Aula Microscópia - Revisão - Alunos.

Microscopia
Faculdade Vértice – Univértix
Observações Iniciais
Curso: Medicina Veterinária
Simples - lupa;
Microscopia
Aula Revisão
Composto
–
Junção
de
dois
sistemas
de
lentes
convergentes.
Invenção do microscópio é atribuída a Antoine von
Professor, Enfº
Enfº.. Laudinei de
Carvalho Gomes
Matipó,, fevereiro de 2014.
Matipó
e-mail:
[email protected]
Leeuwenhoek e Robert Hooke no séc. XVII.
Teorias de Schleiden e Schwann, no século XIX;
Técnicas e metodologias – citoquímicas.
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Microscopia
Microscopia
Observações Iniciais
Unidades de Medidas Usadas
Estruturas micro e macroscópicas;
São o micrômetro (µm) – M. O.;
Nanômetro (ηm) e o Angstrom (Å) – M. E.;
1 µm = 10-3 mm (0,001 mm) = 10-6 m
1 ηm = 10-3µm = 10-6 mm (0,000001 mm) = 10-9 m
1 Å = 10-1 ηm = 10-4 µm = 10-7 mm (0,0000001 mm) = 10-10 m
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Microscopia
Microscopia
Unidades de Medidas Usadas
Formação da Imagem
Em termos de formação de imagem é
fundamental percebermos o significado de três
conceitos muito importantes, que são o poder de
ampliação, o poder de resolução e o limite de
resolução.
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Microscopia
Microscopia
Formação da Imagem
Poder de Ampliação
Ampliada – Simétrica – Invertida – Virtual
Capacidade de um aparelho aumentar n
Imagem II
Imagem I
objeto
F
F
C
Fonte
de luz
F
C
C
objetiva
ocular
condensadora
vezes uma imagem. Na microscopia é
dado pelo produto entre a ampliação
Fonte de luz → Lente condensadora → Lentes objetivas → Lente ocular
das oculares e a ampliação das
O posicionamento estratégico das lentes no microscópio proporcionam a
formação de uma imagem Invertida
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objetivas.
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Microscopia
Microscopia
Poder de Resoluação
Limite de Resolução
Capacidade de individualização de estruturas (pontos);
Capacidade de um aparelho fornecer imagens
distintas de dois pontos. Refere-se à riqueza de
detalhes da imagem obtida, ou seja, à
Inversamente proporcional ao limite de ampliação da
imagem;
Olho humano 0,1 mm;
capacidade do microscópio fornecer imagens
Onde:
K = uma constante experimental estimada em
0,61;
λ = comprimento de onda da energia utilizada
(luz ou feixes de elétrons)
nítidas, com detalhes estruturais.
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Microscopia
Limite de Resolução
Limite de Resolução
Resolução é diretamente proporcional ao comprimento de onda;
Relação de meio e lâmina – índice de refração.
Valores do índice de refração para diferentes meios
Redução do comprimento de onda (alteração da fonte luminosa) e/ou
aumento da abertura numérica;
AN = 0,12 (4x)
AN = 0,34 (10x)
AN = 0,60 (40x)
AN = acima de 1 (100x)
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AN = abertura numérica da lente objetiva.
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Material
Índice de Refração
Ar
1.0003
Água
1.33
Glicerol
1.47
Óleo de imersão
1.515
Vidro
1.52
Diamante
2.42
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Microscopia
Noções de Profundidade de Campo
Microscopia Eletrônica
Regiões do plano focal que permanecem em foco;
Relação de profundidade de campo e abertura numérica;
Devido à pequena profundidade de campo dessa objetiva, um
reduzido número de planos de um objeto será focalizado
simultaneamente;
Maior profundidade de campo é obtida utilizando
objetivas
com menores aberturas numéricas, ou diminuindo-se a abertura
do diafragma.
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Microscopia
Microscopia
Componentes Microscopia Eletrônica
Formação da imagem ao Microscópio eletrônico
CANHÃO ELETRÔNICO =
Fonte de elétrons → Caminha por um
pequeno fragmento de fio onde
sistema de lentes eletromagnéticas
se aplica alta voltagem. Emite
(coluna) → Feixe de elétrons →
Acelerados → Lente condensadora →
elétrons por aquecimento.
Amostra
LENTES = bobina formada
→
Lentes
objetivas
(primeira imagem aumentada da
amostra) → Lentes intermediarias /
por milhares de voltas de fio,
projetivas
por onde passa uma corrente
imagem) → Imagem ampliada →
(formação
final
da
Anteparo fluorescente / monitor
elétrica.
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Microscopia
Microscópio Eletrônico de Transmissão - MET
Microscópio Eletrônico de Transmissão - MET
Imagem formada simultaneamente à passagem do feixe de luz
Os elétrons atravessam o espécime;
Alguns dos elétrons são espalhados outros convergem para
formar a imagem;
Permite definição de imagens intracelulares;
Intervalo de aumento: 1.000x a 200.000x;
LR = 1nm.
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Microscopia
Microscópio Eletrônico de Varredura - MEV
Microscópio Eletrônico de Varredura - MEV
O feixe de elétrons varre o espécime;
Imagem constituída em seqüência no tempo;
Indispensável em pesquisas de: Taxonomia de insetos e fungos;
Morfologia de polens e superfície de diversas estruturas de plantas e
animais;
Grande profundidade de campo: micrografias tridimensional;
Escala de aumentos: 10x a 100.000x;
LR = 10nm.
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Microscopia
Microscopia
MET x MEV
MET x MEV
O MET – estudos em nível molecular, e estruturas subcelulares, é um
Coloração negativa:
vírus
instrumento complexo, os espécimes devem ser ultrafinos, informações
Tecido muscular
em três dimensões dificultadas.
O MEV – estudo topográficos, pouca informações interna.
Guelras de
um peixe
Células epiteliais
Cílio
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Hepátócito:
Complexo de Golgi
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Microscopia
MO – Objeto de nosso estudo
MO – Objeto de nosso estudo
Serve para ampliar um objeto.
Funciona com um conjunto de lentes (ocular e
objetiva) que ampliam a imagem.
A Iluminação é natural ou artificial.
É constituído por uma parte mecânica que
suporta e permite controlar uma parte óptica que
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amplia as imagens.
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Microscopia
MO – Objeto de nosso estudo
MO – Objeto de nosso estudo
Ocular
Oculares
Canhão
Revólver
Braço
Objetivas
Pinças
Platina
Condensador
Parafuso macromético
Diafragma
Parafuso micromético
Fonte luminosa
Ampliam a imagem
fornecida pelo sistema de
objetivas.
Pé ou base
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MO – Objeto de nosso estudo
MO – Objeto de nosso estudo
Canhão ou tubo
Braço
Serve de suporte
ao sistema ocular.
Serve de suporte
à platina e ao
revólver.
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MO – Objeto de nosso estudo
MO – Objeto de nosso estudo
Objectivas
Revólver
Amplia a
imagem do
objeto que está a
ser observado.
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Serve de suporte
às objetivas e
permite a sua
mudança
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Microscopia
MO – Objeto de nosso estudo
MO – Objeto de nosso estudo
Platina
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Condensador
Serve de suporte à preparação a
observar. Tem uma abertura na
pane central (janela da platina).
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Microscopia
MO – Objeto de nosso estudo
MO – Objeto de nosso estudo
Diafragma
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Distribui regularmente no
campo da preparação a luz
que atravessa o diafragma
Fonte de Luz
Regula a intensidade da luz
captada pelo espelho e que
incide na preparação.
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Microscopia
MO – Objeto de nosso estudo
MO – Objeto de nosso estudo
Parafusos Macrométrico e Micrométrico
Base ou pé
Permite movimentos (de maior
ou menor amplitude) de
aproximação ou afastamento
entre a preparação e as
objetivas.
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Constitui a base
de suporte de
todos os
elementos do
microscópio.
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Microscopia
Microscopia
Observações ao Microscópio
Diferenças básicas entre o M. O. e M. E
MO
Luz visível
(fótons)
Ópticas
(cristal)
Fonte
Luminosa
Diatomáceas
Volvox
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Ameba
Protozoários
Lentes
Ovo em
desenvolvimento
Raiz de um cabelo
Visualização
Direta
Material
Fresco ou
fixado
ME
Feixes de elétrons
Bobinas
(Eletromagnéticas)
Tela de
computador
Fixado
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Microscopia
Coloração do Material
Esfregaço
Montagem total: células inteiras (órgãos de insetos, glândulas
salivares);
Esfregaço: camada de material líquido sobre a lâmina (sangue,
sêmen);
Espalhamento: raspagem de camadas superficiais de mucosas
(papanicolau);
Esmagamento: estudo de divisões celulares;
Decalque: colocar sobre a lâmina núcleos inteiros. Estudar DNA.
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Microscopia
Microscopia
Esmagamento
Fixação
Preservar a célula: coagulação;
Impede
autólise
e
proliferação
de
bactérias;
Agentes fixadores: formol, álcool etílico,
álcool acético.
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Microscopia
Microscopia
Inclusão e Corte
Coloração
Corte de órgãos e tecidos: obter
Tornar visíveis os diversos componentes da célula;
material transparente.
Aparelho para corte: micrótomo
(MO) ou ultra-micrótomo (ME).
Inclusão:
apropriado
tornar
para
o
o
Afinidade
material
corte
por
grupamentos
ácidos
(cargas
negativas) das moléculas: DNA, RNA, algumas
–
solidificado.
Substâncias para inclusão: parafina
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Corantes básicos: carga positiva;
(MO) ou epóxi (ME).
proteínas;
Ex corantes básicos: hematoxilina, azul de metileno.
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Microscopia
Microscopia
Coloração
Montagem
Corantes ácidos: carga negativa;
Fechar o material entre a lâmina e a lamínula.
Afinidade por grupamentos básicos (carga positiva)
Resina solidificável: aumentar transparência e
das moléculas: proteínas citoplasmáticas;
Ex: corantes ácidos: eosina, fucsina ácida.
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conservá-los.
Ex: bálsamo-do-canadá (n = 1,535).
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Microscopia
Exame a Fresco
Exame a Fresco
Observação ao microscópio de células, pequenos organismos
vivos ou fragmentos de tecidos “vivos”;
Constitui um procedimento intermediário entre a
observação a fresco e a observação após a fixação.
Líquidos naturais: água doce, água do mar, soro sanguíneo,
Uso de corantes não tóxicos:
etc...;
Corantes vitais: azul de metileno
Líquidos artificiais: soro fisiológico;
vermelho neutro
Vantagem:contraprova, rápido, simples;
Restrições: objetos finos e transparentes; observações rápidas.
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verde Janus
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Referências Básicas
ALBERT, B. JOHNSON, A.; LEWIS, J.; RAFF, M.; BOBERTS, K.; WALTER, P. Biologia
Molecular da Célula. 4 ed. Porto Alegre: Artmed, 2004. 1463p.
ALBERTS, B.; BRAY, D.; HOPKING, K.; JOHNSON, A.; LEWIS, J.; RAFF, M.;
ROBERTS, K.; WALTER, P. Fundamentos da Biologia Celular. 2. ed., Porto Alegre:
Artmed, 2006. 866p.
JUNQUEIRA, L.C.; CARNEIRO, J. Biologia Celular e Molecular. 8. ed., Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2005. 332P.
JUNQUEIRA, L.C.; CARNEIRO, J. Histologia básica. 7ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara
Koogan, 2004..
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