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ANÁLISE DO TRANSCRIPTOMA DE SUBPOPULAÇÕES DE UMA LINHAGEM CELULAR DE LEUCEMIA
MIELÓIDE AGUDA (REARRANJO MLL) SELECIONADAS APÓS EXPOSIÇÃO PROLONGADA À CITARABINA
(ARA-C)
1
Autores
Instituição
2
3
4
Larissa Oliveira Guimarães , Yulan Qing , Ernest Ricky Chan , Kuruvilla Joseph Abraham , Stanton L.
2
1
Gerson , Aparecida Maria Fontes
1
FMRP-USP - Dpto de Genética - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (Av. Bandeirantes, 3900 2
Monte Alegre - Ribeirão Preto - SP), CWRU-CCC - Case Comprehensive Cancer Center (10900 Euclid
3
Ave. Cleveland, Ohio, USA), CWRU - Institute for Computational Biology (10900 Euclid Ave. Cleveland,
4
Ohio, USA ), Uniseb - Centro de Pediatria - Uniseb - Estácio Centro Universitário (Rua Abrahão Issa
Halach, 980 - Ribeirânia, Ribeirão Preto - SP)
Resumo
OBJETIVOS
A natureza heterogênea da Leucemia Mielóide Aguda (LMA) é um desafio para o sucesso da quimioterapia em
leucemias com prognóstico ruim, como a portadora da translocação MLL (11q23), em que até 70% dos pacientes não
atingem 5 anos de sobrevida livre da doença. Este trabalho objetivou caracterizar quanto à expressão gênica
subpopulações celulares com comportamento distinto ao tratamento com Citarabina (Ara-C), com a finalidade de
sugerir vias gênicas relevantes complementares ao tratamento convencional.
MÉTODOS
Para tal, a linhagem celular MV-4-11 (ATCC® CRL-9591™), portadora da fusão MLL-AF4, foi exposta ao Ara-C por
aproximadamente 12 semanas. As células foram caracterizadas quanto: 1) marcadores de superfície celular CD34 e
CD38 (citometria de fluxo), 2) ciclo celular (coloração com iodeto de propídeo), e 3) sequenciamento do transcriptoma
[RNA-seq - HiSeq® 2500 Sequencing System (Illumina)]. Os programas Tophat, Cufflinks e R foram utilizados na
análise do sequenciamento.
RESULTADOS
Após o tratamento com Ara-C, observou-se que as células apresentaram distribuição bimodal com relação ao
marcador de superfície CD38. Desta forma, optou-se por separar (sorting em citometria de fluxo) as subpopulações
tratadas de acordo com os níveis de CD38 expressos: 1) expressão baixa do marcador - MV-4-11 T CD38Low, e
expressão elevada - MV-4-11 T CD38High. As análises de ciclo celular indicaram que estas duas subpopulações
celulares comportam-se de maneira distinta quando expostas à droga: as células MV-4-11 T CD38High acumulam-se
na fase Sub-G1 do ciclo celular, o que indica que a morte celular é mais pronunciada que nas células MV-4-11 T
CD38Low, que tendem a se acumular na fase G1, que antecede a síntese do DNA (S), quando Ara-C é incorporado.
As análises de RNA-seq destas subpopulações demonstram que 3395 genes estão diferencialmente expressos entre
MV-4-11 T CD38Low e MV-4-11 T CD38High. Grupos de genes candidatos foram propostos por estarem envolvidos
na leucemogênese, no metabolismo da droga, ou por estarem associados ao ciclo celular; e o nível de expressão de
seis genes foi validado por qPCR: 1) enzima metabolizadora de Ara-C (NME-1); 2) HOX (HOXA13 e HOXB7) 3)
regulador de expressão gênica (MEIS1, cofator de genes HOX); 4) reparo de DNA (PARP12), e 5) ciclo celular e
regulação de apoptose (TP53), representados em um heatmap conforme a expressão. NME-1, MEIS1, HOXB7 e
TP53 estão hiperexpressos em MV-4-11 T CD38Low, enquanto, HOXA13 e PARP12 estão hiperexpressos em MV-411 T CD38High.
CONCLUSÃO
Dado que as duas subpopulações celulares apresentam comportamentos diferentes no ciclo celular em resposta ao
Ara-C, e que as principais enzimas metabolizadoras de Ara-C (DcK e CDA), não se encontram diferencialmente
expressas nas subpopulações celulares conforme a análise de RNA-seq, sugere-se que a resposta ao Ara-C em
leucemia MLL-AF4 deve-se principalmente à regulação de genes associados a ciclo celular e apoptose.
Palavras-chaves: Clonalidade variegada , Leucemogênese, Resposta à quimioterapia
Agência de Fomento: Capes, CNPq