Componentes Orgânicos

Meios de cultura:
componentes e tipos de meio
Prof. Paulo Hercílio Viegas Rodrigues
Prof.
CEN001
CEN
001
Meios de Cultivo
• Meios de cultura consistem da associação
qualitativa e quantitativa de substâncias que
fornecem os nutrientes necessários ao
desenvolvimento (cultivo) de organismos fora
do seu meio natural.
Meios de Cultivo
- Soluções inorgânicas simples:
Solução de Knop (1865)
Solução de Knudson (1925)
Solução de Hoagland & Arnon (1938)
- Soluções mais completas:
White (White, 1943)
MS (Murashige & Skoog, 1962)
B5 (Gamborg et al, 1968)
KM (Kao & Michayluk, 1975)
Casos...
1- Aula em Cuiabá!
2- Guia com seqüência dos sais e orgânicos na
preparação do meio de cultivo
(evita colocar 2 x a mesma solução!!)
Fácil e $$$$...
Componentes Orgânicos
Vitaminas
-São fatores catalíticos de rotas metabólicas nas células;
-São utilizadas fração de 1 mg/L a 10 mg/L
* Primeiros trabalhos em cultura de tecidos
-Definida a mistura básica de vitaminas:
B1 (tiamina), B6 (piridoxina), ácido nicotínico (niacina),
ácido pantotênico e ácido ascórbico.
Tiamina: exerce maior estímulo para o crescimento.
Tiamina
Componentes Orgânicos
• Mio
Mio--inositol
inositol:
É um hexitol ou composto cíclico com grupos
-OH em todos os seus carbonos.
a concentração mais usada é 100 mg/L
 é incorporado a moléculas de fosfolipídeos da
membrana plasmática.
Componentes Orgânicos
• Fonte de Carbono:
Carbono
Células, tecidos e órgãos cultivados in vitro:
# são heterotróficos;
# dependem de fonte externa de energia;
# necessário incorporar fonte de carbono.
- Fornecem energia e esqueletos de carbono para:
* biossintese de polissacarídeos, aminoácidos e
proteínas, enfim para o crescimento da célula.
Componentes Orgânicos
• Fonte de carbono:
carbono
Sacarose 2 - 3%:
- é a mais utilizada nos meios (açúcar cristal);
- em presença de auxina contribui para a
diferenciação celular.
Outros açúcares (frutose, glicose, maltose,
galactose, celobiose).
Ácidos orgânicos e alcoóis (sorbitol)
 Em excesso conservam material vegetal (agente osmótico)
crescimento mais lento da cultura.
Componentes Orgânicos
• Misturas complexas:
complexas água de coco
extrato de levedura
extrato de malte
água de coco é a mais utilizada:
- estimula o crescimento de calo,
- aumenta a formação de embriões somáticos,
- induz o desenvolvimento de embriões
imaturos.
* Endosperma líquido!
Reguladores de crescimento
• Substâncias orgânicas que regulam o crescimento
crescimento,
diferenciação e desenvolvimento das plantas em
baixas concentrações (0,1 – 100 µM).
Auxinas
Citocininas
Giberilinas
Ac.. Abscísico
Ac
Etileno
Reguladores de crescimento
• AUXINAS: crescimento e alongamento celular
divisão celular
indução e crescimento de raízes
dominância apical
produção de etileno
In vitro: divisão celular
enraizamento
indução de calo
embriogênese somática
Abreviatura
P.M
Ácido 3-indolacético
AIA
175,20
Ácido naftalenoacético
ANA
186,20
Ácido indolbutírico
AIB
203,23
Ácido 2,4-diclorofenoxiacético
2,4-D
221,04
Ácido 4-clorofenoxiacético
4-CPA
184,50
Picloran
241,46
NOA
202,21
Reguladores
Auxinas
Ácido 4-amino-3,5,6-tricloropicolínico
Ácido naftóxiacético
Reguladores de crescimento
• Auxinas
AIA
AIB
ANA
2,4-D
2,4,5-T
Picloran
Dicamba
Naturais
Sintéticas
Substitutos de auxinas
Reguladores de crescimento
• Auxinas no meio de cultura:
cultura
- ANA bastante utilizado em protocolos de
estabelecimento (cerca de 51%);
- 2,4
2,4--D indução de calo mesmo em baixa concentração;
- AIB muito utilizado para enraizamento
enraizamento;
- AIA menos estável em meio de cultura (fotoxidação e
ação da AIA-oxidase).
Reguladores de crescimento
• CITOCININAS
CITOCININAS: derivadas da adenina (base púrica).
• In vitro:
vitro divisão celular
quebra da dormência apical
morfogênese (gemas adventícias)
desenvolvimento de brotos laterais
Reguladores de crescimento
Reguladores
Abreviatura
P.M
BAP ou BA
225,20
CIN
215,20
Isopenteniladenina
2iP
203,30
Zeatina
ZEA
219,20
Tidiazuron
TDZ
220,20
Citocininas
6-Benzilaminopurina ou 6Benziladenina
6-Furfurilaminopurina ou
Cinetina
Reguladores de crescimento
• Citocininas
Zeatina
2iP
BAP ou BA
Cinetina
TDZ
Naturais
Sintéticas
Substituto de citocinina
Reguladores de crescimento
• Citocininas no meio de cultura
- em excesso é tóxica, produzindo:
*Demasiado entufamento;
*Falta de alongamento das culturas;
*Redução do tamanho das folhas;
*Encurtamento dos entrenós;
*Hiperidricidade (vitrificação);
*Dificuldade de enraizamento;
*Variação somaclonal.
Estágios da propagação in vitro
Chapter 2
Chapter 4
Selection
0 of a Stage
I I:
superior
Introduction of
germplasm aseptic cultures
In vitro under
photomixotrophic
conditions
Stage II:
II
Multiplication
III III:
Stage
Rooting and
preparation
In vitro under
photoautotrophic
conditions
Chapter 3
Chapter 4
IV
Stage IV:
Acclimatization
Growth
Ex vitro under
controlled environment
conditions with
artificial light
Adaptado de Couceiro (2006)
Balanço citocinina
citocinina/auxina
/auxina (c/a)
• Alta relação c/a:
c/a promove a proliferação de
brotos; suprime a formação de raízes (estádio
II).
• Baixa relação c/a:
c/a favorece a formação de
raízes (estádio III).
• Concentrações iguais:
iguais propiciam a produção
de calo.
Foto c/a
• Exemplos:
•
•
•
•
Banana ?
Heliconia ?
Mirtilo ?
Mangaba ?
Outros Aditivos
• Antibiótico e fungicidas:
fungicidas
- Controle de contaminação microbiana;
- Não apresenta ação fitotóxica.
- Benomil (Benlate
Benlate))
- Cefotaxima sódica
Outros Aditivos
Polifenóis
Antioxidantes
Oxidação
Carvão ativado
Ácido ascórbico
Escurecimento
Ácido cítrico
L-cisteína
Morte da planta
Polivinilpirrolidona (PVP)
• Carvão ativado: 1 a 3 %
- adsorção de fenóis;
- adsorção de componentes orgânicos (auxinas e
citocininas);
- contribui para a morfogênese e embriogênese;
- desenvolvimento de raízes;
- estabiliza pH.
Meios de cultura – forma física
• Líquido
• Semi sólido:
sólido
– Agar
– Goma (Gelrite, Phytagel)
– Agarose
Bifásico: meio semi-sólido coberto com meio líquido.
Bifásico
Meio de cultura líquido
• Condições de cultivo + uniformes;
• Renovação do meio sem mudança de recipiente;
• Esterilização pode ser por microfiltração
microfiltração;
• Lavagem dos recipientes + fácil;
• Asfixia e hiperidratação dos explantes –
distúrbios fisiológicos.
fisiológicos
Sistemas de suporte
• Agar: mistura de polissacarídeos derivados de
•
•
•
•
algas marinhas.
- fusão: 100C
- solidificação: 45C
- concentração: 0,6 – 1,0%
Não reage com componentes do meio de cultivo;
Não é digerido pelas enzimas das plantas;
Não solidifica em pH ácido;
Impurezas (sais inorgânicos, compostos
orgânicos, fenóis, etc)
Sistemas de suporte
 Goma
Goma: polissacarídeo produzido pela bactéria
P.elodea;
• Phytagel (Sigma), Gelrite (Merck) – 0,2%
• Mais translúcido que o ágar (contaminação)
• Impurezas (sais inorgânicos)
• Não contém componentes orgânicos
• Solidifica na presença de ions de Ca e Mg
 Agarose
Agarose: extraído do ágar, alto grau de pureza
 Mecânico
Mecânico: pontes de papel de filtro (meio
líquido).
Variantes Somaclonais de H.bihai,
obtidas in vitro
vitro..
Variantes Somaclonais de H.bihai,
obtidas in vitro.
Variabilidade genética que ocorre
em decorrência do processo in
vitro!
 repicagens, reguladores de
crescimento e tempo de cultivo.