Ocorrência de Albinismo em embriogênese somática

Comunicado 155
Técnico
ISSN 9192-0099
Brasília, DF
Dezembro, 2006
OCORRÊNCIA
DE
ALBINISMO
EM
EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA REPETITIVA
EM Brachiaria brizantha.
G. B. Cabral1
C.G. Santana2
V.T.C. Carneiro1
D.M.A. Dusi1
K.Matsumoto1
Palavras-chave: Albinismo, Braquiária, Embriogênese somática Repetitiva,
1
2
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. [email protected]
Universidade de Brasília.
Introdução
O gênero Brachiaria possui cerca de 100
espécies forrageiras e é originário da
África Tropical. No Brasil, essas espécies
demonstraram uma grande capacidade
de adaptação às mais variadas
condições de ambientes, ocupando
atualmente uma área de pastagens de
cerca de 50 milhões de hectares. Este
gênero é extremamente importante pois
viabilizou a pecuária de corte nos solos
ácidos e de baixa fertilidade, constituindo
a base das pastagens cultivadas em
solos brasileiros, tendo desencadeado o
desenvolvimento da indústria de
sementes e levado o Brasil a ser o maior
exportador desse insumo para o mundo
tropical (VALLE et al., 2000).
A braquiária apresenta dois
modos de reprodução, um sexual e outro
apomítico facultativo, sendo este último o
mais freqüente. Enquanto a reprodução
sexual gera variabilidade genética na
progênie pela fusão de gametas
reduzidos (n), na apomixia ou
agamospermia ocorre a produção de
embriões e sementes viáveis originários
de oosfera não reduzida (2n), originando
clones da planta-mãe.
Em Brachiaria a apomixia é do
tipo aposporia, na qual o saco
embrionário não reduzido é originado de
células somáticas do óvulo, as células do
nucelo que se diferenciam em “iniciais
apospóricas” (ARAÚJO et al., 2000;
ALVES et al., 2001; DUSI et al., 2004).
Em B. brizantha, dos 275 acessos
naturais já caracterizados, apenas um foi
classificado como sexual, sendo o
mesmo diplóide (BRA002747) e o
restante classificado como apomíticos
apospóricos facultativos. Em gramíneas
a apomixia está associada à poliploidia
(VALLE e SAVIDAN, 1996).
A EMBRAPA tem um programa
de melhoramento genético de Brachiaria,
sendo uma das principais demandas a
melhoria da qualidade nutricional das
forrageiras e a resistência a pragas e
doenças. Entretanto os melhoristas
enfrentam restrições devido às plantas
apomíticas serem poliplóides, mais
comumente tetraplóides, e às plantas
sexuais serem diplóides. Além da
barreira da diferença de ploidia, e da
reprodução apomítica não gerar
variabilidade genética, as plantas
apomíticas podem ser utilizadas apenas
como doadoras de pólen, ou seja, como
progenitor masculino. As espécies de
maior importância como forrageira são
as apomíticas tetraplóides, B. brizantha
cv. Marandu e B. decumbens cv. Basilisk
(VALLE et al., 1994).
As técnicas de biologia molecular
e celular - cultura de tecidos - são
ferramentas poderosas para introduzir
por transformação genética
características desejáveis em plantas
como braquiária, que apresentam as
limitações supracitadas, auxiliando o
melhoramento genético clássico.
O sucesso da transformação
estável depende da capacidade de
regeneração in vitro da espécie em
estudo. A regeneração de plantas pode
ocorrer por embriogênese somática ou
organogênese. No caso de Brachiaria
brizantha a via de regeneração mais
estudada tem sido a embriogênese
somática. Lenis em 1998, desenvolveu
uma metodologia de regeneração de
plantas por embriogênese somática
usando embriões isolados de sementes
maduras de B. brizantha. A eficiência de
formação de calos embriogênicos no
meio M1 relatada por Lenis foi de 76%,
considerando o número de embriões
apomíticos isolados e inoculados no
meio de cultura, e o número de embriões
apomíticos isolados que formaram calos.
Quanto à obtenção de brotos, a
modificação dos meios de cultura M1.2/MS2 em lugar de M1/MS1 definidos por Lenis, levaram a um
aumento de 54% de número de brotos
obtidos em relação ao número de
embriões plaqueados. A porcentagem de
obtenção de brotos chegou a 67% com a
modificação dos meios de cultura
(SILVEIRA et al., 2003). Neste estudo
foram utilizadas sementes maduras, ao
contrário dos trabalhos anteriores, nos
quais eram usados como explantes os
embriões isolados das sementes
maduras, e a combinação de meios
MSCLind/MSCLreg para indução de
calos embriogênicos e manutenção
desses calos em embriogênese somática
repetitiva. Este trabalho teve como
objetivo tornar a indução da
embriogênese somática mais
homogênea e sincronizada quanto ao
aumento do número de células
competentes para regeneração e
transformação genética, utilizando a
embriogênese somática repetitiva.
O aprimoramento das técnicas de
cultura de tecidos de Brachiaria
proporcionará o domínio de
metodologias biotecnológicas que
auxiliarão o melhoramento genético,
fornecendo meios para a caracterização
da função de genes envolvidos com a
reprodução apomítica, e para a
introdução de genes de interesse
agronômico.
Material e Métodos
Cultura de tecidos
Material vegetal
Sementes de Brachiaria brizantha
cultivar Marandu (acesso BRA000591),
apomítica tetraplóide (2n=4x=32) foram
cedidas pela Dr. Cacilda Borges do Valle
– EMBRAPA Gado de Corte.
Indução de embriogênese somática
Após a retirada da pálea, as sementes
foram desinfestadas por 5 minutos em
álcool comercial 70% e por 40 minutos
em hipoclorito de sódio 5%, em seguida
foram lavadas três vezes com água
destilada esterilizada. Logo após as
sementes foram inoculadas (10
sementes por placa de Petri) em meio de
indução de embriogênese somática –
MSCLind - tendo sido incubadas em
câmara de crescimento no escuro a
27±2ºC por 30 dias.
Embriogênese somática repetitiva
Calos embriogênicos foram
subcultivados em meio de indução –
MSCLind - por um período de 5 meses
no escuro a 27±2ºC. Ao longo deste
período, a cada trinta dias, calos de
aspecto friável granular foram
selecionados e subcultivados em meio
MSCLind. A partir do quarto mês de
subcultura, alguns desses calos foram
transferidos para o meio de regeneração
- MSCLreg.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Indução de embriogênese somática
Calos embriogênicos tiveram
origem no escutelo do embrião da
semente apomítica após 15 dias de
cultura na presença da auxina 2,4-D.
Este sistema de embriogênese somática
utilizando sementes maduras de B.
brizantha demonstrou maior praticidade
em relação ao sistema descrito por Lenis
(1998) e Silveira et al. (2003), visto que o
isolamento de embriões além de ser
bastante laborioso, pode favorecer a
contaminação. A indução de calos
embriogênicos ocorre de forma bastante
heterogênea, havendo diversos tipos de
calos e diferentes estágios de
desenvolvimento dos embriões
somáticos, o que implica uma não
sincronização das células com potencial
embriogenético, dificultando o processo
de transformação.
Embriogênese somática repetitiva
Calos subcultivados por um
período de cinco meses formaram calos
friáveis que originaram escutelo do
embrião somático (EES) isolados, ou
seja, um escutelo formando um embrião,
distribuídos ao longo dos calos de forma
homogênea (Figura 1A). Os EES
apresentavam coloração branca opaca,
enquanto os embriões somáticos
propriamente ditos eram de cor creme
brilhante, com aspecto perolado (Figura
1B). Esses calos quando transferidos
para meio de regeneração apresentaram
anormalidades e retardamento na
elongação e germinação dos embriões
somáticos, levando cerca de 80 dias
(Figura 1C), quando normalmente a
formação dos brotos pela germinação
dos ES leva em média 15 dias. Os
embriões que mantiveram a capacidade
de germinação produziram brotos albinos
numa freqüência de 100% (Figura 1D).
A ocorrência de albinismo em
embriogênese somática repetitiva de B.
brizantha pode ser devida (1) à
concentração da auxina 2,4-D na
concentração 3mg/L ou (2) ao longo
período aos quais os calos foram
submetidos à auxina, inibindo a
diferenciação de pro-plastídeos ou
etioplastos em cloroplastos. Visando
reduzir a concentração do 2,4-D no meio
de manutenção dos calos
embriogênicos, alguns calos foram
induzidos e subcultivados em meio
MSCLind suplementado com 1 ou 2mg/L
de 2,4-D por um período de 4 meses.
Estes calos desenvolveram uma grande
quantidade de raízes, produziram calos
friáveis que não formaram embriões e
não regeneraram brotos, e apresentaram
70% de oxidação. Estes resultados
indicam que a redução do 2,4-D em meio
indutor desfavorece a produção de calos
embriogênicos em B. brizantha.
Apesar da obtenção de calos
embriogênicos homogêneos e
sincronizados, a manutenção desses
calos em meio de indução por apenas
quatro meses foi determinante na
redução da capacidade de germinação
dos embriões. Quando ocorreu
germinação dos embriões somáticos
todos os brotos eram albinos, indicando
a inviabilidade de utilização do sistema
de embriogênese repetitiva para B.
brizantha devido à impossibilidade de
manutenção das culturas a longo termo.
Segmentos basais de brotos
albinos oriundos de embriogênese
somática repetitiva foram cultivados em
meio LS, que é suplementado com altas
concentrações de citocininas, visando à
reversão do albinismo pelo
favorecimento da diferenciação de proplastídeos em cloroplastos funcionais.
Os segmentos basais desenvolveram
multibrotações albinas, indicando que as
citocininas foram eficientes na indução
de brotação de gemas pré-existentes na
região meristemática, mas não sendo
eficiente para diferenciação dos proplastídeos.
Em cevada foi reportada a
presença de plântulas albinas nos
cultivares de primavera pela presença da
auxina 2,4-D (CHO et al., 1998).
Enquanto quem em cultivares de arroz a
freqüência de albinismo pode variar de
cinco a 100% dependendo das
condições de cultura e do tempo de
permanência no 2,4-D. Plantas
regeneradas de calos de um mês em
cultura eram verdes, enquanto aquelas
regeneradas de calos induzidos por 11
meses eram 100% albinas (KAWATA et
al., 1995), indicando que as
monocotiledôneas são mais sensíveis ao
efeito de 2,4-D em períodos mais longos
de cultura.
Apesar da obtenção de um
sistema sincronizado de regeneração,
este sistema demonstrou-se inviável
devido à produção de plântulas albinas.
Conclusão
O sistema de embriogênese repetitiva foi
testado para B. brizantha e demonstrou
ser bastante homogêneo e sincronizado
quanto à formação de embriões
somáticos. No entanto, uma vez que a
manutenção dos calos em subcultivos de
apenas cinco meses resultou em 100%
de plântulas albinas, a utilização deste
sistema para transformação genética fica
inviabilizada.
Figura 1. A) Calos embriogênicos
oriundos de embriogênese repetitiva
bastante homogêneos após 4 subcultivos
em MSCLind. B) EES com coloração
branca opaco e os embriões somáticos
de cor creme brilhante, com aspecto
perolado. C) ES em meio de
regeneração apresentando
anormalidades e retardamento na
elongação e germinação. D)
Multibrotação de plântulas albinas em
meio LS.
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