DIVERSIDADE GENÉTICA DE POPULAÇÕES

DIVERSIDADE GENÉTICA DE POPULAÇÕES NATURAIS DE Anthonomus grandis Boheman
(COLEOPTERA: CURCULIONIDAE)*
Walter Fabrício Silva Martins (UEPB/CCBS), Constância Flávia Junqueira Ayres (CPqAM/FIOCRUZ),
Wagner Alexandre (Embrapa Algodão / [email protected])
RESUMO - A diversidade genética e o padrão de dispersão do bicudo do algodoeiro Anthonomus
grandis foi avaliado em onze populações naturais provenientes das regiões norte, nordeste e centrooeste do Brasil através da análise de 8 loci de microssatélites. A maior diversidade genética foi
encontrada na população de Itaporanga (P = 75% e HO = 0,224) e a menor em Indiara (P = 37,5% e HO
= 0,038). Os marcadores analisados revelaram baixa variabilidade genética intra-populacional,
sugerindo que a colonização deste inseto no Brasil ocorreu em uma ou poucas áreas, com pequeno
número de indivíduos. A variabilidade genética inter-populacional demonstrou que a diferenciação
genética é maior no ecossistema do Cerrado do que na Caatinga, possivelmente devido ao programa
de controle empregado nesta região. Considerando as regiões geográficas a diferenciação genética
observadoa na região Centro-Oeste (FST = 0,281) foi maior que a observada na região Nordeste (FST =
0,08). O fluxo gênico entre as populações se mostrou maior na região de Caatinga do que no Cerrado.
Entretanto, foi detectado elevado fluxo gênico entre as populações do Cerrado e entre as populações
da Caatinga, sugerindo que o transporte passivo de insetos tem efeito maior do que a distância
geográfica na estrutura genética das populações.
Palavras-chave: bicudo do algodoeiro, fluxo gênico, marcadores moleculares, variabilidade genética.
INTRODUÇÃO
O bicudo do algodoeiro Anthonomus grandis Boheman é a principal praga da cotonicultura
mundial, ocasionando danos que repercutem principalmente na produtividade, perda na qualidade do
algodão colhido e gastos com medidas de controle. Este inseto é nativo do México ou da América
Central, tendo recebido maior atenção a partir do momento em que passou a ser conhecido como
praga nos Estados Unidos por volta de 1890 (BURKE et al., 1986). No Brasil, a presença do bicudo do
algodoeiro foi notificada pela primeira vez em fevereiro de 1983, em plantações de algodão de Santa
Bárbara do Oeste, São Paulo, dispersando-se posteriormente, para os estado da Paraíba,
Pernambuco, Rio Grande do Norte e Ceará (LOZADA et al., 1987).
A introdução do bicudo do algodoeiro no Brasil causou redução na produção e crise na
cotonicultura nacional durante a segunda metade da década de 80. A expansão da cotonicultura para o
Cerrado Brasileiro a partir de 1996 e as novas políticas de controle do bicudo, fez com que o Brasil
voltasse a ser um dos cinco maiores produtores de algodão no mundo (DEGRANDE et al., 2005).
As três maiores áreas de produção de algodão do Brasil estão situadas nos estados do Mato
Grosso e Goiás (Centro-Oeste) e Bahia (Nordeste). Entretanto, a cotonicultura também faz parte do
agro-ecossistema de vários outros estados do Norte e Nordeste. Atualmente, quase todas as áreas de
cultivo de algodão no Brasil estão infestadas por esta praga. As regiões produtoras têm mantido
*
Instituições financiadoras: Embrapa Algodão e Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães/FIOCRUZ
diferentes programas de controle, no entanto, nenhuma conseguiu erradicar completamente o bicudo,
embora, cada região tenha conseguido alcançar diferentes níveis de controle.
O conhecimento do padrão de dispersão de uma espécie praga é um aspecto fundamental
para a elaboração de programas de controle mais eficientes. A dispersão de indivíduos entre as
populações podem ser medidas de forma indireta através do fluxo gênico, a partir de medidas de
estruturação genética (BOSSART e PROWELL, 1998).
Os marcadores de DNA, especialmente microssatélite, têm desempenhado um papel importante na
análise da diversidade genética de populações naturais de diversas espécies. Os primeiros estudos
realizados com marcadores moleculares em populações de A. grandis ocorreram no final da década de
70 empregando isoenzimas (BANCROFT e JONES, 1977; BIGGERS e BANCROFT, 1977; BARTLETT,
1981; BARTLETT et al. 1983; TERRANOVA e NORTH, 1985; TERRANOVA et al, 1991).
Posteriormente, Roehrdanz e North (1992) e Roehrdanz (2001) utilizaram o Polimorfismo do
Comprimento do Fragmento de Restrição (RFLP) e DNA mitocondrial (DNAmt) de A. grandis para
estudos de sistemática molecular em insetos coletados nos Estados Unidos. Kim e Sappington (2004
a,b) por sua vez utilizaram RFLP/DNAmt e Polimorfismo do DNA Amplificado Randomicamente (RAPD)
para analisar a dispersão do bicudo do algodoeiro no Sul dos Estados Unidos. A estimativa indireta do
fluxo gênico revelada pelos dois marcadores indicou freqüente movimentação de insetos entre
populações separadas por menos de 300 km. Scataglini et al. (2000) utilizaram (RAPD) para analisar
populações de bicudo do algodoeiro da América do Sul. Os dados obtidos sugeriram a ocorrência
natural de A. grandis na América do sul, antes do cultivo extensivo de algodão e onde em alguns
casos, o fluxo gênico entre as populações e a distância geográfica não estão correlacionados. Embora
o Brasil seja um grande produtor de algodão, com grandes áreas de cultivo, apenas o trabalho
realizado por Martins et al. (2007), utilizando isoenzimas e RAPD descreve o padrão de diversidade e
estrutura genética das populações naturais de A. grandis das regiões Nordeste e Centro-Oeste do
Brasil.
O objetivo foi caracterizar o padrão de dispersão e a estrutura genética das populações
naturais de A. grandis coletadas nas regiões Norte, Nordeste e Centro-Oeste do Brasil.
MATERIAL E MÉTODOS
Maçãs e botões florais encontrados sobre o solo, com presença de orifícios de oviposição,
foram coletados entre 2002 e 2005 em campos de algodão localizados nas regiões Norte, Nordeste e
Centro-Oeste do Brasil, em ecossistemas de Caatinga e Cerrado (Tab 1). As populações de A. grandis
de Goiás (GO), Mato Grosso (MT) e Bahia (BA) foram coletadas em áreas de Cerrado, onde é
praticado um sistema de plantio empresarial. Enquanto que as populações da Paraíba (PB) e Ceará
(CE) estão inseridas em um ecossistema de Caatinga, onde predominantemente ocorre a agricultura
familiar. A população do Pará (PA) foi coletada em região de transição do Cerrado com floresta
Amazônica.
Para amplificação dos oito loci de microssatélites foram utilizados primers específicos para A.
grandis descritos por Kim e Sappington (2004 c). As reações de amplificação foram realizadas em um
volume final de 25 µL usando de 15-40 ng do DNA genômico, MgCl2 1,5 mM, 200 µM de cada dNTP,
0,16 µM de cada primer e 0,2 U de Taq DNA polimerase (Amersham). As amplificações foram
realizadas em um termociclador gradiente Eppendorf programado para 3 min a 94 ºC, seguido por 30
ciclos de 1 min a 94 ºC, 1 min a 57 ºC e 1 min a 72 ºC, com extensão final de 72 ºC por 10 min. Os
amplicons obtidos foram submetidos à eletroforese desnaturante (acrilamida 6% e Uréia 7 M) em cuba
de seqüenciamento por 4 horas. Posteriormente, o produto obtido foi corado com nitrato de prata, de
acordo com o protocolo descrito por Creste et al. (2001).
A matriz alélica obtida da análise dos géis foi utilizada para estimar a heterozigosidade
esperada (HE) e a observada (Ho) de acordo com Nei (1987) e a proporção de loci polimórficos,
considerando o critério de 95% e utilizando-se o programa GENETIX 4,05 (BELKHIR et al., 2001). As
análises de diferenciação genética (FST) entre as populações foram realizadas de acordo com Weir e
Cockerham (1984) no programa FSTAT versão 2.9.3. A distância genética de Nei (1972) foi utilizada
para a construção do dendrograma utilizando o método neighbour-joining no programa MEGA 3 versão
3.0 (KUMAR et al., 2004).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Dos oito locos de microssatélites analisados nas 11 populações de A. grandis do Brasil, dois
foram monomórficos em todas as populações. Os outros seis foram polimórficos em pelo menos cinco
populações. O número de alelos por locus variou de 1 a 5, com médias de 1,5 a 2,12 alelos por
população (Tabela 1). A maior diversidade genética foi encontrada na população ITA na Paraíba (P =
75% e HO = 0,224) e a menor em IND em Goiás (P = 37,5% e HO = 0,038) (Tab. 1), com
heterozigosidade total correspondendo a 0,268. Considerando os ecossistemas de Cerrado e Caatinga,
a heterozigosidade total correspondeu a 0,184 e 0,078, respectivamente, sendo a diferença de
heterozigosidade entre os dois ecossistemas significativa (p < 0,05). Índices de diversidade genética
similares aos observados no presente trabalho também foram obtidos por marcadores de RAPD (H =
0,262) e isoenzimas (H = 0,212), nas populações brasileiras analisadas por Martins et al. (2007). Kim e
Sappington (2004 c) estudando os mesmos loci de microssatélite, verificaram um maior número de
alelos por locus, que variaram de 3 a 10. Entretanto, naquele trabalho os autores empregaram
amostras de bicudo provenientes de diferentes regiões do Texas-EUA e México, revelando um HO que
variou de 0,089 a 0,689. Os índices de diversidade genética obtidos no presente trabalho, embora
tenham sido baixos, mostraram diferentes níveis de variação genética (Ho) nas populações, o que
permitiu a distinção das populações oriundas das regiões Norte e Nordeste daquelas coletadas no
Centro-Oeste (Tab 1).
A diferenciação genética (FST), considerando todas as populações, correspondeu a 0,220. A
diferenciação entre as populações par a par, variou de 0,009 (CG e MV) a 0,523 (BARR e GOU).
Considerando a diferenciação entre as populações dentro de cada região o FST foi maior na região
Centro-Oeste (0,281) e menor na região Nordeste (0,08), sendo a diferença de estruturação genética
observada nas duas regiões significativa (p < 0,05). No ecossistema da Caatinga, o FST correspondeu a
0,061, enquanto que no ecossistema de Cerrado o FST foi de 0,305.
O fluxo gênico entre todas as populações foi baixo (Nm = 0,8). Entretanto, na região Nordeste o
número de migrantes correspondeu a 2,87, enquanto que no Centro-Oeste o Nm foi de 0,64. Em
relação aos dois ecossistemas o Nm foi de 3,84 na Caatinga e no Cerrado de 0,57. Os valores de FST e
Nm observados nas populações do Cerrado brasileiro indicaram a eficiência dos programas de
controle mantidos nesta região, através da restrição do fluxo gênico entre as populações, mesmo
estando localizadas em ambiente de cultivo homogêneo propício à proliferação do bicudo do
algodoeiro. No entanto, a eliminação completa deste inseto-praga nas regiões produtoras do Cerrado
pode ser prejudicada principalmente pela ausência de programas de controle na região Nordeste, onde
observou-se os maiores índices de diversidade genética e fluxo gênico entre as populações.
A distância genética de Nei (1978) calculada ente as populações variou de 0,04 entre Missão
Velha e Campina Grande a 0,204 entre Barreiras e Gouvelândia. O dendrograma construído utilizando
o método neighbour-joining (Figura 1) a partir dos valores de distância genética revelou a presença de
dois grupos: o primeiro formado pelas populações do Nordeste mais Ipameri e Indiara (Centro-Oeste) e
o segundo constituído pela população Redenção (Norte) e demais populações do Centro-Oeste. Isso
mostra claramente a ocorrência de uma ancestralidade entre as populações do Nordeste em relação as
populações de Ipameri e Indiara (Centro-Oeste). Os dois agrupamentos formados também sugerem
que a introdução de A. grandis na região Centro-Oeste ocorreu a partir de populações de grupos
genéticos distintos.
Tabela 1. Populações de A.grandis estudadas, número médio de alelos detectados (na) e medidas de
variabilidade genética: heterozigosidade observada (HO) e esperada (HE) e Polimorfismo (P).
Região
População/abreviação
Centro-Oeste Ipameri, IPA
Itumbiara, ITU
Indiara, IND
Gouvêlandia, GOU
Primavera do Leste, PL
Nordeste
Campina Grande, CG
Itaporanga, ITA
Barbalha, BARB
Missão Velha, MV
Barreiras, BARR
Norte
Redenção, RE
Estado
na
Goiás (GO)
1,87
1,62
1,50
1,62
Mato Grosso (MT) 1,50
Paraíba (PB)
2,00
2,12
Ceará (CE)
1,87
1,87
Bahia (BA)
1,62
Pará (PA)
2,12
HO
HE
P
0,198
0,039
0,038
0,060
0,063
0,202
0,224
0,140
0,166
0,044
0,109
0,274
0,163
0,167
0,124
0,170
0,224
0,340
0,225
0,216
0,136
0,171
0,500
0,625
0,375
0,500
0,375
0,625
0,750
0,625
0,625
0,500
0,625
ITA
PL
IPA
GOU
BARR
49
73
30
19
66
52
RE
ITU
68
59
IND
CG
MV
BARB
Figura 1. Dendrograma construído pelo método neighbour-joining, baseado na distância genética de
Nei (1978), mostrando o relacionamento entre as populações de A. grandis do Brasil.
As populações estão listadas na Tabela 1. Os números nos ramos correspondem aos valores
de Bootstrap obtidos através de 1000 permutações.
CONCLUSÕES
Os índices de diversidade genética (Ho) e (P) obtidos no presente trabalho mostraram
diferentes padrões de estruturação genética nas populações oriundas dos agroecossistemas
estudados, revelando que as populações coletadas nas áreas onde é praticada a agricultura
empresarial apresentam variabilidade genética menor que a observada nas populações coletadas nas
áreas onde é realizada a agricultura em pequena escala. Desta forma, a implantação de programas de
controle na região Nordeste do país é fundamental para o sucesso das estratégias que visam à
erradicação do bicudo, pois esta região está funcionando como reservatório do pool gênico das
populações de A. grandis do Brasil, o que a torna uma possível fonte para a reintrodução do bicudo do
algodoeiro em áreas que estão em processo de erradicação do mesmo.
CONTRIBUIÇÃO PRÁTICA E CIENTÍFICA DO TRABALHO
O conhecimento sobre os padrões de dispersão e variabilidade genética das populações do
bicudo do algodoeiro possui especial aplicabilidade nos programas de controle da praga, constituindose em prática já empregada em larga escala em vários programas de controle de insetos-praga e
vetores executados com sucesso em todo o mundo. As ferramentas moleculares oferecem a
possibilidade de obtermos respostas rápidas e precisas com um espaço amostral menor.
Adicionalmente, os genes que conferem resistência aos agentes de controle empregados também
podem ser monitorados a fim de evitar o desenvolvimento da resistência e conseqüente perda de
eficiência do programa de controle.
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