Instituto de Investigação em Imunologia

PROGRAMA DA REITORIA DA USP DE INCENTIVO À PESQUISA
PROJETO:
INSTITUTO DE INVESTIGAÇÃO EM IMUNOLOGIA
Coordenador:
JORGE KALIL
Sede do Núcleo:
Laboratório de Imunologia do Instituto do Coração
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
(VERSÃO EM PORTUGUÊS)
2011
INSTITUTO DE INVESTIGAÇÃO EM IMUNOLOGIA
PROJETO DE PESQUISA:
PARTE A: INTRODUÇÃO
PARTE B: PROJETO III-INCT
PARTE C: PROJETOS ADICIONAIS
PARTE D: ORÇAMENTO
PARTE E: CRONOGRAMA
PARTE A - INTRODUÇÃO
0
PARTE A - INTRODUÇÃO
SUMÁRIO
1. Introdução e Apresentação do Projeto .................................................................................. 01
2. Relevância da Proposta ........................................................................................................ 02
3. Diferencial para a USP .......................................................................................................... 02
4. Qualificação e Arranjo Institucional ....................................................................................... 03
5. Coerência entre Objetivos e Estratégia ................................................................................. 03
1
PARTE A - INTRODUÇÃO
1. INTRODUÇÃO E APRESENTAÇÃO DO PROJETO
Apresentamos como proposta para o Programa de Incentivo à Pesquisa da PróReitoria de Pesquisa da USP uma extensão das atividades do Instituto de Investigação em
Imunologia – Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia (iii-INCT), cuja sede encontra-se na
Faculdade de Medicina da USP. Além das áreas de pesquisa presentes na proposta do iiiINCT, esta extensão compreende a inclusão de três novas áreas de pesquisa. Com esta
proposta planejamos a aquisição de novos equipamentos, bem como verbas de custeio,
essenciais para a execução dos projetos. A proposta está organizada da seguinte maneira: A)
introdução geral à proposta; B) o projeto iii-INCT, tal como foi enviado e apoiado pelo CNPq
em 2008 para ser um dos INCTs; C) projetos adicionais, correspondentes a novas áreas de
atuação; D) o orçamento desta proposta, com sua justificativa detalhada; E) cronograma de
execução.
O iii-INCT conta com 15 membros da equipe ligados à USP, provenientes de 5
Unidades diferentes, os quais coordenam 8 das 10 áreas temáticas/subprojetos. Além disso, o
instituto também conta com 18 pesquisadores principais de outras instituições de diferentes
estados, obedecendo a estrutura multirregional intrínseca dos INCTs. A equipe completa do iiiINCT, entre pesquisadores, colaboradores, alunos e técnicos, é de 244 membros, dos quais
139 têm vínculos com a USP, e inclui 33 colaboradores internacionais. Além dos
pesquisadores principais, o iii-INCT também conta com diversos pesquisadores colaboradores,
totalizando o envolvimento de 7 Unidades da USP.
As áreas temáticas nas quais o iii-INCT atua são: Autoimunidade, HIV/AIDS,
Imunodeficiências, Doenças infecciosas tropicais, Transplante e Imunorregulação, Câncer e
Alergia. Incluímos como novas áreas de atuação, Dengue, Doença de Chagas e o uso
terapêutico de células tronco mesenquimais, de amplo interesse para o nosso País. A
solicitação orçamentária visa a aquisição de equipamentos multiusuários, fundamentais em
todas as áreas de atuação do Projeto, assim como ao desempenho de várias plataformas
tecnológicas. Visa também a aplicação de recursos em custeio, basicamente como “seed
money” para insumos, de forma a acelerar o desenvolvimento de projetos transdisciplinares.
Dentre os equipamentos, os dois de mais alto custo (espectrômetro de massa MALDI-Tof/Tof e
sintetizador múltiplo de 96 peptídeos), têm ampla gama de uso, e serão os únicos em toda a
FMUSP e Complexo Hospital das Clínicas, o que trará evidente benefício para toda nossa
Unidade.
2
2. RELEVÂNCIA DA PROPOSTA
A Imunologia é o primeiro ramo da Medicina Molecular – fronteira no desenvolvimento
de agentes terapêuticos – que desenvolveu e usou biofármacos para o tratamento de
diferentes doenças. Somente com estratégias inovadoras pode-se desenhar vacinas eficazes
contra patógenos complexos, para os quais ainda não existem vacinas, como o HIV e o
estreptococo. As áreas de atuação do iii-INCT envolvem problemas de saúde que afetam
milhões de pessoas em nosso País e no mundo, como doenças infecciosas, câncer, alergia e
outros distúrbios do sistema imune. Além da relevância sócio-econômica, estas doenças são
também modelos biológicos importantes, na medida em que permitem avançar no
conhecimento dos mecanismos fisiopatológicos, possibilitando a intervenção terapêutica
orientada pela patogenia, além de novos produtos diagnósticos e profiláticos, sem perder a
atenção às políticas de saúde.
Desde seu início em 2001, o iii-INCT tem como objetivo a tradução do conhecimento
básico em avanços da prática médica – especificamente, na Imunologia Clínica. A pesquisa de
tradução envolve o estabelecimento de rotas tecnológicas para o desenvolvimento de diversos
produtos imunobiológicos, desde a fase de descoberta de mecanismos fisiopatológicos,
passando pela inovação no desenho de biofármacos baseados nestes mecanismos (portfólio
de produtos), experimentação em animais, produção com boas práticas de manufatura/GMP,
até os testes clínicos fase I/II. O iii-INCT tem mostrado sinergia para a identificação e teste de
alvos terapêuticos e vacinas, formação de recursos humanos para a pesquisa de tradução,
bem como para a significativa produção científica em periódicos de alto impacto.
3. DIFERENCIAL PARA A USP
O principal diferencial competitivo para a USP a ser trazido por essa proposta é a
inédita consolidação de uma estrutura de pesquisadores complementares em rede, com rotas
tecnológicas completas para a pesquisa de tradução e produção de imunobiológicos em
projetos liderados por nossos pesquisadores. Alguns dos projetos e produtos que integram a
proposta podem realmente ter alcance e repercussão mundiais, como o estudo aprofundado de
questões fundamentais relativas à Dengue e células-tronco, vacinas para o HIV, o estreptococo
e leishmaniose, e os imunomoduladores para doenças autoimunes e rejeição a aloenxerto,
colocando a USP em novos e importantes fórums de discussão. O projeto atende, dessa forma,
a necessidade de interação com a sociedade e devolução do conhecimento gerado na forma
de produtos inovadores para a saúde, inaugurando um novo formato de pesquisa associada
em rede.
3
4. QUALIFICAÇÃO E ARRANJO INSTITUCIONAL
A qualificação da equipe de pesquisadores do iii-INCT pode ser aferida pela sua
produção científica e formação de recursos humanos entre 2001 e 2009: foram responsáveis
por 785 publicações, cerca de 20% da produção indexada em Imunologia no Brasil; foram
realizados 8 ensaios clínicos e foram formados 35 pós-doutores, 195 doutores e mestres, e 100
alunos de iniciação científica. Oito das 10 áreas de pesquisa do iii-INCT são lideradas por
pesquisadores da USP. Seis membros da equipe USP são pesquisadores bolsistas de
produtividade 1 do CNPq, e 6 pesquisadores USP associados a programas de pós-graduação
de nível 6 ou 7 na CAPES. Contando os colaboradores de outras instituições, 22 dos 32
integrantes da proposta são pesquisadores 1 do CNPq, e 18 são associados a programas de
pós-graduação de nível 6 ou 7 na CAPES. A equipe completa do iii-INCT, entre pesquisadores,
colaboradores, alunos e técnicos, é de 244 membros. O arranjo institucional inclui destacados
cientistas e especialistas da USP e instituições colaboradoras, que dominam áreas
complementares para montar toda a rota tecnológica (médicos clínicos e cirurgiões,
imunologistas básicos e clínicos, geneticistas, virologistas, bioquímicos, biólogos, biólogos
moleculares, especialistas em bioinformática, biotecnólogos, médicos veterinários). Além das
áreas temáticas, há plataformas tecnológicas horizontais que interagem de forma matricial com
cada área, propiciando a base técnica para execução dos projetos. O Instituto é administrado
por um Comitê Gestor composto por pesquisadores do iii-INCT.
5. COERÊNCIA ENTRE OBJETIVOS E ESTRATÉGIA
A estratégia usada pelo iii-INCT para alcançar seus objetivos baseia-se no paradigma
da abordagem integrada da pesquisa de tradução, a partir da observação clínica e
conhecimento
da
patogenia.
A
abordagem
multidisciplinar,
com
associação
entre
pesquisadores cobrindo expertises complementares, capacita o nosso Instituto a produzir
resultados com menor perda de energia, tempo e recursos, introduzindo o iii-INCT no caminho
da identificação e teste de novos alvos imunomodulatórios e vacinas. Isso permite a seleção
dos alvos terapêuticos mais adequados e, facilitará a transferência do conhecimento adquirido
para a beira do leito. A associação com empresas públicas e privadas, como o Instituto
Butantan e a EMS Farmacêutica, acelerará as etapas finais de desenvolvimento dos produtos.
PARTE B – PROJETO III-INCT
0
PARTE B - PROJETO III-INCT
Ministério da Ciência e Tecnologia – MCT
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES
Edital 15/2008 – Institutos Nacionais de Ciência e Tecnologia
Instituto de Investigação em Imunologia
Sumário:
1. Justificativa e Qualificação
1
2. Projetos:
10
a. Auto-imunidade
10
b. HIV/AIDS
21
c.
37
Imunodeficiências
d. Doenças Infecciosas-Leishmaniose
40
e. Transplantes
49
f.
Câncer
62
g. Alergia
76
3. Plataformas:
84
a. Imunogenômica
84
b. Proteômica
87
c.
89
Epidemiologia e Ensaios Clínicos
d. Produção de Imunobiológicos
95
e. Bioinformática
100
f.
101
Qualidade
g. Ensino e Interação com a Sociedade
105
4. Metodologia
112
5. Caracterização da Rede e Grupo Proponente
121
6. Infraestrutura
139
7. Orçamento Justificado
151
8. Informações Complementares
159
(Auxílios últimos 5 anos, publicações 2005-8 , Formação
de recursos humanos e situação profissional atual)
9. Cronograma de Execução
216
10. Bibliografia
220
1
1. Justificativa e Qualificação
Desde a sua criação em 2001, o Instituto de Investigação em Imunologia (iii) tem
como objetivo principal a consolidação e expansão da pesquisa de tradução na área de
Imunologia no Brasil. A Imunologia é uma das áreas das Ciências Biológicas que mais se
desenvolveu na segunda metade do século XX, fato evidenciado, inclusive, pela atribuição
de 6 Prêmios Nobel de Medicina neste período. A grande expansão do conhecimento básico
precisa ser traduzida em avanços da prática médica, no desenvolvimento de novos e nas
políticas de saúde. O iii tem apresentado um sucesso consistente em estimular grupos de
pesquisa básica a investir no desenvolvimento de produtos, dos quais já conta com um
portfólio considerável. O Instituto também avançou na aproximação de grupos básicos e
clínico-cirúrgicos, alguns deles com imunobiológicos já em testes clínicos avançados. A
proposta atual do iii visa consolidar e expandir as áreas de pesquisa de tradução em
Imunologia, além de atuar firmemente na educação científica e na interação com a
sociedade, reforçando ainda a sua atuação na fundamentação científica para as políticas
públicas. Um outro ponto crítico desta etapa, e que complementa a nossa estratégia, é a
interação com empresas do setor privado e público. A interação academia-empresa é, ainda
hoje, um gargalo no desenvolvimento do setor de Ciência, Tecnologia e Inovação no Brasil.
Ademais, a nossa própria trajetória demonstra que obstáculos relacionados com produção
em maior escala e em condições de boas práticas de manufatura necessitam de soluções
ágeis, que podem ser facilitadas através da interação dos setores produtivos privados com o
setor público e a academia. Na busca de soluções para esses obstáculos, nós temos
interagido com setores empresariais ligados à área de atuação do iii, e temos cartas de
interesse na parceria com o iii para a superação desses problemas (www.iii.org.br/info).
Sabe-se hoje que várias doenças previamente tidas como de etiologia obscura, na
verdade decorrem de disfunções imunológicas, quer por um exacerbado processo
inflamatório, quer pela sua ausência. As áreas de atuação do iii (infecções, doenças autoimunes, imunodeficiências primárias e HIV/AIDS, transplantes, câncer e alergias) envolvem
problemas de saúde que afetam, hoje, milhões de pessoas em nosso País e no mundo. Além
da relevância sócio-econômica, estas doenças são também modelos biológicos importantes,
na medida em que permitem avançar no conhecimento dos mecanismos fisiopatológicos,
possibilitando a intervenção terapêutica orientada pela patogenia.
No Brasil, nos últimos anos, houve grande desenvolvimento da Imunologia com a
publicação de um número significativo de trabalhos em periódicos com alto nível de impacto,
o que colocou a Imunologia em posição de destaque dentre as áreas de pesquisa brasileiras
no contexto mundial. O reconhecimento internacional da Imunologia brasileira também é
patente pelo aumento do número de citações, um dos maiores entre todas as áreas
científicas brasileiras. Outra ação importante foi a realização do Congresso Internacional de
Imunologia no Brasil em 2007, que teve o seu corpo dirigente composto principalmente por
2
membros do iii. Este congresso, o maior evento da Imunologia mundial, realizado a cada 3
anos, obteve expressivo reconhecimento científico e organizacional, reiterando a inserção da
Imunologia brasileira no contexto internacional. Embora a Imunologia brasileira ainda tenha
maior destaque na área de doenças endêmicas/parasitárias, o Congresso propiciou
interações em diversas áreas. Acreditamos que este evento tenha deixado sementes
duradouras.
Para continuarmos a progredir, há necessidade de romper as dificuldades ainda
existentes na inovação tecnológica em saúde no Brasil. Como conseqüência, a aplicação
clínica de resultados de pesquisa em Imunologia básica produzida em nosso País ainda é
rara. O alinhamento de pesquisa de tradução, inovação tecnológica em saúde, e pesquisa
clínica, em vigência no iii, pode ser um modelo para outras áreas. Assim, na primeira fase do
iii (2001-2005) focamos na tradução do conhecimento básico em Imunologia para a
aplicação clínica, no desenvolvimento de novas vacinas e imunobiológicos e no
aprimoramento diagnóstico, consolidando a rede de pesquisadores. Na segunda fase (20062008), expandimos o portfólio de produtos em teste e atuamos decisivamente na prática
clínica, com ensaios clínicos para o tratamento de tumores e de doenças infecciosas. Na
proposta atual, aumentamos o foco nos produtos potenciais mais promissores para ensaios
clínicos e com possibilidade de produção em maior escala, em associação com empresas.
Faremos esforço especial para implementar a na produção piloto para ensaios clínicos,
propiciando a definitiva incorporação destes métodos produtivos ao País. Expandiremos a
atuação em pesquisa clínica.
Nas etapas anteriores, o iii desenvolveu uma plataforma de educação e ensino, com
utilização intramural. Agora esta plataforma se expandirá para incluir a Interação com a
Sociedade, atuando também no ensino médio e na graduação, e mantendo a interação com
associações de pacientes e populações-alvo das intervenções. Vamos atuar na relação da
sociedade com a ciência, utilizando a Imunologia como modelo.
Na primeira etapa, de 2002 a 2005, formamos 18 mestres, 25 doutores, treinamos 29
pós-doutores; publicamos 170 trabalhos em periódicos indexados, realizamos 5 ensaios
clínicos e entramos com 4 pedidos de patente. Além disto e, talvez, ainda mais relevante,
implementamos uma efetiva rede complementar de competências técnicas e científicas
(visão global da patogenia, biotecnologia e pesquisa clínica) que nos permitiu fazer a rota
tecnológica que vai da pesquisa fundamental à aplicação clínica.
Na segunda fase (2005-2008) formamos 76 mestres, 66 doutores, treinamos 35 pósdoutores; realizamos 2 ensaios clínicos e entramos com 3 pedidos de patente no exterior. A
produção científica dos 31 pesquisadores membros do iii no período de 2005-2007
representou 23% (435/1917) da publicação indexada em Imunologia brasileira no mesmo
período (dados Lattes e Scimago, www.scimagojr.com). Estes dados mostram que a base
sólida de ciência do iii tem sido e continuará sendo fundamental para a alimentação do
3
processo de novas descobertas com potencial aplicação. Consolidamos a abordagem
matricial, abordando os problemas científicos de cada uma das áreas de atuação com as
plataformas transversais de imunogenômica, proteômica, bioinformática, epidemiologia e
ensaios clínicos, imunobiológicos e formação e ensino.
A atuação do iii confirma a vantagem de uma ação sinérgica com fertilização
cruzada, decorrente do trabalho em rede. Assim, para o próximo período, a atuação do iii
continuará nas áreas de Imunologia Clínica originalmente propostas, a saber: Doenças
Infecciosas Tropicais, Doenças Auto-imunes, HIV/AIDS, Imunodeficiências, Transplante,
Câncer e Alergia, concentrando o seu foco na imuno-intervenção e produtos vacinais,
imunomoduladores e diagnóstico molecular, chegando à fase de produção piloto para
ensaios clínicos através da interação com empresas. Na etapa atual, temos o potencial de
produzir 9 imunobiológicos em diferentes formulações e elaborar 12 ensaios clínicos,
precedidos pelo número correspondente de testes pré-clínicos. Antecipamos que alguns
desses ensaios sejam iniciados e até concluídos durante o primeiro triênio. Esperamos com
isto solicitar até novas 10 patentes. Na nova proposta, ora apresentada, foram incorporados
pesquisadores que trazem novas expertises ao nosso Instituto, nas áreas de bioinformática,
qualidade, epidemiologia e estudos pré-clínicos, o que certamente contribuirá para
superarmos dificuldades que identificamos em nossa rota tecnológica no transcorrer dos
primeiros anos de atividade. Continuaremos a desempenhar a missão que julgamos
essencial, de formação de pessoal em pesquisa de tradução, buscando criar essa cultura na
comunidade científica de nosso país.
A continuidade do iii - agora como um dos Institutos Nacionais de Ciência e
Tecnologia - permitirá que o trabalho desta rede consolidada de pesquisadores, provido de
uma diversidade de conhecimentos, de sólidas instalações tecnológicas, amplie o retorno
para a sociedade obtido nas fases anteriores. Também nesta etapa, o iii incrementará a sua
aproximação com empresas públicas e privadas, permitindo a sua consolidação definitiva,
preenchendo uma lacuna importante na aproximação entre a academia e empresas. Desta
forma, o iii será capaz de atuar nos 3 Ps da pesquisa de tradução - produtos, prática e
contribuição para as políticas de saúde.
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QUALIFICAÇÃO DO GRUPO:
Nos seis anos de trabalho conjunto nas duas etapas anteriores do iii, foram criados
vínculos científicos e operacionais entre os diversos grupos que compõem o iii que nos
capacitam de maneira única para executar pesquisa de tradução em saúde com uma forte
vertente em estudos das bases fisiopatológicas de doenças que afetam o sistema imune. Isto
permitiu que refinássemos, neste estágio, a proposta de trabalho, priorizando projetos com
claro potencial de obtenção de imunobiológicos e com alto impacto social e econômico para
o Brasil. O iii possui uma combinação única de pesquisadores, biotecnólogos e médicos
clínicos e cirurgiões, tanto no grupo central como entre os colaboradores. Dos 33 integrantes
principais do nosso grupo, 27 são pesquisadores do CNPq, sendo que 22 destes são
pesquisadores nível 1.
Nas etapas anteriores, identificamos que os grandes gargalos para a execução de
pesquisa de tradução em nosso País estão nas áreas de 1) produção em condições de Boas
Práticas de Manufatura, 2) testes pré-clínicos e, 3) falta de apoio institucional para tratar da
questão
da
propriedade
intelectual.
Para
resolver
estes
problemas,
assumimos
compromissos com a maior empresa privada na área de manufatura de fármacos no Brasil
(EMS) que cederá área e funcionários para produção GMP de imunobiológicos, além de
estreitarmos nossos laços com o Instituto Butantan, instituição pública reconhecidamente
capacitada na produção de imunobiológicos onde usaremos a planta GMP de células
eucariotas; documentos que atestam esta colaboração estão disponíveis. Em relação aos
testes pré-clínicos, trouxemos para o iii especialistas nesta área. Quanto às questões de
propriedade intelectual e questões regulatórias, a colaboração com a indústria citada acima
também nos facultará o acesso aos suportes especializados jurídico e administrativo,
5
conforme documentação disponível. A inclusão de colaboradores em grandes centros
clínicos no Brasil (Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP, Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto, Instituto do Câncer do Estado de São Paulo e Hospital Alemão
Osvaldo Cruz, aliado ao Instituto Ludwig de pesquisa sobre Câncer), também ampliará a
nossa estrutura para os ensaios clínicos propostos.
Para enfrentar o novo desafio que integra de forma mais orgânica a Missão do nosso
Instituto - Interação com a Sociedade - elaboramos uma proposta que envolve atividades
educacionais e de difusão, abrindo as portas do iii para o diálogo com a sociedade.
Contaremos com a valiosa colaboração de profissionais das áreas de Educação, de
Jornalismos Científico e de Percepção Pública da Ciência que nos ajudarão a capacitar a
nossa equipe para a realização deste trabalho.
Finalmente, a distribuição geográfica dos componentes do grupo principal de
pesquisadores, incluindo indivíduos em instituições nas regiões Sul, Sudeste, Centro-Oeste e
Nordeste, facilitará a disseminação dos conhecimentos obtidos para a comunidade médica e
de saúde assim como para a sociedade em geral, dando uma dimensão nacional tanto na
prestação de serviços e ofertas de oportunidades científicas, quanto no repasse dos
conhecimentos para a sociedade.
Linhas Temáticas de Pesquisa
A Imunologia é o primeiro ramo da Medicina Molecular que desenvolveu e usou
biofármacos. Aproximadamente 40 anticorpos monoclonais e proteínas recombinantes são,
atualmente, comercializados e, aproximadamente, outros 50 se encontram em ensaios
clínicos para o tratamento de diferentes doenças imunológicas e hematológicas, câncer,
alergia, e rejeição de transplantes. Apesar dos avanços consideráveis no conhecimento
celular e molecular dos estados patológicos humanos é ainda limitada a nossa compreensão
das causas e dos mecanismos das doenças, assim como do tratamento mais adequado. O
progresso na imunoterapia e no diagnóstico de muitas doenças é prejudicado pela nossa
incapacidade de delinear, de modo completo, as vias moleculares complexas, sugerindo que
uma abordagem integrada que inclua ferramentas clínicas, moleculares, informáticas e
epidemiológicas seja necessária para encontrar novas soluções para essas questões. As
recentes falhas na produção de novas vacinas, sendo a vacina contra o HIV das indústrias
Merck um exemplo, indicam que precisamos de um conhecimento integrado num contexto
mais abrangente para abordarmos de forma inovadora a questão da vacinação. O mesmo se
aplica ao tratamento do câncer, à imunoterapia para o transplante, doenças infecciosas,
auto-imunes e alergias. A ineficiência da ciência contemporânea para compreender sistemas
biológicos complexos, constituídos de partes não-idênticas com suas múltiplas interações,
tem limitado o progresso na tradução dos ganhos da ciência básica para melhoria da saúde.
6
Cientistas que pensam de forma “centrada no organismo” são cada vez mais
importantes para que as ciências da vida moderna possam “fazer sentido”, e para que
possam passar da análise de componentes para a biologia de sistemas. A geração de novos
agentes imunobiológicos para emprego terapêutico ou como ferramentas diagnósticas
envolve mais do que a simples habilidade de produzi-los em grande quantidade ou a
capacidade de efetuar pesquisa básica de ponta. O Instituto de Investigação em Imunologia
(iii) foi estabelecido levando-se em conta esta perspectiva, e se propõe a desenvolver
pesquisa de tradução visando testar, em humanos, estratégias imunoterapêuticas inovadoras
desenvolvidas através da experimentação. Nas duas etapas anteriores, foram recrutados e
treinados recursos humanos, e criadas instalações para o desenvolvimento de rotas
tecnológicas que nos permitiram mover do reconhecimento da doença para a descoberta de
mecanismos patogênicos, passando para o desenho de biofármacos baseados nestes
mecanismos, para a experimentação em modelos animais, criando um portfólio de produtos
imunoterapêuticos. Nesta etapa, além de continuar a pesquisa de tradução nas diversas
áreas pretendemos atuar decisivamente na produção e teste clínico de nosso portfólio, com
instalação física, equipamentos e treinamento de pessoal para operar as plantas piloto em
condições de boas práticas de manufatura necessárias e a realização de ensaios clínicos de
fase I/II. Usando essa rota tecnológica, cientistas, biotecnólogos e médicos do iii tencionam
continuar cooperando no desenvolvimento de soluções baseadas na Imunologia para
responder questões comuns às doenças que afetam milhões de brasileiros e que
representam um ônus social e econômico.
A estratégia usada pelo iii baseia-se numa abordagem integrada, que leva em conta
a complexidade do ser humano como sistema. Isso nos permitirá a seleção do alvo
terapêutico mais adequado e, facilitará a transferência do conhecimento adquirido para a
beira do leito. Essa abordagem multidisciplinar melhora a nossa capacidade de produzir
resultados com menor perda de energia, tempo e recursos, introduzindo o iii no caminho da
identificação de alvos imunomodulatórios para tolerância ao enxerto e doenças auto-imunes,
o conhecimento de moléculas-alvo para o tratamento de imunodeficiências primárias e a
AIDS, o desenvolvimento de vacinas e imunoterapia para febre reumática e outras doenças
auto-imunes,
leishmaniose,
infecção
por
HIV,
alergia,
imunodeficiências primárias, como detalhado nas páginas a seguir.
câncer,
leishmaniose
7
DESENVOLVIMENTO PREVISTO EM CADA AREA TEMÁTICA/SUBPROJETO
ALERGIA
Etapas previstas
Tema Subprojeto
Estudo
Mecanismo
Patogênese
Ident. Alvo
molecular
Intervenção
Produção
agente
intervenção
Intervenção
Pré-clínica
(animais)
Produção
agente
intervenção
Intervenção
Pré-clínica
(animais)
Pré-Clínica
Prod.
Agente
interv.
clinica
Ensaio
Clínico
fase I/II
Prod.
Agente
interv.
clinica
Teste
Clínico
fase I/II
Caracterização Molecular
dos Antígenos
Imunodominantes de
Novas Fontes de
Alérgenos Regionais
(Projeto GENAR)
Estudo
imunopatogenético e
clínico da asma grave
Imunoterapia e
imunodiagnóstico em
alergia respiratória
TRANSPLANTE E IMUNORREGULAÇÃO
Etapas previstas
Tema Subprojeto
Proteína de Choque
Térmico 60 e células
dendríticas: bases
moleculares para
imunorregulação
Avaliação do potencial
modulador de células
CD4+CD25+ em
respostas in vivo a
células alogênicas
Tolerância operacional
no transplante humano
Desenvolvimento de um
anticorpo humanizado
anti-CD3 para aplicação
na clínica médica e
avaliação da sua
atividade
imunorreguladora
Estudo
Mecanismo
Patogênese
Ident. Alvo
molecular
Intervenção
Pré-Clínica
8
IMUNODEFICIÊNCIAS PRIMÁRIAS
Etapas previstas
Tema Subprojeto
Estudo
Mecanismo
Patogênese
Ident. Alvo
molecular
Intervenção
Produção
agente
intervenção
Intervenção
Pré-clínica
(animais)
Produção
agente
intervenção
Intervenção
Pré-clínica
(animais)
Produção
agente
intervenção
Intervenção
Pré-clínica
(animais)
Pré-Clínica
Prod.
Agente
interv.
clinica
Teste
Clínico
fase I/II
Prod.
Agente
interv.
clinica
Teste
Clínico
fase I/II
Prod.
Agente
interv.
clinica
Teste
Clínico
fase I/II
Imunodeficiências primárias
HIV/ AIDS
Etapas previstas
Tema Subprojeto
Estudo
Mecanismo
Patogênese
Ident. Alvo
molecular
Intervenção
Pré-Clínica
Imunopatogênese da
infecção pelo HIV
Desenvolvimento de novos
imunógenos
Novas estratégias de
intervenção terapêutica
DOENÇAS TROPICAIS-Leishmaniose
Etapas previstas
Tema Subprojeto
Vacina Leishmaniose visceral
Estudo farmacológico da
saliva do flebótomo
Imunoterapia com N-acetil
cisteína associado a
antimonial pentavalente no
tratamento da leishmaniose
visceral humana e canina
Estudo
Mecanismo
Patogênese
Ident. Alvo
molecular
Intervenção
Pré-Clínica
9
DOENÇAS AUTO-IMUNES
Etapas previstas
Tema Subprojeto
Estudo
Mecanismo
Patogênese
Ident. Alvo
molecular
Intervenção
Produção
agente
intervenção
Intervenção
Pré-clínica
(animais)
Produção
agente
intervenção
Intervenção
Pré-clínica
(animais)
Pré-Clínica
Prod.
Agente
interv.
clinica
Teste
Clínico
fase I/II
Prod.
Agente
interv.
clinica
Teste
Clínico
fase I/II
Auto- imunidade – Febre
reumática: desenvolvimento
de Vacina contra o S.
pyogenes
Doença de Crohn
CÂNCER
Etapas previstas
Tema Subprojeto
Estudo
Mecanismo
Patogênese
Ident. Alvo
molecular
Intervenção
Pré-Clínica
Estudo de fase II da injeção
intra-tumoral neoadjuvante da
vacina de DNA-HSP65 em
pacientes portadores de
carcinoma epidermóide de
cavidade oral
Vacinação terapêutica com
NY-ESO-1 e adjuvante MPLA
em pacientes com câncer
epitelial de ovário: Testes
Clínicos Fase I/II
Avaliação de NY-ESO-1
como potencial alvo de
imunoterapia em pacientes
com glioblastoma
Etapas previstas de desenvolvimento para cada um dos subprojetos dentro das áreas temáticas do iii,
neste período
10
2. Projetos
A. AUTO-IMUNIDADE
A auto-imunidade patológica inclui tanto um
grupo de doenças
definido
nosologicamente (diabetes, lúpus, artrite reumatóide, esclerose múltipla, miastenia gravis,
etc) como também doenças e síndromes onde o componente auto-imune parece ter um
papel importante no fenômeno inflamatório embora de forma ainda pouco clara
(aterosclerose, febre reumática, doença de Cronh, etc). Em geral, as ferramentas disponíveis
para o tratamento dessas entidades clínicas ainda são precárias e algumas associadas a
vários efeitos colaterais. Os fatores e os mecanismos envolvidos nos distúrbios da tolerância
imunológica em tais doenças ainda são objeto de debate e esse conhecimento certamente
auxiliará no desenvolvimento de métodos terapêuticos mais específicos e eficazes.
Os projetos incluídos na linha de pesquisa temática – Auto-imunidades – pretendem
investigar os mecanismos envolvidos nos distúrbios imunoreguladores que acompanham
duas entidades clínicas que apresentam um componente auto-imune importante - a Febre
reumática (DRC) e a Doença de Crohn (DC) – assim como desenvolver agentes
imunobiológicos protetores contra infecções desencadeadoras de lesões auto-imunes e
imunomodulares da reatividade inflamatória auto-imune.
As
estratégias
propostas
envolvem
a
produção
de
vacinas
e
agentes
imunomoduladores, ensaios pré-clínicos em animais experimentais usando esses agentes
assim como estudos clínicos de Fase I e II em pacientes. Como resultados esperados dessa
linha temática pretendemos contribuir para: a) compreender melhor os mecanismos
imunopatológicos envolvidos no desencadeamento das lesões auto-imunes na DR e na DC;
b) desenvolver agentes imunobiológicos com ação de proteção anti-infecciosa e com ação
imunomoduladora mais específicos que aqueles atualmente utilizados no tratamento dessas
doenças; c) estabelecer protocolos alternativos de utilização das vias mucosas (oral e nasal)
para administração eficaz, segura e viável de agentes imunobiológicos; d) formação de
estudantes de mestrado e doutorado assim como a produção de artigos científicos.
Os projetos envolverão esforços da imunologia básica não somente na compreensão
dessas doenças mas também na tradução clínica de tal compreensão em forma de
intervenções mais seguras, mais específicas e mais facilmente aplicáveis que as disponíveis
no momento. Para isto, a equipe se compõe de pesquisadores da área básica, da área
clínica, médicos, estudantes, pós-doutores e colaboradores internacionais capazes de
integrar nosso trabalho com o conhecimento de ponta na área.
SUBPROJETO 1: FEBRE REUMÁTICA: DESENVOLVIMENTO DE VACINA CONTRA O S. PYOGENES
Streptococcus pyogenes beta hemolítico do grupo A pode causar infecção invasiva
grave com seqüela não supurativa, a Febre Reumática (RF/ RHD), glomerulonefrite aguda e
também simples faringites e piodermites (Feldman, 1996). A RF ocorre mais freqüentemente
em crianças e adolescentes entre 5 e 18 anos, o que coincide com a idade de pico de
incidência das infecções estreptocócicas. A FR afeta 1-5% das crianças não tratadas.
11
Doença Reumática Cardíaca (DRC) é a complicação mais grave da doença, desenvolve
dentro de 4-8 semanas após a infecção pelo S. pyogenes em 30 a 45% dos indivíduos com
FR. As reações auto-imunes observadas na FR/DRC são devidas à resposta de células T e
B contra estruturas do S. pyogenes e proteínas humanas, principalmente proteínas
cardíacas, pelo mecanismo de mimetismo molecular.
Uma vacina contra S. pyogenes poderá reduzir significantemente os números de
novos casos de FR/DRC e os custos, para o governo e poderá trazer melhorias na qualidade
de vida de milhares de crianças visto que: 1. A prevalência de FR em países em
desenvolvimento é de aprox. 24/1000 indivíduos; 2. Mundialmente, existem 16 milhões de
indivíduos com DRC e aprox. 2 milhões com doenças invasivas graves; 3. Número de mortes
causadas pela DRC e doenças invasivas é superior a 500.000/ano; 4. Número de novos
casos de faringites /ano é de 616 milhões (WHO, 2004); 5. No Brasil, a incidência de FR,
considerando número de casos registrados, era de 20.000 novos casos/ano em 1990,
diminuindo nos últimos anos para 5.000 novos casos/ano; 5. A lesão valvular, conseqüência
da FR, é responsável por aprox. 90% das cirurgias cardíacas infantis no Brasil,
Este trabalho encontra-se em desenvolvimento há aproximadamente 20 anos tendo
sido iniciado a partir da pesquisa básica nas áreas de Imunologia, Bioquímica e atualmente
encontra-se em fase de pesquisa aplicada para o desenvolvimento de vacina em fase
experimental. Temos a participação de vários pesquisadores da área básica, bem como
vários clínicos.
Nos últimos 20 anos, nosso grupo vem estudando os mecanismos de patogênese
responsáveis pelas lesões auto-imunes da FR/DRC. Nosso trabalho trouxe contribuições
importantes para a compreensão das bases celulares e moleculares da DRC. O
conhecimento adquirido sobre o desencadeamento das reações auto-imunes que geram
lesões no coração, abriu a possibilidade do desenvolvimento de uma vacina segura. No
decorrer destes estudos, mapeamos regiões da proteína M do estreptococo (N-terminal) que
apresentavam reatividade cruzada com o tecido cardíaco utilizando células de sangue
periférico de pacientes com FR/DRC comparado a controles. Estudamos a região C-terminal
da proteína M e identificamos epitopos potencialmente protetores, reconhecidos por linfócitos
T e B de indivíduos saudáveis e de pacientes com FR/DRC (total 800 indivíduos) (Guilherme
et al, 2006). Construímos uma proteína recombinante contendo os epitopos protetores
selecionados. Utilizamos clones de linfócitos T infiltrantes da lesão cardíaca de pacientes
com DRC, como estratégia para identificação e diferenciação de epitopos da proteína M com
potencial para desenvolver auto-imunidade daqueles com potencial protetor. Camundongos
transgênicos para as moléculas HLA de classe II humanas vem sendo utilizados para
verificarmos a capacidade de proteção e segurança dos epitopos vacinais em diferentes
alelos HLA de classe II.
Nossos trabalhos anteriores permitiram entender como indivíduos saudáveis e
pacientes com FR/DRC respondem a epitopos da proteína M do estreptococo. A avaliação
da resposta imune humoral e celular no sangue periférico, bem como no tecido cardíaco,
12
frente a peptídeos sintéticos derivados da proteína M, permitiu a discriminação de epitopos
envolvidos com a doença daqueles envolvidos com proteção. Através da utilização, de 2Deletroforese e espectrometria de massa (Maldi-Tof) identificamos vários auto-antígenos no
tecido cardíaco reconhecidos por linfócitos T e B de pacientes. Caracterizamos também o
repertório de linfócitos T infiltrantes do tecido cardíaco de pacientes com DRC, através do
estudo do receptor da célula T, e o perfil de citocinas produzidas in situ e após estimulação
antígeno-específica.
O desenho da vacina contra o S. pyogenes, atualmente denominada StreptInCor
corresponde a 55 resíduos de aminoácidos da porção C-terminal definidos como epitopos T
e B, 22 e 25 resíduos de aminoácidos, respectivamente ligados por 8 resíduos em acordo
com a seqüência observada na bactéria, cepa M5 (Guilherme et al, 2006). Esta vacina
poderá também servir como modelo vacinal para outras doenças de caráter auto-imune. O
epitopo vacinal identificado por nosso grupo já está patenteado no Brasil INPI -0501290 /
0604997-4, PCT-BR07/000184 em fase de registro em 11 países.
O epitopo vacinal foi avaliado quanto ao potencial de desenvolver auto-reatividade.
Para tal, 29 linhagens de linfócitos T infiltrantes do tecido cardíaco de 22 pacientes com DRC
e 50 clones de linfócitos T intralesionais foram testadas frente a vários peptídeos sintéticos
componentes do epitopo vacinal frente a proteínas cardíacas identificadas através de
eletroforese bidimensional. Apenas 5% dos clones reconheceram o agente vacinal e alguma
proteína cardíca, no entanto, estas células supostamente auto-reativas produziram a citocina
IL-10 (reguladora da inflamação), sugerindo a presença de clones com capacidade de
regulação inflamatória e, portanto, potencial terapêutico do agente vacinal, a ser confirmado.
O agente vacinal na forma de peptídeo sintético apresenta estrutura em alfa-hélice,
identificada por ressonância magnética (artigo em preparação), e a sua imunogenicidade,
segurança e capacidade de proteção já foram avaliadas em camundongos isogênicos
“inbred” (C57BL6 e BALB-c) e camundongos “out-bred” (SWISS) em combinação com Alum3
Al(OH) . Os resultados mostraram altos títulos de anticorpos específicos e sobrevida de 80 e
100% em 21 dias contra 40% nos controles (artigo em preparação). Também iniciamos
testes com um novo adjuvante para indução de resposta imune de mucosa oral, derivado do
proteolipossoma (AFPL1), que na sua forma antigênica, está presente na membrana externa
da Neisseria meningitidis B, e por extração com detergente forma nanopartículas agrupadas
que
originam
um
adjuvante
potente,
denominado
de
AFPL1
(Adjuvante
Finlay
Proteolipossoma 1). Este adjuvante vem sendo utilizado para vacinação anti-meningococo e
induz uma resposta imune do tipo Th1 (Lastre et al., 2001). O AFPL1 contém importantes
padrões moleculares associados a patógenos (do inglês-PAMP), como as principais
proteínas da membrana externa (PorA e PorB) reconhecidas por TLR-2, lipopolissacarideo
(LPS) e traços de DNA bacteriano reconhecidos por TLR-4 e TLR-9 respectivamente. Estes
“PAMPS” são capazes de estimular eficientemente o sistema imune (Ail-Bader et al., 2003).
Ensaios preliminares foram realizados em nosso laboratório em colaboração com o Instituto
Finlay de Cuba e os resultados após vacinação oral (I.N) em camundongos isogênicos
13
mostram boa resposta de mucosa. Ensaios similares aos mencionados serão realizados com
o agente vacinal na forma de proteína recombinante.
Objetivos
1) Proceder aos ensaios pré-clínicos em mini-pigs usando o agente vacinal na forma de
peptídeo sintético e/ou de proteína recombinante.
2) Produzir o agente vacinal em condições GMP.
3) Proceder aos ensaios clínicos de Fase I e II em duas regiões do Brasil (Sul - São
Paulo, Nordeste - Bahia/Sergipe) e iniciar Fase III.
4) Identificar cepas de S. pyogenes prevalentes em algumas regiões do Brasil
5) Confirmar a capacidade do epitopo vacinal em induzir células T reguladoras, com
potencial terapêutico em pacientes portadores de lesões valvulares de origem
reumática.
Equipe
Pesquisadores do iii
Responsável:
Luiza Guilherme Guglielmi - InCor-FMUSP
Edécio Cunha Neto - InCor-FMUSP
Verônica Coelho - InCor-FMUSP
Luiz Carlos de Sá Rocha – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia,
USP
Roque Pacheco de Almeida – UFS, Aracaju, Sergipe
Amélia Ribeiro de Jesus - UFS, Aracaju, Sergipe
Jorge Kalil – - InCor-FMUSP
Pedro Francisco Giavina-Bianchi – Serviço de Alergia e Imunologia
Alunos de pós-graduação
Milton Thiago Guerino Silva – Mestrado- FMUSP
Kátia Sanches – Dourorado - FMUSP
Gustavo Kesselring – Doutorado - FMUSP
Pós-doutorando
Flávia Vigna
Colaborador Internacional
Oliver Peres, Instituto Finlay, Havana Cuba
Colaboradores Nacionais e técnicos
Guilherme Spina
Roney Sampaio
14
Flavio Tarassoutchi
Max Grinberg
Pablo Pomerantzeff
Edmundo Câmara
José Caetano Macieira
Cláudio Puschel
Samar Freschi
Edilberto Postol
Sandra Emiko Oshiro
Raquel Alencar
Selma Aliotti
Fábio Higa
Simone Regina dos Santos
Iolanda Oruê
Washington Roberto da Silva
Carlos dos Santos
Subprojeto 2: Imunomodulação na Doença de Crohn experimental e humana
Estado da arte
As doenças inflamatórias intestinais crônicas, como a retocolite ulcerativa (RCU) e a
doença de Crohn (DC), têm chamado a atenção da comunidade científica pela sua incidência
em ascensão. Ambas são caracterizadas por uma intensa resposta inflamatória no trato
gastrintestinal, mas a DC, diferentemente da RCU, pode afetar todo o intestino (grosso e
delgado) sendo o cólon e o segmento terminal do delgado (íleo) as áreas mais afetadas. A
inflamação intestinal da doença de Crohn se caracteriza pelo aumento local da produção de
citocinas do tipo 1: TNF-α, IFN-γ, IL-2 e IL-12 (Barkin & Lewis, 1992; Strober et al, 2007).
Manifestações inflamatórias em outros locais do corpo (na pele, articulações, olhos, vasos
sanguíneos) também estão freqüentemente associadas à DC indicando o caráter sistêmico
dos distúrbios imunológicos que resultam na doença. A etiologia precisa das doenças
inflamatórias intestinais (DII) humanas ainda é desconhecida mas evidências experimentais
e estudos clínicos sugerem que a DC envolve defeitos na tolerância imunológica a autoantígenos e também a antígenos da dieta e da microbiota (Strober et al, 2007).
Normalmente o contato dos antígenos do lúmen do intestino (dieta e microbiota) com
o tecido linfóide associado à mucosa desencadeia a indução de citocinas reguladoras como
IL-10 e TGF-β e de células T reguladoras (Treg) capazes de suprimir a imunidade sistêmica
a esses antigenos, um fenômeno conhecido como “tolerância oral” (Faria & Weiner, 2005).
Nesse sentido, um componente importante da doença de Crohn parece ser a quebra da
15
tolerância oral a antígenos da dieta e da microbiota ocasionada pela alteração inflamatória
do microambiente normalmente tolerogênico da mucosa intestinal e pelo aumento da entrada
de antígenos através da camada epitelial destruída. Camundongos deficientes em IL-10, por
exemplo, desenvolvem enterocolite espontânea com hiperplasia de células epiteliais e
inflamação transmural (Kuhn et al, 1993) sugerindo que, na ausência dessa citocina
reguladora, o contato com antígenos do lúmen resulta em inflamação. Vários estudos têm
mostrado também o aumento da reatividade inflamatória a auto-antígenos da mucosa
colônica na colite experimental (Strober et al, 2007).
O tratamento da doença de Crohn atualmente se baseia no uso de anti-inflamatórios
como sufasalazina, imunossupressores como corticosteróides (prednisona e budesonida),
azatioprina, ciclosporina, tacrolimus, methotrexato, anti-microbianos (metronidazol) e
anticorpos monoclonais inibidores de TNF-α. Todos esses agentes apresentam muitos
efeitos colaterais quando usados cronicamente e alguns são utilizados apenas nos episódios
de crise. Existem recomendações dietéticas para os pacientes com doença de Crohn mas
elas se baseiam na tentativa de repor deficiências geradas pela má absorção comum na
doença. Por outro lado, alguns estudos clínicos mostram que a administração parenteral de
dietas elementares (compostas por aminoácidos, açúcares simples, quantidades mínimas de
lipídeos, minerais e vitaminas) tem um efeito benéfico na doença de Crohn (O’Sullivan &
O’Morain, 2001). Em alguns estudos, o uso de dietas elementares per se se mostrou tão
eficaz quanto o uso de corticoesteróides (Gorard et al, 1993) e elas têm sido propostas como
alternativa terapêutica em casos onde os corticosteróides não são recomendados (gestantes
e crianças) embora seu mecanismo de ação não seja conhecido. Tais dietas são muito caras
já contêm todos os nutrientes na forma elementar e apresentam efeitos colaterais quando
utilizadas a longo prazo na forma enteral ou parenteral (O’Sullivan & O’Morain, 2001).
Nossa hipótese de trabalho é que a eficácia das dietas elementares no tratamento
de pacientes com doença de Crohn se deve ao fato de que essa doença envolve uma
deficiência importante na tolerância oral às proteínas da microbiota intestinal e da dieta. De
fato, camundongos IL-10 mantidos em condições isentas de germe não desenvolvem colite,
mostrando o papel dos antígenos da microbiota na doença (Elson et al, 2001).
As proteínas da dieta na doença de Crohn
Estudos anteriores em nosso laboratório (ICB-UFMG) analisando os efeitos
imunológicos das proteínas da dieta mostraram que esses “antígenos naturais” são cruciais
para o amadurecimento do sistema imune de camundongos. Mostramos esse papel em
camundongos BALB/c e C57BL/6 alimentados, desde o desmame até a vida adulta, com
uma dieta experimental balanceada mas livre de proteínas contendo 15% de aminoácidos
(AA) e comparados com camundongos alimentados com uma dieta controle balanceada cuja
16
fonte protéica foi a caseína. Os animais adultos que se alimentaram com dieta AA tinham o
tecido linfóide associado ao intestino mal desenvolvido, com redução de células na lâmina
própria, dos linfócitos intraepiteliais TCRαβ e dos níveis de IgA secretória. Também houve
redução de IgG e IgA séricas. A produção de citocinas in vitro pelas células de vários órgãos
linfóides mostrou um perfil Th2 com altos níveis de IL-4 e IL-10, e baixos níveis de IFN-γ e IL6. Essas características são compatíveis com o perfil de camundongos neonatos sugerindo
que a retirada dos antígenos (proteínas) da dieta manteve os animais adultos com um perfil
imaturo (Menezes et al, 2003).
Por outro lado, a ausência das proteínas levou a uma
redução drástica das citocinas pró-inflamatórias em todos os órgãos linfóides analisados. A
utilização de dieta elementar (El-diet) composta por todos os componentes nutricionais na
sua forma elementar teve efeitos imunológicos semelhantes. (Menezes et al., 2006).
Pretendemos testar, nesse projeto, se a substituição seletiva das proteínas da dieta por
A tolerância induzida por via nasal na doença de Crohn
Vários estudos têm mostrado a eficácia da administração de auto-antígenos pelas
vias mucosas (oral e nasal) na prevenção e tratamento de modelos experimentais de
doenças auto-imunes (encefalomielite experimental alérgica, artrite, diabetes, uveíte,
miastenia) e doenças inflamatórias crônicas (alergia, aterosclerose e outras). O mecanismo
envolvido seria a geração de células Treg (CD4+CD25+, CD4+LAP+) secretando IL-10 e/ou
TGF-b que acompanha a indução de tolerância oral ou nasal (Faria & Weiner, 2006). A
identificação do auto-antígeno envolvido na doença não é necessária para a indução de
supressão da inflamação local já que qualquer antígeno presente na lesão pode induzir uma
supressão cruzada e modular o processo inflamatório (Faria & Weiner, 2005). Assim, uma
das proteínas com grande eficácia terapêutica quando administrada por via nasal em modelo
experimental de aterosclerose foi a proteína do choque térmico da famíla 60 (hsp60) (Maron
et al, 2002). A administração nasal de hsp60 induziu a produção local e sistêmica de IL-10 e
TGF-b. Como as hsps são expressas em abundância nos processos inflamatórios, elas são
bons alvos para a imunomodulação em doenças inflamatórias crônicas. Recentemente, um
dos grupos do iii mostrou que peptídeos da região C-terminal da hsp60 humana apresentam
propriedades potencialmente reguladoras estimulando a produção de IL-10 por monócitos do
sangue periférico de pacientes submetidos a transplantes renais e de indivíduos normais
(Caldas et al, 2006). A produção de outras citocinas anti-inflamatórias como TGF-β não foi
avaliada nesse trabalho. Pretendemos utilizar tais peptídeos no tratamento por via nasal em
camundongos IL-10-/- antes e durante o desenvolvimento da colite para estudar se esse
tratamento é capaz de modular o desenvolvimento da doença e se essa possível
imunomodulação poderia envolver, nesses animais deficientes em IL-10, a produção de
outras citocinas como TGF-β ou de células Treg (CD4+CD25+Foxp3+, CD4+LAP+) que
exercem sua atividade reguladora pelo contato celular.
Um outro agente imunomodulador também descrito como eficaz pela via mucosa
(oral) são as imunoglobulinas policlonais (IgP). A administração oral de IgP em
17
camundongos com síndrome do anticorpo fosfolipídeo experimental (Krause et al, 2002) e
em camundongos com fator reumatóide experimental (Maier et al, 2007) mostrou a ação
inibitória desse composto na indução de ambas as condições experimentais. As
imunoglobulinas policlonais humanas tem sido utilizadas por via intravenosa para o
tratamento de imunodeficiências humorais. Conhecido como imunoglobulina intravenosa
(IgIV), esse composto de IgG é preparado a partir do fracionamento do plasma de 10 a 20
mil doadores saudáveis após controle de banco de sangue para infecções. A utilização de
IVIg para o tratamento de púrpura trombocitopênica imunológica inaugurou sua utilização em
condições autoimunes e hoje este composto é utilizado em mais de 100 doenças diferentes
que incluem doenças autoimunes, infecções crônicas e agudas. Os mecanismos que
explicam a ação imunomoduladora das IgIV incluem o bloqueio dos receptores de Fc (FcγR),
modulação da ativação do sistema complemento, modulação de células dendríticas,
modulação idiotipo-anti-idiotipo, indução de apoptose de linfócitos B e T (Vani et al, 2008).
Pretendemos aliar, nesse estudo, as propriedades imunomoduladoras das IgP às
propriedades tolerogênicas da via mucosa (nasal) para testar o efeito do tratamento de
camundongos IL-10-/- com preparado de IgP isoladamente ou associado aos peptídeos de
hsp60. Um dos problemas no uso das IgP no tratamento de doenças auto-imunes é seu alto
custo. No entanto, como a via nasal parece ser tolerogênica para antígenos em
concentrações muito baixas, essa seria uma vantagem adicional desse tipo de abordagem.
Objetivos:
Testar as possibilidades terapêuticas e os mecanismos de ação de duas estratégias
potencialmente imunomoduladoras na colite experimental murina e em pacientes com
Doença de Crohn: a) a minimização das proteínas da dieta substituindo-as por um
complemento dietético composto por aminoácidos em quantidade balanceada, e b) a
administração mucosa (nasal) de peptídeos tolerogênicos da hsp60 humana isoladamente
ou em associação ou com preparado de imunoglobulinas policlonais (IgP).
Estratégia experimental:
1) Administração oral de dieta livre de proteínas inteiras (contendo quantidade equivalente de
aminoácidos) em camundongos 129/SeVe IL-10-/- e análise do desenvolvimento da doença
e dos parâmetros imunológicos associados (inflamatórios e reguladores). 2) Administração
de peptídeos potencialmente reguladores da região C-terminal de hsp60 e/ou preparado de
imunoglobulinas policlonais por via mucosa (nasal) em diferentes fases da colite
experimental. 3) Análise do efeito desses tratamentos em parâmetros locais e sistêmicos: a)
citocinas pró-inflamatórias e reguladoras; b) células T efetoras e reguladoras;
18
B. Estudo Clínico:
4) Estudo clínico envolvendo a elaboração e administração oral de um complemento dietético
composto de aminoácidos associado a aplicação de uma dieta minimizada de proteínas em
pacientes portadores de Doença de Crohn; análise de parâmetros clínicos e laboratoriais
antes e durante a utilização da dieta. 5) Análise, por citometria de fluxo, da presença de
células produtoras de citocinas inflamatórias e reguladoras assim como de células Treg entre
as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) dos pacientes tratados.
Metodologia
Modelo experimental de colite espontânea:
Animais – Camundongos 129/SeVe geneticamente deficientes para IL-10. Os animais serão
mantidos no Biotério do Laboratório de Imunobiologia - UFMG em microisoladores.
Dietas - A dieta controle contendo 15% de caseína (Cas) como fonte de proteína ou a dieta
experimental contendo 15% de aminoácidos (Aa) na mesma proporção da caseína serão
feitas com base na dieta padrão para roedores AIN93G (American Institute of Nutrition) em
forma de peletes e administradas desde o desmame até o final dos experimentos.
Avaliação da colite experimental – Será utilizado um índice clínico baseado nas lesões
histológicas apresentadas segundo classificação já descrita (Berg et al, 1996).
Parâmetros imunológicos a serem avaliados: a) análise histológica e por imunohistoquímica
da mucosa intestinal avaliando a morfologia do intestino, as populações celulares presentes
(lâmina própria, linfócitos intraepiteliais e infiltrado inflamatório) e a presença de linfócitos T
CD4+, Treg, macrófagos, neutrófilos, células NK e citocinas pró-inflamatórias e reguladoras;
b) capacidade de indução de tolerância oral a ovalbumina; c) medida, por ELISA, dos níveis
de citocinas inflamatórias (IFN-γ, TNF-α, IL-17, IL-6) e reguladoras (IL-10, TGF-β) em
extratos de regiões do intestino delgado e grosso; d) produção de citocinas por células das
placas de Peyer (PP), lâmina própria (LP), linfonodos mesentéricos (LM), linfonodo cecal
(LC) e baço estimuladas in vitro com anti-CD3/anti-CD28, com hsp60 e com extrato do cólon;
e) produção de IgG1, IgG2a e IgA anti-hsp60 e anti-extrato de cólon das classes no soro e
de IgA secretória total e específica no muco intestinal; f) análise, por citometria de fluxo, da
freqüência de células Treg (CD4+CD25+Foxp3+, CD4+CD25-LAP+) nas PP, LM, LC e baço;
Análise da migração de leucócitos para a mucosa intestinal, por microscopia intravital, de
camundongos IL-10-/- tratados ou não - A microscopia intravital permite a visualização da
microcirculação e análise das etapas do recrutamento de leucócitos. Os animais serão
anestesiados, a jugular direita canulada e o mesentério e cólon expostos ao microscópio
óptico por transluminescência e epifluorescência. A imagem será levada ao monitor de TV e
19
gravador de DVD, para posterior análise. A interação dos leucócitos com endotélio será
registrada pela contagem de leucócitos rolando, aderindo ou transmigrados.
Estudo Clínico (a partir dos dados dos ensaios pré-clínicos em camundongos):
Pacientes – indivíduos entre 25-45 anos portadores de Doença de Crohn selecionados pelo
Serviço de Gastroenterologia do Hospital das Clinicas da UFMG. O critério diagnóstico para
inclusão no estudo será, além da anamnese e exame clínico, os exames laboratoriais
(hemograma, pesquisa de anticorpos séricos ASCA e p-ANCA) e a colonoscopia com biópsia
confirmatórias da doença. Serão excluídos do estudo indivíduos portadores de doenças
degenerativas, doenças cardíacas (especialmente arterosclerose) assim como de outras
doenças auto-imunes (lúpus, diabetes, esclerose múltipla, artrite reumatóide).
Tratamento – os pacientes receberão orientação dietética visando a minimização do
conteúdo de proteínas na dieta e a adesão a essa dieta será monitorada semanalmente por
uma nutricionista. Eles receberão diariamente um complemento dietético (em forma de
comprimido) composto por mistura balanceada de aminoácidos capaz de suprir as
necessidades diárias. O grupo controle permanecerá em dieta nutricionalmente controlada
mas com proteínas recebendo placebo como complemento. A medicação dos pacientes será
mantida sem alterações nessa primeira fase do estudo.
Avaliação da evolução da doença - Os pacientes serão avaliados mensalmente durante 2
anos para os parâmetros: a) história clínica, sinais e sintomas (peso, diarréia, muco ou
sangue nas fezes, dor abdominal, febre, nåuseas, vômitos); b) colonoscopia com biópsia de
6 em 6 meses; c) exames laboratoriais (hemograma, ASCA e p-ANCA).
Parâmetros imunológicos a serem avaliados no sangue: a) medida das citocinas TNF-α, IL-6,
IFN-γ, IL-10 e TGF-β; b) análise, por citometria de fluxo, da freqüência de células T CD4+
IFN-γ+, IL-10+, IL-4+, TNF-α+ e de células Treg CD4+CD25+Foxp3+, CD4+CD25-LAP+).
Equipe:
Pesquisadores do iii:
Ana Maria Caetano de Faria – ICB-UFMG (Coordenadora)
Verônica Coelho – InCOR-FMUSP
Colaboradores Nacionais:
Denise Carmona Cara – ICB-UFMG
Vitor Pordeus – Hospital Pró-Cardíaco – RJ
Joana Ferreira do Amaral - UniBH-MG
José Renan da Cunha Melo – Faculdade de Medicina-UFMG
Colaboradores Internacionais:
20
Donna Marie MacCafferty – University of Calgary, Calgary, Canadá
Yehuda Shoenfeld – TelAviv University, Tel Aviv, Israel
Estudantes de Pós-Graduação:
Ana Cristina Gomes (Doutorado– UFMG)
Josiely de Paula Silva (Mestrado- UFMG)
Hugo Guieiro (Mestrado–UFMG)
Pós-Doutorado: Tatiani Uceli Maioli –UFMG
21
B. HIV-AIDS
Mais de vinte milhões de pessoas já morreram vítimas da infecção pelo HIV, a
maioria em países em desenvolvimento. No Brasil, há uma estimativa de 600.000 pessoas
que vivem com HIV. Sem dúvida, a pandemia provocada por esse vírus é uma das maiores
que a humanidade já conheceu.
A interação entre HIV e hospedeiro é extremamente complexa e sob contínua
investigação científica. Por constituir-se em um vírus que tem como alvo uma das principais
células do sistema imunológico, o linfócito T CD4+ (Dalgleish, 1984; Klatzmann, 1984), as
conseqüências da infecção levam a progressivo colapso dos mecanismos de defesa do
hospedeiro, tornando-o susceptível às doenças oportunistas. O progresso nos últimos anos
ocorrido no conhecimento dos mecanismos fisiopatogênicos da infecção e o estudo da
resposta imunológica em doenças infecciosas, particularmente causadas por patógenos
intracelulares, é impressionante. Provavelmente conhecemos mais sobre a infecção pelo HIV
do que sobre a maioria dos agentes infecciosos causadores de doenças infecciosas em
humanos. Os avanços ocorreram em todos os frontes da imunologia, incluindo a resposta
inata, resposta adquirida, tanto humoral quanto celular, métodos de mensuração da
qualidade e magnitude do funcionamento do sistema imunológico e estabelecimento de
conceitos e estratégias para interferir na capacidade do hospedeiro para combater
microorganismos agressores. A forma pela qual o hospedeiro combate a infecção pode ser
bastante diversa dependendo de multiplos fatores, que incluem a virulência da estirpe
infectante e a magnitude da resposta imunológica do indivíduo. De fato, mesmo pessoas
infectadas pela mesma fonte podem apresentar curso clínico diferente (Liu, 1997). O
repertório genético da pessoa pode interferir no prognóstico da infecção, como representado
pelo diferente controle da replicação viral dependendo do haplotipo do antígeno principal de
histocompatibilidade (human leukocyte antigen – HLA) de diferentes grupos de indivíduos.
Entretanto, até hoje não sabemos como humanos podem se proteger eficientemente contra a
infecção pelo HIV e contra o desenvolvimento da AIDS. Suspeita-se que os diferentes braços
da resposta imunológica contribuam para o combate ao vírus, mas não foi possível identificar
como podemos determinar se este combate se dará de forma eficiente. A falta de
marcadores de proteção dificultam a assistência e o emprego de medidas que fortaleçam o
sistema imunológico em pessoas infectadas e o desenvolvimento de vacinas preventivas e
terapêuticas.
Apenas uma vacina realmente eficaz poderá impedir o custo social e econômico das
mortes por HIV/AIDS em países, uma vez que a terapia antiretroviral não é acessível para a
grande maioria. Grande parte das vacinas testadas até o momento é baseada em vetores
virais ou recombinantes. Infelizmente, nenhuma das vacinas que chegaram a ensaios
clínicos em seres humanos demonstrou proteção, incluindo a vacina com adenovirus 5
(Watkins et al. 2008). Isto significa que esforços são cada vez mais necessários para
melhorar a eficácia das novas vacinas. Estudos recentes têm sugerido que o modelo de
22
desafio com SIV (virus da imunodeficiência símia) heterólogo em macacos Rhesus indianos
parece ser o mais semelhante à infecção humana, especialmente quando a infecção se dá
por doses baixas repetidas via mucosa, e somente aquelas vacinas candidatas que
promoverem proteção no modelo primata com desafio com SIV devem progredir para
ensaios de prova de conceito (fase 2b); com efeito, o imunógeno análogo ao usado no
ensaio Merck (Ad5-SIVgag-pol-nef) não promoveu proteção em primatas/SIV, o que
prenunciaria sua falha em humanos. Resultados preliminares do grupo de David Watkins
(USA) têm mostrado que imunizações onde há indução de resposta CD4+ na fase aguda
têm-se associado a controle da replicação viral. A grande variabilidade genética do HIV,
assim como a diversidade imunogenética do hospedeiro humano, geram um desafio
adicional, já que o imunógeno tem que proteger indivíduos geneticamente heterogêneos
contra diferentes isolados virais.
Anticorpos neutralizantes, linfócitos T CD4+ e T CD8+ desempenham um importante
papel na imunidade contra o HIV (revisto por Gandhi & Walker, 2002). Embora saiba-se que
anticorpos neutralizantes são capazes de prevenir a infecção pelo HIV, até o momento não
foi possível a produção de um imunógeno capaz de induzir elevados títulos de anticorpos
que neutralizem isolados diversos de HIV (revisto por Letvin, 2005). Embora vacinas
indutoras de imunidade celular não confiram imunidade estéril, elas podem diminuir a viremia
inicial e prevenir a destruição maciça e precoce de células T CD4+ de memória, além de
reduzir a transmissão em consequência da redução da carga viral (Johnston & Fauci, 2007).
O efeito antiviral da resposta de linfócitos T CD8+ citotóxicos anti-HIV se dá pela eliminação
das células infectadas, e a produção de quimiocinas β, como MIP-1α, MIP-1β e RANTES,
que ligam-se aos co-receptores do HIV nas células CD4+ bloqueando a entrada do vírus
(revisto por Gandhi & Walker, 2002). A depleção dos linfócitos T CD8+ com posterior
infecção com SIV levou a uma replicação viral descontrolada e acelerada mortalidade
(Schmitz et al., 1999). Em modelos de infecção em primatas, as imunizações direcionadas à
indução de respostas T CD8+ reduzem a carga viral (Letvin, 2005). Já os linfócitos T CD4+
HIV-específicos têm papel fundamental na atividade dos linfócitos T CD8+, através de auxílio
na indução e/ou manutenção das respostas dessas células (Hogan & Hammer, 2001). O
controle da replicação do HIV-1 foi associado a uma vigorosa resposta linfoproliferativa HIV-1
específica em pacientes infectados (Rosenberg et al., 1997), que são um fator de bom
prognóstico na infecção pelo HIV (Pancré et al., 2007). Foi observado que imunização capaz
de preservar as células T CD4+ de memória (Mattapallil et al., 2006) leva a uma sobrevida
+
aumentada após desafio de primatas com SIV (Letvin et al., 2006). Ademais, células T CD4 ,
HIV- específicas podem ter atividade citolítica direta a células expressando p24 do HIV
(Norris et al., 2004). A despeito da importância das respostas T CD4+ anti-HIV, pouca
atenção tem sido dada à identificação de epítopos do HIV-1 reconhecidos pelos linfócitos T
CD4+, ou sua utilização em imunógenos (Fonseca et al. 2006). Dado o seu papel
fundamental, como delineado acima, epítopos apropriados do HIV-1 reconhecidos pelas
células T CD4+ devem ser parte essencial de potencial vacina. Neste projeto, nos propomos
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a estudar aspectos da imunopatogênese, incluindo resposta inata e adaptativa, do
desenvolvimento de novos imunógenos, e explorar novas estratégias de intervençao
terapeutica contra o HIV e a AIDS.
Subprojeto 1. Estudos de imunopatogênese da infecção pelo HIV. Vamos realizar
diferentes projetos para elucidar aspectos da imunopatogênese da infecção pelo HIV na
população brasileira, especificamente nas pessoas que vivem com HIV em São Paulo.
Temos acesso a duas importantes atividades que são fonte das amostras necessárias para
os estudos. A primeira é a Casa da AIDS, ambulatório para pessoas que vivem com HIV
coordenado pelo Departamento de Doenças Infecciosas e Parasitárias da FMUSP, com 3000
pacientes em seguimento ativo e com toda a base de informações já informatizada. A
segunda é uma coorte de pacientes recém-infectados pelo HIV-1, com 270 voluntários que
começaram a ser arrolados em 2002, dos quais são disponíveis amostras de células vivas,
soro, plasma e material nucléico obtidas em intervalos de três meses.
Subprojeto 2. Desenvolvimento de novos imunógenos. Um dos principais focos de
nosso grupo será estudar novas estratégias de desenvolvimento de vacinas anti-HIV, em
consonância com o recém aprovado Plano Brasileiro de Vacinas para HIV. Propomos já
realizar o primeiro estudo fase I com um produto brasileiro e avançar em pelo menos duas
outras estratégias, como será descrito abaixo. Acreditamos que temos todos os elementos
para contribuir com esse importante esforço, tanto como iniciativa genuinamente brasileira,
como em colaboração com importantes centros de pesquisa internacionais.
Subprojeto 3. Explorar novas estratégias de intervenção terapêutica. Continuam os
desafios para decifrar os mecanismos que são associados com prognóstico mais favorável
após a infecção pelo HIV. Nessa etapa, iremos desenvolver um projeto para estudar pessoas
cronicamente infectadas que progridem lentamente ou não progridem para AIDS. Também
iremos realizar estudo longitudinal visando avaliar se a presença de resposta imune a
epitopos mutantes da protease do HIV está associada a um melhor controle da carga viral
em pacientes sob inibidores da protease
Plano de trabalho
Subprojeto 1. Estudos de imunopatogênese da infecção pelo HIV.
Abaixo, são delineados os projetos a serem conduzidos nos próximos anos. Como
indicado, alguns deles já possuem financiamento, mas se beneficiarão da estrutura das
plataformas do iii, e outros serão financiados pelo projeto proposto.
Objetivo 1. Decifrando a genética e a função KIR na infecção recente pelo HIV-1 pela
bioinformática. Nosso objetivo a longo prazo é desenvolver novos métodos imunológicos
para a prevenção e o controle da infecção pelo HIV-1. Nossa intenção nesse projeto é
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mapear as variações genéticas dos receptores KIR (killer Ig-like receptor) e então comparálas a marcadores da doença e à função das células NK, em uma coorte de adultos recéminfectados pelo HIV-1. Esses receptores são reguladores potentes e polimórficos das células
Natural Killer (NK) que se ligam aos alelos do HLA classe I. Ativas antes das respostas de
células T, as células NK são um componente efetor da resposta imune inata de ação rápida
e podem ter um papel fundamental no combate ao HIV-1. Suas funções são controladas por
um grupo de moléculas regulatórias de superfície, entre as quais se destacam os
polimórficos receptores KIR. Nosso trabalho pretende mapear as vias pelas quais as
respostas das células NK podem ser moduladas para gerar um novo mecanismo de proteção
contra o HIV-1. Nós seqüenciaremos os HLA A, B e C e então compararemos, com o auxílio
da bioinformática, os tipos de HLA e KIR à função das células NK (IFN-g e CD107a em
células alvo da linhagem 721.221, de maneira pontual) e a marcadores da doença causada
pelo HIV-1, em um estudo com 1500 adultos. Trata-se de um projeto colaborativo entre a
UCSF (Jason Barbour), envolvendo as coortes de recém-infectados pelo HIV de San
Francisco (Frederick Hecht), Nova Iorque (Martin Markowitz), Montreal (J.P. Routy) e São
Paulo (Esper Kallas).
Equipe
Pesquisadores do iii
Responsável: Esper G. Kallás – FMUSP
Estudantes
Priscilla Costa – Doutorado
Pós-doutoranda
Mariana Mellilo Sauer – FMUSP
Técnico superior
Helena Tomiyama – FMUSP
Cláudia Tomiyama – FMUSP
Colaboradores internacionais
Jason Barbour – Universidade da Califórnia, San Francisco, EUA
Frederick Hecht – Universidade da Califórnia, San Francisco, EUA
Martin Markowitz – Aaron Diamond AIDS Research Center, Nova Iorque, EUA
J.P. Routy – Montreal General Hospital and McGill University Health Centre, Canada
Objetivo 2. Resposta Vif-específica mediada por células T CD8+ em indivíduos que
controlam a replicação do HIV. Descobriu-se recentemente que respostas mediadas por
células T CD8+ específicas para Nef e Vif, em macacos indianos, são capazes de controlar a
replicação viral da cepa altamente patogênica SIVmac239. Enquanto Nef e Gag têm sido
25
considerados no desenvolvimento de vacinas,
Vif não tem sido utilizado como um
imunógeno vacinal até o momento. Iremos explorar, portanto, se linfócitos T CD8+ Vifespecíficos de pacientes capazes de controlar a replicação viral respondem a peptídeos de
tamanho mínimo e características ótimas, usando para isto marcação de citocinas
intracelulares (CIC) por Citometria de Fluxo e ELISPOT. Iremos ainda determinar, por meio
do novo Ensaio de Supressão Viral (ESV), se respostas mediadas por linfócitos T CD8+ Vifespecíficos controlam a replicação viral. Estes estudos irão conduzir à definição de um alvo
adicional para respostas imunes induzidas por vacinas. Atualmente, Env, Gag, Pol e Nef
estão sendo usados em estudos envolvendo humanos, mas Vif não tem sido considerado.
Se pudermos demonstrar que linfócitos T CD8+ específicos para Vif têm um papel relevante
no controle da replicação viral, Vif poderia ser incluído como um importante alvo vacinal.
Equipe
Pesquisadores do iii
Responsável: Esper G. Kallás – FMUSP
Aluísio Augusto Cotrim Segurado – FMUSP
Estudantes
Maria Teresa Maidana Giret – Doutorado
Nancy Gouvea – Doutorado
Elkin Hernán Bermudez – Doutorado
Leandro Tarosso – Mestrado
Pós-doutoranda
Mariana Mellilo Sauer – FMUSP
Técnico superior
Helena Tomiyama – FMUSP
Cláudia Tomiyama – FMUSP
Colaboradores internacionais
David I. Watkins – Universidade de Wisconsin, EUA
Objetivo 3. Resposta imune celular contra epítopos crípticos na AIDS. Com o objetivo de
se elaborar uma vacina contra aids efetiva na indução de resposta por células T CD8+, é
importante entender a resposta completa contra o vírus. Apesar dos muitos anos de esforços
neste sentido, torna-se claro que a extensão total da resposta exercida por células T CD8+
não é completamente compreendida. Nós descobrimos recentemente que as respostas de
células T CD8+ contra epítopos crípticos, derivados de uma seqüência alternativa de leitura
do gene env, foi potente em controlar a replicação e selecionar o escape viral. Desde então,
nós temos observado que o reconhecimento de epítopos crípticos é uma ocorrência na
infecção por SIV. Baseados nestes dados, nós levantamos a hipótese de que o
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reconhecimento de epítopos crípticos é uma ocorrência normal e importante na infecção pelo
vírus causador da aids. Aqui, nós propomos uma série de experimentos que visam avaliar o
papel da resposta específica contra epítopos crípticos no controle da replicação do vírus
causador da AIDS. No segmento de estudos da infecção por SIV, nós examinaremos a
extensão total da resposta específica a epítopos crípticos pelo mapeamento da resposta
contra peptídeos sobrepostos, os quais cobrem todos os cORFs do genoma SIVmac239 de
macacos infectados com SIV. No segmento de estudos da infecção por HIV, nós avaliaremos
5 seres humanos, infectados pelo HIV no Brasil, em fase aguda de infecção, quanto a
resposta contra epítopos crípticos restritos aos HLA mais comuns da coorte. Nós também
avaliaremos 10 seres humanos, infectados pelo HIV, controladores de elite da coorte de São
Francisco, quanto à resposta contra epítopos crípticos restritos ao HLA-B57 e HLA-B27. Os
resultados destes estudos nos dirão se haverá a continuidade para a fase do projeto em
primatas, descrita abaixo.
Equipe
Pesquisadores do iii
Responsável: Esper G. Kallás – FMUSP
Estudantes
Marisa Hong – Doutorado
Maria Teresa Maidana Giret – Doutorado
Nancy Gouvea – Doutorado
Elkin Hernán Bermudez – Doutorado
Leandro Tarosso – Mestrado
Pós-doutoranda
Mariana Mellilo Sauer – FMUSP
Técnico superior
Helena Tomiyama – FMUSP
Cláudia Tomiyama – FMUSP
Colaboradores internacionais
David I. Watkins – Universidade de Wisconsin, EUA
Nicholas Maness – Universidade de Wisconsin, EUA
Douglas F. Nixon – UCSF
Subprojeto 2. Desenvolvimento de novos imunógenos
A identificação e análise de epitopos de linfócitos T e B tem sido um dos principais
focos de nosso grupo de pesquisa nos últimos anos (Rizzo et al., 1989; Cunha-Neto et al.,
1994,1995, 1996; Abel et al., 1997, 2005; Duranti et al., 1999; Iwai et al., 2001, 2005;
27
Fonseca et al. Microb.Infect 2005; Loffredo JV 2007, Loffredo PloS One 2007). A utilização
do algoritmo TEPITOPE, capaz de predizer a ligação promíscua a múltiplas moléculas de
MHC classe II (Sturniolo et al., 1999) tem possibilitado ao nosso grupo selecionar epitopos
freqüentemente reconhecidos pelos linfócitos T CD4+ nas proteínas imunodominantes
obtidas de vários patógenos e alvos de doenças auto-imunes (Iwai et al., 2003; Toscano et
al., 2004; Toscano C et al., 2005, Damico FM et al., 2005; Rosa DS et al. 2006; Garcia et al.
2008). No contexto do iii, nós escrutinamos regiões altamente conservadas da seqüência de
consenso do genoma total do HIV-1 subtipo B (http://HIV-1-web.lanl.gov/content/index) para
ligação promíscua a moléculas HLA-DR utilizando o algoritmo TEPITOPE. Foram
selecionados 18 epitopos, dos quais 11 ainda não descritos. Esta propriedade foi confirmada
por ensaios de ligação HLA-DR-peptídeo. Cada um dos 18 peptídeos selecionados foi
reconhecido (ELISPOT IFN-gama) por células mononucleares de pelo menos 18% dos
pacientes em diferentes estágios da infecção por HIV. Significantemente, 91% (29/32) dos
pacientes reconheceram pelo menos um dos 18 peptídeos (FONSECA et al. 2006),
reconhecendo em média 5 peptídeos distintos. Observamos que células T CD4+ e CD8+ de
memória central e efetora eram as principais populações respondedoras aos peptídeos
(dados não publicados). Os dados sugerem que os peptídeos são naturalmente
apresentados durante a infecção pelo HIV-1. Consideramos as características dos epitopos
como uma base promissora para uma vacina capaz de produzir uma resposta com amplitude
e cobertura significativas sobre a disparidade HLA das populações altamente heterogêneas,
e talvez permitir uma imunização cruzada entre os clados do HIV, já que as sequências são
altamente conservadas entre subtipos distintos (Fonseca et al. 2006). Os peptídeos e seus
usos imunobiológicos foram patenteados (INPI PI0504117-1, USPTO, EPO) inventores
EDECIO
CUNHA-NETO,
JORGE
KALIL,
SIMONE
GONÇALVES
DA
FONSECA,
Depositantes FAPESP, USP e Fundação Zerbini,“Epitopos, combinação de epítopos, usos
de epítopos ou sua combinação, composição, usos da composição, vacinas profiláticas antiHIV-1, vacinas terapêuticas, método para a identificação de epítopos e métodos para o
tratamento ou prevenção”. Ainda no âmbito do Instituto de Investigação em Imunologia 20052008, construímos vacinas de DNA onde um inserto codificando os 18 epitopos, com
espaçadores, construído com otimização de códons, foi introduzido em um plasmídeo pVAXd
1 (pVAX-HIVBr18). Camundongos BALB/c (H-2 ) imunizados com o pVAX-HIVBr18
apresentaram resposta significativa à construção, que foi capaz de induzir proliferação de
+
+
linfócitos T CD4 e CD8 , e geração de células T produtoras de IFN-gama, IL-2 e TNF-alfa
polifuncionais a múltiplos peptídeos que fazem parte da construção, numa resposta
multiepitópica. Além disso, avaliamos a imunogenicidade do DNA multiepitópico pVAXHIVBr18 em camundongos transgênicos para diversas moléculas de HLA de classe II
humanas (DR2, DR4, DQ6 e DQ8). Observamos que as linhagens apresentaram linfócitos
produtores de IFN-γ específicos para o pool de peptídeos do HIV-1 e conjuntos diferentes de
peptídeos. Nas 5 linhagens de camundongos houve reconhecimento de 17 dos 18 epitopos
codificados pela vacina. Estes resultados sugerem que o DNA multiepitópico pVAX-HIVBr18
28
é capaz de induzir uma resposta imune multialélica. Essa propriedade, em conjunto com a
observação de uma resposta multifuncional, e a indução de significativa população de
linfócitos T CD4+ e CD8+ de memória central, sugere que o pVAX-HIVBr18 é um imunógeno
promissor.
Abaixo são descritos projetos que envolvem o desenvolvimento de imunógenos para
prevenção da transmissão do HIV-1.
Objetivo 1. Vacina anti-HIV de epitopos promíscuos de classe II: O iii vem trabalhando no
desenvolvimento de nova vacina candidata anti-HIV que se baseia na estratégia de imunizar
com plasmídios de DNA codificando epitopos promíscuos, reconhecidos por diferentes
moléculas MHC classe II. Os resultados de imunogenicidade obtidos na fase pré-clínica
mostraram-se extremamente promissores. Propomos desenvolver estudo clínico fase I, cego,
randomizado com placebo, com escalonamento de doses, para avaliar a segurança,
tolerância e imunogenicidade do produto em pessoas de baixa vulnerabilidade à infecção
pelo HIV-1. O projeto terá o seguinte delineamento:
Objetivos: Avaliar a segurança, tolerância e imunogenicidade da vacina de DNA baseada em
epitopos classe II.
População estudada: Voluntários saudáveis, de 18 a 50 anos, com baixa vulnerabilidade de
se infectar pelo HIV.
Avaliação primária: presença de eventos adversos relacionados a vacina.
Avaliação secundária: resposta imunológica celular contra os epitopos do HIV codificados na
vacina, tanto reconhecidos por linfócitos T CD4+ como CD8+. Aqui utilizaremos ensaios de
ELISPOT para IFN-γ e ensaios de citometria de fluxo com detecção de citocinas intracelulares.
Características do estudo: Estudo fase I, prospectivo, cego, com escalonamento de doses,
aleatorizado, controlado com placebo. Todos os voluntários serão seguidos por pelo menos 4
anos após o início das vacinações.
Planejamento: Os voluntários serão aleatorizados em três grupos de 12 participantes. Cada
grupo terá três voluntários recebendo placebo e nove recebendo a vacina. A dose da vacina
será escalonada em forma seqüencial em cada grupo em doses de 2mg, 4mg e 8mg da
vacina pVAX (pVAX-HIVBr18). Cada participante receberá 3 doses, com intervalos de 2
meses. O escalonamento para a seguinte dose da vacina dependerá da avaliação dos dados
de segurança após a segunda dose de cada grupo por parte de um Conselho Independente
de Monitoramento de Segurança de Dados (DSMB, em inglês).
Vacina de estudo: vacina de DNA, construída em plasmídeo pVAX (pVAX-HIVBr18),
contendo inserto codificando com otimização de códons - 16 epitopos promíscuos preditos in
29
silico e testados em estudos pré-clínicos com sucesso. Os epitopos são reconhecidos por
múltiplas moléculas MHC classe II, codificados por alelos HLA-DR humanos.
Critérios de inclusão e exclusão: voluntários saudáveis de 18 a 50 anos, com pelo menos
50Kg, com baixo risco de infecção pelo HIV, sem infecção pelo HIV, HBV, HCV e HTLV, sem
problemas médicos que impliquem em qualquer alteração da resposta imunológica, inclusive,
mas não restritos a, imunodeficiências primárias, uso de corticóide, uso de medicação
imunossupressora, uso de quimioterapia; não serão incluídos mulheres grávidas ou em
lactação, homens ou mulheres que planejem ter filhos nos próximos 2 anos, pacientes com
diagnóstico de neoplasia (exceto carcinoma baso ou espinocelular de pele, sem evidências
de disseminação local ou sistêmica), tenha participado em estudo prévio de vacina anti-HIV
(a menos que tenha sido incluído no grupo placebo), tenha histórico de abuso de sustâncias
psicoativas nos últimos 5 anos e que se recuse a assinar o termo de consentimento livre e
esclarecido.
Acompanhamento: os voluntários arrolados serão submetidos a visitas clínicas, testes
sorológicos e de segurança básicos (hematologia e bioquímica), assim como coleta de
amostras periódicas para testes de resposta imunológica celular e armazenamento de
amostras em repositório. As visitas terão intervalos de 4 a 12 semanas nos primeiros 18
meses, passando a 24 semanas de intervalo a seguir.
Equipe
Pesquisadores do iii
Responsável: Esper G. Kallás – FMUSP
Edécio Cunha-Neto – FMUSP
Estudantes
Susan Ribeiro – Doutorado
Pós-doutorandos
Daniela Santoro Rosa – FMUSP
Equipe da Unidade de Pesquisa Clínica
Coordenador Clínico: Ricardo Palacios
Administradora: Maria Candida Dantas
Assuntos Regulatórios: Zelinda Nakagawa, Issler Silva
Médicos: Mariana Sauer, Fábio Leal, João Miraglia
Enfermeiras: Laís Magalhães, Maria Emília Campos
Farmacêuticas: Lígia Correa, Maria Teresa Maidana, Giret, Andréa Pinheiro
Educador Comunitário: Ricardo Gambôa
Aconselhadores: Flávia Penacchin, Daniel Bertevello
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Gerenciadores de dados: Ricardo Russo, Angela Lima
Laboratório: Helena Tomiyama, Leandro Tarosso, Fernanda Bruno
Objetivo 2. Desenvolvimento de nova vacina candidata contra o HIV construída com o
vírus vacinal da febre amarela. Tem sido observado que esquemas de imunização com
vacina de DNA seguido por reforço com vetor viral recombinante (prime-boost) são mais
imunogênicos que a vacina de DNA isoladamente, em primatas e seres humanos. Outros
trabalhos têm sugerido que vetores virais replicantes têm uma imunogenicidade ainda maior.
Dentre esses, um dos mais promissores é o vírus YF17D, da vacina da febre amarela. O
YF17D, uma das vacinas mais eficazes no homem, confere proteção a 98% dos vacinados
por 10 anos, e memória por até 35 anos, podendo albergar e expressar epitopos exógenos
de forma estável e imunizante em algumas regiões, como a região intergênica E/NS1
(Bonaldo MC et al. Virol J. 2007;4:115; Tao D et al. J Exp Med. 2005;201(2):201-9). O virus
YF17D é uma vacina replicativa, que induz respostas imunes intensas de linfócitos T CD4+ e
CD8+. A vacina é barata e aplicada em dose única, com metodologia de produção e
procedimentos de controle de qualidade bem estabelecidos e perfil de segurança bem
conhecido, após muitos milhões de doses administradas por várias décadas. Nesse projeto,
iremos desenvolver um novo protótipo de vacina contra o HIV baseada no vírus vacinal da
febre amarela, cepa 17D. O vetor vacinal YF17D receberá segmentos de DNA codificando
(com otimização de códons) epitopos promíscuos do HIV também utilizados na vacina de
DNA descrita no projeto anterior. Avaliaremos a imunogenicidade da vacina isoladamente e
em comparação à imunização com o DNA, ou em esquemas de prime-boost com DNA e
YF17D-HIV recombinante, em camundongos BALB/c e transgênicos. Monitoraremos as
respostas imunes 15, 90 e 180 dias após a última imunização com ELISPOT IFN-gama e IL2, produção de citocinas intracelulares IFN-gama, IL-2 e TNF-alfa, proliferação e fenótipo de
memória. Com a colaboração do Prof. David Watkins, avaliaremos em seguida a
imunogenicidade de vacinas YF17D recombinantes, construídas com epitopos do SIV
(Simian immunodeficiency vírus), cepa SIVmac239,
também previstos com o algoritmo
TEPITOPE. Também será construída uma vacina de DNA SIVmac239, codificando os
mesmos epitopos. Macacos rhesus receberão as vacinas YF17D-SIV recombinantes,
isoladamente e em comparação à imunização com o DNA, ou em esquemas de prime-boost
com DNA-SIVmac239 e YF17D-SIVmac239. A imunogenicidade será avaliada como descrito
para os camundongos. Primatas imunizados com as vacinas SIVmac239 receberão desafio
com cepa virulenta heteróloga SIVmac251, e avaliaremos a proteção seguindo a carga viral,
o número de células T CD4+/mm3 ao longo das etapas aguda e crônica da infecção, e a
sobrevida.
Equipe
Pesquisadores do iii
31
Responsável: Edécio Cunha-Neto – FMUSP
Esper G. Kallás – FMUSP
Luiza Guilherme – FMUSP
Jorge Kalil – FMUSP
Estudantes
Susan Ribeiro – Doutorado
Pós-doutorandos
Daniela Santoro Rosa – FMUSP
Objetivo 3. Teste de vacina baseada em epitopos crípticos. Na continuidade da proposta
“Resposta imune celular contra epítopos crípticos na AIDS”, na fase com primatas, o estudo
do modelo de macaco / SIV envolverá a vacinação de animais com rBCG carreando as
proteínas de interesse e reforço com Shigella atenuada expressando cORFs imunogênicos
determinados na fase R21. Estes animais serão desafiados com SIVmac239 e a resposta
imunológica e o controle viral avaliados. No estudo da infecção pelo HIV da fase R33, nós
avaliaremos 10 controladores de elite da coorte de São Francisco quanto a resposta contra
peptídeos sobrepostos representando todo o cORF do consenso B. Nós testaremos também
5 pacientes da coorte brasileira quanto a resposta contra peptídeos representantes da
seqüência viral autóloga de cada paciente. Desta forma, resumidamente, os objetivos deste
estudo são: 1. Determinar a contribuição que as respostas contra epítopos crípticos exercem
sobre a resposta imune total específica ao vírus da AIDS. 2. Determinar a habilidade da
resposta imune contra epítopos crípticos induzida por vacina em controlar a replicação viral.
Esse projeto é fruto de uma colaboração entre os Profs. Esper Kallás, David Watkins (U.
Wisconsin) e Douglas Nixon (UCSF) e foi submetido ao National Institutes of Health para
solicitação de financiamento.
Equipe
Pesquisadores do iii
Responsável: Esper G. Kallás – FMUSP
Estudantes
Marisa Hong – Doutorado
Maria Teresa Maidana Giret – Doutorado
Nancy Gouvea – Doutorado
Elkin Hernán Bermudez – Doutorado
Leandro Tarosso – Mestrado
Pós-doutoranda
Mariana Mellilo Sauer – FMUSP
32
Colaboradores internacionais
David I. Watkins – Universidade de Wisconsin, EUA
Nicholas Maness – Universidade de Wisconsin, EUA
Subprojeto 3. Explorar novas estratégias de intervenção terapêutica.
A identificação de possíveis fatores de proteção do hospedeiro contra a evolução
adversa da infecção pelo HIV, em indivíduos com evolução favorável, é importante para o
desenvolvimento de futuras opções terapêuticas para o tratamento da infecção pelo HIV.
Ademais, esses fatores associados à boa evolução podem-se transformar em “correlatos de
proteção”, ou seja, fenotipos imunológicos a serem investigados em ensaios de vacinação.
Considerando que o principal fenótipo dos pacientes progressores lentos ou LTNP é a
manutenção de altos níveis de linfócitos T CD4+ por muitos anos, mecanismos que
promovam a sobrevivência celular e resistência à apoptose de células mononucleares/CD4+
(resistência aliás já descrita entre progressores lentos, Bottarel et al. 2001) podem estar
envolvidos. O surgimento recente de métodos “high-throughput”, como por exemplo, “DNA
arrays” que permitem o estudo simultâneo da expressão diferencial do genoma humano
completo, permite acelerar o descobrimento de fatores intrínsecos do hospedeiro que leva a
uma progressão lenta da doença. Também no contexto do Instituto de Investigação em
Imunologia, 2005-2008, foi realizada análise do perfil de expressão gênica, comparando
pacientes HIV+ progressores lentos (LTNP) e pacientes sob tratamento anti-retroviral
recuperados (CD4>500 cels/mm3) em relação a controles sadios, utilizando o microarray
Codelink, que avalia a expressão de 55.000 genes. Observamos que 36 genes se
encontravam regulados positivamente e 60 negativamente regulados de forma exclusiva em
pacientes LTNP. Dentre estes genes, 22 genes relacionados a sobrevivência celular,
apoptose ou vias imunológicas foram selecionados para validação da expressão diferencial
por PCR em tempo real. Observamos por PCR em tempo real um aumento na expressão
gênica dos genes IL-8 e HIG2, gene induzido por hipoxia, e uma diminuição da expressão
dos genes perforina 1, L-selectina e tripeptidil peptidase I, uma enzima que participa do
processamento de peptídeos que são apresentados via MHC classe I, em pacientes LTNP
em comparação aos pacientes progressores recuperados. Avaliamos funcionalmente
(identificação de estímulos, vias e efeitos) dois genes que foram efetivamente validados
como de expressão aumentada entre os LTNP, IL-8 e HIG2 (hypoxia-induced gene 2). O
HIG2 é um ligante do receptor frizzled 10, sendo ao mesmo tempo indutor e alvo da via
Wnt/beta-catenina, em um sistema de retroalimentação positiva (Togashi et al., 2005). A via
Wnt/beta-catenina está envolvida na proliferação celular e resistência à apoptose em célulastronco hematopoéticas e algumas neoplasias. Entre LTNP e outros indivíduos virgens de
tratamento com antiretrovirais, observamos associação entre a expressão de HIG2 em
PBMC de parâmetros de boa evolução de doença (altos níveis de CD4+, preservação do
3
número de linfócitos T CD4+ acima de 700/mm ) e baixa carga viral, além de correlação
33
negativa com o número de linfócitos T CD4+. Observamos que o tratamento de PBMC de
indivíduos soronegativos com cloreto de lítio, um agonista da via beta-catenina, o próprio
HIG-2 (peptídeo sintético de 36 aa), e a sua combinação era capaz de induzir a expressão
de HIG-2 endógeno. Mais ainda, o pré-tratamento com HIG-2 dobrou a proliferação induzida
por anticorpos monoclonais anti-CD3 e anti-CD28. Em conjunto os resultados sugerem que a
indução do HIG-2 pode ser um mecanismo homeostático visando à manutenção do número
de células T CD4+ à medida que a doença progride e os mecanismos de diminuição de
células T CD4+ aumentam de intensidade. Nesse contexto, pretendemos estudar o efeito do
uso estável e prolongado de carbonato de lítio em pacientes HIV+ com indicação
psiquiátrica, assim como realizar um estudo prospectivo, de fase I, com carbonato de lítio,
monitorado com dosagens plasmáticas, em pacientes HIV+ soronegativos. Mais estudos
estao sendo realizados para investigar um papel funcional deste e outros genes
diferencialmente expressos em pacientes LTNP que possam identificar mecanismos de
proteçao a apoptose das celulas T CD4+ e justificar um melhor prognóstico nestes pacientes
progressores lentos.
Objetivo 1. Identificação de alvos terapêuticos para intervenção na progressão para a
AIDS. Estudo de fatores imunológicos e genéticos diferenciais associados ao fenótipo HIV1+ LTNP a) Validação com Real Time RT-PCR dos genes diferencialmente expressos
oriundos da análise de expressão gênica diferencial entre pacientes HIV-1+ LTNP, utilizando
microarray Codelink de oligonucleotideos de 55,000 genes, b) Investigação funcional dos
genes diferencialmente expressos pelo grupo HIV-1+ LTNP no item (a) e posivelmente
ligados a sobrevivência de células T CD4+, como o gene HIG2 e a via da beta-catenina, por
citometria de fluxo, Western blot indução por agonistas e inibição por antagonistas e siRNA,
e ensaios de proliferação e de resistência a apoptose; c) Comparação de parâmetros
imunológicos e virológicos de pacientes HIV+ usuários ou não de carbonato de lítio, ativador
da via da beta-catenina e da expressão de HIG2; d) ensaio clínico de carbonato de lítio e
outros indutores da via da beta-catenina para pacientes portadores de HIV e virgens de
tratamento; d) análise imunogenética da associação de genes candidatos na progressão da
doença do HIV-1.
Equipe
Pesquisadores do iii
Responsável: Edécio Cunha-Neto – FMUSP
Aluísio Augusto Cotrim Segurado – FMUSP
Esper G. Kallás – FMUSP
Ester Sabino – FMUSP
Estudantes
Susan Ribeiro – Doutorado
34
Pós-doutorandos
Daniela Santoro Rosa – FMUSP
Camila Chaves – FMUSP
Mariana Mellilo Sauer – FMUSP
Técnico superior
Eliane Mairena – FMUSP
Colaboradora Nacional
Simone Fonseca – FMUSP
Rajendranath Ramasawmy-FMUSP
Objetivo 2. Resposta contra epitopos mutantes induzidos por inibidores de protease no
tratamento do HIV. Além dos epitopos conservados do HIV, no âmbito do iii-2005-2008,
identificamos o reconhecimento por células T CD4+ (pela primeira vez) e CD8+ de epitopos
da protease do HIV com mutações induzidas por drogas. Na etapa atual, pretendemos
estudar se o reconhecimento de epitopos da protease do HIV contendo mutações induzidas
por drogas está associado a uma contenção da replicação do vírus mutante, em um estudo
longitudinal. Se a associação for comprovada, tais estudos terão relevância para uma
possível vacina terapêutica em pacientes que irão se submeter a tratamento com inibidores
de protease.
Equipe
Pesquisadores do iii
Responsável: Edécio Cunha-Neto – FMUSP
Aluísio Augusto Cotrim Segurado – FMUSP
Esper G. Kallás – FMUSP
Amilcar Tanuri – UFRJ
Estudantes
Natalie G. Müller – Mestrado
Pós-doutorandos
Edna de Souza – FMUSP
Técnico superior
Helena Tomiyama – FMUSP
Colaborador Nacional
Sandra Moraes – FMUSP
Luiz Augusto Fonseca – FMUSP
Colaborador Internacional
Rafick-Pierre Sékaly – Université de Montreal
35
Objetivo 3. Caracterização do potencial neutralizante de Ac anti-HIV obtidos por phage
display. Nos últimos anos vêm se acumulando evidências da importância de anticorpos
neutralizantes no bloqueio da progressão ou no retardamento de progressão da AIDS. Esse
panorama sugere que esforços no sentido da imunoprofilaxia preventiva devem abordar não
apenas aspectos da imunidade celular, como também da imunidade humoral (Mascola,
2007). Nesse sentido, vêm sendo testados protocolos de imunoprofilaxia passiva in vivo
utilizando-se diversos anticorpos neutralizantes previamente isolados (Veazey et al., 2003).
Achados recentes mostram ainda que a infusão destes anticorpos por via intravenosa
previne a infecção de mucosas com um vírus de imunodeficiência quimérico símio/humano
(SHIV) (Hessel et al., 2007). Os resultados alcançados com primatas não-humanos são
animadores, sugerindo que anticorpos com capacidade neutralizante são capazes de
bloquear a infecção, via vaginal, impedindo a entrada do vírus, e apontando para a sua
utilização tópica, em conjunto, com barreiras mecânicas (Ferrantelli et al., 2004).
Os dados experimentais apontam também para a necessidade de se utilizar não
apenas um, mas um conjunto de anticorpos neutralizantes, para se conseguir a neutralização
de isolados virais de diferentes clãs (Quakkelaar et al., 2007). Os antígenos preferenciais
visando a inibição da entrada do vírus na célula-alvo e, conseqüentemente, a sua
proliferação, são as proteínas do envelope viral: gp120 e gp41 (Karlsson Hedestam et al.,
2008). Dentre estas, se levarmos em questão o fator variabilidade, a gp41 se mostra um alvo
mais promissor dada a sua maior conservação dentre os diversos virotipos circulantes.
Esses dados em conjunto com achados de títulos de IgA urinária, cérvico-vaginal (Alexander
& Mesteckv, 2007) e sérica (Clerici et al, 2002) capazes de neutralizar isolados primários de
HIV, nos levaram a propor o isolamento de anticorpos, na forma de Fab com o potencial
neutralizante. No trabalho de mestrado desenvolvido por Albuquerque fomos capazes de
isolar Ac que se ligam a epitopos de gp41 considerados neutralizantes (Zolla-Pasner et al,
2004). Para tanto, utilizamos uma biblioteca de fragmentos de Ac humanos, previamente
construída pelo grupo (Dantas-Barbosa et al., 2005). Quatro anticorpos diferentes foram
caracterizados e apresentaram capacidade de reconhecimento do epitopo compreendido
entre as posições 575 a 597 da proteína gp160, localizado no domínio descrito como
essencial para promover a fusão de envelope viral e a célula–alvo (Zwick et al., 2004). Os
quatro genes codificadores de Ac humanos selecionados estão sendo transferidos para vetor
de expressão em Pichia pastoris, também desenvolvido por nosso grupo (Burtet et al., 2007)
ainda na forma de Fab. Esperamos com isso conseguir expressar proteínas recombinantes
suficientes para testar a a capacidade de neutralização destes anticorpos que será medida
pela diminuição de títulos virais a partir da infecção de células em cultura. A idéia é conseguir
testar a capacidade destes Ac, isoladamente ou em conjunto, de neutralizar diferentes
virotipos circulantes no Brasil. Dependendo do resultado esperamos ainda converter, por
engenharia genética, alguns desses fragmentos em moléculas de Ac inteiros.
36
Equipe
Pesquisadores do iii
Responsável: Andrea Maranhão – UnB
Marcelo Brígido – UnB
Amilcar Tanuri – UFRJ
Aluisio Augusto Cotrim Segurado - FMUSP
Edécio Cunha-Neto - FMUSP
Estudantes
Maria Teresa Maidana Giret – Doutorado
Nancy Gouvea – Doutorado
Elkin Hernán Bermudez – Doutorado
Leandro Tarosso – Mestrado
Técnico superior
Helena Tomiyama – FMUSP
Cláudia Tomiyama – FMUSP
Colaboradores internacionais
David I. Watkins – Universidade de Wisconsin, EUA
37
C. IMUNODEFICIÊNCIAS
Imunodeficiências primárias são doenças relativamente raras que afetam em conjunto
1 em cada mil a dois mil e quinhentos seres humanos. Além do problema social que
representam por constituírem doenças crônicas de difícil tratamento e que atingem a
crianças e adultos jovens, elas apresentam um alto custo econômico para o pais visto que o
tratamento de muitos destes pacientes fica a cargo do Sistema Único de Saúde (SUS) a
custos que excedem quatro mil reais por mês (Brandau e Gilbert, 2007). Do ponto de vista
científico, estas doenças apresentam-nos um oportunidade única para entendermos o
funcionamento do sistema imune em seres humanos. Concentramos os nossos esforços em
uma síndrome conhecida por imunodeficiência comum variável (ICV). Esta síndrome é
caracterizada por hipogamaglobulinemia e uma variedade de outros fenômenos clínicos
como alergias respiratórias e cutâneas, doenças auto-imunes e neoplasias diversas (Yong et
at., 2008). Esta gama de possíveis complicações é explicada pela diversidade genética que
cerca esta patologia com mais de dez genes descritos em associação com a mesma (Park,
et at., 2008, Schaffer et at., 2008, Kopecky e Luksova, 2007) inclusive um descrito
recentemente pelo nosso grupo (Kuribayashi et al., 2008), o primeiro defeito genético em
imunodeficiências primárias descrito no Brasil e também o primeiro defeito nesta via de
secreção de proteínas associada com uma patologia em seres humanos.
Atualmente o diagnóstico da ICV é complicado por uma série de fatores e o
acompanhamento dos pacientes é pouco personalizado pelas dificuldades em separar as
diversas doenças que compõem está síndrome (Spyridakou et al., 2007). Acreditamos que a
determinação molecular do defeito envolvido no aparecimento da hipogamaglobulinemia
possa justificar as diferentes apresentações clínicas da ICV e conseqüentemente nortear um
tratamento individualizado que permitirá uma maior e melhor sobrevida a estes pacientes,
alem de proporcionar uma diminuição dos custos para o SUS. Sendo assim pretendemos
expandir o estudo genético de todas as alterações conhecidas para todos os 112 pacientes
em seguimento atualmente no serviço, portadores de ICV. Também pretendemos estudar
outros genes candidatos que ainda não foram claramente associados com ICV em indivíduos
representativos de cada um dos grupos de portadores de ICV na nossa coorte.
A leptina é um hormônio produzido pelo tecido adiposo que esta envolvido em
diversas funções endócrinas associadas com o armazenamento de energia, mas também
com a angiogênese, reprodução e a regulação do eixo hipotálamo-pituitária-adrenal. Estudos
anteriores do nosso grupo através dos auspícios do iii, nos permitiram identificar uma
população de pacientes com ICV cujos linfócitos respondem in vitro à reposição de leptina
com a produção de citocinas envolvidas na síntese de anticorpos e diminuição da morte
celular programada (Goldberg et at., 2005 e 2008). Este achado nos abre a perspectiva de
utilizar a reposição de leptina, uma molécula cujo gene já se encontra clonado e disponível
no iii para utilização, como um adjuvante no tratamento da ICV. Para este passo final
pretendemos nesta etapa determinar, através da determinação de marcadores laboratoriais,
qual é o grupo de pacientes que responde in vitro à reposição de leptina e a partir dai
38
estabelecer inicialmente in vitro e depois in vivo se a leptina também induz a síntese de
anticorpos nestes indivíduos.
Objetivos
1. Estabelecer o perfil de mutações conhecidas em todos os pacientes portadores de ICV
acompanhados dentro do iii. Isto permitirá através do cruzamento com os dados clínicos
dos pacientes, estabelecer critérios laboratoriais para acompanhamento destes doentes.
O melhor acompanhamento terá resultados sociais (melhor qualidade de vida e maior
sobrevida), econômico (menor custo com internações por intercorrências). Também
representará um grande avanço científico, visto que estamos em uma condição única no
mundo para avaliar a progressão destes pacientes e correlaciona-la com achados
laboratoriais. A maior casuística desta descrita tem ICV conta com 252 pacientes
(Oksenhendler et at., 2008), descritos em mais de 42 hospitais diferentes. O fato que
todos os nossos pacientes são acompanhados há mais de 10 anos pela mesma equipe
médica nos brinda com uma consistência de análise clínica inalcançável em outros
centros.
2. Estabelecer o perfil de mutações em genes candidatos em todos os pacientes portadores
de ICV acompanhados dentro do iii. Isto permitirá novas associações que vão de
encontro ao objetivo acima. Neste e no objetivo descrito acima esperamos obter novos
testes laboratoriais que auxiliem no diagnóstico e acompanhamento de pacientes
portadores de ICV. Não haverá propriedade intelectual envolvida visto que todos os
conjuntos de genes que serão estudados já foram identificados, haverá apenas a
transferência do conhecimento sobre sua importância em ICV.
3. Determinar as características clínicas e laboratoriais dos pacientes que respondem in
vitro a reposição de leptina. A influência da leptina na resposta imune destes pacientes
foi descrita por nosso grupo e abre perspectivas interessantes de tratamento adjuvante
para a ICV. Alcançar este objetivo nos permitirá iniciar o entendimento dos mecanismos
que resultam nesta resposta, assim entendendo melhor a ICV e também a interação
imuno-endócrina mediada por este hormônio.
4. Determinar se a reposição de leptina resulta também em uma reaquisição da capacidade
de produzir anticorpos nos pacientes responsivos à reposição deste hormônio. Isto
permitirá estabelecer o potencial terapêutico desta molécula como coadjuvante à
reposição endovenosa de gamaglobulina nestes pacientes. Em caso positivo, a
diminuição na quantidade e ou freqüência de administração de imunoglobulina terá um
impacto social, diminuindo o risco inerente da utilização deste produto e um custo
econômico, diminuindo os dias de absenteísmo no emprego dos pacientes e também os
custos do SUS. Em adição a isto, vimos sofrendo com a falta de gamaglobulina no
mercado internacional, visto que o Brasil não produz a gamaglobulina que consome, e
desta forma qualquer intervenção que diminua a necessidade de seu uso terá impacto
imediato. Neste e no objetivo descrito acima esperamos obter um adjuvante no
39
tratamento da ICV. A propriedade intelectual será tratada conforme descrito na seção
específica deste projeto.
EQUIPE:
RESPONSÁVEL:
Luiz Vicente Rizzo, ICB-USP
Anna Carla Renata Krepel Goldberg, IQ-USP
Colaboradores Nacionais:
Myrthes Toledo Barros, FMUSP
Cristina Maria Kokron, FMUSP
Colaboradores Internacionais:
Patrice Debre, Hospital Pitié-Sapetriére, Paris, França
Megan K. Levings, Departamento de Cirurgia, University of British Columbia,
Canadá
Estudantes de pós-graduação:
Ana Karolina Barreto (Mestrado, FMUSP)
Estudantes de graduação
Tatyana Konberg (FMUSP)
Pós-doutores:
Jean Pierre Schatzmann Perón
Luiz Sardinha
Eliana Bline Marengo
Alessandra Gonçalves Commodaro
40
A. DOENÇAS INFECCIOSAS – LEISHMANIOSE
A Leishmaniose Visceral (LV) está em expansão no Nordeste do Brasil e vários
casos estão ocorrendo nas vizinhanças das grandes cidades. É caracterizada por uma
diminuição da resposta imune celular ao antígeno de leishmania. Após o tratamento e cura
da doença, essas funções de células T são restauradas (Bacellar e Barral-Netto , 1991,
Carvalho e Bacellar, 1988). Não há vacinas efetivas e a terapêutica depende de
medicamentos com elevada toxicidade. O tratamento da LV é feito com antimonial
pentavalente, droga com efeitos colaterais importantes no homem (Shyam et al., 2006). Cães
não respondem adequadamente às medicações utilizadas para tratamento de seres
humanos, persistindo com parasitos e apresentando recidiva da doença (Noli et al.,2005).
Medidas de controle como imunoprofilaxia e/ou imunoterapia são necessárias. A busca de
abordagens que reduzam as doses de medicação necessárias e os efeitos colaterais ou
reduzam a resistência são, portanto, de alta relevância.
Os vetores das leishmanioses são os flebotomíneos. A interação entre componentes
da saliva de flebótomos e mecanismos imunes do hospedeiro, com reflexos sobre a
infectividade e a progressão da doença, tem sido estudada e sugere novas alternativas para
o controle da doença. A infecção ocorre quando uma fêmea de flebotomíneo infectada com
Leishmania injeta esses parasitos juntamente com saliva. A saliva secretada beneficia o
parasita transmitido pelo vetor (Titus e Ribeiro, 1988). Crianças da área endêmica de LV
desenvolvem uma resposta imune contra produtos da saliva (Barral et al., 2001; Gomes et al.
2002). Nosso grupo descreveu diversos efeitos da saliva de flebótomos sobre a resposta
imune (revisto em Andrade et al., 2007). Voluntários submetidos a repetidas picadas de
Lutzomyia longipalpis desenvolvem resposta humoral e celular específica (Vinhas et al.,
2007). A possibilidade de que produtos da saliva do flebótomo podem se tornar potenciais
candidatos ao desenvolvimento de uma vacina para controlar a transmissão da Leishmania
foi demonstrada recentemente no hamster (Gomes et al., 2008).
Subprojeto 1: Produtos da saliva de Lutzomyia longipalpis e da Leishmania: Ações
Farmacológicas e em Vacinas.
A saliva de flebotomíneos possui uma grande diversidade de substâncias
farmacologicamente ativas (D’Ávila et al., 2006). Através do RAS (Reverse antigenic
screening) para avaliar as proteínas salivares de Lutzomyia longipalpis capazes de induzir
reações de DTH nos cães vacinados com Homogeneizado de Glândula Salivar (SGH)
verificamos que as proteínas salivares indutoras de DTH podem ser protetoras contra uma
infecção subseqüente com Leishmania chagasi + saliva. Desta forma, três proteínas foram
selecionadas: A, B e C (não identificadas por questões pendentes de propriedade
intelectual). Grupos de cães foram imunizados com os plasmídeos codificantes para as
proteínas A, B e C isoladamente ou em combinação com o plasmídeo responsável pela
codificação do antígeno parasitário KMP-11, além dos controles necessários. Nenhum dos
produtos foi tóxico e o plasmídeo C, isoladamente ou em combinação com o plasmídeo
41
KMP-11 resultou em um aumento significativo de IFN-Ȗ. Os animais infectados com as
vacinas combinadas (A +KMP-11, C+KMP-11 e o grupo controle, um total de 21 cães) estão
expostos em uma área de alta endemicidade para LV. Os outros grupos de cães foram
6
infectados por via intradérmica com 5x 10 mais 5 pares de glândulas salivares, Todos estes
animais estão sendo acompanhados mensalmente para testes laboratoriais (provas
bioquímicas), sorologia para Leishmania.
Nesse projeto, testaremos o potencial farmacológico e imunomodulatório das
proteínas recombinantes da saliva de 11, 44, 45 e 61 kDa de Lu. longipalpis realizando um
rastreamento de suas atividades farmacológicas em abordagens in vitro e in vivo que serão
avaliadas pela indução e função de corpúsculos lipídicos. Os corpúsculos lipídicos são locais
de armazenamento celular de lipídios, mas também são estruturas dinâmicas e altamente
reguladas envolvidos na formação de prostaglandinas e os leucotrienos na resposta
inflamatória e infecciosa (D’Ávila et al., 2006). Desta forma, os corpúsculos lipídicos vêm
sendo propostos como um novo alvo para o screening e desenvolvimento de drogas antiinflamatórias (Bozza et al, 1996). Dados do nosso grupo mostram que o homogeneizado de
glândula salivar (SGH) é capaz de induzir corpúsculos lipídicos de maneira dose e tempo
dependente (Araújo-Santos et al., manuscrito em preparação). Pretendemos testar as
proteínas recombinantes da saliva quanto a gênese/função dos corpúsculos lipídicos e
associá-los com efeitos imunomodulatórios na infecção por L. chagasi. A maioria dos
estudos com saliva caracterizam a atuação da saliva total ou de proteínas recombinantes em
detrimento a elementos não protéicos. Nesse sentido, a literatura tem registrado muitos
estudos sobre atividades biológicas dos fosfolipídeos em diferentes sistemas, mas muito
pouco tem sido explorado no contexto vetor-parasita-célula hospedeira. Nesse projeto nos
propomos caracterizar e investigar o papel dos fosfolipídeos da saliva de Lu. longipalpis na
infecção por L. chagasi, assim como suas ações inflamatórias e imunogênicas.
Além disso, daremos continuidade à linha de pesquisa em andamento que tem como
objetivo principal investigar a ação inflamatória de SGH de Lu. longipalpis na resposta inicial
da infecção por L. chagasi. A picada de flebótomos infectados ou não induz um intenso
recrutamento neutrofílico para o local da picada (Peters et al, 2008). Nesse sentido,
observações do nosso grupo concluíram que o SGH de Lu. longipalpis é capaz de recrutar e
de induzir a apoptose de neutrófilos favorecendo o aumento da carga parasitária de L.
chagasi nestas células (Prates et al., manuscrito em preparação). Nesse projeto nos
propomos a avaliar o papel desempenhado pelas proteínas recombinantes da saliva de L.
longipalpis na infecção por L. chagasi e implicações na produção de citocinas e mediadores
lipídicos, no recrutamento de leucócitos, bem como pretendemos explorar a atividade próapoptótica das proteínas.
Objetivos gerais
Os nossos objetivos nesta proposta são: (i) reduzir a transmissão de L. chagasi em
cães, submetendo-os à vacinação, usando uma mistura de moléculas de cDNA de proteínas
42
salivares de Lu. longipalpis combinada com antígenos parasitários, capazes de induzir uma
resposta imune contra estes componentes e portanto, diminuir a transmissão do parasita; (ii)
caracterizar bioquimicamente e molecularmente os peptídeos biologicamente ativos
presentes na saliva de Lu. Longipalpis; (iii) Explorar o potencial farmacológico das proteínas
recombinantes e fosfolpídeos de saliva em modelos de inflamação murina previamente
estabelecidos; (iv) Avaliar o papel pro-apoptótico e imunomodulatório das
proteínas
recombinantes da saliva de L. longipalpis na infecção por L. chagasi.em modelo murino
Objetivos específicos:
1. Testar a imunogenicidade do plasmídeo C combinado às proteínas acidas
ribosomais.
2. Verificar a proteção pela infecção dos cães por via intradérmica de parasitas
combinado à saliva, por infecção experimental, utilizando flebótomos infectados
também por meio de transmissão natural na área endêmica.
3. Avaliar a proteção vacinal no tocante à transmissibilidade de L. chagasi de cães
imunizados para flebótomos não infectados.
4. Investigar os efeitos das proteínas recombinantes da saliva de Lu. longipalpis na
biogênese/função de corpúsculos lipídicos e sua implicação na modulação da
produção de mediadores inflamatórios em modelos murinos.
5. Caracterizar os espectros de ações biológicas de componentes da saliva em
modelos murinos (recrutamento, ativação de leucócitos e potencial pro-apoptótico).
6.
Investigar a atividade imunomodulatória de proteínas recombinantes e fosfolipídeos
da saliva de Lu. longipalpis em macrófagos peritoneais de camundongo quanto à
produção citocinas e mediadores lipídicos durante a infecção por L. chagasi.
7. Caracterizar a estrutura molecular dos componentes biologicamente relevantes por
técnicas de análise da estrutura molecular (modelagem molecular por técnicas de
bioinformática).
Equipe
Pesquisadores do iii
Responsável:
Aldina Barral – FIOCRUZ-BA
Manoel Barral-Netto - FIOCRUZ
Cláudia Ida Brodskyn - FIOCRUZ
Colaboradores Nacionais
José Carlos Miranda – FIOCRUZ
Camila Indiani de Oliveira– FIOCRUZ
Valéria de Matos Borges - FIOCRUZ
Flávia Nascimento – UFMA
43
Petter Franco Entringer- FIOCRUZ-BA
Ivan Nascimento - FIOCRUZ-BA
Colaboradores Internacionais
Jesus Valenzuela– NIH,USA.
Shaden Kanhawi– NIH,USA.
Manuel Soto - Univ. Autonoma de Madrid
Alunos de pós-graduação
Deboraci Brito Prates – Doutorado FIOCRUZ
Ana Paula Souza - Doutorado, FIOCRUZ
Lucilene Amorim - Doutorado, FIOCRUZ
Bruno Bezerril, Doutorado, FIOCRUZ
Viviane Boaventura, Doutorado, FIOCRUZ
Raíssa Maria Araújo Carvalho – Mestrado, FIOCRUZ
Théo de Araújo Santos – Mestrado, FIOCRUZ
Subprojeto 2. Imunoterapia com N-acetil cisteína associado a antimonial pentavalente
no tratamento da leishmaniose visceral humana e canina
A leishmaniose visceral (LV) está em expansão e urbanização no Brasil, atingindo o
ser humano e animais, principalmente os cães, que vivem no ambiente domiciliar e
peridomiciliar (Jeronimo SM, et al, 2004, Costa, CHN, 2007). Em Aracaju-Sergipe, 20 a 25%
dos cães que são levados ao Serviço de Zoonoses do município, apresentam sorologia
positiva para calazar. Por lei, estes animais devem ser sacrificados. Apesar desta medida de
controle, a prevalência da doença tem persistido elevada em diversas regiões (Burattini MN,
et al 1998). O tratamento da leishmaniose visceral é feito com antimonial pentavalente, droga
com efeitos colaterais importantes no homem e, em algumas áreas, a resistência ao
tratamento tem sido relatada (Sundar, S e Chatterjee, M, 2006). Cães não respondem
adequadamente às medicações utilizadas para tratamento de seres humanos, persistindo
com parasitos e apresentando recidiva da doença. Animais soropositivos atualmente são
sacrificados por recomendação do Ministério da Saúde. Medidas de controle como
imunoprofilaxia e/ou imunoterapia são necessárias, a fim de que ocorra o controle mais eficaz
da doença. Leishmaniose visceral é caracterizada por uma diminuição da resposta imune
celular ao antígeno de leishmania. Após o tratamento e cura da doença, essas funções de
células T são restauradas no homem (Bacellar e Barral-Netto, 1991, Carvalho e Bacellar,
1988). A busca de abordagens que reduzam os efeitos colaterais ou reduzam a resistência é
de alta relevância.
N-acetil cisteína (NAC) é um composto precursor de glutationa e os níveis
intracelulares de glutationa em células apresentadoras de antígenos (APC) promovem a
morte do parasita e influenciam na resposta Th1/Th2 (Rocha-Vieira, 2003). A depleção de
44
glutationa favorece a derivação de uma resposta Th2 e sua reposição favorece uma resposta
Th1 (Peterson et al.,1998). NAC tem sido utilizado em pacientes com fibrose cística, levando
à melhora das complicações pulmonares, com regulação da inflamação e diminuição de
atividade da elastase de neutrófilos (Tirouvanziam et al, 2006). A hipótese deste ensaio
clínico é que NAC associado ao antimônio terá benefícios superiores no tratamento de
leishmaniose visceral quando comparado ao tratamento com antimonial. Este ensaio está
sendo proposto por pesquisadores integrantes do iii desde 2002, tendo sempre apresentado
propostas de ensaios clínicos levados a cabo com sucesso. Esta proposta, no entanto, será
implementada em novo serviço universitário, pois os pesquisadores recentemente se
transferiram para o Hospital da Universidade Federal de Sergipe, onde estão formando a sua
nova equipe.
Objetivo Geral
Avaliar a resposta em humanos e cães com leishmaniose visceral a imunoterapia
com N-acetil cisteína associada ao antimonial pentavalente, em ensaios clínicos,
randomizados e cegos.
Objetivos Específicos
1. Avaliar a resposta terapêutica de pacientes com leishmaniose visceral a N-acetilcisteína
(NAC) como adjuvante ao tratamento padrão com antimonial pentavalente, comparado ao
tratamento somente com antimonial, através de estudo clínico randomizado e duplo cego.
2. Avaliar a resposta terapêutica de cães de rua da cidade de Aracaju com leishmaniose
visceral a N-acetilcisteína (NAC) como adjuvante ao tratamento com antimonial pentavalente,
comparado ao tratamento somente com antimonial, em estudo clínico randomizado e cego.
Métodos específicos:
Desenho do experimental estudo do objetivo 1:
Objetivo 1: Avaliar a resposta terapêutica de pacientes com leishmaniose visceral a
N-acetilcisteína (NAC) como adjuvante ao tratamento padrão com antimonial pentavalente,
comparado ao tratamento somente com antimonial, através de estudo clínico randomizado e
duplo cego.
Trata-se de um estudo de intervenção, tipo ensaio clínico, randomizado, duplo-cego,
placebo-controlado. Ressaltamos que o placebo se refere ao controle do NAC, mas todos os
pacientes receberão o tratamento padrão com antimonial.
Área do Estudo: anualmente, um total de 50 casos de LV são notificados no Estado de
Sergipe. Em 2007 foram notificados 75 caso. Os pacientes são atendidos no Hospital
Universitário (HU) da Universidade Federal de Sergipe.
O HU encontra-se em plena
expansão e atualmente faz parte de sua estrutura uma enfermaria de Pediatria com 20 leitos
e outra de Doenças Infecciosas com 10 leitos. Professores, médicos, residentes e internos
de Medicina fazem parte do corpo clínico.
45
Definição diagnóstica: O diagnóstico de LV é baseado na presença de sintomas e sinais
clínicos como febre, hepatoesplenomegalia, diarréia, epistaxe, icterícia. O diagnóstico
laboratorial é feito pela presença de anemia, leucopenia, plaquetopenia, hipoalbuminemia e
hiperglobulinemia, contudo a confirmação diagnóstica é feita pela sorologia positiva para L.
chagasi por ELISA e/ou imunofluorescência, teste de Montenegro negativo e cultura positiva
para o parasito obtido de biópsia aspirativa de medula óssea e/ou baço. Serão introduzidos
no estudo apenas os pacientes com diagnóstico parasitológico da doença.
Seleção dos pacientes: Os pacientes com diagnóstico confirmado de LV de acordo com os
critérios acima serão selecionados para participar do estudo randomizados em 2 grupos:
Grupo I (NAC 600mg, 3x ao dia VO, 20 dias + antimônio dose padrão – 20mg/kg/dia por 20
dias, IV) e Grupo II (comprimido efervescente parecido com o da droga em teste, contendo
os componentes da medicação exceto a N-acetil cisteína. + antimônio dose e tempo padrão
– 20 dias). Vinte pacientes virgens de tratamento com diagnóstico de LV serão incluídos em
cada grupo segundo os seguintes critérios de inclusão: idade • 2 anos de idade, diagnóstico
comfirmado pela presença de leishmania no exame direto ou cultura e que nunca foi tratado
para leishmaniose anteriormente. Os critérios de exclusão do estudo serão: outras doenças
associadas agudas ou crônicas, como uso de imunossupressores e AIDS, história de alergia
ao NAC e/ou ao antimonial pentavalente, tratamento prévio para calazar, diagnóstico de
fenilcetonúria. Os pacientes serão alocados nos grupos a partir de uma tabela de
randomização. Após preencherem os critérios de inclusão no estudo, os números serão
atribuídos aos pacientes. O médicos pediatra e infectologista serão responsáveis pela
avaliação da evolução clínica dos pacientes e pela coleta de dados quanto aos efeitos
colaterais e exames laboratoriais. Estes não terão conhecimento da randomização
previamente realizada. A N-acetil cisteína será utilizada na dose de 600 mg em comprimidos
efervescentes, conforme orientação do fabricante. NAC é disponibilizado comercialmente no
Brasil. O tratamento com antimônio será fornecido por um farmacêutico e realizado por um
técnico de enfermagem com treinamento para o procedimento. Todos os pacientes
realizarão avaliação bioquímica, dosagem de eletrólitos, avaliação da função renal, enzimas
hepática, hemograma completo e eletrocardiograma antes do tratamento e após quinze, 30,
60, 90 e 180 dias do mesmo.
Tratamento proposto: Todos os pacientes receberão antimonial pentavalente na dose de
20mg/Kg/dia, 20 dias.
A apresentação comercial do NAC (Fluimucil® Comprimidos
efervescentes de 600mg) será dissolvido para 100 ml de água. Ressaltamos que o placebo
se refere ao controle do NAC, mas todos os pacientes receberão o tratamento antimonial
padrão. O placebo a ser utilizado é um comprimido efervescente parecido com o da droga
em teste, contendo os componentes da medicação exceto a N-acetil cisteína.
Tamanho da amostra: Os parâmetros para cálculo do número de pacientes por grupo foram
a melhora clínica e laboratorial durante o tratamento, ou seja desaparecimento da febre e
aumento dos níveis de hemoglobina. No estudo de Thakur CP, 1998, 92 % dos pacientes
melhoraram dos parâmetros clínicos e laboratoriais apenas com 6 meses após o início da
46
terapia. O atual estudo pretende reduzir este tempo em 30% a 50%. Desta forma, serão
necessários 20 pacientes em cada grupo, com poder de 90% (beta de 10%) e alfa de 5% (p
= 0.05).
Seguimento dos pacientes: Todos os pacientes estudados terão acompanhamento clínico e
laboratorial por um período de 12 meses com avaliação regular de 30 em 30 dias até
completar 180 dias e após 360 dias.
Critério de cura: A cura clínica é definida no paciente com redução do baço e fígado a
tamanhos normais. Ausência de febre por mais de 15 dias após e tratamento, ganho de
peso, viragem do DTH, normalização dos níveis de globulinas.
Avaliação estatística: será feita uma avaliação qualitativa em que se comparam as
freqüências de cura no D60 de acompanhamento e uma avaliação quantitativa, quanto aos
tempos de melhora dos parâmetros clínicos e laboratoriais através do teste U de WilcoxonMann-Whitney.
Aspectos Éticos: Para o desenvolvimento dos estudos aqui propostos, será obtido
consentimento por escrito de todos os pacientes com mais de 18 anos de idade e dos
responsáveis pelos pacientes com menos de 18 anos. O projeto deste estudo foi aprovado
pelo Comitê de Ética Pesquisa da UFS. O presente projeto obedecerá aos critérios
preconizados no capítulo III da Resolução 196/96, quais sejam: autonomia, beneficência, não
maleficência, justiça e eqüidade. A pesquisa segue as seguintes exigências: realização
prévia de experimentos em laboratórios, animais ou em outros fatos científicos; prevalência
de benefícios sobre riscos; adequação aos princípios científicos; justificativa do uso de
placebo; consentimento livre e esclarecido do sujeito da pesquisa e/ou seu representante
legal; confidencialidade, privacidade, proteção da imagem e não estigmatização; garantia de
benefícios para a comunidade cujos efeitos continuem a se fazer sentir após sua conclusão;
inexistência de conflito de interesses entre o pesquisador e os sujeitos da pesquisa ou
patrocinador do projeto e descontinuação do estudo somente após análise das razões da
descontinuidade pelo CEP que a aprovou.
Desenho exerimental do estudo do objetivo 2:
Objetivo 2. Avaliar a resposta terapêutica de cães de rua da cidade de Aracaju com
leishmaniose visceral a N-acetilcisteína (NAC) como adjuvante ao tratamento com antimonial
pentavalente, comparado ao tratamento somente com antimonial, em estudo clínico cego e
randomizado.
Trata-se de um estudo de intervenção, tipo ensaio clínico, cego, randomizado,
placebo-controlado. Ressaltamos que o Ministério da Saúde proíbe o tratamento de cães,
pela persistência freqüente de parasitos nestes animais, só permitindo em caso de pesquisa.
Os cães do presente estudo serão tratados e mantidos em cativeiro até o sacrifício. O
placebo se refere ao controle do NAC, mas todos os cães receberão o tratamento com
antimonial.
Área do Estudo: Vinte a Trinta cães com sorologia positiva para calazar são eutanaziados
pelo Controle de Zoonoses da Cidade de Aracaju. Estes cães serão utilizados no estudo. Os
47
animais serão mantidos em canis individuais no Hospital de Medicina Veterinária da
faculdade PioX, a qual é parceira neste estudo. O hospital possui excelente estrutura, com
serviços de diagnósticos laboratoriais, imagem, sala de necropsia, cirurgia e histopatologia.
Seis médicos veterinários darão suporte à pesquisa.
Definição diagnóstica: Leishmaniose visceral (LV) canina é uma doença que se caracteriza
por perda de peso, atrofia muscular, linfoadenopatia generalizada ou localizada, caquexia,
anorexia, diarréia, vômito, melena, epistaxe, rinite, onigrifose, hepatoesplenomegalia,
anemia, leucopenia e hiperglobulinemia. O diagnóstico laboratorial é realizado com sorologia
positiva para L. chagasi por ELISA e/ou imunofluorescência, teste de Montenegro negativo e
cultura positiva para o parasito obtida de biópsia aspirativa de medula óssea e/ou linfonodo.
Seleção dos animais: Será realizado um ensaio clínico randomizado, cego, placebo
controlado, no qual os cães selecionados para participar serão divididos em 2 grupos: Grupo
I (NAC 400mg, 3x ao dia IM, 20 dias + antimônio – 100mg/kg/dia por 20 dias, IM) e Grupo II
(diluente + antimônio – 20 dias). Quinze cães virgens de tratamento com diagnóstico de LV
serão incluídos em cada grupo segundo os seguintes critérios de inclusão: idade entre 2 a 4
anos, com diagnóstico de leishmaniose visceral. Os critérios de exclusão do estudo serão:
outras doenças associadas agudas ou crônicas e que nunca tenha sido tratado para calazar
canino. Os cães serão alocados nos grupos a partir de uma tabela de randomização. Após
preencherem os critérios de inclusão no estudo, os números serão atribuídos aos cães. Dois
médicos veterinários serão responsáveis pela avaliação da evolução clínica dos cães. Outros
2 médicos serão responsáveis pela coleta de dados laboratoriais e avaliação de efeitos
colaterais. Estes não terão conhecimento da randomização previamente realizada. A Nacetil cisteína será utilizada na dose de 400mg, IM, 3 vezes ao dia. NAC é disponibilizado
comercialmente no Brasil. O tratamento com antimônio será fornecido por um farmacêutico e
realizado por um técnico com treinamento para o procedimento em cães.
Todos os cães realizarão avaliação bioquímica, dosagem de eletrólitos, hemograma,
avaliação de enzimas hepáticas e função renal, ultrassonografia abdominal antes do
tratamento, com quinze e 30, 60, 90, 120 e 180 dias.
Tratamento proposto: Todos os cães receberão antimonial pentavalente na dose de
100mg/Kg/dia, 20 dias. A apresentação comercial do NAC (Fluimucil® 2 ampolas de 200mg)
serão aplicadas por via IM, 3 vezes ao dia, por um período de 20 dias. Ressaltamos que o
placebo se refere ao controle do NAC, mas todos os cães receberão o tratamento antimonial
100mg/Kg/dia por 20 dias, IM (Mireta, J , et al, 2008). Como antimonial pentavalente não é
efetivo, será possível avaliar se a combinação com NAC é mais eficiente.
Tamanho da amostra: Os parâmetros para cálculo do número de cães por grupo foram a
melhora clínica e laboratorial no dia 90 após o tratamento e cultura da medula óssea
negativa para leishmania. Estima-se que o grupo tratado com NAC e antimonial pentavalente
reduza em 60% o tempo necessário para melhora dos parâmetros. Desta forma, serão
necessários 15 cães em cada grupo, com poder de 90% (beta = 10%) e alfa de 5% (p =
0,05),
48
Seguimento dos cães: Todos os cães arrolados no estudo terão acompanhamento clínico e
laboboratorial por um período de 6 meses com avaliação regular de 30 em 30 dias até
completar 180 dias.
Critério de cura: A cura é definida no cão com redução do baço e fígado a tamanhos
normais, ganho de peso, DTH +, cultura para leishmania negativa. Iremos também realizar
RT-PCR para a identificação do parasita no sangue, aumentando a sensibilidade de
detecção da leishmania com esta técnica, que será importante para definição de cura
parasitológica (Manna L et al, 2006). Porém, a evolução clínica é mandatória nestes casos.
Após 6 meses os cães serão sacrificados para realização de necrópsia e verificar a presença
de parasitos nos tecidos.
Avaliação estatística: será feita uma avaliação qualitativa em que se compararam as
freqüências de cura no D60 de acompanhamento e uma avaliação quantitativa, quanto aos
tempos de cura através do teste U de Wilcoxon-Mann-Whitney.
Equipe
Pesquisadores do iii
Responsável:
Amélia Ribeiro de Jesus – UFS - Sergipe
Roque de Almeida Pacheco – UFS - Sergipe
49
E. Transplante e imunorregulação
O principal fator limitante à longa sobrevida dos enxertos ainda é a rejeição e os
efeitos
colaterais
de
imunossupressores
utilizados
permanecem
como
problemas
importantes. Assim, a busca de novos protocolos terapêuticos mais eficazes e com menores
efeitos colaterais continua sendo uma necessidade e a idéia de tolerância imunológica na
clínica se constitui ainda em um grande desafio.
Os
projetos
propostos
na
linha
de
pesquisa
temática
-
Transplante
e
imunorregulação – envolvem o estudo de mecanismos imunorreguladores, tanto em modelos
animais como humanos, a avaliação de parâmetros de tolerância operacional em humanos e
a produção de imunobiológicos imunomoduladores.
As nossas estratégias envolvem combinar investigações no sistema humano, in vitro,
com células de indivíduos saudáveis e de indivíduos transplantados, com estudos em
modelos experimentais, nos quais é possível testar, in vivo, protocolos para a indução de
tolerância
ao
aloenxerto.
Investimos
também
no
desenvolvimento
de
produtos
imunobiológicos com atividade imunorreguladora. Avaliamos como resultados esperados
desta Linha de Pesquisa Temática, contribuir para: (i) a melhor compreensão de
mecanismos de imunorregulação no transplante, (ii) a definição de parâmetros diagnósticos
do estado de tolerância operacional, (iii) a definição de alvos terapêuticos para indução de
tolerância ao aloenxerto em pacientes, (iv) identificação e produção de imunobiológicos para
imunorregulação e outros adjuvantes, (v) formação de 5 alunos de mestrado e 2 de
doutorado, (vi) publicação de artigos científicos. Em função dos resultados dos estudos préclínicos, estão previstos 1 ensaio pré-clínico (peptídeo de Hsp60), 1 ensaio clínico (anti-CD3)
e 2 patentes (peptídeo de Hsp60 e anti-CD3 humanizado).
Os projetos desta Linha de Pesquisa temática serão desenvolvidos em rede, com a
participação de pesquisadores de diferentes grupos do iii, de diferentes áreas temáticas, da
área básica de imunologia, assim como médicos, pesquisadores clínicos, pós-doutorandos e
alunos de pós-graduação. Utilizaremos os diferentes conhecimentos do grupo para uma
maior compreensão dos resultados gerados, objetivando a sua tradução para uma aplicação
clínica.
Subprojeto 1: Proteína de Choque Térmico 60 e células dendríticas: bases moleculares para
imunorregulação
As
proteínas
de
choque
térmico
(Hsp)
são
proteínas
bem
conservadas
filogeneticamente, expressas constitutivamente em todas as formas vivas e importantes na
manutenção da homeostase (Pockley et al., 2008). Além de sua função de chaperona, uma
característica dessas proteínas é a sua capacidade de interagir com componentes tanto da
resposta imune inata quanto da adaptativa, induzindo respostas pró-inflamatórias efetoras e
também imunorreguladoras. As propriedades imunológicas polares das Hsp têm sido objeto
de intensos debates na comunidade científica, tendo sido tema de um Workshop, no último
13th International Congress of Immunology, gerando uma publicação sobre o tema (Coelho
et al., 2008). Essa dupla capacidade funcional - inflamatória e reguladora - indutora de
50
respostas imune inata e adaptativa – é também característica das células dendríticas (DCs)
que funcionam como uma ponte entre esses dois tipos de respostas imunes. Por essas
características, as DCs e as Hsps têm sido exploradas no seu potencial de modificar a
resposta imune, com vistas a novas terapias, seja estimulando uma resposta imune efetora,
como no câncer e em processos infecciosos (revisado Binder et al., 2008; Luptrawan et al.,
2008), seja induzindo imunorregulação (revisado por van Eden, 2006), como em doenças
auto-imunes, inclusive em humanos (Raz et al, 2001, Huurman et al, 2007), e no transplante.
Em nosso grupo, investigamos a resposta imune à Hsp60 no contexto do transplante
(Granja et al, 2004); (Caldas et al, 2004) e em condições fisiológicas em humanos, e em
modelos experimentais murinos (Luna et al, 2007). Visamos identificar regiões da Hsp60 e
condições em que a Hsp60 (ou peptídeo) é capaz de induzir imunorregulação, para futura
utilização na clínica. Recentemente, temos também explorado o potencial imunorregulador
de atuação sinérgica da Hsp60 e seus peptídeos com as DCs que também podem ser
tolerogênicas (revisado por Morelli et al., 2007). Estamos adotando, agora, a estratégia de
direcionar, in vivo, as DCs, utilizando o anticorpo anti-DEC205, acoplado a peptídeos da
Hsp60. O DEC-205 é um receptor endocítico presente na superfície de DCs CD8α+. É um
receptor de captura de antígenos, permitindo a apresentação em moléculas MHC classe I e
II, induzindo tanto resposta imune efetora como imunorreguladora. O anticorpo anti-DEC205
tem sido utilizado pelos grupos dos Professores Michel Nussenzweig e Ralph Steinman para
direcionar diferentes antígenos às DCs, in vivo, geralmente, para induzir uma resposta imune
efetora pró-inflamatória. Quando este anticorpo é injetado junto com um anticorpo agonista
de CD40, ocorre indução de uma potente resposta imune inflamatória, com efeitos biológicos
vacinais, em modelos animais (Trumpfheller et al., 2006). Por outro lado, para uma resposta
imune reguladora, o anti-DEC205 é usado sem o agonista de CD40, como descrito em
modelos animais (Bonifaz et al., 2002; Hawiger et al., 2004).
Em nosso grupo, utilizando um peptídeo C-terminal da Hsp60, conseguimos um
aumento da sobrevida do enxerto de pele em camundongos, porém, ainda não conseguimos
induzir tolerância (Luna et al, 2007). No sistema humano, identificamos peptídeos
potencialmente imunorreguladores, com indução de alta freqüência de células produtoras de
IL-10 e FOXP3, tanto no transplante como em indivíduos saudáveis (Caldas et al. 2008,
manuscrito em preparação). Na interação com as células dendríticas, a Hsp60 foi capaz de
induzir modificações marcantes na expressão de diversos genes relacionados com
atividades pró-inflamatória e reguladora, em linfócitos T, e identificamos um peptídeo indutor
de um perfil dominantemente imunorregulador (Socorro-Silva et al. 2008, manuscrito em
preparação).
No presente projeto, a nossa proposta é a analisar, de uma forma mais global, um
conjunto de fatores moleculares que podem contribuir para o direcionamento de uma
resposta imunorreguladora, utilizando um painel de peptídeos da Hsp60 e seus fragmentos.
Analisaremos a indução da expressão de moléculas (gênica e protéica) relacionas à
imunorregulação e outras pró-inflamatórias, assim como a indução de células T reguladoras
51
de diferentes fenótipos (Roncarolo et al, 2006), visando identificar peptídeos/fragmentos
capazes de induzir um padrão dominantemente imunorregulador, nos sistemas humano e
murino. Fragmentos e peptídeos da Hsp60 selecionados serão utilizados para a indução de
tolerância nos modelos murinos de alotransplante de pele e de ilhotas pancreáticas.
Ademais, utilizaremos peptídeos da Hsp60 selecionados acoplados ao anticorpo antiDEC205 recombinante que será usado para o direcionamento, in vivo, das células
dendríticas e indução de tolerância ao aloenxerto. Por outro lado, os peptídeos com um perfil
predominantemente pró-inflamatório serão testados como adjuvantes em modelos de
vacinas em projetos do nosso Instituto, como em HIV e na vacina contra o estreptococos.
Objetivos
Objetivo geral
O nosso principal objetivo, neste projeto, é identificar componentes moleculares
potencialmente envolvidos na atividade supressora induzida pela Hsp60 e seus peptídeos,
nos sistemas humano e murino. Selecionaremos peptídeos e fragmentos da Hsp60
candidatos para a indução de tolerância no transplante alogenéico murino, com ou sem
direcionamento, in vivo, das células dendríticas, visando uma futura aplicação no contexto
clínico.
Objetivos específicos
Produção de imunobiológicos
1. Produzir o anticorpo anti-DEC205 recombinante acoplado a peptídeos da Hsp60, visando
o direcionamento células dendríticas, in vivo, em camundongos, em protocolos para indução
de tolerância no contexto do transplante.
Sistemas Humano e Murino
1. Identificar peptídeos/fragmentos da Hsp60 capazes de induzir um perfil de expressão
gênica predominantemente imunorregulador, em células mononucleares do sangue periférico
(humanas) ou células esplênicas (murinas). Esta identificação será feita por meio da análise
de um painel de genes mais relacionados a uma atividade imunorreguladora (IL-10, IL-4,
TGFβ, R-TGFβ, FOXP3, GATA3 e IDO, PD1) e outros mais pró-inflamatórios (IFNγ, TNFα,
IL-6, IL-12, IL-17, IL-23 t-bet) – painel REGULA x INFLAMA.
2. Determinar a produção de citocinas induzida por peptídeos selecionados o painel
REGULA x INFLAMA, no sobrenadante de cultura em células mononucleares do sangue
periférico (humanas) ou células esplênicas (murinas) com peptídeos/fragmentos da Hsp60.
3. Determinar se a expressão protéica com perfil imunorregulador induzida pelos peptídeos/
fragmentos da Hsp60 ocorre diretamente em populações de linfócitos T para os peptídeos
selecionados no painel REGULA x INFLAMA.
4. Verificar a capacidade supressora, in vitro, de linfócitos cultivados com peptídeos/
fragmentos
da
Hsp60
selecionados,
indutores
de
um
perfil
predominantemente
imunorregulador.
5. Analisar se os peptídeos selecionados são ligantes de moléculas de superfície celular,
como receptores do tipo Toll, moléculas MHC e receptores do tipo scavenger.
52
Sistema Murino
1. Testar a capacidade imunorreguladora, in vivo, de peptídeos da Hsp60 selecionados, para
a indução de tolerância, no modelo de alotransplante de pele murino e de ilhotas
pancreáticas, seja pelo uso direto do peptídeo selecionado, seja pelo direcionamento, in vivo,
às DCs com o anticorpo αDEC205 conjugado a um peptídeo da Hsp60.
Equipe
Pesquisadores do iii:
Responsável:
Verônica Coelho - InCor – FMUSP
David Saitovitch – PUC Porto Alegre – Rio Grande do Sul
Ana Caetano de Faria – UFMG
Luiza Guilherme – InCor – FMUSP
Edecio Cunha-Neto – InCor – FMUSP
Gustavo Amarantes- ICB USP
Ana Maria Moro – Instituto Butantan
Maria Regina Cardoso – Faculdade de Saúde Pública da USP
Francisco Inácio Bastos – FIOCRUZ – Rio de Janeiro
Guilherme Werneck – FIOCRUZ – Rio de Janeiro
Jorge Kalil – FMUSP
Colaboradores Nacionais:
Luiz Alberto Benvenuti – InCor – FMUSP
Beatriz Stolf – ICB II
Colaboradores Internacionais:
Michel Nussenzweig – Rockefeller University, EUA
Alunos:
Laboratório de Imunologia InCor – FMUSP:
Anna Paula Sheppard Guembes (mestrado)
Fernanda Gonçalves Martello (mestrado)
Pedro Mendes Vieira (mestrado)
Maisa Takenaka (mestrado)
PUC - Porto Alegre RS:
Patrícia Sesterheim (doutorado)
Técnicos:
Sandra Maria Monteiro
Luiz Roberto Mundel.
Pós-doutorandas: InCor – FMUSP: Georgia Porto; Ana Cláudia Pelizon.
53
Subprojeto 2: Avaliação do potencial modulador de células CD4+CD25+ geradas, in vitro, em
respostas, in vivo, a células alogênicas.
As células dendríticas têm como função principal internalizar, processar e
apresentar antígenos para linfócitos T. As DCs podem ser classificadas quanto ao seu
estado de maturação, como maduras (mDC) e imaturas (iDC). Este estado de maturação
pode ser evidenciado pela expressão de moléculas do MHC e de moléculas coestimuladoras, sendo que o estado maduro das DCs é caracterizado pela alta expressão das
moléculas ditas acima (Steinman e Witmer, 1978, Steinman e Nussenzweig, 1980, Steinman
e Inaba, 1985). Existem trabalhos na literatura nos quais é mostrado que a interação entre
DCs e células T naïve, é capaz de induzir a geração de células T reguladoras com fenótipo
CD4+CD25+Foxp3+ (Yamazaki et al, 2003, Hara et al, 2001, Giorgini e Noble, 2007). Alguns
trabalhos mostram que essa capacidade supressora das Tregs é dependente da produção
de IL-10 e TGF-β, por outro lado, em outros se observam mecanismos de supressão
independentes de IL-10 (Chen et al, 1994, Nakamura et al, 2001). Estudos sugerem que
células da medula óssea possuem propriedades moduladoras quando administradas com
células do baço em camundongos alogênicos. É relatado que a administração de
esplenócitos juntamente com células da medula óssea de camundongos C57BL/6 em
BALB/c,
diminuiu
a
porcentagem
de
células
de
memória
com
fenótipo
CD4CD45RBlowCD44high e CD8CD45RBlowCD44high no baço de BALB/c, indicando o
poder regulador das células da medula óssea. Apesar de regular negativamente o número
das células de memória, a administração dessas células não foi capaz de induzir tolerância a
aloenxertos de pele nem de transplantes cardíacos (de Moraes et al, 2008).
Objetivo Geral
Avaliar a capacidade moduladora das células T CD4+CD25+, geradas a partir de cocultura de células dendríticas com células de linfonodo autólogas, na presença de células
low
alogênicas (camundongo C57BL/6) em apoptose, sobre as células CD4CD45RB CD44
low
CD8CD45RB CD44
high
high
e
após a inoculação de esplenócitos de camundongos C57BL/6.
Objetivos Específicos
1. Caracterizar, imunofenotipicamente, as células dendríticas geradas a partir de células de
medula óssea de camundongos BALB/c.
+
+
2. Gerar células T reguladoras CD4 CD25 em co-cultura com células dendríticas (DCs) e
células autólogas de linfonodo (BALB/c) na presença de células alogênicas (C57BL/6) em
apoptose (Cel. Alo Apo).
3. Analisar o imunofenótipo das células T geradas, in vitro, nas co-culturas, com e sem
contato célula-célula, inclusive a expressão de Foxp3.
4. Analisar a produção de citocinas nas co-culturas de linfócitos com células dendríticas, no
caso da cultura sem contato célula-célula.
54
+
+
5. Determinar a capacidade imunomoduladora das células CD4 CD25 (geradas em coculturas com DCs auto + Cel. Alo Apo), in vivo, sobre a população de células de memória,
+
+
em camundongos que receberam transferência passiva de células CD4 CD25 autólogas em
combinação com esplenócitos alogênicos de camundongos C57BL/6.
Equipe:
Pesquisadores do iii: Responsável: Luiz Vicente Rizzo ICB - USP; Verônica Coelho – InCor
FMUSP. Aluna: Thaís Boccia da Costa (mestrado); Técnica: Cristina Kubo (Bióloga, técnica
de nivel superior - USP).
Subprojeto 3: Tolerância operacional no transplante humano.
Apesar do sucesso de diversos protocolos para indução de tolerância ao aloenxerto
em modelos experimentais animais, a sua tradução para a clínica permanece um desafio. As
discrepâncias entre os resultados experimentais em roedores e aqueles observados em
animais de maior porte e nos ensaios clínicos podem ser decorrentes de múltiplos fatores
como: (i) diferenças biológicas entre as espécies, (ii) maior heterogeneidade e diversidade
das respostas imunes em humanos e animais maiores, (iii) efeito da imunidade heteróloga
induzida por constantes exposições a microorganismos, que pode influenciar a resposta ao
enxerto, como por exemplo, desencadeando rejeição.
Não obstante, há na clínica um grupo de pacientes que possuem uma função estável
do enxerto após a retirada de imunossupressores. Esses pacientes são chamados de
tolerantes operacionais. O estado de tolerância operacional é uma certificação de que a
tolerância ao aloenxerto é possível na clínica. Apesar dos dados publicados sobre tolerância
operacional abordem apenas um ou outro parâmetro da resposta imune, recentemente, há
análises imunológicas mais globais, no transplante renal, que trazem importantes
informações (Brouard et al., 2007; Braud et al., 2008). Porém, este tipo de estudo mais global
precisa ser ampliado envolvendo outros parâmetros imunológicos, outros tipos de
transplante, e em outros centros no mundo. Há, na comunidade científica, uma grande
expectativa sobre a possibilidade de se identificar, nesses pacientes, determinadas
características imunológicas que permitam definir um perfil imunológico do estado de
tolerância operacional. O conhecimento dessas características pode ser de grande
importância para a compreensão de mecanismos envolvidos nesse estado de tolerância,
para o seu diagnóstico, permitindo a identificação de pacientes que podem se beneficiar com
a diminuição ou retirada de drogas imunossupressoras, assim como para o desenvolvimento
de novas terapias.
A nossa proposta neste projeto é analisar de forma mais global, indivíduos
transplantados em estado de tolerância operacional, assim como aqueles recebendo baixa
imunossupressão, comparativamente com pacientes com rejeição crônica e com aqueles
com estabilidade do enxerto e doses convencionais de imunossupressores. Pretendemos
55
estudar a dinâmica/cinética das respostas imunes, analisando os seguintes parâmetros: (i)
perfil imune molecular e celular, (ii) perfil imune humoral/sérico e (iii) perfil proteômico da
urina.
Este projeto faz parte de um estudo multicêntrico, aprovado pela comissão de ética
do HC FMUSP (no.1097/05) para ser realizado nos transplantes renal, hepático e cardíaco.
Realizaremos, nos primeiros anos, o estudo no transplante renal. Iniciaremos, também, o
recrutamento dos sujeitos de pesquisa de transplantes hepático e cardíaco para coleta
material biológico, e fazemos os estudos direcionados com base nos resultados obtidos no
transplante renal. Também esperamos, com este projeto, criar um grupo multidisciplinar para
o estudo e discussão sobre imunorregulação no transplante humano.
Objetivo geral
Determinar um perfil imunológico global diferencial do estado de tolerância operacional,
visando contribuir para a compreensão de mecanismos envolvidos neste estado de
tolerância e para a identificação de parâmetros para o seu diagnóstico.
Objetivos específicos
Analisar comparativamente em indivíduos em diferentes estados clínicos do transplante renal
(Tolerância
operacional,
baixa
imunossupressão,
rejeição
crônica,
estáveis
com
imunossupressão usual):
Perfil imuno celular
1. Analisar a resposta celular dirigida a três tipos de antígenos: alogênicos (peptídeos HLADR), autólogos (proteína de choque térmico 60 – Hsp60) e viral (peptídeos do vírus
Epstein Bar), mediante a análise da expressão gênica e protéica de um painel de fatores
de transcrição e citocinas.
2. Analisar, ex-vivo, a expressão de mRNA para citocinas e fatores de transcrição (IL-10,
TNF-α, FoxP3, Tbet, GATA-3, IFNγ, TGFȕ, TGFȕR) em células do sangue periférico
(análise seqüencial).
3. Analisar, ex-vivo, as vias de sinalização envolvidas nos processos de imunorregulação,
como vias indutoras de Foxp3, T-bet e GATA-3 em células do sangue periférico.
4. Determinar o perfil imunofenotípico de diferentes populações celulares, em sangue
periférico, analisando moléculas relacionadas à atividade imunorreguladora, à memória,
à imunidade inata (análise seqüencial).
Perfil humoral/sérico
5. Analisar o repertório global de aloanticorpos e aquele dirigido a aloantígenos do doador,
no soro (seqüencial).
56
6. Determinar o perfil global de reatividade de auto-anticorpos dirigidos a um painel de autoantígenos, no soro.
7. Determinar o perfil do repertório de CDR3 presente nos receptores de células B no
sangue (seqüencial).
8. Analisar o perfil de peptídeos ligantes de anticorpos presentes no soro, visando
identificar potenciais epitopos de anticorpos reguladores.
9. Selecionar peptídeos miméticos de antígenos humanos reconhecidos diferencialmente
pelo repertório das imunoglobulinas IgM e IgG, no soro.
10. Analisar o padrão de peptídeos reconhecidos pelas imunoglobulinas IgM e IgG.
11. Analisar o repertório de micropartículas do soro e a expressão de Q-SOX, uma enzima
com atividade potencialmente imunorreguladora.
Perfil proteômico
12. Analisar o perfil de expressão protéica na urina.
Delineamento experimental: Os sujeitos de pesquisa selecionados serão informados de
todos os aspectos técnicos e éticos de nossa pesquisa e deverão assinar Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido para cada protocolo, antes da inclusão em cada
respectivo projeto.
1. Seleção de sujeitos de pesquisa
Em cada tipo de transplante, serão selecionados 20 indivíduos adultos para cada grupo
(A, B, C, D e E), com os critérios descritos abaixo. O número de indivíduos transplantados
sem uso de drogas imunossupressoras vai depender da disponibilidade de indivíduos com
este perfil.
Grupo A – estáveis com longo tempo de transplante (> 1 ano de transplante), sem uso de
drogas imunossupressoras há pelo menos 6 meses, ou com baixas doses de
imunossupressores, seja monoterapia ou terapia com 2 drogas. Grupo B – longo tempo de
transplante (> 1 ano de transplante) com rejeição crônica (diagnóstico por biópsia). Grupo C
– estáveis com longo tempo de transplante (> 1 ano de transplante) com doses habituais de
imunossupressores. Grupo D - insuficiência renal crônica e não transplantados (grupo renal).
Grupo E – sadios doadores de transplante. Critérios de baixa imunossupressão: Tx renal:
Azatioprina: < 1mg/kg, prednisona < 0,10 mg/Kg/dia; Ciclosporina < 1,5mg/kg/dia (ou nível
sérico no tempo zero < 50ng/ml), rapamicina < 1mg/dia (ou nível sérico < 5 ng/ml),
micofenolato mofetil < 15mg/kg/dia, micofenolato sódico 10 mg/kg/dia, tacrolimus <
0,05mg/kg/dia (ou nível sérico < 5 ng/ml). Tx cardíaco: Azatioprina: < 1 mg/Kg, prednisona: <
0,1 mg/Kg, Ciclosporina: <1,5 mg/Kg, rapamicina: < 2mg/dia, micofenolato: <15mg/dia,
tacrolimus: <0,05mg/dia. mg/dia. Tx hepático: Níveis séricos de ciclosporina(C0): ≤ a 50 ng/ml
ou de tacrolimus ≤ a 5 ng/ml. Função estável: Tx renal: limite de clearance de creatinina
>45ml/min, não apresentando variação negativa de clearance > 10% nos últimos 6 meses.
Tx cardíaco: Classe Funcional I ou II. Ecocardiograma com boa função ventricular esquerda
57
(FE > 50%). Tx hepático: enzimas hepatocelulares e canaliculares dentro dos valores da
normalidade. Exclusão: Tx hepático: serão excluídos pacientes que tiveram Hapatite C como
doença de base.
2. Coleta de material biológico
(i) Coleta de sangue periférico a cada 4 meses (3 coletas) para os estudos seqüenciais e
pontuais. (ii) Coleta de sangue simultânea para realização de hemograma (seqüencial) para
cálculo de números absolutos de populações celulares e creatinina sérica (transplante renal.
(iii) Coleta de sangue periférico em caso de quadro infeccioso e/ou rejeição.
Equipe
Pesquisadores do iii:
Responsável:
Verônica Coelho (InCor –FMUSP);
Marcelo Brígido – (UnB) - Responsável investigação repertório peptídeos
reconhecidos por Imunoglobulinas Phage Display
Andréa Queiroz Maranhão – UnB
David Saitovitch - PUC - Porto Alegre RS
Jorge Kalil - InCor – FMUSP
Edecio Cunha Neto - InCor – FMUSP
Maria Regina Alves Cardoso – FSP – USP
Francisco Inacio Bastos – FIOCRUZ – Rio de Janeiro
Guilherme Werneck – FIOCRUZ – Rio de Janeiro
Sandro J. de Souza – Instituto Ludwig – São Paulo
Colaboradores nacionais:
Francine Lemos – InCor HC – FMUSP
Hélcio Rodrigues - InCor – FMUSP
Nicolas Panajotopoulos - InCor HC – FMUSP
Maria Lúcia Marin InCor – FMUSP
Jorge Neumann - Santa Casa da Misericórdia - Porto Alegre – RS
Irene Noronha - Hospital da Beneficiência Portuguesa - São Paulo
Margarida Dutra - Hospital Português – Bahia e Faculdade de Medicina Dep. de Medicina - UFBA
Lauro Vasconcelos – Unidade de Transplante Renal Hospital das Clínicas UFES Vitória – Espírito Santo
Simone Corrêa da Silva – ICB USP
Fernando Bacal - InCor - HC FMUSP
André Cosme de Oliveira - Hospital da Clínicas, FMUSP
Paulo Bittencourt - Hospital Português - Unidade de Gastrohepatologia
Gilda Porta - HC FMUSP e Hospital AC Camargo
58
Simone Fonseca – InCor FMUSP e Université de Montreal
Colaboradores internacionais:
Eli Sercarz – Division of Immune Regulation - Torrey Pines Institute for
Molecular Studies (TPIMS) - La Jolla - EUA.
Idania Marrero - Division of Immune Regulation - Torrey Pines Institute for
Molecular Studies (TPIMS) - La Jolla – EUA
Irun Cohen - The Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel
Kathryn Wood – University of Oxford, UK
Sophie Brouard – INSERM e Institute de Transplantation et de Recherche en
Transplantation, Nantes, France
Michal Or-Guil - Humboldt University zu Berlin, Institute for Theoretical
Biology, Systems Immunology
Kellen Faé – Max Planck Institute – Berlim (Análises repertório de linfócitos
B/CDR3).
Técnica:
Sandra Maria Monteiro - InCor - FMUSP
Alunos:
Pedro Manoel Mendes de Moraes Vieira (mestrado USP)
Hernandez Moura Silva (doutorado USP)
Maisa Takenaka (mestrado USP)
Rafael Burtet (doutorado UnB)
Patrícia Sesterheim (doutorado - PUC - Porto Alegre RS).
Pós-doutor:
Florencia Barbé PUC - Porto Alegre - RS
Subprojeto 4: Desenvolvimento de um anticorpo humanizado anti-CD3 para aplicação na
clínica médica e avaliação da sua atividade imunorreguladora.
Os anticorpos recombinantes se destacam entre os fármacos de nova geração para
uso terapêutico. O mercado de biofármacos derivados de anticorpos com atividade biológica
específica cresce a cada ano, estimando-se que chegue a US$30 bi em 2010 (Maggon,
2007). O anticorpo monoclonal anti-CD3 OKT3 foi o primeiro anticorpo a ser utilizado
clinicamente para prevenir a rejeição de órgãos transplantados. Essas moléculas possuem
ação efetiva sobre as de células T, depletando-as, ou inibindo a sua função efetora. Esse
efeito imunológico aponta um potencial de utilização mais amplo; além do transplante, em
doenças auto-imunes. No entanto, a utilização continuada de anticorpos monoclonais, como
o OKT3, é limitada por sua toxicidade, em parte provocada por sua natureza heteróloga.
Nesse sentido, procura-se modificar anticorpos anti-CD3 por meio de sua humanização ou
modulação de sua capacidade efetora. Atualmente, existem 5 anticorpos anti-CD3 em testes
clínicos: 2 murinos; 1 quimérico (humano e murino); 1 humanizado (manipulação genética a
59
partir de um anticorpo murino) e 1 humano Além de já qualificados para a terapia póstransplante e para Diabetes do tipo I, esses anticorpos estão sendo testados para outras
doenças, como a Doença de Crohn, a Colite ulcerativa, linfomas e câncer de mama
(www.clinicaltrials.gov).
Em uma experiência pioneira no Brasil, o Instituto Butantan produziu um anticorpo
anti-CD3 a partir de hibridoma, em condições GMP (do inglês, Good Manufacture Practices,
Boas Práticas de Manifatura), para uso clínico, e esse produto foi testado clinicamente no HC
FMUSP (Lemos et al., 2006). Tendo em vista o potencial clínico do anticorpo anti-CD3
murino, e por outro lado, a sua limitação de uso devido à sua alta imunogenicidade, o grupo
da UnB iniciou, em parceria com o Instituto Butantan e InCor, o processo de humanização
desse anticorpo. Inicialmente, foram desenhadas duas construções totalmente humanizadas
produzidas em Pichia pastoris na forma de scFv (Fragmento variável de cadeia única)
(Costa, 2004).
Uma segunda geração desses anticorpos foi produzida na forma de FvFc (fragmento
de anticorpo na forma de scFv conectado ao Fc de IgG1 humana), em clones de células
animais (CHO). Esse anticorpo recombinante foi capaz de se ligar especificamente a
linfócitos T humanos, competindo com os anticorpos comerciais OKT3 e UCHT, mas com
uma menor afinidade. Além disso, em ensaios, in vitro, de cultura de linfócitos humanos na
presença do anti-CD3 humanizado, ou do anticorpo monoclonal OKT3 murino, observamos
que o anticorpo humanizado foi menos mitogênico do que o OKT3 e induziu maior produção
de IL-10 e menor produção de IFNγ e IL-5. Com base nesses resultados, ainda que
preliminares, sugerimos que o nosso anticorpo anti-CD3 humanizado possa induzir atividade
imunorreguladora.
Na presente etapa do projeto abordaremos 3 características do h-anti-CD3: (i) sua
capacidade imunorreguladora, in vitro, (ii) o papel da sua afinidade de ligação à molécula
CD3, e da porção efetora (Fc), na atividade potencialmente imunorreguladora. O objetivo é
verificar como anticorpos com especificidades similares podem redundar em efeitos opostos
na ativação linfocitária. Para avaliar a afinidade e sua importância no efeito biológico,
utilizaremos a ressonância plasmônica de superfície usando, in vitro, um fragmento
recombinante correspondente ao dímero das cadeias acessórias ao TCR γε imobilizado
(Kjer-Nielsen et al., 2004). Além disso, serão gerados mutantes de anticorpo anti-CD3
baseados no modelo molecular do anti-CD3. As recentes publicação da estrutura tridimensional do complexo OKT3/CD3 (Kim et al., 2000) e da estrutura cristalina do UCHT,
outro anti-CD3 que reconhece um epitopo sobreponível com o OKT3 (Arnett et al., 2004),
servirão de base para a sugestão de alterações na estrutura do domínio humanizado que
possam contribuir com a ligação. Serão realizadas análises estruturais mais refinadas por
modelagem molecular associados a estudos de mutagênese sítio-dirigida de aminoácidos
que são importantes para que ocorra a interação antígeno-anticorpo, permitindo a
identificação de regiões específicas de ligação, e a interação entre as cadeias VH e VL. Para
a verificação do papel do Fc na resposta biológica do h-anti-CD3, serão comparadas as
60
versões humanizadas com a versão quimera, contendo as cadeias variáveis murinas do
OKT3. Além disso, serão gerados mutantes do Fc que sabidamente alteram a capacidade
efetora da IgG1 humana. Todas essas construções serão testadas quanto à afinidade ao
antígeno, e quanto à capacidade de ativar linfócitos in vitro.
Este projeto dá continuidade a estudos anteriores a fim de se obter anticorpos
totalmente humanizados, modificados para apresentar um melhor efeito modulador da
resposta de linfócitos T. Esses estudos poderão contribuir para a compreensão do efeito
biológico da interação entre o anti-CD3 humanizado e a molécula CD3, contribuindo para
protocolos clínicos mais simples e baratos baseados em reagentes de última geração. Em
função dos resultados obtidos nos estudos pré-clínicos, estimamos iniciar ensaios clínicos de
fase I com o nosso anticorpo anti-CD3 humanizado, dentro de 3-4 anos.
Objetivo Geral
Nosso o objetivo nesse projeto é preparar um anticorpo humanizado anti-CD3 para utilização
na clínica médica como imunomodulador. Nesse sentido, propomos estudos para avaliar a
sua capacidade imunorreguladora e o papel da afinidade do anticorpo nesta atividade e
também a redução da capacidade efetora por meio de modificações no Fc.
Objetivos específicos
1. Construir anticorpos quimeras com mutagênese sítio-dirigida de resíduos selecionados e
anticorpos humanizados com e sem mutação dirigida do Fc.
2. Analisar a afinidade dos anticorpos gerados, pela molécula CD3, in vitro.
3. Analisar o efeito dos anticorpos na indução de proliferação, produção de citocinas e na
expressão de fatores de transcrição imunorreguladores,
em células mononucleares do
sangue periférico.
4. Analisar o efeito dos anticorpos na geração de células T com atividade supressora, in vitro.
5. Produzir os anticorpos em condições GMP, para uso clínico.
6. Realizar testes pré-clínicos.
7. Realizar ensaios clínicos de fase I.
Equipe
Pesquisadores do iii:
Responsáveis: Marcelo de Macedo Brígido e Andréa Queiroz Maranhão – UnB
Verônica Coelho – InCor FMUSP
Ana Maria Moro – Instituto Butantan
David Saitovitch – PUC, Porto Alegre, Rio Grande do Sul
Jorge Kalil – InCor FMUSP
Alunos:
Maryani Andressa Bezerra (Mestrado UnB)
61
Janaina do Nascimento Lima Matias de Paula (doutorado UnB)
Yuri Santos Oliveira (Mestrado UnB)
Hernandez Moura Silva (doutorado USP)
Pedro Manoel Mendes Vieira (mestrado USP).
62
F. Câncer
O câncer é a doença que mais mata pessoas com idade abaixo de 85 anos, sendo o
principal problema de saúde pública dos países desenvolvidos (Jemal et al., 2007). Apesar
do número de casos estar aumentando em todo o mundo, as taxas de mortalidade estão em
declínio principalmente nos países desenvolvidos onde a doença é detectada precocemente
e tratada adequadamente. Em contrapartida, tanto a incidência como a mortalidade estão
aumentando nos países em desenvolvimento. Oitenta por cento das mortes por câncer
ocorrem nestes países. É esperado que a diferença entre países desenvolvidos e em
desenvolvimento aumente substancialmente e economistas da saúde prevêem que o câncer
poder tornar-se um impedimento ao desenvolvimento socio-econômico em nações
economicamente emergentes. No Brasil, as estimativas para o ano de 2008 e válidas
também para o ano de 2009, apontam que ocorrerão 466.730 casos novos de câncer.
O tratamento da doença, quando possível, consiste na remoção cirúrgica do tumor
primário seguida de radio e/ou quimioterapia adjuvante para o combate à doença residual e
metastática. No entanto tais terapias adjuvantes são altamente inespecíficas e tóxicas para
as células normais, resultando em efeitos colaterais nem sempre tolerados pelos pacientes
(Cooper, 2000).
Neste contexto, a imunoterapia contra o câncer é considerada uma promessa de
tratamento eficaz e específico e tem sido amplamente explorada pela indústria farmacêutica.
As abordagens imunoterapêuticas para o combate do câncer incluem, até o momento, a
transferência passiva de anticorpos, a transferência adotiva de células T e as vacinas
terapêuticas (Baxevanis et al. 2008) . O desenvolvimento de vacinas terapêuticas contra o
câncer tem sido uma das principais áreas de pesquisa do Instituto Ludwig, iniciada no início
da década de 90 com a identificação do primeiro antígeno tumoral, denominado MAGE-1,
reconhecido especificamente por células T CD8 de um paciente com melanoma (Old, 2008).
A identificação de um número significativo de antígenos tumorais se tornou possível
nos anos subseqüentes devido ao estabelecimento de sistemas autólogos in vitro para a
identificação de antígenos tumorais e do desenvolvimento de metodologias como o “T cell
epitope cloning” (Traversari et al. 1992) e o SEREX (Serological identification of antigens by
recombinat expression cloning) (Sahim et al. 1995). Os antígenos tumorais conhecidos até o
momento podem ser agrupados em 5 categorias principais: antígenos de diferenciação,
antígenos correspondentes a proteínas mutadas no tumor, antígenos superexpressos ou
amplificados nos tumores, antígenos de origem viral, antígenos Câncer-Testis (CT).
Antígenos Câncer-Testis
A principal característica dos antígenos CT é a sua restrita expressão nas células
germinativas do testículo adulto e do ovário fetal dentre os tecidos normais e sua expressão
aberrante em tumores de diferentes tipos histológicos (Simpson et al., 2005). Os antígenos
CT são capazes de induzir resposta imune humoral e celular em pacientes com câncer e,
devido a essa imunogenicidade, e ao restrito padrão de expressão, são considerados
candidatos ideais para o desenvolvimento de vacinas terapêuticas contra o câncer.
63
Os antígenos CT tem sido o enfoque dos programas de identificação de antígenos
tumorais e desenvolvimento de vacinas terapêuticas contra o câncer desenvolvidos pelo
Instituto Ludwig. Ensaios clínicos nos quais antígenos CT são utilizados como alvo para o
desencadeamento da resposta imune anti-tumoral já estão em andamento e são financiados
pelo Instituto Ludwig em colaboração com o Câncer Research Institute, em um programa
internacional denominado Câncer Vaccine Collaborative (CVC) que envolve mais de 24
centros em 11 países (Old, 2008). Diferentes abordagens imunológicas têm sido utilizadas,
dentre as quais destacam-se: vacinação com peptídeos antigênicos ou com a proteína
recombinante, transferência de células T ativadas in vitro e transferência de células
dendríticas “pulsadas” com o antígeno de interesse (Old, 2008).
O antígeno NY-ESO-1
O antígeno NY-ESO-1 é um dos antígenos CT melhor caracterizados até o momento
em termos de padrão de expressão e imunogenicidade. Este antígeno foi identificado em
1997 pela presença de anticorpos anti-NY-ESO-1 no soro de um paciente com tumor de
esôfago. No ano seguinte, células CD8 foram isoladas a partir de um paciente com
melanoma que reconheciam especificamente o antígeno NY-ESO-1 (revisado em Gnjatic et
al. 2006).
O antígeno NY-ESO-1 apresenta o padrão de expressão característico de antígenos
CT sendo expresso na grande maioria dos tumores humanos. A expressão de NY-ESO-1 é
detectada em 20 a 30% dos tumores de pulmão, esôfago, fígado, estômago, próstata, ovário,
bexiga e melanomas. A expressão de NY-ESO-1 é mais freqüente em tumores de estágios
mais avançados e parece estar associada a um pior prognóstico. Esses dados sugerem que
a expressão desse antígeno possa estar associada à agressividade do tumor ou a uma
menor suscetibilidade ao tratamento quimio e radioterápico (revisado em Gnjatic et al. 2006).
O antígeno NY-ESO-1 é também o mais imunogênico dos antígenos tumorais
conhecidos até o momento. Respostas humoral e celular CD4 e CD8 são encontradas de
forma integrada e interdependente em aproximadamente 5 a 15% dos pacientes com
diferentes tipos de tumores. No entanto quando se analisa pacientes com tumores NY-ESO1 positivos essa freqüência sobe para 50%. Respostas humoral e celular não são
encontradas em pacientes com tumores que não expressam o antígeno NY-ESO-1 nem em
indivíduos sadios. Mais de 12 epítopos distintos já foram descritos para esse antígeno,
mapeados em sua maioria nas regiões central e C-terminal do antígeno (revisado em Gnjatic
et al. 2006).
Vacinas terapêuticas com o antígeno NY-ESO-1
Devido a sua alta imunogenicidade e elevada frequência de expressão em diversos
tipos de tumores humanos, NY-ESO-1 é considerado o antígeno mais promissor para o
desenvolvimento de vacinas terapêuticas. Mais de 34 ensaios clínicos utilizando diferentes
formulações de vacinas (peptídeos, proteína recombinante, vetores bacterianos e virais e
64
diferentes adjuvantes) com o antígeno NY-ESO-1 foram e estão sendo realizados no
momento.
Nestes ensaios, uma das prioridades tem sido o monitoramento da resposta imune
dos pacientes após as imunizações. Esse monitoramento imunológico permite a comparação
entre os diferentes ensaios e a identificação de formulações de vacina e estratégias de
imunização mais eficazes e capazes de induzir uma resposta humoral e celular integrada
(Old, 2008). A formulação de vacina mais utilizada para o antígeno NY-ESO-1 é a com
peptídeos HLA-A2 sintéticos em combinação com diferentes adjuvantes (CpG, Adjuvante
imcomplete de Freund, GM-CSF, IL2). Tais formulações já foram testadas em pacientes com
tumores de ovário, pulmão, melanoma e sarcoma sinovial. No entanto, os resultados mais
promissores foram obtidos nos ensaios com a proteína NY-ESO-1 recombinante expressa
em E. coli (Murphy et al., 2005), a qual foi capaz de induzir uma resposta imune humoral e
celular integrada nos pacientes imunizados (revisado em Gnjatic et al. 2006).
O primeiro ensaio clínico utilizando a proteína recombinante NY-ESO-1 foi conduzido
pela filial do Instituto Ludwig em Melbourne - Austrália. Neste ensaio duplo-cego com
placebo, a proteína foi utilizada em conjunto com o adjuvante ISCOMATRIX (partículas
encapsuladoras compostas por lipídeos e saponina) para a imunização de pacientes com
melanoma. Uma resposta imune integrada foi observada exclusivamente em todos os
pacientes imunizados com NY-ESO-1/iscomatrix (Davis et al., 2004, Chen et al., 2004). Esta
formulação está no momento sendo utilizada em ensaios de fase clínica II também em
pacientes com melanoma e foi recentemente licenciada sem exclusividade de uso pelo
Instituto Ludwig para a GSK (Glaxo Smith Klein). Resultados preliminares desse ensaio
confirmam a indução de uma resposta imune integrada capaz de prevenir a ocorrência de
doença metastática nos pacientes imunizados. Os resultados desses ensaios serão
comparados com outros ensaios também em andamento nos quais a proteína recombinante
NY-ESO-1 está sendo utilizada em combinação com os adjuvantes BCG e CHP (cholesterolbearing hydrophobized pullulan) para a imunização de pacientes com tumores de bexiga
(Kawabata et al., 2007).
Utilização de LPS na formulações de vacinas com a proteína recombinante NY-ESO-1
A utilização de moléculas imunoestimulatórias capazes de ativar receptores toll-like,
em particular o LPS, parece muito promissora para o desenvolvimento de vacinas
terapêuticas contra o câncer (Smits et al. 2008). Dados recentes da literatura mostram que a
ativação de receptores toll like, em particular TLR4, é capaz de induzir uma resposta
inflamatória levando a redução da massa tumoral (Andreani et al., 2007). No entanto a
utilização de LPS como adjuvante pode levar a uma toxicidade indesejada e subprodutos
derivados do LPS com menor toxicidade tem sido considerados mais promissores para a
utilização como adjuvantes.
O MPL – monofosforil lipídeo A, obtido pela hidrose do lipopolissacarídeo da
Salmonella minesonta, é um derivado do LPS e apresenta baixa toxicidade e propriedade
65
imuno-estimuladora. Justifica-se assim o fato que o MPLA derivado da Salmonella venha
sendo investigado como ajduvante para vacinas em humanos desde 1990. Este produto foi
formulado com o nome de MF59 e está sendo considerado o primeiro adjuvante sem alume
aprovado pela Comunidade Europea com o nome de Fluad (Ott el al, 2000).
Traços de LPS presentes na vacina celular da Bordetella pertussis são a principal
fonte de toxicidade. Este fato levou pesquisadores do Instituto Butantan a desenvolver um
método para extração do LPS da bactéria. A separação do LPS permitiu produzir uma vacina
celular DTP com baixa toxicidade e baixo custo. O LPS extraído é submetido a hidrólise
ácida liberando o MPLA, que é purificado por cromatografia de afinidade. Este método
simplificado leva à produção de MPLA da B. pertussis a custo bem baixo. Ensaios com
MPLA da B. Pertussis, em emulsão ou suspensão, não se revelaram tóxicos como esperado.
Só muito recentemente investigou-se a resposta celular para vacinas de influenza e
hepatite B. Na vacina da Influenza, a combinação de MPLA da B. pertussis e hidróxido de
alumínio como adjuvante leva, em camundongos, a um balanço entre a resposta humoral e
celular com aumento acentuado na resposta imune tipo Th1, mostrando ser capaz de
aumentar a imunogenicidade e diminuir o seu custo (Quintilio et al., 2008).
O objetivo principal deste projeto é usar o MPLA produzido pelo Butantan como
adjuvante de uma vacina terapêutica com o antígeno NY-ESO-1. Comprovando-se a eficácia
deste composto (vacina + adjuvante) atingiremos nossa missão de disponibilizar para a
população brasileira uma nova terapia de combate ao câncer a custo muito abaixo do que
está disponível atualmente no mercado.
Sub-projeto 1: Vacinação Yerapêutica com NY-ESO-1 e Adjuvante MPLA em Pacientes com
Câncer Epitelial de Ovário: Testes Clínicos Fase I/II
O câncer de ovário persiste como a principal causa de morte por câncer ginecológico
entre as mulheres ocidentais. No Brasil, a incidência é de 6.000 novos casos diagnosticados
e 2.700 mortes. A Ressonância Nuclear Magnética vem se mostrando como um método de
alta acurácia para diagnóstico diferencial pré-operatório de tumores benignos e malignos.
Como marcador do adenocarcinoma seroso, o CA-125 está bem determinado, porém com
capacidade preditiva baixa, principalmente em estágios iniciais, com valores acima do normal
em 50 a 77% casos em estadio I, 90% em estadio 2, 92% em estadio 3 e 94% em estadio 4.
O diagnóstico de certeza é histopatológico. Em geral, a taxa de sobrevida de 5 anos para o
estágio III/IV deste tipo de câncer é estimada em 31%. O tratamento do câncer de ovário
difere de acordo com subtipo histológico, grau histológico e estadiamento, mas consiste
basicamente em cirurgia e quimioterapia. Apesar de muitas pacientes que se submetem a
cirurgia e quimioterapia na fase inicial da doença conseguirem uma regressão completa do
tumor, cerca de 50 – 75% das pacientes recidivam. Uma vez ocorrendo a reincidiva, existem
alguns agentes quimioterápicos com atividade conhecida a serem aplicados, como a
repetição do tratamento com quimioterapia baseada em platina, topotecan, doxorubicina,
66
gemcitabine, vinorelbine entre outros. Entretanto, nenhuma terapia curativa está disponível
atualmente e a sobrevida dificilmente ultrapassa 2 anos.
O antígeno NY-ESO-1 é expresso em 30-40% dos tumors de ovário e é capaz de
induzir resposta immune humoral e cellular espontânea nesses pacientes (Yakirevich et al.,
2003, Odunsi et al., 2003, Qian et al., 2004) . Aproximadamente 20% dos pacientes com
câncer de ovário apresentam anticorpos anti NY-ESO-1 na ocasião da ressecção cirúrgica. O
desencadeamento de uma resposta immune anti-NY-ESO-1 parece ter um efeito protetor em
pacientes com câncer de ovário (Sato et al., 2005).
Dois ensaios clínicos de vacinação com o antígeno NY-ESO-1, em pacientes com
câncer de ovário foram realizados até o momento. Um ensaio de fase I mostrou que a
vacinação induziu resposta imune humoral e celular nos pacientes vacinados (Odunsi et. al,
2007). Tolerância e imunogenicidade foram também testadas em um ensaio – fase I, com
vacinação do pepitídeo NY-ESO-1b e adjuvante Montanide em pacientes portadores de
câncer epitelial de ovário com alto risco de recidiva (Diefenbach et. al., 2008). Um ensaio
clínico de fase II está sendo iniciado para avaliação da imunogenicidade com uso da vacina
recombinante Fowlpox NY-ESO-1 em 22 pacientes com câncer epitelial de ovário nos
estadios II, III ou IV da doença.
Objetivos
O
objetivo
deste projeto é
determinar
a
segurança,
a tolerabilidade,
a
imunogenicidade e a eficácia da vacina terapêutica NY-ESO-1, utilizando como adjuvante o
MPLA de B. Pertussis, em pacientes com adenocarcinoma seroso de ovário.
IMPACTO E INOVAÇÃO
Trata-se de projeto multidisciplicar caracterizado pela concentração de esforços do
Instituto Ludwig de Pesquisas sobre o Câncer, do Instituto Butantan, do Hospital das Clínicas
da FMUSP, do Hospital Alemão Oswaldo Cruz (HAOC) e de profissionais altamente
especializados em imunologia que compoem a rede do Instituto do Milenium (iii) para avaliar
o uso do MPLA, produzido pelo Instituto Butantan, como adjuvante da vacina terapêutica
contra o câncer NY-ESO-1, desenvolvida pelo Instituto Ludwig. Comprovando-se a eficácia
deste composto (vacina + adjuvante) nos testes clínicos fase I e II, pretende-se transferir a
tecnologia necessária para que o Instituto Butantan passe a produzir a vacina. Pode-se,
então, estimar o impacto e carater inovador deste projeto ao disponibilizar para a população
brasileira uma nova terapia de combate ao câncer, produzida no Brasil, a custo muito abaixo
do que está disponível, atualmente no mercado.
Desenho Experimental
1.
Fornecimento do Antígeno, de Anticorpos Monoclonais e do Adjuvante
A proteína recombinante NY-ESO-1 a ser utilizada nos ensaios clínicos descritos a
seguir será fornecida pelo Instituto Ludwig de Pesquisas sobre o Câncer. A longo prazo,
dependendo do resultado obtido neste estudo, o antígeno passará a ser produzido em
67
plataforma montada no Instituto Butantan. O Instituto Ludwig ficará também responsável pelo
fornecimento de anticorpos monoclonais anti NY-ESO-1 para avaliar a expressão do
antígeno nos espécimes tumorais através de imuno-histoquímica. O Instituto Butantan será
responsável por produzir e disponibilizar o MPLA da B. pertussis. Um acordo entre estas
duas Instituições está sendo firmado.
2.
Ensaios Clínicos
A segurança, a imunogenicidade e a eficácia clínica da vacinação com o antígeno
NY-ESO-1 em combinação com o MPLA de B. pertussis serão avaliadas em dois ensaios
clínicos realizados em pacientes com adenocarcinoma seroso de ovário atendidos nos
serviços de Ginecologia e Oncologia Clínica do Hospital da Clínicas da Universidade de São
Paulo. Posteriormente, será considerada a inclusão de pacientes atendidos no Hospital
Alemão Oswaldo Cruz e também pacientes oriundos da Rede Nacional de Unidades de
Pesquisa Clínica em Hospitais de Ensino (MS / MCT / FINEP / CNPq). O primeiro ensaio
será realizado para determinar a toxicidade da combinação NY-ESO-1/MPLA. Esse ensaio
envolverá 9 pacientes divididas em 3 grupos de estudo que receberão 100ug da proteína
recombinante NY-ESO-1 em combinação com doses escalonadas de MPLA (15, 45 e
135ug). Cada paciente irá receber 3 doses da formulação, administradas via intra-muscular,
com intervalo de 4 semanas entre as doses, sendo a primeira imunização realizada após 4
semanas do término do tratamento padrão com quimioterápicos (taxol e cisplatina). A
avaliação da toxicidade e imunogenicidade será realizada após cada uma das imunizações e
4 semanas após a última imunização. A formulação que apresentar menor toxicidade e maior
imunogenicidade será utilizada em ensaio clínico de fase II também em pacientes com
adenocarcinoma seroso de ovário. Esse segundo ensaio envolverá 60 pacientes divididas
em 2 grupos que receberão a formulação NY-ESO-1/MPLA e o MPLA somente. O esquema
de imunização será o mesmo utilizado no ensaio clínico de fase I. As pacientes que
apresentarem recidiva da doença irão interromper o tratamento e serão acompanhadas na
sobrevida, enquanto as demais pacientes serão tratadas até a progressão da doença ou até
uma dosagem insuportável de toxicidade. Neste ensaio a avaliação da imunogenicidade e
eficácia clínica do tratamento será realizada a cada 3 doses da vacina.
3. Critérios de inclusão e exclusão das pacientes
Serão incluídas neste estudo pacientes com idade igual ou acima de 18 anos, com
diagnóstico comprovado de carcinoma epitelial de ovário, submetidas ao tratamento padrão
com quimioterapia e cirurgia, e que não apresentarem evidência clínica da doença após o
tratamento documentadas por exame clínico, tomografia e análise dos níveis séricos de CA125. Todas as pacientes incluídas no estudo também devem apresentar prova histológica
por meio de imuno-histoquímica da expressão do antígeno NY-ESO-1 no tumor primário. As
pacientes irão receber informações sobre o estudo e assinar um Termo de Consentimento
Livre e Esclarecido antes de qualquer procedimento. O estudo será submetido para
68
avaliação do Comitê de Ética da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. As
pacientes devem apresentar bom estado geral (Karnofsky performance status • 70%), e os
seguintes parâmetros laboratoriais dentro de, no mínimo, 2 semanas antes do primeiro dia
do estudo: contagem de neutrófilos totais • 1.5 x 109 / L, contagem de plaquetas • 100 x 109
/ L, bilirrubina no soro ” 2.0 mg/dL, aspartato aminotransferase (AST) e alanina
aminotransferase (ALT) ” 2.5 x o limite superior do valor normal (ULN), creatinina ” 2.0
mg/dL, tempo de protrombina < 1,3 x controle. Serão excluídas do estudo pacientes com uso
continuo de esteróides sistêmicos, agentes imunossupressores e antibióticos, doença
cardíaca clinicamente significativa (Segundo Associação do Coração de New York: Classes
III e IV), e história de tumor anterior (com exceção de câncer de pele não-melanoma ou
carcinoma in situ de útero cervical, adequadamente tratados).
4. Critérios de Avaliação do Estudo
- Avaliação da Tolerância / Toxicidade: Serão avaliados os eventos adversos utilizando
critérios do CTCAE (Common Terminology Criteria for Adverse Events) logo após a primeira
imunização em ambos os ensaios. Serão considerados os parâmetros de toxicidade no
câncer através de anamnésia clínica (sinais vitais: pressão arterial, rítmo de pulsação e
temperatura), exame físico, parâmetros de exames laboratoriais (hematologia, sorologia e
urina).
- Avaliação da Imunogenicidade: A presença de anticorpos específicos anti-NY-ESO-1 será
avaliada por ELISA e resposta imune celular CD4 e CD8 será avaliada através de ELISPOT.
Essa avaliação será realizada após cada uma das imunizações no ensaio clínico de fase I e
após a terceira imunização e nas imunizações subseqüentes no ensaio clínico de fase II.
- Avaliação da Eficácia Clínica da Vacinação: A reincidiva do tumor, o aparecimento e
progresso de metástases, a sobrevida livre de doença e global serão avaliadas no ensaio
clínico de fase II após a terceira imunização. Tomografia e exames clínicos e laboratoriais
(CA-125) serão usados nesta avaliação.
NOTA: Esta é uma sinopse do Protocolo que será adotado. Uma versão mais detalhada será
submetida às Comissões de Ética em Pesquisa das Instituições envolvidas e a ANVISA para
aprovação do estudo.
Sub-projeto 2: Avaliação de NY-ESO-1 como Potencial Alvo de Imunoterapia em Pacientes
com Glioblastoma
As propriedades invasivas dos tumores malignos do Sistema Nervoso Central (SNC)
são de relevante importância clínica, uma vez que contribuem para a não resposta às
modalidades terapêuticas correntes (cirurgia, radioterapia e quimioterapia). A sobrevida
média após o diagnóstico de glioblastoma (GBM), o tumor maligno do SNC mais freqüente, é
de 17 semanas sem tratamento e 30 semanas com cirurgia e radioterapia. Esta sobrevida
aumenta para 50 semanas, com uso da quimioterapia, embora se observem muitos efeitos
69
colaterais e queda na qualidade de vida do paciente. A característica infiltrativa destes
tumores, dificultando a ressecabilidade completa e radio e quimiorresistência destas células
tumorais, corroboram para ineficácia destas modalidades terapêuticas tradicionais. Um
aspecto fundamental na terapêutica de câncer é a elucidação das bases celulares da
doença. Neste sentido, a descoberta de células tronco em tumores tem sido relevante nos
últimos anos. Células responsáveis pelo desenvolvimento e recorrência de tumores foram
inicialmente identificadas em leucemia mielóide, considerada uma doença de célula tronco
(Bonnet et al., 1997). Posteriormente, subpopulações com características de células tronco e
capacidade tumorigênica foram descritos em outros tipos de tumores, inclusive em GBMs,
nos quais expressam o marcador de célula tronco CD133, formam oncosferas e
correspondem por 1 a 25% da massa tumoral com alto potencial tumorigênico (Singh et al.,
2003). Recentemente, foi descrito que células CD133 positivas determinam recidiva tumoral,
resistência a radio e quimioterapia (Bao et al., 2006a; Kang e Kang, 2007), contribuem para
angiogênese (Oka et al., 2007), influenciando, assim, o prognóstico clínico.
A expressão de antígenos CT em GBMs foi descrita inicialmente por Sahin et al.
(1995). Sua expressão foi também observada em tumores pediátricos, incluindo GBMs
(Bodey et al., 2008). Observações preliminares no nosso grupo mostraram que cerca de 4%
das células de GBMs apresentam expressão do antígeno NY-ESO-1, levantando a hipótese
de que estas células podem apresentar características de células tronco tumorais,
responsáveis pela recidiva e resistência a terapias vigentes. Se esta hipótese se confirmar, o
antígeno NY-ESO-1 pode ser um potencial alvo para imunoterapia neste tipo de tumores.
Terapias imunoestimulatórias têm sido propostas como um tratamento alternativo e
promissor para pacientes com GBMs e a busca de novos alvos terapêuticos é de
fundamental importância para esta finalidade (Yamanaka, 2008; Das et al., 2008).
Objetivos
Analisar a expressão de NY-ESO-1 como marcador de células tronco em GBM e potencial
alvo de imunoterapia.
IMPACTO e INOVAÇÃO
A busca de novos alvos terapêuticos para o tratamento de pacientes com GBM é de
fundamental importância para uma melhora do prognóstico, uma vez que as modalidades
atuais de tratamento acrescentam pouco na sobrevida destes pacientes. Células tronco
tumorais presentes em GBMs têm sido alvo de intenso estudo, uma vez que são
responsáveis pela recidiva, angiogênese e resistência às terapias vigentes. Estas
características levantam uma hipótese atraente de que os GBMs podem ser curados
atacando-se as células tronco tumorais. Desta forma, a expressão de antígenos nestas
células são importantes, pois podem ser alvos para novas modalidades terapêuticas,
incluindo imunoterapias.
Desenho experimental e Métodos
70
A análise de expressão do gene NY-ESO-1 será realizada por PCR em tempo real.
Serão comparados os pares de oncosferas derivadas de amostras de GBMs e seus
respectivos tumores originais. A análise da expressão da proteína será realizada em
amostras de GBMs por imunohistoquímica.
Oncosferas
Amostras de GBMs serão removidas durante ressecção cirúrgica e ressupensas em
meio de cultura, de acordo com metodologia descrita (Okamoto et al., 2007). Os tecidos
serão lavados, homogenizados mecanicamente e ressuspensos em meio DMEN contendo
10% de soro fetal bovino e antibióticos (estreptomicina, penicilina e gentamicina) e serão
mantidas a 37°C em atmosfera com 5% de CO2. Células não aderentes em crescimento
serão mantidas em cultura por até 3 dias. Nestas condições, algumas células de GBM
exibem expansão clonal in vitro e formam pequenas colônias conhecidas como oncosferas.
Extração de RNA e síntese de cDNA
RNA
será
extraído
das
oncosferas,
bem
como
dos
tumores
originários
correspondentes, utilizando kit RNeasy Mini Kit (Qiagen). A síntese de cDNA será realizada
por transcrição reversa com SuperScript III, utilizando-se oligo(dT) e hexâmeros randômicos,
de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen).
Imunohistoquímica
Para a expressão de NY-ESO-1, cortes de 5µm de tumores incluídos em parafina
serão desparafinizados e re-hidratados. O anticorpo monoclonal E978 contra NY-ESO-1,
gerado pelo Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer (Jungbluth et al., 2001), será
utilizado. A detecção do anticorpo primário será realizada com anticorpo secundário anticamundongo (Vector Labs), seguido de sistema de avidina e biotina (ABC-Elite, Vector
Labs). 3’3’-diaminobenzidina sera utilizada como cromógeno.
Equipe:
Responsável:
Anamaria Camargo - Instituto Ludwig de Pesquisas sobre o Câncer em São
Paulo (LICR)
Sandro de Souza - LICR
Jorge Kalil – InCor, FMUSP
Pedro Giavina-Bianchi Jr. – Serviço de Alergia e Imunologia Clínica, FMUSP
Colaboradores Nacionais:
Juçara Parra – LICR
Sueli Mieko Oba Shinjo, Departamento de Neurologia, FMUSP
Roseli da Silva, Departamento de Neurologia, FMUSP
Jesus Carvalho, Instituto do Câncer do Estado de São Paulo, FMUSP
Paulo Hoff, Instituto do Câncer do Estado de São Paulo, FMUSP
71
Gustavo Kesselring, Hospital Alemão Oswaldo Cruz
Maria Leonor Sarno de Oliveira, Instituto Butantan
Colaboradores Internacionais:
Andrew John George Simpson, Ludwig Institute for Cancer Research, New
York, EUA
Lloyd Old, Ludwig Institute for Cancer Research (LICR) em New York, USA
Sacha Gnjatic, Ludwig Institute for Cancer Research (LICR) em New York,
EUA
Achim Jungbluth, , Ludwig Institute for Cancer Research (LICR) em New
York, EUA
Gerd Ritter, , Ludwig Institute for Cancer Research (LICR) em New York,
EUA
INSTITUIÇÕES ENVOLVIDAS / PARTICIPANTES
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (USP), Depto. Neurologia:
Instituto Ludwig de Pesquisas sobre o Câncer em São Paulo (LICR):
Ludwig Institute for Cancer Research (LICR) em New York, USA:
Faculdade de Medicina da USP
Hospital Alemão Oswaldo Cruz
Instituto Butantan
Rede Nacional de Unidades de Pesquisa Clínica em Hospitais de Ensino
(MS / MCT / FINEP / CNPq)
Subprojeto 3. Estudo de fase II da injeção intra-tumoral neoajuvante da vacina de DNAhsp65 em pacientes portadores de carcinoma epidermóide da cavidade oral.
Nesse ensaio clínico, os pacientes serão tratados no Serviço de cirurgia de cabeça e
pescoço do HCFMUSP sob responsabilidade do Dr. Pedro Michaluart Jr. Um dos objetivos
desse estudo é a avaliação imunológica dos pacientes tratados, que será feita sob
responsabilidade da Dra. Verônica Coelho e do Dr. Edécio Cunha Neto.
Objetivos
Estabelecer a eficácia da vacina de DNA codificando uma proteína de choque
térmico de M. leprae (hsp65) no tratamento de do carcinoma epidermóide de cabeça e
pescoço. . Já encerramos um ensaio de fase I com sucesso utilizando essa vacina de DNA,
o que motivou o ensaio de fase II proposto nessa etapa.
72
Desenho experimental e Métodos
Estudo de Fase 2 prospectivo, aberto e não-randomizado da aplicação intra-tumoral
da vacina de DNA-HSP65 (Heat Shock Protein) do Mycobacterium leprae como um
tratamento neo-adjuvante.Iremos definir se a utilização desta vacina em pacientes com uma
condição clínica e imunológica melhor que os incluídos na Fase I pode ser útil como uma
estratégia neo-adjuvante à cirurgia. Assim, 60 pacientes com diagnóstico recente de
carcinoma de cavidade oral, localmente invasivos receberão três aplicações de 400mcg com
duas semanas de intervalo entre elas. Após as injeções (dias 0, 14 e 28), o paciente será
submetido à ressecção do tumor conforme protocolo de tratamento da Disciplina de Cirurgia
de Cabeça e Pescoço do HCFMUSP. A fim de verificarmos se a vacina é capaz de reduzir
significativamente o tamanho do tumor, serão realizadas tomografias antes do inicio das
injeções e pouco antes da cirurgia. Como o tratamento desses pacientes inclui a ressecção
completa do tumor, analisaremos nos espécimes diversos aspectos histopatológicos e
moleculares potencialmente relacionados à intervenção proposta. A presença de inflamação
tumoral, detectável clinicamente e/ou histologicamente, será analisada e correlacionada com
a atividade/resposta à vacina (surrogate marker). A toxicidade causada pela vacina será
avaliada local e sistemicamente utilizando o NCI-CTC (National Institute of Cancer-Common
Toxicity Criteria). Ainda, como objetivo secundário, os pacientes serão avaliados em relação
à sobrevida livre de doença e à sobrevida global a longo prazo.
SELEÇÃO DOS PACIENTES
Critérios de Inclusão
ƒ
Pacientes com confirmação histológica de carcinoma epidermóide de cavidade oral.
ƒ
Tumor mensurável diretamente e através de tomografia (maior diâmetro superior a
20mm).
ƒ
Paciente não podem ter sido submetidos a tratamento com radioterapia ou quimioterapia
previamente ao inicio do protocolo.
ƒ
Tumor passível de ressecção cirúrgica.
ƒ
Idade maior ou igual a 18 anos.
ƒ
ECOG performance status menor ou igual a 2 (Karnofsky maior ou igual a 70%)
ƒ
Expectativa de vida maior que seis meses.
ƒ
Capacidade de compreender e assinar o consentimento informado oferecido.
ƒ
Pacientes devem ter funções orgânicas e medulares normais.
Critérios de Exclusão
ƒ
Pacientes recebendo qualquer outra droga em investigação.
ƒ
Pacientes com metástases a distância.
73
ƒ
História prévia de reações alérgicas atribuídas a componentes químicos similares ou
composições biológicas semelhantes a vacinas de DNA.
ƒ
História de doença auto-imune sistêmica com acometimento de órgãos internos (por
exemplo, hepatite auto-imune, retocolite ulcerativa inflamatória).
ƒ
Portador de Imunodeficiência primária ou secundaria a drogas (e.g.transplantados).
ƒ
Doenças incontroláveis como insuficiência cardíaca progressiva sintomática, angina
pectoris instável, arritmia cardíaca ou doenças psiquiátricas que possam limitar o
cumprimento dos requerimentos para o estudo.
ƒ
Pacientes portadores de HIV podem apresentar tumores de comportamento diferente
dos tumor epidermóide clássico de Cabeça e Pescoço. Portanto, pacientes HIV-positivos
em uso ou não de terapia anti-retroviral são excluídos deste estudo, Entretanto esta
população poderá ser incluídas em estudos futuro, que visam especificamente o
tratamento de tumores dentro desta população.
ƒ
Pacientes do sexo feminino em idade fértil e que não estejam utilizando um método
seguro de contracepção ou com desejo de engravidar.
ƒ
Mulheres grávidas, devido a falta de informação sobre o risco desta vacina em humanos
durante a gestação.
PLANO DE TRATAMENTO
Aplicação da vacina de DNA
O tratamento será administrado em regime ambulatorial, através da aplicação da vacina
de DNA intra-tumoral nestes pacientes. A dose de 400 mcg da vacina será injetada
buscando uma distribuição ampla dentro da massa tumoral, com um volume total de 1,5ml.
Esta aplicação poderá ser realizada com a utilização de medicações sedativas, como
midazolan intramuscular, para maior conforto dos pacientes, caso haja necessidade.
Nenhuma droga em investigação ou tratamento alternativo dos descritos abaixo será
ministrado para os pacientes incluídos neste estudo.
Tratamento de suporte
Todos os pacientes submetidos a aplicação da vacina estarão em regime ambulatorial,
sendo que estará reservada vaga em leito de enfermaria caso ocorram efeitos adversos
graves ou limitantes, até a completa resolução do efeito observado. Apoio nutricional e de
controle de dor serão oferecidos aos pacientes, com uso de analgésicos, anti-inflamatórios
ou opiáceos, de acordo com a intensidade do sintoma álgico, seguindo esquema
padronizado no serviço.
Em caso de reação local intensa, com dor, edema e/ou sangramento local, os pacientes
serão tratados sintomaticamente, sendo que o uso de corticóide sistêmico poderá ser
considerado caso haja resposta inflamatória local intensa. Qualquer toxicidade sistêmica
será tratada de acordo com a necessidade e os conhecimentos clínicos vigentes. Infecções
74
locais serão tratadas com antibióticos em esquemas habituais e de acordo com a gravidade
do caso e a localização da infecção.
Duração da terapia
Na falta de atrasos no tratamento devido a efeitos adversos, o tratamento deve continuar
até completar três aplicações com duas semanas de intervalo ou até que ocorra um dos
seguintes critérios:
•
Progressão evidente da doença,
•
Doenças intercorrentes que possam impedir a continuação da aplicação do tratamento,
•
Efeito(s) adverso(s) inaceitável(is), de acordo com o CTC, efeitos de grau igual ou
superior a 4,
•
Paciente decida desistir do estudo, ou
•
Alterações gerais ou específicas nas condições do paciente que sejam consideradas
inaceitáveis, no julgamento do investigador, para a continuação do tratamento.
Todos os pacientes serão acompanhados indefinidamente no ambulatório do serviço.
ATRASO DE APLICAÇÕES/MODIFICAÇÕES NA APLICAÇÃO
Em caso de efeitos adversos limitantes às atividades diárias do paciente, a próxima
aplicação da vacina pode ser adiada em uma semana. Em caso de efeitos adversos
inaceitáveis, com eventos adversos de grau 4 ou superior, o paciente poderá ser afastado do
estudo clínico a critério do investigador principal. Caso haja múltiplos eventos adversos
atribuíveis ao uso da vacina em grau 3 ou superior, a suspensão do ensaio clinico será
considerada em conjunto com o Comitê de ètica do HCFMUSP (CAPPesq).
ESTUDOS CORRELATOS/ESPECIAIS
•
Exames de rotina para mapear o surgimento de toxicidade sistêmica (hemograma,
função hepática, função renal, bioquímica, auto-anticorpos de rotina e atividade
inflamatória) e testes de hipersensibilidade tardia.
•
Estudo histológico sobre o impacto do uso intra-tumoral da vacina para avaliar infiltrado
inflamatório dentro do tumor após o uso da vacina. Caso haja inflamação, haverá uma
busca de caracterizar o perfil das células inflamatórias presentes na massa tumoral.
•
Capacidade imunogênica da vacina. detectar a fase de surgimento de algum anticorpo
durante o tratamento. Qualquer sinal ou sintoma sugestivo de manifestação clinica autoimunidade poderá se utilizar desta soroteca para se mapear a fase exata do surgimento
de um auto-anticorpo (e.g. anti-DNA). Esta soroteca também será utilizada para
detecção e elevação de títulos de anticorpos anti-HSP humanos e de Mycobacterium sp.
A soroteca somente será utilizada com o objetivo de se detalhar o surgimento de autoanticorpos ou mensurar a resposta imune desencadeada pela vacina. Nenhum outro
estudo será realizado neste material sem previa autorização do Comitê de Ética.
75
•
Coleta de Células mononucleadas sangüíneas periféricas para ensaios de proliferação
in vitro de linfócitos a diversos antígenos (peptídeos, proteínas de HSP humanas e
derivadas do Mycobacterium sp.). Estes ensaios serão realizados seriadamente em um
subgrupo de pacientes.
NOTA: Esta é uma sinopse do Protocolo que será adotado. Uma versão mais detalhada será
submetida às Comissões de Ética em Pesquisa das Instituições envolvidas e a ANVISA para
aprovação do estudo.
Equipe
Pedro Michaluart Jr (Cordenador), Serviço de cirurgia de cabeça e pescoço do
HCFMUSP
Verônica Coelho – InCor – HC-FMUSP
Edécio Cunha Neto – FMUSP
Francisco Inácio Pinkusfeld Monteiro Bastos - ENSP – FIOCRUZ - RJ
Maria Regina Alves Cardoso – FSP, USP
Guilherme Loureiro Werneck - - ENSP – FIOCRUZ - RJ
Esper Kallas - FMSP
76
G. Alergia
As doenças alérgicas representam um grupo heterogêneo de manifestações clínicas
que atingem cerca de 30% da população mundial. Antígenos de ácaros, animais domésticos,
alimentos, pólens, fungos, venenos de himenópteros e medicamentos estão envolvidos na
imunopatogênese de doenças como a rinite, asma, dermatite atópica, urticária, anafilaxia,
entre outras. Um dos grandes problemas encontrado é a identificação de novos alérgenos.
Muitas fontes potenciais sequer foram detectadas, principalmente em se tratando de
alérgenos regionais. Além disso há os casos de reatividade cruzada, provocados pela
semelhança entre epitopos de proteínas alergênicas diferentes.
A imunoterapia alérgeno-específica (SIT), designada como “vacinas” para alergia, é
a única forma de tratamento capaz de atuar de forma definitiva modificando a resposta imune
alérgica, promovendo controle de sintomas e podendo prevenir o desenvolvimento de novas
sensibilizações e asma. O sucesso da SIT é dependente da qualidade dos extratos
empregados e da dose de alérgeno utilizada. Os extratos alergênicos utilizados atualmente
na SIT são misturas heterogêneas, e sua padronização é difícil de ser realizada. O uso de
alérgenos recombinantes para SIT oferece diversas vantagens sobre os extratos alergênicos
tradicionais, que incluem: produção de alérgenos de forma consistente, em quantidades
essencialmente ilimitadas e com alto grau de pureza, permitindo excelente controle de
qualidade e padronização; desenvolvimento, através de engenharia genética, de variantes
hipoalergênicas com redução significante da reatividade IgE, mas mantendo a capacidade de
estimular células T reguladoras, que permitiriam o uso de doses mais altas de alérgeno com
riscos menores de reações adversas. Estudos controlados demonstraram a eficácia e
segurança do uso de alérgenos recombinantes de polens (variantes hipoalergênicas ou
cocktails desses alérgenos) para imunoterapia em pacientes com rinite alérgica. Além disso,
alérgenos recombinantes de várias fontes têm sido usados em testes cutâneos de
hipersensibilidade imediata para diagnóstico de alergia, aumentando especificidade, sendo
seguros e não associados a risco maior de reações adversas quando comparados a extratos
alergênicos convencionais.
Subprojeto 1. Caracterização Molecular dos Antígenos Imunodominantes de Novas
Fontes de Alérgenos Regionais (Projeto GENAR).
Diante do grande número de pacientes que procuram os diversos serviços médicos
que compõem o grupo do iii com a suspeita clínica de alergias a novos alérgenos ainda não
identificados, o presente subprojeto desenvolverá
uma metodologia sistemática para a
identificação de novos alérgenos e estudos de reatividade cruzada, utilizando principalmente
a abordagem proteômica.
O Grupo de Estudo de Novos Alérgenos Regionais (GENAR), constituído pelo Grupo
de Pesquisa em Biologia Estrutural e Zooquímica do IBRC-UNESP, pela a Disciplina de
Imunologia Clínica e Alergia da Faculdade de Medicina da USP e Disciplina de Imunologia
Clínica do Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da
77
USP, utilizará conhecimentos clínicos, técnicas de biologia molecular, biologia estrutural e
proteômica, para identificar a caracterizar as proteínas antigênicas de diferentes fontes de
alérgenos regionais, tais como artrópodes de hábitos domésticos, venenos de Himenópteros,
medicamentos e alimentos. Aproveitando-se da experiência de trabalho em rede gerada nos
últimos 6 anos dentro do iii.
A identificação das proteínas imunogênicas principais será realizada através de
protocolos de análise proteômica, onde as proteínas dos extratos da fonte alergênica serão
separadas por eletroforese bidimensional, submetidas então a protocolos de immunobloting
com o soro de pacientes alérgicos, identificadas com o uso de protocolos combinados de
espectrometria de massa e ferramentas de bioinformática proteômica. As proteínas
identificadas como alérgenos principais serão purificadas e/ou manipuladas geneticamente,
para sua produção na forma recombinante, para então serem utilizadas em estudos de
biologia estrutural e em protocolos de imunoterapia.
Objetivos:
1.
Detectar e identificar os alérgenos de alimentos, venenos e medicamentos ainda não
descritos na literatura dentre os pacientes atendidos pelo Serviço de Imunologia Clínica e
Alergia do HCFMUSP;
2.
Identificar possíveis reatividades cruzadas entre estes novos alérgenos identificados
e alérgenos já descritos na literatura;
3.
Criar uma sistemática de investigação da clínica ao laboratório para a identificação
de novos alérgenos regionais, utilizando como modelo inicial amostras de sangue de
pacientes alérgicos à mandioca;
Subprojeto 2. Implantação de um centro de referência no atendimento de pacientes
com asma grave.
A asma é uma doença com prevalência mundial estimada em 10%, e por isto um
problema de saúde pública, que vem despertando interesse crescente nos pesquisadores
(GINA, 2008). Desde 1970, apesar de todo avanço da medicina, existem evidências
mostrando que a prevalência da asma aumentou em certas regiões geográficas. Os
Hospitais Universitários recebem os casos mais complexos e graves. É importante salientar
que a asma grave de difícil controle, embora corresponda a não mais do que 5% de todos
pacientes asmáticos, é responsável por cerca de 50% do custo total da doença. Também
está associada a uma morbimortalidade maior, com um risco 15 vezes maior de visitas ao
serviço de emergência e 20 vezes maior de internações.
Atualmente a asma é considerada uma síndrome, ou ao menos uma doença com
diversos fenótipos. Os dois principais, são a asma alérgica e a não alérgica. Ao contrário da
asma alérgica, cuja fisiopatogenia está bem caracterizada, a etiologia e os mecanismos
envolvidos na asma não alérgica não estão elucidados. Alergia desencadeada por antígenos
78
desconhecidos (fungos), infecção persistente (por clamídia, micoplasma ou vírus) e autoimunidade são algumas possibilidades.
Estas são questões fundamentais para o entendimento da fisiopatologia da asma e
conseqüentemente de avanços em seu tratamento o estabelecimento da relação entre os
diversos aeroalérgenos desencadeantes do processo, a determinação de parâmetros válidos
de controle da doença para pacientes dentro da realidade sócio-econômica-cultural do Brasil,
o entendimento do processo fisiopatológico na asma não alérgica, e a investigação de novos
marcadores laboratoriais e agentes terapêuticos para esta doença.
Subprojeto 2.1: Alergia respiratória: reação cruzada entre antígenos do Dermatophagoides
pteronyssinus e Blomia tropicalis.
Os ácaros Blomia tropicalis (Blo t) Dermatophagoydes pteronyssinus (Der p) são
encontrados em elevada freqüência na poeira domésticas, principalmente nos países
tropicais. A importância desses ácaros nas doenças respiratórias alérgicas já foi previamente
descrita por vários autores e a sensibilização por esses ácaros é significantemente elevada
em asmáticos. Nos últimos anos, muitos alérgenos da Blo t e Der p vêm sendo clonados e
seqüenciados, alguns mostrando homologia. Diversos estudos da literatura demonstraram
significante reatividade cruzada entre Blo t e Der p e alguns autores mostram que o extrato
de Der p pode inibir 33% da ligação de IgE do extrato de Blo t, e extrato de Blo t pode inibir
13% da ligação da IgE ao Der p. Apesar desses diversos estudos demonstraram variável
grau de reatividade cruzada alergênica, estes são realizados in vitro, e apenas um estudo
realizou provocação brônquica para determinar o impacto clínico desta reatividade cruzada.
Em alguns casos, talvez seja necessário conduzir testes de provocação para definir o
alérgeno relevante do ponto de vista clínico e começar tratamento apropriado com
imunoterapia específica.
Objetivos:
1.
Estudar a resposta in vivo através de broncoprovocação de pacientes sensibilizados
concomitantemente a Blo t e Der p.
2.
Estudar o perfil de especificidade da IgE destes pacientes através de Western Blot.
3.
Estudar a influência da imunoterapia antígeno-específica com um ou com ambos os
antígenos na apresentação clínica da doença e em seus parâmetros laboratoriais
Subprojeto 2.2: Validação de um questionário de aferição do controle da asma.
Não existe uma unanimidade sobre qual é a melhor maneira para aferir o controle da
asma, provavelmente porque não exista um único método e sim diversos critérios que devem
ser avaliados em conjunto. Trabalhos têm demonstrado que nem sempre há uma correlação
entre eles, enfatizando a necessidade de analisar em grupo mais de um método de aferição.
Por exemplo, o FEV1, um dos índices mais utilizados no acompanhamento dos pacientes,
79
pode não manter correlação com o óxido nítrico exalado e com os questionários de aferição
do controle da asma. Estes últimos foram criados com o objetivo de estruturar e padronizar a
avaliação do paciente e englobam dados clínicos, de função pulmonar e até de inflamação.
Alguns questionários estão validados e recebem graduação em escores que permitem o
seguimento dos doentes. Entretanto, não existe um questionário validado para a língua
portuguesa de fácil aplicação e ampla utilização e que seja aplicável à realidade da maiorira
dos pacientes no Brasil.
O Serviço de Imunologia Clínica e Alergia do HC da FMUSP elaborou um
questionário para o acompanhamento de pacientes com asma que será validado através de
sua comparação com os critérios do GINA, as medidas espirométricas, a celularidade do
escarro induzido e a mensuração do óxido nítrico exalado. O questionário é composto por
seis itens que devem ser avaliados em um sistema de graduação de 0-7, através de uma
média semanal do observado no último mês. Participarão do estudo 80 pacientes. A
validação do questionário que permitirá a melhor avaliação do controle dos pacientes com
asma.
Nosso objetivo neste subprojeto é:
1.
Validar um questionário de avaliação do controle da asma apropriado para os
pacientes brasileiros.
Subprojeto 2.3: Caracterização do padrão imunopatológico na asma não alérgica
Os mecanismos fisiopatológicos
envolvidos
no
desenvolvimento da asma,
principalmente da forma não alérgica, não estão completamente esclarecidos. Sabe-se que a
asma envolve uma resposta inflamatória heterogênea de vias aéreas, onde muitas células
participam. Além da asma alérgica, caracterizada pela resposta de linfócitos auxiliares com
perfil Th2 e subseqüente inflamação eosinofílica. Existe um crescente reconhecimento de
formas não eosinofílicas de asma, particularmente em indivíduos com doença grave e asma
não alérgica. Vários estudos consideram os neutrófilos como os responsáveis pelo infiltrado
celular não eosinofílico. A neutrofilia na asma poderia ser conseqüência da própria doença
ou de seu tratamento, com uso prolongado de corticóide.
A asma brônquica é caracterizada por hiper-responsividade e inflamação das vias
aéreas. Dados da literatura têm demonstrado que este processo inflamatório na realidade é
sistêmico e portanto marcadores sistêmicos de inflamação podem ser úteis na avaliação do
paciente asmático. Vários marcadores dessa inflamação vêm sendo estudados, mas é
necessário encontrar novos métodos, acessíveis, reprodutíveis, não invasivos, para reforçar
as medidas de inflamação na asma. A proteina C reativa é um reagente de fase aguda
secretado, principalmente pelos hepatócitos, na presença de IL-6. Recentemente, a
dosagem de proteína C reativa ultra-sensível vem sendo usada para detectar pequenas
variações nos níveis plasmáticos desta proteína, e estas medidas têm sugerido um baixo
80
grau de inflamação sistêmica em algumas doenças. Alguns estudos mostraram relação de
aumentos nos níveis da proteína C reativa ultra-sensível com aumento de hiperresponsividade nas vias aéreas e baixo VEF1, sugerindo que este marcador e a inflamação
sistêmica possam estar associados com a piora respiratória.
Os pacientes asmáticos selecionados dos ambulatórios do Serviço de Imunologia
Clínica e Alergia do HC da FMUSP caracterizados conforme o GINA e divididos em dois
grupos – asma alérgica e asma não alérgica – através de histórias pessoal e familiar para
atopia, da dosagem de IgE sérica, do teste de puntura, da dosagem in vitro específica para
inalantes e da provocação brônquica com antígenos ácaro. Esperamos assim identificar
possíveis diferenças entre os mecanismos fisiopatogênicos das asmas alérgicas e não
alérgicas.
Objetivos:
1.
Estudar nas amostras obtidas de diversos materiais biológicos destes pacientes a
quantidade de mRNA para citocinas, quimiocinas e seus receptores e de mediadores próinflamatórios associados a eosinófilos, basófilos e mastócitos.
2.
Estudar o perfil do proteômico diferencial no tecido pulmonar nestes dois grupos de
asmáticos.
3.
Dosagem sérica de proteína C reativa ultra-sensível e fibrinogênio no sangue de
pacientes
asmáticos
sensibilizados
ao
Dermatophagoydes
pteronissinus
após
broncoprovocação e comparar com a resposta de indivíduos com asma não alérgica.
4.
Estudar a expressão de mRNA de citocinas, quimiocinas e seus receptores nos
leucócitos circulantes por PCR em tempo real.
Subprojeto 3: Imunoterapia e imunodiagnóstico em alergia respiratória
Previamente, nós determinamos que 80% dos pacientes alérgicos a ácaros
apresentam testes cutâneos positivos para os alérgenos Derp 1 e Derp 2, produzidos como
proteínas recombinantes (r). Uma grande proporção de pacientes também apresentou IgE
específica para Derp 1 e Derp 2 no soro. No presente projeto, nós propomos desenvolver um
estudo clínico para avaliar a segurança e eficácia de uma nova vacina para tratar pacientes
com asma e rinite que são alérgicos a ácaros, usando os alérgenos recombinantes Derp 1 e
Derp 2 produzidos sob condições de boas práticas de manufatura (good manufacturing
practices, GMP). Nós esperamos que o tratamento com essa vacina proverá controle ou
diminuição dos sintomas a longo prazo, melhora da qualidade de vida, e diminuição do uso
de medicações controladoras da asma e rinite, que embora eficazes, estão associadas a
efeitos adversos e a sobrecarga econômica para os pacientes e suas famílias. Trata-se do
primeiro estudo realizado no mundo utilizando alérgenos recombinantes de ácaros para
imunoterapia alérgeno-específica, que poderá resultar em tratamento mais eficaz de asma e
81
rinite, com potencial de beneficiar uma grande quantidade de pacientes que sofrem com
essas doenças.
No nosso meio, a alergia a barata é secundária apenas a alergia a ácaros como
causa de asma. Identificamos a tropomiosina como alérgeno principal de barata Periplaneta
americana, e mostrou que a tropomiosina de barata apresenta elevado grau de similaridade
de seqüência com tropomiosina de Ascaris lumbricoides. Houve ótima correlação de ligação
de IgE humana a tropomiosinas recombinantes de barata e Ascaris, sugerindo reatividade
cruzada. A relação entre infecções por parasitas e desenvolvimento de alergia e asma ainda
não é clara, alguns parasitas como Schistosoma parecer ter efeito protetor, enquanto que
outros como Ascaris não apresentam esse efeito. Nós especulamos que a reatividade IgE a
tropomiosina de Ascaris poderia promover alergia e asma por reatividade cruzada com
tropomiosinas homólogas de barata e ácaros podem exercer No presente subprojeto, a
investigação da reatividade cruzada IgE e da resposta de células T em pacientes alérgicos a
barata, e a elaboração de modelo animal, serão usados para avaliar o potencial terapêutico
da tropomiosina como vacina.
Usando um painel de alérgenos recombinantes de barata (de P. americana: rPer a 7
– tropomiosina; rPer a 1; de Blattella germanica: rBla g 2, rBla g 4, rBla g 5), encontramos
positividade em testes cutâneos em 50% dos pacientes alérgicos a barata, indicando a
necessidade de identificação de novos alérgenos desse inseto para uso em diagnóstico.
Propomos identificar novos alérgenos de P. americana, a espécie domiciliar de barata mais
comum em nosso meio, usando análise proteômica, e produzir painel mais amplo de
alérgenos recombinantes utilizando técnicas de clonagem molecular. O subprojeto deve
resultar em melhora da especificidade do diagnóstico de alergia a barata, usando alérgenos
recombinantes ao invés de extratos brutos, não padronizados de barata, para testes
cutâneos de hipersensibilidade imediata e medida de anticorpos IgE específicos no soro.
Objetivos:
1.
Desenvolver um estudo clínico para avaliar a eficácia e segurança de nova vacina
para pacientes alérgicos a ácaros, usando os alérgenos principais Derp 1 e Derp 2
produzidos como proteínas recombinantes sob condições GMP.
2.
Identificar e produzir novos alérgenos de barata P. americana para possibilitar
formulação de um painel de alérgenos recombinantes para uso em diagnóstico de alergia a
barata.
3.
Investigar a reatividade cruzada IgE e a resposta de células T a tropomiosinas de
barata e A. lumbricoides em pacientes com asma, e avaliar a capacidade dessas
tropomiosinas em causar inflamação eosinofílica e hiperratividade brônquica em modelo
experimental.
82
Equipe:
Coordenadores de subprojetos:
Fábio F. Morato Castro, Disciplina de Imunologia Clínica e Alergia, FMUSP
Pedro Giaviana Bianchi Jr., Serviço de Alergia e Imnologia Clínica, FCFMUSP
Mario Sergio Palma, Centro de Estudos de Insetos Sociais, UNESP
Luisa Karla P. Arruda, Disciplina de Imunologia Clínica do Departamento de
Clínica Médica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
Demais pesquisadores do iii:
Osmar Malaspina
Colaboradores Nacionais:
Cristina Kokron, Serviço de Alergia e Imnologia Clínica, FC-FMUSP
Clóvis Eduardo Santos Galvão, Serviço de Alergia e Imnologia Clínica, FCFMUSP
Rosana Câmara Agondi Leite, Serviço de Alergia e Imnologia Clínica, FCFMUSP
Myrthes Toledo Barros, Serviço de Alergia e Imnologia Clínica, FC-FMUSP
Antonio Abílio Motta, Serviço de Alergia e Imnologia Clínica, FC-FMUSP
Luiz Augusto Marcondes, Serviço de Alergia e Imnologia Clínica, FC-FMUSP
Andréa Cohon, Serviço de Alergia e Imnologia Clínica, FC-FMUSP
Carlos Medeiros, Hospital Vital Brazil, Instituto Butantan
Keity Souza Santos, InCor, HC-FMUSP
Bibiana Monson de Souza, Centro de Estudos de Insetos Sociais, UNESP
Lucilene Delazari dos Santos, Centro de Estudos de Insetos Sociais, UNESP
Lilian Mari M. Cesar-Tognolli , Centro de Estudos de Insetos Sociais, UNESP
Roberta Nocelli, Centro de Estudos de Insetos Sociais, UNESP
Heliana Clara Salles, Centro de Estudos de Insetos Sociais, UNESP
Maria Alice Da Cruz-Hofling, UNICAMP
Virginia P. L. Ferriani
Élcio O. Vianna
Yara Curi , Instituto Butantan
Marco Antonio Stephano, Faculdade de Ciências Faracêuticas - USP
Hisako Gondo Higashi
Ana Beatriz Rossetti Santos
Fabíola Reis Oliveira
Estudantes de pós-graduação
Ariana Campos Yang, Doutorado - FMUSP
83
Cíntia Arens, Mestrado - FMUSP
Fabiane Pomienciski, Mestrado - FMUSP
Ludmila Tais Yazbek Gomieiro, Mestrado - FMUSP
Samantha Carlos de Oliveira, Mestrado - FMUSP
Nicoli Baptista Barão Saidemberg, Doiutorado - UNESP
Paulo Cesar Gomes, Mestrado - FMUSP
Daniel Menezes Saidemberg, Mestrado - FMUSP
Alessandra Vaso Rodrigues, Mestrado - FMUSP
Fernanda Pessoa de Salles, Mestrado - FMUSP
Michelle Christiane Rodrigues Barbosa, Doutorado - FMRP
Patrícia Polles de Oliveira Jorge, Mestrado - FMRP
Maria Fernanda Ferraro, Mestrado - FMRP
Thais Nocitti, Mestrado - FMRP
Estudantes de graduação:
Virgínia M. Resende
José Roberto Pinto
Nathalia Batista Dias
Lorenzo Briganti
Colaboradores estrangeiros:
Terumi Nakajima, Hoshy University, Japão
Abba Kastin, Alabama University, EUA
Martin D. Chapman, Indoor Biotechnologis, Inc., Charlottesville, VA, USA
Fatima Ferreira-Briza, University of Salzburg, Austria
84
3. PLATAFORMAS
O Instituto de Investigação em Imunologia (iii) desenvolve um trabalho em rede para
a produção do conhecimento científico, visando traduzir os conhecimentos gerados na
pesquisa básica para a aplicação clínica. Aliado à pesquisa de tradução, compartilhamos
também os diferentes saberes dos integrantes desta rede para a formação e ensino de
alunos, técnicos e pesquisadores dentro do nosso Instituto. Para potencializar o trabalho em
rede e o treinamento de pessoal, desenvolvemos, ao longo desses anos de existência do iii,
diversas plataformas que possibilitam o funcionamento matricial com as diferentes linhas de
pesquisa temáticas. Na presente proposta contamos com 7 plataformas: 1. Imunogenômica,
2. Proteômica, 3. Epidemiologia e Ensaios Clínicos, 4. Produção de Imunobiológicos, 5.
Bioinformática, 6. Qualidade, e 7. Ensino e Interação com a Sociedade. Essas plataformas
atravessam praticamente todas as áreas temáticas do iii. Destacamos a importante inclusão
de propostas de interação com a sociedade, dentro da Plataforma de Ensino e Interação com
a Sociedade, na qual combinaremos atividades de divulgação com o compartilhamento de
conhecimento. Abaixo descrevemos sucintamente estas plataformas.
A. PLATAFORMA DE IMUNOGENÔMICA
Implantação do BIGiii - Banco de Informação Genética do iii
É crescente a compreensão de que o estudo da variação genética individual é de
vital importância na compreensão das patologias que afetam o ser humano, como salientado,
recentemente, em editorial da revista Science (24 de abril de 2008). Na busca de mapear a
suscetibilidade a doenças multifatoriais e poligênicas, um número muito grande de estudos,
publicados, em anos recentes, tem dado uma nova dimensão à diversidade genética
humana. Um bom exemplo é dos estudos conduzidos pela Wellcome Trust Case Control
Consortium. A avaliação dos genomas individualizados mostrou haver uma enorme
quantidade de variações na forma de polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) e também
estruturais, como adições, deleções, seqüências repetitivas. Por outro lado, há, nos diversos
genes estudados, combinações destas variantes formando haplótipos, que se distribuem
diferencialmente pelas diversas etnias (HapMap, 2005) e se mostram associados às
doenças.
Mesmo quando cada gene tem uma contribuição pequena no fenótipo, é importante
dissecar a somatória dos efeitos, pois a existência de múltiplos fatores genéticos e
ambientais leva grupos de pacientes a apresentar histórias clínicas e necessitar terapêuticas
individualizadas (Loscalzo et al., 2007). Assim, o estudo de um grande número de indivíduos
portadores de uma mesma doença e a comparação com outras enfermidades
correlacionadas, possibilita a identificação dos mecanismos fisiopatológicos importantes em
cada uma delas (Todd JA, 2006).
85
A análise do perfil genético na população brasileira é um desafio permanente, devido
não só ao alto grau de miscigenação que vem ocorrendo desde o início da colonização pelos
portugueses, mas também por um histórico de muitas correntes migratórias com distribuição
diversificada pelas regiões do país. A região de maior interesse, no contexto desta proposta,
é a região sudoeste, e, em especial, a região metropolitana da grande São Paulo. É desta
macrorregião que se origina a maioria dos pacientes registrados no Hospital das Clínicas da
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, portadores das doenças alvo dos
estudos do iii: atopia e alergia, febre reumática, AIDS, imunodeficiências, tumores, além do
grupo de transplantados. O plantel genético, nestes pacientes, inclui componentes
majoritários caucasóides, ameríndios e negros de diversas etnias, além da contribuição de
povos asiáticos e do Oriente Médio.
Integrantes da equipe do iii têm muitos anos de experiência na área de
suscetibilidade genética a doenças infecciosas e auto-imunes. Estes estudos foram
baseados no conceito de gene candidato, com escolha de polimorfismos, preferencialmente
com relevância funcional, em genes importantes na fisiopatologia destas doenças. Esta
abordagem é trabalhosa e o alelo mutante deve ser relativamente comum já que o poder de
identificar alelos de baixo risco (com razão de chances abaixo de 2,5) é limitado. No entanto,
efetuamos diversos estudos com sucesso, indicando que, se tomarmos certos cuidados no
momento de definir as populações em estudo (Bracken et al., 2002), podemos identificar
associações de interesse.
Conciliar as novas técnicas de varredura genômica com as restrições inerentes às
características genéticas e socio-econômicas no país é o desafio que aqui nos propomos a
enfrentar. Buscamos amealhar informação sobre genes de resposta imune, que nos permita
dissecar
a
suscetibilidade
genética
às
doenças,
evitando
varreduras
genômicas
generalizadas, de alto custo e que envolvem, de modo geral, estudos multicêntricos com
grande número de amostras.
Há enorme variabilidade presente nos genes de resposta imune, como apontado em
revisão recente (Lazarus et al., 2002). Dados obtidos no laboratório de Imunologia do InCor
ilustram a diversidade e complexidade presentes no perfil genético da população paulista.
Análise
de
haplótipos
da
região
do
MHC
(6p21),
englobando
uma
região
de
aproximadamente 2 MB, com dados de variantes polimórficas analisadas em apenas 7
0
genes (dados apresentados no 15 Workshop Internacional de Histocompatibilidade, 2008)
mostrou uma variabilidade alélica insuspeita em haplótipos já consagrados na literatura. O
polimorfismo nos genes ligados à resposta imune ainda está para ser mapeada em toda a
sua extensão e o projeto aqui delineado visa dar continuidade na aquisição deste
conhecimento e ao mesmo tempo, fornecer subsídios para estudos de suscetibilidade
genética a doenças, e em especial, as doenças que são o foco de estudos do iii. Identificar
os fatores genéticos envolvidos nos diversos aspectos da patogênese de uma doença, é
importante para se alcançar diagnósticos mais precisos, delinear novas estratégias
86
terapêuticas e no moderno campo da farmacogenômica, avaliar a resposta à imunoterapia e
às vacinas.
Assim, o objetivo principal desta plataforma é estabelecer o primeiro Banco Brasileiro
de Informação Genética em Imunologia (BIGiii), para aplicação no estudo de doenças típicas
do Brasil, numa primeira fase, em andamento no iii. Análise preliminar de tamanho amostral
indica que um N de 1000 amostras seja suficiente. Esse cálculo se baseia em SNPs já
analisados, ao longo dos últimos anos (22 SNPs em genes não-HLA), com freqüências do
alelo raro entre 3,3 e 43,5%. Essas amostras serão de 2 tipos, cada uma com um N de 500:
1) amostras pediátricas de sangue periférico, de indivíduos não relacionados, obtidas
durante estudo da coorte Butantan (plataforma de Epidemiologia, linha de pesquisa em asma
e alergia) e 2) amostras de sangue periférico de indivíduos adultos não relacionados, com
dados demográficos similares aos da população de pacientes em tratamento no complexo
hospitalar do HC-FMUSP. Coleta será feita obedecendo as diretrizes da resolução CNS 347
de 13 de janeiro de 2005. Os leucócitos resultantes serão submetidos à transformação por
EBV, com o intuito de perenizar a fonte de informação. O mapeamento dos polimorfismos
utilizará a plataforma Illumina (PI) em processo de aquisição pela pesquisadora Ester
Cerdeira Sabino. Para mapeamento de polimorfismos, a PI baseia-se no uso de SNPs tipo
"tag" (etiquetados), escolhidos conforme dados obtidos no HapMap Project. O painel para o
ensaio deverá ser preparado para incluir marcadores de ancestralidade (em torno de 50) e
genes candidatos para as diversas doenças em estudo pela equipe do iii. Os SNPs deverão,
na medida do possível, ser funcionalmente relevantes, localizados em genes para citocinas,
quimiocinas e respectivos receptores, genes de resposta inata como receptores tipo Toll e
KIR, moléculas de adesão e de "homing", entre outros. A previsão é de que cada array para
genotipagem por SNPs seja representativo de aproximadamente 300 genes. Na arquitetura
do banco, visando o uso posterior em estudos que incluem grupos de pacientes, está
prevista a sua interconexão com o prontuário eletrônico e com o banco de amostras, ambos
em fase de implementação pelo iii. Finalmente, haverá também conexão com as plataformas
de Bioinformática (ferramentas de análise), Epidemiologia e Ensaios Clínicos (estatística e
amostragem) e Ensino e relação com a sociedade (formação de recursos humanos).
Equipe:Anna Carla Goldberg (Coordenadora)
Maria Regina Cardoso Alves
Ester Cerdeira Sabino
Edécio Cunha-Neto
Sandro José de Souza
Estudantes de pós-graduação:
Amanda Farage Frade (Doutorado)
Outros membros da equipe:
Maria Lucia Carnevale Marin
Sandra Emiko Oshiro
87
B. PLATAFORMA DE PROTEÔMICA
Proteômica é o estudo de identificação funcional, caracterização estrutural e de
interação entre uma proteína alvo e outras proteínas que interagem com o “alvo”. Ela
trabalha com um conjunto de técnicas experimentais, que possibilita a identificação funcional
do complemento protéico completo, expresso pelo genoma de uma determinada célula.
Diferenças nos proteomas, tais como aqueles obtidos por células em diferentes estágios de
desenvolvimento, condições patológicas e/ou sob diferentes tipos de estímulos, podem
fornecer informações valiosas para a melhor compreensão dos mecanismos celulares
envolvidos e identificando proteínas–alvo para o desenvolvimento de drogas. A proteômica
reduz sensivelmente o tempo necessário para o desenvolvimento de novos produtos e
processos em biotecnologia. A arte desta ciência se baseia no limite da tecnologia, para
detectar, microseqüenciar e identificar um enorme número de proteínas de organismos
inteiros, tecidos e/ou células individuais. É uma ferramenta muito poderosa na comparação
de diferentes estados de um sistema biológico, como por exemplo células normais x doentes,
resistente x susceptível e trato positivo x normal. A proteômica se utiliza de tecnologia de
ponta em bioquímica e fisicoquímica para separar/fracionar proteínas, geralmente por
eletroforese 2D e/ou cromatografia líquida de alto desempenho multidimensional, seguida da
realização da “impressão digital protéica”, onde proteínas em quantidades muito reduzidas,
são digeridas por enzimas proteolíticas; os fragmentos gerados são identificados por suas
massas moleculares e microsequenciados por técnicas de ultima geração em espectrometria
de massas; os fragmentos de seqüências primárias conhecidas são utilizados numa busca
por alinhamento virtual com proteínas existentes nos bancos de proteínas, permitindo sua
identificação funcional.
Os grupos de Biologia Estrutural do CEIS/IBRC-UNESP e de Imunologia do InCor
têm colaborado no desenvolvimento de pesquisa e na formação de recursos humanos
altamente qualificados em analises proteômicas. Neste sentido, nos últimos anos investimos
(com recursos do CNPq e da FAPESP) na ampliação da capacidade de técnicas
de
separação de proteínas por eletroforese bidimensional e na montagem de uma facilidade
completa junto ao InCor: sistemas de eletroforese 2D-PAGE de alta performance, incluindo a
tecnologia DIGE - Eletroforese Bidimensional Diferencial (“Ettan™ DIGE System - 2-D
Fluorescence Difference Gel Electrophoresis”), sistema de processamento de amostras de
proteínas em gel robotizado, espectrometria de massas e bionformática proteômica).
Desta maneira, a plataforma de análises proteômicas foi introduzida horizontalmente
como ferramenta em diferentes abordagens experimentai dentro da linhas de pesquisas do
iii, atendendo a vários sub projetos tais como: alergia a venenos de insetos, cardiomiopatia
chagásica crônica, alergia a helmintos, febre reumática,leishmaniose, e transplante renal. A
existência de um conjunto de pessoas e equipamentos capazes de utilizar estas técnicas em
análise molecular e diagnóstico é fundamental, uma vez que a identificação precoce de
marcadores protéicos de susceptibilidade a doença, assim como os marcadores genéticos,
permitirá ações preventivas de saúde pública que podem economizar bilhões de dólares em
88
atenção secundária e terciária a saúde da população. E o desenvolvimento de métodos que
sejam adequados a população miscigenada como a brasileira só será possível se as
condições de pessoal e equipamento estiverem adequadas.
À despeito de todos os investimentos materiais que temos feito, o grupo ainda
necessita investir na plataforma proteômica, adquirindo um espectrômetro de massas,
porque a demanda de nosso projetos pelo uso de um instrumento de alta performance é
muito grande, uma vez que não dispomos deste tipo de espectrômetro em nosso
laboratórios. Como resultado deste fato, frequentemente temos enviado nossos estudantes
de pós-graduação ao exterior, em regimes de bolsa “curta duração”, para execução das
analises necessárias a seus projetos. Deve-se considerar que a demanda geral dos projetos
é muito grande, tornando muito elevados os custos de envio de estudantes ao exterior, além
do fato de que não estamos conseguindo formar nossos próprios recursos humanos aqui no
Brasil. A solução para este problema será a aquisição de um espectrômetro de massas do
tipo MALDI-TOF-TOF para a plataforma de proteômica.
Equipe:
Mario Sergio Palma (coordenador)
Edecio Cunha Neto
Bibiana Monson de Souza
Lucilene Delazari dos Santos
Lilian Mari M. Cesar-Tognolli
Roberta Nocelli
Heliana Clara Salles
Pós-graduandos:
Priscila Teixeira-Doutorado
Nicoli Baptista Barão Saidemberg-Doutorado
Paulo Cesar Gomes-Mestrado
Daniel Menezes Saidemberg-Mestrado
Alessandra Vaso Rodrigues-Mestrado
Fernanda Pessoa de Salles-Mestrado
Técnico Superior:
Andréia Kuramoto
89
C. PLATAFORMA DE EPIDEMIOLOGIA E ENSAIOS CLÍNICOS
O desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas envolvendo biotecnologia
(terapia gênica, anticorpos monoclonais, terapias celulares, proteínas recombinantes, etc.)
sofreu uma grande e rápida expansão nos últimos anos, com algumas centenas de novas
estratégias sendo testadas clinicamente, principalmente em áreas como câncer, doenças
auto-imunes e transplantes. Entretanto, este avanço vem ocorrendo predominantemente em
países de renda elevada e grande experiência científica acumulada, em termos de infraestrutura e recursos humanos altamente qualificados.
No Brasil, há escassez de articulação de recursos humanos e tecnológicos
necessários para desenvolver produtos promissores e realizar todas as fases necessárias,
incluindo a de ensaios clínicos, inclusive fases 1 a 3, para viabilizar esses produtos na órbita
da saúde pública e em escala comercial. No entanto, esses recursos existem no país, e
pretendemos integrá-los em nossa proposta (Azevedo et al., 2007).
Para enfrentar tais questões sugerimos, portanto, a estruturação de uma plataforma
de epidemiologia e ensaios clínicos, que irá articular os diversos níveis de produção e os
produtos elaborados pelas demais plataformas que compõem a presente proposta,
permitindo que cada pesquisador da rede seja auxiliado e tenha suporte na estruturação dos
ensaios clínicos que estão sendo planejados e nos que já estão em andamento. Além disso,
esta plataforma deverá contribuir também para a qualidade dos estudos desenvolvidos pelo
iii que utilizam outros desenhos de estudo (estudos de coorte, caso-controle, etc.). O que se
pretende com a rede é estruturar uma linha de desenvolvimento de produtos de
biotecnologia, com testes in vitro, produção, ensaios pré-clinicos e clínicos. O produto em
questão será diferente em cada ocasião, porém a estrutura utilizada será comum.
O protocolo necessário para se construir um dossiê sobre um produto derivado de
biotecnologia é extenso e envolve múltiplos testes que descrevam toxicidade, ação, eficácia,
farmacologia, características químicas, moleculares, métodos de preparação, produção, etc.
Desta forma, torna-se inviável para um pesquisador interessado em desenvolver
determinado produto derivado de biotecnologia implantar, isoladamente, uma estrutura
complexa e dispendiosa para um único produto. Portanto, é necessária a implantação de
estruturas multi-usuários que possam ser utilizadas por redes de pesquisadores no
desenvolvimento de cada produto.
Além disso, há diversas etapas envolvidas no planejamento e condução de ensaios
clínicos de acordo com as boas práticas clínicas. Assim, grupos de pesquisadores
interessados e com experiência no assunto poderão tornar o processo de estruturação,
redação e implementação de um protocolo de pesquisa clínica mais eficiente, melhorando a
qualidade dos ensaios clínicos.
As normas internacionais de como um produto deve ser desenvolvido estão sendo
unificadas pela Europa, Estados Unidos e Japão (vide International Conference on
Harmonization for Development of Pharmaceutical Products www.ich.org). Portanto, um
produto
que
vise
ao
mercado
mundial
deve
seguir
normas
internacionais
de
90
desenvolvimento, para que possa ser aprovado pelas agências reguladoras de cada país.
Atualmente, as normas para o desenvolvimento de um produto estão sendo estruturadas
pela legislação brasileira e a tendência é cada vez mais haver sincronização das exigências
brasileiras com as exigências internacionais. Há poucos centros capacitados a desenvolver
produtos e pouca experiência nacional no assunto. Há também diferenças grandes entre o
desenvolvimento de produtos derivados de biotecnologia e drogas clássicas e estas
diferenças devem ser abordadas e novos recursos humanos habilitados para tal
desenvolvimento devem ser formados.
Os avanços da genômica e proteômica, componentes centrais da presente proposta,
colocam ainda desafios complexos aos conceitos, desenhos e métodos de análise
habitualmente utilizados em epidemiologia e estatística. Novos desenhos vêm sendo
propostos, como os estudos “case-only” (Botto e Khoury, 2004), assim como novas
metodologias estatísticas, intensivas em recursos computacionais, apropriadas para a
análise de bancos de dados de imensas dimensões, estrutura complexa e que violam
pressupostos centrais da estatística clássica, como o da independência das observações
(Chen et al., 2007).
Considerando que a missão do iii é elevar a imunologia clínica brasileira ao mais alto
padrão internacional e que uma das plataformas centrais da presente proposta refere-se à
formação e ensino, a plataforma de epidemiologia e ensaios clínicos também deverá
contribuir para esta meta por meio de programas de capacitação dos profissionais e alunos
em métodos epidemiológicos e estatísticos, básicos e avançados.
Objetivos
Coordenar os esforços dos pesquisadores envolvidos no iii visando à elaboração de
planos de desenvolvimento de produtos e linhas de pesquisa auxiliares. Propomos reunir a
experiência acumulada dos vários pesquisadores do iii para criar planos de desenvolvimento
de produtos que permitam estabelecer as metas e a tomada de decisões para iniciar e
continuar com as fases de pesquisa clínica iniciais de produtos durante o período de vigência
da proposta. Aqui serão reunidos conhecimentos de cientistas da área básica, clínicos,
cirurgiões, epidemiologistas e especialistas em pesquisa clínica para proporem o avanço do
conhecimento para fases clínicas de desenvolvimento.
Manter e expandir a Unidade de Pesquisa Clínica da Disciplina de Imunologia Clínica
e Alergia para conduzir ensaios clínicos com produtos candidatos em fases 1 a 3. A partir da
Unidade já estabelecida, pretendemos manter as atividades dentro dos mais rigorosos
padrões de boas práticas clínicas e expandir em resposta a demandas que forem emergindo
da linha de desenvolvimento de novos produtos a partir dos grupos envolvidos no iii.
91
Criar uma estrutura compartilhada de desenho de estudos, administração e análise
de dados e garantia de qualidade em pesquisa clínica. A plataforma de epidemiologia e
ensaios clínicos será uma estrutura de confluência das necessidades regulatórias, analíticas
e de desenvolvimento metodológico de forma a garantir que o planejamento, condução e
análise dos estudos clínicos sigam normas internacionais de qualidade e permitam a
utilização em âmbito internacional de seus produtos.
Plano de trabalho
Coordenar os esforços dos pesquisadores envolvidos no iii na elaboração de planos
de desenvolvimento de produtos e linhas de pesquisa auxiliares.
As atividades realizadas nos diferentes grupos têm proporcionado oportunidades
extraordinárias para desenvolvimento de novos produtos. Nesse componente pretendemos
coordenar esforços de diferentes profissionais para otimizar o debate na formulação de
propostas de planos integrais de desenvolvimento de produtos que contemplem as áreas
pré-clínicas, de produção, imunológica, clínica, e de assuntos regulatórios. Serão
considerados o potencial de segurança, tolerabilidade, eficácia e viabilidade de custo e
escalas de produção sob Boas Práticas de Manufatura.do produto candidato. Os planos
farão o acompanhamento do produto em todas as áreas mencionadas, desde o processo de
decisão de avançar aos testes clínicos até as primeiras fases de desenvolvimento.
Os
planos contemplarão metas para decisões avanço ou parada (“go / no go decisions”) no
desenvolvimento do produto para uma aproximação racional da decisão de continuar o
investimento em um determinado produto candidato.
Manter e expandir a Unidade de Pesquisa Clínica da Disciplina de Imunologia Clínica
e Alergia para conduzir ensaios clínicos com produtos candidatos em fases 1 a 3.
Desde 2007, membros do iii vêm trabalhando para estabelecer a Unidade de
Pesquisa Clínica na Disciplina de Imunologia Clínica e Alergia da Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo. Desde Julho de 2008, a Unidade possui certificação
internacional e está preparada para acolher os projetos das etapas de desenvolvimento
clínico propostos.
A constituição da equipe da Unidade de Pesquisa Clínica está apresentada na
Figura abaixo:
92
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Estrutura da Unidade de Pesquisa Clínica (descrita no final dessa plataforma)
Plano de qualidade: Todas as atividades clínicas a serem desenvolvidas na
Unidade adotam o Manual de Qualidade, aprovado pelos profissionais envolvidos na tarefa e
o coordenador da Unidade. Esse plano foi também aprovado pelos National Institutes of
Health e pela PPD Development, Inc., ambos envolvidos nas auditorias para liberar a
Unidade para realizar projetos financiados por agências de fomento internacionais. O Manual
de Qualidade está disponível para acesso de toda a equipe envolvida com a pesquisa,
agências regulatórias e financiadoras dos projetos.
Plano de manuseio de dados: Todos os dados clínicos obtidos nos projetos
seguem normas operacionais padrão para armazenamento. Os dados seguem as normas de
proteção da confidencialidade dos dados pessoas de todos os voluntários envolvidos nos
projetos.
Plano de Farmácia: O Plano Geral da Farmácia foi implantado no primeiro semestre
de 2008. A partir desse plano, são gerados Planos Específicos para cada um dos protocolos
de pesquisa. Cada protocolo só tem início após a aprovação de seu plano específico, que
aborada todas as questões de obtenção do produto, armazenamento, preparação,
administração e/ou distribuição e controle do uso.
Documentação: Todos os documentos regulatórios são mantidos em arquivos
gerais do centro ou específicos para cada protocolo. Esses documentos são guardados em
armários dentro da Unidade e são mantidas cópias de segurança fora das dependências da
Unidade, para assegurar sua integridade em caso de acidentes (um incêndio, por exemplo).
São também mantidos registros de todas as certificações individuais e treinamentos
específicos dos profissionais envolvidos nos projetos de pesquisa clínica.
Procedimentos Operacionais Padrão e Operações Diárias: Virtualmente, todos
os procedimentos repetidos realizados na Unidade, ações específicas da administração,
93
atividades médicas e atividades laboratoriais contam com Procedimentos Operacionais
Padrão (POPs). Eles são revisados e implementados pelo coordenador da Unidade. Nossa
experiência mostra que a qualidade de todas as etapas do trabalho será proporcional à
capacidade de aderir aos procedimentos ditados pelos POPs. Esses POPs têm sido revistos
e aprovados pelo NIH e pela PPD, atendendo às exigências de ambos. Todos os POPs
possuem prazos de validade e novas versões devem passar por novas etapas de revisão e
aprovação.
Treinamento: Os profissionais da Unidade de Pesquisa Clínica passam por
freqüentes treinamentos. Todos são certificados na execução de normas de boas práticas
clínicas. Cada profissional também recebe treinamento específico, de acordo com sua
função. Os certificados de treinamento são mantidos nos arquivos da Unidade. Dependendo
do tipo de treinamento, é exigida sua revalidação periódica.
Cadeia de responsabilidades e processo de tomada de decisão: A administração
de uma Unidade de Pesquisa Clínica requer a capacidade de adaptar a um ambiente
altamente
dinâmico.
patrocinadores,
A
demanda
financiadores,
gerada
instituições
pelas
diferentes
envolvidas,
partes
comunidade,
interessadas,
procedimentos
específicos para cada protocolo e agências regulatórias evolui rapidamente e deve ser
atendida. A Unidade está implementando um Plano de Gerenciamento Estratégico para
assegurar que tais expectativas serão atendidas. Ele irá permitir que a Unidade traduza a
estratégia em termos operacionais, alinhe o grupo de profissionais de forma sinérgica,
estabeleça estratégias de trabalho e garanta a revisão contínua do processo. Isso pode ser
conseguido pelo estabelecimento de um sistema de revisão da estrutura que considere as
métricas da estratégia para todos os envolvidos e interessados na pesquisa. Já temos,
inclusive, um processo sistemático de reuniões para revisão de metas e resultados.
Relação com a comunidade e educação comunitária. Todas as atividades
realizadas nessa plataforma serão conduzidas em interação contínua com representantes da
comunidade. As atividades envolvendo essa interação estão descritas na plataforma de
Ensino e Relação com a Comunidade.
Criar uma estrutura compartilhada de desenho de estudos, administração e análise
de dados e garantia de qualidade em pesquisa clínica.
Será montada uma estrutura unificada compartilhada visando oferecer serviços de
apoio necessário em desenho de estudos, administração e análise de dados e garantia de
qualidade em pesquisa clínica para o desenvolvimento das diferentes linhas de pesquisa e
atividades
do
iii.
Esta
estrutura
permitirá
maior
eficiência
no
cumprimento
de
responsabilidades de promotor em cada um dos projetos e linhas de pesquisa atendendo as
exigências de qualidade ética e de dados necessária no desenvolvimento de produtos e
requerida pelas autoridades regulatórias brasileiras e estrangeiras. Ênfase será dada a
tópicos relacionados ao desenho e implementação de mecanismos de administração
94
eficientes que permitam coleta de dados confiáveis, implementação de sistemas de
farmacovigilância, e garantia de qualidade de processos de planejamento e condução dos
estudos clínico-epidemiológicos.
Adicionalmente, pretende-se desenvolver atividades de educação à distância,
abordando tópicos básicos de epidemiologia, estatística e Boas Práticas Clínicas,
estabelecendo uma interface também com o desenvolvimento do módulo de redação de
artigos científicos. Os seminários, cursos e módulos de educação à distância serão
coordenados pelos epidemiologistas do iii, em colaboração com colegas da Universidade da
Califórnia, Berkeley, e com participação de professores convidados (brasileiros e
estrangeiros) e bolsistas de pós-graduação e pós-doutorado.
EQUIPE
Esper G. Kallás
Francisco Inácio Pinkusfeld Monteiro Bastos
Maria Regina Alves Cardoso
Guilherme Loureiro Werneck
Dr Ricardo Palácios, colaborador da presente proposta, atuará como Coordenador
Clínico dos projetos de pesquisa clínica. É médico e doutor em Infectologia e tem agido
como coordenador geral de centros de pesquisa clínica em projetos financiados pelo NIH
junto com o Dr. Kallas. Desde 2001 colabora habitualmente com a Iniciativa de Pesquisa em
Vacinas e o Programa de Pesquisa em Doenças Tropicais da Organização Mundial da
Saúde (WHO/IVR e WHO/TDR, respectivamente) como Monitor Clínico, Auditor e
Coordenador Regional em diversos estudos clínicos. Também assessorou o Instituto de
Inmunologia del Valle, em Colômbia, no desenvolvimento de ensaios clínicos de fase I e
criação de testes de desafio (“challenge studies”) para candidatos a vacina contra
Plasmodium vivax.
95
D. PLATAFORMA DE PRODUÇÃO DE IMUNOBIOLÓGICOS
Desenvolvimento de imunobiológicos:
O iii, como fruto de projetos desenvolvidos dentro dos Institutos do Milênio, conta
com um portfólio considerável de bioprodutos promissores para uso clínico. Entre as
vantagens do iii para o desenvolvimento desses produtos podemos destacar a inovação
tecnológica, acesso a hospitais e médicos especializados e acesso a pacientes. O
desenvolvimento de imunobiológicos é uma das prioridades da política industrial brasileira
(PITCE) e o mercado brasileiro requer novos medicamentos fabricados no País para reduzir
importações.
Os imunobiológicos resultantes de projetos do iii (7, descritos a seguir, em diferentes
formulações) são de natureza recombinante ou são peptídeos sintéticos. Para a expressão
de proteínas recombinantes geralmente o sistema bacteriano é o preferido, pela
conhecimento acumulado e flexibilidade. Contudo, para obter a resposta clínica desejada a
proteína deve ser ativa in vivo e estar disponível pelo tempo necessário à sua ação.
Sistemas de expressão mais complexos, como células de mamíferos, devem ser
considerados, levando em conta a complexidade estrutural da molécula, configuração e
modificações pós-traducionais, sendo a glicosilação uma das mais importantes. A via de uso,
injetável, oral ou tópico, representa outra forma de determinar qual a célula hospedeira
adequada. O uso profilático, em vacinas recombinantes ou de DNA, indica a utilização de
sistemas bacterianos. Células de mamíferos representam, muitas vezes, a escolha para
proteínas terapêuticas. Cada caso de desenvolvimento para uso clínico precisa ter suas
características estudadas desde o início, para aumentar a chance de sucesso.
Outro aspecto importante no desenvolvimento de processos produtivos é a escala
pretendida. Bactérias crescem muito mais rápido que células de mamíferos, com melhor
rendimento. As últimas, por outro lado, sintetizam moléculas solúveis no sobrenadante de
cultura, facilitando o processo. É interessante que a perspectiva de levar um produto ao
ensaio clínico seja pensada desde o início, adequando a escala de bancada ao
escalonamento.
A cinética de produção e a estabilidade da molécula são parâmetros utilizados para
identificar o modo de cultivo, por batelada ou contínuo em perfusão, de forma imobilizada ou
em suspensão. Bactérias e leveduras são geralmente cultivadas por agitação em batelada
ou batelada alimentada, às vezes com a adição de algum elemento indutor ao meio de
cultura. Para o cultivo de células de mamíferos existem várias opções, que dependem do tipo
da célula, da produtividade, complexidade estrutural e estabilidade da molécula.
Produtos expressos em bactérias serão obtidos por fermentação em batelada, nos
meios de cultura apropriados a cada caso, em planta GMP que será instalada nas
instituições do setor público e privado citadas em cartas disponíveis para consulta
(www.iii.org.br/info). Em princípio os resultados promissores obtidos em bancada serão
levados ao aumento de escala, dependendo da quantidade necessária e da produtividade do
clone. Os parâmetros serão modificados conforme a necessidade e em função dos
96
resultados, não sendo possível prever a priori as modificações. Produtos expressos em
células de mamíferos terão o desenvolvimento de produção em condições GMP no Lab. de
Anticorpos Monoclonais, I.Butantan. Peptídeos selecionados serão sintetizados com um
sintetizador múltiplo de fase sólida Apex 396, utilizando a metodologia FMOC (Atherton E et
al. 1989). Os acoplamentos serão realizados na direção usual de carboxi para o amino
terminal sobre a resina TGR (King DS et al. 1990). A qualidade dos peptídeos será analisada
por HPLC e Ettan Pro Maldi-Tof Mass Spectometer. Os sintetizadores estão localizados na
unidade de síntese de peptídeos do Instituto do Coração-Faculdade de Medicina, e no ICB,
USP. Para síntese de peptídeos em condições GMP para administração em humanos
(ensaios clínicos) prevemos instalar equipamentos certificados (Endevour 90, Apptec) dentro
de área do InCor, em ilhas de trabalho com ar filtrado.
A plataforma de produção de imunobiológicos prevê a produção de proteínas
recombinantes em bactérias e células de mamíferos, humanização e produção em escala
piloto de anticorpos monoclonais, produção de peptídeos sintéticos com fins vacinais, síntese
de peptídeos para ensaios in vitro, além da possibilidade de outros reagentes
imunobiológicos. A coordenação da plataforma está a cargo de Ana Maria Moro que tem
mais de 10 anos de experiência nesta área.
Estudos pré-clínicos:
A evolução rápida dos biofármacos, observada principalmente nos últimos 10 anos,
exige por parte das agências regulatórias do mundo inteiro uma estratégia rápida de
verificação da eficiência, mas principalmente da segurança destes novos produtos
farmacêuticos. Assim, apesar de um estudo pormenorizado caso a caso, há uma tendência
mundial em requerer-se um conjunto de testes mais específicos para biofármacos
procurando agilizar e reduzir custos ao longo da cadeia produtiva dos mesmos. Tem sido
considerado um consenso internacional o mínimo de realização dos seguintes ensaios: 1.
Reação local com avaliação clínica e histopatologia detalhada (incluindo colorações
específicas para cada caso); 2. Toxicidade sistêmica (em uma espécie roedora e outra não
roedora), com realização de hemograma, leucograma, análises de bioquímica sérica,
anatomopatologia e histopatologia completa (semelhante a um protocolo de Toxicidade com
doses repetidas / 28 dias – OECD 407/408/409); 3. Estudos para a verificação da
capacidade imunotoxicológica do novo bioproduto, seja um medicamento ou uma vacina
(semelhante ao protocolo S8 – Immunotoxicological studies for human pharmaceuticals –
ICH). Outros estudos poderão ser sugeridos e realizados segundo determinação das
agências regulatórias levando em consideração especificidades e características de cada
novo produto farmacêutico e sua proposta de utilização. O Pesquisador Luiz Carlos de Sá
Rocha é o responsável por estudos pré-clínicos.
97
Pipeline de imunobiológicos:
VACINA ANTI-ESTREPTOCOCO BETA-HEMOLÍTICO DO GRUPO A: Com potencial de
agente vacinal e agente terapêutico, conta com patentes registradas no INPI e PCT e
atualmente em fase de registro em 11 países Encontra-se atualmente em fase pré-clínica
para análise de resposta imune e desafio em camundongos e mini-pigs, na formulação de
peptídeo sintético. Não há produtos concorrentes com a mesma composição. Paralelamente,
os produtos recombinantes expressos em E.coli em forma solúvel serão produzidos por
fermentação em condições GMP em área classificada.
VACINA DE DNA PARA HIV: A presente vacina, ao contrário das demais já testadas
clinicamente, está baseada num desenho inovador e racional contendo epitopos
conservados e promíscuos.Trata-se de vacina indutora de imunidade celular contra o HIV,
que pode ter uso profilático ou terapêutico. Encaixa-se no conceito de necessidades médicas
não atendidas. Possui patente no INPI, USPTO (EUA) e EPO (Europa). Necessita de testes
pré-clínicos. Concebido como produto produzido em E.coli, encontra-se em estudo para
produção em células VERO infectadas com vírus da febre amarela recombinante, contendo o
DNA da vacina para HIV após otimização de códons. Enquanto produto de E.coli pode ser
produzido em regime de campanha na mesma planta mencionada acima. No caso de
produção em células VERO os potenciais parceiros são Instituto Butantan e BioManguinhos.
Existe outro produto em pipeline para ser produzido em forma de peptídeo sintético.
PROTEÍNA/PEPTÍDEO HIG-2. O gene HIG2 (hypoxia-induced gene 2), da via Wnt/betacatenina, tem sua expressão aumentada em células T CD4+ de memória de pacientes HIV+
progressores lentos; foi observado que sua expressão tem correlação negativa com o
número de células T CD4+ circulantes em pacientes soropositivos, e ele induz proliferação
de linfócitos T CD4+, ligando-se ao receptor Frizzled. Ele pode ser um regulador
homeostático hipotético do número de células T CD4+ na infecção pelo HIV, com o efeito de
refrear a queda nos linfócitos T CD4+ que ocorre na evolução para AIDS; potencializar seu
efeito seria, portanto desejável em pacientes cronicamente infectados pelo HIV. Sabemos
que um peptídeo sintético de 35 aminoácidos, correspondente à proteína, subtraída do
peptídeo sinal, tem ação biológica e ligadora de receptores. Tencionamos produzir o
fragmento ativo do HIG-2 em condições GMP, na forma de peptídeo sintético e de proteína
recombinante produzida em células de mamífero, para uso testes pré-clínicos (aproveitando
a grande conservação evolucionária nesta molécula, entre humanos e camundongos) e
eventual uso em ensaios clínicos.
ANTICORPO MONOCLONAL HUMANIZADO ANTI-CD3: Na forma original murina tem sido
utilizado como agente de controle de rejeição de transplantes desde 1985. Capaz de modular
respostas imunes celulares ao se ligar ao alvo CD3 presente em linfócitos, a forma
98
humanizada tem uso potencial mais amplo na indução de tolerância em doenças autoimunes, além dos transplantes. Anticorpos monoclonais representam hoje o segundo maior
mercado de biofármacos, com projeção de mercado de 30bi dólares para 2010. Com a
seqüência gênica do anti-CD3 humanizado pronta, estamos na fase de expressão estável
em células CHO para posterior escalonamento de processo de produção e início de testes
pré-clínicos e/ou clínicos. O produto será obtido pelo cultivo contínuo da célula CHO em
biorreatores em área limpa classificada já existente no Lab. de Anticorpos Monoclonais do
I.Butantan, que desenvolveu o processo de produção do anti-CD3 murino há vários anos.
ALÉRGENOS RECOMBINANTES Der p 1 e Der p 2: A imunoterapia alérgeno-específica é
eficaz para o tratamento de asma e rinite causadas por ácaros, e é o único tratamento capaz
de modificar a história natural dessas doenças promovendo controle dos sintomas a longo
prazo. Aproximadamente 80% dos nossos pacientes alérgicos a ácaro são sensibilizados
aos alérgenos principais Der p 1 e Der p 2. Uma vacina com Der p 1 (não glicosilado, com
remoção da seqüência pro) e Der p 2 recombinantes, será preparada em condições GMP,
para uso em ensaio clínico para avaliar eficácia e segurança em pacientes com asma e
rinite. O uso dessa vacina será investigado como tratamento adjuvante de pacientes com
asma moderada e rinite, alérgicos a ácaros, fazendo uso contínuo de corticosteróide
inalatório e beta2-agonista de ação prolongada, através de estudo duplo-cego, controlado
com placebo. Será o primeiro estudo realizado no mundo utilizando alérgenos recombinantes
de ácaros para imunoterapia alérgeno-específica, que poderá resultar em tratamento mais
eficaz de asma e rinite, com potencial de beneficiar uma grande quantidade de pacientes que
sofrem com essas doenças. Para esse estudo inicial envolvendo 80 pacientes por período de
2 anos e meio serão necessárias quantidades de 100 mg de cada um dos alérgenos, a
serem produzidas sob condições GMP.
PROTEÍNAS DE CHOQUE TÉRMICO (HSP)/PEPTÍDEOS: As proteínas constitutivas HSP
têm sua expressão aumentada em condições de estresse. HSPs são reconhecidas pelo
sistema imune e respondem com respostas pró-inflamatória ou imunorreguladora em várias
doenças. Existem vários estudos clínicos em andamento pelo mundo com diferentes HSPs e
em diversas doenças, porém não nenhum estudo clínico em transplante de órgãos, situação
em que acreditamos poder haver indução de tolerância ao enxerto por peptídeos que
identificamos e estamos testando em camundongos. Atualmente expressas em E.coli,
estamos identificando outros sistemas de expressão, inclusive células de mamíferos, para
contornar o problema de contaminação por endotoxinas. Dependendo do sistema escolhido,
serão utilizadas as condições GMP de uma ou outra estrutura (campanha da planta piloto
para bactérias recombinantes ou células de mamíferos no I.Butantan). Peptídeos sintéticos
serão produzidos em planta definida para essa finalidade.
99
VACINAS CONTRA LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA: Controlar a infecção por
L.donovani/L.chagasi no hospedeiro canino representa uma das formas mais importantes de
controlar a infecção humana. A vacina contém uma composição de elementos que estão
para ser patenteados e não podem ser descritos no momento. Os resultados em hamsters e
os dados preliminares em cães são promissores. A vacina está na fase de validação
utilizando como desafio vetores de transmissão naturalmente infectados. O processo de
produção da vacina vai atender as normas para vacinas veterinárias e assim será
identificado um parceiro para a produção em fase piloto.
Equipe
Pesquisadores do iii
Responsável: Ana Maria Moro – Instituto Butantan
Luísa Guilherme – InCor-FMUSP
Edécio Cunha Neto – InCor-FMUSP
Verônica Coelho – InCor-FMUSP
Luísa Karla Arruda – FMRP-USP
Aldina Barral – FIOCRUZ-Bahia
Mario Palma – UNESP-Rio Claro
Marcelo Brígido – UnB-Brasilia
Andréa Q. Maranhão-UnB-Brasília
Luiz Carlos de Sá-Rocha – FMVZ-USP
Colaboradores
Maria Teresa A. Rodrigues - IBU
Angélica Garbuio - IBU
Flávia Serpieri - IBU
Roselaine C. Targino - IBU
André Inocêncio - IBU
José Marcelino de Oliveira - IBU
Dirceu C. Bertolino - IBU
100
E. PLATAFORMA DE BIOINFORMÁTICA
A missão do Instituto de Investigação em Imunologia é baseada no desenvolvimento
de novas terapias e biofármacos e sua apliação clínica. Nesses procedimentos é comum a
defrontação de situações onde a análise experimental pode ser apoiada por uso de técnicas
de bioinformática. Essas técnicas permitem a análise de um grande número de dados de
seqüências biológicas com processamento de alto desempenho. A Bioinformática é uma
disciplina nova e é interpretada, num amplo contexto, como sendo a aplicação de modelos
matemáticos aliados ao desenvolvimento e aperfeiçoamento de técnicas computacionais de
processamento, armazenamento e de transmissão de dados de alto desempenho, para fins
de entendimento de seqüências e estruturas biológicas. Nela estão incluídos métodos para
analisar grandes bancos de dados de informação genômica e proteômica, tais como:
seqüências de DNA, dados de expressão de DNA em micro-arranjos, seqüências protéicas,
além de dados para a predição de estrutura tridimensional em macromoléculas biológicas.
As pesquisas teóricas abrangidas por essa plataforma incluirão: alinhamento de
seqüências gênicas e protéicas; descoberta de genes, detecção de genes relacionados a
doenças humanas; predição e determinação de estrutura tridimensional de proteínas;
predição de epitopos para linfócitos T; estudos da relação entre estrutura e função de
proteínas; estudo da interação proteína-proteína; estudo da interação proteína-ligante;
desenho de drogas baseado em estrutura tridimensional; caracterização de domínios
funcionais e estruturais em seqüências de DNA; reconstrução da história evolutiva de
espécies modernas; quantificação da diversidade genética em populações naturais e
agrupamento de dados de micro-arranjos e suas estatísticas; identificação de vias
moleculares envolvidas.
Nosso objetivo nesta plataforma de bioinformática é respaldar os vários grupos
relacionados ao Instituto com apoio logístico e formativo. A plataforma deverá propor
procedimentos e abordagens que melhorem a qualidade do dado experimental ou mesmo
subsidiar os grupos com alternativas metodológicas que ajudem a confirmar os dados
experimentais. Além disso, a plataforma tentará detectar necessidades específicas de
formação entre os participantes de cada grupo e proporá cursos de atualização e ou
formação.
Apesar da atividade da plataforma de bioinformática ter, fundamentalmente, um
caráter norteador e de formação, ela também contará com um estrutura computacional já
implementada no Laboratório de Bioinformática do Instituto Ludwig de Pesquisas sobre o
Câncer e no Laboratório de Biologia Molecular de UnB. Essa estrutura estará disponível para
implementar rotinas e serviços temporários ou não para a resolução de problemas
computacionais relativos aos projetos do Instituto.
Equipe
Responsáveis: Marcelo de Macedo Brígido (UnB) e Sandro José de Souza (ILPC)
Aluno de pós-graduação: Roberto Ternes Arrial (Doutorado, UnB)
101
F. PLATAFORMA DE QUALIDADE
Desde o início do iii, os grupos envolvidos trabalham para aprimorar a qualidade do
trabalho. As reuniões regulares sempre dedicaram sessões específicas para discutir o
assunto e várias propostas foram, inicialmente, implementadas. Entre elas, a adoção de
normas comuns de adoção de procedimentos operacionais padrão e a organização de
documentação científica e o registro de dados experimentais de acordo com normas
internacionais. .
A partir de 2008, iniciou-se um projeto piloto de implantação de normas de boas
práticas laboratoriais (BPL) em um dos laboratórios participantes. A experiência revelou que,
embora se trate de um longo e difícil processo, é fundamental a busca da qualidade no
desenvolvimento do conhecimento científico, incluindo em instituições acadêmicas. A partir
dessa experiência, estamos propondo uma série de ações para estender essa experiência
para todos os grupos do iii.
Nesta nova fase do nosso Instituto, estão sendo propostos estudos que irão avaliar o
potencial de alguns produtos em ensaios clínicos de fase I e fase II. É imprescindível,
portanto, adotar as recomendações de boas práticas clínicas (BPC) para realizar os projetos.
O grupo de investigadores do iii já realiza pesquisa clínica há muitos anos. Desde 2008, foi
estabelecida uma Unidade de Pesquisa Clínica na Faculdade de Medicina da Universidade
de São Paulo para realizar ensaios clínicos sob rigorosas normas nacionais e internacionais.
Em agosto de 2008, o centro foi aprovado e registrado no National Institutes of Health (NIH)
para conduzir projetos de pesquisa clínica, após várias etapas de auditoria. A partir desse
projeto, propomos estender o treinamento em GCP para todos os centros envolvidos no iii
que proponham realizar pesquisa clínica em humanos.
A seguir, serão delineadas as estratégias para atingir tais metas.
Objetivos
1. Boas Práticas Laboratoriais: Disseminar os conceitos de BPL para todos os
laboratórios envolvidos no iii e criar os meios para implementar tais padrões. Verificar a
implantação de tais metas durante a condução do projeto.
2. Boas Práticas Clínicas. Manter e aprimorar o padrão de qualidade e observação
das BPC no iii, obedecendo às normas nacionais e internacionais, utilizando a estrutura da
FMUSP para expandir as outras unidades do iii.
Plano de trabalho
1. Boas Práticas Laboratoriais:
Desde o início da constituição do iii temos trabalhado e discutido as muitas formas
de atingir os padrões de BPL nos laboratórios envolvidos. Além dos diferentes fóruns de
debate e várias iniciativas pontuais, iniciamos um projeto piloto no Laboratório de
Investigação Médica 60 de implantação de BPL, que deverá concluir sua etapa de
102
implementação até o fim de 2008. Esse projeto piloto servirá como modelo para multiplicar a
experiência aos outros laboratórios do iii de acordo com o plano a seguir:
Treinamento e engajamento dos investigadores principais: Ficou bastante claro no
projeto piloto que, antes mesmo de discutir a implementação da BPL, é necessário que os
pesquisadores responsáveis por cada grupo entendam a necessidade e estejam dispostos a
oferecer apoio ao processo, envolvendo toda sua equipe nesta forma de trabalho. Sem esse
engajamento, a adequação a BPL não atinge seu objetivo. Iremos, portanto, iniciar reuniões
com os responsáveis para debater o assunto e conscientizar sobre a necessidade das BPL.
Em seguida, estabeleceremos estratégias para implantarmos BPL nos grupos interessados.
Dada as características do iii, é natural esperar que os vários laboratórios sejam
heterogêneos em sua estrutura e motivação. Não é possível, portanto, imaginar que um
projeto único será capaz de atender às necessidades de laboratórios individuais. É
fundamental fazer o diagnóstico da realidade de cada grupo e cada laboratório para
assegurar qual o nível de complexidade e adequação de cada proposta. A implantação da
qualidade é um processo que precisa atender às necessidades de cada local. A partir dessa
etapa, serão propostos os projetos individuais.
Diligência para diagnóstico da situação dos laboratórios interessados: Desde o início
de 2008, temos trabalhado sob a consultoria de especialista em qualidade de laboratórios.
Serão feitas diligências diagnósticas da situação dos laboratórios interessados para traçar
um plano de objetivos e metas.
Elaboração e implementação do Plano de Ação: A partir do diagnóstico, será
elaborado um Plano de Ação, envolvendo o delineamento da missão do grupo e sua política
de qualidade, criação do Grupo de Qualidade e elaboração do plano de treinamento. A
seguir, serão iniciados o plano de treinamento, criados o Manual de Qualidade e o de
Biossegurança e a montagem dos Procedimentos Operacionais Padrão.
Criação dos Grupos de Auditoria Interna e Externa: Após encerrada a fase de
criação dos Procedimentos Operacionais Padrão, serão criados os Grupos de Auditoria
Interna e Externa, responsáveis por verificar o andamento das atividades e a observação às
normas de BPL. Ambos deverão emitir relatórios regulares, cujos resumos serão
compartilhados com a coordenação do iii.
Certificação por agências regulatórias ou de qualidade: Cada laboratório deverá
solicitar as auditorias para certificação, atendendo ao Plano de Ação elaborado inicialmente.
A certificação poderá variar de acordo com cada laboratório participante, por atender
necessidades diferentes.
103
2. Boas Práticas Clínicas:
Manter e aprimorar os padrões de BPC na Unidade de Pesquisa Clínica: Na Unidade
de Pesquisa Clinica da FM-USP, estamos trabalhando continuamente para atender a todas
as exigências de condução de BPC nos estudos de pesquisa clínica. Estamos recebendo
auditorias freqüentes do NIH e da PPD, Inc., que têm sistematicamente aprovado a atenção
que temos tido às BPC. Todo o grupo tem formação e treinamentos documentados, os
voluntários são tratados com ética e confidencialidade e toda a documentação regulatória
atente às normas e recomendações nacionais e internacionais.
Propomos ampliar a qualidade do nosso trabalho, com diversas ações que estão
descritas na Plataforma de Epidemiologia e Estudos Clínicos. A necessidade de realizar os
estudos clínicos que estão sendo propostos torna tal tarefa fundamental para atingir sucesso.
Treinar outros grupos do iii para implementação de BCP: Durante todo o período do
projeto, serão realizados cursos em BPC para os membros do iii. Esses cursos não só têm
caráter motivacional, mas conferirão certificação no assunto aos que o fizerem. Propomos
também que os interessados em realizar pesquisa com humanos venham à Unidade de
Pesquisa Clínica para treinamentos. Tais treinamentos deverão ter duração e especificidade
para cada caso.
Funcionamento da Plataforma de Qualidade:
A natureza da plataforma de Qualidade possui interface com todas as áreas
temáticas do iii. Todos dos projetos propostos envolvem a implementação dos conceitos de
qualidade pelos pesquisadores listados no iii. Para isso, serão realizadas reuniões
presenciais, chamadas telefônicas em conferência e teleconferências usando a internet.
Contamos com apoio administrativo para realizar os estudos de pesquisa clínica, que
conta com gerenciamento financeiro, gerenciamento de assuntos regulatórios e a Plataforma
de Qualidade, para assegurar a observância às boas práticas clínicas e laboratoriais. Já foi
criada a Unidade de Gestão da Qualidade, para servir aos laboratórios participantes.
Equipe
Esper Kállas - FMUSP
Ana Maria Mouro – IB
Mario Palma - UNESP
Cronograma de Execução da Plataforma de Qualidade
Primeiro semestre: Cursos de BPL aos pesquisadores principais. Palestras
motivacionais em BPL. Identificação das necessidades de cada grupo. Receber as auditorias
regulares na Unidade de Pesquisa Clínica. Elaborar os cursos de treinamento em BPC.
104
Segundo semestre: Diligências locais para diagnóstico de cada situação. Proposição
e início de elaboração de Plano de Ação para os laboratórios que deverão implementar BLP.
Iniciar os treinamentos em BPC.
Terceiro semestre: Implementação de BLP local. Treinamento em BPC na Unidade
de Pesquisa Clínica.
Quarto semestre: Implementação de BLP. Início de avaliações de progressos em
implementação de BLP nos laboratórios participantes do iii. Treinamento em BPC na
Unidade de Pesquisa Clínica.
105
G. PLATAFORMA DE ENSINO E INTERAÇÃO COM A SOCIEDADE
Histórico
É parte integral da Missão do iii, compartilhar saberes sobre práticas de formação e
ensino, fundamental para a construção de um instituto sólido e solidário. Este trabalho em
rede exige a construção de uma nova mentalidade voltada para o trabalho coletivo. É um
processo em construção.
Nesses primeiros anos do iii, além de estabelecermos diversas colaborações
científicas entre os diferentes grupos, criamos, para as atividades educacionais, um núcleo
responsável pelas questões de formação e ensino. Fizemos o diagnóstico da nossa situação
nesta área – através de um questionário envolvendo pesquisadores, alunos e técnicos -,
identificamos problemas e necessidades do iii, e estabelecemos diretrizes para a formação e
ensino em nosso Instituto. As principais ações realizadas nesta plataforma foram: cursos
periódicos, intercâmbios nacionais e internacionais de alunos e pesquisadores do iii,
reuniões sistemáticas para a leitura crítica da literatura científica, investimento na formação
para a escrita de artigos científicos e teses, sistematização dos cadernos de laboratório para
o registro de dados de acordo com normas internacionais de boas práticas de laboratório e
inovação das práticas clínicas com o auxílio da implantação de prontuário eletrônico.
Também criamos um site do Instituto na internet (http://www.iii.org.br) e elaboramos boletins
periódicos.
Nova dimensão da proposta
A anterior Plataforma de Ensino passa a incluir, agora, proposta mais orgânica de
Interação com a Sociedade. Esta idéia já vinha sendo discutida dentro do iii e consideramos
salutar que tenha sido incluída na Missão para os Institutos Nacionais de Ciência e
Tecnologia. Isto coloca como desafio combinar o trabalho de rede no âmbito do iii com o
desenvolvimento de ações criativas fora dos muros da academia. Essas atividades, somadas
a um trabalho de difusão e divulgação das descobertas realizadas em nosso instituto,
permitirão que o iii ingresse em uma fase de maior maturidade, não apenas para “fazer
ciência” de tradução de excelência, mas também para aprender a compartilhar o processo de
fazer ciência e os saberes nele envolvidos, com crianças e jovens, em escolas públicas, com
profissionais do sistema nacional de saúde e em outros espaços na sociedade.
O diálogo entre os saberes populares, científicos e tecnológicos pode ser um
instrumento para a inclusão social, despertando a curiosidade para o pensamento e
descobertas científicos, identificando vocações, contribuindo para a construção de sujeitos
mais críticos, criativos e transformadores da realidade. Ao mesmo tempo, poderá também
ajudar a construir cientistas mais democráticos na relação com o conhecimento. Estamos
certos de que esta nova vertente de ação do iii será muito importante para a construção de
novos conhecimentos, também para todos os integrantes do iii.
Na área de interface com o sistema nacional de saúde, temos uma frutífera
experiência na oferta de cursos de manejo e tratamento das leishmanioses, em diversas
106
regiões do país. Tal interação facilita a disseminação das novas informações científicas e se
reflete em benefício direto para o pacientes. Nesta mesma linha, participantes do iii estão
envolvidos na elaboração de manuais de cuidados clínicos e de tratamento das
leishmanioses por iniciativa do Ministério da Saúde. Pretendemos ampliar estas experiências
para outras áreas de atuação do Instituto.
Outra proposta inserida nessa nova plataforma abarcará estudos de percepção
pública da ciência, com foco nos temas de saúde estudados pelo iii. Além dos três eixos
tradicionais - conhecimento, interesse e atitudes –, a análise complementar do consumo de
informação de temas pesquisados dentro do iii possibilitará um mapeamento de como e
quanto os brasileiros se informam sobre tais temas. Acreditamos que essa será uma
contribuição importante do iii, não só para a imprensa brasileira, mas também para a
definição de políticas e estratégias de divulgação responsável da área. Esses estudos,
combinados com mecanismos de participação social propostos, poderão ser um passo inicial
importante na direção de alterar o quadro polarizado que se repete mundo afora: um alto
interesse e atitude positiva sobre ciência e tecnologia caminhando junto com baixa
compreensão dos mesmos assuntos.
Desde julho de 2008, iniciamos esforços para estreitar os laços com seguimentos da
sociedade. Na área temática de HIV, foi criado o Comitê de Acompanhamento Comunitário
(CAC), que tem o objetivo de acompanhar as atividades de pesquisa que envolvam o
interesse dos grupos de maior vulnerabilidade para infecção pelo HIV. Composto por
representantes da sociedade civil organizada, o CAC tem como missão acompanhar os
projetos dessa área temática, buscando contribuir com seu olhar crítico e dando sugestões
para que as ações dos pesquisadores atendam às necessidades desse seguimento da
sociedade.
Proposta
A nossa proposta dentro da Plataforma de Ensino e Interação com a Sociedade é
desenvolver atividades educacionais no âmbito do iii e da interação com a sociedade, assim
como atividades de difusão e comunicação com a sociedade. Pretendemos que esta
plataforma seja um alicerce para o compartilhamento dos diversos saberes existentes dentro
do iii, assim como um espaço aberto de debate científico/pedagógico e para o
desenvolvimento de novos saberes e novas interações com a sociedade.
Objetivos
Objetivo geral
Desenvolver atividades educacionais e de difusão e comunicação dentro do iii e com a
sociedade.
I. Educacionais
107
Objetivos específicos
Dentro do iii:
1. Realizar cursos técnicos/práticos e teóricos/conceituais:
(i) Escrita científica, (ii) Qualidade na pesquisa – BPL, BPC, Elaborações de POPs
(Protocolos Operacionais Padrão), (iii) Estudos pré-clínicos, (iv) Ensaios clínicos, (v)
Propriedade intelectual, (vi) Bioestatística/Epidemiologia (vii) Delineamento experimental,
(viii) Biossegurança, (ix) Introdução à Bioinformática, (x) Cursos temáticos específicos, e
(xi) Desenvolvimento de novos fármacos e biofármacos.
2. Realizar, periodicamente, encontros científicos e estratégicos da rede:
(i) temáticos, (ii) congressos científicos com pesquisadores e alunos do iii
3. Realizar vídeo-conferências para a discussão de projetos
4. Estabelecer intercâmbios entre os diferentes grupos através de estágios e visitas
5. Manter o site do iii – dinâmico e ativo, com compartilhamento de resultados, seminários,
cursos e demonstração de técnicas gravadas em vídeo.
6. Enviar boletins eletrônicos mensais com novidades sobre as atividades do iii e outras de
interesse ao iii.
Interação com a comunidade técnico-científica externa ao iii:
1. Realizar conferências e debates em congressos de interface com áreas de pesquisa com
o iii
2. Disponibilizar informações geradas no iii de interesse à comunidade científica
3. Promover interações com outros Institutos Nacionais de Ciência e Tecnologia que tenham
interface com o iii.
4. Estabelecer interação com empresas incubadoras, especialmente as de base
biotecnológica, através da realização de seminários de temas comuns e pela oferta de
cursos técnico/práticos, como (i) Escrita científica, (ii) Qualidade na pesquisa – BPL, BPC,
Elaborações de POPs (Protocolos Operacionais Padrão), (iii) Ensaios clínicos, (iv)
Propriedade intelectual, (v) Bioestatística/Epidemiologia (vi) Delineamento experimental, (vii)
Biossegurança.
Interação com a sociedade:
Objetivos gerais
1. Estimular a curiosidade e a capacidade de pensar criticamente sobre como os
conhecimentos científico e tecnológico são produzidos, principalmente na área da saúde
e Imunologia, focos de estudo do nosso instituto.
2. Discutir como a metodologia científica em diálogo com outros saberes pode contribuir para
mais uma leitura da realidade e para a busca de soluções de problemas.
3. Construir novos conhecimentos relacionados com temas na imunologia.
Objetivos específicos
108
Para alunos e professores de escolas públicas – ensinos fundamental e médio:
1. Realizar oficinas temáticas envolvendo diversos temas de interesse àquele coletivo, com a
participação de pesquisadores e alunos do iii.
2. Realizar cursos de temas de Imunologia para professores de biologia das escolas públicas
e disponibilizar cursos no site do iii.
3. Realizar debates sobre temas de interesse daquele coletivo, com preparação prévia e
disponibilização de material informativo.
4. Promover discussões sobre a ciência no Brasil e pesquisa de tradução.
5. Organizar visitas aos laboratórios de pesquisa do iii para acompanhamento de um dia na
vida de pesquisador.
6. Produzir textos didáticos dirigidos a crianças e jovens nos moldes do que vem sendo
publicado, inclusive por membros do presente projeto, para revistas de divulgação de
excelência como Ciência Hoje e Ciência Hoje para Crianças.
Para alunos de graduação:
1. Oferecer cursos temáticos de verão (Imunologia clínica, etc.).
2. Oferecer curso de Escrita científica
3. Organizar visitas aos laboratórios de pesquisa do iii para acompanhamento de um dia na
vida de pesquisador.
4. Promover discussões sobre pesquisa de tradução.
Para profissionais do sistema de saúde:
1. Realizar cursos e discussões sobre o diagnóstico e manejo clínico das doenças de
atuação do iii para profissionais de saúde do SUS.
2. Disponibilizar vídeos dos cursos no site do iii.
3. Discutir sobre o estado da arte das pesquisas científicas na área de interesse e sobre o
conceito de pesquisa de tradução.
Para a sociedade em geral:
1. Participar junto a agremiações de pacientes e usuários, com cursos e discussões para a
comunidade não acadêmica.
2. Participar de fóruns públicos, nos moldes daqueles habitualmente promovidos pela SBPC
e sociedades específicas de fomento e difusão da ciência.
II. Difusão de conhecimento e mecanismos de participação social dentro do iii
Objetivo geral
109
Instituir mecanismos bilaterais de comunicação entre pesquisadores e sociedade, visando
tanto a difusão dos conhecimentos gerados dentro do iii quanto a participação de diferentes
setores da sociedade nos rumos das pesquisas.
Objetivos específicos
1. Elaborar e consolidar uma política de comunicação para o iii, com um plano de
comunicação institucional, sobretudo por meio do site, o que permitirá uma
democratização do conhecimento gerado dentro do instituto:
a. Divulgar notícias sobre trabalhos publicados pelos pesquisadores do iii, assim
como atividades realizadas no âmbito do instituto, com ajuste de linguagem
visando atingir um público mais amplo.
b. Publicar reportagens especiais e/ou dossiês tratando dos temas estudados
dentro do iii.
c.
Realizar entrevistas com pesquisadores do instituto e disponibilizá-las em
formato vídeo no site.
d. Criar um link com informações pertinentes às pesquisas e doenças estudadas
no iii preparado para a população em geral
e. Disponibilizar gravações de informações esclarecedoras objetivas em temas de
interesse do público geral, em formato de Podcasts.
f.
Enviar material jornalístico, previamente selecionado, tanto para veículos de
comunicação especializados quanto para a grande mídia.
g. Estabelecer comunicação confiável com os órgãos de imprensa, com o objetivo
de fazer do site do iii uma fonte segura para a obtenção de notícias e para a
divulgação das ações institucionais, priorizando a agilidade e a qualidade das
informações e a credibilidade do conteúdo publicado.
h. Elaborar programação específica para divulgação no Dia da Imunologia
(http://www.dayofimmunology.org/initiative)
2. Criar os Comitês de Acompanhamento Comunitário, compostos por representantes dos
grupos da sociedade civil organizada, com interesse naquela área de pesquisa, quando
for planejado um projeto de pesquisa que envolva seres humanos. Isto permitirá o
diálogo mais próximo entre pesquisadores e a sociedade e incorporação de sugestões
relevantes.
3. Realizar, em colaboração com o Laboratório de Estudos Avançados em Jornalismo da
Unicamp (Labjor), liderado por Carlos Vogt, pesquisas de percepção pública da ciência
com foco nos temas estudados pelo iii. Tal mapeamento permitirá traçar políticas e
estratégias responsáveis de divulgação científica.
110
a. Participar, inicialmente, da pesquisa de percepção pública da ciência com
adolescentes em escolas públicas e privadas da cidade de São Paulo, a ser
desenvolvida pelo grupo Labjor, ainda em 2008, introduzindo questões da
imunologia como parte dessa pesquisa.
b. Mapear como e onde os brasileiros se informam sobre os temas pesquisados
dentro do iii, assim como o seu conhecimento, interesse e atitude a respeito de
tais temas, em pesquisa dirigida a perguntas do tema do iii.
ESTRATÉGIAS PARA A INTERAÇÃO COM A SOCIEDADE
As nossas atividades educacionais incluirão: (i) cursos (ii) conferências, (iii) oficinas, (iv)
debates, (v) visitas de campo, (vi) vídeos, (vii) publicações, (viii) criação de comitês da
comunidade para acompanhamento de pesquisas.
1. Interação com escolas públicas – realizaremos inicialmente discussões com a participação
de educadores que desenvolvem este tipo de trabalho, para a elaboração de projetos
pilotos para o iii, nos diversos estados integrantes do iii. Com uma proposta elaborada,
conversaremos com a direção de escolas públicas candidatas a esta experiência
pedagógica.
2. Integrantes do iii de cada estado serão estimulados a desenvolver atividades de interação
com a sociedade. Também poderemos, periodicamente, ter algumas atividades com
pesquisadores de outros estados.
Equipe da Plataforma de Ensino e Interação com a Sociedade
Responsáveis: Verônica Coelho ( InCor- FMUSP) e Manoel Barral (Fiocruz BA)
Núcleo:
Anna Paula Sheppard Guembes – InCor - FMUSP
Carolina Luque – InCor - FMUSP
Georgia Porto Mundin – InCor - FMUSP
Sandra Moraes – InCor – FMUSP e IMT-USP
Todos Pesquisadores Principais do iii
Colaboradores do iii na Plataforma de Ensino e Interação com a Sociedade:
Carlos Vogt - Lab. de Estudos Avançados em Jornalismo (Labjor)/Unicamp. Colaborador
na pesquisa sobre percepção da ciência e de temas de saúde e Imunologia
relacionados ao iii.
111
Cristina Caldas - Laboratório de Estudos Avançados em Jornalismo (Labjor) - Unicamp Difusão
do iii e colaboradora na pesquisa sobre percepção pública da
ciência e de temas de saúde e Imunologia relacionados ao iii.
Gilson Volpato – UNESP – Botucatu – São Paulo – Cursos e oficinas de Escrita científica.
Jackson Costa – Fiocruz – Bahia - Atividades educacionais para profissionais do SUS.
Yurij Castelfranchi - Laboratório de Estudos Avançados em Jornalismo (Labjor) Unicamp.Colaborador na pesquisa sobre percepção da ciência e de
temas de saúde e Imunologia relacionados ao iii.
Nélio Bizzo –
Faculdade de Educação USP - Faculdade de Educação da USP - Discussão
sobre atividades educacionais sobre ciência e temas do iii em escolas
públicas.
Paulo Roberto da Cunha – Fundação Instituto de Ensino para Osasco (UNIFIEO) –
Colaboração na elaboração de material didático.
112
4. Metodologia
Todas as metodologias descritas neste projeto são utilizadas corriqueiramente nos
laboratórios do iii segundo protocolos-padrão (POP), o que permite uma comparação direta e
correta dos dados obtidos pelos vários grupos de pesquisa, garantindo, portanto, a qualidade
e a reprodutibilidade de nossos resultados. Várias destas metodologias agrupam-se nas
plataformas de suporte técnico do iii, ficando, então, sob a supervisão especial de alguns
grupos. Por estes motivos, as descrições deste item não serão feitas em detalhe nesta
proposta. As metodologias específicas estão descritas dentro de cada subprojeto, quando
pertinente.
1. CRITÉRIOS DE INCLUSÃO, EXCLUSÃO E TRATAMENTO DOS PACIENTES
Todos os pacientes selecionados para os diferentes estudos contidos nesta proposta
serão amplamente informados de todos os aspectos técnicos e éticos de nossa pesquisa e
deverão assinar Termo de Consentimento Livre e Esclarecido para cada protocolo, antes da
inclusão em cada respectivo projeto. Todos os processos de aprovação reguladora
institucionais e nos diferentes níveis municipal, estadual e federal serão seguidas
rigorosamente. Os critérios de seleção dos pacientes específicos para cada estudo estarão
descritos em maior detalhe no item 5, Caracterização da Rede- Linhas de pesquisa.
2. MODELOS ANIMAIS
Todos os procedimentos com
animais seguirão as normas brasileiras e
internacionais para o uso das espécies em questão. Estes procedimentos estão descritos em
detalhe para cada projeto, assim como citado acima para a pesquisa com seres humanos.
2.1 Testes pre-clinicos de toxicidade aguda e eficiência/imunogenicidade: Os
imunobiológicos serão avaliados nas formulações adequadas em grupos de animais
comparados a grupos controle não tratados, de duas espécies distintas (camundongos e
mini-pigs),
conforme
recomendações
das
agências
regulatórias.
A
eficiência/imunogenicidade e a toxicidade aguda do imunobiológico serão avaliadas durante
30 dias com provas bioquímicas séricas, hemograma completo, urianálise, seguidos de
necropsia e coleta de órgãos para análise histopatológica. Os ensaios serão realizados pela
empresa Ciallyx.
3. TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS
3.1. Imunofluorescência por citometria de fluxo: A avaliação da expressão de
proteínas de superfície celular e de citocinas intracelulares será realizada através de
protocolos bem estabelecidos na literatura e utilizados corriqueiramente em nossos
laboratórios. A aquisição das amostras será realizada em aparelhos FACScan, FACScalibur,
FACSCanto e Facs Aria (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, California)
e a análise será feita através dos programas CellQuest, FACSDiva e FlowJo. Os laboratórios
113
envolvidos dominam diferentes protocolos de verificação de diferentes proteínas na
superfície e no interior de diversas populações celulares. Além disso, possuem padronizadas
técnicas de detecção de produção de citocinas, com destaque para IFN-gama, IL-2, TNFalfa, IL-4, IL-5 e IL-6. A detecção destas citocinas são habitualmente combinadas à
caracterização fenotípica de linfócitos, permitindo a identificação de subpopulações celulares
responsáveis pelas ações do sistema imune em estudo.
3.2. ELISPOT (Enzyme-linked immunospot assay): A produção de diferentes
citocinas por linfócitos T será detectada usando os conjuntos BD para citocinas humanas ou
murinas, conforme instruções do fabricante. Os “spots” revelados serão contados utilizando
estereomicroscópio automatizado e software KS ELISPOT (Zeiss).
3.3. ELISA (Enzyme-liked immunosorbent assay): Em alguns casos, citocinas serão
quantificadas por ELISA “sanduíche” utilizando curva-padrão e pares de anticorpos e
citocinas recombinantes de acordo com as especificações do fabricante. Anticorpos IgE, IgG
e IgG4 específicos para alérgenos de ácaros e baratas serão quantificados no soro de
pacientes por ELISA quimérico, como descrito por Trombone et al (2002).
3.4. Dosagem de citocinas por CBA (Cytometric Bead Array): Alternativamente,
citocinas poderão ser quantificadas por CBA, de acordo com as instruções do fabricante (BD
Biosciences, CA, EUA). As amostras processadas serão adquiridas por citometria de fluxo e
analisadas através do programa BD CBA. A concentração de cada amostra será calculada a
partir de curvas-padrão.
3.5. Detecção da expressão protéica e modificações pós-traducionais por “WesternBlot”: Após separação de proteínas de extratos celulares por eletroforese em gel de
poliacrilamida contendo SDS (SDS-PAGE), estas proteínas serão transferidas para
membranas de nitrocelulose ou PVDF, onde serão realizados ensaios de western-blot para
avaliar a expressão de proteínas de interesse, incluindo fosfoproteínas. As reações serão
reveladas por quimioluminescência e documentadas após exposição a um filme de
autoradiografia.
3.6 Antigen-chip: Com o objetivo de visualizar um perfil global da reatividade de autoanticorpos presentes no soro, em modelo murino, será utilizado um chip que possui spots de
antígenos, especialmente peptídeos derivados de proteínas de choque térmico, a ser sondado
por anticorpos presentes em soros dos camundongos experimentais. Este chip foi desenvolvido
e previamente validado em modelo murino de diabetes mellitus (Quintana et al. 2004).
3.7 Bioplex®: O sistema Bioplex se utiliza de microesferas de poliestireno que são
internamente marcadas com dois fluorocromos espectralmente distintos e é utilizado para
detecção simultânea de até 100 analitos. Será utilizado para estudo de aloanticorpos no soro do
paciente transplantado.
114
4. TÉCNICAS DE BIOLOGIA CELULAR
4.1. Separação das células mononucleares do sangue periférico (PBMC): As
amostras serão obtidas de sangue, por centrifugação em solução de gradiente de FicollHypaque (d=1,077). As células serão ressuspendidas em meio DMEM enriquecido com
aminoácidos, vitaminas, piruvato de sódio, L-glutamina, e antibióticos. A contagem das
PBMC será feita em câmara de Neubauer.
4.2. Obtenção de células dendríticas a partir da medula óssea murinas: As células
6
dendríticas (DCs) serão diferenciadas a partir de medula óssea. As células (1,5x10
células/poço) serão ressuspensas em meio RPMI 5% FCS, 50mM β-Mercaptoetanol com rGMCSF (R&D Systems), e mantidas a 37ºC com 5% CO2. A partir do dia 3, será adicionada
10ng/ml IL-10 (R&D Systems) nos poços destinados à geração DCs tolerogênicas. No dia 10
serão adicionados 100 ng de LPS (Sigma) nos poços que desejamos obter DCs maduras. A
0
partir do 13 dia, todas as DCs estarão prontas para serem submetidas a protocolos de
transferência.
4.3. Obtenção de subpopulações de células mononucleares: As células humanas e
murinas serão obtidas a partir de PBMC e esplenócitos, respectivamente. A população será
enriquecida de linfócitos com o fenótipo desejado através do processo de seleção positiva ou
negativa com pérolas magnéticas ligadas aos anticorpos monoclonais correspondentes
(Miltenyi Biotec GMBH, Alemanha). Alternativamente. utilizaremos o citômetro de fluxo de 7
cores com “sorter”/separador celular, utilizando anticorpos monoclonais adequados
(FacsAria, Becton Dickinson, CA, EUA).
4.4. Ensaio in vivo de funcionalidade das células T CD4+CD25+Foxp3+: serão
inoculadas células do baço de camundongos C57BL/6 juntamente com as células T
CD4+CD25+ isoladas de linfonodos naive, geradas e isoladas da cultura in vitro; e a
condição controle de somente de esplenócitos de camundongos C57BL/6. Os espenócitos
dos
recipientes
serão
analisados
quanto
ao
numero
de
células
de
memória
(CD4/CD8+CD45RB low CD44high) no 7 º e 21º dia após as inoculações.
4.5. Ensaio de degranulação de mastócitos: A degranulação de mastócitos será
realizada através de medidas da liberação de grânulos marcados (β-D-glucosaminidase) que
se co-localizam com a histamina nos grânulos dos mastócitos, segundo Hide et al. (1993).
4.6. Teste de ativação de basófilos.
A determinação da ativação de basófilos
obtidos por centrifugação em amostra anticoagulada com ACD (adenina-citrato-Dextrose)
será feita pela identificação do aumento da expressão de marcadores de superfície CD63 por
citometria de fluxo, após estimulação com os alérgenos
4.7. Ensaio de proliferação celular: No caso de ensaios de proliferação de linfócitos T
4
5
frente a DC maduras e imaturas, serão utilizados 5x10 linfócitos T com 2x10 DCs maduras
e imaturas. Como controle positivo serão utilizadas PHA 2,5 µg/ml (para humanos) ou ConA
o
1-5 µg/ml (para camundongos). Após incubação (3-4 dias) a 37 C, e 5% de CO2 as células
serão tratadas com 0,5 µCi de 3H (Timidina Triciada, Amersham-Pharmacia). A leitura será
em contador beta (Beta plate 1205-LKB). O índice de estimulação (IE) será calculado pela
115
razão entre a média de CPM do experimento com antígeno e a média de CPM do
experimento sem antígeno, e serão considerados positivos IE≥2-2,5. Também será feito
ensaio de inibição da proliferação de células T autólogas potencialmente supressoras, além
de culturas com os diferentes antígenos pré-estabelecidos. Também será realizado o ensaio
de diluição de CFSE. Células respondedoras serão marcadas com 2,5-5µM de CFSE (5,6
carboxyfluorescein diacetate succinimidylester) e incubadas com seus estímulos (peptídeos,
o
proteínas ou células) por 72-120 h a 37 C, 5% de CO2.e analisadas por citometria de fluxo,
sendo calculado o índice de divisão celular, das células que dividem pelas que não se
dividem
4.8. Cultura mista de linfócitos: Serão utilizados como respondedores esplenócitos
de animais tolerantes. Estas células serão marcadas com 2,5-5µM de CFSE (5,6
carboxyfluorescein diacetate succinimidylester). Como estimuladoras serão utilizadas células
o
do doador estimuladas ou não. A co-cultura será mantida durante 72 horas a 37 C, 5% de
CO2. No quarto dia, as células serão analisadas por citometria de fluxo. Será calculado o
índice de divisão celular, das células que dividem pelas que não se dividem. Também serão
realizadas culturas mistas de células dendríticas e células alogênicas em apoptose.
4.9. Determinação e quantificação de apoptose: É possível determinar qual a
proporção de células que se encontra nas fases G1, S e G2 do ciclo celular, além de verificar a
proporção delas em apoptose. Esta técnica pode, ainda, ser aliada à marcação para proteínas
de superfície, permitindo a caracterização da evolução da divisão celular nas diferentes
populações estudadas. Três eventos serão analisados: a) Externalização de resíduos de
fosfatitilserina, que será acompanhada através da marcação com Anexina V-FITC (Martin et
al., 1995); b) Fragmentação de DNA, verificada através da análise do conteúdo de DNA por
citometria de fluxo (Nicoletti et al., 1991) e c) ensaio de MTT.
4.10. Protocolos para a indução de tolerância: para a indução de tolerância intranasal
em camundongos serão utilizados peptídeos previamente selecionados. Para a indução de
tolerância pela transferência celular utilizaremos os linfócitos T purificados da cultura de
esplenócitos estimuladas com os peptídeos selecionados. O alotransplante de pele será
realizado 1 dia após a última transferência celular. Utilizaremos células da mesma linhagem
do camundongo receptor do aloenxerto. Para posterior análise de migração celular,
utilizaremos células de camundongos da linhagem C57BL/6 transgênicos para GFP. Após 1
semana do transplante, avaliamos diariamente o enxerto de pele por critérios macroscópicos
e por análise histopatológica no momento da rejeição e em caso de tolerância, após 100
dias.
4.11. Transplante de pele: o transplante de pele será realizado conforme adaptação
do método descrito originalmente por Billingham et al (1951). Fragmentos de pele da cauda
dos animais doadores serão implantados na região dorsal do receptor.
4.12. Análise histopatológica do enxerto: Após perda do enxerto (retração e
diminuição de pelo menos 70% de sua área) os enxertos de pele serão fixados e submetidos
a análise histopatológica seguindo os critérios específicos para rejeição.
116
5. TÉCNICAS BIOQUÍMICAS
5.1. Cromatografia de Fase Reversa de Alta Performance (HPLC): Será utilizada
para purificação de peptídeos sintéticos, purificação de diferentes frações de misturas
complexas e quantificação de nucleotídeos de adenina, creatina e fosfocreatina. Após a
solubilização, as amostras serão fracionadas em coluna em HPLC sob fase reversa (HPLC
SHIMADZU - Modelo LC-AD 10). Os picos de interesse serão re-fracionados em gradiente
isocrático, no mesmo sistema de HPLC.
5.2. Síntese de peptídeos: A síntese dos peptídeos selecionados será realizada em
um sintetizador múltiplo de fase sólida Apex 396 (Advanced ChemTech, Kentucky, USA),
utilizando a metodologia FMOC (Atherton et al. 1989) e a resina TGR (Novabiochem, USA)
(King et al. 1990). A qualidade dos peptídeos será analisada por espectrometria de massa
e/ou HPLC (Akta, Amersham-GE, USA) e Ettan Pro Maldi-Tof Mass Spectrometer
(Amersham-GE, USA).
5.3. Sequenciamento por Química Degradativa de Edman: Os peptídeos sintetizados
e extensivamente purificados que apresentaram um único pico de massa molecular (m/z),
em análises de espectrometria de massa, serão submetidos ao sequenciamento primário
através da Química Degradativa de Edman em um PPSQ-21A (SHIMADZU).
5.4. Pesquisa de micropartículas (MPs) contendo QSOX: será estudada a partir do
soro dos pacientes de diferentes grupos clínicos. MPs serão separadas por centrifugação e a
contagem de MPs, expressão de fosfatidilserina e presença de QSOX investigada por
citometria de fluxo; sua presença também será avaliada por Western blot. A atividade da
QSOX será verificada pela fluorescência do ácido homovanílico na presença de DTT.
5.5. Análise global de expressão protéica: Extratos protéicos de células ou tecidos
serão obtidos a partir da lise celular em tampões apropriados e separados por eletroforese
bidimensional, onde a primeira dimensão é realizada com tiras de gradiente de pH
imobilizado na faixa de 3-10, em sistema de focalização isoelétrica “Ettan IPGphor”, e a
segunda dimensão é corrida em gel de poliacrilamida. O resultado final é observado através
de coloração com Coomassie R-250, e a imagem é adquirida com o equipamento
“ImageScanner” e analisada com o programa “ImageMaster 2D-Platinum” (Amersham
Biosciences/GE healthcare). Avaliação de expressão diferencial pode ser feita usando a
tecnologia 2D-DIGE (Ettan
TM
Differential 2D Gel Electrophoresis) onde as amostras são
previamente marcadas com diferentes corantes fluorescentes e misturadas antes da
focalização isoelétrica, sendo que a separação das proteínas de várias amostras é realizada
no mesmo gel bidimensional, o que permite a detecção precisa de mudanças na expressão.
As imagens dos géis bidimensionais contendo proteínas acopladas a fluoróforos são
adquiridas com o equipamento “Typhoon 9410 Variable Mode Imager” (Amersham
Biosciences/GE Healthcare), e as análises da expressão protéica diferencial são realizadas
utilizando-se os programas “DeCyder Differential Analysis” e EDA (Extended Data Analysis)
(ambos da Amersham Biosciences/GE healthcare). Os “spots” de interesse serão finalmente
processados (recorte, digestão tríptica, retirada de corante, obtenção de peptídeos trípticos
117
em matriz de alpha-hydroxycinamic acid) sobre placas metálicas por sistema automatizado
“Ettan Spot Handling Workstation”, e analisadas em um espectrômetro de massas Ettan
MALDI-ToF/Pro” ou Espectrômetro de Massas ESI – triploquadrupolo QUATRO II
(MICROMASS) ou mesmo num espectrômetro de massas MALDI-TOF/TOF a ser adquirido
pelo projeto. A identificação das proteínas utilizando dados das análises MS e MS/MS será
realizada
com
auxílio
de
ferramentas
de
informática
como
o
MS-Fit
http://prospector.ucsf.edu/;ou o Mascot http://www.matrixscience.com/ utilizando os banco de
dados “NCBInr (non redundant)” ou “SwissProt” disponíveis na internet. Os protocolos de
espectrometria de massas serão adaptados a partir do sistema descrito por Chassaigne &
Lobinski (1998).
6. TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR
6.1. Seleção de peptídeos: O algoritmo TEPITOPE (Sturniolo et al. 1999) permite a
seleção de seqüências previstas para se ligarem simultaneamente de forma promíscua a
várias moléculas HLA-DR (Iwai LK et al. 2003). As seqüências das proteínas codificadas por
todo o genoma do HIV-1 que apresentarem predição de ligação com no mínimo 18/25
moléculas HLA-DR, com o limiar de 3% serão selecionadas para síntese. Para as
seqüências mutantes da protease do HIV-1, a seleção será similar, mas o limiar será maior
(5%).
6.2. Extração de DNA e RNA: Os métodos empregados variam conforme a
aplicação. Para a extração de DNA serão utilizadas colunas de purificação Qiagen ou
técnicas padronizadas (usando fenol: clorofórmio, precipitação com sal ou uso de
DTAB/CTAB) para obtenção de DNA em grandes quantidades. Para a extração do RNA
7
total, aproximadamente 10 células serão lisadas com 1 mL de uma mistura de fenol e
isotiocianato de guanidina (Trizol, Life Technologies) e o RNA obtido purificado de acordo
com protocolo do fabricante,
6.3. Avaliação da expressão gênica por RT-PCR ou Real-Time PCR: Células
provenientes dos diversos pacientes ou linhagens celulares estabelecidas serão avaliadas
quanto à expressão de genes de interesse utilizando técnicas de RT-PCR e Real-Time PCR.
Após a conversão do RNA em cDNA (cDNA Cycle Kit for RT_PCR, Invitrogen), estes serão
submetidos à amplificação por meio da metodologia padrão de RT-PCR. Para tanto
oligonucleotídeos específicos para detecção dos referidos genes serão sintetizados a partir
de seqüências obtidas pelo banco de dados blast (http://www.ncbi.nih.gov/BLAST). As
análises por “Real Time PCR” serão realizadas em placas de 96 poços, usando os reagentes
“SYBR-Green PCR Master Mix” (Applied Biosystems, USA) e o equipamento “Perkin-Elmer
ABI Prism 7500 sequence detection system”. A normalização e a quantificação relativa serão
realizadas pelo método ǻǻCt, de acordo com o manual de instruções do fabricante ABI
PRISM 7500, sendo utilizado o GAPDH como gene endógeno. Os laboratórios já possuem
painéis de oligonucleotídeos para análises de expressão de dezenas de citocinas,
quimiocinas, receptores e outras moléculas imunológicas no homem e em outras espécies.
118
6.4 Immunoscope. Os cDNA codificadores da CDR3 são amplificados por PCR
utilizando iniciadores que anelam em sítios específicos das regiões V e C. Os produtos
dessa reação são então marcados com iniciadores fluorescentes que se anelam nas regiões
J ou C. Finalmente, os fragmentos amplificados são separados por eletroforese e
visualizados por seqüenciamento de fluorescência. A digitalização das imagens será feita
com o programa Genemapper® analysis software (Applied Biosystems). As proporções
relativas de cada classe de tamanho de mRNA é calculada, a distribuição dos comprimentos
das CDR3 pode ser exibida como um gráfico de probabilidade de distribuição (Miqueu et al.
2007).
6.5. Análise imunogenômica: Estudos de associação buscando encontrar o papel do
polimorfismo de genes candidatos, incluindo resposta imune inata, e genes codificando
citocinas inflamatórios e anti-inflamatórios e suas vias de sinalização serão testados com
PCR-RFLP, “Real-Time TaqMan-PCR” e iScan System GoldenGate Custom genotyping
Panels (Illumina, Hayward, CA) que permitem a análise de até 1536 SNP. Análises de
combinação e “clustering” também serão realizadas.
6.6. Sequenciamento de DNA: Os alvos da amplificação por “nested PCR” com
primers apropriados serão seqüenciados diretamente usando o kit ABI Prism Big Dye-Dye
Terminator Cycle Sequencing Reaction Kit (Perkin Elmer, Foster City, CA, USA), em um
seqüenciador automatizado (ABI Model 377, Perkin Elmer), de acordo com o protocolo do
fabricante.
6.7. Modelagem molecular: Será utilizado o programa MODELLER para a
modelagem molecular dos peptídeos com ação biológica relevante. O procedimento de
modelagem se iniciará com um alinhamento de seqüências a serem modeladas (seqüências
alvo) com estruturas tridimensionais conhecidas já descritas (modelos). Os modelos serão
gerados usando as coordenadas atômicas do carbono α dos peptídeos modelos. Todo o
processo de modelagem será processado em um computador PC (Intel Pentium 4 Dualcore). A total qualidade estereoquímica dos modelos finais será avaliada pelo programa
PROCHECK.
6.8.
Produção
de
anticorpos
“humanizados”:
A
seqüência
polipeptídica
correspondente às cadeias leves do anticorpo anti-CD3 será sintetizada pelo método do PCR
recombinante, com primers sobreponíveis, e clonada em vetor plasmidial para análise
preliminar por sequenciamento de DNA. Clones contendo o domínio sintético com seqüência
correta serão transferidos para vetores de expressão de anticorpos recombinantes em
células de Pichia pastoris e células animais em cultura. Serão utilizados os vetores pPIg 16 e
o pMacPS, respectivamente (Caldas et al., 2000). O anticorpo recombinante será preparado
a partir de sobrenadante de cultura de clones (levedura ou CHO) transfectados com o vetor
de expressão, purificados em coluna de proteína A-Sepharose. Anticorpos monoclonais para
uso clínico serão purificados por seqüência cromatográfica de troca iônica, afinidade e gel
filtração. A atividade ligante dos anticorpos será testada por FACS com linfócitos humanos
+
CD3 . Serão realizadas análises das implicações estruturais da humanização das cadeias
119
leve e pesada na capacidade de ligação ao antígeno dos anticorpos recombinantes, através
de modelagem molecular por transposição de coordenadas da estrutura disponível do
complexo OKT3/CD3. Conforme o impacto estrutural desses resíduos, eles serão
classificados ou não para o procedimento de mutagênese
6.9. Produção de vacinas de DNA: Um gene sintético codificando os epitopos
escolhidos é sub-clonado dentro de vetores de expressão de mamíferos pVAX1. (Genscript
Corp, Piscataway, NJ, USA http://www.genscript.com/gene_synthesis.html). Os plasmídeos
para estudos em roedores serão purificados usando o sistema Gigaprep (Qiagen, Inc). No
caso de estudos clínicos a purificação será efetuada em planta piloto GMP usando sistema
AKTA PILOT.
6.10. Produção de Imunobiológicos: Entre os projetos do iii, diferentes metodologias
são possíveis, como a produção de proteínas recombinantes em bactérias, levedura e
células de mamífero. As diferentes estratégias estão descritas nos projetos anexados
(Alergias, Transplante, Doenças infecciosas, Imunodeficiências Primárias, Doenças autoimunes, HIV/AIDS, Câncer).
Produtos expressos em bactérias serão obtidos por fermentação em tanques de
agitação ou de alimentação, nos meios de cultura apropriados a cada caso, podendo haver a
adição de indutores no meio de cultura em escala piloto e em instalações GMP. Em princípio
os resultados promissores obtidos em bancada serão levados ao aumento de escala,
dependendo da quantidade necessária e da produtividade do clone. Os parâmetros serão
modificados conforme a necessidade e em função dos resultados, não sendo possível prever
a priori as modificações. Para obtenção de produtos expressos em bactérias (proteínas e
DNA recombinante) em condições cGMP para administração em humanos (ensaios clínicos)
implementaremos uma planta piloto de fermentação em condições GMP.
Produtos expressos em células de mamíferos serão obtidos em biorreatores e
desenvolvidos em condições cGMP no Lab. de Biofármacos em Célula Animal, I.Butantan,
de acordo com tipo de célula, complexidade estrutural e estabilidade da proteína desejada.
7. OBTENÇÃO DOS VENENOS DAS VESPAS
Os venenos das espécies Agelaia pallipes pallipes e Polybia paulista serão
fornecidos pelo Centro de Estudos de Insetos Sociais/Departamento de Biologia do Instituto
de Biociências da Universidade Estadual Paulista (UNESP) de Rio Claro-SP e extraídos
conforme metodologia descrita em trabalhos anteriores. Após a captura, os insetos serão
º
imediatamente congelados a -80 C e levados ao laboratório para confirmar a identificação
taxonômica. As vespas serão então dissecadas e o reservatório do veneno extraído de cada
inseto, com o uso de microbisturís. Estes reservatórios serão cuidadosamente lavados em
solução isotônica, perfurados e agitados suavemente em solução isotônica por 5 minutos a
º
º
4 C e centrifugados a 12000 rpm por 15 minutos a 4 C.
120
8. ANÁLISE ESTATISTICA DOS DADOS
Utilizaremos testes paramétricos e não paramétricos, curvas de sobrevida, análises
uni e multiparamétricas, desenho de ensaios e ensaios clínicos dentro da plataforma de
bioestatística e epidemiologia.
121
5.
CARACTERIZAÇÃO DA REDE
Arranjo institucional
O Instituto de Investigação em Imunologia (iii), criado em 2001, é hoje constituído
por um núcleo de 33 pesquisadores de 18 grupos de pesquisa de 6 estados do Brasil. Há 6
anos, temos desenvolvido dentro do iii um trabalho em rede, compartilhando saberes para a
produção do conhecimento científico, assim como para a formação e ensino, de forma
continuada, de alunos, técnicos e pesquisadores. Trabalhamos em uma estrutura matricial,
na qual desenvolvemos projetos de pesquisa temáticos, em 7 áreas de relevância médica no
país, visando a tradução de conhecimentos da pesquisa básica para a aplicação clínica, e a
geração de vacinas, produtos imunobiológicos e diagnósticos. Também criamos plataformas
horizontais compartilhadas por todos, ou por diversos projetos temáticos verticais,
alavancando o trabalho em rede e o desenvolvimento da rota científico/tecnológica de cada
linha de pesquisa. Nesses primeiros anos de trajetória do iii, foram estabelecidas diversas
colaborações científicas entre os diferentes grupos, gerando um grande número de
publicações, disseminando tecnologias de ponta e concluindo a formação de 91 doutores, 94
mestres e 138 alunos de iniciação científica.
O grande desafio tem sido a construção de uma mentalidade para o trabalho
coletivo, em rede, compartilhando saberes e compartilhando o fazer.
Nesta nova etapa, foram incorporados novos pesquisadores com expertises
complementares às existentes no iii. Todos os grupos participantes assumiram o
compromisso de realizar um trabalho em rede, disponibilizando seus conhecimentos para o
instituto, assim como as expertises e infraestrutura de seus grupos, e propiciando a
integração de seus alunos ao iii. Temos, hoje, 18 subprojetos dentro das 7 linhas de
pesquisa temáticas. Todos os subprojetos têm interface com algum outro grupo do iii e
outras surgirão
A gestão geral do iii é sediada em São Paulo. A Disciplina de Imunologia Clínica e
Alergia e o Laboratório de Imunologia do Instituto do Coração da Faculdade de Medicina da
USP são as Instituições sede da coordenação do iii que tem como coordenador o Professor
Jorge Kalil. Estas Instituições estão compromissadas com o desenvolvimento de projetos de
pesquisa em imunobiológicos e vacinas em Febre Reumática, Doença de Chron,
Leishmaniose, Infecção por HIV, Imunodeficiências, Alergias, Transplante e Câncer. Nessas
instituições sede da coordenação do iii, disponibilizamos para todos algumas unidades de
tecnologias avançadas, como unidade multiusuária de proteômica, análise por ELISPOT e
genômica funcional, produção de proteínas recombinantes e unidade para síntese de
peptídeos. Essas Instituições também são responsáveis, junto com a FIOCRUZ-BA, pela
Plataforma de Ensino e Interação com a Sociedade, abrigando o núcleo do grupo de
formação e ensino, assim como pela Plataforma de Ensaios Clínicos e Epidemiologia.
122
Cada
instituição
participante
do
iii
tem
compromisso
com
o
desenvolvimento/colaboração de algum projeto dentro de alguma linha de pesquisa temática
ou tem a responsabilidade por alguma plataforma horizontal, compartilhada com diversos
projetos e grupos. Durante os primeiros anos, trabalhamos na integração do grupo como um
todo, estreitamos interfaces entre os diversos subprojetos, gerando novas colaborações.
Nesta nova etapa, este trabalho será intensificado e aprimorado visando um maior
investimento na geração de vacinas moleculares ou celulares e imunobiológicos. Para a
consolidação do ciclo das rotas científico-tecnológicas e a efetivação da produção de
imunobiológicos e vacinas, contamos com expertise do Instituto Butantan na produção em
média/larga escala em condições GMP e estamos estreitando relações com setores da
indústria farmacêutica para a futura produção e comercialização desses produtos.
Cada uma das Instituições envolvidas no projeto tem um representante, cada linha
de pesquisa temática e cada plataforma horizontal tem um responsável, e cada subprojeto
dentro destas linhas de pesquisa tem um responsável. Os recursos financeiros ficam sob a
responsabilidade do grupo gestor (Caracterização da Rede). O novo desembolso seguirá a
alocação prevista no orçamento. A proposta é manter a criação de uma reserva que o
coordenador distribuirá segundo opções estratégicas surgidas durante o desenvolvimento do
projeto.
Para a viabilização do trabalho em rede, contamos com: reuniões periódicas para
discussões científicas dos resultados, do estado da arte, e para a busca de novas estratégias
dentro de cada linha de pesquisa, assim como sobre estratégias globais para a formação
técnico-científica de nossos profissionais e alunos. Realizaremos cursos de interesse geral
dos intergrantes do iii como escrita científica, qualidade e propriedade intelectual, etc.
usando técnicas para ensino a distância. Contamos também com o site do iii
(http://www.iii.org.br), no qual disponibilizamos diversos documentos, artigos publicados por
pesquisadores do iii, e podcasts de seminários e discussões temáticas, e começaremos a
disponibilizar uma área esecífica para interação com a sociedade, como descrito na
Plataforma de Ensino e Relação com a Sociedade.
O Núcleo Gestor do iii é constituído pelo Prof. Jorge Kalil (coordenador geral do iii),
Prof. Manuel Barral (vice-coordenador), Dra. Ana Moro, Prof. Mario Palma, Dr. Esper Kállas
e Prof. Luiz Vicente Rizzo. A Dra. Ana Moro (responsável pela plataforma de produção de
imunobiológicos) participa pela importância que esta plataforma tem no escopo desta
proposta, o Prof. Mario Palma (coordenador da plataforma de proteômica e participante de
várias linhas de pesquisa e outras plataformas) pela representatividade dentro das linhas de
pesquisa e pela importância da plataforma de proteômica dentro do fluxo de pesquisa básica
no iii, o Dr. Esper Kállas (coordenador da plataforma de qualidade, de ensaios clínicos e
epidemiologia e co-responsável pela linha de pesquisa em HIV/AIDS) pela importância das
plataformas que ele representa dentro rota tecnológica proposta pelo instituto e o Prof. Luiz
Vicente Rizzo (responsável pela linha de imunodeficiências) por representar o grupo
123
envolvido nos testes diagnósticos utilizados e a ser desenvolvidos pelo iii. O Núcleo Gestor
do iii, tem reuniões a cada 6 meses para tratar das questões estratégicas do nosso Instituto,
distribuição de recursos e planejamento das atividades.
A cada reunião, os pesquisadores elaboram um relatório dos progressos obtidos no
período, os problemas encontrados e as soluções propostas. Ao final da reunião, é
apresentado pelo coordenador ou relatores da reunião, o plano estratégico definido para o
próximo período. A nossa proposta é que as reuniões continuem sendo itinerantes uma vez
que permitem o conhecimento dos diversos lugares de atuação do iii e a participação de
colaboradores e alunos daquela localidade. Também realizaremos reuniões periódicas em
função da necessidade de cada linha de pesquisa temática. A cada semestre será gerado
um relatório do progresso das atividades de cada linha de pesquisa temática e plataforma
horizontal, incluindo dados objetivos, problemas encontrados, soluções propostas e a
previsão para o próximo período. Este relatório será disponibilizado num “site” na internet
(http://www.iii.org.br). Terão acesso à estas informações todos os participantes do projeto, e
o grupo de pesquisadores do iii (constituído pelos 33 investigadores principais descritos
nesta proposta).
Mantendo a mesma proposta da primeira etapa, reservamos a última reunião de
cada ano para todos os integrantes do iii, incluindo alunos e alguns colaboradores nacionais
e internacionais. Esta reunião tem o formato de congresso, com apresentação e discussão
dos dados científicos e produtos obtidos em cada um dos subprojetos, assim como um
balanço e discussão sobre as diversas plataformas horizontais. É um espaço importante de
debate científico e de discussão sobre novos caminhos. A identificação de novas interfaces é
continuamente estimulada nas reuniões, de forma a manter sempre ativa a construção de
novas ramificações no nosso trabalho em rede.
INSTITUIÇÕES PARTICIPANTES E CONTRIBUIÇÕES DENTRO DO iii:
SÃO PAULO:
Universidade de São Paulo (USP): 1) Disciplina de Imunologia Clínica e Alergia da
Faculdade de Medicina (DICA-FMUSP); 2) Laboratório de Imunologia do Instituto do
Coração (InCor-FMUSP) - Instituições sede da coordenação do iii. Projetos em Alergia,
Doenças auto-imunes, HIV/AIDS, Imunodeficiências primárias, Transplante e Imunoregulação, e Câncer. Plataformas de Proteômica, de Ensino e Interação com a
Sociedade, de Epidemiologia e Ensaios Clínicos, de Qualidade, e de Imunobiológicos;
3) Departamento de Moléstias Infecciosas e Parasitárias da Faculdade de Medicina (MIFMUSP) – participação no projeto HIV/AIDS; 4) Disciplina de Cirurgia de Cabeça e
Pescoço (DCCP-FMUSP)
Projeto Câncer-Imunoterapia 5)
Instituto de
Ciências
124
Biomédicas (ICB-USP) – Projeto Imunodeficiências primárias; 6) Departamento de
Epidemiologia da Faculdade de Saúde Pública (Epidemio-FSP-USP) – Plataforma de
Epidemiologia e Ensaios Clínicos; 7) Núcleo de Terapia Celular (NUCEL-USP) –
Plataforma Imunogenômica.; 8) Departamento de Pediatria - Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto (Pediatria-FMRP) – Projetos em Alergia. 9) Faculdade de Medicina
Veterinária
e
Zootecnia
(FMVZ-USP)
Ensaios
pré-clínicos
na
Plataforma
de
Imunobiológicos
Instituto Butantan (IB): 10) Laboratório de Biofármacos em Célula Animal –Plataformas
de Imunobiológicos e de Qualidade
Instituto Ludwig de Pesquisa contra o Câncer (LICR): 11) Projeto CâncerImunoterapia e Plataforma de Bioinformática
Universidade Estadual de São Paulo (UNESP): 11) Laboratório de Biologia Estrutural e
Zooquímica - Instituto de Biociências de Rio Claro – Projeto Alergia e Plataformas
Proteômica e de Qualidade.
BAHIA:
Fundação Oswaldo Cruz-Bahia (FIOCRUZ-BA): 12) Laboratório Integrado de
Microbiologia e Imunorregulação (LIMI) – Sede da Vice-ccordenação do iii - Projetos
Doenças infecciosas- Leishmaniose, Plataforma de Ensino e Interação com a Sociedade
13) Laboratório de Imunoparasitologia - (LIP) - Projetos Doenças infecciosasLeishmaniose.
BRASÍLIA:
Universidade de Brasília (UnB): 14) Laboratório de Biologia Molecular do Departamento
de Biologia Celular – Instituto de Ciências Biológicas - Projetos em Transplante e Imunoregulação e HIV/AIDS, Plataforma de Bioinformática,.
MINAS GERAIS:
Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG): 15) Laboratório de Imunobiologia Departamento Bioquímica e Imunologia - Projeto em Doenças auto-imunes e Transplante
RIO DE JANEIRO:
Escola Nacional de Saúde Pública-Fundação Oswaldo Cruz (ENSP-FIOCRUZ): 16)
Escola Nacional de Saúde Pública: Plataforma de Epidemiologia e Ensaios Clínicos
125
RIO GRANDE DO SUL:
Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul (PUCRS): 17) Laboratório de
Nefrologia do Instituto de Pesquisas Biomédicas - Departamento de Medicina Interna –
Projeto Transplante e Imunoregulação.
SERGIPE
Universidade Federal de Sergipe (UFS): 18) Campus de Ciências da Saúde. Projetos
Doenças Infecciosas-Leishmaniose e Doenças auto-imunes. Plataforma de ensaios
clínicos.
126
Interações dentro do iii
Grupo/Linhas
Pesquisa
Alergias
Transplante
e Imunoregulação
Imunodeficiências
Primárias
HIV/AIDS
Doenças
InfecciosasLeishmaniose
Doenças
Auto-imunes
DICA-FMUSP
InCor-FMUSP
Epidemio-FSPUSP
MI-FMUSP
DCCP-FMUSP
ICB-USP
Nucel-USP
FMVZ-USP
Clín. MédicaFMRP
I. Butantan
I. Ludwig
UNESP
UnB
FIOCRUZ-BALIMI
FIOCRUZ-BA-LIP
LI-ICB-UFMG
ENSP-FIOCRUZ
LVM-UFRJ
PUCRS
UFS
Descrição do grupo proponente.
São considerados membros nucleares do iii, 33 pesquisadores com nível de
doutorado, efetivamente engajados em todas as etapas de construção do Instituto. Junto
com esses pesquisadores nucleares, também participam do nosso Instituto 29 pósdoutorandos, 59 alunos de doutorado, 33 de mestrado, 69 de iniciação científica, 33 técnicos
e 57 pesquisadores colaboradores nacionais e 15 colaboradores internacionais. A riqueza
deste Instituto é aglutinar pesquisadores com conhecimentos e expertises complementares,
em imunologia fundamental, imunologia clínica, biotecnologia e pesquisa clínica. Esses
saberes somam-se e se traduzem em aplicação em saúde, e podem alavancar rota
Câncer
127
científico/tecnológica,
permitindo
a
geração
de
produtos
diagnósticos,
vacinais,
imunobiológicos e inovando, assim, abordagens terapêuticas para doenças com base
imunológica. O nosso instituto também é inovador na sua proposta de compartilhar a
experiência pedagógica de formação continuada de pesquisadores, alunos e técnicos
envolvidos no trabalho científico/tecnológico na imunobiologia médica. Pretendemos, deste
modo, construir um espaço de formação com uma visão ampla, crítica, ética e criativa para a
busca de novas soluções para problemas biomédicos de relevância no país.
Grupo proponente:
Jorge Kalil: Médico, Prof. Titular da Disciplina de Imunologia Clínica e Alergia e Diretor do
Laboratório de Imunologia do Instituto do Coração da Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo. Pesquisador 1A do CNPq. Linhas de pesquisa principais:
Imunologia
de
transplantes,
Auto-imunidade,
Imunogenética.
Atividades
no
iii:
Coordenador do iii. Investigador nos projetos de pesquisa em Alergia, Doenças autoimunes, Imunodeficiências primárias, Transplante e imuno-regulação, HIV/AIDS, e Câncer.
Manoel Barral-Netto: Médico com doutorado em Patologia Humana. Pesquisador Titular do
Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz-FIOCRUZ, Chefe do Laboratório de Imuno-regulação
(LIMI). Pesquisador 1-A do CNPq. Professor Titular da Disciplina de Imunologia - FAMEBUFBA. Principais linhas de pesquisa: Imunoparasitologia e Imunopatologia humana e
experimental. Atividades no iii: Vice-coordenador do iii. Participação dos subprojetos em
leishmaniose e nas plataformas de epidemiologia e ensaios clínicos, e educação e interação
com a sociedade.
Aldina Maria Prado Barral: Médica com doutorado em Patologia Humana, Pesquisadora
Titular do Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz-FIOCRUZ, Chefe do Laboratório de
Imunoparasitologia (LIP). Pesquisadora 1-B do CNPq. Professor Adjunto da Disciplina de
Imunologia
-
FAMEB-UFBA.
Principais
linhas
de
pesquisa:
Imunoparasitologia
e
Imunopatologia humana e experimental. Atividades no iii: Participação dos subprojetos em
leishmaniose e nas plataformas de imunogenômica, epidemiologia e educação e interação
com a sociedade.
Aluisio Augusto Cotrim Segurado: Médico infectologista, Livre-Docente em Doenças
Infecciosas e Parasitarias pela Faculdade de Medicina da USP; Professor Associado do
Departamento de Moléstias Infecciosas e Parasitarias da FMUSP; Coordenador Científico do
Serviço de Extensão ao Atendimento a Pacientes HIV/AIDS da Divisão de Clínica de
Moléstias Infecciosas e Parasitárias do Hospital das Clínicas da FMUSP (SEAP-HIV/AIDSHC-FMUSP); Pesquisador do Laboratório de Investigação Médica em Virologia (LIM-52) do
HC-FMUSP; Pesquisador Nível 2 do CNPq. Principais linhas de pesquisa: Retrovirologia
clínica e laboratorial. Atividades no iii: Participação em subprojetos em infecção por HIV.
128
Amélia Maria Ribeiro de Jesus: Médica, doutorado em medicina (Imunologia Clínica),
Professora Adjunto de Medicina, Pesquisadora do Laboratório de Biologia Molecular.
Pesquisadora 1C do CNPq. Principais linhas de pesquisa: Imunologia e Imunogenética
humana. Atividades no
iii: Participação dos subprojetos em
Febre Reumática,
Imunodeficiências, Imunoprofilaxia e Imunoterapia na Leishmaniose Visceral e Plataforma de
Formação e Ensino e Plataforma de Ensaio Clínico.
Amilcar Tanuri: Médico, doutor em Genética. Professor adjunto da Universidade Federal do
Rio de Janeiro e é chefe do Laboratório de Virologia Molecular. Bolsista de Produtividade em
Pesquisa do CNPq - Nível 1D. Trabalhou de 2003 a 2006 como Research Fellow no Center
for Disease Control (CDC) em Atlanta, USA, dentro do Global AIDS Program (GAP) atuando
no combate ao HIV/AIDS na África Sub-Saariana. Tem experiência na área de Virologia e
Genética, com ênfase em Retrovirologia, atuando principalmente nos seguintes temas: HIV1, (subtipos, diversidade genética), HIV, SIV, HCV, e resistência à droga. Atividades no iii:
genotipagem, ensaios de neutralização, e resistência a inibidores da protease do HIV em
subprojetos HIV/AIDS.
Anna Carla Goldberg: Bióloga, Livre-Docente em Imunologia. Pesquisadora Associada do
NUCEL. Pesquisador 1B do CNPq. Líder dos grupos de pesquisa do CNPq: Imunologia e
Imunogenética Humana, Terapia Celular para Regeneração Hepática. Linhas de pesquisa
principais: Polimorfismo Genético na população brasileira e em diversas doenças infecciosas
e auto-imunes, Monitoração de marcadores de estresse celular em células beta
pancreáticas, Diferenciação de hepatócitos a partir de células-tronco (modelo de ensaio préclínico). Atividades no iii: Responsável pela plataforma de Imunogenômica; Co-responsável
pela linha de Imunodeficiências (leptina).
Ana Maria Caetano de Faria: Médica, Doutora em Imunologia, Professora Associada 2 do
Departamento de Bioquímica e Imunologia, ICB – UFMG, Sub-Coordenadora do Programa
de Pós-Graduação em Bioquímica e Imunologia (UFMG), Pesquisadora 1B do CNPq, Chefe
do Laboratório de Imunobiologia (UFMG), Principais linhas de pesquisa: Imunologia de
Mucosas, Tolerância oral, Imunbiologia da Nutrição, Imunobiologia do Envelhecimento em
modelos experimentais e humanos. Atividades no iii: Responsável pelo sub-projeto em
Doença de Crohn e participação na área temática de Doenças auto-imunes.
Anamaria Aranha Camargo: Bióloga, Doutora em Ciências. Diretora Associada e Membro
Associado do Instituto Ludwig de Pesquisa Sobre o Câncer. É bolsista de Produtividade em
Pesquisa do CNPq - Nível 1C. Possui vasta experiência na área de Genética e Biologia
Molecular, com ênfase em Genética Humana e Médica. Linhas de Pesquisa que atua:
Análise de dados do projeto genoma humano do câncer; Isolamento de seqüência de DNA
diferencialmente metiladas em tumores de mama; Caracterização do envolvimento de
membros da família ADAM no processo de formação e progressão tumoral; Identificação in
silico e caracterização experimental de novos antígenos tumorais da classe dos CT (câncer-
129
testis); Identificação de novos genes regulados pela super-expressão do oncogene c-erbB2
em tumores de mama; Atuação em redes de sequenciamento de genomas bacterianos
(ONSA, BRGene, GeneSul). Atividades no iii: Coordenação dos estudos relacionados à
biologia molecular e genética médica na área temática Câncer-imunoterapia.
Ana Maria Moro: Bióloga, Doutora em Genética,, Pesquisador Científico VI do I. Butantan,
Pesquisador 1D de Produtividade em Desenvolvimento Tecnológico e Extensão Inovadora
do CNPq, Diretora do Lab. de Anticorpos Monoclonais (IBU). Ex-diretora do Centro de
Biotecnologia (IBU), Membro do Conselho de Produção e Desenvolvimento Tecnológico
(IBU), Membro da Comissão Científica do PEACe (Protein Expression in Animal Cells), Sócio
Ordinário da ESACT (European Society for Animal Cell Technology). Linhas principais de
pesquisa: Desenvolvimento de linhagens celulares produtoras de anticorpos monoclonais
humanizados, Desenvolvimento de processos de cultivo e purificação de biofármacos
recombinantes em células de mamíferos em condições GMP. Atividades no iii: Participação
na Área Temática Transplantes e responsável pela Plataforma de Imunobiológicos.
Andrea Maranhão: Bióloga, Doutora em Biologia Molecular, Professora Adjunto IV da
Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Laboratório de Imunologia
Molecular. Principais linhas de pesquisa: Humanização de Anticorpos de Interesse Clínico,
Produção de Insumos Biológicos Recombinantes, Obtenção de Anticorpos Monoclonais por
Phage Display. Atividades no iii: Participação nos subprojetos: “Obtenção de anticorpos
humanizados anti-CD3 humano”, “Análise do perfil de reatividade do repertório de anticorpos
de pacientes transplantados” e “Caracterização do potencial neutralizante de Ac anti-HIV
obtidos por phage display”.
Claudia Ida Brodskyn: Biomédica com doutorado em Imunologia. Pesquisadora Titular do
Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz-FIOCRUZ. Pesquisador 1-C do CNPq. Professora
Adjunta da Disciplina de Imunologia - Inst. de Ciências da Saúde - UFBA. Principais linhas de
pesquisa: Imunoparasitologia e Imunopatologia humana e experimental. Atividades no iii:
Participação dos subprojetos em Doenças Infecciosas-leishmaniose e nas plataformas de
epidemiologia e educação e interação com a sociedade.
David Saitovitch: Médico, Doutor em Imunologia de Transplantes, Prof. adjunto do
departamento de medicina interna da PUCRS, Médico do Serviço de Nefrologia do Hospital
São Lucas da PUCRS. Linhas de pesquisa principais: Imunologia de transplante. Atividades
no iii: Participação na área temática de transplantes, nos subprojetos de pacientes com
longo tempo de transplante, nos modelos experimentais de transplantes de ilhotas
pancreáticas em camundongos, e nos projetos com o anticorpo humanizado anti-CD3.
Edecio Cunha-Neto: Médico e Livre-Docente em Imunologia Clínica e Alergia, Professor
Associado do Departamento de Clínica Médica e Pesquisador do Instituto do Coração,
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Chefe do Laboratório de Imunogia
130
Clínica e Alergia (LIM-60), Disciplina de Imunologia Clínica e Alergia-FMUSP. É pesquisador
1B do CNPq. É membro do Comitê de Vacinas Anti-HIV do Programa Nacional de DST/AIDS
do Ministério da Saúde. Atividades no iii: Coordenador da área temática HIV/AIDS no iii.
Participa da plataforma de proteômica.
Esper G. Kallás: Médico e Doutor em Imunologia. Médico pesquisador da Disciplina de
Imunologia Clínica e Alergia da FMUSP/LIM-60, pesquisador nível 1D do CNPq, e Professor
Adjunto da Disciplina de Doenças Infecciosas da Universidade de Rochester, NY. Coordena
um grupo de pesquisa sobre patogênese do HIV no LIM-60, com colaborações nacionais e
internacionais. Investigador principal de vários projetos que receberam financiamento dos
NIH, incluindo o São Paulo Clinical Trials Unit e de um dos centros do protocolo iPrEx, que
estudará uma nova estratégia de prevenção da transmissão do HIV, financiado também pela
Fundação Bill & Melinda Gates. Membro do Comitê de Vacinas Anti-HIV do Programa
Nacional de DST/AIDS do Ministério da Saúde e vem conduzindo pesquisa clínica desde
1993 e projetos no estudo da patogênese do HIV desde 1996. Atividades no iii: Divide a
coordenação da área temática HIV/AIDS no iii.
Ester Cerdeira Sabino: Médica, Livre Docente em Hematologia e Hemoterapia, e chefe do
Departamento de Biologia Molecular da Fundação Pró Sangue Hemocentro de São Paulo.
Pesquisadora nível 2
do CNPq
e investigadora principal
do projeto Retrovirus
Epidemiological Donor Study II International. Sua principal linha de pesquisa é segurança
transfusional e diversidade genética do HIV. Atividades no iii: Participação dos subprojetos
de HIV e Imunogenética.
Fábio F M Castro: Médico, Livre-docente em Imunologia Clínica e Alergia, Professor
Associado da Disciplina de Imunologia Clínica e Alergia do Departamento de Clínica Médica
da FMUSP; Supervisor do Serviço de Imunologia Clínica e Alergia do Hospital das Clínicas
da FMUSP. Experiência clínica e de pesquisa na área de alergia e pesquisador principal de
vários projetos de pesquisa clínica fase II, III e IV. Atividades no iii: Coordenador da área
temática Alergia e do projeto GENAR (grupo de estudos de novos alérgenos regionais);
Colaborador da implantação de bioinformática estrutural.
Francisco Inácio P. Bastos: Médico, doutor em Saúde Pública, Pesquisador titular da
Fundação Oswaldo Cruz e pesquisador visitante honorário do Imperial College, Londres,
Reino
Unido.
Pesquisadora
nível
1B
do
CNPq.
Desenvolve
pesquisas
voltadas
especialmente para a epidemiologia e prevenção do abuso de drogas e do HIV/AIDS.
Atividades no iii: Plataforma de epidemiologia e ensaios clínicos.
Guilherme Werneck: Médico, doutor em Epidemiologia e pesquisador 1C do CNPq.
Atualmente desenvolve suas atividades de pesquisa no Departamento de Endemias Samuel
Pessoa da Escola Nacional de Saúde Pública da FIOCRUZ. Investigador principal de
pesquisas
financiadas
pelo
CNPq
enfocando
o
desenvolvimento
de
métodos
131
epidemiológicos, estatísticos e computacionais aplicados ao estudo de doenças infecciosas.
Atividades no iii: Apoio à análise estatística dos dados e formação de recursos humanos
capacitados em métodos epidemiológicos e estatísticos. Participará da plataforma de
epidemiologia e ensaios clínicos.
Gustavo Amarante-Mendes: Biomédico, doutor em Imunologia. Professor Doutor no Depto.
Imunologia ICB-USP. Pesquisador 1C do CNPq. Linhas de pesquisa principais: ativação e
diferenciação celular, apoptose. Atividades no iii: Participação em estudos de ativação e
morte celular programada em câncer e na plataforma de proteômica.
Luisa Karla de Paula Arruda: Médica, Livre-Docente e Professora Associada da Disciplina
de Imunologia Clínica do Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FMRP-USP). Chefe do Serviço de Alergia e
Coordenadora do Programa de Residência Médica em Alergia e Imunologia do Hospital das
Clínicas da FMRP-USP. Chefe do Laboratório de Alergia da FMRP-USP. Pesquisadora nível
2 do CNPq. Principais linhas de pesquisa: Identificação, clonagem molecular e expressão
recombinante de alérgenos de ácaros e barata; fatores de risco para o desenvolvimento de
alergia
e
asma;
imunoterapia
alérgeno-específica;
relação
entre
parasitoses
e
desenvolvimento de alergia e asma; estudo da reatividade cruzada IgE. Atividades no iii:
Participação nos subprojetos em alergia
Luiz Carlos de Sá Rocha: Médico veterinário, Doutor em Patologia Experimental e
Comparada, Professor Doutor da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia-FMVZUSP. Principais linhas de pesquisa: Toxicologia, organofosforados. Atividade no iii: Estudos
pré-clínicos na plataforma de imunobiológicos.
Luiz Vicente Rizzo: Médico, Professor titular de imunologia da USP, presquisador 1A do
CNPq. Principais linhas de pesquisa: Imunodeficiências primárias, Imunologia Ocular,
Transplantes. Atividades no iii: Coordenador do subprojeto de Imunodeficiências. Participa
nos projetos de Imunodeficiências/Transplante e plataforma de Ensino e Integração com a
Sociedade.
Luiza Guilherme: Farmacêutica, Livre Docente em Imunologia. Pesquisadora do Laboratório
de Imunologia do InCor-FMUSP. Pesquisador 1D do CNPq. Atividades no iii: Responsável
pela linha de pesquisa Doenças auto-imunes e pelo subprojeto de desenvolvimento da
vacina contra o estrepotococo.
Marcelo M Brigido: Biólogo, Doutor em Bioquímica, Professor Associado I da Universidade
de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Laboratório de Imunologia Molecular.
Pesquisador 2 do CNPq. Principais linhas de pesquisa: Humanização de Anticorpos de
Interesse Clínico, Produção de Insumos Biológicos Recombinantes, Bioinformática e
Genômica Comparativa. Atividades no iii: Participação nos subprojetos: “Obtenção de
anticorpos humanizados anti-CD3 humano”, “Análise do perfil de reatividade do repertório de
132
anticorpos de pacientes transplantados” e “Caracterização do potencial neutralizante de Ac
anti-HIV obtidos por phage display”.
Maria Regina Alves Cardoso: Cirurgiã dentista, Doutora em Epidemiologia, Profa.
Associada do Departamento de Epidemiologia da Faculdade de Saúde Pública da USP.
Pesquisador 2 do CNPq. Líder do grupo de pesquisa do CNPq: Observatório de Saúde
Pública, Ambiente e Diversidade Social. Linhas de pesquisa principais: Epidemiologia do
ciclo de vida e dos agravos à saúde, Ambiente e Saúde, Doenças respiratórias na infância.
Atividades no iii: Co-responsável pela Plataforma de Epidemiologia e Ensaios Clínicos.
Mario Sergio Palma: Químico, Livre Docente. Professor Adjunto da disciplina de Análise
Proteômica do Instituto de Biociências de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista
(UNESP), em Rio Claro, SP. Coordenador do Laboratório de Biologia Estrutural e
Zooquímica do Centro de Estudos de Insetos Sociais (CEIS). Pesquisador 1B do CNPq.
Experiências em pesquisa e desenvolvimento: Análise estrutural de macromoléculas
(proteínas e peptídeos; Química de proteínas e peptídeos; Enzimologia geral; Síntese
orgânica; Desenho de drogas. Atividades no iii: Responsável pela Plataforma Proteômica
do iii, identificação de componentes peptídicos de ação inflamatória nos venenos de insetos;
identificação das proteínas imunogênicas principais; Responsável pela implantação da
Bioinformática Estrutural dentro do iii e pela elaboração das estratégias de análises.
Osmar Malaspina: Biólogo, Professor Livre docente do Depto de Biologia e pesquisador do
Centro de Esudos de Insetos Sociais do IB-UNESP, Rio Claro. Pesquisadora nível 1D do
CNPq Atua nas áreas de Zoologia, com ênfase em Zoologia Aplicada e em Biologia Celular.
Pesquisas com enfoque principal nos seguintes temas: insetos sociais (biologia,
comportamento, controle, toxicidade, interação abelha-planta, conservação de polinizadores
e produtos apícolas). Atuação no iii: Área temática de alergias
Pedro Giavina Bianchi: Médico, Professor Livre-docente da Disciplina de Imunologia Clínica
e Alergia do Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina da Universidade de
São Paulo e Médico responsável pelo Ambulatórios do Serviço de Imunologia Clínica e
Alergia do Hospital das Clínicas de São Paulo. Experiência em pesquisa clínica em pacientes
com asma. Atividades no iii: Responsável pelos subprojetos de asma na Área de Alergia.
Participação nos projetos de Doencas autoimunes-Vacina para a febre reumática e de
Oncologia.
Pedro Michaluart Junior: Médico e Doutor em Medicina, foi Research Fellow no Memorial
Sloan Kettering Cancer Center de 1996 a 1998. Atualmente Professor colaborador da
Faculdade de Medicina da USP, médico assistente do HCFMUSP, co-responsável pelo
laboratório de investigações médicas 28 do HCFMUSP. Atividades no iii: Coordenará o
ensaio clínico com DNA-Hsp65 no CA epidermoide cabeça e pescoço.
133
Roque Pacheco de Almeida: Médico, Professor adjunto de Clinica Médica da Universidade
Federal de Sergipe, doutorado em medicina, Imunologia Clínica, Professor Adjunto de
Medicina, Chefe do Laboratório de Biologia Molecular. Pesquisador 1D do CNPq. Principais
linhas de pesquisa: Imunologia e Imunoterapia humana. Atividades no iii: Participação dos
subprojetos em colaboração com Doenças Infecciosas-Leishmaniose, Doenças autoimunesFebre Reumática, Imunodeficiências primárias, e Plataformas de Ensino e Relação com a
Sociedade e Plataforma de Epidemiologia e Ensaios Clínicos.
Sandro José de Souza: Bioquímico e doutor em Bioquímica. Membro associado do Instituto
Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer. Pesquisador do CNPq - Nível 1D. Tem experiência na
área de Genética, com ênfase em Bioinformática, Transcriptoma e Genômica, atuando
principalmente nos seguintes temas: câncer e evolução molecular. Atividades no iii: Área
temática de Câncer.
Verônica Coelho: Médica com doutorado em Imunologia, Pesquisadora no Laboratório de
Imunologia - Instituto do Coração. Pesquisadora 1D do CNPq. Coordena grupo de pesquisa
em Imunologia de transplantes, auto-imunidade e imunorregulação e é responsável pelo
Laboratório de Experimentação Animal do Laboratório de Imunologia - InCor. Linhas de
Pesquisa principais: Imunologia de Transplantes, Auto-imunidade e Imunorregulação e
terapia celular.
Atividades no iii: Responsável pela linha de pesquisa temática
Transplantes e Imunorregulação e pela Plataforma de Ensino e Interação com a Sociedade
do iii (junto com o vice-coordenador, Manoel Barral).
1. J. Kalil
2. E. Cunha
3. E. Kallas
4. F.M. Castro
5. P.G. Bianch
6. L. Guilherme
7. V. Coelho
8. A. Segurado
9. PG. Michaluart
10. LV. Rizzo
11. G.A. Mendes
12. A.C. Goldberg
13. L.C. Rocha
14. M.R. Cardoso
15. A.M. Moro
16. O. Maslapina
17. M.S. Palma
18. L.K. Arruda
19. A.Camargo
20. S. Souza
21. R. Almeida
22. A. Jesus
23. C. Brodskyn
24. A. Barral
25. M. Barral
26. M.Brígido
27. A. Maranhão
28. Ester Sabino
29. G. Werneck
30. F. I. Bastos
134
31. A. Tanuri
32. D. Saitovitch
135
Intercâmbio científico dos pesquisadores envolvidos no projeto.
Todos os projetos de pesquisa dentro do iii têm interface e colaboração com pelo menos
outro grupo do Instituto. Nesta nova etapa do iii, retiramos do instituto projetos que não
permitiam o trabalho colaborativo e estabelecemos novas interfaces entre os diferentes
grupos integrantes do iii. Elaboramos duas tabelas para ilustrar as interações existentes
entre as diferentes instituições, linhas de pesquisa e pesquisadores. O intercâmbio se dá
através de visitas científicas dos pesquisadores e alunos aos grupos colaboradores,
realização de experimentos em conjunto, estágios de treinamento em diferentes grupos do iii,
discussões pela internet e em encontros do iii já descritos na Caracterização da Rede ou em
reuniões específicas sobre uma das linhas de pesquisa, além da apresentação e publicação
de trabalhos em conjunto.
136
INTERCÂMBIO DOS PESQUISADORES: PARTICIPAÇÃO EM LINHAS DE PESQUISA TEMÁTICAS
Pesquisador/Linhas
Pesquisa
Jorge KalilINCOR/FMUSP
Manoel Barral-FIOCRUZBA
Aldina Barral-FIOCRUZBA
Aluísio Segurado-MIFMUSP
Amélia de Jesus-UFS
Amilcar Tanuri-UFRJ
Ana C. Faria-UFMG
Ana Maria Moro-I.
Butantan
Anamaria CamargoI.Ludwig
Andréa Q. Maranhão-UnB
Anna C. Goldberg-NUCEL
Claudia BrodskynFIOCRUZ-BA
David Saitovitch-PUCRS
Edecio Cunha Neto-DICAFMUSP
Esper G. Kallás-DICAFMUSP
Ester Sabino-F. Pró
Sangue
Fábio M. Castro-DICAFMUSP
Francisco I. Bastos-ENSP
Guilherme Werneck-ENSP
Gustavo A. Mendes ICBUSP
Luisa Karla Arruda-FMRP
Luiz C. Sá Rocha-FMVZUSP
Luiz Vicente Rizzo-ICBUSP
Luiza Guilherme-INCOR
Marcelo Brígido-UnB
M. Regina Cardoso-FSP-
Alergias
Transplante
e Imunoregulação
Imunodeficiência
s Primárias
HIV/AIDS
Doenças
Tropicais
Doenças
Auto-imunes
Câncer
137
USP
Mario S. Palma-UNESP
Osmar Malaspina-UNESP
Pedro Bianchi -DICAFMUSP
Pedro Michaluart
DCCP/FMUSP
Roque P. de Almeida-UFS
Sandro J. de Souza-I.
Ludwig
Verônica Coelho-INCOR
Pesquisador/Plataforma
Jorge KalilINCOR/FMUSP
Manoel Barral-FIOCRUZBA
Aldina Barral-FIOCRUZBA
Aluísio Segurado-MIFMUSP
Amélia de Jesus-UFS
Amilcar Tanuri-UFRJ
Ana C. de Faria-UFMG
Ana Maria Moro-I.
Butantan
Anamaria CamargoI.Ludwig
Andréa Q. MaranhãoUnB
Anna C. GoldbergNUCEL
Claudia BrodskynFIOCRUZ-BA
David Saitovitch-PUCRS
Edecio Cunha NetoDICA-FMUSP
Esper G. Kallás-DICAFMUSP
Ester Sabino-F. Pró
Sangue
Fábio M. Castro-DICAFMUSP
Francisco I. Bastos-
Imunogenômica
Proteômica
Epidemiologia e
Ensaios
Clínicos
Imunobiológicos
Bioinformática
Qualidade
Ensino e
interação
c/ a
socied.
138
ENSP
Guilherme WerneckENSP
Gustavo A. Mendes ICBUSP
Luisa Karla ArrudaFMRP
Luiz C. Sá Rocha-FMVZUSP
Luiz Vicente Rizzo-ICBUSP
Luiza Guilherme-INCOR
Marcelo Brígido-UnB
M. Regina Cardoso-FSPUSP
Mario S. Palma-UNESP
Osmar MalaspinaUNESP
Pedro Bianchi -DICAFMUSP
Pedro Michaluart
DCCP/FMUSP
Roque P. de AlmeidaUFS
Sandro J. de Souza-I.
Ludwig
Verônica Coelho-INCOR
139
6.
INFRAESTRUTURA
Área, Instalações Disponíveis e Apoio Administrativo
CIRURGIA DE CABEÇA E PESCOÇO – HC/FMUSP
O tratamento dos pacientes incluídos no ensaio clínico proposto será realizado no
Serviço de Cirurgia de Cabeça e Pescoço do HCFMUSP que consiste de 18 leitos de
internação, localizados no oitavo andar do Instituto Central do Hospital das Clínicas, e 10
salas atendimento ambulatorial, localizadas no prédio dos ambulatórios do HC. Disponibiliza
ainda para os pacientes, atendimento psicológico e fonoaudiológico.
Nesse serviço são
realizadas anualmente aproximadamente 50 cirurgias com intenção curativa para carcinoma
epidermóide de cavidade oral .
O Serviço conta também com o laboratório de investigação médica número 28 que
2
fica localizado no segundo andar da Faculdade de Medicina da USP e tem 35m . Esse
laboratório está equipado para fazer a coleta e armazenamento de material biológico e de
dados pertinentes ao estudo. Os dois freezer -80ºC ficam localizados em sala específica na
Faculdade de Medicina que possui gerador próprio.
Centro de Estudos de Insetos Sociais (CEIS) – UNESP
Cinco laboratórios (Entomologia, Microbiologia, Apicultura, Biologia Molecular e
2
Biologia Estrutural & Zooquímica). O CEIS possui 1800 m de área construída, de modernas
instalações para pesquisa e administração, com estação de tratamento de água, geradores
de energia, no-break e câmaras frias. Infra estrutura do Laboratório de Biologia Estrutural &
2
Zooquímica: cerca de 660m de área completamente equipada com 2 geradores de energia
(Potencia total de 400 KWa), 3 sistema no-Brake (60 Kwa), dotados de ar condicionado
central de 1200 BTU de potência, poço artesiano e sistemas de tratamento de água e
resíduos químicos. O grupo conta com secretaria própria, realizando sua administração
contábil internamente.
Clínica Médica FMRP
2
O Laboratório compreende área de 110m para biologia molecular, produção de
alérgenos recombinantes e métodos sorológicos. Colaborações internacionais incluem a
companhia de biotecnologia Indoor Biotechnologies Inc., Charlottesville, VA, USA (Dr. Martin
Chapman), e a University of Salzburg (Prof. Fátima Ferreira-Briza).
140
DIB-ICB-UFMG
Laboratório com 100 m
2
contando com equipamento para cultura de células, biologia
molecular, testes funcionais imunológicos.
2
Biotério Experimental do Laboratório de Imunobiologia – 150m contando com estrutura para
manutenção
de
camundongos
em
experimentação,
micro-isoladores
para
animais
geneticamente modificados, área de lavagem, secagem e esterelização de material.
Serviços de Acompanhamento Clínico – Serviço de Gastroenterologia do Hospital das
Clínica-UFMG com ambulatório e leitos em número variável.
DICA - FMUSP
Um total de 12 leitos na Unidade de Internação no Hospital das Clínicas, 12 períodos
ambulatoriais de 04 horas por semana com as seguintes unidades ambulatoriais: (1) alergias
ocupacionais; (2) alergia a medicamentos; (3) rinite alérgica; (4) reações anafiláticas por
venenos de insetos; (5) alergia infantil; (6) alergias de pele; (7) dermatite atópica e alergia
alimentar; (8) Imunodeficiências secundárias; (9) Imunodeficiências primárias; (10) autoimunidade; (11) asma. Três Unidades de apoio diagnóstico e de tratamento: (1) Sala de
testes cutâneos e de aplicações de imunoterapia alérgeno-específica; (2) Sala de
espirometria e nasofibroscopia; (3) Cabine de provocação brônquica (única da América
Latina).
O Laboratório de Imunologia Clínica e Alergia-LIM60 tem uma área de 220 m2,
dividida em laboratório multiusuário e de citometria, sala de biossegurança nível 2 para
cultura celular e citômetro de fluxo “sorter” FACS ARIA, sala de biologia molecular, sala de
computação, sala de criopreservação, sala de radioativos.
ENSP – FIOCRUZ
2
Infra-estrutura física e de informática (20m ) para realização de atividades de
processamento e análise de dados.
EPIDEMIOLOGIA FSP-USP
Salas equipadas com microcomputadores e impressoras. Laboratório de informática
do Departamento de Epidemiologia da faculdade de Saúde Pública – USP.
141
FIOCRUZ -BA
2
Laboratórios FIOCRUZ BA: 180 m de área para atividades de biologia molecular, cultura de
2
células, citometria de fluxo e bioquímica. Biotério com roedores e um insetário de 30m para
2
manutenção de Lu. longipalpis. 50m de área administrativa.
O grupo da UFMA (Universidade Federal do Maranhão) possui um canil com
aproximadamente 60m
2
e recentemente sofreu uma reforma que garantiu melhores
condições de saneamento,com parte das paredes revestidas com azulejo,uma área de
solarium e um espaço específico para a limpeza dos animais e exame clínico dos mesmos.
Em Aracaju (SE) imunizaremos os cães sorologicamente negativos da própria área
endêmica. Neste caso contaremos com a estrutura e suporte do Serviço de Zoonoses de
Aracaju.
Apoio administrativo:
Possuímos uma secretaria de aproximadamente 50m2 com 2 computadores e dois
funcionários (uma secretária e uma gestora de projetos) que, atualmente, são responsáveis
pelas
compras
de
reagentes
e
prestação
de
contas
dos
financiamentos
em
andamento. Possuem treinamento apropriado para esta finalidade.
ICB-USP
2
2
Laboratório: 200 m para, biologia molecular área biolimpa (10 m ), citometria de fluxo com
capacidade para “sorting”, cultura de células com todos os equipamentos, biotério de
experimentação.
Dispomos de serviços de citometria de fluxo, incluindo separação celular baseada
em marcadores de superfície, um biotério SPF com 22 linhages isogênicas de camundongos
e um serviço básico de histologia.
Incor - FMUSP
2
Laboratório: 800 m de para cultura de tecidos, análise proteômica, síntese de peptídeos,
citometria de fluxo, ELISA, ELISPOT, RAST, biologia molecular e tipagem de HLA. Biotério
de experimentação com capacidade de alojar 300 camundongos em condições SPF.
INSTITUTO BUTANTAN
2
Laboratório: Anticorpos Monoclonais com 540m de laboratório com 2 salas de cultivo
celular, sala de biologia molecular, sala de cromatografia, sala de ensaios e área de apoio.
142
Parte do lab. foi recentemente reformada e hoje atende normas de Boas Práticas de
Laboratório (GLP).
Área limpa (GMP) certificada para produção e purificação em escala piloto de
2
produtos de células de mamíferos, com dimensões de 260m , sendo metade de área
classificada 10.000 (ISO 7) e metade de área de apoio (pesagem, lavagem e esterilização de
materiais, vestiários. Temos central de água purificada e central de gases (oxigênio,
nitrogênio, gás carbônico, ar comprimido). Todas as áreas e equipamentos contam com
gerador de emergência.
Instituto Ludwig/HAOC/Instituto do Câncer/HC
Instituto Ludwig: Laboratório para os testes de imunogenicidade.
HAOC: Exames clínicos e laboratoriais
HC – Instituto do Câncer:
HC – bloco cirúrgico
A coordenação administrativa, a logística e a interface entre as Instituições
participantes do Projeto Imunoterapia do Câncer estarão sob a responsabilidade da
Dra. Juçara Parra, do Instituto Ludwig de Pesquisas sobre o Câncer.
LVM-UFRJ
2
120m para virologia molecular; 30m2 para imunologia; 50m2 de área NB3 para
cultivo de virus patogênicos.
PUC-RS
Laboratório de Nefrologia, Instituto de Ciências biomédicas da PUCRS: 36m
2
-
laboratório que agrega nossa linha de pesquisa.
Além disso, o IPB possui laboratórios de uso comum de apoio aos pesquisadores.
SEAPHIV/AIDS-HC/FMUSP
Fundado em 1994, o Serviço de Extensão ao Atendimento de Pacientes HIV/AIDS,
da Divisão de Moléstias Infecciosas e Parasitárias do Hospital das Clínicas da Faculdade de
Medicina da Universidade de São Paulo - SEAPHIV/AIDS-HC/FMUSP é unidade destinado
143
ao ensino, pesquisa e assistência a pacientes adultos vivendo com o vírus da
imunodeficiência humana - HIV e aids. Atende 3500 pacientes adultos infectados pelo HIV,
2
em regime de ambulatório e hospital-dia. Instalada numa area util de 1.300 m , dispoe de 10
consultórios médicos para atendimentos de infectologia e sala de apoio a atividades de
pesquisa clinica.
Universidade Federal de Sergipe (UFS), Campus de Ciências da Saúde: Laboratório de
Biologia Molecular, localiza-se no prédio de Patologia do Hospital Universitário -. Consiste de
3 salas e 1 escritório, equipado com fluxo laminar (1), Freezer – 70 (1), máquina de PCR (1),
estufa de CO2 (1), centrífugas (2), sistema de fotodocumentação de gel (1)
144
EQUIPAMENTOS
CIRURGIA DE CABEÇA E PESCOÇO – HC/FMUSP
Equipamentos disponíveis
Freezer -80ºC mantidos em sala com gerador
Crioplus
Geladeira
Tambores de nitrogênio
Tambores de nitrogênio para transporte
Microscópio
Computadores
Impressoras
Câmera digital para documentação de procedimentos cirúrgicos
quantidade
2
1
2
2
2
1
4
2
1
Centro de Estudos de Insetos Sociais (CEIS) – UNESP
EQUIPAMENTOS - Descrição
Ultra freezer
Fluxo laminar
Seqüenciador de DNA
Sistema BOD
Sistema central de tratamento de água
Sistema de purificação de água – Milli-Q
Termocicladores
Espectrofotômetro UV-VIS
HPLC
Sistema de análise proteômica
Seqüenciador de proteína/peptídeo automático
Liofilizadores
Ultra centrífuga refrigerada
Centrífugas refrigeradas
Leitor de microplaca UV’VIS
Sistema de eletroforese 2-D
FPLC
Triple quadrupole mass spectrometer, Micromass, mod. Quatro II
Speed-Vac
Espectrofluorímetro
Geradores
No-break
Quantidade
2
4
2
10
1
2
4
3
5
1
1
2
1
4
1
1
2
1
2
1
2
3
Clínica Médica FMRP-USP
EQUIPAMENTOS - Descrição
Leitor de ELISA
ImunoCAP (Dosagem de IgE total e IgE específica)
PhastSystem (análise de proteínas e DNA)
Termociclador
Quantidade
1
1
1
1
145
Sistema de eletroforese em gel
Shaker incubator
Micro-computadores
Câmera digital
Freezer -70oC
Fluxo laminar
Centrifuga refrigerada
Microcentrífuga
Espirômetro
1
1
5
1
1
1
1
1
1
DIB-ICB-UFMG
EQUIPAMENTOS – Descrição 5
Microscópio de fluorescência com sistema de imagem
Microscópio confocal Zeiss
Citometro de fluxo FACSvantage
Citometro de fluxo FACScan
PCR
Real Timer- PCR
Seqüenciador MegaBase DNA
Fluxo laminar
Estufas de CO2
Centrífuga Refrigerada
o
Freezer -80 C
Container de nitrogênio
Sistema de imagem de gel para imagem e quantificação de bandas
Leitor de Elisa Bio-rad
Sistema de purificação Milli-Q
Sistema de intravital com captação e gravação de imagem
Autoclave
Sistema de Eletroforese em gel horizontal
Microcentrífuga
Quantidade
1
1
1
1
2
1
1
2
2
1
1
1
1
1
2
1
2
2
1
FIOCRUZ –BA
EQUIPAMENTOS - Descrição 12
Quantidade
Câmara de fluxo laminar
6
Sistema de purificação de água
1
Microscópios
6
Microscopio de imunofluorescência (multiusuário)
1
Leitor de ELISA
1
Centrifugas refrigeradas
4
Microcentrifugas
2
Incubadoras de CO2
2
Ultracenrifuga (multiusuário)
2
Contador de cintilação (multiusuário)
1
Aparato de eletroforese
6
146
Termocicladores
2
FACS cell sorter (multiusuário)
1
Zeiss microscópio eletrônico (multiusuário)
1
FUNDAÇÃO PRÓ-SANGUE
EQUIPAMENTOS - Descrição 1
Computador pessoal com acesso de alta velocidade a internet
Impressora colorida a laser
Lavadora de ELISA
Leitora de ELISA
Máquina de flocos de gelo
Microcentrífuga
Microscópio
Termociclador (um “real-time”)
Transiluminador – UV
Servidor Dual Xeon E5405 Quad Core/2gh/12m cachê/FSB 1333mhz
Cuba de eletroforese horizontal
Fonte de eletroforese Capela de fluxo
Sequenciador automático DNA ABI PRISM - Applied Biosystems
Micro array- Iscan System Illumina
Quantidade
10
1
2
2
1
4
1
5
1
1
3
2
4
1
1
ICB-USP
EQUIPAMENTOS - Descrição 3
Cromatografia líquida de alta performance (HPLC/FPLC) – Capacidade
industrial Akta Explorer 100 XT
Termociclador
Termociclador para análises em tempo real
Sintetizador de peptídeos
Fluorímetro e leitor de quimioluminescência para proteínas
Aparelho para Citometria de Fluxo
Aparelho para leitura de ensaios de ELISPOT
Equipamento para congelamento de células em nitrogênio liquido
Fluxo laminar
Fluxo laminar P2
Computador pessoal com acesso de alta velocidade a internet
Impressora
Spectramax 190
Sistema de captação de imagem Alpha Innotech para eletroforese em gel
Sistema de captação de imagem Leyka/Morphos para microscópio
Microscópios
Câmera digital com acessórios
DICA-FMUSP
Citometro de fluxo “sorter” FACS ARIA BD
Citometro de fluxo 6 cores CANTO BD
Citometro de fluxo 4 cores COULTER
Leitor de ELISA
Quantidade
3
4
1
1
1
2
1
6
4
1
18
10
1
1
1
8
3
1
1
1
1
147
Estufa CO2
Fluxo Laminar
Microscópio
Termociclador
Aparelho de fotodocumentação
Aparelho RAST
Autoclave
Balança Analítica
Capela de bancada
Cell harvester - Sistema de Vácuo/pressão
Cell Harvester Molecular Devices
Centrífugas refrigeradas
Centrífuga Refrigerada (microcentrifuga)
Centrífuga Refrigerada
Espectrofotômetro
Fonte Eletroforese
Freezer - 80ºC
Máquina de Gelo
Purificador de água MILLIQ
Purificador de água RIOS
Nasofibroscópio
Espirômetro
Cabine de provocação brônquica
4
4
5
2
2
1
1
1
1
1
1
4
3
1
1
1
5
1
1
1
1
2
1
Incor - FMUSP
EQUIPAMENTOS - Descrição 1
Computador pessoal com acesso de alta velocidade a internet
Impressora colorida a laser
Contador de 96 poços para incorporação de timidina Beta Matrix
Contador de 96 poços para incorporação de timidina Betaplate
Câmera de vídeo digital
Capela de fluxo laminar
Centrífuga
Citômetro de fluxo
Leitor automático de ELISPOT (KS Elispot, Zeiss)
Container nitrogênio
Espectrofotômetro
Estante ventilada p/ camundongo
Fonte de eletroforese 600V 400 MA 100W
Sistema de secagem de gel
Incubadora CO2
Lavadora de ELISA
Leitora de ELISA
Máquina de flocos de gelo
Microcentrífuga
Microscópio
Termociclador (um “real-time”)
Sistema ALPHA IMAGER 2200 para análise de gel
Transiluminador - UV
Quantidade
50
2
1
1
1
13
21
2
1
14
5
2
6
1
6
2
2
1
5
11
7
1
1
148
Sistema de liofilização THERMO SAVANT
Limpador ULTRASONIC CLEANER
Video COPY PROCESSOR
Aparelho de rádiodetecção c/ cápsulas transmissoras
LAMBDA DOT - Dispensador eletrônico / células
Sistema p/ leitura de placas/tipagem HLA - Auto Scope
Ettan Spot Handling workstation
Scanner de alta resolução
TYPHOON - DIGE, 9410, Fluorescence Laser Scanner Workstation, 2DDIGE system
Single user DeCyder software, 2D-DIGE system
Computador Pentium-4 e impressora para Spot Handling Workstation
Computador Pentium-4 e impressora para o Scanner
Computador Pentium-4 e impressora para o TYPHOON
Sistema ROTOFOR, separação de proteínas por pI em fase solúvel
Software para aquisição de imagens
Software para tratamento e análise de imagens
Software para aquisição de imagens eletroforese 2D
Sistema de secagem a vácuo
ª
Cuba de 2 dimensão gel 2D, 6 géis, Ettan-Dalt-Six - Amersham Biosciences
Cuba isoeletrofocalização IPG-PHOR - Amersham Biosciences
Cuba de eletroforese vertical - BioRad/ Mini Protean 3
Fonte de eletroforese - Amersham Biosciences / EPS 601
Unidade FPLC
Sintetizador automático de 8 peptídeos PSSM-8
Sintetizador automático de 96 peptídeos ACT 96
Unidades HPLC
Liofilizador alto vácuo
Capela de alto fluxo com 7 metros
Sequenciador automático DNA ABI PRISM - Applied Biosystems
Scanner p/ leitura de lâminas MICRORRAY GENEPIX 4000B - AmershamGE
Real Time PCR System 7500 - Applied Biosystems
Sistema de purificação de água - Millipore – Milli Ro
Sistema de purificação de água - Millipore – Milli Q
Aquecedor de tubos
Autoclave horizontal digital de bancada microprocessada 33 lit.
Bloco de prata p/ 768 amostras PE
Câmera de vídeo Col. Digital
Coletor de células c/ bomba à vácuo
Detector fluorescência
Estereomicroscópio com leitor automático de ELISA KS Elispot e Axiovision
Fotodyne
Coletor de frações
Incubadora C02
Liofilizador alto vácuo
Luz fibra ótica
PCR PTC 100
Unidade de Separação rápida de proteínas
Plataforma integrada p/ manuseio de proteína
1
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
3
2
1
1
1
1
1
1
1
2
2
1
3
2
1
1
1
11
1
1
2
1
1
149
Sistema de análises de imagem modelo ALPHA IMAGER 2200
Sistema de liofilização THERMO SAVANT
Limpador ULTRASONIC CLEANER
Video COPY PROCESSOR
Micros computadores de uso pessoal ligados a internet rápida
Servidor Dell
Scanner HP Scanjet 5490
Câmera digital
Projetor multimídia Sony VPL-cx1
Tela plana fixação teto p/ projeção
Cabine p/ broncoprovocação
Espirômetro simples
Espirometro para broncoprovocação
Nasofibroscópio
Aparelho p/ análise composição corporal
Bicicletas ergométricas
1
1
1
1
17
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
2
INSTITUTO BUTANTAN
EQUIPAMENTOS - Descrição 13
Biorreator de fibras ocas
Biorreator de leito fluidizado
Sistema de cromatografia AKTA PILOT (GMP)
Sistema de cromatografia HPLC – AKTA Purifier - Certificado
Bombas e colunas de cromatografia
BIAcore T-100 Certificado
Citômetro Guava Easy Cyte
Concentrador Pellicon
Analisador de metabólitos BioProfile
Estufas de CO2
Microscópios
ClonePix – seleção de clones por fluorescência e distribuição robotizada
Tanques de nitrogênio líquido com alarme
Máquina de gelo em flocos
Centrífugas (chão e mesa)
Cabines de fluxo laminar
Módulos de fluxo laminar
Sistemas para eletroforese/eletrofocalização/blotting
Sistema de fotodocumentação
Colunas cromatográficas industriais InDEx
Sistema central de água purificada com aparelhos de osmose reversa
Gerador de emergência 440kVa
Autoclaves
Freezer ultra baixa temperatura
Leitor de placa
Espectrofotômetro com especificação USP
Instituto Ludwig/HAOC/Instituto do Câncer/HC
Quantidade
2
2
1
1
3
1
1
1
1
6
4
1
2
1
6
6
2
3
1
3
1
1
3
3
1
1
150
Equipamentos - Descrição
Servidor/Processador AMD Athlon(tm) 64 Processor 3200+ - 2GHz
Servidor/Processador AMD Athlon(tm) 64 Processor 3500+ - 2.2GHz
Servidor/Processador Intel(R) Core(TM)2 Quad CPU Q6600 2.40GHz
Servidor/Processador Intel(R) Core(TM)2 Quad CPU Q6600 @ 2.40GHz
Servidor/Processador AMD Athlon(tm) 64 Processor 3400+ 2.4GHZ
Servidor/Processador Compaq AlphaServer ES40 1024.00 MHz
Servidor/Processador Pentium III – 700MHz
Servidor/Processador AMD Athlon(tm) 64 Processor 3400+ - 2.4GHz
Servidor/Processador AMD Athlon(tm) 64 X2 Dual Core Processor 4600+ 2,6GHz
Intel(R) Core(TM)2 Quad CPU Q6600 @ 2.40GHz
2 X INTEL XEON E5405 2.00 12M 1333MHZ 771
AMD Athlon(tm) 64 Processor 3200+ - 2GHz
Sequenciador Mega Bace (96 capilares)- GE
Sequenciador 3130XL (16 capilares)- Applied Biosystems
Centrífuga Eppendorf 5810R
Real time 7300- Applied Biosystems
Fluxo Laminar- Veco
Leitor de Elisa- Bio Rad- modelo 550 microplate reader
Termocicladores, Gene Amp PCR system 9700- Applied Biosystems
Termociclador Eppendorf, Mastercycler Gradient
Captura de imagem Multi Doc-IT- Digital Imaging System
Quantidade
3
3
1
2
1
1
1
1
2
1
2
6
1
1
1
1
1
1
4
1
1
IMUNOGENÔMICA
EQUIPAMENTO -
Quantidade
Citômetro FACSAria
1
PUC-RS
®
Nikon “Stereo microscope teaching system”,
Aparelho para medir função pulmonar em lactentes
Seqüenciador de DNA
Citômetro de Fluxo
Sala de esterilização
Sala de cultura de tecidos
Termociclador automático
Microcentrífuga
Biotério/roedores
1
1
1
1
1
1
1
1
1
151
7. ORÇAMENTO JUSTIFICADO
Orçamento- Justificativa
O orçamento para esta proposta foi construído com alguns princípios que devem ser
aqui esclarecidos.
Em primeiro lugar, os custos de todas estas atividades propostas ultrapassam em
muito o limite de R$ 9.000.000,00 para 3 anos, estabelecido no edital.
A quase totalidade dos recursos já está distribuída pelos diversos projetos e,
consequentemente, pelas Instituições e grupos envolvidos. Como trata-se de grupos de
pesquisa consolidados e com estruturas laboratoriais já bem montadas, a ênfase da
solicitação foi para estabelecer novas metodologias ou aprimorar já existentes e, que são
essenciais para a proposta.
Os equipamentos solicitados serão todos multiusuários e a prioridade foi dada para a
estrutura da planta piloto de produtos biotecnológicos, principal gargalo do iii em seu estágio
atual, e no qual serão gastos quase 25% dos recursos. Solicitamos, ainda, um citômetro de
fluxo de 17 cores para análises mais sofisticadas de subpopulações celulares e uma
máquina de PCR “real time” pela absoluta sobrecarga deste aparelho com o aumento
explosivo do emprego desta tecnologia nos últimos anos. Esses três últimos equipamentos
perfazem cerca de 15% do orçamento.
Embora os projetos tenham necessidades de insumos e serviços consideráveis,
limitamos os valores nesta fase. São verbas de manutenção do que existe. Foram previstos
recursos para interação do Instituto com viagens e estadias de curto prazo (9%) e,
reservados 12% dos recursos para despesas de valor complementar, atribuídas ao comitê
gestor, bem abaixo do limite permitido pelo edital.
As bolsas serão solicitadas para o Instituto como um todo e distribuídas de acordo
com as necessidades dos projetos, após criteriosa avaliação de mérito pelos investigadores
do iii. O número de bolsas foi baseado nas solicitações dos grupos.
Os
ensaios
clínicos
serão
fundamentalmente
custeados
pelas
Instituições
participantes. Diagnósticos, cirurgia, acompanhamento clínico terão outros financiamentos.
Os recursos alocados são para o acompanhamento imunológico e eventual exame não
obtido na Instituição.
O pessoal para o projeto de imunoterapia para câncer será contratado pelo Hospital
Alemão Oswaldo Cruz e o da operação das plantas piloto de produtos biotecnológicos será
contratado pela empresa EMS S.A.
As adaptações de área física e a construção da área limpa também serão
contrapartidas institucionais. O Hospital das Clínicas, o Instituto do Coração e a EMS S.A. se
propõem a abrigar esta planta e serão feitas negociações para a instalação no local de
maiores vantagens para o iii.
É fundamental salientar que o iii dará uma expressiva contrapartida, com a injeção
de recursos de projetos específicos, infraestrutura, pessoal altamente qualificado e verbas
adicionais das instituições envolvidas.
152
Após o primeiro triênio estão previstos anualmente 30% dos recursos para o comitê
gestor para redirecionamento das ações. Verba limitada para reposição de equipamentos
(16%), interação da rede (9%) e o restante para consumo e serviços (45%) onde a parte de
recursos para ensaios clínicos será necessariamente mais expressiva.
Segue o orçamento para grandes equipamentos. Abaixo também os orçamentos
detalhados para os primeiros 3 anos e o orçamento resumido para 5 anos.
13
12
Equipamentos multiusuário de alto custo
Citômetro de Fluxo LSRII Becton-Dickinson 17 cores
Espectrômetro de massa MALDI-ToF-ToF Shimadzu
Termociclador em tempo real 3000Mx5 Stratagene
cabine de fluxo laminar em aço inox (3 peças)
Equipamentos
PLANTA PILOTO-FERMENTAÇÃO
ÍTEM
ESPECIFICAÇÃO
1 autoclave (A1) para descontaminação c/ gerador elétrico de vapor
2 autoclave (A2) para esterilização (de barreira)
3 forno de esterilização (de barreira)
4 fermentador 100L completo
5 sistema ultrafiltração molecular (tipo Pellicon) c/ acessórios/bombas
6 sistem ultrafiltação molecular (tipo Prostak completo c/bomba (semi-industrial)
7 sistema para clarificação e esterilização
8 sistema de teste de integridade de esterilização
9 freezer vertical -80ºC capacidade 326L
10 estufa de CO2
11 reator de processo com dupla camisa, agitador, coleta de amostra, pH, condutividade
dKd>
100L
200L
153
760,000.00
760,000.00
60,000.00
1,580,000.00
2,200,000.00
54,000.00
200,000.00
270,000.00
R$
252,000.00
207,000.00
275,000.00
396,000.00
36,000.00
378,000.00
21,600.00
46,800.00
48,600.00
11,160.00
154
DETALHAMENTO DO ORÇAMENTO DO INSTITUTO
DE INVESTIGAÇÃO EM IMUNOLOGIA (iii) PARA 3 ANOS
Projeto Cancer
Item/Ano
Custeio
1º
a) Material de Consumo
2º
45,000.00
50,000.00
0.00
0.00
0.00
95,000.00
b) Serviço de terceiros
c) Diárias
d) Passagens
Bens de Capital
Total
45,000.00
50,000.00
0.00
0.00
0.00
95,000.00
Total p/ 3 anos
3º
45,000.00
50,000.00
0.00
0.00
0.00
95,000.00
285,000.00
Doenças Infecciosas-Leishmania
Item/Ano
Custeio
1º
a) Material de Consumo
2º
70,000.00
14,000.00
0.00
0.00
0.00
84,000.00
b) Serviço de terceiros
c) Diárias
d) Passagens
Bens de Capital
Total
70,000.00
14,000.00
0.00
0.00
0.00
84,000.00
Total p/ 3 anos
3º
70,000.00
14,000.00
0.00
0.00
0.00
84,000.00
252,000.00
Alergia
Item/Ano
Custeio
1º
a) Material de Consumo
b) Serviço de terceiros
c) Diárias
d) Passagens
Bens de Capital
Total
2º
3º
70,000.00
70,000.00
70,000.00
30,000.00
0.00
0.00
0.00
100,000.00
30,000.00
0.00
0.00
0.00
100,000.00
30,000.00
0.00
0.00
0.00
100,000.00
300,000.00
Total p/ 3 anos
Autoimunidade - Febre Reumática
Item/Ano
Custeio
a) Material de Consumo
b) Serviço de terceiros
c) Diárias
d) Passagens
Bens de Capital
Total
Total p/ 3 anos
1º
2º
70,000.00
30,000.00
0.00
0.00
0.00
100,000.00
70,000.00
30,000.00
0.00
0.00
0.00
100,000.00
3º
70,000.00
30,000.00
0.00
0.00
0.00
100,000.00
300,000.00
155
Imunodeficiências Primárias
Item/Ano
Custeio
1º
a) Material de Consumo
b) Serviço de terceiros
c) Diárias
d) Passagens
Bens de Capital
Total
2º
3º
48,000.00
18,000.00
0.00
0.00
60,000.00
126,000.00
14,000.00
12,000.00
0.00
0.00
0.00
26,000.00
14,000.00
12,000.00
0.00
0.00
0.00
26,000.00
178,000.00
1º
2º
3º
70,000.00
12,000.00
0.00
0.00
0.00
82,000.00
70,000.00
9,000.00
0.00
0.00
0.00
79,000.00
70,000.00
9,000.00
0.00
0.00
0.00
79,000.00
240,000.00
Total p/ 3 anos
Transplante e Imunorregulação
Item/Ano
Custeio
a) Material de Consumo
b) Serviço de terceiros
c) Diárias
d) Passagens
Bens de Capital
Total
Total p/ 3 anos
HIV/AIDS
Item/Ano
Custeio
1º
a) Material de Consumo
2º
70,000.00
16,000.00
0.00
0.00
760,000.00
846,000.00
b) Serviço de terceiros
c) Diárias
d) Passagens
Bens de Capital
Total
70,000.00
16,000.00
0.00
0.00
0.00
86,000.00
Total p/ 3 anos
3º
50,000.00
16,000.00
0.00
0.00
0.00
66,000.00
998,000.00
PLATAFORMAS
Imunogenomica
Item/Ano
Custeio
a) Material de Consumo
b) Serviço de terceiros
c) Diárias
d) Passagens
Bens de Capital
Total
Total p/ 3 anos
1º
2º
70,000.00
12,000.00
0.00
0.00
24,000.00
106,000.00
70,000.00
12,000.00
0.00
0.00
12,000.00
94,000.00
3º
70,000.00
12,000.00
0.00
0.00
0.00
82,000.00
282,000.00
156
Imunobiológicos
Item/Ano
Custeio
1º
2º
3º
a) Material de Consumo
70,000.00
50,000.00
0.00
0.00
1,200,000.00
1,320,000.00
70,000.00
50,000.00
0.00
0.00
800,000.00
920,000.00
70,000.00
50,000.00
0.00
0.00
200,000.00
320,000.00
2,560,000.00
1º
2º
3º
b) Serviço de terceiros
c) Diárias
d) Passagens
Bens de Capital
Total
Total p/ 3 anos
Qualidade
Item/Ano
Custeio
a) Material de Consumo
0.00
30,000.00
0.00
0.00
0.00
30,000.00
b) Serviço de terceiros
c) Diárias
d) Passagens
Bens de Capital
Total
0.00
30,000.00
0.00
0.00
0.00
30,000.00
0.00
30,000.00
0.00
0.00
0.00
30,000.00
90,000.00
Total p/ 3 anos
Proteômica
Item/Ano
Custeio
1º
a) Material de Consumo
2º
60,000.00
12,000.00
0.00
0.00
760,000.00
832,000.00
b) Serviço de terceiros
c) Diárias
d) Passagens
Bens de Capital
Total
60,000.00
12,000.00
0.00
0.00
72,000.00
Total p/ 3 anos
3º
60,000.00
12,000.00
0.00
0.00
0.00
72,000.00
976,000.00
Ensino
Item/Ano
Custeio
a) Material de Consumo
b) Serviço de terceiros
c) Diárias
d) Passagens
Bens de Capital
Total
Total p/ 3 anos
1º
2º
6,000.00
48,000.00
0.00
0.00
0.00
54,000.00
6,000.00
48,000.00
0.00
0.00
0.00
54,000.00
3º
12,000.00
48,000.00
0.00
0.00
0.00
60,000.00
168,000.00
157
Animação da rede
Item/Ano
Custeio
1º
Reunião Anual
2º
3º
80,000.00
5,000.00
75,000.00
25,000.00
85,000.00
270,000.00
80,000.00
5,000.00
75,000.00
25,000.00
85,000.00
270,000.00
80,000.00
5,000.00
75,000.00
25,000.00
85,000.00
270,000.00
810,000.00
Item/Ano
1º
Consumo
Serviço de Terceiros
Bens de Capital
Diárias
Passagens
649,000.00
322,000.00
2,804,000.00
140,000.00
130,000.00
4,045,000.00
2º
615,000.00
313,000.00
812,000.00
140,000.00
130,000.00
2,010,000.00
170,000.00
350,000.00
520,000.00
170,000.00
350,000.00
520,000.00
3º
601,000.00
313,000.00
200,000.00
140,000.00
130,000.00
1,384,000.00
7,439,000.00
170,000.00
351,000.00
521,000.00
1,561,000.00
9,000,000.00
Reunião Gestores
Intercâmbio Nacional
Consultores Internacionais
Viagens ao exterior
Total
Total p/ 3 anos
RESUMO ORÇAMENTO - 3 ANOS
TOTAL
SUBTOTAL GERAL 1
Bolsas (4DTI + 4PDJ+ 4AT-NM)
Valor complementar
TOTAL
SUBTOTAL GERAL 2
TOTAL GERAL (1 + 2)
Item/Ano
Consumo
Serviço de Terceiros
Bens de Capital
Diárias
Passagens
TOTAL
SUBTOTAL GERAL 1
Bolsas (4DTI + 4PDJ+
4AT-NM)
Valor complementar
TOTAL
SUBTOTAL GERAL 2
TOTAL GERAL (1 + 2)
2º
615,000.00
313,000.00
812,000.00
140,000.00
130,000.00
2,010,000.00
170,000.00
350,000.00
520,000.00
1º
649,000.00
322,000.00
2,804,000.00
140,000.00
130,000.00
4,045,000.00
170,000.00
350,000.00
520,000.00
351,000.00
521,000.00
170,000.00
3º
601,000.00
313,000.00
200,000.00
140,000.00
130,000.00
1,384,000.00
RESUMO ORÇAMENTO DO INSTITUTO DE INVESTIGAÇÃO EM IMUNOLOGIA (iii) PARA 5 ANOS
158
1,051,000.00
1,070,000.00
170,000.00
4º
660,000.00
600,000.00
400,000.00
140,000.00
130,000.00
1,930,000.00
1,051,000.00
1,070,000.00
3,701,000.00
15,000,000.00
5º
660,000.00
600,000.00
400,000.00
140,000.00
130,000.00
1,930,000.00
11,299,000.00
170,000.00
159
8. INFORMAÇÕES COMPLMENTARES
Projetos/ Auxílios aprovados nos últimos 5 anos
ALERGIA
Mário Sergio Palma
- Auxílio Pesquisa, a Projeto Temático outorgado pela FAPESP (Proc. 06/57122-7), para o
projeto intitulado “Procura de compostos-líderes para o desenvolvimento racional de novos
fármacos e pesticidas a partir da bioprospecção da fauna de artrópodes”, no valor de
R$ 1.585. 000,00. Vigência de 10/12/2007 a 09/12/2011.
- Auxílio Pesquisa outorgado pelo CNPq (Proc. 472870/2004.1), vinculado ao projeto
“Prospecção de Compostos Neuroativos nas Secreções das Aranhas Construtoras de Teias
Aéreas Pela Procura de Compostos-Líderes Para o Desenvolvimento Racional de Novos
Fármacos e Pesticidas Seletivos”, no valor de R$ 30 000,00. (Vigência: 10/12/2007 a
09/12/2011.
- Auxílio Pesquisa outorgado pela FAPESP (Proc. nº 2005/00982-1), vinculado projeto
“Identificação dos Antígenos Principais dos Venenos das Vespas Sociais Agelaia pallipes
pallipes e Polybia paulista (Hymenoptera, Vespidae), no valor total de R$ 340 000,00.
- Auxílio Pesquisa outorgado pela FAPESP (Proc. nº 2004/07942-2), vinculado ao projeto
“Bioprospecção da Fauna de Artrópodes do Estado de São Paulo Pela Procura de
Compostos-Líderes
Para o Desenvolvimento Racional de Novos Fármacos e Pesticidas
Seletivos”, no valor total de R$ 360 000,00.
- Auxílio Pesquisa outorgado pela FINEP (Empenho 2004NE000810), convênio FNDCT/CTINFRA (Chamada Pública CT-BIOTEC- Anticorpos – MCT-FINEP 01/2003), para o projeto
“Anticorpos Monoclonais e Policlonais: Produção em Larga Escala e Uso Clínico”, Vigência
03/09/2004 a 03/03/2008.
Karla Arruda
o
- Programa de Apoio a Jovens Pesquisadores em Centros Emergentes FAPESP Proc. n
1995/09690-0. Projeto intitulado: “Alérgenos de Barata: Imunoquímica, Biologia Molecular e
Papel na Asma”, no valor total de R$ 300.000,00. Vigência: 01/12/1996 a 20/07/2005. Projeto
concluído.
- Auxílio Pesquisa – Regular, outorgado pela FAPESP 2005/05215-0. Projeto intitulado:
“Tropomiosina recombinante de Ascaris lumbricoides: modelo para investigar a reatividade
cruzada IgE entre invertebrados e o papel das parasitoses no desenvolvimento de alergia e
asma”, no valor total R$ 43.055,00. Vigência: 01/07/2006 a 30/06/2009.
AUTO-IMUNIDADE FR
Luiza Guilherme
160
- “Desenvolvimento de vacina contra o estreptococo β-hemolítico do grupo A”, apoio
FAPESP - PITE 00/14549-4/Laboratório Teuto. Vigência 2002 a 2007. Valor: R$
4.390.000,00.
- “Análise da expressão de quimiocinas e fatores de transcrição (Th1/Th2) nas lesões
cardíacas de pacientes com febre reumática e doença reumática cardíaca”, apoio FAPESP
Processo Nº2006/03578-0. Vigência: 2006-2008. Valor: R$ 96.814,63.
- “Avaliação experimental de dois modelos de vacinas humanas utilizando adjuvante
composto por um cocleato com capacidade de indução de IgA e IgG”, apoio FAPESP
07/50355-9. Vigência: 01/04/2007 a 31/05/2007. Valor: R$ 27.807,49.
- “Estudo das células reguladoras em pacientes com cardite pós-estreptocócica”, apoio
FAPESP/INSERM 06/58347-2. Vigência 2007 a 2008. Valor: R$ 37.234,90.
- “Identificação das Cepas de S. pyogenes Isoladas na Cidade de São Paulo através de
Genotipagem”, apoio FAPESP Processo 07/59262-3. Vigência: R$ 130.118,26.
CÂNCER
- “Genoma Clínico”, apoio da FAPESP - N° Processo
2 001/12900-9. Vigência :
01/05/2002 a 30/06/2005. Valor aprovado: R$ 48.185,49 e U$ 10,611.00. Contou ainda com
apoio do Ludwig Institute for Cancer Research em foram de bolsas de estudo total
aproximado de R$ 80.000,00.
Estudo encerrado e aprovado.
- “Desenvolvimento de microcápsulas biodegradáveis de liberação lenta contendo GM-CSF
para uso intratumoral no tratamento de pacientes com carcinoma epidermóide avançado de
cabeça e pescoço”, apoio da FAPESP - N° Processo
20 01/08821. Vigência: 01/03/2002 a
30/11/2007. Valor aprovado: R$ 96.919,10 e U$ 21,471.78. Estudo encerrado e aprovado.
- “Busca de marcadores de agressividade em tumores de cabeça e pescoço”, apoio
FAPESP. N° Processo 2004/12054-9. Vigência: 01/01/2 005 a 31/12/2008. Valor aprovado:
R$ 51.841,00 e U$ 360,366.00. Esse projeto contou ainda com bolsas de estudo do Instituto
Ludwig e do Hospital Israelita Albert Einstein que totalizaram aproximadamente R$
40.000,00.
Sandro de Souza
- Bioinformatics Co-ordination, apoio FAPESP Nº 1999/04925-0. Vigência: 01/06/99 a
31/10/01. Valor: R$ 68.000,00.
- Bioinformatics Co-ordination, apoio FAPESP Nº 1999/04925-0. Vigência: 01/06/99 a
31/10/01. Valor: U$ 292,700.00.
- Bioinformatics, apoio FAPESP Nº 2000/08728-3. Vigência: 01/08/00 a 30/07-03. Valor: R$
20.939,35.
- Bioinformatics, apoio FAPESP Nº 2000/08728-3. Vigência: 01/07/00 a 30/07/03. Valor: R$
49.500,02.
161
- Bioinformatics, apoio FAPESP Nº 2000/08728-3. Vigência: 01/07/00 a 30/07/03. Valor: U$
26.055,28.
- Computer programer, apoio Duke University. Vigência: 01/06/02 a 21/05/03. Valor: U$
15,000.00.
- ICOBICOBI-2004, apoio CNPq Nº 452189/03-9. Vigência: 25/10/04 a 28/10/04. Valor: R$
20.000,00.
- ICOBICOBI-2004 (registration fees), apoio Fees & Sponsorships. Vigência: 01/01/04 a
28/10/04. Valor: R$ 110.397,00.
- ICOBICOBI-2004, apoio CAPES Nº 0228/04-04. Vigência 25/10/04 a 28/1004. Valor: R$
20.000,00.
- ICOBICOBI-2004, apoio FAPESP Nº 2004/07049-6. Vigência: 25/10/04 a 28/10/04. Valor:
20.000,00.
- ICOBICOBI-2004, apoio FINEP Nº 01040430-00. Vigência: 14/10/04
a 27/12/04. Valor:
R$ 15.000,00.
- X-Meeting 2005, apoio FAPERJ. N/A. Vigência: 04/10/05 a 07/10/05. R$ 10.100,00.
- Bolsa de produtividade em pesquisa, CNPq (taxa de bancada). Processo: 303097/2005-1.
Vigência: 01/03/06 a 8/0/209 ?. Valor: R$ 36.000,00
- 1st International Conference of the AB3C, apoio FAPESP Nº 2005/55507-6. Vigência
04/10/05 a 07/10/05. Valor R$ 13.760,00.
- "SAGE of Multiple Tumors for the Cancer Genome Anatomy Project", apoio Johns Hopkins
University. 23XS073.Vigência: 29/07/05 a 28/07/06. Valor: U$ 12,800.00 .
- Auxílio visitante exterior - regular, apoio FAPESP Nº 2006/54247-3. Vigência 25/07/06 a
08/08/06. Valor: R$ 6.323,00.
- Conf. Inter. Assoc. Brasileira Bioinf. Biologia Computacional, apoio FAPESP- Nº
2007/55269-. Valor: R$ 30.000.00.
- “Splicing alternativo: Integração de estratégias computacionais para a caracterização
funcional de variantes identificados por mutações em sítios reguladores de splicing em
tumores de cólon”, apoio FAPESP Nº2007/55790-5. Vigência: 1/12/07 a 30/11/ 09. Valor: R$
26.992,26 e U$ 44,277.00.
IMUNODEFICIÊNCIAS
L.V. Rizzo
- “Caracterização fenotípica e funcional das células T reguladoras em pacientes com uveíte”,
apoio CNPq. Vigência 2007-2009. Valor: R$ 27.000,00
- “Caracterização fenotípica e funcional das células T reguladoras no olho de pacientes com
uveítes auto-imunes sem comprometimento sistêmico”, apoio FAPESP. Vigência: 2007-2010.
Valor: R$ 129.000,00.
- “Regulation of the inflammatory response in the eye of patients with autoimmune uveitis,
apoio Panamerican Association of Ophthalmology”. Vigência: 2008-2009. Valor: U$
20.000,00.
162
- “Toxoplasmose ocular: caracterização de aspectos moleculares e celulares da resposta
imune ocular e sistêmica e sua associação a forma clínica da doença”, apoio CNPq.
Vigência: 2003-2005. Valor R$ 50.000,00.
DOENÇAS INFECCIOSAS –LEISHMANIA
Amélia de Jesus e Roque Almeida
- “Parasite antigenic differences and Host Genetic in tegumentary leishmanisis”, apoio NIH
RO3 Grant 1R03AI70909-01. Vigência: 2007–2009. Valor: 150.000,00.
- “Immune Response and Imunogenetics in Leprosy”, apoio FAPITEC-SE. Vigência: 20082008. Valor: 20.000,00.
-“Evaluation of the Impact f Schistosomiasis in the State of Sergipe using Geographic
Information System (GIS)”, apoio CNPq / FAPITEC. Vigência 2008-2009. Valor: 36.000,00.
-“Características fenotípicas de Leishmanias braziliensis que têm efeito na resposta imune e
influenciam a apresentação clínica e resposta ao tratamento na leishmaniose tegumentar”,
apoio CNPq. Vigência: 2008-2009. Valor: R$ 72.000,00.
-“Imunoterapia na leishmaniose visceral”, apoio FAPITEC-SE. Vigência: 2008-2008. Valor:
R$ 14.500,00
DOENÇAS INFECIOSAS – BAHIA FIOCRUZ
Manoel e Aldina Barral
- “Estudo integrado nas leishmanioses” Edital Doenças Negligenciadas, apoio CNPq.
Vigência: 08/01/2007 a 30/12/2009. Valor: R$ 700.000,00.
- “Mecanismos de Controle e Imonoprofilaxia na Leishmaniose-Cyted”, apoio Cyted/CNPq.
Vigência: 01/01/2007 a 01/01/2010. Valor: R$ 163.349,70.
-“Efeito da saliva de Lutzomyia longipalpis no Recrutamento Celular e na Infecção por
Leishmania Chagasi no Modelo Bolsão Inflamatório” Edital Universal, apoio CNPq. Vigência:
21/07/2005 a 21/072007. Valor: R$ 40.000,00.
-“Avaliação proteômica funcional da saliva de Lutzomyia longipalpis (Lutz & Neiva, 1912)
(Diptera: Phlebotominae) PAPES IV”, apoio CNPq. Vigência: 16/03/2006 a 06/03/2008. Valor:
R$ 60.000,00.
- “AI30639-9- Pathogenesis of Leishmaniasis: Host, Parasite and Vector”, apoio NIH -USA –
TMRC. Vigência: 09/2002 a 06/2007. Valor: U$ 598,419.00.
- “Potencial Biotecnológico das Proteínas da Saliva de Lutzomyia longipalpis –Renorbio”,
apoio CNPq. Vigência: 01/09/2006 a 01/09/2009. Valor: R$ 1.002.923,16.
- “Avaliação da imunidade protetora de candidatos a vacinas de DNA responsáveis pela
codificação de proteínas salivares de L. longipalpis e Leishmania chagasi no modelo de
Leishmaniose Visceral em hamsters”. Edital Universal, apoio CNPq. Vigência: 01/10/2006 a
01/10/2008. Valor: R$50.000,00.
163
-“Avaliação da Imunidade protetora da saliva de Lutzomia Longipalpis na infecção por
Leishmania braziliensis PAPES IV”, apoio CNPq. Vigência: 01/03/2006 a 01/03/2008. Valor:
R$ 45.000,00.
- “Intervenção imunológica utilizando moléculas recombinantes para o controle e regulação
de doenças infecciosas – Casadinho”, apoio CNPq. Vigência: 31/08/2004 a 20/05/2005.
Valor: R$ 374.127,6.
-“Modulação da Resposta Imune Induzida pela Infecção por Toxoplasma e por saliva
Flebotomíneos. PROCAD”, apoio CAPES. Vigência: 03/04/2006 a 0312/2009. Valor: R$
83.332,00.
- “Programa de cooperação Internacional Brasil /Espanha Capes DGU 139/07”, apoio
CAPES. Vigência: 18/04/2007 a 18/04/2009 prorrogáveis por mais 2 anos. Valor: R$
57.822,00
.
-“Imunopatogênese celular e molecular da leishmaniose, HTLV-1 e vasculites /Pronex”, apoio
FAPESB. Vigência: 01/12/2006 a 30/11/2009. Valor: R$ 758.977,00.
Aluisio Segurado
- “Escape da viremia plasmática de HIV em pacientes sob terapia anti-retroviral de alta
potência”, apoio FAPESP – Auxílio-Pesquisa (Processo Nº 2005/50468-2). Vigência: 2005 a
2007. Valor: R$ 58.857,50.
- “Avaliação da excreção cervicovaginal do vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 (HIV1) em mulheres menopausadas e em idade fértil”, apoio FAPESP – Auxílio-Pesquisa
(Processo Nº 2005/50182-1). Vigência: 2006 a 2008. Valor: R$ 112.871,25.
Francisco Bastos
- “Avaliação do teste Oral para o HIV em usuários de drogas brasileiros”, financiado pelo
NIDA/NIH (# R21 DA017025). Vigência: 2006 a 2007. Valor: R$ 300.000,00.
-.“Coorte de mulheres vivendo com HIV/AIDS: incidência de co-infecções, saúde sexual e
reprodutiva”, financiado pela Fundação Ford, PAPES IV-FIOCRUZ & OMS. Vigência: 2006 a
2007. Valor: R$ 300.000,00.
- “PROSUL - integração de bases de dados de Brasil, Argentina e Uruguai”, financiado pelo
CNPq. Vigência: 2006 a 2007. Valor: R$ 50.000,00.
- “Modelos computacionais de grande porte para aplicação de teoria de decisão Bayesiana no
controle de doenças infecciosas e avaliação dos padrões espaciais de consumo de drogas
ilícitas na cidade do Rio de Janeiro”, parcialmente financiado pela FAPERJ. Vigência: 2007-
.
Valor: R$ 35.000,00
- “Psychosocial Factors Associated with the Sexual Health and Well-Being of People Living with
HIV/AIDS Receiving Treatment From Public Health Clinics in Rio de Janeiro, Brazil”, financiado
pela Fundação Ford. Vigência: 2008- . Valor: R$ 360.000,00.
- “Taxas de infecção de HIV e sífilis e inventário de conhecimento, atitudes e práticas de risco
relacionadas às infecções sexualmente transmissíveis entre usuários de drogas em 10
164
municípios brasileiros”, financiado pelo Ministério da Saúde. Vigência: 2008. Valor: R$
800.000,00
Anna Carla Goldberg
- "Papel do polimorfismo genético na resposta imune em humanos: abordagem por
genotipagem e análise de expressão gênica”, Auxílio Temático, FAPESP. Vigência: 2002 a
2006. Valor: R$ 339.500,00 e U$ 328,773.00 (U$ 415,000.00).
- "Identificação do auto-antígeno na hepatite auto-imune tipo 1: análise proteômica através
de géis bidimensionais e Western blotting”, Auxílio a Pesquisa, CNPq, Edital Universal 2006:
Vigência: 2006 a 2008. Valor: R$ 31,500.00 (U$ 15,000.00).
- "Diferenciação de hepatócitos a partir de células tronco e desenvolvimento de ensaio préclínico visando o transplante em pacientes com insuficiência hepática". Auxílio a Pesquisa,
FAPESP. Vigência: 2007 a 2009. Valor: R$ 167.080,00 e U$ 21,152.00.
- “Estudo integrado nas leishmanioses”. Auxílio a Pesquisa, CNPq, Edital Doenças
Negligenciadas. Vigência: 2007 a 2009. Valor: R$ 430.000,00 (U$ 215,000.00).
- “Terapia celular como alternativa terapêutica do Diabetes mellitus e de outras doenças”.
Apoio FINEP. Vigência: 2004 a 2008. Edital CT-Saúde. Valor: R$ 2.252.910,00 (valor
aproximado U$ 750,000.00).
- CNPq Edital CT-Biotecnologia: RECT-NUCEL: Células-Tronco de Lesões em Doenças
Degenerativas (Diabetes, Hepatopatias, Neuropatias, Lesões Ósseas e Lesões Renais).
Vigência: 2006 a 2008. (subprojeto Diferenciação de hepatócitos a partir de células tronco de
cordão umbilical: modelo de ensaio pré-clínico visando transplante-ponte em pacientes com
hepatopatias,). Valor: R$ 443.000,00 (valor aproximado U$ 200,000.00).
- Chamada Pública MCT/FINEP/Ação Transversal – Equipamentos Multiusuários – 04/2006.
Aquisição e Implantação de Citômetro de Fluxo no Núcleo de Terapia Celular e Molecular.
Valor: R$ 1.086.050,00 (U$ 500,000.00).
Maria Regina Cardoso
- “Poluição ambiental urbana e outros fatores relacionados à ocorrência de chiado na
infância: um estudo de coorte na cidade de São Paulo, Brasil - Projeto Chiado”, financiado
pelo CNPq. Valor: R$ 240.000,00. Vigência: 2004-2007.
- “Qualidade microbiológica de águas de consumo humano em assentamento periurbano,
município de Suzano (SP)”, financiado pela FAPESP. Valor: R$ 68.000,00. Vigência: 2007atual.
- “Estudo de prevalência de base populacional das infecções pelos vírus das hepatites A, B e
C nas capitais do Brasil”, financiado pelo Ministério da Saúde. Valor: R$ 3.000.000,00.
Vigência: 2006-atual.
- “Avaliação do Programa Nacional de Controle de Infecção Hospitalar”, financiado pelo
Ministério da Saúde - ANVISA. Valor: R$ 480.000,00. Vigência: 2001-2006.
165
-. “Latin-american multicentre study on antibiotic resistance of Streptococcus pneumoniae
isolated from children with severe pneumonia”, financiado pela Organização Panamericana da
Saúde (PAHO) e pela Organização Mundial da Saúde (WHO). Valor: U$ 450.000,00. Vigência:
2001-2005.
Amilcar Tanuri
- “Chemokines: A Measure of Pediatric HIV Disease Activity”, co-investigador R01 NIH, junto
com Dr. De’Vicco, Institute of Human Virology, University of Mariland, USA. Vigência:
01/09/1999 – Atual. Valor: U$ 450,000.00.
- “Monitoring HIV drug resistance in Brazil”, Ministério da Saúde-Programa Nacional de AIDS.
Vigência: 01/01/1998 – Atual. Valor: U$ 500,000.00.
- “Monitoring the quality of antiretroviral compounds used in the fabrication of generic HIV
drugs in Brazil”, Programa Nacional de DST-AIDS, financiamento Farmanguinhos,
Fiocruz/Ministério da Saúde. Vigência: 01/01/2000 – Atual. Valor: U$ 600,000.00.
- “Developing of a NS5b HCV antiviral inhibitor”, Projeto Tecnológico FINEP/Subvenção
econômica da Universidade Federal do Rio de Janeiro e Laboratório Farmacêutico Cristália.
Vigência: 2007 a 2010. Valor: U$ 1,550,000.00.
Marcelo Brígido
-
“Desenvolvimento
de
Medicamentos
Recombinantes
para
Uso
em
Hematologia/Hemoterapia”, financiamento BNDES/HEMOBRAS/COPPETEC. Vigência: 2008
a 2011. Valor: R$ 480.000,00.
- “Humanização de Anticorpos Anti Antígeno da Hepatite B HBsAg”, financiamento
Biomanguinhos. Vigência: 2006 a 2008. Valor: R$ 120.000,00.
- “Produção de Fatores Plasmáticos Recombinantes”, Rede Nacional Fator VIII,
financiamento FINEP/MCT/MS. Vigência: 2001 a 2008. Valor: R$ 1.250.000,00.
- “Humanização do Anticorpo Anti-CD3”, relacionado ao projeto de obtenção de anti-CD3
recombinantes – Plataforma de transplantes, financiamento Edital Universal. Vigência: 2008
a 2010. Valor: R$ 97.000,00.
- “Produção de Antígeno recombinante de Hantavírus: caracterização molecular e elaboração
de kits de diagnóstico”, financiamento CNPq. Vigência: 2005 a 2007. Valor: R$ 97.000,00.
- “Obtenção de anticorpos anti-nematóide por Phage Display, financiamento Prodetab.
Vigência: 2003 a 2004. Valor: R$ 104.000,00.
Ana Maria Moro
- “Anticorpos Monoclonais e Policlonais como Ferramentas Imunoterapêuticas: Produção em
Larga Escala e Uso Clínico”, financiamento FINEP. Vigência: 10/2004 a 03/2008. Valor: R$
498.959,93.
166
- “Anticorpos Monoclonais para Tratamento de Câncer: Desenvolvimento e Testes Clínicos”,
financiamento MCT/MS/FINEP, Ação Transversal – Cooperação ICTs-Empresas. Vigência:
11/2006 a 10/2008 (prorrogação em andamento). Valor: R$ 6.197.136,62 (FINEP/MS) +
contrapartida da empresa.
- “Linhagens Celulares de Alta Produtividade e Estabilidade de Anticorpos Monoclonais
Humanizados para Terapia de Câncer”, financiamento FAPESP. Vigência: 10/2007 a
09/2010. Valor: R$ 72.460,64 + US$ 647.185,85 + contrapartida da empresa.
Guilherme Loureiro Werneck
- "Fatores associados à incidência da leishmaniose visceral em Teresina, Piauí: abordagens
hierárquicas e espaço-temporais" financiamento CNPq. Vigência: 2005 a 2008. Valor: R$
32.100,00.
- "Desenvolvimento e implementação de modelos hierárquicos e espaço-temporais para a
identificação de fatores associados à incidência da leishmaniose visceral em dois cenários
distintos de transmissão", financiamento CNPq. Vigência: 2006 a 2009. Valor: R$ 49.794,45.
- "Impacto da heterogeneidade dos padrões de contato social na dinâmica das doenças de
transmissão direta: o caso da coqueluche", financiamento CNPq. Vigência: 2003 a 2006.
Valor: R$ 14.260,00.
- "Fatores associados à incidência da leishmaniose visceral em Teresina, Piauí: abordagens
hierárquicas e espaço-temporais", financiamento PAPES/Fiocruz. Vigência: 2008 a 2010.
Valor: R$ 40.000,00.
- "Avaliação do impacto da modificação da composição do chumbinho na incidência de
intoxicações exógenas no Rio de Janeiro"; financiamento ANVISA/Bayer CropScience.
Vigência: 2002 a 2006. Valor: R$ 400.000,00.
- "Leishmaniose visceral em meio urbano: avaliação das estratégias de controle utilizando
uma abordagem espacial", financiamento Ministério da Saúde. Vigência: 2003 a 2007. Valor:
R$150.000,00.
HIV
Como coordenador:
A) Coordenador, Auxílio NIH ( National Institutes of Health, USA): 1 R03 AI06696101A1HIV-1 PROTEASE CD4+ T CELL EPITOPES AND DRUG-INDUCED MUTATIONS
2007-2009, US$ 162.000,00
B)Coordenador do Projeto “Imunogenicidade de diferentes formulações candidatas a vacina
anti-HIV-1 contendo epitopos promíscuos para linfócitos T CD4+ e plasmídeos codificando o
gene vif, rico em epitopos para linfócitos T CD8+” Programa Nacional de DST e AIDS,
Ministério da Saúde, valor captado R$ 500.000,00, 2007-2008
167
C) Coordenador, Auxílio à pesquisa ICGEB (International Center for Genetic Engineering and
Biotechnology/United Nations, Trieste, Itália), CRP/BRA05-01, Identification of novel
promiscuous CD4+ T cell epitopes from HIV-: recognition by HIV-1 patients and assessment
of immunogenicity with HLA-transgenic mice 2006-2008. Euros 48.000,00
D) Coordenador brasileiro do projeto ANRS 1294, financiado pela agência governamental
francesa ANRS, intitulado: Crossreactivity of dominant CD4+ T cell epitopes contained in
French HIV-1 strains circulating in Brazil: relevance for future definition of vaccines, 20052007 Euros 34.000,00
E)Processo FAPESP NUPLITEC 04/15331-3, que resultou na patente nacional e no PCT
PI0504117-1, depositada no INPI em 05/09/2005. Inventores EDECIO CUNHA-NETO,
JORGE KALIL, SIMONE GONÇALVES DA FONSECA, e depositantes FAPESP, USP e
Fundação Zerbini “Epitopos, combinação de epítopos, usos de epítopos ou sua combinação,
composição, usos da composição, vacinas profiláticas anti-HIV-1, vacinas terapêuticas,
método para a identificação de epítopos e métodos para o tratamento ou prevenção
F) Coordenador, Auxílio à Pesquisa FAPESP, processo 00-08404-3: Identificação de
epitopos imunodominantes de antígenos protetores do Paracoccidiodes braziliensis e
Schistosoma mansoni e estudo do reconhecimento molecular destes peptídeos por células T
humanas , 2000-2006 US$ 80.000,00
G) Coordenador, Auxílio à Pesquisa FAPESP, processo 01/00729-3: Identificação de fatores
virológicos, genéticos e imunológicos associados ao fenótipo de não progressão da doença
do HIV: Estudo de marcadores de virulência do HIV, genotipagem de co-receptor CCR5, e
expressão de painel abrangente de citocinas em amostras de sangue periférico de pacientes
portadores do HIV não progressores e progressores acompanhados na Casa da AIDS ,
2001-2006 US$ 100.000,00
Como colaborador:
A) Colaborador, Bases moleculares dos mecanismos patogenéticos da doença de Chagas,
Projeto DECIT/MS 2007-2008 (Coord. Bianca Zingales) R$ 350.000,00
B) Pesquisador,
Programa Institutos do Milênio/MCT – “Instituto de Investigação em
Imunologia” – Areas Cardiopatia chagásica crônica e HIV, 2005-2008 (Coordenador Prof.
Jorge Kalil) R$ 4.400.000,00
C) Colaborador, Projeto PITE FAPESP 00/1459-4, “Desenvolvimento de vacina contra o
estreptococo b-hemolitico do grupo A 2001-2006 (Coord. Dra. Luiza Guilherme Guglielmi)
R$ 9.000.000,00
168
D) Projeto Temático, FAPESP 01/09850. "Papel do polimorfismo genético na resposta imune
em humanos: abordagem por genotipagem e análise de expressão gênica”, 2002-2006
(Coordenador: Anna Carla Goldberg) R$ 339.500,00 e US$ 328.773,00
E)
Programa
Equipamentos
Multi-usuários
2,
FAPESP
04/08932-0,
“Eletroforese
Bidimensional diferencial e identificação proteica por “peptide mass fingerprinting”no estudo
da fisiopatologia de doenças humanas” 2005-2007, (Coordenador Prof Jorge Kalil) R$
204.451,50 e US$ 272.602,00
169
Esper Kallas
U01 AI69420 Janeiro 2007 a Dezembro 2013
Financiamento: NIH, U$ 4,500,000.00
São Paulo Clinical Trials Unit
Global IPrEx Maio 2008 a Abril 2012
Financiamento: NIH, U$ 1,900,000.00
Chemoprophylaxis of HIV in men who have sex with men
V520 – 023, HVTN 502 Kallas EG (Site PI)
Setembro 2005 a Dezembro 2009
Financiamento: Merck & Co., Inc., R$ 600,000.00
A multicenter, double-blind, randomized, placebo-controlled phase II proof-of concept study a
evaluate the safety and efficacy of a 3-dose regiment of the Merck adenovirus serotype 5
HIV-1 gag/nef/pol vaccine (MRKAd5 HIV-1 gag/nef/pol) in adults at high risk of HIV-1
infection.
R01 AI060379-01 (Douglas F. Nixon, PI) Abril 2005 a Março 2010
Financiamento: NIH, U$125,000.00
Cell mediated immunity in HIV-infected children
Role: Co-investigador
R21 AI073230-01A1 (Watkins DI and Kallas EG, PIs) Abril 2008 a Março 2013
Financiamento: NIH/NIAID, U$ 390,000.00
Vif-specific CD8 responses in individuals that control HIV replication
04/10918-6
Fevereiro 2005 a Janeiro 2007
Financiamento: FAPESP (Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo), R$
120,000.00
Caracterização de linfócitos CD25+CD4+ de infectados pelo HTLV-I, co-infectados ou não
pelo HIV-1.
001-01-LI-DIPA Fevereiro 2002 a Dezembro 2007
Financiamento: Brazilian Ministry of Health and the Health Department of the City of Sao
Paulo, Brazil, R$ 375,000.00
Resposta imune celular em recém infectados pelo HIV-1, identificados pelo teste de duplatestagem (detuned)
Cellular immune response a HIV antigens in HIV recently infected subjects, identified by the
dual testing strategy
V520 – 018, HVTN 050 Setembro 2003 a Dezembro 2008
Financiamento: Merck & Co., Inc., R$ 500,000.00
A worldwide, phase I, dose-escalating study of the safety, alerability, and immunogenicity of a
3-dose regimen of the MRKAd5 HIV-1 gag vaccine in healthy adults.
Goals: Evaluate safety, alerability, and immunogenicity of a novel HIV vaccine candidate in
an international, 8 countries, 4 continent study.
170
F) Projeto de Pesquisa FAPESP 05/00982-1 - Caracterização Molecular dos Antígenos
principais dos Venenos das Vespas Agelaia pallipes pallipes e Polybia paulista” 2005-2007
(CoordenadorMario Sergio Palma) US$ 48.000,00
G) Pesquisador, Programa Institutos do Milênio/MCT - Instituto de Investigação em
Imunologia (iii) 2002-2005
ESTER SABINO
REDS International Study – NHLBI US 3.000.000 Ester Sabino co PI 2006-2010
FAPESP – Temático HIV (Ricardo Diaz PI), Esper Kallas e Ester Sabino co PI
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MORAES, L. V. et al. Transplant Immunology, v. 18, p. 330-337, 2008.
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MORENO-CARVALHO, O. A. et al. Acta Paediatrica (Oslo), v. 97, p. 816818, 2008.
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NORONHA, A. et al. Pathology, Research and Practice, v. 204, p. 155-161,
2008.
487.
PONTE, E. V. et al. Allergy (Copenhagen), v. 63, p. 564-569, 2008.
488.
PRATES, D. et al. Journal of Medical Entomology, v. 45, p. 409-413, 2008.
489.
RAMASAWMY, R. et al. Molecular Immunology, v. 45, p. 283-288, 2008.
490.
RAMOS, D. M. et al. Revista Brasileira de Cirurgia da Cabeça e Pescoço, v.
37, p. 37-43, 2008.
190
491.
REIS, A. D. et al. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, v.
50, p. 37-40, 2008.
492.
RIBEIRO DE JESUS, A. et al. International Immunopharmacology, v. 8, p.
1344-1353, 2008.
493.
RIZZO, L. V. et al. International Immunopharmacology, v. 8, p. 1-1, 2008.
494.
ROCHA, T. et al. Microscopy Research and Technique (Online), v. 71, p.
220-229, 2008.
495.
SANTOS, A. B. R. et al. Journal of Allergy and Clinical Immunology, v. 121, p.
1040-1046, 2008.
496.
SCAZUFCA, M. et al. International Psychogeriatrics, v. 20, p. 394-405, 2008.
497.
SCAZUFCA, M. et al. International Journal of Epidemiology, p. 879, 2008.
498.
SCHRIEFER, A. et al. Gazeta Médica da Bahia, v. 78, p. 47-51, 2008.
499.
SEGURADO, A. A. C. et al. AIDS Care, v. 20, p. 15-20, 2008.
500.
TATAKIHARA, V. L. H. et al. FEMS Immunology and Medical Microbiology, v.
52, p. 47-58, 2008.
501.
TAVARES, M. R. et al. Surgery Today (Tokyo), v. 38, p. 499-504, 2008.
502.
VANZ, A. N. L. S. et al. Microbial Cell Factories, v. 7, p. 13, 2008.
503.
VILLENA, S. N. et al. Cellular Microbiology, v. 10, p. 1274-1285, 2008.
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WATKINS, D. I. et al. Nature Medicine, v. 14, p. 617-621, 2008.
505.
XIMENES, R. A. et al. International Journal of Epidemiology, v. 37, p. 852861, 2008.
506.
ZANETTI, M. V. et al. British Journal of Psychiatry, v. 193, p. 25-30, 2008.
191
Lista dos pesquisadores e alunos formados-Situação atual
Formação de recursos humanos e situação profissional atual
Pesquisador
Aldina Maria
Prado
Barral
Nome do aluno
Grau
Ano de
conclusão
Dorlene Maria
Cardoso de
Aquino
Doutorado
2007
Professora da UFMA
Maria Jania
Teixeira
Doutorado
2005
Funcionária da UFC e
Professora de Pós Graduação
da UFC
Arlene de Jesus
Mendes Caldas
Doutorado
2004
Professora adjunta do curso de
enfermagem da UFMA
Situação atual
Maria da Gloria
Bomfim Arruda
Doutorado
2001
Chefia do Serviço de
Hematologia/CTMO Hospital
Universitário Prof. Edgard
Santos
Tânia Maria
Correia Silva
Doutorado
1999
Médica da UFBA e colaborada
na Fiocruz
Jackson Mauricio
Lopes Costa
Doutorado
1997
Pesquisador Titular da
Fundação Oswaldo Cruz
Petter Franco
Entriger
Pós-Doutorado
2008
Em andamento/Fiocruz
Camila Indiani
Pós-Doutorado
2006
Tecnologista da Fiocruz
Luis Fabiano
Oliveira
Pós-Doutorado
2008
Pós-Doc no NIH
Formação de recursos humanos e situação profissional atual
Pesquisador
Aluisio
Segurado
Nome do aluno
Grau
Ano de
conclusão
Crispim Cerutti
Jr
Mestrado
1998
Professor Adjunto - UFES
Arnaldo Etzel
Mestrado
1999
Professor Doutor – UNILUS,
Santos-SP
Claudia Biasutti
Mestrado
2002
Professora – universidade
privada, ESJ
Jose Marcos
Pereira Costa
Mestrado
2005
Médico infectologista,
Hospital Heliópolis, SP
Situação atual
192
Flavio Augusto
Padua Milagres
Mestrado
2006
Médico infectologista - TO
Mildred Pitman
de Castro
Mestrado
2007
Assistente Social
Supervisora – SEAPHIV/AIDS- HC-FMUSP
Carla Baggetti
Ferraz de LIma
Mestrado
2008
Biologista - Cia. Industrial
fabricante de reagentes
Arnaldo Etzel
Doutorado
2004
Professor Doutor – UNILUS,
Santos-SP
Ricardo Tapajos
Martins Coelho
Pereira
Doutorado
2005
Médico assistente, HCFMUSP
Claudia
Courtouke
Guedes
Doutorado
2008
Professora – universidade
privada, SP
Formação de recursos humanos e situação profissional atual
Pesquisador
Amélia
Ribeiro de
Jesus
Nome do aluno
Grau
Ano de
conclusão
Andre Luiz
Muniz
Doutorado
2006
Médico do Serviço de
Neurologia do Hospital São
Rafael
Lea Castellucci
Doutorado
PósDoutorado
2003
Pesquisadora do Serviço de
Imunologia do HUPES,
UFBA
Lucas P.
Carvalho
Doutorado
2004
Pós-doutorando na
University of Pensilvania
Tânia Luna
Mestrado
2006
Doutorado na UFBA
Situação atual
Formação de recursos humanos e situação profissional atual
Pesquisador
Amilcar
Tanuri
Nome do aluno
Grau
Ano de
conclusão
Renato S
Rodarte
Mestrado
1998
Professor Adjunto II,
Universidade Federal de
Alagoas/UFAL
Luciana Jesus
Costa
Mestrado
1998
Professor Adjunto I,UFRJ
Simone Morais
da Costa
Mestrado
1998
Tecnologista, FIOCRUZ
Situação atual
193
Andreia Palluch
Mestrado
2000
Senior Medical Writer, Eisai,
London
Daniella
Ishimaru
Mestrado
2000
Pesquisadora associada,
LTVP, UFRJ
Cecília Jacques
Gonçalves de
Almeida
Mestre
1999
Pesquisador assistente,
FIOCRUZ
Marcelo Alves
Soares
Mestre
1997
Professor Adjunto III, UFRJ
Ana Beatriz
Furlanetto
Pacheco
Doutorado
2000
Professor Adjunto III, UFRJ
Renato Aguiar
Santana
Mestre
1992
Professor Adjunto I, UFRJ
Patricia Alvarez
Baptista
Brindeiro
Doutorado
2006
Tecnologista , FIOCRUZ
Rodrigo M.
Brindeiro
Doutorado
1999
Professor Adjunto III, UFRJ
Luis Mario
Janini
Doutorado
1999
Professor Adjunto II, UFESP
Agdemir Waléria
Aleixo
Doutorado
2006
Pesquisadora no setor de
genética e biologia
molecular, UFMG
Formação de recursos humanos e situação profissional atual
Pesquisador
Ana Maria
Caetano de
Faria
Nome do aluno
Grau
Ano de
conclusão
Situação atual
Bruna de
Paula Santos
Mestrado
2008
Recém-egressa
Andrezza
Fernanda
Santiago
Springett
Mestrado
2008
Doutoranda, UFMG
Danielle de
Abreu
Foschetti
Mestrado
2007
Professora de Biologia
Raphaela
Mendes
Fernandes de
Souza.
Mestrado
2007
Doutoranda, UFMG
Alice Oliffson
Kamphorst
Leal da Silva.
Mestrado
2004
Doutoranda,
Rockefeller University, NY,
EUA
194
Michele
Mendes
Barsante.
Mestrado
2001
(Falecida em 2008)
Professora Adjunta UFJF
Elaine Speziali
de Faria
Mestrado e
Doutorado
1999 /
2004
Professora de Imunologia
da UNIVALE, MG
Sabine
Madsen Ficker
Mestrado
1998
Profissional liberal
Tatiani Uceli
Maioli
Doutorado
2008
Pós-doutoranda, UFMG
Andrea Catão
Alves
Doutorado
2008
UFMG
Fabiano
Comin
Doutorado
2007
Pós-doutorando, UFMG
2006
Coordenadora do
Programa de PósGraduação e professora do
curso de Nutrição UNI-BH,
MG
2003
Professora da
UNIMONTESMG/Pesquisadora
Colaboradora da FIOCRUZ
Joana Ferreira
do Amaral
Mariléia
Chaves
Andrade
Juscilene da
Silva Menezes
Doutorado
Doutorado
Doutorado
2001
Pós-doutoranda
no California Institute of
Technology (CALTECH),
EUA EUA
Formação de recursos humanos e situação profissional atual
Pesquisador
Anamaria
Camargo
Nome do aluno
Grau
Ano de
conclusão
Giseli Klassen
PósDoutorado
2004
UFPR - Professora
Raphael B
Parmigiani
PósDoutorado
2008
LICR - Pesquisador
Newton Valério
Verbisck
PósDoutorado
2003
UFABC - Professor
José Claudio
Casali Rocha
Doutorado
2002
INCA - Pesquisador
Fabiana Bettoni
Doutorado
2003
Pós-Doutorando - LICR
Fabricio Falconi
Costa
Doutorado
2004
Pós-Doutorando – CMRC,
USA
Situação atual
195
Natanja Sara
Kirschbaum
Slager
Doutorado
2005
Israel, empresa de
bioinformática
Daniela Ierardi
Doutorado
2005
Pós-Doutorando - UNIFESP
Ana Paula
Medeiros Silva
Doutorado
2006
Pós-Doutorando - LICR
Mônica
Caamaño
Cristovão Poli
Doutorado
2007
AC Camargo - Hematologia
Gerusa Gabriele
Seniski
Mestrado
2008
Paulo Henrique
Baldan Pineda
Mestrado
2007
UNIP - Professor
Murilo Vieira
Mestrado
2006
Doutorando - USP
Felicia Peterson
Cavalhero
Metrado
2005
Doutorando - LICR
Formação de recursos humanos e situação profissional atual
Pesquisador
Ana Maria
Moro
Nome do aluno
Grau
Ano de
conclusão
Maria Teresa A.
Rodrigues
Doutorado
1996
Pesquisadora IV do
Laboratório
Ney Silvio
Laignier
Mestrado
1999
Tem empresa de paisagismo
Angélica
Garbuio
Mestrado
2002
Biotecnológa II do
Laboratório
Noemi
Morimatsu Taga
Mestrado
2003
Trabalha na indústria
farmacêutica
Situação atual
Formação de recursos humanos e situação profissional atual
Pesquisador
Nome do aluno
Grau
Ano de
conclusão
Situação atual
196
Formação de recursos humanos e situação profissional atual
Pesquisador
Anna Carla
Goldberg
Nome do aluno
Grau
Ano de
conclusão
Situação atual
Rafael Ioschpe
Mestrado
2005
Trabalha
em
indústria
farmacêutica - monitor de
pesquisa clínica
Josely Marchi
Chiarella
Mestrado
1995
Diretora Geral da Eppendorf do
Brasil
Kellen Christina
Faé
Mestrado e
Doutorado
1999 / 2003
Sandra Aparecida
Drigo
Mestrado e
Doutorado
Pós-Doutorado UNESP2000 / 2004 Botucatu
Paulo Lisboa
Bittencourt
Doutorado
2000
Coordenador do Serviço de
Gastroenterologia, Hospital
Português, BA
Maria Lúcia
Carnevalli Marin
Mestrado
2002
Biologista e pesquisadoraInCor
Rajendranath
Ramasawmy
Pós-Doutorado
2006
Pesquisador Visitante - UFBA
Humberto Miguel
Pós-Doutorado
Garay Malpartida
2007
Prof. Doutor EACH-USP
Pós-Doutorado no exterior
Formação de recursos humanos e situação profissional atual
Pesquisador
Claudia Ida
Brodskyn
Nome do aluno
Grau
Ano de
conclusão
Robson Amaro da
Silva
Doutorado
2008
Professor UFBA, campus de
Vitória da Conquista
Cecília Beatriz
Fiúza Favali
Doutorado
2007
Bioquímica do LACEN e
Professora Adjunta da FTC
Regis B. B.
Gomes
Doutorado
2006
Pós-Doc no NIH
Situação atual
Formação de recursos humanos e situação profissional atual
Pesquisador
Nome do aluno
Grau
Ano de
conclusão
Situação atual
197
Formação de recursos humanos e situação profissional atual
Pesquisador
David
Saitovitch
Nome do aluno
Grau
Ano de
conclusão
Situação atual
Edgar Chagas
Dieffenthaeller
Mestrado
2000
Professor Adjunto da Pontifícia
Universidade Católica do RS
Auri Ferreira dos
Santos
Doutorado
2001
Médico Nefrologista, Hospital
Don Vicente Schrer, Porto
Alegre
Nícea Bastos
Mestrado
2002
Nutricionista, Hospital de
Clinicas de Porto Alegre
Luciana Roesh
Schreiner
Mestrado
2002
Médica Endocrinologista,
Hospital São Lucas PUCRS
Patricia
Sesterheim
Mestrado
2002
Doutoranda - PUCRS
Gibsi P. Rocha
Mestrado
2002
Médica Psiquiatra - PUCRS
Florencia Maria
Barbé
Mestrado
2002
Professora Substituta - PUCRS
Maria Alice Dotta
Mestrado
2002
Doutoranda - UFRGS
Luciano Diogo
Mestrado
2002
Professor Adjunto PUCRS
Luciano Percival
Krug
Doutorado
2003
Biólogo - Empresário
Regina Schroeder
Mestrado
2003
Bióloga – Santa Casa de Porto
Alegre
Vanessa Ramos
Kirsten
Mestrado
2004
Nutricionista - Professora da
Universidade Federal de Santa
Maria
Luis Alberto
Michet da Silva
Doutorado
2004
Professor Adjunto da
Universidade Federal de Santa
Maria
Andrea Carla
Bauer
Doutorado
2005
Médica Nefrologista do
Hospital São Lucas PUCRS
Sandra Regina
Fernandes
Mestrado
2005
Bióloga – Coordenadora do
Laboratório de Imunologia do
Hospital Don Vicente Scherer –
Porto Alegre
Salvador Gullo
Neto
Mestrado
2005
Cirurgião geral do Hospital São
Lucas da PUCRS –
Doutorando PUCRS
198
Formação de recursos humanos e situação profissional atual
Pesquisador
Nome do aluno
Grau
Ano de
conclusão
Situação atual
Florencia Maria
Barbé
Doutorado
2006
Professora Substituta - PUCRS
Karine
Berdichewski
Mestrado
2006
Médica Anestesista do Hospital
São Lucas PUCRS
Fabiana Piovesan
Mestrado
2007
Professora Adjunta da
Universidade de Passo Fundo
Izabel Cristina
Schander de
Almeida
Doutorado
2007
Médica do Hospital de Clínicas
de Porto Alegre
Marcelo Junges
Hartmann
Mestrado
2008
Cirurgião Geral do Hospital
São Lucas da PUCRS
Luciano Diogo
Doutorado
2008
Professor Adjunto da Pontifícia
Universidade Católica do RS
Formação de recursos humanos e situação profissional atual
Pesquisador
Edecio
Cunha-Neto
Nome do aluno
Grau
Ano de
conclusão
Situação atual
Lucia Cristina
Jamli Abel
Doutorado
1999
Coordenadora dos cursos de
Pós graduação Latu Sensu da
UNIP
Marcia Aparecida
Duranti
Doutorado
2000
Monitora de Ensaios Clínicos
Francisco Max
Damico
Doutorado
2002
Pesquisador ICB USP
Leo Kei Iwai
Doutorado
2004
Pós-Doutorando,
Diabetes
Center,
Medical School, EUA
Simone Gonçalves
Fonseca
Doutorado
2004
Pesquisadora
FMUSP
Joslin
Harvard
Bióloga
da
Sandra Drigo
Doutorado
2004
Coordenadora do curso de
Farmácia
da
Faculdade
Sudoeste Paulista e PósDoutorado no Lab. Neogene de
Botucatu/UNESP
Lucila Campos
Mestrado
2004
Gerente-Médica da Roche
Produtos
Clínicos
e
Farmacêuticos S.A
199
Formação de recursos humanos e situação profissional atual
Pesquisador
Nome do aluno
Grau
Ano de
conclusão
Situação atual
Renata Cristina
Ferreira
Mestrado
2004
Docente
da
Universidade
Estadual do Sudoeste
da
Bahia
Angelina Morand
Bianchi Bilate
Mestrado
Doutorado
Pós-Doutorado
2007
Pós Doutorado,
University, EUA
New
York
Formação de recursos humanos e situação profissional atual *
Orientador
Nome aluno
grau
Ano
conclusão
Situação atual
Esper G.
Kallás
Marcos Davi
dos Santos
Mestre
2001
Médico Infectologista
Mariana
Mellilo Sauer
Mestre
2002
Médica Infectologista, pesquisadora,
aluna de pós-doutorado
Marta Anésia
Viana
Mestre
2004
Técnica em citometria, coordenadora
de divisão do Laboratório Diagnósticos
da América
Mestre
2005
Técnica em imunologia, Santa Casa
de São Paulo
Tânia Maria
da Silva
Mestre
2005
Técnica do Laboratório Central do
Hospital São Paulo
Hugo Marcelo
Ribeiro
Barbosa
Mestre
2007
Doutora
2001
Doutora
2007
Débora
Cristina
Rocha
Denise S. S.
Rodrigues
Mariana
Mellilo Sauer
Médico Infectologista
Recém-Doutora pela FAPESP,
pesquisadora do Instituto Clemente
Ferreira
Médica Infectologista, pesquisadora,
aluna de pós-doutorado
Formação de recursos humanos e situação profissional atual
Pesquisador
Nome do aluno
Grau
Ano de
conclusão
Situação atual
200
Ester
Sabino
Cesar de
Almeida Neto
Doutorado
2008
Chefe do Departamento de
aconselhamento da
Fundação PróSangue/Hemocentro de São
Paulo
Luciano Vieira
de Araújo
Doutorado
2008
Pós-doutorado
Erika Maria do
Nascimento
Doutorado
2007
Médica, CRT/AIDS
Walter Kleine
Neto
Mestrado
2007
Biologista da Fundação PróSangue
Sabri Sababani
Doutorado
2005
Pós-doutorado
2004
Biologista da Fundação PróSangue
Suzete Ferreira
Claudia Cortese
Barreto
Doutorado
2001
Biologista da Fundação PróSangue
Marilia A
Rossini
--
2000
Chefe de Laboratório.
Insituto Adolfo Lutz
Anna Shoko
Nishya
Mestrado
2000
Biologista da Fundaçao ProSangue
Rubia A F
Santana
--
1999
Biologista do Hospital Albert
Einstein
Camilo
Anssarah
Sobrinho
--
--
Maria Cecilia
Araripe
Sucupira
--
1997
Pós- doutorado
Pesquisadora UNIFESP
Formação de recursos humanos e situação profissional atual
Pesquisador
Nome do aluno
Grau
Ano de
conclusão
Izabella Cordeiro
Freire Saad
Rached
Doutorado
2003
Serviço de Alergia do Hospital
Municipal de São Paulo
Mestrado
2003
--
Mestrado
2004
--
Doutorado
2004
--
Paulo Márcio
Fabio
Gonçalves Barros
Fernandes
Morato Castro
Rosangela
Carboni Castro
Silvia Helena
Grosso Esher
Situação atual
201
Formação de recursos humanos e situação profissional atual
Pesquisador
Nome do aluno
Grau
Ano de
conclusão
Soraya Regina
Gonçalves de
Andrade
Mestrado
2006
--
2006
Professora substituta da
Disciplina Medicina Interna I –
Universidade Federal de
Sergipe
Maria Fernanda
Malaman
Doutorado
Situação atual
Carlos Roberto de
Medeiros
Doutorado
2007
Aguarda inscrição para pósdoutorado neste programa,
desenvolvendo atividades de
pesquisa – Responsável pela
Diretoria do Instituto do Butantã
Veridiana Aun
Rufino Pereira
Doutorado
2007
Hospital do Servidor Público
Estadual do Estado de São
Paulo
Formação de recursos humanos e situação profissional atual *
Orientador
Nome aluno
grau
Ano
conclusão
Situação atual
Francisco
Bastos
Sonia
Izecksohn
Garcia
Mestre
1996
Psicóloga da UERJ
Mestre
1999
Psiquiatra
da UFRJ
Ana Lúcia S.
Bentes
Mestre
1999
Beatriz
Grinsztejn
Doutor
2001
Pesquisadora FIOCRUZ
Claudia TV de
Souza
Doutor
2001
Pesquisadora FIOCRUZ
Kátia
Coutinho
Mestre
2001
Analista de C&T, iniciativa privada
Mestre
Doutora
2002
2007
Pesquisadora FIOCRUZ
Doutora
2002
Pesquisadora FIOCRUZ
Nélson do
Rosário
Caldas
Sylvia
Teixeira
Maria Goretti
Fonseca
Psiquiatra do M. da Saúde
202
Mariana
Hacker
Claudia
Cunha
Sabrina
Oliveira
Mestre
Doutora
2002
2006
Pesquisadora FIOCRUZ
Mestre
2004
Doutoranda UFRJ
Mestre
2004
Ass. Pesquisa FIOCRUZ
Mestre
2005
Doutoranda UFMG
Mestre
Doutora
2005
2008
Pesquisadora FIOCRUZ
Mestre
2005
Gerente informática FIOCRUZ
Mestre
Doutora
2005
2008
Pesquisadora visitante da
Universidade da Escócia
Doutora
2005
Coordenadora de assistência,
iniciativa privada
Mestre
2006
Médica no Espírito Santo
Doutora
2006
Pesquisadora FIOCRUZ
Mestre
2006
Gerente de vigilância, Niterói, RJ
Mestre
2007
Aux. de pesquisa, FIOCRUZ
Doutorado
2007
Pesquisadora Universidade Federal
do Espírito Santo
Doutorado
2007
Professor da Universidade de Volta
Redonda, RJ
Mestre
2007
Doutora
2008
Aline Dayrell
Mônica Malta
Maria Estela
Leite
Elize Massard
da Fonseca
Ana Simões
Junia
Rodrigues
Ruth
Friedman
Maristela
Bernardi
Vivian Studart
Rita Checon
Silva
Julio Aragão
Antonio
Souza
Maria de
Lourdes
Oliveira
Doutorando IMS-UERJ
Pesquisadora FIOCRUZ
203
Formação de recursos humanos e situação profissional atual
Pesquisador
Guilherme
Loureiro
Werneck
Nome do aluno
Grau
Ano de
conclusão
Nádia Cristina P
Rodrigues
Mestrado
2002
Professor, UERJ
Ana Claudia
Montenegro
Mestrado
2002
Profissional liberal, fisioterapia
Valeska T da Silva
Mestrado
2002
Profissional liberal, médica
Enilce Sally
Mestrado
2002
Professor, UFF
Marcos J do Lago
Doutorado
2002
Professor, UERJ
Rosana Costa
Doutorado
2002
Professor, UFRJ
Paula M. Luz
Mestrado
2003
Pesquisador, Fiocruz
José Cerbino Neto
Mestrado
2003
Pesquisador, Fiocruz
Mariana T Aires
Mestrado
2003
Médico, UFRJ
Marisa Santos
Mestrado
2004
Médica, INCL
Virginia R M
Correia
Doutorado
2004
Especialista em SIG, INPE
Wilza Andrade B
Felippe
Mestrado
2005
Enfermeira, Instituto Nacional
do Câncer
Alessandra
Amorim
Mestrado
2006
Professora, Universidade
Severino Sombra
Marcus V Gouvêa
Mestrado
2006
Médico Veterinário, Ministério
da Agricultura
Felipe Canavez
Mestrado
2007
Professor, Centro Universitário
de Volta Redonda
Otília Pimenta
Azevedo
Mestrado
2007
Enfermeira, Ministério da
Saúde
Situação atual
204
Formação de recursos humanos e situação profissional atual
Pesquisador
Nome do aluno
Grau
Ano de
conclusão
Flávia Santos
Barbosa
Doutorado
2007
Pós-doutoranda, UERJ
Rogério Costa
Gondim
Doutorado
2007
Professor, UFC
Alexandre dos
Santos Brito
Doutorado
2007
Professor Visitante, UFRJ
Fabio Silva Aguiar
Mestrado
2008
Médico, UFRJ
Simone M Santos
Doutorado
2008
Consultora, Fiocruz
Situação atual
Formação de recursos humanos e situação profissional atual
Pesquisador
Nome do aluno
D Crevat
Jorge Kalil
Grau
Doutorado
Ano de
conclusão
Situação atual
1982
Pesquisador da Escola
Veterinária Nacional de Lyon,
França, Unidade de Patologia
Infecciosa
G Paranhos
Mestrado
1986
Equipe de Citologia Analítica e
Citogenética Molecular do
Hospital Edouard Herriot, Lyon,
France
Terezinha Maria
de Paiva
Mestrado
1988
Pesquisadora Científica do
Instituto Adolfo Lutz
Claudia Macaúbas
Mestrado
1991
Departamento de Microbiologia
e Imunologia da Universidade
de Stanford, CA, EUA
1992
Vice Diretora do Laboratório de
Imunologia do Instituto do
Coração, Pesquisadora IC pelo
CNPq e Pesquisadora II no
Laboratório de
Imunologia/InCor
1992
Médico do Corpo Clínico dos
Hospitais Sírio-Libanês e
Hospital Alemão Oswaldo Cruz
de São Paulo
Luiza Guilherme
Guglielmi
Wagner Felipe de
Souza Weidebach
Doutorado
Mestrado
205
Formação de recursos humanos e situação profissional atual
Pesquisador
Nome do aluno
Edecio CunhaNeto
Grau
Doutorado
Ano de
conclusão
Situação atual
1994
Professor Associado, Dep.
Clínica Médica, e Pesquisador
do Instituto do Coração,
Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo.
Chefe do Laboratório de
Imunogia Clínica e Alergia
(LIM-60), Disciplina de
Imunologia Clínica e AlergiaFMUSP
Verônica Coelho
Doutorado
1994
Médica Pesquisadora no
Laboratório de Imunologia do
Instituto do Coração (InCor) e
Professora colaboradora da
Disciplina de Imunologia
Clínica e Alergia da FMUSP
Mônica Spadafora
Ferreira
Mestrado
1995
Pesquisadora científica IV do
Instituto Butantan
Ricardo Moliterno
Doutorado
1995
Professor Associado C da
Universidade Estadual de
Maringá
Teresa Tié Oshiro
Mocelin
Mestrado
1996
Médico do Hospital
Universitário de Londrina,
Centro de Ciências da Saúde
Francisco de Assis
Salomão Monteiro
Mestrado
Doutorado
Médico pesquisador do
1994/1997 Laboratóro de Imunologia do
Instituto do Coração
Silvia de Oliveira
Sampaio
Mestrado
Doutorado
1990/1998
Médica Patologista Clínica do
Laboratório DASA
Newton Lucchiari
Doutorado
1998
Professor titular da
Universidade Federal de Santa
Catarina e Professor Doutor da
Universidade do Extremo Sul
Catarinense
Carlos Alberto
Mayora Aita
Mestrado
1998
Professor Adjunto da Pontifícia
Universidade Católica do
Paraná
Lucia Jamli Abel
Doutorado
1999
Professora titular da
Universidade Paulista
Edilamara
Rodrigues Oliveira
Mestrado
2003
Médico
Andréa Cohon
Doutorado
2004
Médica Assistente da Disciplina
de Imunologia Clínica e
Alergia, HC-FMUSP
Clóvis Eduardo
Santo Galvão
Pós-Doc
2004
Médico Assistente da Disciplina
de Imunologia Clínica e
Alergia, HC-FMUSP
206
Formação de recursos humanos e situação profissional atual
Pesquisador
Nome do aluno
Grau
Ano de
conclusão
Leo Kei Iwai
Pós-Doc
2004
Pós doutor - Joslin Diabetes
Center, Harvard Medical
School, EUA
Situação atual
Ricardo José
Giordano
Pós-Doc
2005
Cientista pesquisador da
Universidade do Texas MD
Anderson Cancer Center, EUA
Professor do Dep. Bioquímica,
IQ-USP
Idania Marrero
Pós-Doc
2005
Pós doutoranda do La Jolla
Allergy and Immunology
Institute, San Diego, EUA
Gustavo Silveira
Graudenz
Pós-Doc
2006
Gerente técnico na Nalco Brasil
e membro da força tarefa de
qualidade do ar e prevenção de
doenças transmissíveis pela –
International Society For Indoor
Air Quality
Kellen Cristina
Faé
Pós-Doc
2006
Pós-doutor, Instituto Max
Planck ,Berlim, Alemanha
Rosemeire
Aparecida Silva
Doutorado
2006
Biologista do InCor/HCFMUSP
Doutora em Ciências pela
Universidade de São Paulo
Simone Gonçalves
Fonseca
Pós-Doc
2007
Biologista/Pesquisadora da
Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo
Carla Regina da
Silva Corrêa
Ronda
Mestrado
2007
Analista de Laboratório de
Pesquisa do Instituto do
Coração
Juçara Zulli
Mohovic
Doutorado
2008
Médica
Beatriz Simonsen
Stolf
Pós-Doc
2008
Professora Doutora do
Departamento de Parasitologia
do ICB-USP
Formação de recursos humanos e situação profissional atual
Pesquisador
Luisa Karla
Arruda
Nome do aluno
Grau
Ano de
conclusão
Ana Beatriz R.
Santos
Mestrado e
Doutorado
2000/2004
Ataíde Ademir
Camara
Doutorado
2003
Situação atual
Pos-Doc Lab Alergia FMRPUSP
Clinica privada, Hospital Santa
Lídia
207
Formação de recursos humanos e situação profissional atual
Pesquisador
Nome do aluno
Grau
Ano de
conclusão
Kátia Regina
Coimbra Tobias
Mestrado
2002
Docente em Porto Velho,
Rondonia
Cíntia Arens
Mestrado
2003
Doutorado FMUSP
Michelle
Christiane R.
Barbosa
Mestrado
2006
Doutorado Lab Alergia FMRPUSP
Ana Paula F.
Trombone
Mestrado
2002
Pos-Doc Depto. Imunologia
FMRP-USP
Cecília Isumi Saito
Miyahara
Mestrado
2006
Clínica privada
Alessandra Santos
Zampolo
Mestrado
2007
Sem vínculo no momento
Situação atual
Formação de recursos humanos e situação profissional atual
Luiz Carlos de
Sá-Rocha
Nome aluno
grau
Ano
conclusão
Situação atual
Sady Alexis
Chauvaty
Mestrado
2003
Realizando doutoramento em
Piracicaba / SP – ESALQ/USP
Clarissa
Niciporciukas
Mestrado
2003
Exercendo atividades em
Clínica Veterinária Particular
própria
Daniel Wagner
Hamada Cohn
Mestrado
2005
Realizando doutoramento em
São Paulo / SP FMVZ/USP
Luciana Mirotti
Mestrado
2006
Realizando doutoramento na
Inglaterra na área de
Imunologia
Adriana Correa
Mestrado
2007
Professora de Imunologia da
UNISA - Universidade Santo
Amaro
Sandra
Freiberger
Affonso
Doutorado
2007
ContratadaFMVZ-USP / Depto
de Anatomia / Técnica de nível
superior
Denise
Kinoshita
Mestrado
2008
Realizando doutoramento em
São Paulo / SP FMVZ/USP
Formação de recursos humanos e situação profissional atual
208
Pesquisador
Luiz Vicente
Rizzo
Nome do aluno
Grau
Ano de
conclusão
José Álvaro
Pereira Gomes
Mestrado
1996
Professor Colaborador,
UNIFESP
Pedro GiavinaBianchi
Doutorado
2001
Assistente Médico do HCFMUSP
Adriana Lima
Vallochi
Doutorado
2002
Pesquisadora – FIOCRUZ
Maria
Auxiliadora
Monteiro Frazão
Sibinelli
Doutorado
2002
Professora – Depto.
Oftalmologia Santa Casa de
Misericórdia de São Paulo
Situação atual
Myrna Serapião
dos Snatos
Doutorado
2003
Diretora do Banco de Olhos
do Hospital do Servidor
Público Estadual de São
Paulo
Luciana Vieira
de Moraes
Doutorado
2003
Pesquisadora – Instituto
Gulbenkian - Portugal
Marco Antônio
de Campos
Machado
Doutorado
2005
Assistente Médico no
Hospital São Paulo
Alessandra
Gonçalves
Commodaro
Doutorado
2005
Pós-doutoranda no Depto.
de Oftalmologia, UNIFESP
Rafael
Assunção
Larocca
Mestrado
2006
Gisele Vanessa
Baracho
Doutorado
2006
Pós-doutoranda no La Jolla
Immunology Institute, EUA
Lília Rios
Tsukuda
Doutorado
2007
Quintilles – Ensaios Clínicos
Internacionais
Miguel Ferreira
Mouta Jr.
Mestrado
2007
Jean Pierre
Schatzmann
Perón
Doutorado
2008
Pós-doutor no Depto. de
imunologia do ICB/USP
Formação de recursos humanos e situação profissional atual
Pesquisador
Nome do aluno
Grau
Ano de
conclusão
Luiza
Guilherme
Daniele
Diefenbach
Mestrado
2001
Situação atual
Interior de Santa Catarina
209
Flávio Ferraz de
Paes Alcântara
Doutorado
2006
Lab. Biologia Molecular do
HC-FMUSP
Juliana Mattos
de Almeida
Bessa
Mestrado
2005
Cytos – Zurick/Suissa
Kellen Cristina
Faé
Doutorado
2003
Instituto Max Planck,
Berlim, Alemanha
Sandra Emiko
Oshiro
Mestrado
2000
Analista do Lab. de
Imunologia do InCor
Formação de recursos humanos e situação profissional atual
Pesquisador
Manoel
Barral-Netto
Nome do aluno
Grau
Ano de
conclusão
Vera Sílvia de
Freitas Vinhas
Doutorado
2007
Funcionária da UFBA
Sebastião Martins
de Souza Neto
Doutorado
2007
Professor da UFBA, campus
Barreiras
Clarissa Romero
Teixeira
Doutorado
2006
Pós-Doutorando no NIH, EUA
André Luiz
Barbosa Báfica
Doutorado
2006
Professor na UFSC
Jorge Clarencio de
Souza Andrade
Doutorado
2005
Funcionário da FIOCRUZ
Theolis Costa
Barbosa
Doutorado
2002
Pós-Doutoranda
na
Tecnologista FIOCRUZ
Marcos Célio
Almeida
Doutorado
2002
Professor da UnB
Margarida Maria
de Lima Pompeu
Doutorado
2001
Professora da UFC
Aristides Cheto
Queiroz
Doutorado
1999
Professor da UFBA
Marcelo Chalhoub
Doutorado
1999
Professor da Escola Bahiana
de Medicina
Sérgio Marcos
Arruda
Doutorado
1998
Pesquisador da FIOCRUZ
Claudia Ida
Brodskyn
Doutorado
1996
Pesquisador da FIOCRUZ
Situação atual
Itália,
210
Formação de recursos humanos e situação profissional atual
Pesquisador
Nome do aluno
Grau
Ano de
conclusão
Ivan Pereira
Nascimento
Pós-Doutorado
2008
Situação atual
Em andamento/Fiocruz
Formação de recursos humanos e situação profissional atual
Pesquisador
Nome do aluno
Grau
Ano de
conclusão
Diorge Paulo de
Souza
Mestrado
2003
Funcionário da ANVISA
--
2004
Doutorado no Instituto
Ludwig de Pesquisa sobre o
Câncer - SP
Patrícia Luiza
Nunes da Costa
Mestrado
2004
Doutorado na Faculdade de
Medicina da USP
Hernandez
Moura Silva
Mestrado
2008
Doutorado na Universidade
de Canberra - Austrália
Carolina
Rezende de
Melo Silva
Mestrado
2007
Mestrado em Imunologia –
USP -SP
Gabriela
Menezes
--
2007
Funcionária da ANVISA
Simone de
Oliveira Reis
Marcelo
Brigido
Situação atual
Formação de recursos humanos e situação profissional atual
Pesquisador
Maria
Regina
Alves
Cardoso
Nome do aluno
Grau
Ano de
conclusão
Situação atual
Antônio Sérgio
Melo Barbosa
Mestrado
1999
Técnico e pesquisador em
Vigilância em Saúde da
Secretaria Municipal de
Saúde de São Paulo
Elizete
Cavalcante C.
Barros
Doutorado
2001
Docente de universidade
privada
Sandra Regina
Brasil Stolf
Pukinskas
Mestrado
2002
Pesquisadora do Instituto
Adolfo Lutz, São Paulo
Carolina Moura
de Souza
Mestrado
2002
Gestora de serviço municipal
de saúde no interior do
estado de São Paulo
2003
Pesquisadora da CETESB
(Companhia de Tecnologia e
Saneamento Básico –
Estado de São Paulo)
Rúbia Kuno
Mestrado
211
Rudge Pinto de
Figueiredo
Mestrado
2003
Técnica e pesquisadora da
Universidade Federal da
Paraíba - UFPb
Paulo Fernando
Garreta Harkot
Mestrado
2003
Docente de universidade
privada
Ellen Regina
Sola
Mestrado
2004
Gestora de serviço de saúde
privado
Laura Caruso
Ribeiro
Mestrado
2004
Chefe de serviço de
fonoaudiologia do Hospital
do Servidor Público do
Estado de São Paulo
Marcos Eduardo
Fernades
Mestrado
2005
Veterinário, iniciativa privada
Rafael de
Carvalho
Cacavallo
Mestrado
2005
Nutricionista, iniciativa
privada
Andressa
Aparecida
Simardi
Mestrado
2006
Fonoaudióloga de secretaria
municipal de saúde do
interior de São Paulo e
doutoranda
Érica Gervásio
Mestrado
2008
Fisioterapeuta de hospital
público de São Paulo
Marina Morettin
Mestrado
2008
Doutoranda
Antônio Sérgio
Melo Barbosa
Doutorado
2006
Técnico e pesquisador em
Vigilância em Saúde da
Secretaria Municipal de
Saúde de São Paulo
Silvana Maria
Bruno da Costa
Doutorado
2003
Fonoaudióloga e cirurgiã
dentista. Pesquisadora da
USP Ribeirão Preto.
2006
Docente de universidade
privada
Formação de recursos humanos e situação profissional atual
Pesquisador
Mario
Sergio
Palma
Nome do aluno
Grau
Ano de
conclusão
Domingos
Oliveira
Mestrado
1992
Docente na Univ. Fed.
Uberlândia, Uberlândia, MG
Helena Costa
Mestrado
1994
Pesquisadora – CEPLAC,
Ilhéus, BA
Marcia R.
Oliveira
Mestrado
1996
Docente Univ. Est. Londrina,
Londrina, PR
Situação atual
212
Renato Fontana
Doutorado
2001
Docente Univ. São Caetano,
São Paulo, SP
Heliana C.
Sales
Doutorado
2003
Docente Univ. São Caetano,
São Paulo, SP
Lilian M. Cesar
Doutorado
2005
Pós-Doutorado, IBRCUNESP, Rio Claro, SP
Maurício R.
Marques
Doutorado
2006
Assessor Científico da GE
Biotechnology, São Paulo,
SP
Bibiana M.
Souza
Doutorado
2006
Pós-Doutorado, IBRCUNESP, Rio Claro, SP
Lucilene D.
Santos
Doutorado
2007
Pós-Doutorado, IBRCUNESP, Rio Claro, SP
Keity S. Santos
Doutorado
2008
Pós-Doutorado, InCor-HCUSP, São Paulo, SP
Formação de recursos humanos e situação profissional atual
Pesquisador
Nome do aluno
Grau
Ano de
conclusão
Osmar
Malaspina
Daniela H.
Cavalheri
mestrado
2001
Mendelson de
Lima
doutorado
2004
Gleiciani Burger
Patrício
mestrado
2007
Situação atual
Formação de recursos humanos e situação profissional atual
Pesquisador
Nome do aluno
Pedro
Giavina
Bianchi
Lúcia Helena da
Costa Eduardo
Pinto
Grau
Mestrado
Ano de
conclusão
2006
Situação atual
Aguarda inscrição para
doutorado neste programa;
desenvolve atividades de
pesquisa
213
Rosana Câmara
Agondi Leite
Doutorado
2008
Médica pesquisadora na
DICA-HCFMUSP
Formação de recursos humanos e situação profissional atual
Pesquisador
Pedro
Michaluart
Junior
Nome do aluno
Grau
Ano de
conclusão
Situação atual
Rodney Smith
Doutorado
2006
Médico assistente do Serviço
de Cirurgia de Cabeça e
Pescoço do HCFMUSP
2006
Médica colaboradora do
Serviço de Cirurgia de
Cabeça e Pescoço do
HCFMUSP.
Maria Teresa
Assumpção
Machado Sodré
Doutorado
Formação de recursos humanos e situação profissional atual
Pesquisador
Roque
Almeida
Nome do aluno
Grau
Ano de
conclusão
Anselmo Souza
Mestrado
2008
Mestrado
Ângela Giudice
Mestrado
2005
Doutorado Serviço de
Imunologia do HUPES,
UFBA
Helio Gomes
Souza
Mestrado
2004
Professor da Fac. de Med.
Veterinária-UNIME
Jussamara Brito
Doutorado
2005
Professora da Escola Baiana
de Medicina
Leticia Santos
Rezende
Mestrado
2003
Professora da Universidade
Federal de do Recôncavo
Bahiano, BA
Lívia Maria
Nossa Moitinho
Mestrado
2004
Médica do Hospital
Universitário-UFBA
Maria Elisa
Rosas
Mestrado
2007
Mestrado
Situação atual
Formação de recursos humanos e situação profissional atual
Pesquisador
Nome do aluno
Grau
Ano de
conclusão
Sandro de
Souza
Natanja Sara
Kirschbaum
Salger
Doutorado
2005
Situação atual
Setor privado em
Biotecnologia, Israel
214
Maria Dulcetti
Vibranovski
Doutorado
2005
Pós-Doutorando da
Universidade de Chicago,
EUA
Robson
Francisco de
Souza
Doutorado
2008
Pós-Doutorando, USP
Elza Helena
Andrade
Barbosa Durhan
Doutorado
2007
Setor privado - patentes
Noboru Jô
Sakabe
Doutorado
2007
Pós-Doutorando da
Universidade de Chicago,
EUA
Pedro
Alexandre
Favoretto
Galante
Doutorado
2007
Pesquisador Sênior, Instituto
Ludwig
Daniel Vidal
Doutorado
Em
andamento
Suzana Esquina
Doutorado
Em
andamento
Jorge Stephano
de Souza
Doutorado
Em
andamento
Julio César
Nunes
Mestrado
2008
Caetano
Giminez
Carezato
Mestrado
2004
Fábio Passetti
Mestrado
2000
Gustavo Franca
Mestrado
Em
andamento
Adriana
Brunstein
PósDoutorado
2002
Silvia Kuve
PósDoutorado
2002
Doutorando, UNIFESP
Pesquisador do INCA
Professor Visitante,
UNIFESP
Formação de recursos humanos e situação profissional atual
Pesquisador
Nome do aluno
Grau
Ano de
conclusão
Situação atual
215
Verônica
Coelho
Karina Gil
Portugal
Mestrado
1998
Doutorado 2002
Universidade de Freiburg –
Alemanha. Pesquiadora
Merck Sorona, Genebra
Carlos Alberto
Mayora Aita
Mestrado
1998
Professor Adjunto da
Pontifícia Universidade
Católica do Paraná, PR
Clarissa de Brito
Granja
Doutorado
2000
Pesquisadora no Centro
Colombiano de Investigação
em Aqüicultura em Bogotá,
Colômbia
Francine
Brambate
Carvalhinhos
Lemos
Doutorado
2001
PRODOC/ CAPES, FMUSP,
SP
Claudia
Verônica Guerra
Cevallos
Doutorado
2002
Médica Pesquisadora no
Equador
Idania Glafira
Marrero Suárez
Doutorado
2002
Pós-Doutoranda, TPIMS,
EUA
Mônica
Spadafora
Ferreira
Doutorado
2003
Pesquisadora científica do
Laboratório de Imunoquímica
do Instituto Butantan, SP
Cristina de
Araújo Caldas
Doutorado
2005
Pesquisadora Colaboradora
da Unicamp, SP
Rafael Ioschpe
Mestrado
2004
Coordenador de ensaio
clínico na ICON Clinical
Research
Ernesto Luna
Vázquez
Doutorado
2005
Pós-Doutorando associado
do Departamento de
Microbiologia e Imunologia
da Universidade de Miami,
EUA
Gabriel Victora
Mestrado
2006
Doutorado, NYUSM, EUA
Adalberto
Socorro da Silva
Doutorado
2007
Pesquisador no Piauí
Georgia Porto
Mundin
Doutorado
2008
PRODOC/ CAPES, FMUSP,
SP
216
9. CRONOGRAMA DE EXECUÇÃO
OBJETIVOS
SEMESTRES
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
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4
5
6
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1
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4
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7
8
9
10
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
ALERGIA
Grupo de Estudos de Novos Alergenos Regionais (GENAR)
Caracterização clínica das alergias a mandioca
Caracterização bioquímica do extrato de mandioca
Caracterização imunológica do extrato de mandioca
Caracterização clínica das alergias ao veneno da formiga S.
saevissima
Caracterização bioquímica do veneno da formiga Solenpsis
saevissima
Caracterização imunológica do veneno de S. saevissima
Asma
Observação de Reação cruzada D. pteronyssinus e B. tropicalis
Questionário de aferição de controle de asma
Determinar a existência de padrões imunopatológicos na asma
não alérgica
Avaliar a dosagem de proteína C reativa
Alergia Respiratória
Reatividade cruzada IgE e da resposta de células T
Produção de Der p 1 e Der p 2 recombinantes GMP
Ensaio Clínico com Der p 1 e Der p 2
TRANSPLANTE E IMUNORREGULAÇÃO
Hsp60 e células dendríticas
Produção do anticorpo anti-DEC205 acoplado a diferentes
peptídeos da Hsp60.
Identificar peptídeos/fragmentos da Hsp60 capazes de induzir um
perfil de expressão gênica imunorregulador ou inflamatório in vitro
e teste da capacidade imunorreguladora desses peptídeos e do
anti-DEC205+pep Hsp60
Análise de ligantes dos peptídeos de Hsp60 por microscopia
confocal.
Ensaio pré-clínico (toxicidade)/prod.GMP/ensaio clínico fase I
Células T reguladoras
Caracterizar imunofenotipicamente, as células dendríticas geradas
a partir de células de medula óssea de camundongos BALB/c
+
+
Gerar células T reguladoras CD4 CD25 em co-cultura com
células dendríticas (DCs) e células autólogas de linfonodo
(BALB/c) na presença de células alogênicas (C57BL/6) em
apoptose com análise fenotípica e de prod. citocinas
Determinar a capacidade imunomoduladora das células
+
+
CD4 CD25 sobre a população de células de memória in vivo
Tolerância operacional no transplante humano
Analisar a resposta celular dirigida a antígenos alogênicos,
autólogos e virais, mediante a análise da expressão gênica e
protéica de um painel de fatores de transcrição e citocinase perfil
217
fenotipico
Análise da resposta humoral: repertório global de aloanticorpos,
perfil perfil global de reatividade de auto-anticorpos, (ImmunoChip)
no soro, e repertório de CDR3 presente nos receptores de células
B no sangue
Análise do perfil de peptídeos ligantes de anticorpos presentes no
soro e peptídeos miméticos de antígenos humanos
Analisar o repertório de micropartículas do soro e a expressão de
Q-SOX
Analisar o perfil de expressão protéica na urina
Anticorpo humanizado anti-CD3: aplicação clínica e avaliação
da atividade imunorreguladora
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Construção de anticorpos anti-CD3 quimeras e humanizados
Analisar a afinidade dos anticorpos ligantes da molécula CD3 in
vitro
Analisar o efeito dos anticorpos na indução de proliferação,
produção de citocinas e na expressão de fatores de transcrição
imunorreguladores, em células mononucleares do sangue
periférico, além do efeito dos anticorpos na geração de células T
com atividade supressora, in vitro
Realizar testes pré-clínicos/produção GMP/ensaio clínico fase I
IMUNODEFICIÊNCIAS PRIMÁRIAS
Estabelecer o perfil de mutações conhecidas em todos os
pacientes portadores de ICV acompanhados dentro do iii
Estabelecer o perfil de mutações em genes candidatos em todos
os pacientes portadores de ICV acompanhados dentro do iii
Determinar as características clínicas e laboratoriais dos pacientes
que respondem in vitro a reposição de leptina
Determinar se a reposição de leptina resulta também em uma
reaquisição da capacidade de produzir anticorpos nos pacientes
responsivos à reposição deste hormônio
HIV/ AIDS
Decifrando a genética e a função KIR na infecção recente pelo
HIV-1 pela bioinformática
Resposta Vif-específica mediada por células T CD8+ em
indivíduos que controlam a replicação do HIV
Resposta imune celular contra epítopos crípticos na AIDS
Vacina anti-HIV de epitopos promíscuos de classe II
Desenvolvimento de nova vacina candidata construída com o vírus
vacinal da febre amarela
Teste de vacina baseada em epitopos crípticos
Identificação de alvos
progressão para a AIDS
terapêuticos
para
intervenção
na
Resposta contra epitopos mutantes induzidos por inibidores de
protease no tratamento do HIV
Caracterização do potencial neutralizante de Ac anti-HIV obtidos
por phage display
DOENÇAS TROPICAIS
Leishmaniose
218
Testar a imunogenicidade do plasmídeo C + as proteínas acidas
ribosomais. Esquemas de prime-booster
Verificar proteção pela infecção dos cães por via intradérmica de
parasitas +saliva
Avaliar protecão de cães imunizados e mantidos na area
endêmica
Investigar os efeitos das proteínas recombinantes da saliva de Lu.
longipalpis na biogênese/função de corpúsculos lipídicos
Determinar os efeitos biologicos da saliva (recrutamento, ativação
de leucócitos e potencial pro-apoptótico)
Investigar
a
atividade
imunomodulatória
de
proteínas
recombinantes da saliva de L. longipalpis em macrófagos
peritoneais
Caracterizar
a
estrutura
molecular
dos
componentes
biologicamente relevantes por técnicas de análise da estrutura
molecular (modelagem molecular por técnicas de bioinformática)
Avaliar a resposta terapêutica de pacientes com leishmaniose
visceral a N-acetilcisteína (NAC) como adjuvante ao tratamento
padrão com antimonial pentavalente, comparado ao tratamento
somente com antimonial, através de estudo clínico randomizado e
duplo cego.
Avaliar a resposta terapêutica de cães de rua da cidade de
Aracaju com leishmaniose visceral a N-acetilcisteína (NAC) como
adjuvante ao tratamento padrão com antimonial pentavalente,
comparado ao tratamento somente com antimonial, em estudo
clínico randomizado e cego.
AUTO-IMUNIDADE
Febre Reumática
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Ensaios pré-clínicos em mini – pigs com agente vacinal em
formulações de peptídeo sintético/ proteína recombinante com
adjuvantes (Alum e AFCo1)
Produção do agente vacinal em GMP (peptídeo sintético e
proteína recombinante)
Ensaios Clínicos de Fase I – o desenho será efetuado a partir dos
resultados dos ensaios pré-clínicos (quantidade e número de dose
do agente vacinal e acompanhamento clínico/ laboratorial)
Ensaios Clínicos de Fase II – em função dos resultados obtidos na
fase I e acompanhamento mais prolongado
Identificação de cepas do S. pyogenes
Confirmar capacidade do epitopo vacinal em induzir células T
reguladoras, com potencial terapêutico em pacientes com doença
reumática cardíaca
Ensaio Clínico Fase III – em função dos resultados Fase II
Doença de Crohn
Estudo da produção de citocinas e células T reguladoras após
administração oral de antígenos
Componente da dieta a ser substituído; peptídeos de hsp60
reguladores a serem usados
Complemento dietético composto de aminoácidos balanceados
para uso em camundongo
Estudo pré-clínico em camundongos IL-10-/- que desenvolvem
219
colite espontânea
Complemento dietético composto de aminoácidos balanceados
para uso em humanos
Estudo clínico em pacientes com Doença de Crohn (Fases I e II)
CÂNCER
Preparação do material do estudo com impressão de manuais
Submissão para comitês de ética
Produção da vacina
Inclusão de pacientes
Acompanhamento dos pacientes
Testes imunológicos
Avaliação dos resultados
Publicação
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
220
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PARTE C – PROJETOS ADICIONAIS
0
PARTE C - PROJETOS ADICIONAIS
SUMÁRIO
1. Projeto H: Doença de Chagas ......................................................................................
01
1.1. Subprojeto 1: Análise proteômica do miocárdio de doadores de órgãos e de
pacientes com cardiomiopatia chagásica crônica, idiopática e isquêmica ...............
03
1.2. Subprojeto 2: Migração de células T de memória e células Treg periféricas
para o miocárdio de portadores de Cardiomiopatia Chagásica Crônica: expressão
de quimiocinas e seus receptores em células T periféricas e polimorfismo
genético ....................................................................................................................
04
1.3. Subprojeto 3: Identificação e caracterização de genes de susceptibilidade
associados a evolução para a cardiopatia chagásica crônica utilizando tecnologia
de pesquisa de polimorfismos de alta densidade .....................................................
06
1.4. Equipe ...............................................................................................................
06
2. Projeto I: Células tronco mesenquimais ........................................................................
07
2.1. Equipe ...............................................................................................................
12
3. Projeto J: Dengue ..........................................................................................................
12
3.1. Equipe ...............................................................................................................
14
4. Metodologias .................................................................................................................
14
5. Desenvolvimento previsto em cada área temática/subprojeto ......................................
14
6. Literatura citada .............................................................................................................
14
1
PARTE C - PROJETOS ADICIONAIS
1. PROJETO H: DOENÇA DE CHAGAS
A patogênese da cardiopatia da doença de Chagas crônica ainda é assunto de intenso
debate. Embora a necessidade da persistência do T. cruzi seja inquestionável, o fato que
apenas 30% dos infectados evoluem para a cardiopatia chagásica crônica – e desses somente
um terço apresenta as formas graves, com disfunção ventricular acentuada ou arritmias graves
– indica a existência de outros fatores patogenéticos. Existem pelo menos três principais
mecanismos patológicos que poderiam explicar o desenvolvimento da cardiomiopatia
chagásica crônica: disautonomia, distúrbios da microcirculação e danos teciduais causados por
processos inflamatórios e imunológicos. A cardiomiopatia chagásica é essencialmente uma
miocardite. O processo inflamatório, apesar de mais intenso na fase aguda, é clinicamente
silencioso - porém incessante – durante anos em pacientes na fase crônica da doença, ou
mesmo em pacientes com a forma indeterminada da doença de Chagas. O infiltrado
inflamatório de células mononucleares, rico em células T, desempenha um papel fundamental
na patogenia da doença. Isto é baseado em vários indícios: i) o pior prognóstico da doença de
Chagas, em comparação com cardiomiopatias de etiologia não-inflamatória, ii) a relação entre
freqüência de miocardite e severidade da cardiomiopatia nos pacientes, e iii) a correlação entre
a dilatação do ventrículo esquerdo e a intensidade da miocardite em hamsters sírios
cronicamente infectados por T. cruzi (Marin-Neto et al., 2007). A escassez de parasitas T. cruzi
no tecido cardíaco intensamente inflamado de pacientes com cardiomiopatia chagásica crônica
levanta dúvidas sobre se a inflamação do miocárdio é desencadeada por antígenos de T. cruzi.
Segundo a hipótese auto-imune da patogênese da doença de Chagas, células T infiltrantes do
miocárdio poderiam reconhecer proteínas do coração como resultado de uma infecção crônica
induzida pelo T. cruzi. Ao longo dos anos, um número significativo de estudos descreveu o
reconhecimento auto-imune de neuroantigenos, receptores cardiovasculares, proteínas
altamente conservadas e miosina cardíaca por anticorpos ou células T de pacientes com
doença de Chagas ou de animais experimentalmente infectados (Cunha-Neto et al., 2006).
Linfócitos T CD8+ capazes de reconhecer antígenos do T. cruzi (Fonseca et al., 2005) e
línfócitos T CD4+ capazes de reconhecer cruzadamente auto-antígenos (miosina cardíaca) e
antígenos de T. cruzi, foram encontrados no miocárdio de pacientes com cardiomiopatia
chagásica, indicando que tanto antígenos de T. cruzi como do miocárdio podem desempenhar
um papel na manutenção da lesão miocárdica induzida pela inflamação (Cunha-Neto et al.,
1996).
Dados de modelos animais indicam que citocinas inflamatórias desempenham um
papel central na infecção aguda pelo T. cruzi. Pouco depois do início da infecção aguda,
moléculas do T. cruzi ligam-se a receptores em macrófagos e células dendríticas (Bafica et al,
2006) desencadeando intensa resposta inflamatória inata,
através dos receptores de
patógenos (“Toll-like receptors”, TLR) (Bafica et al, 2006). Em consequência, são gerados
linfócitos T específicos para T. cruzi e produtores da poderosa citocina inflamatória interferon-γ
2
(IFN-γ) (Cunha-Neto et al. 2009). Tais linfócitos migram para tecidos onde há inflamação
induzida por T. cruzi, em resposta a moléculas quimioatraentes ou quimiocinas, participando da
resposta imune contra o parasita (Teixeira et al., 2002). Esta resposta de células T
inflamatórias e anticorpos conduz ao controle - mas não a completa eliminação - do parasitismo
de tecidos e do sangue. Alterações imunológicas encontradas na doença de Chagas latente
são consistentes com o baixo grau de infecção persistente por T. cruzi. Estes incluem títulos
moderados a elevados de anticorpos IgG anti-T. cruzi, aumento dos níveis plasmáticos de TNFα e IFN-γ produzidos por células T CD4+ e CD8+ específicas para T. cruzi, e suprime a
produção da citocina anti-inflamatória IL-4. O subgrupo de pacientes que desenvolvem
cardiomiopatia chagásica apresenta uma série de alterações imunológicas consistente com
uma produção exacerbada de IFN-γ e TNF-α. Diferentes estudos têm demonstrado que esses
pacientes exibem um aumento do número de linfócitos T produtores de IFN-γ no sangue
periférico (Bilate et al. 2008), com número reduzido de linfócitos T reguladores em relação a
pacientes na forma indeterminada da doença de Chagas (Araujo et al. 2007). Entre os
pacientes que apresentavam disfunção ventricular, os níveis plasmáticos de TNF-Į e CCL2 são
mais elevados do que os níveis apresentados por pacientes na fase indeterminada ou
pacientes que apresentam alterações no ECG, mas sem disfunção ventricular (revisado em
Bilate et al., 2008). A resposta Th1 exacerbada observada no sangue periférico é refletida na
constituição do infiltrado inflamatório encontrado no miocárdio de pacientes com cardiomiopatia
chagásica (Abel et al. 2001; Cunha-Neto al et, 2005). As células mononucleares do infiltrado
inflamatório contêm macrófagos; linfócitos T produtores de IFN-γ; células T CD8+ citotóxicas; e
outras células T CD4+. Diversas quimiocinas expressas no miocárdio de pacientes chagásicos,
atraem monócitos e linfócitos T produtores de IFN-γ para o coração. A produção local de
citocinas como IFN-γ, TNF-Į e outras indicam ativação de linfócitos T e macrófagos. A
sinalização por TGF-ȕ pode estar relacionada com a acentuada fibrose encontrada em lesões
cardíacas (Araújo-Jorge et al. 2008). A expressão aumentada de moléculas de adesão e HLA
de classes I e II no miocárdio são secundárias à exposição crônica de citocinas, e facilitam o
fluxo de células inflamatórias e apresentação de antígenos. A sinalização por IFN-γ também foi
observada no miocárdio de pacientes com cardiomiopatia chagásica. Experimentos in vitro
mostraram que o IFN-γ pode provocar profundas mudanças no programa de expressão gênica
de cardiomiócitos, incluindo a indução da expressão gênica do programa hipertrófico e
alterações no metabolismo energético (Cunha-Neto et al., 2005). Sendo assim, estas
observações sugerem que células T produtoras de IFN-γ migram ao coração, onde a
inflamação crônica mediada por IFN-γ poderia desempenhar um papel patogenético
significativo, ambos sustentando a inflamação e agindo diretamente sobre cardiomiócitos.
3
1.1. SUBPROJETO 1: ANÁLISE PROTEÔMICA DO MIOCÁRDIO DE DOADORES DE ÓRGÃOS E DE
PACIENTES COM CARDIOMIOPATIA CHAGÁSICA CRÔNICA, IDIOPÁTICA E ISQUÊMICA
Justificativa
Resultados preliminares de expressão gênica e análise proteômica em miocárdio de
pacientes CCC obtidos por nosso grupo sugerem uma significante sinalização de IFN-gama,
aumento da expressão de genes envolvidos com hipertrofia, e alterações do metabolismo
energético, estes consistentes com dados da literatura. Através da análise proteômica,
utilizando
eletroforese
bidimensional
com
marcação
fluorescente
(DIGE),
resultados
preliminares mostram expressão reduzida das proteínas creatina quinase, de proteínas
envolvidas na beta-oxidação e de componentes do complexo da ATP sintase em miocárdio de
pacientes CCC em comparação ao miocárdio de indivíduos sem cardiomiopatias (manuscrito
em preparação). Dados da literatura têm mostrado que o IFN-gama, principal citocina
inflamatória produzida no miocárdio de pacientes CCC, deprime a produção de ATP por
mitocôndrias de cardiomiócitos em cultura, e seria capaz de inibir a expressão da proteína e do
gene que codifica a creatina quinase.
Assim, com o objetivo de aprofundar as analises de expressão protéica no miocárdio
de pacientes com CCC, CDI e CI e de indivíduos sem cardiomiopatias pretendemos realizar a
separação protéica por eletroforese bidimensional com marcação fluorescente (DIGE) e
detecção protéica por espectrometria de massa. Estas análises nos permitirão detectar um
número muito maior de proteínas, inclusive as que apresentam menor expressão. Acreditamos
que desta forma poderíamos entender melhor os mecanismos patogênicos envolvidos na
insuficiência cardíaca e também estudar a influência do infiltrado inflamatório em danos
cardíacos observados em pacientes com CCC. Estudos também mostram que pacientes com
CCC do sexo masculino apresentam uma menor sobrevida quando comparados com pacientes
com CCC, de mesma classe funcional de insuficiência cardíaca, porém do sexo feminino. Além
disso, pacientes infectados do sexo masculino têm uma maior taxa de progressão para formas
mais graves da CCC. Assim, pretendemos também realizar uma análise proteômica diferencial
entre estes pacientes, utilizando a tecnologia DIGE. Esta análise permitirá avaliar os
mecanismos associados à evolução diferencial nos dois sexos.
Objetivo
Visto que pacientes com Cardiomiopatia Chagásica Crônica (CCC) apresentam um pior
prognóstico em comparação a pacientes com cardiomiopatias de etiologia não inflamatória,
como cardiomiopatia dilatada idiopática (CDI) e cardiomiopatia isquêmica (CI), o objetivo geral
deste trabalho é avaliar a expressão protéica diferencial no miocárdio destes pacientes e de
indivíduos sem cardiomiopatia. Assim, pretendemos contribuir para o melhor entendimento dos
mecanismos envolvidos na patogênese da CCC. Para tal, estabelecemos os seguintes
objetivos específicos:
4
Objetivos específicos
Estudar o perfil de expressão protéica no miocárdio de indivíduos sem cardiomiopatias,
•
criando desta forma um conhecimento básico das proteínas presentes em um coração
saudável.
Analisar a expressão protéica diferencial entre o miocárdio de pacientes com CCC, CDI
•
e CI, e de indivíduos sem cardiomiopatias através da tecnologia de proteoma.
Comparar a expressão protéica no miocárdio de pacientes com CCC do sexo
•
masculino e do sexo feminino, através da análise proteômica, com a finalidade de
compreender melhor o porquê do pior prognóstico que pacientes do sexo masculino
apresentam em relação às pacientes do sexo feminino.
Através dos objetivos anteriores pretendemos traçar mecanismos que possam estar
•
envolvidos no processo patológico da CCC e das outras cardiomiopatias de etiologia
não inflamatória, sendo que as proteínas chaves destes mecanismos serão validadas
com anticorpos monoclonais específicos.
1.2. SUBPROJETO 2: MIGRAÇÃO DE CÉLULAS T DE MEMÓRIA E CÉLULAS TREG PERIFÉRICAS PARA O
MIOCÁRDIO DE PORTADORES DE CARDIOMIOPATIA CHAGÁSICA CRÔNICA: EXPRESSÃO DE QUIMIOCINAS
E SEUS RECEPTORES EM CÉLULAS T PERIFÉRICAS E POLIMORFISMO GENÉTICO
Justificativa
Recentemente, observamos expressão significativamente aumentada de IL-18, das
quimiocinas
CCL3/MIP-1Į,
CCL4/MIP-1ȕ,
CCL5/RANTES,
CXCL9/Mig,
CXCL10/IP-10,
CCL17/TARC, CCL19/ELC ligantes dos receptores CCR5, CXCR3, CCR4 e CCR7 e, assim
+
+
como células mononucleares CCR5 e CXCR3 , em amostras de miocárdio de pacientes com
cardiopatia chagásica crônica terminal, consistente com a presença de células do tipo Th1 de
memória, provavelmente provenientes do sangue periférico. Não detectamos, por outro lado,
citocinas do tipo Th2, TGF-ȕ no miocárdio, embora tenhamos detectado células mononucleares
+
CCR4 e expressão de CCL17/TARC, típicas de células Th2 mas que podem ser coexpressas
em células do tipo Th1. Estes resultados sugerem a incapacidade de mecanismos reguladores
da intensa resposta Th1 vigente no miocárdio CCC. A presença de células T expressando
receptores CCR5 e CXCR3, assim como as células T de memória e células T reguladoras já foi
documentada no sangue periférico de pacientes com IND e CCC. Em conjunto com os nossos
resultados, os dados sugerem que quimiocinas e seus receptores podem estar envolvidas na
migração diferencial de linfócitos T nos casos das formas IND e CCC; e que haja uma migração
diferencial de linfócitos T circulantes para o infiltrado inflamatório cardíaco na CCC, com
migração efetiva de células T do tipo Th1 de memória, e migração pouco significativa de
células T reguladoras Foxp3+, Tr1, e Th2. É possível que a intensidade dos fenômenos de
migração celular estejam relacionados a níveis diferenciais de expressão das quimiocinas
ligantes de CCR5 e CXCR3, secundários a polimorfismos genéticos funcionais. Nossa hipótese
é que pacientes em estágios mais avançados da doença apresentem maior expressão dos
5
receptores de quimiocinas CCR5 e CXCR3 em células na periferia, que migrariam mais
facilmente para o miocárdio em resposta as quimiocinas lá produzidas.
Objetivo
Investigar a expressão de receptores de quimiocinas e quimiocinas, que apresentam
importante expressão no miocárdio de pacientes com CCC, em monunucleares do sangue
periférico de pacientes chagásicos com diferentes formas clínicas cardíacas e pacientes com a
+
+
forma indeterminada da doença, identificando as subpopulações de células T CD4 e TCD8
efetoras e de memória, e células T regulatórias que expressem esses receptores e quimiocinas
e investigar possíveis diferenças imunogenéticas que possam participar da susceptibilidade
diferencial ao desenvolvimento da forma cardíaca da doença de Chagas.
Objetivos Específicos
•
Caracterizar imunofenotipicamente, por citometria de fluxo, as subpopulações de
+
+
-
+
-
linfócitos T CD4 e T CD8 de memória central (CD45RA CCR7 CD27 ) e efetora
-
-
+
+
+
+
(CD45RA CCR7 CD27 ) e células T regulatórias (CD4 CD25 Foxp3 ), ex vivo e in vitro
estimuladas com antígenos de T. cruzi co-expressando os receptores CCR5, CXCR3 e
CCR4 no sangue periférico de pacientes chagásicos com diferentes formas clínicas
cardíacas e pacientes com a forma indeterminada da doença.
•
+
+
Caracterizar funcionalmente as subpopulações de células TCD4 e TCD8 de memória
central e efetora, e células regulatórias, além de monócitos no sangue periférico de
pacientes chagásicos com diferentes formas clínicas cardíacas e pacientes com a
forma indeterminada da doença, quanto à produção intracitoplasmática de CCL4/MIP1ȕ, CCL5/RANTES, CCL17/TARC, CXCL9/Mig, CXCL10/IP-10 e IL-18.
•
Avaliar a expressão de IL-18, CCL4/MIP-1ȕ, CCL5/RANTES, CCR5, CCL17/TARC,
CCR4, CXCL9/Mig, CXCL10/IP-10 e CXCR3 em PBMC através de qRT-PCR.
•
Investigar as implicações do polimorfismo genético de IL-18, CCL4/MIP-1ȕ,
CCL5/RANTES,
CCR5,
CXCR3,
CXCL9/Mig,
CXCL10/IP-10,
CCL17/TARC
e
CCL19/ELC, nas populações de pacientes IND, CCC e CCC grave, observando se
polimorfismos genéticos estão associados as diversas formas de CCC, e se tais
polimorfismos estão associados a variações nos níveis de produção/expressão gênica.
1.3. SUBPROJETO 3:
IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE GENES DE SUSCEPTIBILIDADE
ASSOCIADOS A EVOLUÇÃO PARA A CARDIOPATIA CHAGASICA CRÔNICA UTILIZANDO TECNOLOGIA DE
PESQUISA DE POLIMORFISMOS DE ALTA DENSIDADE.
Justificativa
Os mecanismos relacionados ao fato de que apenas um terço dos pacientes infectados
desenvolve a cardiomiopatia chagásica são pouco compreendidos. A agregação familiar de
casos sugere a existência de um componente genético. Polimorfismos de nucleotídeo único
6
(Single nucleotide polymorphisms - SNPs) de genes da resposta imune/inflamatória, tais como
a molécula MAL/TIRAP, envolvido na transdução de sinal inflamatório dos receptores de
moléculas do T. cruzi, do tipo TLR; as citocinas pró-inflamatórias IL-1ȕ, TNF-α, LTĮ e IL-12ȕ; a
quimiocina CCL2 e o receptor de quimiocinas CCR5, têm sido associados ao desenvolvimento
da cardiopatia chagásica. Dentre os pacientes com cardiomiopatia chagásica e disfunção
ventricular, os portadores de polimorfismo genético associado à alta produção de TNFĮ
apresentaram sobrevida significativamente reduzida (Cunha Neto et al. 2009). Dado o
importante papel desempenhado por essas moléculas inflamatórias nas várias fases da
patogênese, é provável que variantes genéticas possam influenciar o curso da doença de
Chagas.
Objetivo
O projeto tem como objetivo principal realizar um estudo genético com alto poder de
associação em grande número de pacientes com doença de Chagas clinicamente
caracterizados, com as formas polares assintomática e CCC com disfunção ventricular,
utilizando tecnologia de pesquisa de polimorfismos de alta densidade, e assim identificar
fatores genéticos que predispõem indivíduos a doença de Chagas crônica.
Objetivos específicos
•
Efetuar análises de polimorfismos genéticos de larga escala na população estudada,
para obter uma lista primária de genes associados com gravidade da doença (CCC).
•
Estender as análises de genes polimórficos, já efetuados no Laboratório de Imunologia
do InCor, para aperfeiçoamento da amostragem.
•
Caracterizar os genes associados à doença de Chagas, para a obtenção de uma lista
definitiva de polimorfismos que são relevantes para o controle da susceptibilidade
humana a CCC.
•
Efetuar análise “in silico” dos polimorfismos associados para avaliar se podem
modificar o nível de transcrição gênica.
•
Realizar testes funcionais nos polimorfismos associados a CCC por avaliação da
expressão de mRNA em PBMC de pacientes chagásicos.
1.4. EQUIPE
Pesquisadores:
Edecio Cunha-Neto - Incor-FMUSP (Pesquisador responsável)
Jorge Kalil - Incor-FMUSP
Priscila Camillo Teixeira - Incor-FMUSP
Pós-doutorandos
Luciana Nogueira - Incor-FMUSP
Amanda Frade - Incor-FMUSP
7
Estudantes
Aline Siqueira (Mestrado) - Incor-FMUSP
Mônica Santos (Iniciação Científica) - Incor-FMUSP
Técnico Superior
Andréia Kuramoto - Incor-FMUSP
Eliane Conti Mairena - Incor-FMUSP
Colaboradores Nacionais
Noedir Stolf - Incor-FMUSP
Alfredo Fiorelli - Incor-FMUSP
Ronaldo Honorato - Incor-FMUSP
Edimar Bocchi - Incor-FMUSP
Charles Mady - Incor-FMUSP
Bárbara Ianni - Incor-FMUSP
Colaboradores Internacionais
Christophe Chevillard - Universite de Marseille - INSERM (França)
Alain Dessein - Universite de Marseille - INSERM (França)
2. PROJETO I: CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS
As células tronco são células indiferenciadas com capacidade de se renovar e de
originar diversos tipos celulares mais especializados (LEMOLI et al, 2005). Em vertebrados, as
células tronco embrionárias – derivadas da massa celular interna do blastocisto, com 3 a 5 dias
de diferenciação embrionária - são pluripotentes, sendo capazes de gerar qualquer tipo tecidual
dos três folhetos embrionários (mesoderma, endoderma e ectoderma), além de se diferenciar
em células germinativas. As células tronco adultas têm um espectro de diferenciação mais
limitado do que as embrionárias. Elas são multipotentes - capazes de gerar diferentes tecidos estão presentes em diversos nichos do organismo adulto e são capazes de manter uma
constante plasticidade e regeneração tecidual (NARDI & MEIRELLES 2006; KRAMPERA et al,
2006).
As células tronco mesenquimais (MSC, do inglês, mesenchymal stem cells) são um tipo
de célula tronco adulta encontradas em diversos tecidos do corpo, como medula óssea, rim,
fígado, tecido adiposo e outros (NARDI & MEIRELLES 2006). Outras terminologias utilizadas
para as MSC são baseadas nas suas características genotípicas, fenotípicas, imunofenotípicas,
capacidade de aderência e de diferenciação células progenitoras: células tronco estromais e
células tronco maduras (BAKSH, et al, 2004). Alguns pesquisadores defendem a terminologia
células tronco perivasculares e não mesenquimais, por sua capacidade de se diferenciar não
só em células de origem mesenquimal, mas também ectodermal e endodermal, além de sugerir
que sua origem relaciona-se com as células perivasculares (MEIRELLES & NARDI, 2006).
Acredita-se que as MSC atuem como um reservatório de células indiferenciadas que podem
suprir a necessidade de regeneração celular de tecidos do seu microambiente, adquirindo
assim, características fenotípicas do local.
8
As MSC ainda são pouco caracterizadas em relação às suas propriedades físicas,
fenotípicas e funcionais, e as moléculas de superfície descritas para MSC não são específicas.
Assim, a sua definição, é feita pela combinação de critérios: expressão de várias moléculas de
superfície, a ausência de outras moléculas, a sua capacidade de aderência, a sua capacidade
prolongada de proliferação e o seu potencial de diferenciação, in vitro, em pelo menos
adipócitos, condrócitos e osteócitos (NARDI & MEIRELLES 2006; KOLF et al, 2007). As
moléculas expressas na superfície das MSC dos diferentes tecidos são: moléculas de adesão
vascular: CD105 (SH2, endoglina – células mesenquimais humanas, células de medula), CD73
(5´ecto-nucleotidase ligada à membrana – células B e T), CD106 (VCAM-1 - células
endoteliais) e moléculas de adesão intercelular como CD44 (Pgp-1, Hermes – leucócitos e
hemácias), CD90 (Thy-1 – neurônios, timócitos), CD29 (beta1 integrina – leucócitos) e STRO-1.
Por outro lado, as MSC não expressam marcadores de superfície celular de células tronco
hematopoiéticas (CD34, CD54) nem marcadores de monócitos (CD14) e linfócitos (CD3, CD45)
(NARDI & MEIRELLES 2006; KRAMPERA et al, 2006; KOLF et al, 2007).
A expressão de outras moléculas também foi descrita em MSC derivadas de medula
óssea: como, quimiocinas (CCR1, CCR7, CCR9, CXCR4, CXCR5, CXCR9) (revisado em
DOCHEVA et al, 2007), citocinas (IL-6, IL-7,IL -8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, M-CSF, do inglês,
Colony Stimulating Factor-1 in Macrophages), ligante de Flt-3, SCF (do inglês, Stem Cell
Factor), (MAJUNDAR et al, 1998), receptores de citocinas (IL-1, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, LIF, do
inglês, leukemia inhibitory factor), SCF, G-CSF (do inglês, Colony Stimulating Factor-1 in
Granulocytes), IFN (do inglês, Interferon), TNFI, TNFII, TGFI, TGFII, bFGF (do inglês,
Fibroblast Growth Factor), PDGF (do inglês, Platelet-derived growth factor), EGF (do inglês,
Epidermal Growth Factor) (revisado em MINGUELL et al, 2001). Algumas moléculas têm a sua
expressão induzida (GM-CSF) ou aumentada (G-CSF, M-CSF, LIF, IL-6, IL-11) na presença de
citocinas pró-inflamatórias, como IL-1Į (HAYNESWORTH et al, 1996).
Por sua plasticidade e seu potencial de diferenciação em diferentes tecidos, assim
como por suas propriedades imunorreguladoras, as MSC têm sido utilizadas em terapias em
diversos contextos de doenças cardíacas, doenças autoimunes, em transplantes, leucemias e
diferentes tipos de câncer, doenças neurológicas, entre outras (revisado em STOLTZ et al,
2006).
A capacidade imunossupressora das MSC foi descrita em estudos pré-clínicos em
humanos e em modelos animais, e em estudos clínicos relacionados a doenças autoimunes e
rejeições no contexto de transplantes. As MSC podem inibir uma resposta imune efetora, tanto
mediada por fatores solúveis como pelo contato célula-célula. Em modelos animais, há relatos
de uso de MSC juntamente com células beta das ilhotas pancreáticas transplantadas em
camundongos (URBÁNA et al, 2007), com transplante de pele em camundongos, melhorando o
GVHD (do inglês, Graft versus Host Disease) e a vascularização do enxerto (AKSU et al, 2008;
TIAN et al, 2008). Em humanos, dentre os diversos estudos em que se utilizaram as MSC em
ensaios clínicos, foi observada a eficácia do tratamento em: transplante de medula para tratar
leucemias, pacientes com osteogenesis imperfecta, anemia aplástica grave, doenças
9
hematológicas malignas e GVHD grave avançada (revisado em Le BLANC et al, 2007), assim
como em pacientes com diabetes mellitus (VOLTARELLI et al, 2006).
Vários mecanismos têm sido implicados na atividade supressora das MSC. Alguns
pesquisadores discutem que a sua função imunorreguladora está relacionada com sua a
capacidade de inibir a proliferação de células T CD4 e CD8 e NK, mas não de células B
(KRAMPERA et al. 2006). Outros relatam também efeito sobre as células B, porém,
dependente da alta proporção de MSC (COMOLI et al., 2007). Diversos autores relatam que a
inibição da proliferação dos linfócitos, mediada pelas MSC, não está relacionada com a falta de
ativação dos mesmos ou com a indução de apoptose (KRAMPERA et al, 2006; AGGARWALL
& PITTENGER, 2005). Outros relataram efeito regulador decorrente da ação do IFN-γ,
produzido pelas células T e NK, nas MSC (KRAMPERA et al., 2006). O IFN-γ regula
positivamente a expressão da enzima indoleamina 2-3 dioxigenase (IDO) que é produzida
pelas MSC, e a IDO, por sua vez, catalisa a conversão do triptofano em kinurenina, inibindo a
proliferação de células T, uma vez que esse animoácido tem um importante papel nesta
proliferação de linfócitos T (KLYUSHNENKOVA et al., 2005).. Em contrate, outros
pesquisadores, apesar de terem encontrado um aumento de IFN-γ, in vitro, quando houve
supressão exercida pelas MSC, observam supressão não relacionada com a produção de IDO,
mas sim com outras moléculas solúveis como TGF-ȕ (do inglês, Transforming Growth Factor) e
HGF (do inglês, Hepatocyte Growth Factor), importantes na supressão da resposta imunológica
mediada por células T (DI NICOLA et al (2002). Há ainda relatos sobre a capacidade da
prostaglandina PGE2 (KRAMPERA, 2006), produzida pelas MSC, de inibir a proliferação de
células T alogênicas (AGGARWALL & PITTENGER, 2005), induzir apoptose e produção de
citocinas do tipo Th2 (HARRIS et al (2002). Outros pesquisadores relatam a inibição da
produção de citocinas pró-inflamatórias (Th1) como TNF-Į (tumor necrosis factor- Į), IL-1 Į e
IL-1ȕ, e indução da produção de citocinas reguladoras (Th2), como IL-3, IL-5, IL-10, e IL-13
(BATTEN et al , 2006, e AGGARWAL e PITTENGER, 2005).
Outras moléculas e fatores descritos como relevantes na atividade imunorreguladora
das MSC são: (i) PD-1 (do inglês, ligand programmed death receptor-1) uma molécula
homóloga ao B7 que, na interação com seus ligantes PD-L1 (pouco expressa constitutivamente
na membrana das MSC) e PD-L2, inbe a proliferação de células T e da secreção de citocinas
como TGF-ȕ e IL-10, em modelos murinos (AUGELLO et al, 2005); (ii) indução (BATTEN et al,
2006; PREVOSTO et al, 2007; SELMANI et al, 2007), recrutamento (BATTEN et al, 2006) e
+
+
+
manutenção (DI IANNI et al, 2007) de células T reguladoras (Treg), CD4 CD25 Foxp3 , células
Tr1 (produtoras de IL-10); . (iii) HLA-G, seja de superfície (HLA-G1) (de baixa expressão nas
MSC) ou secretada pelas MSC (HLA-G5) (NASEF-b et al, 2007), que podem desempenhar
papel imunorregulador pela sua interação com receptores inibitórios presentes em células NK,
T e APC (revisado em CAROSELLA et al, 2008); (iv) óxido nítrico (NO), produzido pelas MSC
de camundongos, sendo capaz de suprimir as células T pela inibição da fosforilação de STAT5
(fator de transcrição ativado por IL-2, IL-15 e induz Foxp3 em células T efetoras) (SATO et al ,
2006).
10
A grande variedade de vias relacionadas com a atividade imunorreguladora das MSC
indica a enorme plasticidade na sua atividade reguladora. No entanto, ainda há diversos
elementos não esclarecidos que merecem ser estudados em maior profundidade. Também não
se sabe se a grande variação de mecanismos descritos para a atividade supressora das MSC
pode ser decorrente de heterogeneidade de populações celulares mesenquimais, se há
variação dependente de interação com antígenos de diferentes naturezas, como por exemplo,
aloantígenos, autoantígenos ou mesmos antígenos derivados de microorganismos. Ou ainda,
que fatores ou contextos induzem a ativação de diferentes mecanismos supressores pelas
MSC.
Nesse sentido, o microambiente também pode ter um papel importante. O
microambiente adiposo com seus diferentes fatores com atividade pró-inflamatória parece
favorecer a quebra da homeostase e induzir a morte de células T reguladoras ali residentes,
por apoptose. Foi descrito, recentemente, que a inflamação hepática induzida em
camundongos alimentados com uma dieta rica em gordura estava associada à apoptose de
células T reguladoras, com diminuição da expressão do gene protetor contra a apoptose, Bcl-2
(Ma et al., 2007). Alguns fatores produzidos pelos adipócitos, como a Leptina, podem favorecer
o microambiente inflamatório, induzindo células Th1 e inibindo a proliferação de células T
reguladoras (revisado por Matarese et al., 2007). Não obstante, pouco se sabe sobre o perfil
imunológico e funcional das T reg presentes no tecido adiposo e sobre a sua interação com as
MSC do mesmo microambiente, e mesmo sobre os diferentes tipos de células da resposta
imune neste microambiente.
Levantamos
como
hipótese
que
determinados
autoantígenos
presentes
nos
microambientes das MSC também podem ter efeito sobre a sua atividade imunorreguladora. As
proteínas de choque térmico (Hsp, do inglês, Heat shock proteins) por suas importantes
propriedades na manutenção da homeostase, parecem-nos interessantes moléculas a serem
analisadas na interação com as MSC. As Hsp são proteínas bem conservadas
filogeneticamente, expressas em todos os tipos celulares e são capazes de induzir respostas
imunes tanto pró-inflamatórias como imunorreguladoras (revisado por Pockley et al., 2008),
inclusive sendo capazes de induzir atividade imunorreguladora na interação direta com
linfócitos T (Selmani Z, 2008 ). Em nosso grupo, temos investigado a resposta imune à Hsp60
no contexto do transplante (Granja et al, 2004); (Caldas et al, 2004) e em condições fisiológicas
em humanos, e em modelos experimentais murinos (Luna et al, 2007), visando identificar
regiões da Hsp60 e condições em que a Hsp60 (e seus peptídeos) seja capaz de induzir
imunorregulação, para futura utilização na clínica. Identificamos alguns peptídeos da Hsp60,
potencialmente imunorreguladores, com indução de alta frequência de células produtoras de
IL-10 e FOXP3, tanto em células de indivíduos transplantados como em indivíduos saudáveis,
também em camundongos (manuscritos aguardando solicitação de patente para publicação).
No presente projeto, pretendemos analisar o efeito peptídeos da Hsp60 selecionados sobre as
MSC em relação à sua atividade imunorreguladora.
11
Vários dos mecanismos descritos para a atividade imunorreguladora das MSC são
mecanismos descritos nas diferentes vias de manutenção de tolerância periférica. Por exemplo,
o TGF-ȕ tem efeitos imunorreguladores por células T reguladoras (Treg) e na interação das
células T com as células dendríticas (DC) tolerogênicas. É relatado que a interação DC
tolerogênicas/linfócitos T pode promover a diferenciação de T efetoras em células Treg, além
+
de induzir e estabilizar a expressão de FOXP3 , um fator de transcrição importante na atividade
imunorreguladora de células T reg (revisado em TANG et al, 2008). A IDO também tem papel
relevante na manutenção da tolerância materno-fetal (Munn, D.H. et al., 1998), além de ser
produzida por DCs tolerogênicas e ter um papel no estado de supressão induzida por tumores
(Uyttenhove, C. et al., 2003). A enorme sobreposição dos mecanismos imuorreguladores das
MSC e de outras células do sistema imune com atividade reguladora sugere que as MSC
também tenham um papel fisiológico na manutenção da tolerância periférica e que elas tenham
interações diferenciais com as várias células do sistema imune.
Assim, o desfecho de uma resposta imune seja na indução de uma resposta efetora
pró-inflamatória, seja na sua regulação negativa envolve um balanço qualitativo e quantitativo
de tipos celulares e fatores solúveis presentes dentro de um determinado microambiente. De
forma semelhante, a atividade supressora exercida pelas MSC parece envolver uma variedade
de mecanismos que podem depender tanto da heterogeneidade das populações de MSC –
ainda pouco conhecidas - como da natureza do estímulo antigênico, do microambiente e de
fatores solúveis nele presentes. Uma análise mais global da expressão de moléculas
envolvidas tanto em imunorregulação, como na indução de uma resposta inflamatória, poderá
nos fornecer informações importantes sobre os múltiplos fatores envolvidos na interação de
células do sistema imune com as MSC, durante sua atividade supressora. Ademais, explorar o
efeito da interação entre as MSC derivadas de tecido adiposo com as células T CD4+/CD25+
residentes no mesmo microambiente, poderá contribuir para a melhor compreensão sobre
mecanismos envolvidos na comunicação entre esses dois tipos celulares e em potenciais
efeitos sinérgicos imunorreguladores.
Objetivos
•
Determinar a capacidade supressora das células mesenquimais humanas (MSC), in
vitro, e a sua relação com a expressão gênica de um painel de moléculas da resposta
imune, e outras relacionadas à apoptose e ativação celular, nos linfócitos T e nas MSC.
•
Avaliar o efeito da interação dos peptídeos da proteína de choque térmico 60 com as
MSC na sua atividade supressora.
•
Avaliar o perfil imunofenotípico das populações celulares e das células T CD4/CD25
presentes na gordura.
•
Avaliar o efeito da interação entre as MSC e Treg, obtidas do mesmo microambiente de
gordura, nos seus perfis imunofenotípicos e na atividade supressora.
12
2.1. EQUIPE:
Pesquisadores
Verônica Coelho, InCor- FMUSP (Responsável)
Maristela Hernandez
Colaboradores Nacionais:
Jorge Kalil, InCor- FMUSP
Luiza Guilherme, InCor- FMUSP
Janaína Baptista Alves, InCor- FMUSP
David Saitovitch, PUC, RS
Kelen Cristina Ribeiro Malmegrim, FMRPUSP
Colaboradores internacionais:
Kellen Christina Faé, Max Planck Institute, Berlin
Estudantes de pós-graduação:
Carolina Lavini Ramos, FMUSP (Mestrado)
Aprimoranda:
Ana Paula Pacanaro, InCor- FMUSP
3. PROJETO J: DENGUE
A Dengue é uma doença aguda considerada como um dos principais problemas de
saúde pública em regiões tropicais e subtropicais do mundo, responsável por causar cerca de
25 mil mortes todos os anos, 95% bebês e crianças, e não há atualmente vacina ou drogas
antivirais eficazes para auxiliar o controle da doença. O principal obstáculo para o
desenvolvimento da vacina é o conhecimento limitado a respeito do agravamento anticorpodependente (Antibody Dependent Enhancement – ADE). A possibilidade de verificar quais
células são infectadas na fase aguda em humanos, juntamente com avanços tecnológicos na
análise por citometria de fluxo multiparamétrica (FACS), pode proporcionar uma oportunidade
em paralelo para identificar precisamente células-alvo suscetíveis a infecção pelo vírus da
Dengue e definir testes na hipótese do ADE.
A partir de experimentos de desafio em primatas não-humanos e de coloração de tecidos
humanos post-mortem, foi demonstrado que a infecção humana pode ser iniciada no sítio da
inoculação do vírus, possivelmente nas células de Langerhans ou nas células dendríticas, e
então, a infecção se espalha para os nódulos linfáticos regionais (LNs) e para o fígado via
sistema linfático e circulatório respectivamente. O vírus da Dengue pode potencialmente
infectar outros órgãos quando o mesmo atinge a circulação geral. Na teoria, qualquer célula
apresentando receptor(es) permissivo(s) ao vírus da Dengue pode ser suscetível a infecção na
ausência de anticorpos, enquanto que as células sanguíneas carregando FcRs também são
capazes de ligar e internalizar complexos de vírus-anticorpo potencialmente infecciosos
independente de receptor(es) para este vírus. Em ambos os exemplos a disseminação do vírus
da Dengue seria facilitada.
13
Atualmente pouco é conhecido sobre as células-alvo do vírus da Dengue. Achados
clínicos e laboratoriais indicam que: I) – As principais células alvo são de linhagem fagocitária
mononuclear); II) – Muitos tipos de células humanas, incluindo monócitos/macrófagos, células
dendríticas derivadas da linhagem de monócitos, células de Langerhans, células endoteliais,
linhagens de células T, linhagens de células B e linhagens de hepatócitos são suscetíveis a
infecção do vírus da Dengue in vitro; e III) – As células B primárias, NK, T CD4 e T CD8 podem
ser também alvos de infecção do vírus in vivo e in vitro. Dados limitados a partir de autópsias
em humanos revelam antígenos da Dengue e/ou RNA em monócitos/macrófagos ou linfócitos
do: fígado, baço, timo e pulmão. Além disso, a infecção experimental da Dengue em primatas
não-humanos demonstra a replicação do vírus em células semelhantes a macrófagos na
maioria dos nódulos linfáticos e, interessantemente, uma infecção considerável em células
desconhecidas das placas de Peyer.
Os resultados podem contribuir para entender melhor a patogênese da doença e
explorar novos meios de combater a epidemia, em especial os casos mais graves de Dengue.
Objetivos
Testes foram padronizados para detectar tanto o fenótipo quanto o número de células
infectadas e a quantidade de vírus produzidos in vitro por células primárias humanas
infectadas. Os resultados irão proporcionar um teste crítico para atestar ADE. As hipóteses
mencionadas serão testadas desenvolvendo dois objetivos específicos:
Objetivos Específicos
•
Identificar quantitativamente fenótipos de células infectadas no sangue periférico de
indivíduos acometidos com Dengue febril e/ou Dengue hemorrágica;
•
Identificar respostas celulares contra o vírus da Dengue;
•
Caracterizar geneticamente os vírus da Dengue dos indivíduos infectados.
O significado dos resultados deste estudo apresentará duas principais áreas de
interesse da pesquisa em Dengue. Primeiramente, ajudará a responder uma questão chave
relacionada à patogênese da doença: “Qual é a provável fonte celular de mediadores
inflamatórios implicados na lesão microvascular de FHD?”. Esta resposta pode abrir a
possibilidade de novas estratégias para a prevenção de FHD/DHF. Em segundo lugar, estes
resultados concentrarão o foco dos esforços atuais na identificação de um receptor permissivo
para o vírus da Dengue, ou receptores sorotipo-específicos, utilizando tipos celulares
clinicamente relevantes para tais estudos. Por fim, visto que a infecção por diferentes sorotipos
e/ou genótipos podem resultar em diferentes padrões de resposta imunológica, a
caracterização genética do vírus é crucial.
14
3.1. EQUIPE:
Pesquisadores:
Esper Georges Kallás, FMUSP (Responsável)
Edecio Cunha-Neto, FMUSP
Colaboradores Nacionais:
Daniela Santoro Rosa, UNIFESP
Maria Candida Souza Dantas, FMUSP
Colaboradores Internacionais:
David I. Watkins, Universidade de Wisconsin, Madison
Estudantes de pós-graduação:
Andréia Manso de Matos, FMUSP
Pós-doutores:
Karina Carvalho Salmazi, FMUSP
4. METODOLOGIAS
As metodologias que serão aplicadas na execução dos projetos adicionais estão
descritas na Parte B do projeto (página 112)
5. DESENVOLVIMENTO PREVISTO EM CADA NOVA AREA TEMÁTICA/SUBPROJETO
Etapas previstas
Tema Subprojeto
Estudo de
Mecanismo
Ident. Alvo
molecular
Intervenção
Produção
agente
intervenção
Pré-clínica
Intervenção
Pré-Clínica
(animais)
Prod.
Agente
interv.
clinica
Teste
Clínico
fase I/II
Doença de
Chagas
Células Tronco
Mesenquimais
Dengue
6. LITERATURA CITADA
Abel, L.C., Rizzo, L.V., Ianni, B., Albuquerque, F., Bacal, F., Carrara, D., Bocchi, E.A., Teixeira,
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Review
PARTE D - ORÇAMENTO
0
PARTE D - ORÇAMENTO
SUMÁRIO
1. Justificativa do Orçamento ..............................................................................................01
2. Orçamento detalhado ..................................................................................................... 03
1
PARTE D - ORÇAMENTO
1. JUSTIFICATIVA DO ORÇAMENTO
O orçamento para esta proposta foi construído em sintonia com a orientação dos
documentos que regem a proposta: trata-se de solicitação de recursos complementares, para
despesas de capital (equipamentos multiusuário de alto e médio custo) e despesas correntes, que
servirão a diversos pesquisadores USP, em diversas áreas temáticas do projeto do grupo
consolidado iii-INCT. É possível avaliar que o grupo tem sido capaz de obter auxílios em agências
nacionais e internacionais nos últimos 5 anos com valores consideráveis. A ênfase da solicitação
foi para estabelecer novas metodologias ou aprimorar já existentes e, que são essenciais para
a proposta. No atual projeto, além de financiar novos equipamentos indispensáveis – em alguns
casos repondo equipamentos de alto custo obsoletos em uso no iii-INCT até recentemente, vários
com 20 anos de uso, avariados e sem possibilidade de reparos – solicitamos recursos para custeio,
incluindo insumos, para acelerar o desenvolvimento de projetos transdisciplinares, como “seed
money”.
Pretendemos aplicar uma pequena parte dos recursos (5%) em visitas de curta duração a
laboratórios científicos de colaboradores internacionais. Os equipamentos solicitados serão
multiusuário e fazem parte das plataformas existentes no iii-INCT. Durante as negociações
conseguimos descontos de até 30% do preço de catálogo para os equipamentos. A seguir
descreveremos os equipamentos solicitados, bem como uma justificativa detalhada:
1.1. Espectrômetro de massa
Na presente proposta estamos solicitando um equipamento de espectrometria de massa,
do tipo MALDI-ToF/ToF (Matrix-assisted laser desorption/ionization - time-of-flight), modelo
“UltrafleXtreme”, da marca Bruker. Tal equipamento permite a análise da razão massa/carga de
peptídeos e proteínas assim como outras macromoléculas. O espectrômetro de massa é
fundamental dentro das plataformas de proteômica e de produção de imunobiológicos.
Um instrumento do tipo TOF/TOF permite não apenas a identificação de massas de
peptídeos com alta resolução, mas também a seqüência de amino ácido precisas de peptídeos
sintéticos ou clivados por enzimas por meio da funcionalidade do MS/MS. Isto é crucial para a
moderna análise proteômica, a qual faz parte de projetos em diferentes áreas do nosso Instituto,
como a doença de Chagas, transplante, câncer, alergia, autoimunidade, HIV / AIDS e febre
reumática. Além disso, dentro da nossa estrutura, a espectrometria de massa é de fundamental
importância para a análise de peptídeos sintéticos, que são produzidos em pequena e grande
escala por nosso grupo para o uso em quase todas as áreas do Instituto, incluindo as três novas
2
áreas e em especial para a produção de vacinas para uso experimental. Este tipo de análise é
atualmente realizado por colaboradores externos e tornou-se um ponto de gargalo em várias áreas
do nosso Instituto, devido à alta demanda.
Optamos pelo modelo de espectrômetro de massa “UltrafleXtreme” (Bruker), devido sua
alta resolução e diversas utilidades. Permite não apenas o seqüenciamento e a identificação de
peptídeos e proteínas em alta resolução, como também integra novas metodologias de análise de
imagens de tecidos/células, e também de identificação microorganismos, as quais acreditamos ser
de grande utilidade para diversas áreas de estudo integradas em nossos projetos. A Bruker é um
dos fornecedores mais tradicionais de espectrômetros de massa, e seu aparelho é tido como um
dos melhores do mercado. Além disso, o histórico de assistência técnica dessa linha de
equipamentos é longo e consistente.
O equipamento será instalado no Laboratório de Imunologia do InCor, que já conta com
diversos equipamentos de análise proteômica, como aparelhos de eletroforese bidimensional,
escâneres, incluindo um escâner de fluorescência, ferramentas de bioinformática e um sistema
robotizado de processamento de géis bidimensionais; assim como equipamentos de síntese de
peptídeos (um peptídeo por vez), como aparelhos de cromatografia líquida de alta performance,
sintetizadores de larga escala, e liofilizadores. Um sintetizador de múltiplos peptídeos vai ser
solicitado na presente proposta.
É importante ressaltar também que este será o primeiro equipamento de espectrometria de
massa – em especial com capacidade de seqüenciamento de novo com a tecnologia MS/MSdentro da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FMUSP), bem como de todo o
complexo do Hospital das Clínicas (HC-FMUSP). Será um equipamento multiusuário atendendo
não apenas as Instituições e grupos envolvidos no iii-INCT, como também grupos do complexo
HC-FMUSP.
1.2. Sintetizador de peptídeos
O Sintetizador de peptídeos modelo “OPS-230 Overture” (Protein Technologies Inc.) é um
aparelho com 96 canais independentes, o qual permite a síntese de até 96 peptídeos diferentes. O
sistema também permite usar até 6 protocolos diferentes. Este aparelho irá integrar a seção de
síntese de peptídeo permitindo a síntese de uma variedade maior de peptídeos simultaneamente,
imprescindível para suprir a demanda de projetos do nosso Instituto. Peptídeos sintéticos são a
base para diversos projetos nas áreas temáticas de alergia, transplante e imunorregulação,
HIV/AIDS, febre-reumática e auto-imunidade.
3
O equipamento será instalado no Laboratório de Imunologia do InCor, o qual já conta com
diversos equipamentos de síntese de peptídeos, como aparelhos de cromatografia líquida de alta
performance, sintetizadores de larga escala, sintetizadores de múltiplos peptídeos, liofilizadores e
espectrometria de massa (a ser solicitado na presente proposta).
1.3. Centrífuga
Estamos solicitando no presente edital uma centrífuga “Sorvall Superspeed Centrifuge”
modelo “RC6 plus” com seus rotores, que irá pertencer ao parque de equipamentos da plataforma
de produção de imunobiológicos. Este equipamento é de fundamental importância para a produção
de plasmídeos de DNA e proteínas recombinantes e para produção dos vetores vacinais em larga
escala, além de fracionamento de células e tecidos e purificação de proteínas. Será de grande
utilidade nos projetos das áreas temáticas: transplante e imunorregulação, HIV/AIDS, febrereumática e auto-imunidade.
1.4. Freezer Vertical - 80ºC
O freezer vertical – 80 ºC "Value Series", modelo “ULT-2186-4-D”, pode acomodar até 40
mil amostras. Servirá como repositório central dos materiais biológicos (RNA, células, tecido,
plasma, etc) para as diversas áreas temáticas do Projeto.
2. ORÇAMENTO DETALHADO
2.1. Total de recursos solicitados: R$ 2.000.000,00
2.2. Custeio: R$ 805.697,50
2.3. Diárias: R$ 50.000,00
2.4. Passagens: R$ 50.000,00
2.5. Equipamentos e Material Permanente Importado
2.5.1. Espectrômetro de Massa (marca “Bruker Daltonics”), incluindo:
“UltrafleXtreme MALDI TOF/TOF System”: US$ 605.000,00 (R$ 1.010.350,00)
“Starter-Kit FlexImaging”: US$ 9.460,00 (R$ 15.798,20)
“Biotools 3.2 SR1 software package”: US$ 9.680,00 (R$ 16.165,60)
4
“Mascot Server”: US$ 13.145,00 (R$ 21.952,15)
Total: US$ 637.285,00 (R$ 1.064.265,90)
Desconto concedido pela empresa: US$ 191.186,00 (R$ 319.280,62)
Valor Total com desconto: US$ 446.099,00 (R$ 744.985,33)
2.5.2. Sintetizador de Peptídeos (marca “Protein Technologies Inc.”), incluindo:
“OVERTURE Automated 96 Channel, Solid-Phase, Bio-Organic Synthesizer”:
US$157.747,00 (R$ 263.437,49)
Desconto concedido pela empresa: US$ 15.775,00 (R$ 26.344,25)
Valor Total com desconto: US$ 141.972,00 (R$ 237.093,24)
2.5.3. Centrífuga (marca “SORVALL”), Incluindo:
Centrífuga Modelo RC 6 Plus: US$ 26.000,00 (R$ 43.420,00)
Rotor de velocidade de 8.500 rpm com capacidade de 06 tubos de 1000 ml, US$ 17.900,00
(R$ 29.893,00)
Rotor de velocidade de 21.000 rpm com capacidade de 08 tubos de 50 ml, US$ 5.300,00
(R$ 8.851,00)
Valor de frete interno US$ 400,00 (R$ 668,00)
Valor Total: US$ 49.600,00 (R$ 82.832,00)
2.5.4. Freezer vertical (marca “REVCO”), incluindo:
Freezer vertical de ultra-baixa temperatura Série Value, modelo ULT-2186-4-D: US$
17.000,00 (R$ 28.390,00)
Valor de frete interno US$ 600,00 (R$ 1.002,00)
Valor Total: US$ 17.600,00 (R$ 29.392,00)
2.5.5. Total de Equipamentos e Material Permanente Importado: US$ 655.271,00 (R$
1.094.302,50)
OBS: Cotação do Dolar (Banco Central / 22/02/2011): US$1,000 = R$1,67
PARTE E – CRONOGRAMA DE EXECUÇÃO
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PARTE E - CRONOGRAMA DE EXECUÇÃO
OBJETIVOS
TRIMESTRES
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ALERGIA
Grupo de Estudos
Regionais (GENAR)
de
Novos
Alergenos
Caracterização clínica das alergias a mandioca
Caracterização bioquímica do extrato de mandioca
Caracterização imunológica do extrato de mandioca
Caracterização clínica das alergias ao veneno da
formiga S. saevissima
Caracterização bioquímica do veneno da formiga
Solenpsis saevissima
Caracterização imunológica do veneno de S.
saevissima
Asma
Observação de Reação cruzada D. pteronyssinus e
B. tropicalis
Questionário de aferição de controle de asma
Determinar
a
existência
de
imunopatológicos na asma não alérgica
padrões
Avaliar a dosagem de proteína C reativa
Alergia Respiratória
Reatividade cruzada IgE e da resposta de células T
Produção de Der p 1 e Der p 2 recombinantes GMP
Ensaio Clínico com Der p 1 e Der p 2
TRANSPLANTE E IMUNORREGULAÇÃO
Hsp60 e células dendríticas
Produção do anticorpo anti-DEC205 acoplado a
diferentes peptídeos da Hsp60.
Identificar peptídeos/fragmentos da Hsp60 capazes
de induzir um perfil de expressão gênica
imunorregulador ou inflamatório in vitro e teste da
capacidade imunorreguladora desses peptídeos e
do anti-DEC205+pep Hsp60
Análise de ligantes dos peptídeos de Hsp60 por
microscopia confocal.
Ensaio pré-clínico
clínico fase I
(toxicidade)/prod.GMP/ensaio
Células T reguladoras
Caracterizar imunofenotipicamente, as células
dendríticas geradas a partir de células de medula
óssea de camundongos BALB/c
+
+
Gerar células T reguladoras CD4 CD25 em cocultura com células dendríticas (DCs) e células
2
autólogas de linfonodo (BALB/c) na presença de
células alogênicas (C57BL/6) em apoptose com
análise fenotípica e de prod. citocinas
Determinar a capacidade imunomoduladora das
+
+
células CD4 CD25 sobre a população de células
de memória in vivo
Tolerância operacional no transplante humano
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Analisar a resposta celular dirigida a antígenos
alogênicos, autólogos e virais, mediante a análise
da expressão gênica e protéica de um painel de
fatores de transcrição e citocinase perfil fenotipico
Análise da resposta humoral: repertório global de
aloanticorpos, perfil perfil global de reatividade de
auto-anticorpos, (ImmunoChip) no soro, e repertório
de CDR3 presente nos receptores de células B no
sangue
Análise do perfil de peptídeos ligantes de anticorpos
presentes no soro e peptídeos miméticos de
antígenos humanos
Analisar o repertório de micropartículas do soro e a
expressão de Q-SOX
Analisar o perfil de expressão protéica na urina
Anticorpo humanizado anti-CD3:
clínica
e
avaliação
da
imunorreguladora
aplicação
atividade
Construção de anticorpos anti-CD3 quimeras e
humanizados
Analisar a afinidade dos anticorpos ligantes da
molécula CD3 in vitro
Analisar o efeito dos anticorpos na indução de
proliferação, produção de citocinas e na expressão
de fatores de transcrição imunorreguladores, em
células mononucleares do sangue periférico, além
do efeito dos anticorpos na geração de células T
com atividade supressora, in vitro
Realizar testes pré-clínicos/produção GMP/ensaio
clínico fase I
IMUNODEFICIÊNCIAS PRIMÁRIAS
Estabelecer o perfil de mutações conhecidas em
todos
os
pacientes
portadores
de
ICV
acompanhados dentro do iii
Estabelecer o perfil de mutações em genes
candidatos em todos os pacientes portadores de
ICV acompanhados dentro do iii
Determinar as características clínicas e laboratoriais
dos pacientes que respondem in vitro a reposição
de leptina
Determinar se a reposição de leptina resulta
também em uma reaquisição da capacidade de
produzir anticorpos nos pacientes responsivos à
reposição deste hormônio
HIV/ AIDS
Decifrando a genética e a função KIR na infecção
3
recente pelo HIV-1 pela bioinformática
Resposta Vif-específica mediada por células T
CD8+ em indivíduos que controlam a replicação do
HIV
Resposta imune celular contra epítopos crípticos na
AIDS
Vacina anti-HIV de epitopos promíscuos de classe II
Desenvolvimento de nova vacina candidata
construída com o vírus vacinal da febre amarela
Teste de vacina baseada em epitopos crípticos
Identificação de alvos terapêuticos para intervenção
na progressão para a AIDS
Resposta contra epitopos mutantes induzidos por
inibidores de protease no tratamento do HIV
Caracterização do potencial neutralizante de Ac
anti-HIV obtidos por phage display
DOENÇAS TROPICAIS
Leishmaniose
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Testar a imunogenicidade do plasmídeo C + as
proteínas acidas ribosomais. Esquemas de primebooster
Verificar proteção pela infecção dos cães por via
intradérmica de parasitas +saliva
Avaliar protecão de cães imunizados e mantidos na
area endêmica
Investigar os efeitos das proteínas recombinantes
da saliva de Lu. longipalpis na biogênese/função de
corpúsculos lipídicos
Determinar os efeitos biologicos da saliva
(recrutamento, ativação de leucócitos e potencial
pro-apoptótico)
Investigar a atividade imunomodulatória de
proteínas recombinantes da saliva de L. longipalpis
em macrófagos peritoneais
Caracterizar a estrutura molecular dos componentes
biologicamente relevantes por técnicas de análise
da estrutura molecular (modelagem molecular por
técnicas de bioinformática)
Avaliar a resposta terapêutica de pacientes com
leishmaniose visceral a N-acetilcisteína (NAC) como
adjuvante ao tratamento padrão com antimonial
pentavalente, comparado ao tratamento somente
com antimonial, através de estudo clínico
randomizado e duplo cego.
Avaliar a resposta terapêutica de cães de rua da
cidade de Aracaju com leishmaniose visceral a Nacetilcisteína (NAC) como adjuvante ao tratamento
padrão com antimonial pentavalente, comparado ao
tratamento somente com antimonial, em estudo
clínico randomizado e cego.
AUTO-IMUNIDADE
Febre Reumática
4
Ensaios pré-clínicos em mini – pigs com agente
vacinal em formulações de peptídeo sintético/
proteína recombinante com adjuvantes (Alum e
AFCo1)
Produção do agente vacinal em GMP (peptídeo
sintético e proteína recombinante)
Ensaios Clínicos de Fase I – o desenho será
efetuado a partir dos resultados dos ensaios préclínicos (quantidade e número de dose do agente
vacinal e acompanhamento clínico/ laboratorial)
Ensaios Clínicos de Fase II – em função dos
resultados obtidos na fase I e acompanhamento
mais prolongado
Identificação de cepas do S. pyogenes
Confirmar capacidade do epitopo vacinal em induzir
células T reguladoras, com potencial terapêutico em
pacientes com doença reumática cardíaca
Ensaio Clínico Fase III – em função dos resultados
Fase II
Doença de Crohn
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Estudo da produção de citocinas e células T
reguladoras após administração oral de antígenos
Componente da dieta a ser substituído; peptídeos
de hsp60 reguladores a serem usados
Complemento dietético composto de aminoácidos
balanceados para uso em camundongo
Estudo pré-clínico em camundongos IL-10-/- que
desenvolvem colite espontânea
Complemento dietético composto de aminoácidos
balanceados para uso em humanos
Estudo clínico em pacientes com Doença de Crohn
(Fases I e II)
CÂNCER
Preparação do material do estudo com impressão
de manuais
Submissão para comitês de ética
Produção da vacina
Inclusão de pacientes
Acompanhamento dos pacientes
Testes imunológicos
Avaliação dos resultados
Publicação
DOENÇA DE CHAGAS
Análise proteômica do miocárdio de doadores de
órgãos e de pacientes com cardiomiopatia
chagásica crônica, idiopática e isquêmica
Migração de células T de memória e células Treg
periféricas para o miocárdio de portadores de
Cardiomiopatia Chagásica Crônica: expressão de
quimiocinas e seus receptores em células T
5
periféricas e polimorfismo genético
Identificacao e Caracterizacao de Genes de
Susceptibilidade Associados a Evolução para a
Cardiopatia
Chagasica
Crônica
Utilizando
Tecnologia de Pesquisa de Polimorfismos de Alta
Densidade.
CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS
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5
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Determinar a capacidade supressora das células
mesenquimais humanas (MSC), in vitro, e a sua
relação com a expressão gênica de um painel de
moléculas da resposta imune, e outras relacionadas
à apoptose e ativação celular, nos linfócitos T e nas
MSC.
Avaliar o efeito da interação dos peptídeos da
proteína de choque térmico 60 com as MSC na sua
atividade supressora.
Avaliar o perfil imunofenotípico das populações
celulares e das células T CD4/CD25 presentes na
gordura.
Avaliar o efeito da interação entre as MSC e Treg,
obtidas do mesmo microambiente de gordura, nos
seus perfis imunofenotípicos e na atividade
supressora.
DENGUE
Identificar quantitativamente fenótipos de células
infectadas no sangue periférico de indivíduos
acometidos com Dengue febril e/ou Dengue
hemorrágica;
Identificar respostas celulares contra o vírus da
Dengue;
Caracterizar geneticamente os vírus da Dengue dos
indivíduos infectados.