o efeito do triclosan no processo fibrosante de células hepáticas lx

O efeito do triclosan no processo fibrosante de células hepáticas LX-2
mediante a ação na síntese de ácido graxo de novo
Juliana F. MIRANDA,1, Brenda O. SILVA2, Letícia F. RAMOS3,
Letícia R. GONÇALVES4, Karen C. M. MORAES5.
Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências/ Departamento de Biologia, Avenida 24 A,
1515, 13506900, Rio Claro – São Paulo, [email protected]; [email protected];
4
[email protected]; [email protected].
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Universidade Federal de Ouro Preto/ Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas (NUPEB),
Campus do Morro do Cruzeiro, ICEB II, 35400000, Ouro Preto, MG, [email protected];
Resumo – Estudos sugerem que o metabolismo de lipídeos está relacionado à fibrose hepática,
condição clínica presente na maioria das doenças hepáticas. Visando a necessidade do
desenvolvimento de novos tratamentos para estas doenças, selecionamos a proteína chave da
síntese de ácido graxo de novo, FASN, para o estudo da reversão da fibrose hepática, utilizando
fármaco triclosan (TCS) como inibidor desta proteína. Os resultados sugerem que a inibição da
proteína FASN em células LX-2, modelo da principal célula responsável pelo desenvolvimento da
fibrose hepática (célula estrelada hepática), tem potencial na reversão das características
morfofisiológicas de células fibrosadas ao estado normal. A proteína FASN apresenta um alvo em
potencial no desenvolvimento de novas terapias para doenças hepáticas. Contudo, o tratamento com
TCS apresentou características potencialmente citotóxicas nos ensaios com células LX-2.
Palavras-chave: Fibrose hepática, LX-2, metabolismo de lipídeo, triclosan, FASN.
Área do Conhecimento: Biologia celular e molecular
Introdução
O fígado atua como glândula mestra em funções correlatas a manutenção da homeostase celular
e do organismo. Embora o número crescente de pesquisas sobre as doenças hepáticas, ainda são
consideradas um grave problema de saúde pública. Infelizmente, tratamentos convencionais através
de terapias antiinflamatórias, imunossupressivas e antivirais não são satisfatórios na erradicação das
diferentes etiologias de doenças hepáticas. Dentro deste contexto, se torna importante a elucidação
das reações bioquímicas das patogenias hepáticas. Considerando-se as anomalias que acometem o
fígado, a fibrose hepática é a característica clínica presente na maioria das lesões, resultado da
evolução do quadro inflamatório na tentativa de cicatrização e reparo do tecido. Este evento estimula
os processos pró-inflamatórios e pró-fibrogênico através da alteração de vias moleculares do
metabolismo celular, sendo viabilizado pela energia proveniente das gotículas de lipídeos
(ANDRADE, 2005; BECKER, 2013). Dentre os diversos elementos que participam do processo
fibrosante, a principal célula responsável é a célula estrelada hepática (CEH) (FRIEDMAN, 2008).
A CEH foi descrita por Kupffer no século XIX, localiza-se no espaço de Disse e compreende
aproximadamente um terço da população de células não parenquimais (FRIEDMAN, 2008). Quando
o fígado sofre algum tipo de lesão, ela passa do seu estado quiescente para o ativado, induzido pela
ação de citocinas fibrogênicas produzidas por células inflamatórias. No seu estado ativado, a CEH
perde suas gotículas de lipídeo do citoplasma e sua forma estrela, e aumenta a síntese de
componentes de matriz extracelular (IREDALE, 2007). Essa alteração ocorre mediante a ativação de
proteínas como PDGF, CTGF e α-SMA, que irão proporcionar o aumento de síntese dos
componentes da matriz extracelular, da proliferação e contratilidade (FRIEDMAN, 2008). Devido a
importância da CEH, linhagens de CEH humana foram estabelecidas por Xu et al. (2005), dentre elas
a linhagem LX-2 é caracterizada por expressar os dois fenótipos dependendo da concentração de
soro em que é cultivada. Sob baixas concentrações de soro ela expressa o fenótipo quiescente (não
fibrosante) e sob concentrações mais elevadas de soro o fenótipo ativado (fibrosante).
Entre as vias moleculares que se destacam na mudança fenotípica de CEH, encontra-se a via de
metabolismo de lipídeos. A síntese de ácido graxo de novo realizada no fígado é mediada por
diferentes fatores, dentre eles podemos citar: FASN, ACACA, PPAR-γ e SREP1c (LIU et al., 2010).
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Sobretudo, a proteína ácido graxo sintase tem papel de destaque na síntese de ácido graxo de novo,
sua atividade gera longas cadeias de ácidos graxos saturadas através da transmissão de substratos
a partir de um domínio funcional para o seguinte na presença de NADPH. Essa proteína possui sete
domínios funcionais e pode ser dividida em dois subtipos: FAS tipo II, encontrada em bactérias e
plantas; e FASN (tipo I), encontrada em mamíferos. A FASN é formada por dois polipeptídeos
multifuncionais idênticos de 272 kDa e sete domínios funcionais formando uma única ligação
(CHENG et al., 2014; LIU, et al., 2010). O composto triclosan ( 2,4,4’-tricloro-2’-hidroxidifenil éter) tem
sido estudado pela sua atividade inibitória da FAS-II e FASN. O TCS é um agente antimicrobiano
amplamente usado em cosméticos ao redor do mundo e que, apenas recentemente, foi retirado da
lista de compostos aprovados pela FDA (U.S. Food and Drug Administration) (LIU et al., 2010).
Em suma, sabe-se da importância do estudo dos aspectos moleculares das vias metabólicas do
processo fibrosante hepático no desenvolvimento de tratamentos suplementares, sendo a fibrose
hepática um evento complexo com a participação de células e subtâncias heterogêneas. O foco deste
trabalho foi a investigação da atividade da proteína FASN e seu papel no processo pró-fibrosante
hepático, considerando o metabolismo de lipídeo relevante na transdiferenciação das células
hepáticas estreladas. Para essas análises o fármaco TCS foi utilizado em células LX-2 e aspectos
celulares e moleculares da inibição da FASN foram avaliados, visando o desenvolvimento de novas
terapias para o tratamento da fibrose hepática.
Metodologia
Células da linhagem LX-2 foram crescidas em garrafas de 25 ou 75 cm² até a confluência celular
de 90% com meio Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM – Life Technologies) contendo
diferentes concentrações de soro bovino fetal (SBF) - 2% (estado quiescente) ou 10% (ativação dos
mecanismos pró-fibrosantes), na presença ou ausência do TCS, inibidor da proteína FASN, e do
DMSO (controle experimental). As culturas foram mantidas à 37o C em atmosfera contendo 5% de
CO2. Previamente, o fármaco triclosan foi preparado como solução estoque de TCS 10 µM em DMSO
seguindo as recomendações do fornecedor (Sigma – Aldrich) e armazenada em freezer a -20◦ C até o
momento do uso. O clássico ensaio de citotoxicidade ou viabilidade celular (MTT) foi aplicado
utilizando a metodologia descrita em MONSMAN (1983) para avaliar a citotoxidade do DMSO e do
TCS em células LX-2 crescidas em 10% de SBF, e os resultados foram avaliados em leitor de
absorbância a 570nm. Para as realizações das etapas subsequentes, o critério de seleção para os
ensaios de MTT foi a viabilidade de pelo menos 70% das culturas celulares tratadas com TCS ou
DMSO.
Genes específicos do processo fibrosante (genes α-SMA, CTGF e PDGF) e relacionados ao
metabolismo de lipídeo (genes PPARγ, ACACA e FASN) foram analisados pela técnica de PCR
semiquantitativo e/ou PCR em tempo real. Os oligonucleotídeos utilizados foram desenhados
utilizando-se o programa Primer3 (UNTERGASSER et al., 2012).
Ensaios de microscopia de fluorescência e microscopia de luz foram realizados. Para analisar as
gotículas de lipídeos, foi utilizada a técnica de microscopia de luz. Após a fixação das lamínulas com
formol-cálcio de células LX-2 crescidas em 2% de SBF e LX-2 crecidas em 10% SBF tratadas e não
tratadas com TCS ou DMSO (controle experimental), as células foram coradas com Óleo Vermelho O
(Red Oil O, Sigma-Aldrich) para se avaliar o efeito nas gotículas de lipídeos. As imagens foram
obtidas em microscópio de campo claro modelo Leica DMLB acoplado a um sistema fotográfico Leica
MPS. Foi utilizada a microscopia de fluorescência para avaliar a distribuição dos filamentos de actina
celular do citoesqueleto de células LX-2 crescidas em 2% de SBF e LX-2 crescidas em 10% SBF
tratadas e não tratadas com TCS ou DMSO (controle experimental). As células crescidas nas
diferentes condições foram fixadas em paraformaldeído (1,36%) contendo Triton X-100 (0,2%). A
distribuição do citoesqueleto e a morfologia nuclear foram avaliadas através da coloração com
faloidina-TRITC e DAPI, respectivamente, utilizando-se do microscópio de fase modelo BX51
OLYMPUS acoplado a um sistema fotográfico.
As análises estatísticas dos resultados foram geradas através do programa Graph Pad versão 5.0
(Prism Inc.), adotando o valor p<0.05 de significância estatística, utilizando cálculos de variância
simples (One-way ANOVA) seguido do teste post-hoc de Dunnet de maneira distinta entre os grupos
controle e tratamento.
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Resultados
Para analisar o potencial citotóxico do DMSO e do fármaco triclosan (TCS) na cultura de células
LX-2 crescidas em 10% de SBF, foram realizados ensaios de MTT. As células foram tratadas em
diferentes concentrações de DMSO ou de TCS por um período de 24 horas de incubação. Ambos os
resultados para o TCS e para o DMSO apresentaram porcentagem satisfatória de células vivas
(acima de 70%) para assegurar a viabilidade do experimento. Para os ensaios subsequentes foram
selecionadas as concentrações de TCS 50 µM e TCS 10 µM, pois apresentaram um início de
variação morfológica no intervalo de 24 horas (dados não mostrados) sem afetar a viabilidade celular.
As concentrações de DMSO 0,5% v/v (70,4 mM) e 1% v/v (140,8 mM) foram utilizadas nos controles
experimentais por condizerem com as concentrações de DMSO utilizadas como solvente do TCS.
Após as análises de citotoxicidade, o mRNA foi extraído de células LX-2 crescidas em 2% de SBF
ou 10% de SBF, e a partir de culturas cultivadas em 10% de SBF com TCS (10 µM ou 50 µM); as
análises do efeito de DMSO (0,5% v/v ou 1% v/v) foram realizadas e consideradas como controle
experimental do efeito real do fármaco. A qualidade do mRNA foi avaliada por espectrofotometria
(A260/A280 ~2.0) e, em seguida, os mesmos foram submetidos a reações de transcrição reversa.
Para as análises de expressão gênica, foram realizados PCR semiquantitativo e/ou PCR em tempo
real de genes relacionados ao processo fibrosante e de genes relacionados ao metabolismo de
lipídeo. As análises do nível de expressão dos mRNA correlatos ao processo fibrosante (como αSMA, PDGF e CTGF) não apresentaram resultados significativos para as células tratadas com o
fármaco TCS, inibidor da proteína FASN (dados não mostrados). No entanto, os resultados do
tratamento com TCS na concentração 50 µM apresentaram alta variação para dois dos principais
genes correlatos ao metabolismo de lipídeo (ACACA e FASN) (Figura 1 A e B).
Análises de microscopia de luz foram realizadas para se avaliar os efeitos do fármaco TCS nas
gotículas de lipídeos em células LX-2 sob as diferentes condições de cultura. As análises de
microscopia de luz demonstraram a grande quantidade de gotículas de lipídeos no citoplasma de
células normais (LX-2 com 2% de SBF, Figura 1 C) que são perdidas nas células ativadas (LX-2 com
10% de SBF, Figura 1 E) e no tratamento com DMSO 1% v/v (Figura 1 D); e, por sua vez,
recuperadas parcialmente no tratamento com TCS 50 µM (Figura 1 F). Além dos resultados da
microscopia de luz, a quantificação das gotículas de lipídeos realizada através do software Image-J
demonstrou um aumento significativo para o tratamento com TCS 50 µM quando comparado à cultura
celular LX-2 com 10% de SBF.
Figura 1: Níveis de expressão relativa dos mRNA FASN e ACACA, e análise das gotículas de lipídeos em células LX-2.
Análises dos genes FASN (A) e ACACA (B) por PCR em tempo real de células LX-2 crescidas em 10% de SBF e LX-2 com 2%
de SBF sem ou com adição de DMSO 1% ou TCS 50 µM. Microscopia de luz de células LX-2 em 2% de SBF (C) ou LX-2 em
10% de SBF sem (E) ou com DMSO 1% (D) ou TCS 50 µM (F) coradas com Red Oil O.
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A análise do efeito do TCS na distribuição dos filamentos de actina no citoesqueleto de células LX2 crescidas em 10% de SBF foi realizada por microscopia de fluorescência. Células LX-2 crescidas
em 2% de SBF se encontram no estado quiescente, no formato estrela e com actina celular
despolimerizada (Figura 1, seta amarela). Os resultados tanto para LX-2 crescida em 10% de SBF
quanto para o tratamento com DMSO 1% apresentaram padrão de organização do citoesqueleto
similar, com a presença de filamentos de actina bem desenvolvidos (Figura 2, seta branca)
característico da célula estrelada hepática ativada (SATO & SENOO, 2003). Interessantemente, o
tratamento com TCS na concentração 50 µM apresentou a organização do citoesqueleto semelhante
à cultura celular normal (LX-2 crescida em 2% de SBF), com a despolimerização dos filamentos de
actina (Figura 2). No entanto, foi possível observar neste tratamento a presença da deformação do
núcleo celular (Figura 2, seta vermelha) e de estruturas globulares de actina (Figura 2, seta azul).
Figura 2: Análises do citoesqueleto e núcleo por microscopia de fluorescência em células LX-2. Microscopia de
fluorescência de células LX-2 em 2% de SBF ou LX-2 em 10% de SBF sem ou com DMSO 1% ou TCS 50 µM coradas com
faloidina-TRICT (citoesqueleto), DAPI (núcleo) e sobrepostas. Seta branca: filamento de actina polimerizado; seta amarela:
filamento de actina despolimerizado; seta vermelha: núcleo deformado; seta azul: estruturas globulares de actina.
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Discussão
Na síntese de ácido graxo de novo, a proteína FASN é responsável por catalisar a reação através
de sucessivas condensações dos substratos acetil-CoA e malonil-CoA (LIU, et al., 2010). O acetilCoA é sintetizado através da glicólise e do ciclo de Krebs a partir de glicose livre na circulação, e o
malonil-CoA é formado através da condensação enzimática da acetil-CoA pela acetil-CoA carboxilase
(ACACA) (CHENG et al., 2014). Neste contexto, o aumento da atividade enzimática tanto da proteína
FASN quanto da ACACA sugerem a amplificação da síntese de ácido graxo de novo no tratamento
com TCS na concentração 50 µM de cultura celular LX-2 crescida em 10% de SBF.
Interessantemente, o fármaco TCS, amplamente estudado pela sua ação inibitória da proteína FASN,
quando adicionado na concentração 50 µM à cultura celular LX-2 apresentou um mecanismo de
compensação, aumentando os níveis de expressão do mRNA tanto de FASN, quanto de outros
genes correlatos ao metabolismo de lipídeo, como ACACA, MLYCD e SREP1c (dados de MLYCD e
SREP1c não mostrados).
Paralelamente, os resultados das análises de microscopia de luz e da quantificação das gotículas
de lipídeos corroboram o conceito de que as células estreladas hepáticas em seu fenótipo quiescente
apresentam grande quantidade de gotículas de lipídeos em seu citoplasma, as quais são perdidas
durante o processo de ativação celular, fornecendo energia necessária para promover as mudanças
celulares ocasionadas pelo processo fibrosante (MALLAT, et al., 2014). Os resultados para o
tratamento com TCS 50 µM asseguraram a amplificação da síntese de ácido graxo de novo,
demonstrando o aumento da quantidade de gotículas de lipídeos no citoplasma, sugerindo que a
inibição da proteína FASN em células LX-2 crescidas em 10% de SBF (fenótipo ativado) apresenta
características celulares e moleculares similares àquelas da CEH quiescente (LX-2 com 2% de SBF).
Finalmente, as análises celulares de microscopia de fluorescência do citoesqueleto e núcleo de
células LX-2 complementam os resultados acima mencionados. Durante o processo de fibrose
hepática as CEH ativadas apresentam citoesqueleto celular com filamentos de actina bem
desenvolvidos (SATO & SENOO, 2003). Os resultados para LX-2 crescida em 10% de SBF (estado
ativado) e para o tratamento com DMSO 1% apresentam os filamentos de actina desenvolvidos,
confirmando a afirmação acima. Ademais, a célula LX-2 em 10% de SBF tratada com TCS 50 µM
apresenta citoesqueleto com filamentos de actina despolimerizados, assim como LX-2 crescida em
2% de SBF (estado quiescente). Estes resultados sugerem o efeito do TCS 50 µM na reversão de
algumas características celulares e moleculares do processo de fibrose hepática em cultura celular
LX-2. Por outro lado, células LX-2 tratadas com TCS 50 µM apresentaram estruturas globulares de
actina no seu citoesqueleto e deformação do núcleo celular. Estudos demonstraram que o
desenvolvimento dessas estruturas globulares de actina está associado a eventos que precedem a
apoptose celular (KHAJAH, et al., 2015; SADOWSKI, et al., 2014). Ainda, segundo Versaevel et al.
(2012), grandes mudanças na morfologia celular induzem a deformação e orientação do núcleo,
afetando também a proliferação celular; portanto, as alterações na distribuição dos filamentos de
actina em células tratadas com TCS 50 µM podem ter ocasionado as deformações do seu núcleo.
Conclusão
Nos últimos anos, mesmo frente aos avanços da medicina, as doenças hepáticas são
consideradas um grave problema de saúde pública. Estima-se que 80% a 90% do parênquima
hepático deve estar modificado para configurar a existência de uma doença hepática, levando o
paciente a iniciar o tratamento quando esta se encontra em estado avançado (ANDRADE, 2005;
BECKER, 2013). Portanto, o estudo de diferentes vias metabólicas relacionadas ao processo de
iniciação de perpetuação da fibrose hepática se torna essencial no desenvolvimento de tratamentos
suplementares para as doenças hepáticas. Dentro deste contexto, foi investigada a via metabólica da
síntese de ácido graxo de novo, como mencionado anteriormente, focando na proteína FASN e seu
inibidor, o fármaco triclosan.
Os resultados deste estudo apontaram a síntese de ácido graxo de novo como uma via metabólica
importante no desenvolvimento de novas terapias das doenças hepáticas. O TCS foi recentemente
retirado da lista de compostos aprovados pela FDA por apresentar risco à saúde pública (FDA, 2016).
Os resultados apresentados neste estudo sugerem que este composto na concentração 50 µM pode
ser citotóxico em células LX-2, indicando a necessidade de maiores estudos dos seus efeitos.
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Por outro lado, em nossas análises a proteína FASN se mostrou importante alvo terapêutico
devido a sua função no controle do fornecimento de energia para o processo de fibrose hepática, e,
em longo prazo, pode subsidiar o desenvolvimento de novos fármacos. Pouco se conhece sobre a via
metabólica da fibrose hepática devido à complexidade do processo fibrosante, com a interação de
diferentes moléculas e vias metabólicas, apontando a necessidade de cada vez mais estudos.
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