm sido estudados com o objetivo de proporcionar uma
liberação sustentada do fármaco em sítios de ação específicos, diminuição de efeitos
colaterais e proteção de fármacos facilmente degradáveis, aumentando assim a
biodisponibilidade e a eficácia do produto (SCHAFFAZICK et al, 2003; ALVES et al,
2007).
As nanopartículas, constituídas por polímeros biodegradáveis, têm atraído grande
atenção dos pesquisadores, devido às suas potencialidades terapêuticas e à alta estabilidade
nos fluídos biológicos e durante o armazenamento, frente aos lipossomas. Elas podem ser
definidas como sistemas coloidais submicrométricos, com tamanho de partícula entre 10 e
1000 nm, embora a faixa geralmente obtida seja de 100 a 500 nm. O termo nanopartícula
polimérica inclui as nanocápsulas e as nanoesferas (Figura 6), as quais diferem entre si
segundo a composição e organização estrutural. As nanocápsulas são constituídas por um
núcleo oleoso rodeado por uma membrana polimérica, podendo o fármaco estar dissolvido
neste núcleo e/ou adsorvido à parede polimérica. Por outro lado, as nanoesferas, que não
apresentam óleo em sua composição, são formadas por uma matriz polimérica, onde o
fármaco pode ficar retido ou adsorvido (COUVREUR et al, 2002; SCHAFFAZICK et al,
2003; ANTON, BENOIT e SAULNIER, 2008; MORA-HUERTAS, FESSI e ELAISSARI,
2010).
Figura 6. Representação esquemática de nanoesferas e nanocápsulas (DOS SANTOS, et al., 2008).
Em vista disto, as nanocápsulas podem ser definidas como um sistema reservatório
e apresentam algumas vantagens como alta eficiência de encapsulação de substâncias ativas
lipofílicas, devido à grande afinidade do fármaco com o núcleo oleoso, baixa concentração
27
de polímero quando comparado a outros sistemas nanoparticulados como as nanoesferas e
proteção do ativo contra fatores de degradação, como pH e radiação, devido a presença da
membrana polimérica (PINTO et al, 2006; ANTON, BENOIT e SAULNIER, 2008).
O desenvolvimento de formulações dermocosméticas utilizando ativos associados à
nanocarreadores têm sido objeto de estudo da comunidade científica. Entretanto, a
comprovação da segurança destes ativos nanoestruturados, bem como os efeitos
ocasionados pelas formulações na pele humana devem ser investigados. Equipamentos de
aplicação em cosmetologia, medicina estética e dermatologia, têm sido empregados com
esta finalidade dando, assim, origem a novas metodologias não invasivas para a avaliação
das características fisiológicas da pele in vivo (LEONARDI, GASPAR e MAIA CAMPOS,
2002; WISSING e MÜLLER, 2003). Vale ressaltar que não existem estudos anteriores
associando adapaleno à nanocarreadores.
2.7 Bioengenharia cutânea
Com relação aos demais campos da medicina, a dermatologia ainda faz pouco uso
de instrumentos que forneçam uma descrição objetiva e reprodutível das características
biológicas, mecânicas e funcionais da pele. Estes instrumentos são destinados a mudar a
nossa compreensão atual sobre muitos aspectos da fisiologia cutânea, fornecendo
explicações para fatos que até então permanecem confusos e revelando erros quando
somente a interpretação visual é utilizada (LOMUTO, PELLICANO e GIULIANI, 1995;
LEONARDI, GASPAR e MAIA CAMPOS, 2002).
A bioengenharia cutânea constituiu-se, nos últimos anos, num dos mais importantes
avanços de natureza tecnológica na área de dermatologia. Trata-se do estudo das
características biológicas e funcionais da pele através da medição rigorosa de determinadas
variáveis por métodos cientificamente comprovados e não-invasivos, não provocando,
portanto, qualquer agressão ou desconforto ao paciente ou aos voluntários que participam
dos estudos (LEONARDI, GASPAR e MAIA CAMPOS, 2002; WISSING e MÜLLER,
2003; KIM et al, 2009; CHENG et al, 2010).
A bioengenharia cutânea tem por objetivo compreender e analisar como os
componentes e demais ativos usados nos produtos agem sobre a pele, almejando comprovar
28
a eficácia de um produto, assim como criar parâmetros para o desenvolvimento de novos
produtos (GONÇALVES e CAMPOS, 2009).
Os equipamentos de biometria cutânea permitem que diversos parâmetros sejam
avaliados, como por exemplo, conteúdo aquoso do estrato córneo (hidratação), pH da pele,
coloração da pele, perda transepidérmica de água, dentre outros, através dos aparelhos
denominados Corneometer®, Skin pH-meter®, Mexameter® e Tewameter® (CourageKhazaka Electronic, Alemanha), respectivamente (BETZ et al, 2006).
O Mexameter® (Courage-Khazaka Electronic, Alemanha) é um instrumento portátil
projetado para medir o conteúdo de melanina e hemoglobina da pele, neste equipamento 16
emissores de luz de diodo dispostos circularmente, emitem luz em três comprimentos de
onda definidos 568 nm (verde), 660 nm (vermelho) e 880 nm (infravermelho) (CLARYS et
al, 2000). A célula fotoelétrica mede a luz refletida pela pele. Este medidor de reflexão
simples é baseado no mesmo princípio óptico desenvolvido por Diffey e colaboradores
(1984).
O índice de melanina é calculado a partir da intensidade da luz absorvida e refletida
em, respectivamente, 660 e 880 nm e o índice de eritema é calculado a partir da intensidade
da absorção e reflexão da luz em, respectivamente, 568 e 660 nm. A área de medição da
pele é de 5 mm de diâmetro (superfície 0,20 cm2). A sonda é aplicada sobre a superfície da
pele (1,54 cm2), com pressão constante através de uma mola (CLARYS et al, 2000; PARK
et al, 2006).
A determinação do pH cutâneo, ou seja, a concentração hidrogeniônica da superfície
cutânea é um importante indicador funcional da pele, visto que, a produção de ácido lático
confere à superfície cutânea aquilo que se convencionou designar por “manto ácido
cutâneo”. Desta forma a pele apresenta pH levemente ácido (4,6 – 5,8), contribuindo com a
proteção bactericida e fungicida em sua superfície. Além disso, as secreções cutâneas tem
capacidade tamponante, o que torna-se importante, uma vez que o pH da pele é
freqüentemente alterado em conseqüência da utilização de produtos tópicos inadequados,
expondo a pele a uma série de agentes agressores, em especial microorganismos
(RODRIGUES, 1995; PINTO, GALEGO e SILVA, 1997).
No Skin pH-meter® (Courage-Khazaka Electronic, Alemanha) a medida do pH
cutâneo é realizada por potenciometria direta, isto é, através de um eletrodo especial. A
29
potenciometria direta tem sido o método mais empregado para medição desta variável, pois
permite sensibilidade de determinação da ordem de 0,1 unidade de pH. Além disso, o Skin
pH-meter® é considerado como o único método técnico e cientificamente comprovado, a
medição é rápida e sem dificuldade, garantindo resultados precisos (RODRIGUES, 1996).
A hidratação cutânea é mantida por um filme hidrolipídico encontrado na pele, que
tem como funções formar uma barreira de proteção acídica evitando a penetração de
substâncias danosas ao organismo, protegendo a pele do ressecamento e mantendo a sua
flexibilidade (YILMAZ e BORCHERT, 2006).
O conteúdo aquoso do estrato córneo pode ser avaliado através do Corneometer®,
um equipamento que tem sido muito utilizado por apresentar alta sensibilidade
(HILLEBRAND et al, 2001; WISSING e MÜLLER, 2003; HÜBNER et al, 2006). Este
instrumento mede alterações na capacitância (capacidade elétrica, relação entre a carga
elétrica e o potencial de um condutor) de um condensador de precisão colocado em
contacto com a pele (LOMUTO, PELLICANO e GIULIANI, 1995). A capacitância é
medida através de uma sonda composta de eletrodos que contem uma rede interdigital de
ouro, não havendo contato galvânico entre a sonda e a superfície da pele. Existe um campo
elétrico de frequência variando entre 40 a 75 kHz que é estabelecido na camada superior da
pele. As mudanças na capacitância são convertidas em unidades de hidratação que variam
de 0 a 130 unidades arbitrárias (UA), onde 0 unidade corresponde à pele muito seca e 130
unidades à pele muito hidratada (Manual Courage-Khazaka Electronic, Alemanha).
A medida de perda de água transepidérmica (PTEA) é um método bem estabelecido
na dermatologia para avaliar a integridade da função barreira do estrato córneo da pele
humana in vivo. Uma das vantagens da utilização deste método é o fato de não ser
necessária a adição de nenhuma solução para a realização do teste. Quando a pele está
danificada, a sua função barreira é prejudicada, resultando em uma maior perda de água.
Mesmo mudanças sutis na integridade da barreira podem ser detectadas por medidas de
PTEA (NETZLAFF et al, 2006; CHENG et al, 2008).
Uma das funções principais da pele é a de se portar como barreira e manter a
homeostase interior e a resistência da permeabilidade de água do corpo. A capacidade da
perda de água transepidérmica no estrato córneo da pele, tem sido amplamente utilizada
como índice para avaliação da função barreira da pele (CHOU et al, 2005).
30
Um dos equipamentos mais utilizados para medir a PTEA é o Tewameter®, o qual é
baseado no princípio da difusão, descrito por Adolf Fick em 1885, que vem sendo muito
empregado na determinação da perda transepidérmica de água. Os valores são expressos
em g/hm2 (ROSADO, PINTO e RODRIGUES, 2005; INDRA et al, 2005; NETZLAFF et
al, 2006).
31
3 METODOLOGIA
3.1 Materiais
3.1.1 Matérias-primas, solventes e outros materiais
- Acetona P.A - Nuclear;
- Acetonitrila grau CLAE - J.T. Baker;
- Ácido fosfórico P.A - Nuclear;
- Adapaleno - Pharma Nostra;
- Metanol grau CLAE - J.T. Baker;
- Monoestarato de sorbitano (Span 60®) - Sigma Aldrich;
- Óleo de Melaleuca (Tea Tree Oil) - Via Farma;
- Poli (ε-caprolactona) MM = 65000 - Aldrich;
- Polissorbato 80 (Tween 80®) - Via Farma;
- Tetrahidrofurano grau CLAE - J.T. Baker;
- Aristoflex AVL® (Ammonium Acryloyldimethyl-taurate/ VP Polymer; Trilaureth-4Phosphate;
Polyglyceryl-2-sesquiisostearate;
Sunflower
Seed
Oil;
Tetradibutyl
Pentaerithrityl Hydroxyhydrocinnamate) – Pharma Special;
- Metilparabeno – Alpha Química;
- Propilparabeno – Alpha Química;
-Carbopol
940®
(carbomer
2-Propenoic
acid,
polymer
with
2,2-
bis(hydroxymethyl)propane-1,3-diol 2-propenyl ether) – Henrifarma.
3.1.2 Equipamentos
- Balança analítica AX 200 – Shimadzu®;
- Coluna cromatográfica – Lichrospher® 100 RP – 18,250 mm, 4,0 mm, 5 µm - Merck®;
- Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência Shimadzu – CLAE – equipado com bomba
modelo LC-10AD, detector com comprimento de onda variável UV/Vis modelo SPD10Avp, controlador SLC-10Avp, integrador automático computadorizado com software
Class VP® e injetor automático SIL-10-Avp, forno para coluna CTO-10Asvp Shimadzu;
32
- Evaporador rotatório 801 – Fisatom®;
- Câmara climatizada TE 4001 - Tecnal®;
- Potenciômetro - Digimed®;
- Zetasizer® - Nano-ZS – Malvern®;
- Vórtex P56 - Phoenix®;
- Centrífuga TDL80-2B – Centribio®;
- Bomba de vácuo – modelo 131, Prismatec®;
- Lavadora Ultra-sônica - Unique®;
- Placas de vidro (espalhabilidade);
- Purificador de água Milli-Q A10®, Millipore;
- Vidrarias calibradas;
- Viscosímetro rotacional – RV DV-1+ Brookfield;
- Tewameter® TM 300 (Courage-Khazaka Electronic, Alemanha);
- Mexameter® MX 18 (Courage-Khazaka Electronic, Alemanha);
- Sebumeter®/Corneometer®/Skin-pH-Meter® (Courage-Khazaka Electronic, Alemanha)
3.2 Método
As
suspensões de nanocápsulas contendo
adapaleno
foram previamente
desenvolvidas e caracterizadas por Barrios et al (2009).
3.2.1 Preparação das suspensões (FESSI, PUISIEUX e DEVISSAGUET, 1989)
As suspensões foram preparadas segundo método de deposição interfacial de
polímero pré-formado utilizando a composição descrita na Tabela 1.
Os componentes da fase orgânica foram pesados e colocados em um béquer e
mantidos sob agitação magnética em banho-maria à temperatura de 40 ºC até completa
dissolução de todos os componentes. A fase orgânica foi vertida sobre a fase aquosa, com
auxílio de um funil, e mantida sob agitação mecânica moderada.
33
Tabela 1. Composição das suspensões de nanocápsulas de poli(ε-caprolactona) contendo
adapaleno.
Fase orgânica
Fase aquosa
Óleo de melaleuca...................3,10 mL
Polissorbato 80........................766 mg
Monoestearato de sorbitano......766 mg
Água MilliQ®..............................533 mL
Poli(ε-caprolactona)..................1000mg
Acetona.....................................267 mL
Adapaleno ...................................30mg
*As suspensões foram ajustadas para 100 mL.
A suspensão foi agitada durante 10 minutos e concentrada a um volume final de
100 mL em um evaporador rotatório para eliminação do solvente orgânico e ajuste da
concentração final de adapaleno, sendo a mesma correspondente a 0,3 mg de adapaleno por
ml de suspensão. Foram preparadas suspensões brancas, sem a adição de adapaleno, sendo
estas preparadas através do mesmo método de preparação.
3.2.2 Avaliação físico-química das suspensões de nanocápsulas contendo adapaleno
A caracterização das suspensões foi realizada com objetivo de afirmar os resultados
obtidos anteriormente por Barrios et al, 2009.
3.2.2.1 Doseamento do adapaleno nas suspensões coloidais (taxa de recuperação)
(GUTERRES et al, 1995)
As suspensões coloidais foram dissolvidas com acetonitrila para realização do
processo, ocasionando a dissolução parcial do polímero e a liberação e dissolução do ativo
contido no interior das nanocápsulas.
O doseamento do adapaleno foi realizado através de cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE) segundo metodologia validada por Barrios e colaboradores (2011) em
termos de especificidade, linearidade, precisão, limite de quantificação e exatidão.
As análises foram realizadas em cromatógrafo Shimadzu, utilizando-se detector
UV/VIS 284 nm, coluna Lichropher 100 RP-18 (5 µm, 250 x 4 mm), pré-coluna do mesmo
34
material (5 µm), fase móvel isocrática de metanol e água em uma proporção 95:5 (v/v),
com pH aparente de 3,0, volume de injeção de 20 µL e fluxo de 1,0 mL/min (BARRIOS et
al, 2011).
Os resultados obtidos, através das áreas dos picos, foram aplicados na curva de
calibração e calculados através da equação da reta. O teor de adapaleno em cada suspensão
foi expresso em µg/mL e porcentagem (%).
3.2.2.2 Determinação do diâmetro médio das partículas e índice de polidispersão
As determinações do diâmetro médio e do índice de polidispersão das
nanopartículas em suspensão foram realizadas através de espalhamento de luz dinâmico. As
suspensões foram diluídas 500 vezes (v:v) em água MilliQ®, no equipamento Zetasizer®,
Nano-ZS da Malvern. Os resultados foram determinados através da média de três
repetições.
3.2.2.3 Potencial zeta
O potencial zeta das suspensões de nanocápsulas foi obtido através da técnica de
mobilidade eletroforética no aparelho Zetasizer®, Nano-ZS da Malvern. As amostras foram
previamente diluídas 500 vezes (v:v) em cloreto de sódio 10 mM e filtradas em membrana
com 0,45µm. Os resultados foram expressos em milivolts (mV) a partir de uma média de
três determinações.
3.2.2.4 Determinação do pH
A determinação do pH foi realizada em potenciômetro (Digimed®) previamente
calibrado com solução tampão pH 4,0 e 7,0 e as medidas foram realizadas diretamente nas
suspensões. Os resultados foram expressos pela média de três determinações.
35
3.2.3 Preparação das formulações semissólidas contendo nanocápsulas de adapaleno
3.2.3.1 Gel Hidrofílico
O gel hidrofílico contendo nanocápsulas de adapaleno foi previamente caracterizado
por Bruschi (2010).
Os componentes utilizados na preparação do gel hidrofílico contendo as
nanocápsulas de adapaleno estão descritos na Tabela 2.
Tabela 2. Composição do gel hidrofílico contendo nanocápsulas de adapaleno
Componentes
Concentração (%)
Dispersão de Carbopol 940® a 6%*
8
®
Solução de Nipagin/Nipazol
1
Sorbitol
5
Trietanolamina
0,03
Suspensão de nanocápsulas contendo adapaleno (0,3mg/mL)
85
®
*6g de Carbopol 940 , 1g de conservante e 97mL de água.
O gel hidrofílico (concentração final de Carbopol 940® = 0,48%) foi preparado
substituindo-se a água pela suspensão de nanocápsulas contendo adapaleno. Primeiramente
foi adicionada à dispersão de Carbopol 940®, a trietanolamina e o sorbitol. Posteriormente a
suspensão de nanocápsulas de adapaleno foi adicionada, acrescentando-se o conservante e
verificando-se o pH. A concentração final de adapaleno na formulação foi de 0,25 mg/g do
gel hidrofílico.
Com o objetivo de comparar os resultados das formulações nas quais foram
incoporadas o fármaco nanoestruturado, foram preparados veículos com o adapaleno na
forma livre. Nesta formulação, o adapaleno (0,0255 g) foi homogeneizado com o
monoestearato de sorbitano (0,766 g) e o Tween 80
®
(0,766 g), sendo adicionados à
dispersão de carbopol 940® a 6% (8 g) e à trietanolamina (0,03 g). Logo após adicionou-se
a água MilliQ® (84,408 g), o sorbitol (5 g) e a solução conservante (1 g). A concentração
final obtida foi de 0,25 mg/g de gel hidrofílico. Todas as formulações semissólidas foram
preparadas em triplicata.
36
3.2.3.2 Creme gel com Aristoflex AVL®
Foram preparadas formulações semissólidas constituídas por Aristoflex AVL®
(ammonium Acryloyldimethyl-taurate/ VP Polymer; trilaureth-4-Phosphate; polyglyceryl2-sesquiisostearate;
sunflower
seed
oil;
tetradibutyl
pentaerithrityl
hydroxyhydrocinnamate), nas quais foram incorporadas as suspensões de nanocápsulas
contendo adapaleno.
Com o objetivo de comparar o comportamento das diferentes formulações, foram
preparadas formulações incorporando-se o fármaco disperso na forma livre. Como
controles, foram utilizados formulações de creme gel, sem adição do fármaco ou da
suspensão. Os componentes das formulações constituídos por Aristoflex AVL® estão
descritos na Tabela 3.
Tabela 3. Composição creme gel contendo adapaleno na forma livre (CGA) e creme gel
com nanocápsulas contendo adapaleno (CGNCA).
Componentes
CGA
CGNCA
Aristoflex AVL®
2g
2g
Solução conservante Nipagin®/Nipasol®
1,0 mL
1,0 mL
Adapaleno
0,025 g
-------
Polissorbato 80
0,766 g
-------
Monoestearato de sorbitano
0,766 g
-------
-------
85 mL
100 mL
100 mL
Suspensão
de
nanocápsulas
contendo
adapaleno
Água MilliQ® q.s.p.
O creme gel foi preparado substituindo-se parte da água pela suspensão de
nanocápsulas contendo adapaleno. Primeiramente foi adicionado ao Aristoflex AVL® a
suspensão de nanocápsulas contendo adapaleno 0,3 mg/mL e a solução conservante de
Nipagin/Nipazol®. Por último acrescentou-se a água MilliQ® e verificou-se o pH. A
concentração final de adapaleno na formulação foi de 0,25 mg/g do creme gel. Da mesma
forma, preparou-se formulações de creme gel contendo suspensões de nanocápsulas sem
adapaleno (formulações brancas).
37
3.2.4 Determinação dos parâmetros de estabilidade para as formulações semissólidas
de Aristoflex AVL® contendo adapaleno na forma nanoencapsulada e na forma livre
Para a determinação da estabilidade as amostras (triplicatas) foram submetidas ao
ciclo gelo-degelo, colocando-as em estufa a 40 °C por 7 dias e, seguindo-se pela
manutenção em geladeira a 4 ºC pelo mesmo tempo. Após esse período, foram levadas
novamente à estufa onde permaneceram por mais 7 dias, completando-se um ciclo de 21
dias (FRIEDRICH et al, 2007; GHOSH e ROUSSEAU, 2009). As amostras foram
analisadas, inicialmente, no tempo zero e aos 21° dias quanto ao teor (por CLAE, no
comprimento de onda de 254nm), às características organolépticas (aparência, cor e odor),
ao pH, à viscosidade, à espalhabilidade, à distribuição de tamanho de partícula, ao potencial
zeta, bem como à separação de fase por centrifugação.
As análises foram realizadas para as formulações de Aristoflex AVL® contendo
adapaleno na forma livre e na forma nanoencapsulada.
3.2.4.1 Determinação das características organolépticas das formulações semissólidas
contendo adapaleno na forma livre e nanoencapsulada
As características organolépticas avaliadas foram aparência, cor e odor. As
formulações com adapaleno nanoencapsulado foram acompanhadas por um período de 21
dias, sendo comparadas com as amostras contendo o fármaco na forma livre. As amostras
foram classificadas de acordo com os seguintes critérios (ALVES, 1996):
1.
Condições normais e satisfatórias;
2.
Ligeira mudança de algum aspecto relativo à aparência, cor e odor da
amostra;
3.
Incorporação de ar, algumas alterações da cor, odor, principalmente em
termos de rancificação;
4.
Início de precipitação da amostra, notável coloração, produto com odor
alterado;
5.
Produto com precipitado; produto fortemente corado; produto com odor
desagradável.
38
3.2.4.2 Determinação da distribuição do diâmetro médio e índice de polidispersão das
nanocápsulas de adapaleno
As determinações do diâmetro médio e do índice de polidispersão das
nanopartículas contidas nos veículos semissólidos foram realizadas de acordo com o item
3.2.2.2.
3.2.4.3 Determinação do potencial zeta das nanocápsulas
As determinações do potencial zeta das nanopartículas contidas nos veículos
semissólidos foram realizadas de acordo com o item 3.2.2.3.
3.2.4.4 Determinação do pH das formulações semissólidas
Para a determinação do pH das formulações semissólidas, foi utilizado um
potenciômetro calibrado com solução tampão pH 4,0 e 7,0. As leituras foram realizadas
diretamente nas formulações semissólidas.
3.2.4.5 Determinação das características reológicas para as formulações semissólidas
contendo adapaleno na forma livre e nanoencapsulada
3.2.4.5.1 Determinação da viscosidade
A viscosidade das formulações semissólidas foi avaliada com auxílio de um
viscosímetro rotacional Brookfield, modelo RV DV-1+ com 10 velocidades. As leituras
foram realizadas na velocidade de 50 rpm usando o spindle 29. A construção dos reogramas
foi feita através da representação gráfica da taxa de cisalhamento, em função da tensão de
cisalhamento. O comportamento reológico foi acompanhado ainda em função da relação
entre a viscosidade em função da taxa de cisalhamento. As análises foram realizadas em
triplicada.
39
3.2.4.5.2 Determinação da espalhabilidade
Para a determinação da espalhabilidade foi empregada a metodologia proposta por
Münzel e colaboradores (1959), modificada por Knorst em 1991. Foi utilizada uma placamolde circular de vidro (diâmetro = 20 cm; espessura = 0,2 cm), com orifício central de 1,2
cm de diâmetro, a qual foi colocada sobre uma placa-suporte de vidro (20 cm X 20 cm).
Sob essas placas foi posicionada uma folha de papel milimetrado. A amostra foi introduzida
no orifício da placa e a superfície nivelada com espátula; após, a placa-molde foi
cuidadosamente retirada. Sobre a amostra foi colocada uma placa de vidro de peso prédeterminado. Após 1 minuto, foi calculada a superfície abrangida através da medição do
diâmetro em duas posições opostas, com posterior cálculo do diâmetro médio.
Esse procedimento foi repetido acrescentando-se novas placas e padronizando-se o
intervalo de 1 minuto entre as placas. Após cada determinação, a superfície abrangida e o
peso da placa adicionada foram registrados. A espalhabilidade (Ei) determinada a 25 ºC e
calculada através da equação abaixo (DE PAULA et al, 1998):
Ei = (d2.π)/4
Onde:
Ei = espalhabilidade da amostra para peso i (mm2);
d = diâmetro médio (mm).
Os valores da espalhabilidade em função dos pesos adicionados foram determinados
através de 3 medições, calculando-se a média entre elas.
3.2.4.6 Determinação do teor de adapaleno das formulações semissólidas
As
formulações
semissólidas
foram
tratadas
com
acetonitrila
(ACN),
tetrahidrofurano (THF) e metanol (2,5:5,0:2,5) com objetivo de extrair o ativo e liberar o
mesmo contido no interior das nanocápsulas.
O doseamento do adapaleno foi realizado através de cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE), de acordo com o item 3.2.2.1.
40
3.2.4.7 Teste de centrifugação
Em tubo de ensaio cônico graduado para centrífuga foi adicionado 1,0 g de cada
amostra, pesado em balança analítica e submetido ao ciclo de 3500 rpm durante trinta
minutos à temperatura ambiente.
3.2.5 Avaliação dos efeitos das formulações na pele humana por Bioengenharia
Cutânea
Para as análises de biometria cutânea foram utilizadas as formulações de Carbopol
940® contendo adapaleno na forma livre e na forma nanoencapsulada.
3.2.5.1 Critérios de inclusão e exclusão para seleção de voluntários
Após a devida aprovação deste projeto pelo Comitê de Ética em Pesquisa
envolvendo seres humanos do Centro Universitário Franciscano – CEP/Unifra nº
359.2008.2 e CONEP nº 1246, foram selecionados 20 voluntários saudáveis, do sexo
feminino, com idade entre 20 e 40 anos. Os voluntários só fizeram parte do estudo após
assinar o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, declarando estar plenamente de
acordo em participar voluntariamente desta pesquisa.
Alguns critérios de exclusão foram adotados durante a seleção dos voluntários. Não
participaram da pesquisa os voluntários que apresentassem histórico ou sinais de
dermatopatologias, hipersensibilidade a algum componente da formulação, ou que
apresentaram sinais de irritação ou dermatite de contato associado. Também não
participaram da pesquisa voluntárias em período de gestação ou lactação.
3.2.5.2 Condições experimentais
Inicialmente os voluntários foram orientados a não utilizar nenhum produto
cosmético na região dos antebraços, e interromper o uso de qualquer produto uma semana
antes do início e durante as análises do presente estudo.
41
Após cada voluntário concordar em participar da pesquisa, assinar o Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido, e ser compatível com os critérios estabelecidos para
seleção dos mesmos, recipientes contendo o creme gel foram distribuídos para que o
produto fosse aplicado pelo voluntário, em sua residência.
Foi padronizada uma quantidade de 0,2 g de creme gel, para aplicação em cada
antebraço. As aplicações foram realizadas uma vez ao dia, à noite, durante 63 dias. No
antebraço direito foi aplicado o gel contendo adapaleno na forma nanoencapsulada;
enquanto que no antebraço esquerdo foi aplicado o gel com adapaleno na forma livre. Além
disso, a área de aplicação foi delimitada em cada voluntário.
Os testes foram realizados segundo o método de caso-controle, onde cada indivíduo
era controle de si mesmo. A fim de evitar engano durante a aplicação, os voluntários foram
instruídos adequadamente em termos de quantidade e modo de uso de cada formulação,
segundo especificado no protocolo.
3.2.5.3 Estudos de biometria cutânea
Neste estudo avaliou-se o efeito de formulações contendo adapaleno na forma
nanoencapsulada e na forma livre, incorporados em gel de Carbopol 940®, através de
métodos biométricos não invasivos capazes de medir a hidratação, a perda transepidérmica
de água, o pH, o teor de melanina e eritema da pele.
Foram efetuadas medidas em 8 pontos diferentes da região do antebraço dos
voluntários. Os parâmetros referentes ao conteúdo aquoso do estrato córneo, perda
transepidérmica de água, melanina e eritema foram avaliados. Para avaliação do pH, foram
realizadas medidas em 5 pontos diferentes, sendo calculada a média dos valores obtidos. O
número de medições realizadas foi determinado de acordo com o tamanho da região a ser
analisada, de tal forma a garantir que todo o local fosse avaliado.
As medidas de biometria cutânea foram realizadas antes do início da aplicação das
formulações (medidas basais). As leituras foram realizadas de 7 em 7 dias, no 7º, 14º, 21º,
28º, 35º, 42º, 49º, 56º e 63º. Estes estudos foram realizados em ambiente climatizado e
monitorado, com temperatura variando entre 22 °C e 25 °C, e umidade relativa do ar entre
40 % e 50 %. As análises somente foram iniciadas após os voluntários permanecerem de
42
10-15 minutos neste ambiente. Para a realização destes estudos, foram utilizados
equipamentos específicos para este fim, de acordo com o que segue:
3.2.5.4 Determinação do conteúdo aquoso do estrato córneo (grau de hidratação
cutânea)
Para a realização deste estudo foi utilizado o equipamento Corneometer®, acoplado
a um software (SM_CM_PH), o qual mede o conteúdo aquoso do estrato córneo
(determinando assim o teor de água das camadas superficiais da epiderme até uma
profundidade de cerca de 0,1 mm). Este método é baseado no princípio da medida da
capacitância elétrica, ou seja, na variação do valor da constante dielétrica da água. Um
sensor do tipo caneta foi colocado em oito pontos diferentes do antebraço, sendo o final da
análise sinalizado por um bip sonoro, sendo estas medidas registradas automaticamente no
aparelho.
3.2.5.5 Determinação do pH cutâneo
A análise do pH da superfície cutânea foi realizada por potenciometria direta, isto é,
por meio de um eletrodo especial de pontes simples, concebido através de uma fina
membrana de vidro e porcelana, cujo eletrólito é o KCl 3 M. A potenciometria direta tem
sido o método mais empregado para medição dessa variável, a qual permite sensibilidade
de determinação da ordem de 0,1 unidade de pH. Esta análise se deu através do
equipamento Skin-pH-meter®, acoplado a um software (SM_CM_PH).
O eletrodo foi calibrado antes de cada leitura com soluções tampão pH 4,0 e 7,0 e
colocado diretamente em contato com a pele das voluntárias em cinco regiões distintas do
antebraço, sendo que um sinal sonoro indica o término de cada medida (Manual CourageKhazaka Electronic, Alemanha).
3.2.5.6 Determinação da perda transepidérmica de água (PTEA)
Para a realização deste estudo foi utilizado o equipamento Tewameter® TM 300,
43
acoplado a um software (Multi Probe Adapter 5), cuja função é medir a perda
transepidérmica de água (em g/h/m2), baseado no princípio de difusão descrito por Adolf
Fick em 1885:
dm = - D . A . dp
dt
dx
onde:
A = superfície em m2;
m = água transportada (em g);
t = tempo (h);
D = coeficiente de difusão;
p = pressão de vapor da atmosfera;
x = distância da superfície da pele ao ponto de medição (m).
Uma sonda foi colocada em oito pontos diferentes do antebraço, onde o fim de cada
medição foi indicado por um bip sonoro, sendo estas medidas registradas automaticamente
no aparelho. A cabeça de medição da sonda é composta por dois pares de sensores
(temperatura e umidade), onde através destes é possível receber as informações de
temperatura e umidade de cada valor da PTEA durante a medição completa. Isto é de
grande importância para a avaliação da precisão e reprodutibilidade do dispositivo (Manual
Courage-Khazaka Electronic, Alemanha).
3.2.5.7 Determinação da intensidade de melanina e eritema
Este método baseia-se na medida da luz absorvida e refletida, através de um
espectrofotômetro projetado para medir precisamente a cor da pele. O aparelho utilizado
para esta análise foi o Mexameter MX 18, acoplado a um software (Multi Probe Adapter
5), que utiliza o princípio ótico para determinar a intensidade do eritema e da pigmentação
da melanina. Este aparelho apresenta uma sonda especial que emite luz de três
comprimentos de onda definidos.
Assim que a sonda é colocada sobre a superfície da pele o processo para
determinação começa automaticamente. A sonda é muito sensível e mostra uma larga
escala de valores de melanina e eritema (0-999), podendo detectar até mesmo a mais leve
44
alteração na cor da pele. Todos os resultados foram expressos em valores numéricos,
correspondendo ao valor médio de todas as medidas, tanto de melanina como de eritema
(Manual Courage-Khazaka Electronic, Alemanha).
3.2.6 Estudos de liberação in vitro
Estudos de liberação in vitro foram realizados utilizando uma célula de difusão
vertical do tipo Franz com um compartimento receptor com capacidade em torno de 6,0 mL
e uma área de difusão de 3,14 cm2 (FRANZ, 1975; VENTER et al, 2001).
Para realização deste experimento foram utilizadas membranas de acetato de
celulose com poros de 0,45 µm da Millipore®. As membranas foram hidratadas em água
destilada por 24 horas antes de iniciar o experimento. Após esse período, as células de
difusão foram montadas e as membranas mantidas em contato com uma solução receptora
de tampão fosfato pH 7,4. Este meio foi conservado em banho-maria a uma temperatura de
37 °C (± 1 ºC), sendo constantemente agitado com uma barra magnética teflon-coberta. As
amostras (0,5 g) foram colocadas na parte superior da membrana e em intervalos de tempo
pré determinados (de 2 em 2 horas) foram coletados 2 mL da solução receptora por um
período de 10 horas. Após as 10 horas, as amostras foram coletadas nos tempos 24 e 48
horas, até atingir um platô. A cada retirada da solução receptora, foram recolocados
novamente 2 mL da mesma na célula de difusão e as amostras foram analisadas de acordo
com o item 3.2.2.1. Para análise de cada formulação, seis células de difusão tipo Franz
foram utilizadas.
3.2.6.1 Análise dos resultados da liberação
A quantidade de fármaco difundida através da membrana foi plotada em função do
tempo e análises de regressão linear foram estudadas para determinação do fluxo do mesmo
em cada formulação (HUANG et al, 1995; WAGNER e KOSTKA, 2001).
O coeficiente de permeabilidade Kp (cm/h), foi dado conforme a seguinte equação:
45
J = Kp. A. Cd
onde: J = fluxo através da membrana (inclinação da porção linear dos dados);
A = área em cm2;
Cd = Concentração do fármaco no compartimento doador.
3.2.7 Ajuste de curvas dos perfis cinéticos
Os perfis de liberação obtidos, foram modelados utilizando o programa Scientist®
(MicroMath
Scientific
Software,
Inc.),
conforme
cinética
de
primeira
ordem
monoexponencial ou biexponencial utilizando, respectivamente as equações seguinte
(PEREIRA et al, 2006; FELIPPI, 2008):
C = C0 . e-k.t
C = A . e-α.t + B . e-β.t
onde: C = concentração de fármaco no tempo t;
C0 = concentração de fármaco no tempo zero;
k = constante cinética observada no processo monoexponencial;
A = quantidade de fármaco dissolvido na velocidade α;
B = quantidade de fármaco dissolvido na velocidade β;
α = constante cinética observada na etapa rápida de liberação;
β = constante cinética observada na etapa lenta de liberação
Todos os perfis de liberação foram testados para os dois modelos e o modelo mais
adequado foi escolhido baseando-se no valor de Critério de Seleção de Modelo (MSC),
coeficiente de correlação e inspeção visual dos gráficos modelados.
A Lei da Potência foi avaliada com o auxílio do programa Scientist® (MicroMath
Scientific Software, Inc.), para descrever a liberação do adapaleno a partir das nanocápsulas
poliméricas. Este modelo semi-empírico relaciona exponencialmente a liberação de uma
46
substância com o tempo, utilizando a equação abaixo (SIEPMANN e PEPPAS, 2001;
REZA, QUADIS e HAIDER, 2003; SILVA et al, 2010):
ft = atn
onde: a = constante que incorpora características estruturais e geométricas do sistema de
liberação;
n = expoente de liberação e indicativo do mecanismo de liberação da substância;
ft = liberação fracional do fármaco.
O valor de n está relacionado com a forma geométrica do sistema carreador e
determina o mecanismo de liberação, conforme a Tabela 4. Sendo assim, a difusão Fickiana
indica que a liberação da substância é controlada por difusão. Já os modelos não-Fickianos
apresentam três classes (caso-II, caso anômalo e super caso-II), as quais diferenciam-se em
relação à velocidade de difusão do solvente. O caso-II sugere que a liberação da substância
é controlada pelo inchamento do sistema. O caso anômalo indica que os fenômenos de
difusão e relaxamento do polímero são da mesma ordem de magnitude. Por sua vez, o super
caso-II ocorre quando a velocidade de difusão do solvente é o fator determinante da
liberação (SIEPMANN e PEPPAS, 2001; COSTA e LOBO, 2001).
Tabela 4. Mecanismos de liberação de substâncias por difusão a partir de sistemas
poliméricos de diferentes geometrias (SIEPMANN e PEPPAS, 2001).
Expoente de liberação (n)
Mecanismo de liberação da
substância
Filmes
Cilíndrico
Esférico
0,5
0,45
0,43
Difusão Fickiana
0,5 < n < 1,0
0,45 < n < 0,89
0,43 < n < 0,85
Caso anômalo
1,0
0,89
0,85
Caso-II
> 1,0
> 0,89
> 0,85
Super Caso-II
47
3.3 Análise estatística
A metodologia estatística dos dados incluiu análise descritiva de variáveis como
média, desvio padrão (DP), desvio padrão relativo (DPR), análise de variância (ANOVA) e
teste de Tukey, considerando-se níveis de significância de 0,05.
48
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Avaliação físico-química das suspensões de nanocápsulas contendo adapaleno
As características físico-químicas das suspensões foram avaliadas através da
determinação da distribuição do diâmetro das partículas, índice de polidispersão, potencial
zeta, pH e teor do ativo.
A suspensão contendo nanocápsulas de adapaleno foi previamente desenvolvida e
caracterizada por Barrios et al (2009). No presente trabalho, a suspensão foi novamente
caracterizada com o objetivo de comparar com os resultados obtidos anteriormente.
As nanocápsulas de adapaleno apresentaram um diâmetro médio em torno de 153,9
nm (±3,85) e índice de polidispersão de 0,1 (±0,01). Os valores referentes ao tamanho de
partícula, estão de acordo com os encontrados por Barrios et al (2009) os quais foram
próximos a 154 nm. Para o índice de polidispersão, os resultados encontrados também
foram semelhantes, sendo que os apresentados por Barrios et al (2009) foram inferiores a
0,1. Estes valores indicam uma homogeneidade na distribuição do tamanho das partículas,
prevendo uma boa estabilidade das suspensões. Com relação ao potencial zeta, observou-se
valores de aproximadamente -27,3 mV (±2,6), os quais foram maiores do que os
encontrados por Barrios et al (2009) para o mesmo experimento (-18 mV).
Vale ressaltar que o fator mais importante que afeta o potencial zeta é o pH, ou seja,
as características ácido-básicas da superfície da partícula estão intimamente relacionadas
com o seu potencial. Desta forma, é interessante observar que o maior valor de potencial
zeta (em módulo) ocorre em um pH oposto ao pH do ponto isoelétrico (pHIEP), onde o
potencial zeta é igual a zero. Por exemplo, considerando uma partícula com pHIEP = 3,5, o
seu valor máximo de potencial zeta será obtido em pH de aproximadamente 11,5
(GOUVÊA e MURAD, 2001; HANS e LOWMAN, 2002; FRONZA, CAMPOS e
TEIXEIRA, 2004). Os valores para o pH das suspensões neste experimento foram de 5,3
(±0,15) e nas suspensões desenvolvidas por Barrios et al (2009) os valores foram de 5,5.
Estes valores de pH levemente ácidos, encontram-se de acordo com os resultados relatados
na literatura para este tipo de sistema (ALVES et al, 2007; ROGGIA, 2009; MARCHIORI
et al, 2010).
49
O teor de ativo das suspensões de nanocápsulas no presente estudo foi de 99,1 %
(±1,9), encontrando-se o mesmo dentro dos limites aceitáveis para o teor de ativo, sendo
estes entre 90 e 110%, conforme Guia de estabilidade da ANVISA (BRASIL, 2004). Neste
contexto, ressalta-se que a taxa de associação do fármaco às nanocápsulas, observada por
Barrios e colaboradores (2009), para as suspensões de adapaleno contendo óleo de
melaleuca como núcleo oleoso, foi de 95,4%, sendo este valor considerado eficaz para a
encapsulação de ativos.
Deve-se considerar que por se tratar de um óleo essencial volátil pode ter ocorrido
perda do mesmo, durante o processo de obtenção das nanopartículas, desta forma o
processo de caracterização das estruturas foi acompanhado por avaliações do óleo de
melaleuca por CLAE.
Conforme os resultados obtidos por Barrios (2009) e através da avaliação físicoquímica das suspensões de nanocápsulas realizada no presente experimento, pode-se
concluir que o adapaleno adequou-se a este tipo de sistema.
4.2 Determinação dos parâmetros de estabilidade para as formulações semissólidas de
Aristoflex AVL® contendo adapaleno na forma nanoencapsulada e na forma livre
Após a caracterização das suspensões, estas foram incorporadas em formulações
semissólidas contendo Aristoflex AVL®. Este veículo propõe inovação e tecnologia para as
bases dermocosméticas, visto que trata-se de uma dispersão polimérica líquida, de preparo
instantâneo à frio, onde o acriloildimetil-taurato de amônio é utilizado como polímero. É
um veículo não comedogênico, com sensorial agradável e isento de pegajosidade, tornandose adequado para formulações faciais, especialmente em indivíduos com pele oleosa e
acneica. Além disso, o Aristoflex AVL® apresenta-se como um creme gel de caráter
aniônico, sendo compatível com a suspensão de nanocápsulas (CASTELI et al, 2008;
MENDONÇA et al, 2009; Pharmaspecial, 2010).
A estabilidade é um parâmetro necessário para assegurar a qualidade do produto
cosmético ou farmacêutico, desde a fabricação até a expiração do prazo de validade.
Fatores relacionados à formulação, ao processo de fabricação, às condições ambientais,
assim como cada componente da formulação seja ativo ou não, podem influenciar na
50
estabilidade do produto (BRASIL, 2004; ISAAC et al, 2008). Com base nestes dados,
alguns estudos de estabilidade de formulações utilizando nanoestruturas já vem sendo
realizados para o desenvolvimento de novos produtos, com o objetivo de assegurar que a
nanotecnologia na área farmacêutica, gere além de inovações uma maior qualidade e
segurança das formulações (SCHAFFAZICK et al, 2002; MANCONI et al, 2003; IOELE et
al, 2005; OURIQUE et al, 2008).
Os estudos realizados para a determinação da estabilidade das formulações
desenvolvidas no presente trabalho, após a incorporação das suspensões no veículo
semissólido, consistiram nas avaliações referentes à determinação do diâmetro das
partículas, pH, índice de polidispersão e potencial zeta. Determinação das características
organolépticas, espalhabilidade, viscosidade, teor do ativo e teste de centrifugação.
As formulações contendo nanocápsulas brancas (sem adapaleno) foram avaliadas
como controle do experimento e a caracterização físico-química das mesmas torna-se de
suma importância, pois através delas pode-se avaliar se houve alterações no comportamento
destes sistemas com a incorporação do fármaco nanoestruturado.
4.2.1 Determinação das características organolépticas das formulações semissólidas
contendo adapaleno na forma livre e nanoencapsulada
As formulações semissólidas contendo o adapaleno na forma livre ou
nanoencapsulada foram analisadas com relação à aparência, cor e odor.
Figura 7. Formulações semissólidas contendo adapaleno nanoencapsulado em 0 dias (A) e após 21 dias de
experimento (B)
51
Figura 8. Formulações semissólidas contendo adapaleno na forma livre em 0 dias (A) e após 21 dias de
experimento (B)
Inicialmente as formulações contendo o fármaco na forma livre ou nanoestruturada
apresentaram coloração branca e superfície lisa com aspecto brilhante e homogêneo,
indicando que o veículo utilizado foi adequado para a preparação das formulações contendo
adapaleno. Neste contexto, é importante ressaltar que o produto final não apresentou o
aspecto gel-gelatina, observado em muitos dos géis formulados com espessantes à base de
polímero.
Conforme pode ser observado nas Figuras 7 e 8, para ambas as formulações
(contendo adapaleno livre ou nanoencapsulado) não houve alteração quanto à aparência,
cor e odor ao longo do período de estudo, mantendo-se inalteradas após as diferentes
condições à que foram submetidas.
Em estudos desenvolvidos anteriormente por este grupo de pesquisa, suspensões
contendo nanocápsulas de adapaleno foram incorporadas em base semissólida de Carbopol
940®, determinando-se a estabilidade da mesma (Bruschi, 2010). Foi observado que, com
relação às características organolépticas (aparência, cor e odor), para as amostras
armazenadas em temperatura ambiente, ambas as formulações (contendo o fármaco livre e
nanoencapsulado) apresentaram ligeiras modificações com relação à aparência, cor e odor
após 90 dias de estudo, enquanto para as preparações mantidas em estufa, as mesmas
modificações foram observadas nas duas formulações estudadas após 60 dias de
armazenamento. Entretanto, para as formulações armazenadas em geladeira, observou-se
que a forma nanoencapsulada não sofreu alteração durante os 90 dias de experimento,
enquanto o hidrogel contendo o fármaco livre apresentou alterações visíveis em relação à
coloração e odor após 60 dias de estudo. Desta forma, o autor concluiu que, para as
amostras mantidas em geladeira, as nanopartículas podem estar promovendo uma proteção
52
do fármaco, visto que a nanoencapsulação do ativo foi capaz de manter um melhor aspecto
da formulação semissólida durante um período maior de tempo.
4.2.2 Determinação da distribuição do diâmetro médio, índice de polidispersão e
potencial zeta das nanocápsulas de adapaleno incorporadas nas formulações
semissólidas
A determinação do tamanho de partícula e do índice de polidispersão em função do
tempo são parâmetros que devem ser estudados em preparações coloidais, visto que
qualquer mudança pode ser indício de agregação das partículas e, consequentemente,
sedimentação do sistema (GUTERRES et al, 1995; CALVO, VILA-JATO e ALONSO,
1996).
Diversos autores têm avaliado o tamanho de partícula em formulações contendo
nanocápsulas preparadas pelo método de nanoprecipitação, utilizando como polímero a poli
(ε-caprolactona). Entre eles, Pohlmann e colaboradores (2002) estudaram nanocápsulas de
indometacina, Ourique e colaboradores (2008) avaliaram formulações contendo
nanocápsulas de tretinoína e Terroso e colaboradores (2009) desenvolveram nanocápsulas
associadas à coenzima-Q10. Estes autores encontraram diâmetros em torno de 197, 222 e
218 nm, respectivamente.
Com relação ao potencial zeta, o qual reflete o potencial de superfície das partículas,
vale ressaltar que quanto maior o potencial zeta, maior a probabilidade de a suspensão
manter-se estável, pois as partículas carregadas se repelem umas às outras e essa força
supera a tendência natural à agregação. Portanto, em módulo, um valor relativamente alto
de potencial zeta é importante para uma boa estabilidade físico-química da suspensão
coloidal, pois grandes forças repulsivas tendem a evitar a agregação em função das colisões
ocasionais de nanopartículas adjacentes (SCHAFFAZICK et al, 2003; BOCHI, 2010).
Em outros estudos, utilizando-se também como polímero a poli (ε-caprolactona),
determinou-se o potencial zeta das formulações e foram obtidos valores negativos em torno
de - 10 mV para nanocápsulas contendo nimesulida (ALVES, POHLMANN e GUTERRES,
2005); - 24 mV para nanocápsulas contendo indometacina (DOMINGUES et al, 2008) e -
9,5 mV para nanocápsulas contendo benzofenona-3 (PAESE, 2008).
53
Os resultados referentes ao diâmetro médio das partículas, índice de polidispersão e
potencial zeta das suspensões incorporadas em Aristoflex AVL® estão descritos na Tabela
5.
Tabela 5. Diâmetro médio, índice de polidispersão e potencial zeta das nanocápsulas
contendo adapaleno (CGNCA) e das nanocápsulas sem adapaleno (CGNC) incorporadas
em Aristoflex AVL®
CGNCA
CGNC
Dias
Diâmetro
(nm)±DP
PI±DP
0,1±0,03
Potencial
Zeta (mV)
±DP
-35,9±3,8
0
183,2±3,09
21
183,1±0,05
Diâmetro
(nm)±DP
PI±DP
182,1±0,61 0,07±0,02
Potencial
Zeta
(mV)±DP
-32,6±2,1
0,1±0,04
-34,3±4,6
184,0±0,76
-33,1±1,5
0,1±0,03
Após a incorporação da suspensão no veículo, observa-se que houve um aumento do
tamanho das nanopartículas, passando de 153,9 ± 3,8 nm (diâmetro observado para as
suspensões de nanocápsulas) para 183,2 ± 3,0 nm (Tabela 5). Este aumento pode estar
associado a vários fatores dentre eles à agregação de moléculas de água, ou mesmo de
cargas presentes na formulação de creme gel, à estrutura polimérica das nanocápsulas
(FERRONY, 2009). Da mesma forma, houve um aumento do potencial zeta após a
incorporação da suspensão no creme gel, passando de – 27,3 ± 2,6 mV para -35,9 ± 3,8
mV. Este aumento da carga negativa pode estar relacionado com o caráter aniônico do
veículo.
De acordo com a Tabela 5, para ambas as formulações, os valores iniciais referentes
ao tamanho de partícula não sofreram alteração significativa (p>0,05) após 21 dias de
análise. Permanecendo entre 183,2 ± 3,09 nm e 183,1 ± 0,05 nm para as formulações
contendo nanocápsulas de adapaleno e entre 182,1 ± 0,6 nm e 184,0 ± 0,7 nm para as
formulações brancas, ou seja, sem a presença do ativo.
Os valores de polidispersabilidade obtidos para ambas as formulações, durante os
21 dias de análise, mantiveram-se estáveis, ou seja, menores que 0,2 (Tabela 5), as quais
não demonstraram diferença estatística significativa (p>0,05) entre seus valores iniciais e
finais, bem como entre si. Desta forma, os resultados obtidos indicam uma estreita
distribuição do tamanho das partículas e boa homogeneidade destes sistemas ao longo do
54
tempo de armazenamento (MÜLLER et al, 2001; MILÃO, KNORST e GUTERRES, 2003;
ALVES, POHLMANN e GUTERRES, 2005).
A Tabela 5 ainda demonstra que o potencial zeta para a formulação contendo
nanocápsulas de adapaleno, não apresentou alteração significativa (p≤0,05), comparando-se
os valores iniciais (- 35,9 ± 3,8 mV) aos finais (- 34,3 ± 4,6 mV) mantendo-se inalterado,
no decorrer das análises. A formulação branca, ou seja, sem adapaleno obteve um valor
inicial médio de potencial zeta de - 32,6 ± 2,1 mV e final de - 33,1 ± 1,5 mV, desta forma
também não foi observada diferença significativa entre os valores basais e após 21 dias de
experimento.
De acordo com a literatura, a carga negativa destes sistemas deve-se a presença de
poli (ε-caprolactona), fosfolipídios e tensoativos não-iônicos como o Span 60® e o Tween
80® (MÜLLER, MÄDER e GOHLA, 2000; SCHAFFAZICK et al, 2003). Além disso, o
potencial zeta pode ser influenciado pelo dispersante, pelo pH, condutividade, concentração
dos componentes da formulação, inclusive do princípio ativo e pela força iônica do meio
(TEIXEIRA, 2010).
Baseado nos resultados obtidos pode-se afirmar que a distribuição do diâmetro,
índice de polidispersão e potencial zeta das formulações contendo nanocápsulas de
adapaleno mantiveram os valores iniciais, ou seja, as amostras não apresentaram sinais
agregação ou sedimentação durante os 21 dias de experimento. Desta forma, pode-se
concluir também que o veículo mostrou-se adequado para a incorporação deste tipo de
sistema.
4.2.3 Determinação do pH das formulações semissólidas contendo adapaleno na forma
livre e na forma nanoencapsulada
O monitoramento do pH em função do tempo fornece informações relevantes sobre
a estabilidade de formulações, principalmente as nanoparticuladas, visto que alterações
deste parâmetro podem estar relacionadas com a degradação do polímero, de algum outro
componente da formulação ou até mesmo difusão da substância ativa do sistema para o
meio aquoso (GUTERRES et al, 1995; SCHAFFAZICK et al, 2003).
Por outro lado, em relação ao pH fisiológico, pode-se considerar que a pele humana
55
apresenta um pH levemente ácido, o qual atua na proteção contra bactérias e fungos. Dessa
forma, as formulações tópicas devem apresentar valores de pH entre 3 e 10, pois do
contrário podem provocar alterações no pH cutâneo (LEONARDI, GASPAR e MAIA
CAMPOS, 2002).
As formulações semissólidas contendo nanocápsulas de adapaleno e as formulações
contendo o fármaco na forma livre apresentaram declínio dos valores de pH (p<0,05),
passando de 5,0 ± 0,1 para 4,4 ± 0,1 e de 6,3 ± 0,02 para 6,0 ± 0,1, respectivamente, após
21 dias de análise. Apesar da diferença estatística verificada, considera-se que os valores
experimentais são coerentes para este tipo de sistema e encontram-se na faixa de pH
adequada para formulações de uso tópico (ALVES et al, 2007).
Comparando-se as formulações contendo o fármaco na forma livre e o fármaco na
forma nanoencapsulada pode-se considerar que houve diferença significativa (p<0,05) entre
os valores encontrados, observa-se que para as formulações contendo as nanocápsulas os
valores iniciais e final de pH foram menores. Esta diferença pode ser decorrente da
presença de grupos carboxílicos funcionais na cadeia polimérica (SCHAFFAZICK et al,
2002).
Diversos autores têm estudado formulações semissólidas contendo nanocápsulas
associadas a diferentes ativos e utilizando como polímero a poli (ε-caprolactona). Entre
eles, Marchiori e colaboradores (2010) realizaram a incorporação de nanocápsulas de
dexametasona em um hidrogel e observaram valores de pH em torno de 5,7 ± 0,1. Estes
resultados foram semelhantes aos valores iniciais encontrados no presente estudo, que
foram de 5,0 ± 0,1.
Em outro estudo realizado por MILÃO, KNORST e GUTERRES (2003), os autores
avaliaram nanopartículas poliméricas contendo diclofenaco incorporado em diferentes
veículos, e também observaram uma diminuição dos valores de pH. Dentre as possíveis
causas estaria a degradação do polímero, o qual não pode ser justificado pelos autores, pois
também houve diminuição do pH, na formulação de creme gel contendo fármaco livre. Da
mesma forma, no presente estudo houve uma redução significativa dos valores de pH tanto
para as formulações contendo nanocápsulas de adapaleno, quanto para aquelas contendo o
fármaco livre, descartando a possibilidade de degradação do polímero.
56
4.2.4 Determinação das características reológicas para as formulações semissólidas
contendo adapaleno na forma livre e nanoencapsulada
O termo reologia vem do grego rheo (fluxo) e logos (ciência), foi sugerido por
Bingham e Crawford, para descrever as deformações de sólidos e a fluidez de líquidos
(LABA, 1993; LEONARDI e MAIA CAMPOS, 2001). Desta forma, a reologia é o ramo da
física que estuda a viscosidade, a plasticidade, a elasticidade, o escoamento e a deformação
da matéria sobre ações de forças. A viscosidade pode ser definida como a resistência
interna que um fluido apresenta resultante da aplicação de uma força que causa deformação
temporária ou permanente da matéria, ou simplesmente a resistência de uma substância ao
fluxo, quando submetida a uma tensão, sendo que quanto maior a viscosidade, maior a
resistência (MARTIN, 1993).
Nos últimos anos, tem havido um grande interesse em estudar a reologia das
emulsões, principalmente pela relação direta da mesma com a estabilidade do produto
(AULTON, 1988; LABA, 1993; MARTIN, 1993; CORRÊA et al, 2005; PRESTES et al,
2009). Em vista disso, análises reológicas são fundamentais para o desenvolvimento
tecnológico, sendo imprescindíveis para quantificar, em produtos semissólidos, os efeitos
provocados pelo tempo, pela temperatura, pela incorporação de substâncias ativas e de
carreadores como lipossomas, ciclodextrinas e sistemas nanoparticulados (MARTIN, 1993;
ALVES et al, 2007).
Vale ressaltar também que a receptividade dos cremes e loções tópicas por parte do
consumidor depende principalmente, da eficácia e do sensorial do produto, ambos
influenciados pelos aspectos reológicos (LEONARDI e MAIA CAMPOS, 2001).
Em estudos de reologia, os sistemas podem apresentar fluxo newtoniano ou não
newtoniano. O fluxo newtoniano é caracterizado pela viscosidade constante, independente
da força de cisalhamento aplicada. Entretanto, a maioria dos fluídos cosméticos e
farmacêuticos apresentam comportamento não newtoniano, visto que a viscosidade do
fluido varia com a velocidade de cisalhamento. O fluxo não newtoniano não apresenta
relação linear entre a taxa de cisalhamento aplicada e sua tensão de cisalhamento. Dentre a
classificação de fluído não-newtoniano inclui-se o fluxo plástico, pseudoplástico e dilatante
(MARRIOT, 2005; ALLEN Jr., POPOVICH e ANSEL, 2007; ALVES et al, 2007).
57
O comportamento não newtoniano plástico é caracterizado pela necessidade de uma
força de cedência prévia capaz de ultrapassar as forças internas e destruir a estrutura do
material para que ocorra a sua fluidez. Todavia, o sistema não-newtoniano pseudoplástico
não possui ponto de cedência, por isso o reograma começa na origem e o material começa a
fluir tão logo uma tensão de cisalhamento seja aplicada. A inclinação da curva diminui
gradualmente com o aumento da velocidade de cisalhamento (AULTON, 2005).
Os valores referentes à viscosidade das formulações semissólidas contendo
adapaleno na forma livre e na forma nanoencapsulada podem ser observados na Tabela 6.
As leituras foram realizadas na velocidade de 50 rpm usando o spindle 29.
Tabela 6. Valores referentes à viscosidade, índice de plasticidade (n) e coeficiente de
consistência (K) apresentados pelo creme gel de Aristoflex AVL®, contendo adapaleno na
forma livre (CGA) e nanoencapsulada (CGNCA) durante 21 dias de experimento.
CGNCA
CGA
Tempo
(dias)
Viscosidade
(mPa.s)
n
K
0
56200±
916,51
0,24±0,03
112620,4±
3191,8
21
67734,33±
714,57*
0,24±0,01
124828,9±
10830,1
Viscosidade
(mPa.s)
n
K
81733,33±
611,01
0,24±0,04
157697,8±
23760,1
79200±
2088,06
0,29±0,02
129734,2±
3191,8
Valores referentes à média para determinação de três formulações ± desvio padrão.
* Valores estatisticamente significativos (p≤0,05) quando comparados com os seus resultados iniciais (0 dias).
De acordo com os resultados apresentados na Tabela 6 é possível observar que as
formulações contendo adapaleno na forma livre mantiveram seus valores de viscosidade
sem apresentar diferença significativa durante os 21 dias de estudo, quando comparado com
os valores iniciais. Entretanto, para as formulações contendo o fármaco nanoencapsulado
ocorreu um aumento significativo (p<0,05) da viscosidade após 21 dias de análise, quando
comparado com seus valores iniciais.
Conforme os resultados expostos na Tabela 6, pode-se observar também que não
houve uma alteração significativa (p>0,05) do índice de plasticidade e do coeficiente de
consistência em ambas as formulações semissólidas contendo adapaleno em função dos 21
dias de análise.
Houve diferença significativa (p<0,05) no tempo zero, quando a viscosidade do
58
creme gel contendo o fármaco na forma livre foi comparada com o creme gel contendo a
forma nanoencapsulada. Da mesma forma, após 21 dias de experimento também foi
observada diferença significativa entre a viscosidade das duas formulações estudadas.
Conforme demonstra a Tabela 6, a forma livre apresentou valores maiores de viscosidade
quando comparado com a forma nanoencapsulada. Pode-se observar desta forma, que para
cada formulação existe um tipo de interação entre o carreador, o fármaco e/ou o veículo,
em função do tempo e dos componentes envolvidos, determinando os diferentes
comportamentos reológicos de cada sistema. Além disso, estes resultados demonstram que
apesar da formulação nanoestruturada apresentar um valor de viscosidade menor que o
encontrado para a formulação contendo o ativo na forma livre, ela é capaz de manter a
viscosidade da formulação em valores adequados mesmo após ser submetida ao ciclo gelodegelo durante 21 dias, não havendo perda da estabilidade do produto.
Estes valores podem ser comparados com o comportamento reológico apresentado
por formulações semissólidas contendo nanocápsulas de adapaleno quando incorporadas
em bases de Carbopol 940® estudados por Bruschi (2010). O autor observou que as
formulações contendo os sistemas nanopartículados não sofreram alteração significativa de
viscosidade, comparando os valores iniciais (886333 ± 91571 mPa.s) e após 90 dias de
armazenamento em estufa (780000 ± 17088 mPa.s). Além disso, pode-se observar que o
Carbopol 940® contendo adapaleno nanoestruturado apresentou maior viscosidade que as
formulações de Aristoflex AVL® após a incorporação da suspensão de nanocápsulas,
entretanto ambas as formulações apresentaram valores de viscosidade adequados. Desta
forma, pode-se considerar que esta divergência, provavelmente deva-se às diferenças entre
os dois veículos.
59
Figura 9. Reograma para as formulações semissólidas contendo adapaleno na forma livre ou nanoencapsulada
referentes aos valores iniciais e após 21 dias de estudo
Através da análise das características reológicas das formulações semissólidas
contendo adapaleno, tanto para a forma nanoencapsulada como para a forma livre (Tabela 6
e Figura 9), pode-se verificar que as formulações apresentaram fluxo não-newtoniano e
comportamento pseudoplástico (n<1), seguindo o modelo de Ostwald, indicando que a
adição das nanopartículas não modificou o comportamento reológico da formulação. De
acordo com a literatura, várias formulações farmacêuticas e cosméticas apresentam este
comportamento, especialmente géis, emulsões e suspensões constituídas com partículas de
diâmetro inferiores a 1 µm (GASPAR e MAIA CAMPOS et al, 2003; ALVES,
POHLMANN e GUTERRES 2005; RIBEIRO, MORAIS e ECCLESTON, 2004;
BRUSCHI, 2010).
O fluxo pseudoplástico pode ser caracterizado pela ruptura progressiva da estrutura
do meio, quando a taxa de cisalhamento é aumentada. Nas dispersões poliméricas e na
maioria os sistemas semissólidos que contenham esses componentes, o comportamento
pseudoplástico surge em consequência da existência de interações intermoleculares entre as
cadeias poliméricas (LACHMAN, LIEBERMAN e KANIG, 2001).
O tipo de influência que os sistemas nanoestruturados exercem nas formulações
semissólidas tem sido avaliado por diversos autores. Alves e colaboradores (2007)
estudaram o comportamento reológico de formulações semissólidas (hidrogéis) contendo
60
nanocápsulas, nanoesferas ou nanoemulsões de nimesulida e observaram que todas as
formulações estudadas (contendo nanocarreador ou não) apresentaram comportamento não
newtoniano pseudoplástico, indicando que a adição de nanopartículas não modificou as
características reológicas da formulação de gel hidrofílico.
Bruschi (2010) ao estudar nanocápsulas de adapaleno incorporadas em base de
Carbopol 940®, avaliou as características reológicas do hidrogel contendo o fámaco na
forma livre ou nanoestruturada e observou que ambas as formulações estudadas
apresentaram comportamento não newtoniano com fluxo pseudoplástico.
Este comportamento não newtoniano pseudoplástico ainda foi observado com
nanocápsulas de meloxicam incorporadas em hidrogel de Carbopol 940® (BOCHI, 2010),
confirmando os resultados obtidos no presente estudo e com nanocápsulas de dexametasona
incorporadas em creme gel (FERRONY, 2009).
Dentre as avaliações reológicas realizadas pode-se determinar os valores de
espalhabilidade, avaliando-se o comportamento da mesma após a incorporação do
nanocarreador. Pode-se avaliar ainda se as formulações semissólidas mantêm seus valores
de espalhabilidade quando submetidas ao ciclo gelo-degelo durante 21 dias. No presente
estudo, os valores de espalhabilidade foram comparados entre as formulações semissólidas
contendo adapaleno na forma livre e na forma nanoencapsulada. Essa comparação foi
realizada para verificar se a presença das suspensões contendo nanocápsulas poderia
modificar a espalhabilidade da formulação.
Os valores de espalhabilidade para as formulações contendo adapaleno na forma
livre e nanoencapsulada encontram-se descritos na Tabela 7 e na Figura 10.
Tabela 7. Valores referentes à espalhabilidade (mm²) das formulações semissólidas
contendo adapaleno na forma livre (CGA) e na forma nanoencapsulada (CGNCA) durante
21 dias de estudo
Tempo (dias)
CGNCA
CGA
0
4905±435
2793±489
21
4641±446
6269±1034*
Valores referentes à média para determinação de três formulações ± desvio padrão.
* Valores estatisticamente significativos (p≤0,05) quando comparados com os seus resultados iniciais.
**Peso da placa: 348,62 g.
61
Conforme pode ser observado na Tabela 7 e Figura 10, as formulações semissólidas
contendo adapaleno nanoencapsulado, não alteraram significativamente seus valores de
espalhabilidade após 21 dias de análise. Entretanto, nas formulações contendo adapaleno na
forma livre, verificou-se um aumento significativo (p<0,05) entre a espalhabilidade inicial e
após 21 dias.
Figura 10 - Valores referentes a espalhabilidade apresentada pelas formulações contendo adapaleno na forma
livre ou nanoencapsulado durante 21 dias de estudo
Quando foram realizadas análises de espalhabilidade no tempo zero, observou-se
que houve diferença significativa (p<0,05) entre a espalhabilidade do gel contendo o
fármaco na forma livre e na forma nanoestruturada. Desta forma, pode-se verificar que a
incorporação da suspensão de nanocápsulas conferiu um aumento significativo da
espalhabilidade das preparações, comparando com as formulações contendo adapaleno
livre. Entretanto, estes valores foram mantidos durante todo o período de estudo.
A espalhabilidade está diretamente relacionada com a viscosidade e com a
composição da formulação (CONTRERAS e SANCHEZ, 2002). Desta forma, pode-se
observar no presente estudo que apesar de ter ocorrido um aumento estatisticamente
significativo nos valores de viscosidade para as formulações contendo o ativo
nanoestruturado, experimentalmente este aumento não modificou as características do
produto assim como os valores de espalhabilidade.
De acordo com os resultados encontrados no presente experimento, pode-se
62
observar que o Aristoflex AVL® representou ser um veículo adequado para a incorporação
de suspensões contendo nanocápsulas de adapaleno, visto que as características reológicas
das formulações estudadas foram mantidas durante todo o período de análise.
4.2.5 Determinação do teor de adapaleno das formulações semissólidas
4.2.5.1 Construção da curva padrão para determinação do teor de adapaleno
A metodologia analítica para a quantificação do adapaleno em suspensões de
nanocápsulas foi previamente desenvolvida e validada por Barrios e colaboradores (2011).
O método foi linear na faixa de concentração entre 10-30 µg/mL, apresentando coeficiente
de determinação de 0,994. Foram determinados também os limites de quantificação e de
detecção, indicando que a metodologia é eficiente para quantificar o adapaleno em
concentração mínima de 0,37 µg/mL.
Analisando os resultados obtidos, constatou-se que a curva padrão do adapaleno
apresentou regressão linear significativa (p<0,05), não havendo desvio significativo de
linearidade (p>0,05), mostrando-se desta forma linear. A equação da reta para o método
foi: y = 73,688x – 304,39; onde x é a concentração em µg/mL e y a área, apresentando um
coeficiente de determinação de 0,9992.
Figura 11. Curva padrão do adapaleno obtida por CLAE
De acordo com os resultados obtidos, conclui-se que a curva analítica pode ser
63
utilizada para a interpolação de valores experimentais, visando à determinação quantitativa
do teor de adapaleno, visto que o coeficiente de determinação foi maior que 0,99. Isto
permite uma estimativa da qualidade da curva analítica obtida, sendo que quanto mais
próximo de 1,0, menor a dispersão do conjunto de pontos experimentais (ANVISA, 2003a).
4.2.5.2 Doseamento do adapaleno na forma livre e nanoencapsulada e incorporado nas
formulações semissólidas
De acordo com os resultados obtidos (n = 3), o teor inicial de adapaleno (95,31 % ±
1,33) nas formulações semissólidas contendo o fármaco nanoencapsulado não sofreu
alteração significativa (p>0,05), quando comparado com o teor obtido no término do
experimento (94,59 % ± 1,82). Porém, nas formulações contendo o ativo na forma livre
houve uma redução estatisticamente significativa (p<0,05) na concentração de adapaleno,
visto que o teor inicial foi de 99,21 % ± 1,50 e que este decaiu para 87,43 % ± 1,64 após 21
dias de análise.
A influência que sistemas nanoestruturados exercem com relação à manutenção do
teor de ativos por um período de tempo maior, tem sido investigada por diversos autores
como Paese et al (2009) que realizaram experimentos com nanocápsulas de benzofenona-3,
Ioele et al (2005) que estudaram lipossomas contendo tretinoína e isotretinoína e Ourique et
al (2008) que realizaram estudos utilizando a tretinoína associada a nanocápsulas
poliméricas. Os autores observaram que a associação do ativo ao nanocarreador aumentou a
estabilidade do mesmo, ou seja, o teor do ativo foi mantido por um período de tempo
maior, comparando com as formulações contendo o fármaco na forma livre.
Neste contexto, os resultados encontrados no presente experimento indicam que as
nanocápsulas estão mantendo o teor do ativo por um período de tempo maior, quando
comparado com as mesmas formulações contendo o fármaco na forma livre, ou seja, as
nanocápsulas podem estar exercendo uma ação protetora frente ao fármaco, permitindo a
manutenção de seus teores acima de 90% mesmo após serem submetidas ao ciclo gelodegelo durante 21 dias.
64
4.2.6 Teste de centrifugação
Quando trata-se de formulações emulsionadas, como no presente experimento, a
centrifugação simula um aumento na força da gravidade, acelerando a mobilidade das
partículas e antecipando possíveis sinais de instabilidade, como precipitação, separação de
fases, formação de sedimento compacto e coalescência (ANVISA, 2007).
O teste de centrifugação realizado no presente experimento teve como objetivo
determinar o comportamento apresentado pelas formulações no final das condições de
armazenamento. Observou-se que as formulações estudadas não sofreram qualquer tipo de
alteração após a centrifugação, ou seja, não houve precipitação ou mudanças que
demonstrem instabilidade. Desta forma, pode-se considerar que o Aristoflex AVL® é um
veículo adequado para a incorporação de suspensões coloidais contendo nanocápsulas de
adapaleno.
4.3 Avaliação dos efeitos das formulações na pele humana por Bioengenharia Cutânea
De acordo com a Agência Nacional de Vigilância Sanitária do Ministério da Saúde,
quando a um produto é atribuído um beneficio específico, é necessária a comprovação de
sua eficácia e segurança. Sendo assim, para a avaliação da segurança de um produto
dermocosmético deve-se considerar parâmetros como condições de uso, composição do
produto, efeitos toxicológicos sistêmicos e reações de irritação, as quais são decorrentes da
penetração cutânea ou de mucosa dos ingredientes e estão relacionadas às concentrações de
uso do produto final. Destaca-se, assim, a importância da realização de ensaios em
humanos para avaliar produtos de uso tópico a fim de verificar potencial de reações
cutâneas (ANVISA, 2003b).
A incidência de dermatite de contato pela aplicação de produtos dermocosméticos
varia de acordo com a área geográfica, visto que depende de hábitos de prescrição, além de
variações no decorrer dos anos (LAZZARINI et al, 2009). É desencadeada por agentes com
propriedades de causar dano tecidual direto, sendo o eczema de contato, em todas as fases,
o tipo mais freqüente de reação, sempre acompanhado de prurido intenso. Os agentes
causadores da dermatite de contato, presentes em formulações de uso tópico, incluem tanto
65
principios ativos (retinóides, peróxido de benzoíla) quanto outros ingredientes
(conservantes, acidulantes, emulsificantes), muitos dos quais são encontrados tanto em
formulações farmacêuticas quanto cosméticas (BRANDÃO, GOOSSENS e TOSTI, 2006).
Destaca-se também, que pacientes portadores de dermatites apresentam uma perda
da função barreira da pele, o que aumenta a probabilidade de sensibilização à substâncias
ativas (LAZZARINI et al, 2009).
A avaliação através de ensaios de biometria cutânea tem sido bastante utilizada para
realização de estudos sobre os efeitos de diferentes ativos na pele, mas existem poucos
trabalhos realizados com ativos em sistemas nanoparticulados (WISSING e MÜLLER,
2003; MÜLLER et al, 2007; PARDEIKE, SCHWABE e MÜLLER 2010). Desta forma,
torna-se de extrema relevância a realização deste experimento, em função de que até o
presente momento, nenhum trabalho foi realizado com o adapaleno nanoencapsulado para
determinação dos parâmetros analisados.
Cabe ressaltar que para a realização dos ensaios de biometria cutânea in vivo,
utilizou-se as formulações semissólidas previamente desenvolvidas por Bruschi (2010),
visto que o autor já realizou testes de estabilidade das preparações, bem como ensaios de
permeação cutânea in vitro.
A região dos antebraços dos voluntários foi a região corporal escolhida para a
realização do referido estudo, pois a mesma vem sendo empregada para a avaliação de
eficácia de produtos dermocosméticos. Esta região pode apresentar uma série de vantagens,
como o comprometimento dos voluntários ao estudo, devido à facilidade de aplicação e
avaliação. Considera-se ainda que nessa região, ocorre menor interferência das condições
ambientais e do estilo de vida (CAMARGO Jr., 2006; ESPOSITO et al, 2007;
ALEKSEEV, SZABO e ZISKIN, 2008; CHENG et al, 2008).
4.3.1 Determinação do conteúdo aquoso do estrato córneo (grau de hidratação
cutânea)
O conteúdo aquoso do estrato córneo é mantido por um filme hidrolipídico,
constituído por material graxo excretado pelas glândulas sebáceas e componentes
excretados no suor (emulsão epicutânea). Este filme hidrolipídico encontrado na pele, tem
66
como funções: formar uma barreira de proteção acídica evitando a penetração de
substâncias danosas ao organismo, proteger a pele do ressecamento e manter a sua
flexibilidade (SPENCER, 1988). A hidratação da pele é um dos principais determinantes da
absorção percutânea, visto que influencia cada passo da formação, maturação e esfoliação
do estrato córneo, incluindo a formação dos corneócitos e a organização lipídica
intercelular (SMITH, 1999).
O Corneometer® é um equipamento baseado na medida da capacitância, e vem
sendo muito utilizado na avaliação do conteúdo aquoso do estrato córneo por apresentar
alta sensibilidade (RODRIGUES,1995; ROGIERS et al, 1999; MÜLLER et al, 2007).
Os resultados obtidos para a determinação do conteúdo aquoso do estrato córneo no
antebraço dos voluntários são expressos em unidades arbitrárias (U.A.) e estão
demonstrados na Tabela 8.
Tabela 8. Determinação do conteúdo aquoso do estrato córneo realizado por biometria
cutânea utilizando gel de Carbopol® contendo adapaleno na forma livre (GCA) e na forma
nanoencapsulada (GCNCA)
Tempo
(dias)
0
7
14
21
28
35
42
49
56
63
Formulações
GCA
GCNCA
Média (U.A.) ± DP
DPR (%)
47,19±7,53a
15,96
45,69±6,31a
13,82
13,78
a
13,49
a
12,49
a
12,36
a
17,59
a
17,61
a
15,77
a
21,43
a
12,68
a
11,12
41,48±5,72
abc
39,7±5,53
b
41,29±4,67
abc
42,09±7,32
abc
42,75±6,69
abc
42,59±8,44
abc
40,53±7,46
abc
b
38,83±8,02
33,25±4,03
bd
13,90
11,31
17,38
15,64
19,83
18,40
20,65
12,11
Média (U.A.) ± DP
42,14±5,69
40,23±5,02
41,72±5,16
42,77±7,52
41,67±7,34
42,45±6,69
40,54±8,69
40,94±5,19
41,15±4,58
DPR (%)
a-b-c-d: as médias com as letras diferentes dentro da mesma coluna apresentaram diferença significativa entre
si (p<0,05) de acordo com o teste de Tukey.
Conforme pode ser observado na Tabela 8, os valores basais das formulações
contendo adapaleno na forma livre apresentaram uma diminuição significativa (p<0,05)
após 56 dias de aplicação do produto, ou seja, ocorreu uma redução do conteúdo aquoso do
67
estrato córneo com o uso prolongado da formulação. Entretanto, no caso do gel contendo o
ativo na forma nanoencapsulada não ocorreu diferença significativa durante todo o período
observado.
Comparando o gel contendo adapaleno na forma nanoestruturada com o gel
contendo o fármaco na forma livre houve alteração significativa (p<0,05) após 63 dias de
aplicação, observando-se uma redução mais pronunciada dos valores do conteúdo aquoso
do estrato córneo nas regiões tratadas com o gel com o ativo na forma livre, o que indica
que as formulações nanoestruturadas podem estar causando uma diminuição do
ressecamento provocado pelo adapaleno.
As alterações que diferentes ativos de uso tópico podem causar, com relação às
características fisiológicas da pele, vêm sendo estudadas por diversos autores. Entre eles,
Gomes (2007) analisou formulações semissólidas contendo ácido retinóico nas
concentrações de 0,025, 0,05 e 0,1%, comparando com formulações contendo palmitato de
retila nas concentração de 0,025, 0,05 e 1%. Para a realização dos ensaios biológicos foram
utilizados, como modelo experimental, camundongos sem pêlo. Na avaliação da pele dos
camundongos por técnicas de Biometria Cutânea, o palmitato de retila não apresentou
nenhuma alteração nos valores do conteúdo aquoso do estrato córneo quando comparados
com o controle e o veículo. Por outro lado a aplicação das diferentes concentrações de
ácido retinóico reduziu de forma estatisticamente significativa o grau de hidratação cutânea,
semelhante ao que foi observado no presente experimento quando avaliou-se o conteúdo
aquoso da pele dos voluntários após a aplicação das formulações contendo adapaleno na
forma livre.
Com base no exposto pode-se concluir que, com relação à hidratação cutânea, o
adapaleno associado às nanocápsulas foi capaz de manter as características fisiológicas da
pele mesmo com o uso prolongado do produto. Desta forma, as formulações contendo o
fármaco nanoencapsulado podem ser mais indicadas para pacientes com pele sensível, visto
que a hidratação cutânea reduz a suscetibilidade à irritação, favorecendo a manutenção da
integridade do estrato córneo.
68
4.3.2 Determinação do pH cutâneo
A manutenção do pH cutâneo está diretamente ligado ao equilíbrio do manto
hidrolipídico, da homeostase e de funções imunológicas da pele. Porém, em estudos que
envolvem avaliação do pH cutâneo é comum que algumas variações sejam observadas na
realização destas análises, sem com isto significar algum comprometimento da pele
(LEONARDI, GASPAR e MAIA CAMPOS, 2002). Os resultados referentes à
determinação do pH no antebraço dos voluntários durante 63 dias estão demonstrados na
Tabela 9.
Tabela 9. Determinação do pH realizado por biometria cutânea para avaliação do gel de
Carbopol® contendo adapaleno na forma livre (GCA) e na forma nanoencapsulada
(GCNCA)
Formulações
Tempo
(dias)
GCA
Média (U.A.) ± DP
4,57±0,41
a
4,54±0,65
a
4,62±0,46
a
4,60±0,62
a
4,84±0,59
a
4,87±0,53
a
42
4,86±0,45
a
49
a
0
7
14
21
28
35
56
63
4,77±0,7
4,74±0,67
a
5,03±0,78
a
GCNCA
DPR (%)
8,94
14,30
9,97
13,48
12,25
10,94
9,36
14,87
14,14
15,48
Média (U.A.) ± DP
DPR (%)
4,54±0,43
a
9,47
4,62±0,50
a
10,91
4,78±0,37
a
7,82
4,72±0,78
a
16,45
4,92±0,54
a
10,98
4,79±0,39
a
8,22
4,85±0,40
a
8,33
4,71±0,59
a
12,56
4,89±0,56
a
11,53
5,07±0,56
a
11,05
a-b: as médias com as letras diferentes dentro da mesma coluna apresentaram diferença significativa entre si
(p<0,05) de acordo com o teste de Tukey.
De acordo com os resultados expressos na Tabela 9, pode-se observar que não
houve alteração estatisticamente significativa (p>0,05) do pH durante os 63 dias de
aplicação para ambas as formulações testadas. Desta forma, os valores do pH cutâneo
mantiveram-se dentro de uma faixa considerada normal (4,5-5,5) para aplicação de
produtos tópicos, demonstrando que as formulações estudadas não alteraram as
características fisiológicas da pele (PRUNIERAS, 1994; LEONARDI, GASPAR E MAIA
69
CAMPOS, 2002).
A importância do pH se deve principalmente pela ligação entre o mesmo e algumas
patogenias como dermatite de contato, dermatite atópica, ictiose, acne vulgar e infecções
por Candida Albicans (EBERLEIN-KÖNIG et al, 2000; SCHMID-WENDTNER e
KORTING, 2006). Em vista disso, vale ressaltar a importância das formulações analisadas
no presente experimento não causarem alterações no pH cutâneo.
Apesar de existirem poucos trabalhos utilizando análises biofísicas não invasivas
para avaliação de sistemas nanoparticulados, Silva (2010) realizou estudos de
bioengenharia cutânea comparando formulações de creme gel contendo um filtro solar
químico (benzofenona-3) associado à nanocápsulas com o creme gel contendo o ativo na
forma livre. O experimento foi realizado com vinte voluntários e o pH foi avaliado nos
tempos 0, 7, 14, 21 e 28 dias, comparando os valores basais (5,31 e 5,46) e finais (4,67 e
4,75) de ambas as formulações, pode-se observar uma diminuição nos valores obtidos para
a determinação do pH e a ocorrência de diferença estatística significante (p<0,05), porém
estes valores, assim como os encontrados neste experimento, mantiveram-se dentro de uma
faixa considerada normal, não caracterizando alteração fisiológica importante.
4.3.3 Determinação da perda transepidérmica de água
Além do conteúdo aquoso do estrato córneo, um parâmetro importante na avaliação
da função barreira da pele é a perda transepidérmica de água (PTEA). Quando a pele está
adequadamente hidratada, ela está apta para cumprir efetivamente todas as suas funções. O
aumento excessivo da PTEA indica que a função barreira da pele está prejudicada, ou seja,
a pele está susceptível a agentes externos e, também, à desidratação (HADGRAFT, 2001;
VERDIER-SEVRAIN e BONTÉ, 2007).
Levin e Maibach (2005) observaram que há relação entre a perda transepidérmica
de água e a absorção percutânea e que, além disso, diversos estudos mostraram a associação
entre várias doenças de pele e a função barreira alterada, expresso por um aumento da
PTEA. Lebwohl e Herrmann (2005), por exemplo, demonstraram que a dermatite atópica
está associada a distúrbios da função barreira da pele, evidenciado por um aumento na
PTEA. Os estudos clínicos realizados por estes autores sugerem que este déficit aumenta a
70
susceptibilidade à irritação e compromete a integridade do estrato córneo. O mesmo foi
observado por Agner (1992) o qual constatou que pacientes com dermatite atópica tinham
um aumento na PTEA, bem como na susceptibilidade da pele à irritação em comparação ao
grupo controle. Neste contexto, Lodén (1995) observou que o uso de hidratantes contendo
óleo de canola aumenta a hidratação da pele e diminui a PTEA, com isso reduz a irritação
cutânea induzida por lauril sulfato de sódio.
Os resultados obtidos através da determinação da perda transepidérmica de água no
antebraço dos voluntários são expressos em g/h/m2 e estão demonstrados na Tabela 10 e
Figura 12.
Tabela 10. Determinação da perda transepidérmica de água realizada por biometria cutânea
utilizando o gel de Carbopol® contendo adapaleno na forma livre (GCA) e na forma
nanoencapsulada (GCNCA)
Tempo
(dias)
Formulações
GCA
Média (U.A.) ± DP
0
7
14
21
28
35
42
49
56
63
5,35±1,28
a
ab
6,66±1,89
ab
6,15±1,75
ab
6,64±1,68
ab
6,65±1,66
6,92±1,77
b
7,63±2,09
b
7,90±2,24
b
7,39±1,51
b
8,15±1,97
b
GCNCA
DPR (%)
23,96
28,35
28,50
25,27
24,94
27,36
25,60
28,32
20,37
24,20
Média (U.A.) ± DP
DPR (%)
5,88±1,36
a
23,22
5,82±0,87
a
14,99
ab
27,84
3,78±1,06
b
27,96
3,71±1,05
b
28,36
3,42±0,74
b
21,63
3,65±0,58
b
15,93
3,54±0,84
b
23,61
3,40±0,77
b
22,60
3,40±0,72
b
21,23
5,97±1,66
a-b: as médias com as letras diferentes dentro da mesma coluna apresentaram diferença significativa entre si
(p<0,05) de acordo com o teste de Tukey.
De acordo com os resultados apresentados na Tabela 10, observa-se que na
formulação contendo o fármaco na forma livre houve um aumento estatisticamente
significativo (p<0,05) na PTEA após 35 dias de aplicação do produto testado (6,92±1,77),
quando comparado aos valores basais (5,35±1,28). Ao contrário, analisando-se os valores
obtidos pelo uso do gel contendo adapaleno nanoencapsulado observa-se uma redução
estatisticamente significativa (p<0,05) na PTEA após 63 dias de experimento (3,40±0,72),
71
comparando com os valores iniciais (5,88±1,36).
Figura 12. Representação gráfica dos valores médios obtidos no período de 63 dias, no ensaio de biometria
cutânea para perda transepidérmica de água.
Através da comparação entre a formulação de gel contendo o adapaleno na forma
livre e nanoestruturada, evidenciou-se que as nanocápsulas poliméricas são capazes de
diminuir a perda transepidérmica de água, favorecendo o grau de hidratação cutânea, apesar
do uso do retinóide.
Este efeito vem sendo evidenciado para nanopartículas lipídicas sólidas (NLS).
Wissing e Müller (2003) avaliaram a hidratação cutânea utilizando ensaios in vivo não
invasivos durante o desenvolvimento de novas formulações cosméticas. Os autores
compararam um creme O/A convencional com o mesmo creme enriquecido com NLS e
observaram que o creme contendo as nanopartículas foi significativamente mais efetivo que
o creme convencional, visto que foi capaz de aumentar 31% o conteúdo aquoso do estrato
córneo, enquanto a formulação sem a adição das nanopartículas aumentou 24%. Estes
resultados confirmaram o que foi observado pelos mesmos autores para formulações
fotoprotetoras associadas à NLS. Neste caso, foi detectado a formação de um filme sobre a
pele após a aplicação das preparações, visualizado por microscopia eletrônica (Wissing e
Müller, 2003). Desta forma os autores sugerem que as nanopartículas reduzem a perda
transepidérmica de água e com isso aumentam o grau de hidratação cutânea.
Além da estrutura e características do sistema, a concentração do ativo é outro fator
que pode influenciar as características fisiológicas da pele, em vista disso Camargo Jr
72
(2006) avaliou formulações cosméticas contendo diferentes concentrações de pantenol (0,5;
1,0 e 5,0 %), para tal foi realizada a determinação da perda transepidérmica de água por
metodologia in vivo não-invasiva (Biometria Cutânea). Neste estudo, para analisar os
efeitos à longo prazo, as formulações foram aplicadas nos antebraços de 40 voluntários,
sendo realizadas medidas basais e após 15 e 30 dias de experimento. Com isso os autores
observaram que apenas as formulações contendo o pantenol a 1,0 e 5,0% protegeram a
função barreira, provocando uma diminuição significativa na perda transepidérmica de
água, o que pode sugerir que para que o pantenol tenha um efeito significativo na função
barreira da pele à longo prazo, este deve ser incorporado nas formulações em concentrações
mais altas, ou seja, 1,0 e 5,0%.
Conforme descrito anteriormente, pode-se concluir que a associação do fármaco às
nanocápsulas impediu o aumento da PTEA causada pelo ativo na forma livre, contribuindo
para a redução do ressecamento da pele, o qual é considerado um dos principais efeitos
adversos provocados pela administração tópica do adapaleno.
4.3.4 Determinação do conteúdo de melanina
A pigmentação da pele deve-se a presença da melanina, que se dispõe de forma
homogênea na camada córnea. A síntese de melanina resulta de um processo complexo,
designado melanogênese, o qual é regulado pela incidência da radiação UV, por estímulos
hormonais e por fatores hereditários (OLIVEIRA et al, 2004a). O Mexameter® MX 18
especificamente mede o conteúdo de melanina e hemoglobina na pele.
Conforme Bhawan (1998) os retinóides além de agirem na modulação da
proliferação e diferenciação dos queratinócitos, estão envolvidos na pigmentação do estrato
córneo, visto que esta classe de fármacos atua na regulação da atividade dos melanócitos,
promovendo também a dispersão dos grânulos de melanina.
Neste contexto, Draelos (2005) avaliou a eficácia de um creme emoliente contendo
retinol a 0,3% associado à hidroquinona a 4% em 44 voluntários, com idade entre 30 e 50
anos. A formulação foi aplicada uma vez ao dia (à noite) durante 16 semanas, observando
no final do experimento que o creme constituiu uma forma eficaz para eliminar manchas
castanhas resultantes da exposição solar excessiva.
73
No presente experimento, para efeito de classificação, segundo Fitzpatrick e
colaboradores (1974), foram determinados seis fototipos cutâneos que variaram de acordo
com a coloração da pele de mais clara a mais escura, sendo que 60 % dos voluntários
apresentaram fototipo IV (pele morena, cabelos castanhos escuros e olhos escuros), 30 %
apresentaram fototipo III (pele clara a morena clara, cabelos loiros ou castanhos claros e
olhos claros) e 10 % apresentaram os demais fototipos.
Os resultados obtidos na determinação da melanina no antebraço dos voluntários
estão demonstrados na Tabela 11.
Tabela 11. Determinação do conteúdo de melanina realizado por biometria cutânea
utilizando o gel de Carbopol® contendo adapaleno na forma livre (GCA) e na forma
nanoencapsulada (GCNCA)
Tempo
(dias)
Formulações
GCA
Média (U.A.) ± DP
0
7
14
21
28
35
42
49
56
63
174,78±44,44
a
ab
163,03±41,45
ab
159,07±41,58
ab
150,82±36,15
ab
148,00±37,64
ab
148,33±38,88
ab
137,87±32,87
ab
143,06±38,48
ab
138,59±35,81
134,15±34,69
b
GCNCA
DPR (%)
25,43
25,43
26,14
23,97
25,43
26,21
23,84
26,90
25,84
25,86
Média (U.A.) ± DP
DPR (%)
a
25,78
ab
27,46
ab
26,69
ab
25,70
ab
26,53
ab
26,48
ab
26,17
ab
26,71
ab
26,07
b
25,02
172,16±44,38
161,18±44,26
156,40±41,74
149,00±38,30
147,27±39,07
145,11±38,42
141,22±36,96
139,24±37,19
136,15±35,49
131,95±33,02
a-b: as médias com as letras diferentes dentro da mesma coluna apresentaram diferença significativa entre si
(p<0,05) de acordo com o teste de Tukey.
Através da comparação dos valores basais com os obtidos após 63 dias de
experimento, pode-se observar uma diminuição estatisticamente significativa (p<0,05) do
conteúdo de melanina no decorrer do experimento para ambas as formulações.
Provavelmente esta diminuição esteja associada à ação regulatória dos retinóides sobre a
atividade dos melanócitos, visto que os receptores retinóicos são importantes tanto na
modulação da diferenciação dos queratinócitos quanto na sua pigmentação (BHAWAN,
1998).
74
Em outro estudo envolvendo biometria cutânea, Hwang e colaboradores (2009)
avaliaram o índice de melanina em 40 voluntários com melasma que foram tratados durante
16 semanas com ácido L-ascórbico 25% associado a N-metil-2-pirrolidona e dimetil
isossorbida (C’ensil). O serum estudado foi aplicado na face dos pacientes duas vezes ao
dia e o conteúdo de melanina foi determinada através de ensaios de biometria cutânea nos
tempos 0 (medida basal), 4, 8, 12 e 16 semanas. Os resultados demonstraram que houve
uma diminuição estatisticamente significativa no índice médio de melanina comparando os
valores basais com àqueles obtidos após 16 semanas de experimento. Com isso os autores
podem concluir que a formulação estudada foi efetiva para o tratamento do melasma.
Com base nos resultados obtidos no presente experimento evidenciou-se que o
adapaleno tanto na forma livre quanto nanoencapsulada reduziu o índice de melanina com o
uso prolongado do produto, sendo que esta redução foi verificada somente após 63 dias de
aplicação das formulações.
4.3.5 Determinação da presença de eritema
O índice de eritema tem uma correlação direta com os processos de irritação da pele
e é frequentemente usado em testes para avaliação da segurança dos produtos. Os
resultados obtidos na determinação do eritema no antebraço dos voluntários estão
demonstrados na Tabela 12 e Figura 13.
A análise estatística indicou que as formulações contendo o fármaco na forma livre
aumentaram, de maneira significativa (p<0,05) o índice de eritema da pele dos voluntários.
Este aumento pode ser observado após 56 dias de aplicação do produto quando comparado
com os valores basais.
Com relação ao gel contendo nanocápsulas de adapaleno, não houve qualquer
indício de irritação, uma vez que os valores basais obtidos não apresentaram alteração
significativa nos 63 dias de uso das formulações (Tabela 12), ou seja, não foram
estatisticamente diferentes (p>0,05), indicando que as formulações nanoestruturadas
reduziram o eritema causado pelo uso do retinóide na forma livre. Este fato provavelmente
deva-se à redução da perda transepidérmica de água causada pelo o uso das formulações
nanoestruturadas, o que reduz a suscetibilidade à irritação, favorecendo a manutenção da
75
integridade do estrato córneo e a hidratação cutânea.
Tabela 12. Determinação da presença de eritema realizado por biometria cutânea utilizando
o gel de Carbopol® contendo adapaleno na forma livre (GCA) e na forma nanoencapsulada
(GCNCA)
Tempo
(dias)
Formulações
GCA
Média (U.A.) ± DP
0
7
14
21
28
35
42
49
56
63
238,08±47,80
a
ab
247,14±49,46
ab
250,48±41,90
ab
248,29±46,52
ab
260,70±44,01
ab
262,11±34,98
ab
262,39±39,90
ab
263,19±35,54
272,71±38,33
b
276,18±39,34
b
GCNCA
DPR (%)
20,08
20,01
16,73
18,74
16,88
13,34
15,21
13,50
14,06
14,24
Média (U.A.) ± DP
DPR (%)
240,27±56,54
a
23,53
239,19±55,87
a
23,36
234,48±47,30
a
20,17
229,59±53,42
a
23,27
232,92±42,46
a
18,23
227,84±47,20
a
20,72
224,36±49,82
a
22,21
214,63±47,95
a
22,34
217,82±46,69
a
21,44
208,94±42,90
a
20,53
a-b: as médias com as letras diferentes dentro da mesma coluna apresentaram diferença significativa entre si
(p<0,05) de acordo com o teste de Tukey.
Figura 13. Representação gráfica dos valores médios obtidos no período de 63 dias, no ensaio de biometria
cutânea para os valores de eritema.
Gomes (2007) avaliou o índice de eritema na pele de camundongos sem pêlo através
de ensaios de biometria cutânea, comparando formulações semissólidas contendo ácido
76
retinóico 0,025, 0,05 e 0,1% com formulações contendo palmitato de retila 0,025, 0,05 e
1%. Após 5 dias de experimento, a análise dos resultados demonstrou que apenas as
formulações contendo 0,025 e 0,05% de ácido retinóico e 1,0% de palmitato de retinila
aumentaram, de maneira estatisticamente significativa, o índice de eritema da pele dos
camundongos sem pêlo, quando comparados com a região que recebeu apenas a aplicação
do veículo. Analisando os resultados, o autor sugeriu que após 5 dias de tratamento, os
grupos tratados com as formulações contendo as duas menores concentrações de ácido
retinóico ainda estavam em processo de aumento da vascularização e os grupos tratados
com a maior concentração deste já estavam no final do processo e com a vascularização e,
conseqüentemente, com o eritema reduzidos. Neste contexto, pode-se concluir que o ácido
retinóico, bem como o adapaleno, na forma livre podem provocar um aumento do índice de
eritema, sendo este efeito considerado como adverso ao uso de retinóides por via tópica.
Com base no exposto, pode-se concluir que a formulação contendo adapaleno
nanoencapsulado foi capaz de reduzir o índice de eritema provocado pelo fármaco na forma
livre e isto provavelmente esteja associado à velocidade de liberação mais lenta do ativo
quando incorporado a este tipo de sistema.
4.4 Estudos de liberação in vitro
4.4.1 Construção da curva analítica para realização dos estudos de liberação
A curva analítica para realização dos estudos de liberação foi obtida através de
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), de acordo com o item 3.2.2.1. A equação
da reta foi calculada por meio de estudos de regressão linear, entre a concentração de
adapaleno e sua respectiva área (Figura 14).
77
Figura 14. Curva de calibração do adapaleno obtida por CLAE
O estudo da linearidade do método analítico foi realizado através de análise de
variância, verificando-se regressão linear significativa e desvio da linearidade não
significativo (p<0,01). O método foi considerado linear na faixa entre 0,2 e 4 µg/mL,
obtendo-se um coeficiente de determinação igual a 1.
4.4.2 Análise dos resultados de liberação
O perfil de liberação in vitro de uma substância ativa associada à nanocápsulas
depende de uma variedade de fatores, tais como: concentração e características físicoquímicas do fármaco (principalmente sua solubilidade e coeficiente de partição óleo/água);
natureza, degradabilidade, peso molecular e concentração do polímero; microestrutura do
polímero sólido, quando re-precipitado; a natureza do núcleo oleoso; tamanho das
nanocápsulas; condições do método de preparação e condições do ensaio de liberação (pH
do meio, temperatura e tempo de contato). Neste contexto, as condições estabelecidas para
a realização de cada estudo é fundamental na determinação do perfil de liberação in vitro da
substância ativa (MORA-HUERTAS, FESSI e ELAISSARI, 2010).
De acordo com a literatura, nanocápsulas obtidas por nanoprecipitação representam
um sistema bifásico com uma liberação rápida inicial (burst), seguida por uma fase de
liberação mais lenta (CAUCHETIER et al, 2003). A fase de liberação inicial pode ser
atribuída ao fármaco que encontra-se adsorvido na superfície da nanocápsula (CRUZ et al,
2006) ou a degradação da fina membrana polimérica (CAUCHETIER et al, 2003). A
78
segunda fase corresponde à difusão da substância ativa a partir do núcleo oleoso. Este
processo de difusão é determinado pelo coeficiente de partição do fármaco entre o núcleo
oleoso e o meio aquoso externo, pelos volumes relativos das duas fases, pela existência de
interações entre o polímero e o ativo e pela concentração de surfactantes (TEXEIRA et al,
2005; LIMAYEM et al, 2006).
Diversos artigos, assim como guias internacionais (FDA), preconizam o uso de
células de difusão como a célula de Franz, com membrana sintética de acetato de celulose
para determinar a liberação in vitro de ativos incorporados em formulações tópicas, como
em cremes, géis, loções e sistemas transdérmicos (DOUCET et al, 1998; SHAH et al, 1998;
CLEMENT, LAUGEL e MARTY, 2000). As membranas sintéticas são amplamente
empregadas por atenderem a exigências, dentre elas, como não reagir com a formulação ou
o meio receptor, serem permeáveis ao fármaco e não serem determinantes da taxa de
liberação (SHAH et al, 1998).
Vale ressaltar que no presente estudo a manutenção das condições sink nas células
de difusão foi respeitado durante todo o experimento para garantir a obtenção de resultados
efetivos. A condição sink é fundamental para a realização de análises matemáticas de
liberação, uma vez que as equações de difusão tornam-se de difícil resolução em condições
de acúmulo do ativo no meio de dissolução (WASHINGTON, 1990; SAARINENSAVOLAINEN et al, 1997). No presente experimento, utilizou-se uma concentração bem
abaixo dos 10% de saturação da solução receptora, que é de 1,2 mg.
As leituras foram realizadas através de CLAE e os resultados obtidos (em área)
foram plotados frente a uma curva analítica correspondendo a concentração de 0,2; 0,5; 1;
2; 3 e 4 μg/mL.
A Tabela 13 descreve os resultados referentes ao fluxo, concentração total liberada
de adapaleno, coeficiente de regressão e coeficiente de permeabilidade (Kp) para as duas
formulações testadas: gel de Carbopol® contendo nanocápsulas de adapaleno (GCNCA) e
gel de Carbopol® contendo o fármaco na forma livre (GCA).
79
Tabela 13. Valores referentes ao fluxo, coeficiente de regressão, coeficiente de
permeabilidade (Kp) e concentração total liberada de adapaleno para a forma
nanoencapsulada (GCNCA) e para a forma livre (GCA) (n=6).
Concentração
Coeficiente de
Fluxo
Kp (cm2/h)
Formulação
2
2
total (µg/cm )**
regressão (r2)
(µg/cm /h)
GCA
26,0x10-2
4,86 ± 0,11
0,96
2,0x10-3
-2
GCNCA
9,0x10 *
1,55 ± 0,01*
0,97
0,7x10-3
* Valores estatisticamente significativos (p≤0,05) quando comparados com os resultados encontrados para as
formulações contendo o fármaco na forma livre.
**Concentração total liberada até atingir o nível linear platô (48 horas)
Na Tabela 13 pode-se observar os resultados de coeficiente de permeabilidade (Kp)
para as duas formulações estudadas. Observa-se uma quantidade maior de fármaco
difundida pela membrana em função do tempo para o gel contendo o ativo na forma livre
(Kp = 2,0x10-3), quando comparado com o gel contendo o adapaleno nanoencapsulado (Kp
= 0,7x10-3).
Pode-se verificar ainda, que a membrana artificial de acetato de celulose foi
adequada para a realização dos estudos de liberação in vitro. Isto pode ser justificado
analisando-se os valores de regressão linear para as formulações, o qual apresentou-se em
torno de 0,97 (Tabela 13).
As formulações foram analisadas até atingirem o platô, o qual foi observado para as
duas formulações a partir da décima leitura, ou seja, após 10 horas de experimento.
Figura 15. Perfil de liberação do gel contendo adapaleno nanoencapsulado (GCNCA) e do gel contendo o
fármaco livre (GCA) até atingir o platô (48 horas) (n = 6).
80
Na Tabela 13 e Figura 15 pode-se observar que o fluxo determinado através da
quantidade de fármaco detectado na solução receptora em função da área e do tempo foi de
9,0x10-2 (µg/cm2/h) para a forma nanoencapsulada e de 26,0x10-2 (µg/cm2/h) para a forma
livre. Com relação à concentração total liberada, os valores encontrados foram de 1,55
µg/cm2 para as formulações contendo nanocápsulas de adapaleno e de 4,86 µg/cm2 para as
formulações contendo o fármaco na forma livre. Assim, pode-se verificar que o adapaleno
na sua forma livre apresentou uma liberação maior do veículo quando comparado com as
formulações contendo o fármaco nanoencapsulado, sendo esta diferença estatisticamente
significativa, tanto para o fluxo, quanto para a concentração total liberada (p<0,05).
Diversos autores têm estudado a influência do polímero no processo de liberação de
fármacos. Entre eles, Cauchetier e colaboradores (2003) realizaram ensaios de liberação in
vitro com suspensões de nanocápsulas contendo atovaquona usando diferentes polímeros:
poli (ε-caprolactona) (PCL), ácido poli (lático) (PLA) e ácido poli (lático-co-glicólico)
(PLGA). Os autores observaram que após 4 meses de experimento não houve liberação do
fármaco a partir das nanocápsulas preparadas com PCL, apenas 25,9 % da atovaquona foi
liberada a partir das suspensões preparadas com PLA e para as nanocápsulas contendo
PLGA como polímero houve uma liberação de 54,2 % do ativo. Conforme os
pesquisadores, este comportamento deve-se à capacidade do polímero ou dos fosfolípideos
presentes na formulação em manter a substância ativa mesmo após os 4 meses de estudo.
Barrios (2010) realizou estudos de liberação in vitro com a suspensão de
nanocápsulas de adapaleno contendo óleo de melaleuca como núcleo oleoso e observou que
após 46 horas de experimento, a concentração total de fármaco liberado foi de 13,58
µg/cm2, prevendo um comportamento de liberação prolongada ou modificada para este tipo
de preparação, visto que para a nanodispersão a quantidade de fármaco liberado no mesmo
período foi de 17,63 µg/cm2. Comparando os resultados obtidos por Barrios com os
observados no presente experimento, percebeu-se que a incorporação da suspensão de
nanocápsulas contendo adapaleno no Carbopol 940® reduziu a quantidade de fármaco
liberado após 48 horas de análise (1,55 µg/cm2), indicando que a incorporação no veículo e
conseqüente aumento da viscosidade da preparação vieram reforçar a liberação sustentada
do ativo fazendo com que o fármaco seja lentamente disponibilizado para o meio
(OLIVEIRA et al, 2004b; MARRIOT in AULTON, 2005).
81
A influência do veículo sobre a liberação de ativos tem sido alvo de estudos para
que os diversos parâmetros físico-químicos que envolvem estes sistemas sejam elucidados.
Chorilli e colaboradores (2007) avaliaram a influência da viscosidade do veículo na
liberação in vitro da cafeína e verificaram que o aumento da viscosidade da formulação, em
função do aumento da concentração de Carbopol 940®, diminuiu a velocidade de liberação
da cafeína.
Marchiori e colaboradores (2010) avaliaram o perfil de liberação de géis de
Carbopol Ultrez
®
contendo dexametasona associada à nanocápsulas e na forma livre. Os
autores observaram resultados semelhantes aos demonstrados no presente experimento,
visto que os perfis de liberação indicaram que a inclusão da dexametasona nas
nanoestruturas diminuiu a liberação do ativo por cm2 após 24 horas de experimento. Além
disso, a formulação contendo dexametasona nanoencapsulada apresentou um fluxo de
liberação menor (20,21 ± 2,96 mg/cm2/h) quando comparada ao gel contendo o fármaco na
forma livre (26,65 ± 2,09 mg/cm2/h).
Bruschi (2010) realizou estudos de permeação cutânea com formulações
semissólidas contendo adapaleno na forma livre ou nanoencapsulada usando como veículo
o Carbopol 940®. A pele de orelha de porco foi utilizada como membrana e o autor
observou que após 48h de experimento, não houve diferença significativa entre a
quantidade de fármaco retido no estrato córneo para as formulações contendo adapaleno na
forma livre (2,22 µg/cm²) e nanoencapsulado (2,24 µg/cm²). Entretanto, para o fármaco
quantificado na derme e epiderme, a forma nanoencapsulada (1,23 µg/cm²) apresentou uma
penetração significativamente maior (p<0,05), quando comparada com a forma livre do
adapaleno (0,84 µg/cm²). Esta diferença provavelmente deva-se tanto a tendência das
nanopartículas em acumularem-se nas aberturas foliculares (ALVAREZ-ROMÁN et al
2004), quanto ao fato de que o adapaleno livre, por apresentar uma liberação maior do
veículo, é mais rapidamente metabolizado.
Com base no exposto, vale ressaltar que para os produtos de uso dermatológico
deseja-se que o fármaco administrado tenha um pequeno fluxo e uma alta taxa de retenção
nas membranas (TOUITOU, MEIDAN e HORWITZ, 1998).
Considerando que somente a formulação contendo adapaleno livre provocou
ressecamento e eritema na pele dos voluntários, pode-se concluir que a associação do
82
fármaco às nanocápsulas foi capaz de reduzir estes efeitos colaterais. Este fato
provavelmente esteja relacionado à liberação sustentada ou modificada do adapaleno
nanoencapsulado e a redução da perda transepidérmica de água observada para este tipo de
sistema, visto que a manutenção do conteúdo aquoso do estrato córneo diminui a
suscetibilidade à irritação. Desta forma, o fármaco nanoestruturado foi capaz de reduzir os
principais efeitos adversos causados pelo uso de retinóides por via tópica.
4.5 Ajuste de curvas dos perfis cinéticos
Sistemas transportadores de fármacos devem ser capazes de controlar a velocidade
de liberação sem alterar a estrutura química da molécula transportada. Esses sistemas
envolvem duas concepções básicas: sistemas matriciais ou monolíticos, nos quais o
fármaco está intimamente misturado com os excipientes da fórmula, podendo proporcionar
maiores tempos de liberação do mesmo e sistemas reservatórios, nos quais o fármaco
encontra-se separado do meio de dissolução através de um revestimento, uma membrana ou
uma interface, devendo transpor essa barreira para ser liberado para o meio (OLIVEIRA,
SCARPA e CERA, 2002; OLIVEIRA et al, 2004b).
As nanocápsulas poliméricas são consideradas sistemas reservatórios e espera-se
diferentes comportamentos cinéticos para um fármaco dissolvido no seu núcleo oleoso ou
simplesmente retido ou adsorvido em sua parede polimérica (MORA-HUERTAS, FESSI e
ELAISSARI, 2010). Desta forma, uma compreensão adequada do mecanismo de liberação
do ativo a partir deste nanocarreador é essencial (ABDEL-MOTTALEB, NEUMANN e
LAMPRECHT, 2010).
Neste contexto, a partir dos resultados obtidos na liberação in vitro, foi realizado um
estudo comparativo entre o GCNCA e GCA baseado no ajuste de curvas dos perfis
cinéticos segundo os modelos monoexponencial (fornece uma constante cinética para o
processo) e biexponencial (constituído de duas constantes cinéticas).
Seguindo metodologia adaptada por Cruz e colaboradores (2006) o ajuste de curvas
foi realizado para os pontos experimentais até a décima hora de experimento para as duas
formulações. Para a escolha do modelo matemático adequado aos pontos experimentais
foram observados os melhores ajustes gráficos, os maiores coeficientes de correlação e os
83
valores de critério de seleção do modelo (MSC). Os perfis de liberação foram construídos
plotando-se a concentração de adapaleno liberada em função do tempo.
Através do programa Micromath Scientist®, o ajuste de curva obtido pelo perfil de
liberação do gel contendo adapaleno livre mostrou que a equação monoexponencial foi a
que melhor descreveu o comportamento dos dados experimentais, com coeficiente de
correlação (r) próximo a 1 (Tabela 14), semelhante ao que foi observado por Domingues e
colaboradores (2008) para a liberação de indometacina pura e a partir de micropartículas
nanorrevestidas com nanocápsulas de Eudragit® RS100.
Tabela 14. Parâmetros do modelo monoexponencial para o gel hidrofílico contendo
adapaleno na forma livre (GCA)
Parâmetro
Média ± DP
Monoexponencial
k (h-1)
0,3241 ± 0,4031
MSC
3,0654 ± 0,2368
r
0,9802 ± 0,0013
Conforme demonstrado na Tabela 14, foi possível calcular a constante cinética para
a liberação do fármaco (k = 0,3241 h-1). O ajuste gráfico dos pontos experimentais para a
Concentração (%)
liberação do adapaleno livre incorporado no gel hidrofílico é apresentado na Figura 19.
Tempo (horas)
Figura 16. Ajuste gráfico do modelo monoexponencial para o gel contendo adapaleno na forma livre
84
Quanto ao perfil de liberação do adapaleno a partir de nanocápsulas incorporadas no
gel de Carbopol®, o modelo biexponencial apresentou valores de MSC = 3,48 e r = 0,995
(Tabela 15), sendo esses, superiores aos obtidos pelo modelo monoexponencial. Pela
comparação desses valores e da análise gráfica dos ajustes, o modelo escolhido para
descrever
matematicamente
a
liberação
da
formulação
contendo
o
fármaco
dois
termos
nanoencapsulado foi o biexponencial.
O
modelo
biexponencial
é
constituído
pela
adição
de
monoexponenciais, fornecendo duas constantes cinéticas para a liberação, onde α está
relacionada à velocidade de dissolução da etapa rápida de liberação (efeito burst), e β está
relacionada à velocidade de dissolução da etapa lenta de liberação (resultante da dissolução
do fármaco mais internamente localizado). Da mesma forma, os parâmetros A e B
representam a quantidade de fármaco dissolvido nas etapas rápida e lenta de liberação,
respectivamente (PEREIRA et al, 2006).
A Tabela 15 apresenta os parâmetros da modelagem matemática para as
formulações contendo adapaleno nanoencapsulado. Pode-se observar que o percentual de
fármaco que contribui para a dissolução na fase rápida é de 77% e o percentual de
adapaleno liberado na fase lenta é em torno de 30%. Estes resultados estão de acordo com
os encontrados por Pereira e colaboradores (2006) para a liberação de dexametasona a
partir de micropartículas preparados com propilenoglicol. Os autores também observaram
que 77% do fármaco foi liberado na fase rápida e 27% na fase lenta, com uma velocidade
de dissolução de 0,0177 min-1 e 0,032 min-1, respectivamente.
Tabela 15. Parâmetros do modelo monoexponencial e biexponencial para o gel contendo
adapaleno nanoencapsulado (GCNCA).
Parâmetro
Monoexponencial
K (h-1)
MSC
r
Biexponencial
A
α (h-1)
B
β (h-1)
MSC
r
Média ± DP
0,059 ± 0,010
2,675 ± 0,104
0,972 ± 0,010
0,695 ± 0,004
0,774 ± 0,123
0,302 ± 0,000
0,004 ± 0,003
3,485 ± 0,361
0,995 ± 0,004
85
O ajuste gráfico dos pontos experimentais para a liberação do gel contendo
adapaleno associado às nanocápsulas é apresentado na Figura 17.
(a)
Concentração (%)
Concentração (%)
(b)
Tempo (horas)
Tempo (horas)
Figura 17. Ajuste gráfico do modelo monoexponencial (a) e biexponencial (b) para o gel contendo
nanocápsulas de adapaleno
Barrios (2010) comparou o perfil de liberação do adapaleno em suspensões
contendo diferentes núcleos oleosos, Miglyol® e óleo de melaleuca e a nanodispersão do
fármaco. O autor observou que a nanodispersão e a formulação contendo Miglyol® como
núcleo oleoso foram adequadamente descritas pelo modelo monoexponencial, enquanto a
formulação de nanocápsulas contendo o óleo de melaleuca obteve um melhor ajuste gráfico
pelo modelo biexponencial. Desta forma, é importante ressaltar que a incorporação da
suspensão no gel de Carbopol 940® não modificou o perfil de liberação das nanocápsulas
de adapaleno contendo óleo de melaleuca como núcleo oleoso, ou seja, os resultados
obtidos no presente experimento confirmaram aqueles observados por Barrios.
Com base no exposto, pode-se concluir que a associação do fármaco às
nanocápsulas poliméricas contendo óleo de melaleuca como núcleo oleoso foi capaz de
modificar o perfil de liberação do adapaleno livre, sendo este descrito pelo modelo
monoexponencial, com uma única velocidade de difusão (k = 0,3241 h-1), enquanto o
fármaco nanoencapsulado adequou-se melhor a equação biexponencial, tendo uma
velocidade inicial (burst) de 0,7744 h-1, mais rápida que a velocidade de liberação do
fármaco livre. Isto provavelmente deve-se a grande área superficial nas nanocápsulas, visto
86
que a quantidade de adapaleno liberado nesta etapa corresponde ao fármaco que encontrase adsorvido à parede polimérica. Por outro lado, a velocidade lenta de liberação (β =
0,0047 h-1) é menor que a constante cinética para a liberação do adapaleno livre, indicando
que o ativo encontra-se dissolvido no núcleo oleoso e precisa difundir através da parede
polimérica para que ocorra a liberação.
O modelo semi-empírico da Lei de Potência (Korsmeyer-Peppas) foi aplicado com
o objetivo de descrever o mecanismo de liberação do adapaleno a partir do veículo, através
da análise dos valores de n. Foram encontrados valores de n entre 0,43 e 0,85 (Tabela 16),
sugerindo uma liberação de acordo com um modelo não-Fickiano. Considerando a
geometria esférica das nanocápsulas, esses valores indicam comportamento anômalo, ou
seja, processos de cinética de liberação envolvendo comportamento misto entre difusão e
relaxação da cadeia polimérica (SIEPMANN e PEPPAS, 2001; REZA, QUADIS e
HAIDER, 2003).
Os resultados demonstrados na Tabela 15 estão de acordo com a literatura, visto
que, segundo Ritger e Peppas (1987) nos sistemas de liberação controlada, a extensão e a
velocidade de liberação do fármaco resulta da combinação da difusão com o transporte de
Caso II das moléculas de fármaco através das cadeias poliméricas. Nestes casos, a difusão
obedece às leis de Fick, enquanto o transporte Caso II reflete a influência do relaxamento
do polímero.
Tabela 16. Parâmetros obtidos pela aplicação da Lei da Potência à formulação contendo
adapaleno nanoencapsulado
Parâmetro
Média ± DP
a
0,426±0,009
n
0,810±0,012
r
0,991±0,000
MSC
4,052±0,081
Considerando que a poli-(ε-caprolactona) apresenta propriedades plásticas e
hidrofóbicas, vale ressaltar que a sua permeabilidade depende do grau de cristalinidade,
visto que a permeabilidade é uma função da sua fração amorfa. Além disso, existem outros
fatores que influenciam a difusibilidade deste polímero, entre eles a massa molecular
elevada e o grau de interligações (FLORENCE e ATTWOOD, 2003).
87
Silva e colaboradores (2010) realizaram ensaios de liberação in vitro, com objetivo
de avaliar alterações no perfil de liberação do clomazone a partir de nanopartículas de
alginato. Os autores observaram um mecanismo de liberação não-Fickiano, seguindo
comportamento anômalo, ou seja, a análise dos resultados indicou que os valores de n
determinados para o clomazone associado às nanopartículas encontram-se na faixa entre
0,43 e 0,85.
Com base no exposto, pode-se constatar que os resultados da modelagem
matemática empregando o modelo da Lei de Potência permitiram a proposição de um
modelo de liberação não-Fickiano, sugerindo comportamento anômalo, ou seja, a liberação
do adapaleno a partir das nanocápsulas ocorreu através da combinação dos fenômenos de
difusão e relaxação da cadeia polimérica, sendo estes dois mecanismos da mesma ordem de
magnitude. Ressalta-se também que o veículo (Carbopol 940®) é capaz de influenciar no
processo de liberação do fármaco, portanto o modelo de liberação observado para o
GCNCA deve-se não só à associação do ativo ás NC, mas também à incorporação das
suspensões no hidrogel.
88
5 CONCLUSÕES
Considerando os objetivos propostos neste trabalho e analisando-se os resultados
obtidos, é possível obter algumas conclusões em relação ao estudo realizado:
A incorporação de uma suspensão, contendo nanocápsulas de adapaleno com óleo
de melaleuca em creme gel (Aristoflex AVL®), apresentou características físico-químicas
adequadas, representando viabilidade farmacotécnica.
O diâmetro médio das partículas, índice de polidispersão e potencial zeta do creme
gel contendo adapaleno na forma livre e nanoencapsulado não apresentaram alterações após
serem submetidas ao ciclo gelo-degelo.
As características organolépticas referentes à aparência, cor e odor foram mantidas
durante todo o experimento, tanto para o creme gel com Aristoflex® contendo adapaleno na
forma nanoencapsulada como na forma livre.
O creme gel contendo nanocápsulas de adapaleno e as formulações contendo o
fármaco na forma livre apresentaram diminuição significativa para os valores de pH
(p<0,05), após 21 dias de estudo. Entretanto, apesar da diferença estatística verificada,
considera-se que os valores experimentais, os quais ficaram entre 5,0 e 6,3, são coerentes
para este tipo de sistema e encontram-se na faixa de pH adequada para formulações de uso
tópico.
Os valores de viscosidade foram mantidos estáveis para o creme gel contendo
adapaleno na forma livre durante todo o período de análise. Para as formulações contendo o
fármaco nanoestruturado, apesar dos valores de viscosidade apresentarem um aumento
estatisticamente significativo no decorrer do estudo, esta alteração não modificou as
características reológicas do produto.
Nos estudos de espalhabilidade ocorreu um aumento significativo (p < 0,05) entre
89
a espalhabilidade inicial e final quando a formulação contendo adapaleno livre foi
submetida ao ciclo gelo-degelo. Entretanto, as formulações contendo nanocápsulas de
adapaleno não alteraram significativamente seus valores de espalhabilidade durante todo o
período de estudo.
O teor inicial de adapaleno nas formulações semissólidas de creme gel contendo o
fármaco nanoencapsulado não sofreu alteração, quando comparado com o teor obtido no
término do experimento. Porém, para as formulações contendo o ativo na forma livre houve
uma redução na concentração de adapaleno, visto que o teor inicial decaiu para valores
abaixo de 90% após 21 dias de análise. Desta forma, pode-se concluir que as nanocápsulas
exercem um tipo de proteção frente ao fármaco.
Ambas as formulações estudadas não sofreram qualquer tipo de alteração após o
teste de centrifugação, realizado no final do experimento, ou seja, não houve precipitação
ou mudanças que demonstrem instabilidade.
Nos resultados obtidos para hidratação cutânea observou-se uma redução mais
pronunciada dos valores do conteúdo aquoso do estrato córneo, nas regiões tratadas com o
gel contendo o ativo na forma livre, o que indica que as formulações nanoestruturadas
causaram uma diminuição do ressecamento provocado pelo adapaleno.
Para os valores de pH verificou-se uma tendência a elevação do mesmo, porém
estes valores mantiveram-se dentro de uma faixa considerada normal (4,5-5,5).
Para formulação contendo o fármaco na forma livre houve um aumento na perda
transepidérmica de água enquanto que para o gel contendo adapaleno nanoencapsulado
observa-se uma redução deste parâmetro. Assim evidenciou-se que as nanocápsulas
poliméricas são capazes de diminuir a perda transepidérmica de água, favorecendo o grau
de hidratação cutânea e mantendo a integridade do estrato córneo.
Foi detectada uma redução no conteúdo de melanina no decorrer do experimento,
90
tanto para as formulações contendo o fármaco nanoencapsulado como para a forma livre.
Provavelmente esta diminuição esteja associada à ação regulatória do adapaleno sobre a
atividade dos melanócitos.
O gel contendo o fármaco nanoestruturado não causou eritema, configurando a
segurança na utilização da formulação. Entretanto, o gel com o ativo na forma livre
aumentou, de maneira estatisticamente significativa, o índice de eritema da pele dos
voluntários, indicando que as formulações nanoencapsuladas reduziram o eritema causado
pelo uso do adapaleno na forma livre.
A associação do fármaco às nanocápsulas modificou os parâmetros de liberação
com relação ao fluxo e à concentração total de ativo liberada. A formulação contendo
adapaleno na forma nanoencapsulada apresentou concentração total e fluxo de liberação
menor do que o gel contendo o fármaco na forma livre, o que demonstra a capacidade das
nanopartículas em controlar a liberação do ativo.
O modelo monoexponencial foi o mais adequado para descrever o perfil de
liberação da formulação contendo adapaleno livre, obtendo-se apenas uma constante
cinética para o processo. Por outro lado, para o hidrogel contendo o fármaco associado às
nanocápsulas o modelo biexponencial foi o que melhor descreveu os dados experimentais.
A análise dos perfis de liberação através do modelo da Lei de Potência permitiu a
proposição de um modelo de dissolução. A análise do valor de n, considerando a geometria
esférica das nanocápsulas, demonstrou que a liberação do adapeleno a partir das NC foi
classificada como não-Fickiano, sugerindo comportamento anômalo, ou seja, processos de
cinética de liberação envolvendo comportamento misto entre difusão e relaxação da cadeia
polimérica.
91
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABDEL-MOTTALEB, M. M. A.; NEUMANN, D.; LAMPRECHT, A. In vitro drug
release mechanism from lipid nanocapsules (LNC). International Journal of
Pharmaceutics, v.390, p.208–213, 2010.
Agencia Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA. Portaria nº 344, de 12/05/1998:
Aprova o Regulamento Técnico sobre substâncias e medicamentos sujeitos a controle
especial. Brasília, 1998.
Agência Nacional Sanitária – ANVISA; RE nº 899, de 29/05/2003: Guia para validação
de métodos de Vigilância analíticos e bioanalíticos, Ministério da Saúde: Brasil 2003a.
Agência Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA. Gerência Geral de cosméticos. Guia
de orientação para avaliação de segurança de produtos cométicos. Brasília, 2003b.
Agência Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA. Gerência Geral de cosméticos. Guia
de controle de qualidade de produtos cosméticos. Brasília, 2007.
Agência Nacional de Vigilância Sanitária.ANVISA.Bula do paciente, 2005. Disponível em:
http://bulario.bvs.br/index.php?action=search.2004031817580533009945000123&mode=di
r&letter=I. Acesso em 29 junho 2010.
AGNER, T. Noninvasive measuring methods for the investigation of irritant patch test
reactions. A study of patients with hand eczema, atopic dermatitis and controls. Acta
Dermato Venereologica. v.173, p.1-26, 1992.
AKYOL, M.; OZÇELIK, S.; Non-Acne Dermatologic Indications for Systemic
Isotretinoin. American Journal of Clinical Dermatology, v.6, n.3, p.175-184, 2005.
ALEKSEEV, S. I.; SZABO, I.; ZISKIN, M. C. Millimeter wave reflectivity used for
measurement of skin hydration with different moisturizers. Skin Research and
Technology, v.14, p.390-396, 2008.
ALLÉMANN, E.; LEROUX, J.; GURNY, R. Polymeric nanoand microparticles for the
oral delivery of peptides and peptidomimetics. Advanced Drug Delivery, v.34, p.171–189,
1998.
ALLEN Jr., L. V.; POPOVICH, N. G.; ANSEL, H. C. Formas farmacêuticas e sistemas
de liberação de fármacos. 8° Ed. Artmed: Porto Alegre, 2007.
ALVAREZ-ROMÁN, R.; NAIK, A.; KALIA, N.; GUYA, H.; FESSI, H. Skin penetration
and distribution of polymeric nanoparticles. Journal of Controlled Release, v.99, p.53-62,
2004.
92
ALVES, M. P. Desenvolvimento e avaliação da estabilidade de bases dermatológicas.
Influência de promotores de absorção na permeação transdérmica de piroxicam.
(Dissertação de Mestrado). Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia
Farmacêuticas: Universidade Federal de Santa Maria- UFSM. 1996.
ALVES, M. P.; POHLMANN, A. R.; GUTERRES, S. S. Semisolid topical formulations
containing nimesulide-loaded nanocapsules, nanospheres or nanoemulsion: development
and rheological characterization. Pharmazie. v.60, p.900-904, 2005.
ALVES, M. P.; SCARRONE, A. L.; SANTOS, M.; POHLMANN, A. R.; GUTERRES, S.
S. Human skin penetration and distribution of nimesulide from hydrophilic gels containing
nanocarriers. International Journal of Pharmaceutics. v.341, p.215–220, 2007.
ANSEL, H.; ALLEN, L.; POPOVICH, N. Pharmaceutical dosage forms and drug
delivery systems. 7. ed. EUA: 1999.
ANTON, N.; BENOIT, J. P.; SAULNIER, P. Design and production of nanoparticles
formulated from nano-emulsion templates_a review. Journal of controlled release. v.128,
p.185–199, 2008.
AULTON, M. E. Pharmaceutics: The science of dosage form design. New York:
Churchill Livingstone. p.57-73, 1988.
AULTON, M. E. Delineamento de formas farmacêuticas. Artmed, ed.2ª, Porto Alegre:
2005.
BARAN, E. T.; ÖZER, N.; HASIRCI, V. In vivo half life of nanoencapsulated Lasparaginase. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. v.13, p13–21, 2002.
BARRIOS, J.; FARIAS, G.; ROGGIA, I.; ALVES, M. Desenvolvimento e caracterização
de suspensões contendo nanocápsulas de adapaleno em diferentes núcleos oleosos. XIII
Simpósio de ensino, pesquisa e extensão, UNIFRA, 2009.
BARRIOS, J. Desenvolvimento e caracterização de suspensões contendo nanocápsulas
de adapaleno com diferentes núcleos oleosos. Centro Universitário Franciscano.
Dissertação (Mestrado em Nanociências), 2010.
BARRIOS, J. G.; FARIAS, G. D.; ROGGIA, I.; PEIXOTO, S. C.; PONS, F. R.;
BRUSCHI, M.; RAFFIN, R. P.; ALVES, M. P. Validação de método analítico por
cromatografia líquida de alta eficiência para doseamento do adapaleno em suspensões de
nanocápsulas. Química Nova, 2011, no prelo.
BARRY, B. W. Novel mechanisms and devices to enable successful transdermal drug
delivery. European Journal of Pharmaceutical Sciences., v.14, p.102-14, 2001.
BARRY B. in AULTON, M. Delineamento de formas farmacêuticas. 2. ed. Porto
Alegre: Artmed, 2005.
93
BETZ G.; AEPPLI A.; MENSHUTINA, N.; LEUENBERGER, H. In vivo comparison of
various liposome formulations for cosmetic application. International Journal of
Pharmaceutics. v.296, p.44–54, 2006.
BHAWAN, J. Short- and long-term histologic effects of topical tretinoin on photodamaged
skin. International Journal of Dermatology. v.37, p.286-292, 1998.
BOCHI, L. D. C. S. Desenvolvimento, caracterização e avaliação da atividade
antinociceptiva de uma formulação tópica semissólida contendo nanocápsulas de
meloxicam. Dissertação (Mestrado em Nanociências), Santa Maria – RS, 2010.
BOUCLIER, M.; CHATELUS, A.; FERRACIN, J.; DELAIN, C.; SHROOT, B.;
HENSBY, C. Quantification of epidermal histological changes induced by topical retinoids
and CD271 in the rhino mouse model using a standardized image analysis technique. Skin
Pharmacology. v.4, p.65–73, 1991.
BOWMAN, D. M.; CALSTER, G. Flawless or Fallible? A Review of the Applicability of
the European Union's Cosmetics Directive in Relation to Nano-Cosmetics. Studies and
Ethics, Law, and Technology. v.2, n.3, 2008.
BRANDÃO, F. M.; GOOSSENS, A.; TOSTI, A. Topical drugs. In: Frosch, P.J.; Menne,
T.; Lepoittevin, J. P. Contact Dermatitis. Speyer:Springer, p.623-652, 2006.
BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Guia de
Estabilidade de Produtos Cosméticos. Brasília, DF, 2004.
BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Guia para Avaliação de Segurança
de Produtos Cosméticos. Brasília, DF, 2003. Disponível em: <http://www.anvisa.gov.br>
Acesso em 02 set. 2010.
BRUSCHI, M. Formulações tópicas contendo nanocápsulas de adapaleno: avaliação
da estabilidade e permeação cutânea. Centro Universitário Franciscano. Dissertação
(Mestrado em Nanociências), 2010.
CALVO, P.; VILA-JATO, J. L.; ALONSO, M. J. Comparative in vitro evaluation of
several colloidal systems, nanoparticles, nanocapsules, and nanoemulsions, as ocular drug
carriers. Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 85, p. 530-536, 1996.
CAMARGO Jr., Flávio B. Desenvolvimento de formulações cosméticas contendo
pantenol e avaliação dos seus efeitos hidratantes na pele humana por bioengenharia
cutânea. 2006. 153f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Curso de PósGraduação em Ciências Farmacêuticas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão
Preto, São Paulo, 2006.
CASTELI, V. C.; MENDONÇA, C. C.; CAMPOS, M. A. L.; FERRARI, M.; MACHADO,
S. R. P. Desenvolvimento e estudos de estabilidade preliminares de emulsões O/A contendo
Cetoconazol 2,0%. Acta Scientiarum Health Science, v.30, n.2, p.121-128, 2008.
94
CAUCHETIER, E.; DENIAU, M.; FESSI, H.; ASTIER, A.; PAUL, M. Atovaquone-loaded
nanocapsules: influence of the nature of the polymer on their in vitro characteristics.
International Journal of Pharmaceutics. v.250, p.273–281, 2003.
CEVC, G.; VIERL, U. Nanotechnology and the transdermal route A state of the art review
and critical appraisal. Journal of Controlled Release, v.141, p.277–299, 2010.
CHENG, Y. et al. Protecion effect of cosmetics on human skin under simulated rigorous
environment. Skin Research and Technology, v.14, p.45-52, 2008.
CHENG, Y.; DONG, Y.; WANG, J.; DONG, M.; ZOU, Y.; REN, D.; YANG, X.; LI, M.;
SCHRADER, A.; ROHR, M.; LIU, M. Moisturizing and anti-sebum secretion effects of
cosmetic application on human facial skin. International Journal of Cosmetic Science,
v.32, n.1, p. 81, 2010.
CHIVOT, M. Retinoid Therapy for Acne: A comparative Review. American Jornal
Clinical Dermatology. v.6, n.1, p.13-19, 2005.
CHORILLI, M.; ZAGUE, V.; SCARPA, M. V.; LEONARDI, G. R. Influência da
viscosidade do veículo na liberação in vitro da cafeína. v.IV, n.1, p.52-60, 2007.
CHOU, T. C. et al. Transepidermal water loss and skin capacitance alterations among
workers in an ultra-low humidity environment. Archives for dermatological research,
n.296, p.489- 498, 2005.
CLARYS P.; ALEWAETERS K.; LAMBRECHT R.; BAREL A. O. Skin color
measurements: comparison between three instruments: the Chromameter®, the
DermaSpectrometer® and the Mexameter®. Skin Research and Technology. v.6, p.230–
238, 2000.
CLEMENT, P.; LAUGEL, C.; MARTY, J.P. Influence of three synthetic membranes on
the release of caffeine from concentrated W/O emulsions. Journal of Controlled Release,
v. 66, p. 243-254, 2000.
COLLIER, C.; HARPER, J.; CANTRELL, C. The prevalence of acne in adults 20 years
and older. Journal American Academy of Dermatology, v.58, p.56-59, 2008.
CONTRERAS, M. D.; SANCHEZ, R. Application of factorial design to the study of the
flow behavior, spreadability, transparency of Carbopol EDTA 2020® gel. Part II.
International Journal of Pharmaceutics, v.234, p.149-157, 2002.
COSTA, P.; LOBO, J. M. S. Modeling and comparison of dissolution profiles. European
Journal of Pharmaceutical Science, v.13, p. 123-133, 2001.
COSTA, A.; ALCHORNE, M. M. de A.; GOLDSCHMIDT, M. C. B. Fatores
etiopatogênicos da acne vulgar. Anais Brasileiros de Dermatologia, v.83, n.5, 2008.
95
COUVREUR, P. ; BARRAT, G. ; FATTAL, E. ; LEGRAND, P. ; VAUTHIER, C.
Nanocapsule technology: a review. Therapeutic Drug Carrier Systems. v.19, p.99–134,
2002.
CORRÊA, N. M.; CAMARGO JÚNIOR, F. B.; IGNÁCIO, R. F.; LEONARDI, G. R.
Avaliação do comportamento reológico de diferentes géis hidrofílicos. Revista Brasileira
de Ciências Farmacêuticas. v.41, n.1, p.73-78, 2005.
CRUZ, L.; SOARES, L. U.; COSTA, T. D.; MEZZALIRA, G.; DA SILVEIRA, N. P.;
GUTERRES, S. S.; POHLMANN, A. R. Diffusion and mathematical modeling of release
profiles from nanocarriers. International Journal of Pharmaceutics. v.313, p.198–205,
2006.
CZERNIELEWSKI, J. ; MICHEL, S. ; BOUCLIER, M.; BAKER M.; HENSBY J. C.
Adapalene biochemistry and the evolution of a new topical retinoid for treatment of acne.
Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. v.15, p.5–12,
2001.
DE PAULA I. C.; ORTEGA G. G.; BASSANI V. L.; PETROVICK P. R. Development of
Ointment Formulations Prepared with Achyrocline satureioides Spray-Dried Extracts.
Drug Development and Industrial Pharmacy. v.24, n.3, p.235-241, 1998.
DIFFEY, B. L.; OLIVER, R. J.; FARR, P. M. A portable instrument for quantifying
erythema induced by ultraviolet radiation. British Journal of Dermatology. v.111, p.663–
672, 1984.
DOMINGUES, G. S.; GUTERRES, S. S.; BECK, R. C. R.; POHLMANN, A. R.
Micropartículas nanorrevestidas contendo um fármaco modelo hidrofóbico: preparação em
etapa única e caracterização biofarmacêutica. Química Nova. v. 31, n. 8, p. 1966-1972,
2008.
DOS SANTOS, R. M. M.; FIALBO, S. L. Nanopartículas: Uma alternativa para a
administração de biofármacos. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, n.37, 2008.
DOUCET, O.; FERRERO, L.; GARCIA, N.; ZASTROW, L. O/W emulsion and W/O/W
multiple emulsion: physical characterization and skin pharmacokinetic comparison in the
delivery process of caffeine. International Journal of Cosmetic Science, v.20, p.283-295,
1998.
DRAELOS Z.D. Novel Approach to the Treatment of Hyperpigmented Photodamaged
Skin: 4% Hydroquinone/0.3% Retinol versus Tretinoin 0.05% Emollient Cream.
Dermatologic Surgery. v.31, p.799-804, 2005.
DURAN, N.; MATTOSO, L. H. C.; MORAIS, P. C. Nanotecnologia: introdução,
preparação e caracterização de nanomateriais e exemplos de aplicação, São Paulo, SP:
Artliber, p.11-15, 2006.
96
EBERLEIN-KÖNIG, B.; SCHÄFER, N. T.; HUSS-MARP, J.; DARSOW, U.; MOÈ
HRENSCHLAGER, M.; HERBERT, O.; ABECK, D.; KRAÈ MER, U.; BEHRENDT, H.;
RING, J. Skin Surface pH, Stratum Corneum Hydration, Trans-epidermal Water Loss and
Skin Roughness Related to Atopic Eczema and Skin Dryness in a Population of Primary
School Children. Acta Dermato-Venereologica, v.80, p.188-191, 2000.
ESPOSITO, E.; DRECHSLER, M.; MARIANI, P.; SIVIERI, E.; BOZZINI, R.;
MONTESI, L.; MENEGATTI, E.; CORTESI, R. Nanosystems for skin hydration: a
comparative study. International Journal of Cosmetic Science, v.29, p.39–47, 2007.
FELIPPI, C. C. Nanopartículas contendo isotretinoína: Preparação, caracterização físicoquímica, estudo de estabilidade e avaliação da penetração cutânea. Dissertação de
Mestrado, Porto Alegre-RS, 2008.
FESSI, H.; PUISIEUX, F.; DEVISSAGUET, J. Procédé de préparation des systémes
collïdaux dispersibles d’une substance sous forme de nanocapsules. European Patent,
0274961 A1, 1989.
FERRONY, D. A. Estudo de estabilidade de uma formulação semissólida contendo
nanocápsulas de dexametasona. Dissertação de Mestrado, Santa Maria –RS, 2009.
FITZPATRICK, T. B.; PATHAK, M.; PARRISH, J. A. Protection of human skin against
the effects of the sunburn ultraviolet (290-320nm). In: FITZPATRIC, T. B. Sunlight and
man, normal and abnormal photobiological responses. Tokio, 1974.
FLORENCE, A. T. e ATTWOOD, D. Princípios físico-químicos em farmácia, 3.ed.
Edusp, 2003. Cap. 8.
FRANZ, T. J. Percutaneous absorption. On the relevance of in vitro data. The Journal of
Investigative Dermatology, v. 64, n.3, p.190-195, 1975.
FREITAS, C.; MÜLLER, R. H. Effect of light and temperature on zeta potential and
physical stability in solid lipid nanoparticle (SLN™) dispersions. International Journal of
Pharmaceutics. v.168, p. 221–229, 1998.
FRIEDRICH, M.; PRIMO, F. T.; FUNCK, J. A. B.; LAPORTA, L. V.; ALVES, M. P.;
BITTENCOURT, C. F.; ESCARRONE, A. L. V. Avaliação da Estabilidade FísicoQuímica de Creme Não Iônico Inscrito no Formulário Nacional. Latin American Journal
of Pharmacy, v.26, n.4, p.558-562, 2007.
FRONZA, T.; CAMPOS, A.; TEIXEIRA, H. Nanoemulsões como Sistemas de Liberação
para Fármacos Oftálmicos. Acta Farmacêutica Bonaerense, v. 23, n.4, p.558-566, 2004.
FRONZA, T.; GUTERRES, S. S.; POHLMAMM, A. R.; TEIXEIRA, H. Nanocosméticos:
Em direção ao estabelecimento de marcos regulatórios. 1 ed. Porto Alegre: Gráfica de
UFRGS. 2007.
97
GALDERMA
LABORATORIES,
L.
P.
2003.
Disponível
em:
http://www.differin.com/AboutDifferin/ProductInsert_Gel.aspx Acesso em 01 dezembro
2008.
GASPAR, L. R.; MAIA CAMPOS, P. M. B. G. Rheological behavior and the SPF of
sunscreens, International Journal of Pharmaceutics. v.250, p.35–44, 2003.
GHOSH, S.; ROUSSEAU, D. Freeze–thaw stability of water-in-oil emulsions. Journal of
Colloid and Interface Science. v.339, p.91-102, 2009.
GOMES, M. L. C. Influência de diferentes concentrações de retinóides em formulações
dermocosméticas nos efeitos benéficos e/ou colaterais na pele de camundongos sem
pelo. Universidade de São Paulo. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas),
2007.
GONÇALVES, G. M. S.; CAMPOS, P. M. B. G. M. Aplicação de métodos de biofísica no
estudo da eficácia de produtos dermocosméticos. Brazilian Journal of Pharmaceutical
Sciences. v.45, n.1, 2009.
GOUVÊA, D.; MURAD, B. B. S. Influência das características ácido-básicas da superfície
dos óxidos na estabilidade de suspensões cerâmicas de Al2O3 ou SnO2 com dispersantes
comerciais. Cerâmica. v.47, p.51-56, 2001.
GUEDES, A. C. M.; BENTES, A. A.; MACHADO-PINTO, J.; CARVALHO, M. L. R.
ACNE INDUZIDA POR AMINEPTINA. Anais Brasileiros de Dermatologia. v.84, n.1,
2009.
GUTERRES, S. S.; FESSI, H.; BARRATT, G.; DEVISSAGUET, J-PH.; PUISIEUX, F.
Poly (DL-lactide) nanocapsules containing diclofenac : I. Formulation and stability study.
International Journal of Pharmaceutics. v. 113, p. 57-63, 1995.
GUTERRES, S. S; ALVES, M. P.; POHLMANN, A. R. Polymeric nanoparticles,
monospheres and nanocapsulas for cutaneous applications, Drug target insights. v. 2, p.
147-157, 2007.
HADGRAFT, J. Modulation of the barrier function of the skin. Skin Pharmacology and
Applied Skin Physiology. v.14, n.1, p.72-81, 2001.
HADGRAFT, J. Skin deep. European Journal of Pharmaceutics and
Biopharmaceutics. v.58, p.291–299, 2004.
HANS, M. L.; LOWMAN, A. M. Biodegradable nanoparticles for drug delivery and
targeting. Current Opinion in Solid State and Materials Science. v.6, p.319–327, 2002.
HARTMANN, R. R.; PLEWIG, G. Acne fulminans -Tratamento de 11 pacientes com o
ácido 13 - cis – retinóico. Anais Brasileiros de Dermatologia. v.58. n.1, 1983.
98
HASBÚN, T.; NAVARRETE, A.; HERRADA L.; VALENZUELA A.; BUSTAMANTE,
F.; ORLANDI, C. Trastorno depresivo mayor en pacientes con acne. Piel. v.23, 2ª Ed..
Santiago, Chile, 2008.
HILLEBRAND G.; MIYAMOTO K.; SCHNELL, B.; ICHIHASHI, M.; SHINKURA, R.;
AKIBA S. Quantitative evaluation of skin condition in an epidemiological survey of
females living in northern versus southern Japan. Journal of Dermatological Science.
v.27, p.42–52, 2001.
HODOSHIMA, N.; UDAGAWA, C.; ANDO, T.; FUKUYASU, H.; WATANABE, H.;
NAKABAYASHI, S.; Lipid nanoparticles for delivering antitumor drugs. International
Journal of Pharmaceutics, n.146, p. 81-92, 1997.
HÜBNER, N.; KAMPF, G.; LÖFFLER, H.; KRAMER, A.; Effect of a 1 min hand wash on
the bactericidal efficacy of consecutive surgical hand disinfection with standard alcohols
and on skin hydration. International Journal of Hygiene and Environmental Health.
v.209, p.285-291, 2006.
HUANG, Y.; WU, P.; KO, H.; TSAI, Y. Crodamom oil as a skin permeation enhancer for
indomethacin, piroxicam and diclofenac. International Journal of Pharmaceutics, v. 126,
p.111-117, 1995.
HWANG, S.; OH D.; LEE, D.; KIM, J.; PARK, S. Clinical Efficacy of 25% L-Ascorbic
Acid (C’ensil) in the Treatment of Melasma. Journal of Cutaneous Medicine and
Surgery. v.13, n.2, p.74-81, 2009.
INDRA, A. K.; MOHAN, W. S.; FRONTINI, M.; SCHEER, E.; MESSADDEQ, N.;
METZGER, D.; TORA L. TAF10 is required for the establishment of skin barrier function
in foetal, but not in adult mouse epidermis. Developmental Biology. v.285, p.28 – 37,
2005.
IOELE, G.; CIONEB, E.; RISOLIA, A.; GENCHIB, G.; RAGNOA, G. Accelerated
photostability study of tretinoin and isotretinoin in liposome formulations. International
Journal of Pharmaceutics. v.328, p.251-256, 2005.
IRBY, C. E.; YENTZER, B. A.; FELSMAN S. R.; A Review of Adapalene in the
Treatment of Acne Vulgaris. Journal of Adolescent Health. v.43, p.421-424, 2008.
ISAAC, V. L. B.; CEFALI, L. C.; CHIARI, B. G.; OLIVEIRA, C. C. L. G.; SALGADO,
H. R. N.; CORRÊA, M. A. Protocolo para ensaios físico-químicos de estabilidade de
fitocosméticos. Revista de Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada. v.29, n.1, p.81-96,
2008.
JACYK, W. K.; MPOFU, P. Adapalene gel 0,1% for topical treatment of acne vulgaris in
African patients. Cutis, v. 68, p.48-54, 2001.
99
KATSUNG, B. Farmacologia Básica e Clínica; 8 ed.; Editora Guanabara Koogan: RJ;
2003.
KIM, H. S.; LIM, S. H.; SONG, J. Y.; KIM, M.; LEE, J. H.; PARK, J. G.; KIM, H. O.;
PARK, Y. M.; Skin barrier function recovery after diamond microdermabrasion. The
Journal of Dermatology. v.36, n.10, p. 529-533, 2009.
KNORST, M. T. Desenvolvimento tecnológico de forma farmacêutica plástica
contendo extrato concentrado de Achyrocline satureioides (Lom) DC. Compositae
(Marcela). 1991 228p. Dissertação (Mestrado) - Curso de Pós-graduação em Ciências
Farmacêuticas, Curso de Farmácia, 1991.
KOROLKOVAS, A. Dicionário Terapêutico Guanabara. Rio de Janeiro: Guanabara
Koogan S.A., 2002.
LABA, D. Rheological Properties of Cosmetics end toiletries. New York: Marcel
Dekker, p.09-33, 1993.
LACHMAN, L.; LIEBERMAN, H. A.; KANIG, J. L. Teoria e prática na indústria
farmacêutica. Fundação Calouste Gulbenkian: Lisboa, 2001.
LAZZARINI, R.; BRAGA, J. C. T.; DUARTE, I.; LIGABUE, S. L. Dermatite alérgica de
contato a medicamentos de uso tópico: uma análise descritiva. Anais Brasileiros de
Dermatologia, v.84, n.1, p.30-34, 2009.
LEBWOHL M,; HERRMANN L. G. Impaired skin barrier function in dermatologic
disease and repair with moisturization. Cutis, n.76, v.6, p.7-12, 2005.
LEONARDI, G. R.; MAIA CAMPOS, P. M. B. G. Estabilidade de formulações
cosméticas. Int. J. Pharm.Compounding, v. 3, n. 4, p.154-156, 2001.
LEONARDI G. R.; GASPAR L. R.; MAIA CAMPOS P. M. B. G. Application of a noninvasive method to study the moisturizing effect of formulations containing vitamins A or
E or ceramide on human skin. Journal of Cosmetic Science, v.53, n.5, p.263-268, 2002.
LEVIN J.; MAIBACH H. The correlation between transepidermal water loss and
percutaneous absorption: an overview. Journal of Controlled Release, v.103, p.291-299,
2005.
LIMA, D. R. Manual de Farmacologia Clínica Terapêutica e Toxicologia. v.1. Rio de
Janeiro: Guanabara Koogan S.A., 2004.
LIMAYEM, I.; CHARCOSSET, C.; SFAR, S.; FESSI, H. Preparation and characterization
of spironolactone-loaded nanocapsules for paediatric use. International Journal of
Pharmaceutics. v.325, p.124–131, 2006.
100
LIU, Z.; XIANG, J. A high yield and pilot – scale process for the preparation of adapaleno.
Organic Process Research e Development. v.10, p.285-288, 2006.
LODÉN M. Biophysical properties of dry atopic and normal skin with special reference to
effects of skin care products. Acta Dermato Venereologica. v.192, p.1-48, 1995.
LOMUTO, M.; PELLICANO, R.; GIULIANI, M. Equipment Available for Bioengineering
of the Skin. Clinics in Dermatology, v.13, p.409-415, 1995.
MANCONI, M. et al. Niosomes as carriers for tretinoin II. Influence of vesicular
incorporation on tretinoin photostability.International Journal of Pharmaceutics. v.260,
p.261-272, 2003.
Manual Courage-Khazaka Electronic, Alemanha.
MARCHIORI, M. L.; LUBINI, G.; NORA, D.; FRIEDRICH, R. B.; FONTANA, M. C.;
OURIQUE, A. F.; BASTOS, M. O.; RIGO, L. A.; SILVA, C. B.; TEDESCO, S. B.; BECK,
R. C. R. Hydrogel containing dexamethasone-loaded nanocapsules for cutaneous
administration: preparation, characterization, and in vitro drug release study. Drug
Development and Industrial Pharmacy, v.36, n.8, p.962-971, 2010.
MARRIOT, C. in AULTON, M. E. Delineamento de formas farmacêuticas. Artmed,
ed.2ª, Porto Alegre: 2005.
MARTIN, A. Physical Pharmacy. 4. ed. Philadelphia: Lea & Febiger, 1993. p. 153-476.
MARTIN, B.; MEUNIER, C.; MONTELS, D.; WATTS, O. Chemical stability of
adapalene and tretinoin when combined with benzoyl peroxide in presence and in absence
of visible light and ultraviolet radiation. British Journal of Dermatology, v.139 p.8 –11,
1998.
MENDONÇA, C. C.; SILVA, I. C. L.; RODRIGUES, K. A.; CAMPOS, M. A. L.;
MEDEIROS, M. C. M.; CASTELI, V. C.; FERRARI, M.; MUSIS, C. R.; MACHADO, S.
R. P. Emulsões O/A contendo Cetoconazol 2,0%: avaliação da estabilidade acelerada e
estudos de liberação in vitro. Revista de Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada,
v.30, p.35-46, 2009.
MENON, G. K. New insights into skin structure: scratching the surface. Advanced Drug
Delivery Reviews. Amsterdan, v.54, p.S3-S17, 2002.
MILÃO, D.; KNORST, M. T.; GUTERRES, S. S. Hydrophilic Gel Containing
Nanocapsules of Diclofenac: Development, Stability Study and Physic-chemical
Characterization. Pharmazie. v. 58, p.325-329, 2003.
MONACO, J. P. Desenvolvimento de sistemas bio e mucoadesivos de uso intra-bucal:
Avaliação in vitro da liberação de nimesulida. Dissertação (Mestrado) - Ciências
Farmacêuticas, Universidade de São Paulo/Ribeirão Preto, SP, 2000.
101
MORA-HUERTAS, C. E.; FESSI, H.; ELAISSARI, A. Polymer-based nanocapsules for
drug delivery. International Journal of Pharmaceutics, v.385, p.113–142, 2010.
MOSER, K., KRIWET, K., NAIK, A., KALIA, Y.N., GUY, R.H. Passive skin penetration
enhancement and its quantification in vitro. European Journal of Pharmaceutics and
Biopharmaceutics., Amsterdam, v.82, p.103-112, 2001.
MÜLLER, C. R.; SCHAFFAZICK, S. R.; POHLMANN, A. R.; FREITAS, L. DE L.; DA
SILVEIRA, N. P.; DALLA COSTA, T.; GUTERRES, S. S. Spraydried diclofenac-loaded poly
(epsilon-caprolactone) nanocapsules and nanospheres. Preparation and physicochemical
characterization. Pharmazie. v. 56, p. 864–867, 2001.
MÜLLER, R. H.; MÄDER, K.; GOHLA, S. Solid lipid nanoparticles (NPLS) for controlled
drug delivery – a review of the state of the art. European Journal of Pharmaceuticals and
Biopharmaceuticals. v.50, p.161-177, 2000.
MÜLLER, R. H.; PETERSEN, R. D.; HOMMOSS, A.; PARDEIKE, J. Nanostructured
lipid carriers (NLC) in cosmetic dermal products. Advanced Drug Delivery Reviews,
v.59, p.522–530, 2007.
MÜNZEL, K.; BUECHI, J.; SCHULTZ, O. E. (Hrsg.) Galenisches Praktikum. Stuttgart:
Wissenschaftliche, 1959.
NETZLAFF, F.; KOSTKA, K. H.; LEHR, C. M.; SCHAEFER, U. F.; TEWL
measurements as a routine method for evaluating the integrity of epidermis sheets in static
Franz type diffusion cells in vitro. Limitations shown by transport data testing. European
Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, v. 63, p. 44-50, 2006.
OBERDÖRSTER, G.; STONE, V.; DONALDSON, K. Toxicology of nanoparticles: A
historical perspective. Nanotoxicology. v.1, p.2-25, 2007.
OLIVEIRA, A. G.; SCARPA, M. V.; CERA, L. F. R. Microemulsões II: Aplicações de
liberação de fármacos. Infarma, v.14, p.76-80, 2002.
OLIVEIRA, D. A. G. C.; DUTRA, E. A.; SANTORO, M. I. R. M.; HACKMANN, E. R.
M. K. Protetores Solares, Radiações e Pele. Cosmetics & Toiletries (Edição em
Português), v.16, p.68-72, Mar/Abril, 2004a.
OLIVEIRA, A. G.; SCARPA, M. V.; CORREA, M. A.; CERA, L. F. R., FORMARIZ, T.
P. Microemulsões: estrutura e aplicações como sistema de liberação de fármacos. Química
Nova, v.27, n.1, p.131-138, 2004b.
OLUTUNMBI, et al. Adolescent Female Acne: Etiology and Management. Jornal
Pediatric and Adolescent Gynecology, Pittsburgh, USA, 2008.
102
OURIQUE, A. F.; POHLMANN, A. R.; GUTERRES, S. S.; BECK, R. C. R.; Tretinoinloaded nanocapsules: Preparation, physicochemical characterization, and photostability
study. International Journal of Pharmaceutics. v.352, p.1-4, 2008.
PAESE, K. Desenvolvimento tecnológico, estudo da fotoestabilidade e avaliação da
permeação cutânea in vitro da benzofenona-3 a partir de nanocápsulas poliméricas
incorporadas em diferentes veículos semissólidos. Universidade Federal do Rio Grande
do Sul. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas), 2008.
PAESE, K.; JAEGER, A.; POLETTO, F.; PINTO, E. F., ROSSI-BERGMANN, B.;
POHLMANN, A. R. GUTERRES, S. S. Semisolid Formulation Containing a
Nanoencapsulated Sunscreen: Effectiveness, In Vitro Photostability and Immune Response.
Journal of Biomedical Nanotechnology, v.5, n.3, p.240-246, 2009.
PARDEIKE, J.; SCHWABE, K.; MÜLLER, R. H. Influence of nanostructured lipid
carriers (NLC) on the physical properties of the Cutanova Nanorepair Q10 cream and the in
vivo skin hydration effect. International Journal of Pharmaceutics, v.396, p.166-173,
2010.
PARK, E. S.; IM NA, J.; OK KIM, S.; HUN HUH, C.; YOUN, S. W.; PARK, K. C.
Application of a pigment measuring device – Mexameter® – for the differential diagnosis of
vitiligo and nevus depigmentosus. Skin Research and Technology, v.12, p.298–302,
2006.
PASCHOALINO, M. P.; GLAUCIENE P. S.; MARCONE, G. P. S.; JARDIM, W. F. Os
nanomateriais e a questão ambiental. Quimica Nova, v.33, n.2, p.421-430, 2010.
PEREIRA, M. R.; CRUZ, L.; RÉ, M. I.; GUTERRES, S. S. Micropartículas Secas
contendo Fármaco Modelo Lipofílico preparadas a partir de Suspensão Aquosa: Estudo de
Formulação. Acta Farmacêutica Bonaerense. v.25, n.2, p.198-205, 2006.
PHARMACEUTICAL
NEWS,
2007.
Disponível
http://www.newsmedical.net/?id=26724. Acesso em 30 junho 2009.
em:
PHARMASPECIAL - Informativo Técnico Aristoflex AVL Disponível
http://www.pharmaspecial.com.br/imagens/ literatura>. Acesso em: 17 out. 2010.
em:
PINTO P.; GALEGO N.; SILVA N. Definição de critérios de avaliação dos efeitos sobre a
superfície cutânea de cremes hidratantes: I – análise após uma aplicação. Revista
Portuguesa de Farmacia, v.47, n.1, p.23-34, 1997.
PINTO, C.; NEUFELD, R. J.; RIBEIRO, A. J.; VEIGA, F. Nanoencapsulation I. Methods
for preparation of drug-loaded polymeric nanoparticles. Nanomedicine, v.2, n.1, p.8–21,
2006.
PIQUERO, J. Isotretinoína: su uso en el acné del adolescente. Dermatologia Pediátrica
Latinoamericana,v.2, n.1, p.72-81, 2004.
103
PISKIN, S.; UZUNALI, E. A review of the use of adapalene for the treatment of acne
vulgaris. Therapeutics and Clinical Risk Management, v. 3(4), 2007.
POET, T.; MCDOUGAL, J. Skin absorption and human risk assessment. ChemicoBiological Interactions, v.140, p.19–34, 2002.
POHLMANN, A. R.; WEISS, V.; MERTINS, O.; SILVEIRA, N. P.; GUTERRES, S. S.
Spray-dried indomethacin-loaded polyester nanocapsules and nanospheres: development,
stability evaluation and nanostructure models. European Journal of Pharmaceutical
Sciences, v.16, p.305–312, 2002.
PRAUSNITZ, M. R., MITRAGOTRI, S.; LANGER, R. Current status and future potential
of transdermal drug delivery. Nature Reviews, New York, v. 3, p.115-124, 2004.
PRESTES, P. S.; RIGON, R. B.; CORRÊA, N.M.; LEONARDI, G. R. Avaliação da
estabilidade físico-química de emulsão acrescida de uréia dispersada, ou não, em
propilenoglicol. Revista de Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada. v.30, p.38-44,
2009.
PRUNIERAS, M. Manual de cosmetologia dermatológica. 2.ed. São Paulo: Editora
Andrei, 1994.
RAMOS E SILVA, M.; CARNEIRO, S.; PONZIO, H.; ASSUNÇÃO, B.; CARDOSO, A.;
ALMEIDA, F.; ZAITZ, C. & CAMPBELL, I. Estudo clínico aberto multicêntrico da
efetividade e tolerabilidade do gel de adapaleno a 0,1% em pacientes com acne vulgar.
Anais Brasileiros de Dermatologia; Rio de Janeiro; v.78, n. 2, 2003.
RAWLINGS, A. V.; MATTS, P. J.; ANDERSON, C. D.; ROBERTS, M. S. Skin biology,
xerosis, barrier repair and measurement. Drug Discovery Today: Disease Mechanisms, n.
261, 2008.
REICHLING, J.; LANDVATTER, U.; WAGNER, H.; KOSTKA, K.; SCHAEFER, U. F.
In vitro studies on release and human skin permeation of Australian tea tree oil (TTO) from
topical formulations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. v.64,
p.222-228, 2006.
REZA, S. QUADIS, M. A.; HAIDER, S. S. Comparative avaluation of plastic, hydrophobic
and hydrophilic polymers as matrices for controlled-release drug delivery. Journal of
Pharmaceutical and Pharmaceutics Science, v.6, n.2, p.282-291, 2003.
RIBEIRO, H. M.; MORAIS, J. A.; ECCLESTON, G. M. Structure and rheology of
semisolid o/w creams containing cetyl alcohol/non-ionic surfactant mixed emulsifier and
different polymers. International Journal of Cosmetic Science. v.26, n.2, p.47-59, 2004.
RITGER, P.; PEPPAS, N. A. A simple equation for description of solute release. II. Fickian
and anomalous release from swellable devices. Journal of Controlled Release, v. 5, n. 1,
p. 37-42, 1987.
104
RODRIGUES L. Bioengenharia cutânea: novas perspectivas sobre a fisiologia da pele.
Cosmetics & Toiletries, v.8, n.4, p.51-5, 1996.
RODRIGUES L. A avaliação biofísica da superfície cutânea: indicadores fisiológicos da
funcionalidade epidérmica. Revista Portuguesa de Farmácia, v.45, n.1, p.52-9, 1995.
ROGGIA, I. Avaliação da estabilidade, liberação e permeação cutânea de nanocápsulas
contendo benzofenona-3. Dissertação de mestrado, Santa Maria-RS, 2009.
ROGIERS, V.; DERDE, M. P.; VERLEYE, G.; ROSEEUW, D. Standardized Condition
Needed for Skin Surface Hydration Measurements. Cosmetics & Toiletries. v.105, p.7482, 1999.
ROSADO, C.; PINTO, P.; RODRIGUES, L. M. Comparative assessment of the
performance of two generations of Tewameter_: TM210 and TM300. International
Journal of Cosmetic Science, v.27, p.237-241, 2005.
SAARINEN-SAVOLAINEN, P.; JÄRVINEN, T.; TAIPALE, H.; URTTI, A. Method for
evaluating drug release from liposomes in sink Conditions. International Journal of
Pharmaceutics, v.159, p.27–33, 1997.
SAHOO, S. K.; PARVEEN, S.; PANDA, J. J. The present and future of nanotechnology in
human health care. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine, v.3, p.20-31,
2007.
SCHAFFAZICK, S. R.; POHLMANN, A. R.; FREITAS, L. L.; GUTERRES, S. S.
Caracterização e estudo de estabilidade de suspensões de nanocápsulas e de nanoesferas
poliméricas contendo diclofenaco. Acta Farmacêutica Bonaraense, v.21, n.2, p.99-106,
2002.
SCHAFFAZICK, R.; GUTERRES, S. ; FREITAS, L. ; POHLMANN, A. Caracterização e
estabilidade físico-química de sistemas poliméricos nanoparticulados para administração de
fármacos. Química Nova, v. 26, n. 5, p. 726-737, 2003.
SCHMID-WENDTNER, M. H.; KORTING, H. C. The pH of the skin surface and its
impact on the barrier function. Skin. Pharmacol. Physiol., v. 19, n. 6, p. 296-302, 2006.
SHAH, V.P.; BON, C.; KAPLAN, S. A.; YACOBI, A.; MAIBACH, H.; FLEISCHER, N.;
FRANZ, T. J.; KAWAMOTO, J.; MARTY, J.; LESKO, L.; WILKIN, J.; PERSHING, L.;
SCHAEFER, H.; SEQUEIRA, J.; SHRIVASTAVA, S.; WILLIAMS, R.; FLYNN, G.
Bioequivalence of topical dermatological dosage forms: Methods of evaluation of
bioequivalence. Pharmaceutical Research, v. 15, p. 167-171, 1998.
SHALITA A. The integral role of topical and oral retinoids in the early treatment of acne.
Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology, v.15, p.3–9, 2001.
105
SHROOT, B. Pharmacodynamics and pharmacokinetics of topical adapalene. Journal
American Academy of Dermatology, v.39, p.17-24, 1998.
SIEPMANN, J. PEPPAS, N. A. Modelling of drug release from delivery systems based on
hydroxypropyl methylcellulose (HPMC). Advanced Drug Delivery Reviews, v.48, p.139157, 2001.
SILVA, Penildon. Farmacologia. 6° ed.. Rio de Janeiro, RJ: Editora Guanabara, p. 12621266, 2002.
SILVA, M. S.; COCENZA, D. S.; DE MELO, N. F. S.; GRILLO, R.; ROSA, A. H.;
FRACETO, L. F. Nanopartículas de alginato como sistema de liberação para o herbicida
clomazone. Química Nova. v.XV, p.1-6, 2010.
SMITH, W. Stratum corneum barrier integrity controls skin homeostasis. International
Journal of Dermatology. v.21, n.2, p.99-106, 1999.
SOUZA, V. M.; JUNIOR D. A. Ativos dermatológivos: guia de ativos dermatológicos
utilizados na farmácia de manipulação para médicos e farmacêuticos. v.2, São Paulo,
SP: Pharmabooks, 2006.
SPENCER, T. S. Dry skin and skin moisturizers. Clinical Dermatology., v.6, n.3, p.24-28,
1988.
SUH, W. H.; SUSLICK K. H.; STUCKY, G. D.; SUH, Y. Nanotechnology,
nanotoxicology, and neuroscience. Progress in Neurobiology. v.87, p.133–170, 2009.
TEXEIRA, M.; ALONSO, M. J.; PINTO, M. M. M.; BARBOSA, C. Development and
characterization of PLGA nanospheres and nanocapsules containing xanthone and 3methoxyxanthone. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. v.9,
p.491–500, 2005.
TEIXEIRA, Z. Potencial Zeta. Disponível em: www.nanobiotec.iqm.unicamp.br/.../Aula
209-%20zeta.ppt. Acesso em: 05/10/10.
TERROSO, T.; KÜLKAMP, I. C.; JORNADA, D. S.; POHLMANN, A. R.; GUTERRES,
S. S. Development of Semi-Solid Cosmetic Formulations Containing Coenzyme Q10Loaded Nanocapsules. Latin American Journal of Pharmacy, v.28, n.6, p.819-26, 2009.
TOUITOU, E.; MEIDAN, V. M.; HORWITZ, E. Methods for quantitative determination of
drug localized in the skin. Journal of Controlled Release v. 56, p. 7-21, 1998.
TRICHARD, L.; DELGADO-CHARRO, M. B.; GUY, R. H.; FATTAL, E.; BOCHOT A.
Novel Beads Made of Alpha-cyclodextrin and Oil for Topical Delivery of a Lipophilic
Drug. Pharmaceutical Research, v.25, p.435-440, 2008.
106
VAZ, A.; Acne vulgar: Bases para o seu tratamento, Revista Portuguesa de Clínica
Geral, v.19, 2003.
VENTER, J. P.; MÜLLER, D. G.; PLESSIS, J.; GOOSEN, C. A comparative study of in
situ adapted diffusion cell and in vitro Franz diffusion cell method for transdermal
absorption of doxylamine. European Journal of Pharmaceuticals Sciences, v.13, p.169177, 2001.
VERDIER-SEVRAIN, S.; BONTÉ, F. Skin hydration: a review on its molecular
mechanisms. Journal Cosmetic Dermatology. v.6, n.2, p.75-82, 2007.
VERMA, D. D.; VERMA, S.; BLUME, G.; FAHR, A. Particle size of liposomes influences
dermal delivery of substances into skin. International Journal of Pharmaceutics, v.258,
p.141-151, 2003.
VILA, A.; SÁNCHEZ, A.; TOBÍO, M.; CALVO, P.; ALONSO, M. Design of
biodegradable particles for protein delivery. Journal of Controlled Release, v.78, p.15-24,
2002.
VLACHOU, C.; LICHYSHYN, A. Prescribing in acne. Management and prescribing,
v.73. n.6, 2006.
WAGNER, H.; KOSTKA K. Interrelation of permeation and penetration parameters
obtained from in vitro experiments with human skin and skin equivalents. Journal of
Controlled Release, v. 75, p. 283-295, 2001.
WASHINGTON, C. Drug release from microdisperse systems: a critical review.
International Journal of Pharmaceutics, v.58, p.1-12, 1990.
WIECHERS, J. W.; BARLOW, T. Skin moisturization and elasticity originate from at least
two different mechanisms. International Journal Cosmetic Science, v.12, p.425-435,
1999.
WISSING, S. A.; MÜLLER, R. H. The influence of solid lipid nanoparticles on skin
hydration and viscoelasticity – in vivo study. European Journal of Pharmaceutics and
Biopharmaceutics, v. 56, p. 67-72, 2003.
YAMASHITA, F.; HASHIDA, M. Mechanistic and empirical modeling of skin permeation
of drugs. Advanced Drug Delivery Review,. v. 55, p.1185–1199, 2003.
YILMAZ E.; BORCHERT H. Effect of lipid-containing, positively charged nanoemulsions
on skin hydration, elasticity and erythema—An in vivo study. International Journal of
Pharmaceutics, v.307, p.232–238, 2006.
107