determinação de ivermectina em amostras de

ARS VETERINARIA, 16(2):112-117, 2000.
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DETERMINAÇÃO DE IVERMECTINA EM AMOSTRAS DE
PLASMA BOVINO PARA FINS DE ESTUDO DE
BIOEQUIVALÊNCIA
(DETERMINATION OF IVERMECTIN IN BOVINE PLASMA
FOR BIOEQUIVALENCY STUDIES)
L. B. COUTO1, R. G. BARBOSA1, L. R. L. PEREIRA1, P. C. B. REZENDE2, A. J. COSTA2
RESUMO
O presente trabalho avaliou a bioequivalência de duas formulações farmacêuticas, para uso veterinário, contendo
Ivermectina 1%, sendo uma delas como referência. As concentrações plasmáticas de Ivermectina, em 504 amostras de
sangue colhidas de 18 bovinos, distribuídos em dois grupos, foram determinadas por cromatografia líquida de alta eficiência
com detector de fluorescência, após processo de derivatização. Nenhuma alteração clínica ou hematológica (hematócrito,
contagem de leucócitos e níveis de uréia) foi observada nos bovinos medicados com os dois compostos. Segundo os
parâmetros farmacocinéticos determinados conforme a legislação vigente, que regula a produção de medicamentos genéricos
para humanos, as duas formulações avaliadas mostraram-se bioequivalentes.
PALAVRAS- CHAVE: Ivermectina, bioequivalência, exames hematológicos, bovinos.
SUMMARY
The present work evaluated the bioequivalency of two commercial 1% Ivermectin formulae, one used as reference
product. The plasmatic concentrations of Ivermectin, in 504 blood samples taken from 18 steers, distributed in two groups,
were determined by high performance liquid chromatography (HPLC), with fluorescence detector, after a derivation process.
Clinical and hematological (hematocrit, white cell count and blood urea nitrogen levels) examination showed no alterations
in the animals medicated with both formulations. The pharmacokinetic parameters, determined according to brazilian law
that regulates the production of generic medicaments for humans, showed that both evaluated formulations to be bioequivalent.
KEY-WORDS: Ivermectin, bioequivalency, hematological analysis, cattle.
INTRODUÇÃO
As avermectinas são lactonas macrocíclicas,
estruturalmente complexas, porém, estreitamente
relacionadas entre si. A ivermectina (CAS70288-86-7) faz
parte deste grupo de compostos e foi introduzida como
fármaco antiparasitário em 1981 (CAMPBELL, 1989). A
fermentação do actinomiceto Streptomyces avermitilis
produz quatro pares homólogos de compostos
estreitamente relacionados, um dos quais serve de base
para o análogo semi-sintético 22, 23-dihidro avermectin
B1, o qual tem sido usado pela designação genérica de
ivermectina. Esse fármaco, dotado de potente atividade
antiparasitária, tem se mostrado eficaz no tratamento contra
um grande espectro de endo e ectoparasitos (CAMPBELL,
1989, SILVA et al. 1995, MEEUS et al., 1997; MILLER
1 Professores de Farmacologia – Curso de Ciências Farmacêuticas – Universidade de Ribeirão Preto – 14096-380, Ribeirão
Preto, SP, Brasil – e-mail: [email protected]
2 Centro de Pesquisas em Sanidade Animal – CPPAR/Departamento de Patologia Veterinária – FCAVJ - UNESP
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ARS VETERINARIA, 16(2):112-117, 2000.
et al., 1997; WILLIAMS et al., 1999; LIFSCHITZ et al.,
1999a; LIFSCHITZ et al., 1999b; ANZIANI et al., 2000;
LIFSCHITZ et al, 2000). Segundo ARANCÍBIA, (1992)
e STOPIRTIS & CONSIGLIERI (1995), parâmetros
farmacocinéticos, como área sob a curva do gráfico de
concentração plasmática do fármaco analisado em função
do tempo, concentração máxima atingida no plasma em
função do tempo, tempo no qual a concentração máxima
foi atingida, além de tempos de meia-vida de eliminação e
coeficiente de variação, são preconizados para estudos de
biodisponibilidade e bioequivalência. De acordo com a
Lei número 9787 (Regulamentação de Medicamentos
Genéricos), de 03 de Agosto de 1999, a biodisponibilidade
está relacionada à “velocidade e à extensão de absorção
de um princípio ativo em uma forma de dosagem a partir
de sua curva de concentração/tempo na circulação
sistêmica ou sua excreção na urina”.
A ivermectina tem sido determinada em
amostras de plasma por cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE) com detector de fluorescência, após
processo de derivatização (MONTIGNY et al, 1990;
RABEL et al, 1993; REISING 1998).
No presente trabalho foi avaliada a
bioequivalência de duas formulações de Ivermectina 1%*,
sendo uma delas como referência, em amostras de plasma
de bovinos.
MATERIAL E MÉTODOS
Bovinos
Foram selecionados 18 bovinos da raça Nelore,
fêmeas, com idade aproximada de 8 a 12 meses, os quais
não haviam recebido tratamento com qualquer lactona
macrocíclica nos últimos seis meses. Os animais foram
pesados e, após identificação com brincos plásticos
numerados, listados em ordem decrescente de acordo com
o peso individual. Em seguida, os primeiros dois animais
foram alocados um para cada grupo e, assim, por diante
até que, ao final, se obtivesse dois grupos de nove animais
com pesos médios semelhantes. Os bovinos foram
instalados em baias individuais onde permaneceram
durante o período experimental.
Por sorteio, um dos grupos (I) de bovinos recebeu
o tratamento com a formulação contendo 1% de
Ivermectina referência* (Partida: 130/98) e o outro grupo
(II) outra formulação também contendo Ivermectina 1%* *
(Partida 010/99). Os animais foram medicados, via
subcutânea, de acordo com as dosagens recomendadas
pelos fabricantes (200μg/kg). Após a administração dos
medicamentos, os animais foram observados diariamente
_________________________________________________________________________________________________
*
Ivomec - Merial Saúde Animal Ltda. (referência)
Ivermectina 1% Ouro Fino – Produtos Veterinários Ouro Fino Ltda.
**
até o término do período experimental, anotando-se
quaisquer sinais clínicos que eventualmente pudessem
apresentar.
Análises hematológicas
Para avaliação de parâmetros hematológicos
(hematócrito, contagem de leucócitos e níveis de uréia)
foram colhidas amostras de sangue, em todos os animais,
imediatamente antes dos tratamentos e no final do período
experimental. As determinações hematológicas foram
realizadas de acordo com KANEKO (1989).
Fases experimentais (I e II)
Fase I
Amostras de sangue foram colhidas, de todos os
animais, na seguinte periodicidade: 1, 3, 6, 12, 24, 48, 72
horas, 5, 7, 9, 14, 21 e 28 dias pós-tratamento. As amostras
de plasma obtidas foram armazenadas a -20oC, para
posteriores análises dos níveis plasmáticos dos fármacos
administrados.
Fase II
No 28o dia pós-tratamento, após a última colheita
de sangue (Fase I), os animais foram mantidos nas baias e
não receberam nenhum tipo de medicação por 29 dias.
Este “intervalo” foi considerado suficiente para a completa
eliminação dos fármacos. No 21o dia deste “intervalo” foi
realizada uma colheita de sangue para confirmação da
baixa concentração plasmática dos fármacos aplicados.
Decorridos 29 dias de intervalo dos tratamentos,
iniciou-se a segunda fase do experimento (Fase II). Nesta,
manteve-se os mesmos grupos, com os mesmos animais,
porém os tratamentos foram invertidos, ou seja, cada
animal foi medicado com a formulação diferente daquela
recebida na primeira fase. Antes da inversão dos
tratamentos, todos os animais foram novamente pesados
para cálculo das dosagens a serem administradas. Realizouse, ainda, nesta segunda fase, colheitas de sangue de cada
bovino, na mesma periodicidade estabelecida na primeira
fase, para análises hematológicas e níveis plasmáticos de
ivermectina.
Determinação de Ivermectina por Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
A 1,0 mL de plasma foram adicionados 50 μL de
padrão interno, 1,0 mL de solução de acetona; água (50:50
v/v) e 6,0 mL de isooctano em um tubo de vidro, cônico,
com tampa esmerilhada. A extração foi realizada sob
agitação por 10 minutos. Após centrifugação, a fase
orgânica foi separada e evaporada (50° C) em tubo de vidro
silanizado. O resíduo seco foi reconstituído com 100 μL
da mistura derivatizante [ dimetilformamida / anidrido
acético / 1 – metilmidazol (9:3:2 v/v/v)] e aquecido a 100°
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C durante 1 hora. Após o resfriamento, 1,0 mL de
clorofórmio foi adicionado ao tubo e agitado em mixer. O
extrato obtido pela derivatização (de cor marrom), foi
adicionado em colunas de sílica pré-condicionadas com
3,0 mL de clorofórmio. A eluição foi realizada utilizandose 8,0 mL de clorofórmio. O eluato purificado foi
evaporado (50°C) e reconstituído com 100 μL de metanol
e uma alíquota de 50 μL foi injetada no CLAE Varian
9012, detector de fluorescência Varian 9070 e
comprimentos de onda de 364 nm e 440 nm de excitação
e emissão, respectivamente. Os compostos foram
separados em coluna C18 Varian (250,0 x 4,6 mm) (5,0
μm) e fase móvel, metanol / água (95:5 v/v) com fluxo de
1,8 mL/minuto. Todas estas análises foram realizadas no
Laboratório de Biofarmacotoxicologia da Universidade de
Ribeirão Preto - UNAERP.
zero até o último tempo de colheita, C*, à concentração
plasmática neste último tempo e Kel, a constante de
eliminação, determinada por meio da expressão
matemática: Kel = 0,693 / t½ el. Os tempos de meia-vida de
eliminação (t½ el.) foram obtidos graficamente relacionandose os logaritmos das concentrações plasmáticas dos
fármacos em função do tempo (h). Os valores de MRT
(Mean Residence Time) foram determinados através da
seguinte expressão matemática: MRT = AUMC0-∞/AUC0∞, onde AUMC0-∞ = ASC0-t + C*.t* / Kel + C* / Kel2. (C*.t*
representa a concentração do produto no último tempo
avaliado de colheita). O coeficiente de variação (CV) foi
determinado segundo a expressão matemática: CV = Cmáx
/ ASC0-t (SRINIVASU et al, 2000).
Análise estatística
Foi realizada através da análise de variância
(ANOVA) e dois testes estatísticos adicionais para
comparações pareadas entre as médias (Test t e Tuckey),
seguindo o que é sugerido pela Legislação vigente no
Brasil, que regula a produção de medicamentos genéricos
para humanos, como também o que preconiza o Federal
Drug Administration (FDA), E.U.A.
Estabilidade de Ivermectina em amostras de plasma
Amostras de plasma bovino de referência, livres
de ivermectina, foram enriquecidas com os fármacos em
estudo, nas concentrações de 25 ng/mL. Estas amostras
foram armazenadas em freezer e a cada sete dias, durante
dois meses, uma fração representativa (1mL) foi
descongelada e determinada a concentração de
ivermectina, segundo a metodologia anteriormente citada.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Análises farmacocinéticas
Neste estudo foi considerada a biodisponibilidade
absoluta, avaliada pela área sob a curva do tempo zero ao
infinito e definida pela equação: ASC0-∞ = ASC0-t + C*/
Kel, onde ASC0-t corresponde à área sob a curva do tempo
Parâmetros clínicos e hematológicos
Os resultados dos exames clínicos e
hematológicos (hematócrito, contagem de leucócitos e
uréia), realizados em todos os animais, no início e
Tabela 1 - Valores hematológicos e ponderais obtidos de bovinos antes e imediatamente após tratamento (200 μg/kg) com
duas formulações de ivermectina. UNAERP, Ribeirão Preto - SP, Brasil.
IVERMECTIN**
IVERMECTIN*
o
N dos
b o v in o s
96
98
250
86
237
100
82
84
97
m é d ia
83
247
238
94
243
95
249
85
99
m é d ia
V o lu m e
in je ta d o (m L )
2 ,9 2
2 ,6 0
2 ,6 0
2 ,5 0
2 ,4 4
2 ,1 4
2 ,1 4
2 ,0 6
2 ,0 2
2 ,3 8
2 ,8 8
2 ,8 4
2 ,5 6
2 ,5 0
2 ,3 0
2 ,2 4
2 ,1 4
2 ,1 0
1 ,8 4
2 ,3 8
A n te s d o T ra ta m e n to
H e m a to c rito (% )
35
43
34
37
31
30
39
40
42
4 ,0 9
36
41
41
39
32
44
38
35
42
3 8 ,6 7
-1
L e u c ó c ito (μ l )
9100
9800
10000
11800
11900
6500
9700
8800
9500
1 0 7 5 ,3 1
11000
11800
11700
10000
11700
9500
10000
9200
7700
1 0 2 8 8 ,8 9
*Ivomec injetável -Merial Saúde Animal Ltda.
** Ivermectina 1% Ouro Fino - Produtos Veterinários Ouro Fino Ltda.
***NS= não significativo (P > 0.05)
A p ó s o tra ta m e n to
U ré ia (m g /d l)
1 8 ,9 0
2 3 ,8 0
1 8 ,8 0
3 1 ,9 0
2 7 ,3 0
2 8 ,9 0
2 6 ,9 0
2 2 ,9 0
2 3 ,5 0
2 ,7 5
2 2 ,8 9
2 3 ,6 0
3 7 ,6 0
3 9 ,0 0
2 7 ,8 0
3 9 ,9 0
3 5 ,9 0
2 4 ,8 0
1 7 ,9 0
2 9 ,9 3
H e m a to c rito (% )
38
44
32
38
41
35
44
43
35
4 ,3 2
43
40
39
35
29
34
24
34
33
3 4 ,5 6
-1
L e u c ó c ito (μ l )
6550
8900
5800
11950
10000
4900
8200
9700
8400
9 1 8 ,5 2
10000
7550
11950
7000
9060
6600
11300
6900
9000
8 8 1 7 ,7 8
U ré ia (m g /d l)
3 2 ,8 0
2 4 ,8 0
2 1 ,8 0
2 9 ,7 0
3 2 ,3 0
2 8 ,7 0
1 8 ,9 0
1 7 ,9 0
4 0 ,3 0
3 ,0 5
1 2 ,9 0
3 2 ,4 0
2 6 ,8 0
3 6 ,8 0
2 4 ,8 0
2 7 ,8 0
2 3 ,7 0
2 6 ,9 0
3 1 ,6 0
2 7 ,0 8
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ARS VETERINARIA, 16(2):112-117, 2000.
Tabela 2 - Concentrações de ivermectina (ng/mL) em amostras de plasma de bovinos medicados com a formulação* Produtos Veterinários Ouro Fino Ltda (Fases I e II). UNAERP, Ribeirão Preto – SP, Brasil.
Tabela 3 - Concentrações de ivermectina (ng/mL) em amostras de plasma de bovinos medicados com a formulação* –
Merial Saúde Animal Ltda (Fases I e II). UNAERP, Ribeirão Preto – SP, Brasil.
imediatamente após o período experimental (Tabela 1),
demonstraram que os mesmos apresentavam-se dentro dos
parâmetros de normalidade para a espécie bovina
(KANEKO, 1989).
Determinação de Ivermectina por CLAE
O método analítico desenvolvido apresentou
sensibilidade (limite de detecção 5,0 ng/mL) e
especificidade (ausência de interferentes como compostos
endógenos presentes no plasma ou resíduos de reagentes
utilizados no processo de extração). A linearidade foi
confirmada no intervalo de 5,0 a 80 ng/mL pelo coeficiente
de correlação r = 0,998. A repetibilidade analítica
(precisão) foi avaliada através da determinação dos
coeficientes de variação, os quais mostraram valores
inferiores a 10 %. As concentrações plasmáticas de
Ivermectina 1% (Produtos Veterinários Ouro Fino Ltda) e
de IvomecÒ (Merial Saúde Animal Ltda) nas diferentes
ARS VETERINARIA, 16(2):112-117, 2000.
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Tabela 4 - Parâmetros farmacocinéticos obtidos pela administração subcutânea de 200μg/kg de Ivermectina 1% (Produtos
Veterinários Ouro Fino Ltda.) e Ivomec® (Merial Saúde Animal Ltda.), em dose única, em 18 bovinos.
T ra ta m e n to
ASC
ASC
0 -∞
CV
0 -t
M RT
( n g .h .m l-1 )
( n g .h .m l -1 )
(h )
T
1 /2 e l.
(h )
T
m áx
( n g .h .m l-1 )
C
m áx.
( n g /.m l)
M é d ia ± d e s v io p a d rã o
Iv e rm e c tin a
a 1%
F ase I
Iv e rm e c tin a
a 1%
F a s e II
Iv o m e c
F ase I
1 2 .7 6 5 ,1 8
± 3 .2 2 2 ,1 8
1 1 .6 7 6 ,7 7
± 3 .1 4 4 ,9 9
0 ,0 0 3 6
± 0 ,0 0 1 3
8 6 ,2 8
± 3 7 ,9 9
1 3 6 ,0 0
± 3 7 ,0 4
5 3 ,3 3
± 1 0 ,5 8
4 6 ,7 8
± 1 6 ,6 4
1 7 .9 2 0 ,0 9
± 2 .0 6 7 .0 0
1 6 .6 2 3 ,1 0
± 1 .8 4 7 ,0 6
0 ,0 0 3 7
± 0 ,0 0 0 5
7 2 ,5 1
± 4 8 ,3 5
2 4 8 ,0 0
± 4 8 ,6 5
5 3 ,3 3
± 1 0 ,5 8
6 0 ,7 2
± 1 3 ,8 4
1 2 .3 3 8 ,6 7
± 3 .2 4 7 ,0 0
1 0 .6 4 2 ,2 6
± 2 .9 1 9 ,4 7
0 ,0 3 3
± 0 ,0 0 0 7
1 6 9 ,7 2
± 1 2 4 ,9 5
2 0 5 ,0 0
± 7 1 ,1 0
5 3 ,3 3
± 1 0 ,5 8
3 3 ,1 6
± 1 0 ,9 8
Iv o m e c
F a s e II
1 4 .6 6 7 ,2 6
± 3 .1 7 6 ,0 5
1 3 .7 1 9 ,4 9
± 3 .2 4 0 ,1 1
0 ,0 4 2
± 0 ,0 0 0 6
6 7 ,6 9
± 4 5 ,5 8
1 2 9 ,0 0
± 4 8 ,0 1
6 4 ,0 0
± 1 2 ,0 0
5 8 ,0 0
± 1 6 ,4 2
Concentrações plasmáticas (ng/mL)
* O s c á lc u lo s fo r a m r e a liz a d o s e m m o d e lo n ã o -c o m p a r tim e n ta l
70
Ivermectina Fase I
Seqüência1
60
Seqüência2
Ivermectina Fase II
50
Seqüência3
Ivomec Fase I
Seqüência4
Ivomec Fase II
40
30
20
10
0
0
200
400
600
800
Tempo (h)
Figura 1 - Concentrações plasmáticas de Ivermectina 1%
(Produtos Veterinários Ouro Fino Ltda.) e
Ivomec ® (Merial Saúde Animal Ltda.) em
bovinos. Concentrações menores do que 5 ng/
mL não foram consideradas.
fases do experimento são apresentadas nas Tabelas 2 e 3.
As determinações das concentrações plasmáticas
do referido fármaco, nas duas formulações, no período
denominado “intervalo”, já definido ao longo deste texto,
foram menores que o limite de detecção do método
analítico (5,0 ng/mL).
Estabilidade de Ivermectina em amostras de plasma
As concentrações de ivermectina determinadas
em amostras de plasma, armazenadas em freezer, durante
60 dias, apresentaram variações menores que 10%. Por
estes resultados, pode-se constatar a estabilidade da
ivermectina, nas condições avaliadas.
Análises farmacocinéticas
As curvas das médias das concentrações
plasmáticas do princípio ativo, contido nas duas
formulações avaliadas, em bovinos, em função do tempo,
estão representadas na Figura 1. As concentrações
plasmáticas máximas (Cmáx), determinadas para cada
animal de experimentação, foram atingidas em 53,33 h
(Tmáx), em média, após as administrações de Ivermectina
1% (Produtos Veterinários Ouro Fino Ltda.) nas fases I e
II.
Para o Ivomec® (Merial Saúde Animal Ltda.) na
Fase I obteve-se os mesmos valores de (Tmáx) encontrados
para a Ivermectina 1% (Produtos Veterinários Ouro Fino
Ltda.), sendo que, no entanto, na fase II, o valor de (Tmáx)
foi de 64,00 h.
Dentre os parâmetros farmacocinéticos propostos por
STORPIRTIS & CONSIGLIERI (1995), GLEITER et al
(1998) e OLLING et al (1999), para fins de comparação
em estudos de biodisponibilidade entre medicamentos,
foram analisados no presente estudo o Tmáx, a Cmáx, a ASC0, a ASC0-∞, o coeficiente de variação (CV) e o MRT (Mean
t
Residence Time). Para todos os parâmetros
farmacocinéticos citados, os valores obtidos, e
representados na Tabela 4, não apresentaram diferenças
estatisticamente significativas (P ≤ 0,05).
Outro dado que pode ser analisado neste trabalho
e que reflete a extensão da absorção dos medicamentos
em estudo é a razão ASCo-t / ASC0-∞. Segundo a Legislação
vigente no Brasil, que regula a produção de medicamentos
genéricos para humanos, e também o preconizado pelo
Federal Drug Administration (FDA) é estabelecido o
limite mínimo de 80% para os valores da razão ASCo-t /
ASC0-∞. No presente estudo, a Ivermectina 1% (Produtos
Veterinários Ouro Fino Ltda.) mostrou valores de 91% e
93% para as fases I e II, respectivamente. Para o Ivomec®
(Merial Saúde Animal Ltda.), o parâmetro acima referido
apresentou valores correspondentes a 86% e 93% para as
fases I e II, respectivamente. Assim, a análise dos dados
farmacocinéticos obtidos sugere, nas condições estudadas,
a bioequivalência entre as duas formulações.
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ARS VETERINARIA, 16(2):112-117, 2000.
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