Aplicação de marcadores de ancestralidade no controle genômico
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS FACULDADE DE BIOMEDICINA DÉBORA CHRISTINA RICARDO DE OLIVEIRA FERNANDES APLICAÇÃO DE MARCADORES DE ANCESTRALIDADE NO CONTROLE GENÔMICO EM UMA INVESTIGAÇÃO SOBRE RESPOSTA FARMACOGENÉTICA À ISONIAZIDA EM PACIENTES PORTADORES DE TUBERCULOSE NO ESTADO DO PARÁ BELÉM 2010 DÉBORA CHRISTINA RICARDO DE OLIVEIRA FERNANDES APLICAÇÃO DE MARCADORES DE ANCESTRALIDADE NO CONTRLOLE GENÔMICO EM UMA INVESTIGAÇÃO SOBRE RESPOSTA FARMACOGENÉTICA À ISONIAZIDA EM PACIENTES PORTADORES DE TUBERCULOSE DO ESTADO DO PARÁ Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Faculdade de Biomedicina da Universidade Federal do Pará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Biomedicina. Orientador: Profº Dr Sidney Emanuel Batista dos Santos BELÉM 2010 DÉBORA CHRISTINA RICARDO DE OLIVEIRA FERNANDES APLICAÇÃO DE MARCADORES DE ANCESTRALIDADE NO CONTRLOLE GENÔMICO EM UMA INVESTIGAÇÃO SOBRE RESPOSTA FARMACOGENÉTICA À ISONIAZIDA EM PACIENTES PORTADORES DE TUBERCULOSE DO ESTADO DO PARÁ Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Faculdade de Biomedicina da Universidade Federal do Pará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Biomedicina, aprovado com o conceito __________________. Belém (PA), 06 de dezembro de 2010. Banca Examinadora: ____________________________________ Profº. Dr. Sidney Emanuel Batista dos Santos ICB – UFPA - (orientador) _____________________________________ Profª Drª. Andrea Kely Campos Ribeiro dos Santos ICB-UFPA _____________________________________ Profº. Dr. Rommel Mario Rodríguez Burbano ICB-UFPA ______________________________________ Profª Drª Greice de Lemos Cardoso – suplente ICB-UFPA i “Dedico este trabalho a pessoa mais maravilhosa e amorosa do mundo, minha mãe, que sempre esteve ao meu lado e me apoiou em todos os momentos da minha vida, me dando muita força e garra para alcançar com honestidade os meus objetivos.” ii AGRADECIMENTO Agradeço a Deus que me iluminou durante estes quatros anos de caminhada, por toda força e garra que me forneceu, nos momentos mais difíceis, que não foram poucos, sempre tive a certeza de que Ele estava ao meu lado. A todos que contribuíram diretamente ou indiretamente para a realização deste trabalho. Imensamente ao meu orientador Profº. Dr. Sidney Santos, por todas as oportunidades fornecidas nesses anos de faculdade, por todos os apoios, incentivos, por todas as aulas, por todas as “chamadas de atenção”, tudo ajudou bastante na minha formação. À Profª Drª. Andrea Santos e ao Profº. Dr. João Guerreiro por incansáveis dúvidas tirada, por toda atenção e oportunidade de começar o meu primeiro estágio no laboratório. Ao “meu orientador, meu amigo” Profº. Ms. Ney Santos por tudo que me ajudou, ensinou, apoiou, incentivou, por todas as explicações (que não foram poucas) e por todas as aulas. Obrigada por toda sua amizade, carinho e preocupação em todos os momentos de minha vida. Sua ajuda foi indispensável para a realização deste trabalho. Ao PIBIC/CNPq pela bolsa de Iniciação Científica, que durante três anos, me deu apoio financeiro que foi necessário para ajudar no decorrer da minha formação. A todos os meus amigos do Laboratório Genética Humana e Médica (LGHM) por sempre estarem comigo, fazendo meus dias mais alegres em um clima agradável e tranqüilo de muita amizade. A todos os meus professores e amigos que estiveram ao meu lado nestes longos e inesquecíveis quatro anos, principalmente as minhas amigas de turma (amigas do G7), por todos os momentos de estudos, diversão e tristezas que passamos juntas. À minha grande e unida família! À todas as minhas tias por todos os conselhos, apoios, carinhos e palavras de incentivos. Por todos os momentos bons e ruins que sempre passamos juntas, sempre muito unidas e amorosas. E imensamente à minha madrinha por todo apoio, ajuda, amor e carinho de segunda mãe em todos os momentos de minha vida. A todos os meus primos-irmãos, que sempre me divertiram muito, obrigada por todo carinho, amor e companheirismo de todos. Ao meu pai e meu irmão por estarem presentes em minha vida. Amo muito vocês! Agradeço em especial à minha MÃE por tudo! Por todo o amor único e incondicional e por sempre está ao meu lado quando preciso. Obrigada por esta vida, pelos iii ensinamentos, pela dedicação quase que exclusiva, pelas brigas e puxões de orelha na hora certa, pela confiança, força e carinho. É o meu tudo, a minha vida! Amo-te mãezinha! Aos meus avos por todo carinho, preocupação e atenção comigo. Especialmente ao meu pai-avô por tudo que realizou em minha vida. É a minha fortaleza o alicerce da nossa casa, suas palavras calmas e tranqüilas sempre me confortando e apoiando em todos os momentos. Obrigado por sempre estarem comigo, vocês foram e sempre serão essenciais e indispensáveis em minha vida. Amo muito vocês! Agradeço também a um anjo, que nossa família ganhou de presente. Kaique, meu eterno primo amado, por todos os momentos de alegria, maravilhosos que vivi ao seu lado, sempre que estava triste, bastava ver um sorriso teu para o meu dia ficar mais alegre. Ensinaste e despertaste os mais puros e verdadeiros de todos os sentimentos, o amor, a humildade e a paciência em todos nós. Obrigada por ter existido em minha vida, tenho a certeza que sempre vai cuidar e me proteger. Pra sempre te amarei. iv SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS E TABELAS ................................................................... vi LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS OU SÍMBOLOS .................................. vii RESUMO .......................................................................................................... viii 1. INTRODUÇÃO .............................................................................................. 1 1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS ...................................................................... 1 1.2 CLÍNICA DA TUBERCULOSE .................................................................... 3 1.2.1 Tuberculose Pulmonar (TB) .................................................................. 3 1.2.2 Tuberculose Extrapulmonar (TEP) ....................................................... 3 1.3 DIAGNÓSTICO DA TUBERCULOSE ......................................................... 4 1.4 EPIDEMIOLOGIA DA TUBERCULOSE ...................................................... 4 1.5 TRATAMENTO DA TUBERCULOSE .......................................................... 7 1.5.1 Efeitos Adversos aos Fármacos Antituberculose .............................. 8 1.6 FARMACOGENÉTICA ................................................................................ 10 1.6.1 Farmacogenética da Isoniazida ............................................................ 11 1.7 CONTROLE GENÔMICO DA ANCESTRALIDADE, NOS PACIENTES PORTADORES DA TUBERCULOSE (INDEL) ................................................. 12 2. JUSTIFICATIVA ............................................................................................ 17 3. OBJETIVOS .................................................................................................. 19 3.1 OBJETIVO GERAL ..................................................................................... 19 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ....................................................................... 19 4. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................. 20 4.1 AMOSTRA ................................................................................................... 20 4.2 ASPECTOS ÉTICOS .................................................................................. 20 4.3 OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS DE SANGUE ............................................ 21 4.4 EXTRAÇÃO DE DNA .................................................................................... 21 4.5 QUANTIFICAÇÃO DO DNA ......................................................................... 21 4.6 GENOTIPAGEM ............................................................................................. 21 4.7 ANÁLISES ESTATÍSTICAS ......................................................................... 25 5. RESULTADOS ................................................................................................... 26 5.1 CONTROLE GENÔMICO DA ANCESTRALIDADE EM INDIVÍDUOS COM E SEM HEPATOTOXICIDADE ................................................................ 26 v 5.2 CONTROLE DO EFEITO DA ETNIDADE NOS INDIVÍDUOS COM E SEM HEPATOTOXICIDADE ............................................................................... 28 6. DISCUSSÃO ....................................................................................................... 31 7. CONCLUSÃO .................................................................................................... 35 8. REFERÊNCIAS .................................................................................................. 36 9. DOCUMENTOS ELETRÔNICOS ................................................................. 41 vi LISTA DE FIGURAS E TABELAS Figura 1 - Taxa de incidência de casos notificados de tuberculose no ano de 2007, nos estados do Brasil ............................................................................ 7 Figura 2 - Caminho de metabolização da INH com participação das enzimas NAT2, CYP2E1 e GSTM1 ............................................................................... 12 Figura 3 - Genotipagem conjunta de 16 marcadores de ancestralidade Européia investigados …................................................................................... 22 Figura 4 - Genotipagem conjunta de 16 marcadores de ancestralidade Indígena investigados ….................................................................................... 23 Figura 5 - Genotipagem conjunta de 16 marcadores de ancestralidade Africano investigados …..................................................................................... 24 Figura 6 - Distribuição de estimativas individual. Os vértices do triângulo representam as populações parentais. Os círculos em cores ao centro do triângulo descrevem os indivíduos com e sem hepatotoxicidade ................... 27 Figura 7 - Distribuição da ancestralidade do INDEL Europeu no grupo de pacientes com e sem hepatotoxicidade. Cada grupo é representado por uma caixa, divididos em parte superior e inferior separados por uma linha mediana, assim a caixa contém em suas partes metade (50%) dos escores da distribuição. As linhas verticais fora da caixa, tanto a maior quanto a menor, estão dentro do intervalo de 1,5 . O círculo aberto representa os valores extremos ............................................................................................... 30 Tabela 1 - Estimativa da taxa de tuberculose no ano de 2007, em diferentes países ............................................................................................................... 6 Tabela 2 - Dosagem dos fármacos antituberculose e as reações adversas mais comuns ................................................................................................... 10 Tabela 3 - Distribuição das estimativas globais de ancestralidade estratificando pacientes com e sem hepatotoxicidade .................................... 28 Tabela 4 - Modelos de regressão logística controlando o efeito da etnicidade 29 vii LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS OU SÍMBOLOS - Estima coeficiente AIDS – Síndrome da imunodeficiência adquirida ALT - Alanina-aminotransferase AST - Aspartato-aminotransferase BAAR - Bacilo álcool-ácido resistentes CO2 – Gás carbônico CYP2E1- Citocromo P450 oxidase CYP3A4 - Citocromo P450 oxidase df - Grau de liberdade DNA - Ácido desoxirribonucléico EDTA - Ácido etilenodiamino tetra-acético FST - Índice de fixação de Wright GSTM1 - Glutationa S-transferase M1 HIV - Vírus da Imunodeficiência Humana HUJBB – Hospital Universitário João de Barros Barreto IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística IC - Intervalo de Confiança INDEL - Inserção/deleção INH – Isoniazida MDR – Resistentes a múltiplas drogas MIAs - Marcadores Informativos de Ancestralidade Mtb – Mycobacterium Tuberculosis NAT2 - N-acetiltransferase 2 OMS - Organização Mundial da Saúde OR - Odds ratio (risco relativo) O2 - Oxigênio PCR - Reação em cadeia da polimerase RNA – Ácido ribonucléico SE - Erro Padrão TB – Tuberculose TEB – Tuberculose extrapulmonar WHO – Organização Mundial da Saúde viii RESUMO A tuberculose é uma das principais causas de morte no mundo, sendo responsável por cerca de 1,8 milhões de óbitos por ano em diferentes partes do mundo. A hepatotoxicidade causada pelo uso de medicamentos anti-tuberculose tem a maior taxa de mortalidade no mundo causada pelo emprego de fármacos nos tratamentos de diferentes enfermidades. Em investigações do tipo caso-controle os resultados podem ser mal interpretados em função da existência de uma estratificação populacional não identificada, entre os dois grupos investigados. Este fato é particularmente importante quando as investigações são realizadas em populações miscigenadas, como é o caso da maioria da população brasileira. Neste trabalho foi empregado um painel de 48 Marcadores (bialélicos do tipo INDEL- Inserção e Deleção de pequenos fragmentos de DNA) Informativos de Ancestralidade, para estabelecer o controle genômico de ancestralidade, em uma amostra de 135 pacientes portadores de tuberculose do Estado do Pará, todos eles tratados com o fármaco Isoniazida. Estes pacientes foram agrupados segundo a resposta medicamentosa ao tratamento: i) Grupo I, formado por pacientes que desenvolveram hepatotoxicidade medicamentosa (118 indivíduos) e; Grupo II, formado por pacientes que não desenvolveram hepatotoxicidade medicamentosa, quando condicionados ao mesmo tratamento (17 indivíduos). Todas análises foram realizadas empregando a técnica de PCR multiplex (os 48 sistemas são genotipados em três reações de PCR, seguidas de eletroforese capilar). As análises estatísticas relativas à subestruturação populacional foram realizadas empregando-se o programa STRUCTURE V e para a regressão logística foi usado o programa SPSS 14.0. Os resultados mostraram que o efeito étnico foi significativo em especial para ancestralidade européia (P=0,034), mostrando que existe subestruturação populacional entre as amostras analisadas para esta etnia. Quando as três etnias foram incluídas nas análises (Europeu, Africano e Ameríndio) o efeito dos genes investigados apresentou uma significância com risco relativo elevado (P=0,023; 95% IC1,2-18,5;OR=4,79). O modelo que incluiu apenas a variável etnicidade européia foi significativo para a associação dos genes relacionados com a metabolização do INH com hepatopatia medicamentosa (P=0,046; 95%IC1,02-11,43; OR=3,41). Concluímos que o controle genômico foi efetivamente importante para a presente investigação uma vez que foram encontradas diferenças significativas em relação à etnicidade entre os pacientes com e sem hepatotoxicidade. Palavras chave: Tuberculose, INDEL e Hepatotoxicidade. 1 1. INTRODUÇÃO 1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS: A tuberculose (TB) é uma doença infecto-contagiosa causada pelo bacilo álcool ácido resistente (BAAR) Mycobacterium tuberculosis e transmitida pelas vias aéreas, podendo acometer tanto o homem quanto os animais. A infecção e manifestação de sintomas dependem de todos os fatores biológicos intrínsecos e extrínsecos ao hospedeiro como o tempo de exposição do indivíduo sadio à fonte de infecção, do índice bacilar desta fonte e da resposta imune do hospedeiro (Fundação Nacional de Saúde, FUNASA, 2002). A presença do bacilo da tuberculose no hospedeiro induz a uma reação tissular que provoca a formação de tubérculos típicos (granulomas celulares epitelióides), advindo daí o nome da nosologia (Leão, 2004). A tuberculose é uma das principais causas de morte no mundo, sendo responsável por cerca de 1,8 milhões de óbitos por ano em diferentes partes do mundo. A hepatotoxicidade causada pelo uso de medicamentos anti-tuberculose ocorre em função do emprego de fármacos inadequados nos tratamentos de diferentes enfermidades (Global tuberculosis control- WHO, Report 2009). É conhecido o fato de que muitos indivíduos que chegam a ter contato com o bacilo causador de tuberculose manifestam os sintomas clínicos da doença (Leão, 2004). Entretanto, estima-se que um terço da população mundial apresenta formas latentes da tuberculose. Entende-se por forma latente aquela em que o indivíduo é portador do bacilo, mas não tem manifestação clínica da doença (Raviglioni, 1995). De forma inversa, em muitos casos os indivíduos chegam a desenvolver manifestações clínicas graves decorrentes da infecção pelo bacilo da tuberculose, apresentando uma evolução clínica gradualmente crônica que, se não tratada convenientemente, pode evoluir para o óbito (Leão, 2004). Com a epidemia da AIDS, a infecção por Mycobacterium tuberculosis (Mtb) aumentou o fator de risco de mortalidade em indivíduos co-infectados com HIV 2 (vírus da imunodeficiência humana). Somado a esse cenário, aproximadamente 50 milhões de pessoas são infectadas com cepas de Mtb resistentes a múltiplas drogas (MDR). Este conjunto de fatores levou a OMS, em 1995, a declarar a TB como uma emergência sanitária mundial (OMS, 2006). Apesar de apresentar ocorrência mundial, a distribuição geográfica da prevalência de tuberculose é grandemente influenciada pela situação sócioeconômica das diferentes áreas do globo. Por este motivo, nos países desenvolvidos, onde os padrões de vida são elevados e as condições de saneamento e de saúde pública são controladas a contento, a incidência e a mortalidade da tuberculose diminuíram de forma significativa. O mesmo não acontece em países menos desenvolvidos (ou mesmo em países em desenvolvimento) onde apenas a mortalidade mostrou nítido declínio, em função do progresso da quimioterapia (administração de fármacos). Nesses países, a condição inadequada de saneamento básico e de acesso à saúde pública de qualidade não permitem a redução da taxa de incidência da tuberculose (Guia de vigilância epidemiológica, 2004). Existem achados a respeito das manifestações clínicas da tuberculose, em grupos populacionais antepassados. Relatos arqueológicos encontraram evidências de tuberculose espinhal em esqueletos que datam de 8000 A.C. e de 5000 A.C encontrados em um cemitério neolítico próximo a Heidelberg, na Alemanha. A tuberculose foi descrita por diferentes filósofos e pensadores ao longo da história da humanidade, como Homero (900 A.C.), Heródoto (450 A.C.) e Hipocrates (400 A.C.). A hipótese mais corrente da entrada do bacilo da tuberculose no Brasil, sugere que o mesmo tenha sido introduzido pelos colonizadores e jesuítas, no período logo após o descobrimento (Sant´Anna, 1985). Até as primeiras décadas do século XX, a mortalidade de pacientes portadores de tuberculose era muito elevada por todo o mundo. Na segunda metade desse século, após o advento dos quimioterápicos, com a introdução da Estreptomicina, em 1940, e da Isoniazida em 1950, foi possível consolidar uma base moderna de quimioterapia, o que reduziu consideravelmente a mortalidade por tuberculose. 3 Dados retirados de publicações da Organização Mundial de Saúde (World Health Organization - WHO, 2009) relatam o aparecimento, somente no ano de 2007, de 9,27 milhões de novos casos da doença, em 196 diferentes países. Estimase que neste mesmo ano, a tuberculose foi responsável por cerca de 1,8 milhões de mortes no mundo. Estima-se, ainda que o número total de pessoas portadoras de tuberculose chegou próximo de 13,7 milhões, entre os anos de 1990 e 2007(Global tuberculosis control - WHO, Report 2009). 1.2 CLÍNICA DA TUBERCULOSE Existem diversos tipos de tuberculose, definidos em função dos diferentes órgãos que os bacilos afetam, sendo que cada uma das infecções caracterizada por um grupo de manifestações clínicas que podem ser muito diferentes entre si. 1.2.1 Tuberculose Pulmonar (TB) A tuberculose pulmonar é a forma mais frequente tanto entre adultos (90% de todos os casos), quanto nas crianças (75% dos casos). Esta doença apresenta manifestações clínicas que evoluem gradativamente com o tempo. Em fases mais avançadas é possível identificar um conjunto de manifestações clínicas que envolvem desde febre diária, tosse, dor torácica, dispnéia, sudorese, hemólise, além de emagrecimento, astenia e hipóxia (Leão, 2004). 1.2.2 Tuberculose Extrapulmonar (TEP) A forma dita extrapulmonar é caracterizada pela infecção que afeta isoladamente um órgão em particular, sem disseminação para outros órgãos ou sistemas, apesar da infecção ter como ―porta de entrada‖ quase sempre os pulmões (Capone et al., 2002). As formas mais frequêntes de tuberculose extrapulmomar são: tuberculose pleural, tuberculose ganglionar, tuberculose meníngea, e tuberculose osteoarticular. A forma de tuberculose miliar é caracterizada por ser extrapulmonar, entretanto apresenta disseminação do bacilo pelo organismo (Capone et al., 2002). 4 1.3 DIAGNÓSTICO DA TUBERCULOSE Além do diagnóstico clínico, diferentes exames laboratoriais podem auxiliar na identificação da infecção pelo bacilo da tuberculose. Os principais exames laboratoriais utilizados para diagnosticar a tuberculose são: bacteriológico; radiológico; prova tuberculínica; histopatológico; e exames específicos complementares (FUNASA, 2002). A pesquisa bacteriológica é considerada fundamental, tanto para o diagnóstico como para o controle de tratamento. A investigação bacteriológica envolve, entre outros exames: i) o exame microscópico direto do escarro, que é um método fundamental e que deve ser empregado em todos os casos de suspeita de tuberculose pulmonar; ii) cultura para micobactéria. Este tipo de cultura é indicado para os suspeitos de tuberculose pulmonar persistente, que se mostram negativos ao exame direto e para o diagnóstico de formas extrapulmonares, como meningoencefálica, renal, pleural, óssea ou ganglionar. A cultura também é indicada nos casos de suspeita de resistência bacteriana aos fármacos, seguida do teste de sensibilidade; iii) exames radiológicos; iv) prova tuberculínica; v) exames histopatológicos; vi) hemocultura; vii) teste da detecção da produção de CO2; viii) detecção de consumo de O2; ix) testes sorológicos e x) técnicas de biologia molecular (FUNASA, 2002). 1.4 EPIDEMIOLOGIA DA TUBERCULOSE A Organização Mundial de Saúde (2009) apresentou dados sobre a incidência da tuberculose em 196 países entre os anos de 1990 a 2007. Os dados apontam para a existência de cerca de 13,7 milhões de casos em todo o mundo. Destes, mais de 9,6 milhões tinham diagnóstico concluído através do teste de escarro positivo para BAAR. O número estimado de mortes causadas pela tuberculose em todo mundo é muito elevado, em torno de dois milhões por ano (WHO, 2009). 5 De todo o continente americano, o Brasil é o único que faz parte do grupo de 22 países que concentram 80% dos casos de tuberculose (Tabela 1). Devido ao elevado número populacional, o Brasil apresenta o maior índice de casos de tuberculose de toda a América do Sul (114 mil casos em 2007; média de 90 mil casos novos por ano). Entretanto, seus indicadores relativos são os menores em relação aos outros países sul-americanos. Dentre os países do continente americano, o Brasil e o Peru são responsáveis por cerca de 50% de todos os casos de tuberculose. A média anual de casos dessa doença em território nacional é de cerca 90 a 95 mil casos, incluindo casos novos e de recidiva no tratamento. A mortalidade causada pela tuberculose no Brasil é muito elevada, em torno de 4,5 mil óbitos por ano (Ministério da Saúde, 2007). O Ministério da Saúde estima que cerca de 50 milhões de brasileiros são portadores de tuberculose, considerando tanto indivíduos portadores da tuberculose na forma latente, quanto na forma ativa causadora da doença. 6 Tabela 1: Estimativa da taxa de tuberculose no ano de 2007, em diferentes países. Fonte: Global tuberculosis control, report 2009 – WHO A incidência de tuberculose notificada no Brasil, entre os estados brasileiros demonstra uma distribuição irregular da doença mesmo dentro das diferentes regiões geográficas (Figura 1). A região Norte apresenta maior taxa de incidência da tuberculose, seguido das regiões Sudeste, Nordeste, Sul e CentroOeste. Especificamente na região Norte, o Ministério da Saúde registrou durante o ano de 2007 um total de 45 novos casos para cada 100.000 habitantes. Desses, o estado do Pará manteve a taxa de incidência da região: de 45,7 novos casos por 100.000 habitantes. A região Norte apresenta taxa de incidência de tuberculose superior a média brasileira que é de 38,2 para cada 100.000 habitantes; este fato evidencia a importância da implementação de políticas de saúde publica nesta região, visando conter o avanço da tuberculose. 7 Figura 1: Taxa de incidência de casos notificados de tuberculose no ano de 2007, nos estados do Brasil. Fonte: MS / SVS / SINAN e IBGE, 2009. 1.5 TRATAMENTO DA TUBERCULOSE O tratamento atual da tuberculose comumente empregado na rede de saúde pública do Brasil envolve ação de seis diferentes tipos de fármacos: Estreptomicina (S), Rifampicina (R), Isoniazida (H), Etambutol (E), Pirazinamida (Z) e Etionamida (Et) (Ministério da Saúde, 2009). Os fármacos considerados de primeira linha no combate à tuberculose, são: Isoniazida, Rifampicina, Pirazinamida e Etambutol, enquanto que os fármacos de segunda linha são Estreptomicina e Etionamida. Os efeitos positivos da combinação de fármacos para o tratamento da tuberculose são fundamentados na biologia dos agentes infecciosos. Esses bacilos são seres de aerobiose estrita, com 8 crescimento lento e proporção variada de populações mutantes, que podem se multiplicar em um período de até 20 horas. Nessa situação, a combinação dos fármacos administrados é necessária para evitar o surgimento de colônias de bactérias mutantes, resistentes à ação de um fármaco unitário (Ministério da Saúde, 2009). O Ministério da Saúde (2009) estipulou diversos esquemas de tratamento que padronizam os fármacos e as dosagens utilizadas em cada fase de tratamento da tuberculose, em toda a rede pública do país. Em todos os esquemas de tratamento da tuberculose devem-se levar em consideração os grupos de alto risco ao desenvolvimento de toxicidade. Este grupo é constituído por pessoas com mais de 60 anos, alcoólatras, pacientes soro positivos para o HIV, indivíduos que fazem uso concomitante de fármacos anticonvulsivos e por pessoas que manifestam alterações hepáticas, independente da causa dessas alterações (Ministério da Saúde, 2009). 1.5.1 Efeitos Adversos aos Fármacos Antituberculose A WHO (2009) define reação adversa a medicamentos como: ―qualquer efeito prejudicial ou indesejável, não intencional, que aparece após a administração de um medicamento em doses normalmente utilizadas no homem para a profilaxia, o diagnóstico e o tratamento de uma enfermidade‖. É possível identificar na literatura especializada uma série de descrições pormenorizadas a respeito dos efeitos adversos da administração de medicamentos de combate à tuberculose (Peloquin, 2002; 2004). O aparecimento de diferentes efeitos adversos e a intensidade das manifestações desses efeitos pode sofrer variações de indivíduo para indivíduo, em decorrência da administração de diferentes tipos de fármacos. Fontes da FUNASA (2002) indicam que os efeitos adversos mais brandos ao tratamento da tuberculose ocorrem entre 5 e 20% dos pacientes enquanto que sintomas mais graves dos efeitos ocorrem entre 2 e 8% dos pacientes que se submetem a um dos esquemas de tratamento. 9 Dentre os efeitos adversos mais graves destaca-se a hepatotoxicidade caracterizada por danos no fígado, causados em geral pela ação indesejada de medicamentos. Segundo o Guia da Vigilância Epidemiológica de 2004 do Ministério da Saúde, a hepatotoxicidade é caracterizada por critérios clínicos, tais como: náuseas, vômito, dor abdominal ou icterícia; e por alterações nas provas hepáticas AST (Aspartato-aminotransferase), ALT (Alanina-aminotransferase), Bilirrubina total e Creatinina. Em todo o mundo, a toxicidade causada pelo tratamento com fármacos antituberculose está associada com elevadas taxas de morbidade, mortalidade e, além disso, está envolvida com o aumento de custos durante o tratamento (Ingelman-Sundberg, 2001; Lundkvist, 2004; Teixeira, 2007). A Isoniazida (INH) é considerada um medicamento de primeira linha no combate a tuberculose. Este fármaco tem ação sobre a síntese de lipídios, de ácidos nucléicos e de ácido micólico (ácido que está presente na parede celular das micobactérias, de uma maneira geral) e que pode interferir no processo de glicólise da bactéria. A atividade bacteriostática atua impedindo a divisão celular das bactérias durante a multiplicação das mesmas e a atividade bactericida tem ação somente sobre células em fase de crescimento ativo (www.chemistrydaily.com (2009)). A Isoniazida é bem absorvida através do trato digestivo e excretada na urina após a inativação pelo fígado. A meia vida da INH é longa logo após o nascimento, mas é reduzida logo na primeira infância. No adulto, a meia vida do fármaco é curta, entre duas a cinco horas. A Isoniazida foi isolada pela primeira vez em 1912. Seu efeito bacteriostático contra a Mycobacterium tuberculosis foi descoberto mais tarde, em 1952. Ela é ativa contra o bacilo tanto no meio intracelular como no meio extracelular. No tratamento de pacientes com tuberculose, se a Isoniazida for administrada isoladamente pode levar ao desenvolvimento de resistência ao fármaco, de modo que ela deve ser sempre administrada em conjunto com outros medicamentos (Rang et al., 2001). 10 Os efeitos adversos relatados em diferentes publicações, associados com o uso da INH são: a hepatotoxicidade, erupções cutâneas alérgicas, febre, alterações hematológicas, sintomas artríticos, vasculite, alguns tipos de câncer e problemas no sistema nervoso central e periférico (Kita et al., 2001; Shakya et al., 2005; Shaaf et al., 2005; Shimizu et al., 2005; Upton et al., 2001; Sandy et al., 2005; Fernandes et al., 2003; Donald et al., 2004). Uma das formas mais recorrentes das reações adversas por efeito da Isoniazida é a hepatotoxicidade, caracterizada por lesões hepáticas que se manifestam na forma de hepatite ou anormalidades do fígado . Portadores de HIV, tratados com Isoniazida contra a tuberculose, apresentam comumente uma reação de hipersensibilidade de pele (Fernandes et al., 2003; Shakya et al.,2005). Estima-se que cerca de 5% dos pacientes tratados com Isoniazida apresentem efeitos adversos ao tratamento. Na Tabela 2 está apresentada de forma resumida a dosagem utilizada dos diferentes fármacos, normalmente empregados para o tratamento de tuberculose, bem como alguns de seus efeitos adversos. Tabela 2: Dosagem dos fármacos antituberculose e as reações adversas mais comuns. Fonte: Chan & Iseman, 2002. 1.6 FARMACOGENÉTICA A farmacogenética estuda o efeito individualizado de variações genéticas em resposta aos medicamentos. A provável origem do termo farmacogenética data 11 de 1902, com o pesquisador Archibald Garrod, que realizou estudos sobre a metabolização de diversos fármacos (Meyer, 2004). Entretanto, somente no ano de 1950 foi possível determinar quais variações genéticas estavam associadas a diferentes respostas a medicamentos. Desde o início, em meados do século passado, o objetivo das pesquisas em farmacogenética era buscar uma terapia individualizada para maximizar a eficácia dos medicamentos e minimizar os efeitos colaterais associados à utilização destes. Mais recentemente, uma nova linha de ação tem sido desenvolvida, a farmacogenômica, a qual considera que o efeito farmacológico de um fármaco depende da interação de diferentes genes envolvidos na metabolização deste medicamento (Weinshilboum & Wang, 2004). 1.6.1 Farmacogenética da Isoniazida O mecanismo de metabolização da INH envolve principalmente as enzimas: N-acetiltransferase 2 (NAT2), que participa com processos de acetilação; Citocromo P450 oxidase (CYP2E1), envolvido no mecanismo de oxidação e a Glutationa S-transferase M1 (GSTM1), que faz a detoxificação deste fármaco (Figura 2). 12 Figura 2: Caminho de metabolização da INH com participação das enzimas NAT2, CYP2E1 e GSTM. Fonte: Modificado de Roy et al., 2008. Diferentes investigações na literatura indicam que o desenvolvimento de hepatotoxicidade medicamentosa causada por administração da Isoniazida em pacientes com tuberculose estão associadas às variações genéticas nos genes NAT2 (Upton et al., 2001; Kita et al., 2001; Fernandez – Villar et al., 2003; Sandy et al., 2005; Donald et al., 2004; Huang et al., 2002); CYP2E1 (Roy et al., 2008; Huang et al., 2003; Fukino et al., 2008; Cho et al., 2007) e GSTM1 (Roy et al., 2008; Fukino et al., 2008; Sun et al., 2008). Segundo Roy et.al. (2008), apesar de os polimorfismos presentes no gene NAT2 serem os mais extensivamente investigados como candidatos ideais para explicar o desenvolvimento da hepatopatia medicamentosa, as variantes genéticas nos genes CYP2E1 e GSTM1 podem contribuir efetivamente para o aparecimento desta manifestação clínica. 13 1.7 CONTROLE GENÔMICO DA ANCESTRALIDADE, NOS PACIENTES PORTADORES DA TUBERCULOSE (INDEL). As principais causas de morbidez e de mortalidade humana no mundo podem ser atribuídas às doenças prevalentes em sociedades contemporâneas, como as doenças cardiovasculares, câncer, tuberculose, diabetes, obesidade, doenças psiquiátricas e doenças inflamatórias. Todas essas originadas pela combinação de múltiplos fatores ambientais e genéticos. A descoberta de características genéticas associadas a essas doenças pode permitir o avanço de novos conhecimentos a respeito da patogênese, do diagnóstico e do tratamento das mesmas (Santos et.al., 2009). Nos últimos anos, várias pesquisas têm obtido sucesso na tentativa de identificar variantes (formas alélicas) responsáveis por doenças monogênicas, atribuídas a um único locus, a partir da investigação de regiões cromossômicas identificadas previamente em estudos de ligação, em populações miscigenadas. Por outro lado, o sucesso desse tipo de investigação ocorre em uma taxa menor, quando se tenta localizar variantes genéticas responsáveis por doenças complexas de herança quantitativa, possivelmente em função do fato de que cada variante contribui apenas com uma pequena parte para o risco do desenvolvimento dessas doenças (The International Hap Map Consortium, 2003 – www.hapmap.org). A identificação de genes e de suas formas alternativas, responsáveis por efeitos adversos em resposta aos fármacos, pode ser muito útil no estabelecimento de políticas de saúde publica e no desenho e interpretação de ensaios clínicos. A existência de diferenças interétnicas em relação a variabilidade encontrada em genes envolvidos na resposta aos fármacos, pode ser um fator importante para a interpretação errônea dos resultados. Em investigações do tipo caso/controle, os resultados podem ser mal interpretados em função da existência de uma estratificação populacional, não identificada, entre os dois grupos investigados. Este fato é particularmente importante quando as investigações são realizadas em populações miscigenadas em um passado relativamente recente, como é o caso da maioria da população brasileira (Santos et.al., 2009). 14 Apesar da notória importância desse tipo de investigação, os resultados de associações entre marcadores genéticos específicos, formas alélicas variantes e determinados traços populacionais, doenças complexas, por exemplo, podem ser mal interpretados em função da existência de uma subestruturação populacional ou estratificação populacional, não identificada na população investigada (Edwin et al., 2000; Köhler & Bickeböller, 2005; Tang et al., 2005). Uma das formas mais eficientes de controle de fatores que podem gerar associações espúrias em estudos de traços qualitativos e quantitativos, como o caso da estratificação populacional, é o emprego de análises centradas na investigação de familiares dos portadores do traço investigado. Com base nesta premissa, muitos revisores e editores de revistas exigem, para a publicação, que associações genéticas identificadas em estudos populacionais do tipo caso-controle, sejam confirmadas em investigações envolvendo familiares dos portadores do traço. (Thomson, 1995; Allison, 1997). Na prática, as investigações baseadas em grupos de familiares têm limitações muito sérias: i) amostras com um número significativo de pacientes são difíceis de reunir, especialmente entre aquelas doenças de manifestação tardia; ii) estas amostras permitem informações menos precisas sobre possíveis associações, quando comparadas às investigações baseadas em caso-controle, com amostra de tamanho equivalente (Morton & Collins, 1998); iii) embora irmandades possam ser empregadas como controles, quando os pais não estiverem disponíveis , este tipo de investigação é ainda mais ineficiente, do ponto de vista estatístico (Spielman & Ewens, 1998). Deste modo, com relação ao custo beneficio, pode ser muito mais parcimonioso investir tempo e recursos, humanos e patrimoniais, na tentativa de controlar possíveis efeitos ligados à estratificação populacional do que escolher um tipo de investigação muito mais laboriosa e que, além disso, podem envolver objeções de enfoque ético, casos específicos do envolvimento de parentes de afetados (Shriver et al., 2003). 15 Em geral, a estratificação populacional existe quando a população em questão é constituída pela mistura de diferentes grupos de populações, europeus e africanos, por exemplo, e que normalmente são denominadas de subpopulações e quando a proporção de mistura, definida como a proporção do genoma que teve origem em cada subpopulação, varia entre indivíduos (Shriver et al., 2003). A estratificação discreta de subpopulações é um caso especial dentro desse modelo geral, no qual a proporção de mistura de cada indivíduo é especificada com valores entre 0 e 1. Se o risco de desenvolver a doença, o traço sob investigação varia com a proporção da mistura, associações espúrias podem ser encontradas com o genótipo de qualquer locus, desde que as frequências alélicas desse locus específico também sejam diferentes entre as subpopulações. Um exemplo recente de associação espúria, foi o da associação do câncer de próstata com o polimorfismo CYP3A4 entre negros americanos (Kittles et al., 2002). De forma resumida, o princípio que rege as análises de subestruturação populacional diz que em uma população na qual proporções de mistura variam entre os indivíduos que a compõem e na qual as frequências alélicas de um determinado marcador variam entre as diferentes subpopulações ancestrais, poderá haver associações entre alelos de loci não ligados, isto é, alelos não ligados tendem a serem herdados conjuntamente muito mais em função da ancestralidade. Esta é a base do que se convencionou chamar de associação decorrente de subestruturação (Pritchard et al., 2000; Pritchard e Donnelly, 2001). Diversas publicações mais recentes (Hoggart et al., 2003; Montana e Pritchhard, 2004; McKeigue, 2005) tem demonstrado que já estão disponíveis várias metodologias, tanto métodos laboratoriais como estatísticos que permitem mensurar com precisão a proporção de mistura individual e, por conseguinte, contornar a questão da subestruturação populacional nos diversos experimentos do tipo casocontrole. O princípio geral que rege essas análises é que se as subpopulações ancestrais que formaram a população total são conhecidas; se as frequências alélicas dentro de cada uma subpopulação são conhecidas, dentre um painel de loci marcadores de ancestralidade, então a proporção de mistura de cada indivíduo pode 16 ser mensurada a partir dos genótipos apresentados (Elston, 1971; Chakraborty, 1975). Desse modo, com uma amostra de indivíduos genotipados para vários loci de marcadores de ancestralidade é possível estimar a proporção de mistura de cada indivíduo e com isso evitar os efeitos da, assim denominada, associação decorrente de subestruturação populacional, no mesmo tempo em que permite obter-se uma estimativa muito mais acurada do processo de miscigenação que ocorreu naquela população sobre investigação. Desta maneira é importante empregar tecnologias capazes de realizar um controle genômico entre casos e controles, quantificando individualmente a proporção de mistura entre as populações ancestrais, logo corrigir o provável efeito do subestruturamento populacional na amostra investigada. Uma ferramenta importante que pode ser empregada nestas análises são os Marcadores Informativos de Ancestralidade (MIAs), também chamados de ―marcadores população-específicos‖ (Parra et al., 2003). Para atingir o objetivo proposto, o presente trabalho utilizará 48 INDEL (inserção/deleção) marcadores informativos de ancestralidade previamente desenvolvidos capazes de se estimar com precisão a mistura individual e global interétnica em populações miscigenadas com diferentes grupos étnicos. Estes marcadores de ancestralidade foram desenvolvidos para este fim e estão descritos no artigo de Santos et al., 2009. 17 2. JUSTIFICATIVA Diversos estudos genéticos no mundo adotam a metodologia caso – controle para se investigar se uma variante genética pode estar associada a uma determinada doença (Hoggart et al., 2003; Montana & Pritchhard, 2004; McKeigue, 2005). Esse tipo de análise apresenta grande importância na investigação de uma patologia seja por predizer um resultado (estudos de susceptibilidade genética) ou por ajudar a definir melhor qual terapia utilizar em cada paciente portador de determinada patologia (estudos de farmacogenética) (Suarez-Kutz, 2005). O desenvolvimento de pesquisas em farmacogenética iniciará uma nova era na medicina. Estabelecendo o conceito de uma terapia individualizada, onde o fármaco certo é administrado na dose certa para o paciente correto, pois a redução dos efeitos adversos além de serem alcançadas pela seleção do melhor fármaco e a melhor dose para aqueles pacientes que têm metabolização deficiente, poderá ainda abrir as portas para a pesquisa e o desenvolvimento de novos alvos terapêuticos, que não sejam metabolizados por determinada enzima ou Via (Fiegenbaum & Hutz, 2006). Esse tipo de investigação está sujeita a erros se não forem controladas todas as variáveis relativas ao modelo de comparação entre casos e controle. Esse fato é importante quando essas análises são realizadas em populações miscigenedas, como é o caso da maioria da população brasileira (Hoggart et al., 2003; McKeigue, 2005). Neste contexto se enquadra a variação individual de ancestralidade. O controle genômico é particularmente importante nas amostras investigadas, pois foi estimado na população do Norte brasileiro um elevado grau de subestruturamento populacional que justifica a utilização deste controle em estudos de associação com doenças (Santos et.al., 2009). Uma publicação de Santos (Comunicação Pessoal) submetida recentemente avaliou o efeito da associação dos genes NAT2/CYP2E1 para o desenvolvimento de hepatotoxicidade em amostras de tuberculose da região Norte 18 do Brasil. O efeito conjunto de ambos os genes observado foi significativo (P=0,0121) na terapêutica com INH. O presente projeto pretende investigar se a utilização dos Marcadores Informativos de Ancestralidade são influentes no estudo farmacogenético da isoniazida. O presente estudo torna-se relevante para evidenciar a importância de se controlar o efeito da subestruturação populacional em investigações do tipo caso – controle principalmente na região norte do Brasil. Deve-se destacar que o presente projeto é inovador sobre o ponto de vista que pretende controlar o efeito da ancestralidade genômica em estudos de associação entre genes e doenças em populações miscigenadas brasileiras (Santos et.al., 2009). 19 3. OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GERAL: Aplicar um conjunto multiplex de marcadores de ancestralidade já previamente desenvolvido em um estudo de farmacogenética da isoniazida no estado do Pará. Utilizar os marcadores INDEL como método de controle genômico para o pareamento de ancestralidade individual entre caso-controle em estudo de associação de genes candidatos a doenças complexas (farmacogenética). 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS: - Estimar a ancestralidade global dos pacientes portadores de tuberculose. - Estimar a ancestralidade individual de cada paciente participante da investigação. - Utilizar as ancestralidades individuais obtidas para controlar o efeito desta na associação dos genes NAT2 e CYP2E1 para a hepatotoxicidade. - Aplicação desse conjunto multiplex de polimorfismos do tipo INDEL para realizar o controle genômico de ancestralidade individual para estudos caso-controle em projetos de farmacogenética da tuberculose, na tentativa de eliminar possíveis influências de subestruturação populacional sobre os resultados com polimorfismos genéticos já identificados. 20 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1 AMOSTRA Neste trabalho empregou-se um painel de 48 Marcadores (bialélicos do tipo INDEL- Inserção e Deleção de pequenos fragmentos de DNA) Informativos de Ancestralidade, para estabelecer o controle genômico de ancestralidade, em uma amostra de 135 pacientes diagnosticados com tuberculose, residentes no Estado do Pára, Brasil, atendidos no Hospital Universitário João de Barros Barreto (HUJBB) durante o período de 2006 a 2008, todos eles tratados com o fármaco Isoniazida. Os indivíduos foram selecionados depois da confirmação da infecção, realizada através dos exames clínicos, bacteriológico, radiológico, prova tuberculínica, histopatológico e específicos complementares (FUNASA, 2002). Os dados clínicos foram obtidos por informações de prontuário. Estes pacientes foram agrupados segundo a resposta medicamentosa ao tratamento: i) Grupo I, formado por pacientes que desenvolveram hepatotoxicidade medicamentosa (17 indivíduos) e; Grupo II, formado por pacientes que não desenvolveram hepatotoxicidade medicamentosa, quando condicionados ao mesmo tratamento (118 indivíduos). Ambas as amostras foram controladas por diferentes fatores que são considerados de risco à toxicidade de drogas, como idade elevada, alcoolistas, infecção pelo HIV, uso concomitantes de drogas (principalmente anticonvulsivantes) e hepatopatias crônicas. 4.2 ASPECTOS ÉTICOS Os indivíduos foram devidamente esclarecidos a respeito da pesquisa e assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, o qual permite o uso de suas alíquotas de sangue e de seus dados clínicos, em nível de prontuário. O presente estudo foi aprovado no Comitê de Ética do Hospital Universitário João de Barros Barreto sob protocolo nº 350507. 21 4.3 OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS DE SANGUE De cada indivíduo foram obtidos 5mL de sangue venoso colhido de veia periférica , em sistema de coleta a vácuo, utilizando EDTA como anticoagulante. 4.4 EXTRAÇÃO DE DNA A extração de DNA foi feita segundo método descrito por Sambrook et al., (1989). 4.5 QUANTIFICAÇÃO DO DNA A determinação da concentração do DNA foi realizada em espectrofotômetro GeneQuant RNA/DNA (Pharmacia Biotech). 4.6 GENOTIPAGEM Todas análises foram realizadas empregando a técnica de PCR multiplex (os 48 sistemas são genotipados em três reações de PCR, seguidas de eletroforese capilar) como descrito anteriormente por Santos et al. (2009). Os 48 marcadores (Figuras 3, 4 e 5) foram definidos como informativos de ancestralidades por apresentarem as seguintes características: serem distribuídos ao longo dos cromossomos (autossômicos) e apresentarem valores médios de delta e FST acima 0,36 e 0,31 respectivamente para as populações ancestrais (ameríndios, europeus e africanos) (Santos et.al., 2009). 22 Figura 3: Genotipagem conjunta de 16 marcadores de ancestralidade européia investigados. 23 Figura 4: Genotipagem conjunta de 16 marcadores de ancestralidade indígena investigados. 24 Figura 5: Genotipagem conjunta de 16 marcadores de ancestralidade africana investigados. 25 4.7 ANÁLISES ESTATÍSTICAS Análises relativas à subestruturação populacional foram realizadas empregando-se o programa STRUCTURE V (Pritchard et al., 2000). A análise estatística empregou também a regressão logística usando o programa SPSS 14.0 (SPSS Ins. Chicargo, IL, USA). A análise de regressão logística usou como variáveis dependentes a presença de hepatotoxicidade, e como variáveis independentes foram empregadas o HIV, tabagismo, etilismo, antiretroviral, comorbidade e ancestralidade, fatores estes que podem estar influenciando na toxicidade ao medicamento INH. 26 5. RESULTADOS Foram analisados 135 pacientes portadores do Mycobacterium tuberculosis, todos eles tratados com um protocolo que inclui INH. Destes, dezessete indivíduos (12,59% dos pacientes) apresentaram um quadro clínico de hepatotoxicidade medicamentosa, caracterizados por critérios especificados no Guia de Vigilância Epidemiológica de 2009, do Ministério da Saúde do Brasil, que incluem: náuseas, vômitos, dor abdominal, icterícia e alterações das provas hepáticas: Aspartato-aminotransferase (AST), Alanina-aminotransferase (ALT), Bilirrubina total e Creatinina. Os pacientes foram analisados com os 48 Marcadores Informativos de Ancestralidade para se determinar com precisão a mistura individual e global interétnica (controle genômico) na população, fornecendo subsídios para estimar através de análises estatísticas (regressão logística) o controle do efeito da etnicidade nos grupos analisados (pacientes com e sem hepatotoxicidade). 27 5.1 CONTROLE GENÔMICO DA ANCESTRALIDADE EM INDIVÍDUOS COM E SEM HEPATOTOXICIDADE. Figura 6: Distribuição de estimativa individual. Os vértices do triângulo representam as populações parentais. Os círculos em cores ao centro do triângulo descrevem os indivíduos com e sem hepatotoxicidade. A Figura 6 foi obtida das análises de ancestralidade individual do programa STRUCTURE V (Pritchard evidenciam et al., 2000). Os vértices do triângulo as populações ancestrais (Europeus, Africanos e Ameríndios) previamente genotipadas (Santos et.al., 2009). As amostras de pacientes portadores de tuberculose estratificados segundo resposta terapêutica ao INH (presença de hepatotoxicidade) estão centralizadas no triângulo. O grupo de pacientes sem hepatotoxicidade (N=118) estão representados na cor amarela e com hepatotoxicidade (N=17) estão na cor roxa. As análises individuais de ancestralidade forneceram subsídios para as estimativas globais de mistura interétinica nos grupos de pacientes e para a análise de regressão logística (usando a etinicidade como variável dependente). 28 Tabela 3: Distribuição das estimativas globais de ancestralidade estratificando pacientes com e sem hepatotoxicidade Etnia Total N=135 Sem Hepatotoxicidade Com Hepatotoxicidade N=118 N=17 1 37,4% 40,6% 34,2% 0,034 1 27,3% 25,3% 29,3% 0,351 1 35,3% 34,1% 36,5% 0,416 EUROPEU AFRICANO INDÍGENA Teste Man-Whitney P 1 A Tabela 3 evidencia os valores de distribuição global de mistura interética nos grupos de pacientes com e sem hepatotoxicidade. Os resultados da análise de ancestralidade para todos os 135 pacientes portadores de tuberculose foram: 37,4% de Europeus, 27,3% de Africanos e 35,3% de Indígenas. Os resultados para o grupo de hepatopatas foram: 34,2% de ancestralidade Européia, 29,3% de ancestralidade Africana e 36,5% de ancestralidade Indígena. No grupo sem hepatotoxicidade os valores estimados foram: 40,6% de ancestralidade Européia, 25,3% de ancestralidade Africana e 34,1% de ancestralidade Indígena. As ancestralidades africanas e ameríndias não foram significativamente diferentes entre os grupos de pacientes tratados com INH (P>0,05). O efeito étnico foi significativo especificamente para ancestralidade européia (P=0,034), mostrando que existe subestruturação populacional entre as amostras para esta etnia. 29 5.2 CONTROLE DO EFEITO DA ETINIDADE NOS INDIVÍDUOS COM E SEM HEPATOTOXICIDADE. Tabela 4: Modelos de regressão logística controlando o efeito da etnicidade . Variável S.E Wald DF P OR(95%IC) SEM ETNIAS 1,1803 0,6088 3,7585 1 0,05 3,2553(0,9871-10,7350) AFR/ IND/ EUR 1,5680 0,6900 5,1633 1 0,0231 4,7969(1,2405-18,5491) AFRICANA 1,1823 0,6094 3,7639 1 0,0524 3,2618(0,9880-10,7692) INDÍGENA 1,1831 0,6090 3,7736 1 0,0521 3,2644(0,9895-10,7699) EUROPÉIA 1,2286 0,6166 3,9697 1 0,0463 3,4163(1,0202-11,4398) Estima coeficiente; IC, Intervalo de Confiança; df, O grau de liberdade, OR, odds ratio ; SE , erro padrão A Tabela 4 resume os resultados observados na análise de risco relativo para os diferentes modelos de regressão logística. Os modelos estimados utilizaram como variável dependente a hepatotoxicidade. As variáveis independentes utilizadas em todas as análises foram: tabagismo, etilismo, e comorbidade. A variável independente etnicidade foi excluída no primeiro modelo, o que revelou não ser significativo o efeito dos genes NAT2 e CYP2E1 para o desenvolvimento de hepatotoxicidade (P=0,052). Quando as três etnias foram incluídas nas análises (Europeu, Africano e Ameríndio) o efeito dos genes investigados apresentou uma significância com risco relativo elevado (P=0,023; 95% IC1,2-18,5;OR=4,79). A variável etnicidade foi desmembrada de maneira a fazer as análises separadamente de cada grupo étnico. As análises revelaram que as etnias africana e indígena não indicaram um efeito significativo de associação dos genes investigados (P>0,05). O modelo que incluiu a variável etnicidade européia foi significativo para a associação dos genes relacionados com a metabolização do INH com hepatopatia medicamentosa (P=0,046; 95%IC1,02-11,43; OR=3,41). 30 Figura 7: Distribuição da ancestralidade do INDEL Europeu no grupo de pacientes com e sem hepatotoxicidade. Cada grupo é representado por uma caixa, divididos em parte superior e inferior separados por uma linha mediana, assim a caixa contém em suas partes metade (50%) dos escores da distribuição. As linhas verticais fora da caixa, tanto a maior quanto a menor, estão dentro do intervalo de 1,5. O círculo aberto representa os valores extremos. A Figura 7 exemplifica a distribuição dos grupos com e sem hepatotoxicidade em função da etnicidade européia. Os resultados mostraram que a ancestralidade Européia foi mais frequente no grupo de pacientes sem hepatotocixidade, mostrando diferenças significativas (Man- Whitney teste P=0,034). 31 6. DISCUSSÃO A presente investigação utilizou um painel de 48 marcadores de ancestralidade, capaz de identificar com precisão e menor erro estatístico o subestruturamento populacional em grupos miscigenados. Diferentemente de estudos anteriores, que empregavam SNPs informativos de ancestralidade (Shriver et al., 2003, Yang et al., 2005; Reiner et al., 2005; Benn-Torres et al. 2008; Halder et al., 2008), todos os marcadores utilizados nesta investigação são inserções/deleções de pequenos fragmentos de DNA (INDEL). Uma abordagem semelhante desenvolvida por Bastos Rodrigues et.al. (2006), utilizou 40 polimorfismos INDELs, com o propósito de fazer inferências sobre estrutura genética em populações humanas. Entretanto, nesse trabalho optou-se por utilizar marcadores de elevada heterozigosidade entre populações européias, em vez de empregar marcadores informativos de ancestralidade como foram utilizados na presente investigação. Foram utilizados números de marcadores compatíveis com os estimado na literatura, que pudessem fornecer informações no processo de identificação de populações geograficamente distintas (Turakulov & Easteal, 2003; Bamshad et al., 2003; Bastos-Rodrigues et al., 2006). A capacidade do presente painel de estimar ancestralidade é similar a encontrada em outros trabalhos (Yang et. al., 2005; Halder et al., 2008; Shriver et al., 2003; Reiner et al., 2005; Benn-Torres et al., 2008). O controle da ancestralidade foi de fundamental importância para consolidar as análises de associação de polimorfismos genéticos (gene NAT2 e CYP2E1) no desenvolvimento de hepatotoxicidade medicamentosa ao INH. Em relação ao Brasil este modelo de investigação se torna mais importante em função do elevado grau de miscigenação da população Brasileira. (Suarez-Kutz, 2005; Callegari-Jacques et al., 2003). Em um estudo realizado por Santos et.al. (2009) foi possível identificar na população de Belém-PA, um elevado 32 grau de subestruturamento populacional que justifica realizar o controle genômico de ancestralidade em estudos de associação nessa população. Diferentes trabalhos no mundo relatam a importância de se controlar ancestralidade em estudos de associação de uma variante alélica em relação a uma determinada patologia (Zembrzuski et.al., 2006; Keene et.al., 2008; Hinds et.al., 2004). De igual forma, estudos de farmacogenética devem estabelecer metodologias para evitar inferências errôneas decorrentes de substruturação populacional (Suarez-Kutz, 2005). Principalmente no que se refere á grupos miscigenados como é o caso das populações brasileiras, que apresentam uma elevada flutuação em genes de resposta farmacogenética (Suarez-Kutz, 2005). Comparando nossos resultados obtidos através da estimativa global da ancestralidade média para o total de pacientes portadores de tuberculose entre dados obtidos de um artigo de Santos et al.,2009, os dados obtidos neste estudo revelaram uma contribuição significativamente diferente (P=0,002) entre as ancestralidades para indivíduos portadores de tuberculose e a população de BelémPA, respectivamente: Européia (37,4% X 61,4%), Africanos (27,3% X 11,7%) e Indígenas (35,3% X 26,9%). Esses resultados evidenciaram uma perda de contribuição Européia e uma elevação das ancestralidades Ameríndias e Africanas para a o grupo de indivíduos portadores de tuberculose em relação às estimativas encontradas para população norte do Brasil (Santos et.al., 2009). O modelo proposto para se explicar este evento observado seria de uma seleção direcional para ancestralidades ameríndias e africanas com base na patologia da tuberculose. Dessa forma observou-se uma elevação da contribuição ameríndia e africana para indivíduos portadores de Mycobacterium tuberculosis em função de características social e econômica vinculada a esta doença. 33 Segundo o Guia de vigilância epidemiológica (2004), apesar de apresentar ocorrência mundial, a distribuição geográfica da prevalência de tuberculose é grandemente influenciada pela situação sócio-econômica das diferentes áreas do globo. Em países menos desenvolvidos (ou mesmo em países em desenvolvimento) a condição inadequada de saneamento básico e de acesso à saúde pública de qualidade não permitem a redução da taxa de incidência da tuberculose. Dados do IBGE (Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística) em 2003 indicaram uma disparidade da pobreza com relação às populações Africanas e Indígenas. Em relação ao presente trabalho, o resultado encontrado em uma primeira análise, a qual não controlou a substruturação populacional da amostra, não mostrou uma associação dos genes investigados com hepatotoxicidade. Nossos resultados quando foi realizado o controle genômico o efeito dos genes investigados apresentou uma significância com risco relativo elevado (P=0,023; 95% IC1,218,5;OR=4,79), mostrando que o painel de 48 marcadores genéticos proporcionam uma ferramenta poderosa para a corrigir efeitos da estratificação em estudos caso controle na população brasileira. Os resultados do presente estudo se assemelha a estudos realizados por Luo et al. (2005) e Kittles et al. (2002) nos quais foi realizado o controle genômico em estudos de associação entre os genes investigados e patologias (câncer). Dessa maneira foi possível corrigir o provável efeito do subestruturamento populacional nas amostras investigada. Este resultado pode ser atribuído principalmente a elevada diferença interétnica dos marcadores investigados nos genes NAT2 e CYP2E1. Desta forma o controle genômico se mostrou importante para se controlar um efeito de subestruturação populacional em estudos de associação. Santos (Comunicação Pessoal). 34 Contudo, os resultados obtidos no presente trabalho revelaram que somente a ancestralidade européia (P=0,0463) foi significativamente importante para se realizar o controle genômico em estudos caso-controle para terapia com isoniazida. Particularmente para este estudo as etnias africanas (p=0,0524) e ameríndias (P=0,0521) isoladamente não se revelaram importantes estatisticamente para controlar o efeito da subestruturação. Porém, é importante destacar que para futuros estudos de associação caso-controle e necessário investigar os efeitos de conjunto de todas as etnias. 35 7. CONCLUSÃO O controle genômico foi efetivamente importante para a presente investigação uma vez que foram encontradas diferenças significativas em relação à etnicidade entre os pacientes com e sem hepatotoxicidade. Os dados gerados nessas populações forneceram subsídios para realizar o controle genômico da ancestralidade em investigações caso-controle. O controle da ancestralidade foi de fundamental importância para consolidar as análises de associação de polimorfismos genéticos (gene NAT2 e CYP2E1) no desenvolvimento de hepatotoxicidade medicamentosa ao INH entre os pacientes com e sem hepatotoxicidade. Esta investigação foi a primeira na literatura mundial a realizar o controle genômico da ancestralidade para investigação de estudos caso controle de farmacogenética da isoniazida. Fica evidente para estudos de associação a necessidade de realizar-se o controle genômico da ancestralidade, principalmente em populações que apresentam elevadas taxas de mistura interétnica com grupos populacionais Ancestrais (africanos, europeus e ameríndios), como é o caso das populações da região Norte do Brasil. A farmacogenética deve ser baseada em diferenças individuais genéticas e não em diferenças interétnicas de frequências dos polimorfismos ligados a rota de metabolização de fármacos. Essas variações interétnicas são particularmente influentes em populações que sofrem elevados graus de subestruturamento populacional. 36 8. REFERÊNCIAS ALLISON DB. Transmission/disequilibrium tests for quantitative traits. Am J Hum Genet, 60:676–690, 1997. 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