1 introdução
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Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento Programa de Pós-graduação em Bioengenharia NÍNIVE BASTOS OLIVEIRA UTILIZAÇÃO DA ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO (FTIR) PARA A IDENTIFICAÇÃO DE HERBICIDA À BASE DE DIURON EM PLANTAS São José dos Campos, SP 2014 NÍNIVE BASTOS OLIVEIRA UTILIZAÇÃO DA ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO (FTIR) PARA A IDENTIFICAÇÃO DE HERBICIDA À BASE DE DIURON EM PLANTAS Dissertação apresentada no Programa de Pósgraduação em Bioengenharia, como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Bioengenharia. Orientadora: Profª. Drª. Kumiko Koibuchi Sakane São José dos Campos, SP 2014 NINIVE BASTOS OLIVIERA "UTILIZAÇÃO DA ESPECTROSCOPIA IDENTIFICAÇÃO NO INFRA VERMELHO (FT-IR) PARA A DE HERBICIDA À BASE DE DIURON EM PLANTAS." Dissertação aprovada como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Engenharia Biomédica, do Programa de Pós-Graduação Desenvolvimento em Bioengenharia, do Instituto de Pesquisa e da Universidade do Vale do Paraíba, São José dos Campos, SP, pela seguinte banca examinadora: Prof', Dra. ANDREZA RIBEIRO SIMIONI (UNIVAP)----"-"'--f-=------J'h-H'-I-:c+-+ Prof. Dra. KUMIKO KOIBUCHI SAKANE (UNIV AP).--II-/-_~~!...Of="~=~-_ Prof. Dra. ANDREA SANTOS LIU (IFSP) Prof". Dra. Sandra Maria Fonseca da Costa Diretor do IP&D - UniVap São José dos Campos, 28 de fevereiro de 2014. ~~~~~------_ _ Ao meu amado esposo (Elessandro), meu querido filho (Mateus), meus pais (Vital e Cleidimar), minha tia Mara e meus irmãos (Juninho e Calebe ), minha cunhada Juliana e meu sobrinho Samuel que foram os meus inspiradores e incentivadores nesta conquista; A toda equipe do Laboratório de Espectroscopia no Infravermelho do IP&DUNIVAP, por todo apoio e auxílio na realização deste trabalho, em especial a Profª. Drª Kumiko. AGRADECIMENTOS Esta é uma tentativa de expressar a minha gratidão a todos, que de alguma forma contribuíram para que eu pudesse chegar até aqui. Primeiramente agradeço a Deus, pois sei que pelo Seu infinito amor por mim cheguei até aqui e que Ele tornou todas as coisas possíveis para que mais este sonho se concretizasse, colocando pessoas notáveis no meu caminho, abrindo portas e promovendo grandes livramentos. Ao meu querido esposo que me apoiou, suportando as ausências sempre com palavras doces e de incentivo. Ao meu filho Mateus, um presente de Deus. Aos meus pais Vital e Cleidimar, meus grandes incentivadores , pelo apoio, em especial no cuidado com meu filho, e por sempre acreditarem em mim . Aos meus irmãos Juninho e Calebe, à minha cunhada Juliana e meu sobrinho Samuel por torcerem sempre por mim e à minha amada tia Mara por estar presente em todos os momentos importantes e que sempre me ajudou. Às Faculdades Unificadas Doctum de Teófilo Otoni (FUTO) e Escola Pequeno Prínicipe , que reconhecidamente valorizam o crescimento profissional de seu corpo docente e me proporcionaram a oportunidade de mais esta conquista profissional. À Profª. Drª. Kumiko K. Sakane pelo aprendizado, paciência e carinho durante todo este tempo. Os ensinamentos recebidos pela senhora contribuíram pelo meu crescimento pessoal e profissional. À Patrícia Marcondes , uma amiga, pelo auxílio , em todos os momentos, para a realização deste trabalho. Às minhas amigas e irmãs Cida e Eliene, pelo incentivo que me deram para que eu iniciasse este curso. E, finalmente, aos meus irmãos em Cristo pelas orações por mim e por toda a minha família. “O temor do Senhor é o princípio da ciência.” (BÍBLIA, 2008) RESUMO UTILIZAÇÃO DA ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO (FT-IR) PARA A IDENTIFICAÇÃO DE HERBICIDA À BASE DE DIURON EM PLANTAS O diuron é um herbicida, do grupo da ureia empregado no Brasil, considerado tóxico e persistente no meio ambiente. Através da espectroscopia de absorção na região do infravermelho pode-se determinar a concentração pelo número de ondas e a absorbância. O objetivo deste trabalho é a análise e interpretação de espectros na região do infravermelho de um herbicida à base de diuron e de folhas de plantas tratadas por ele. Foram realizados dois plantios de feijão do tipo carioca. No primeiro plantio o herbicida foi aplicado no solo e no segundo plantio o herbicida foi pulverizado nas folhas. Foram obtidos 12 espectros das folhas do feijão com resolução de 4cm-1 no modo de transmissão a 20 °C utilizando o espectrofotômetro no infravermelho modelo SPECTRUM 2000 da PERKIN ELMER. Outros 24 espectros das folhas do segundo plantio foram obtidos na faixa de 400 a 1000 cm-1, com resolução de 4cm-1 a 20 °C e o espectrofotômetro utilizado foi o modelo Spectrum Spotlight 400 FT-IR da PERKIN ELMER. Na análise visual no espectro do herbicida observou-se uma banda na região de 1389 cm-1. Nos espectros das folhas de feijão que foram tratadas com o herbicida apresentaram uma banda de 1385 cm-1.A intensidade desta banda varia com a quantidade de herbicida aplicado. Este resultado sugere que esta banda de 1384 cm-1 pode estar relacionada à presença do herbicida na planta sugerindo que houve a translocação do diuron para a estrutura da planta . Sendo assim, a banda de 1385 cm-1 pode ser utilizada como banda marcadora do herbicida. Palavras-chave: Diuron. Herbicida. Espectroscopia no Infravermelho. Plantas. ABSTRACT UTILIZATION OF THE FT-IR INFRARED SPECTROCOPY FOR IDENTIFYING THE BASE DIURON HERBICIDE IN PLANTS Diuron is a herbicide, from the urea Group employee in Brazil, considered toxic and persistent in the environment. By absorption spectroscopy in the infrared region the concentration can be determined by the number of waves and the absorbance. The aim of this work is the analysis and interpretation of spectrum in the infrared region of a herbicide based on diuron and leaves of treated plants with him. Two bean plantations of the carioca type were carried out. In the first planting the herbicide was applied in the soil and in the second planting herbicide was sprayed on the leaves. 12 spectrum were obtained from the leaves of the bean with a resolution of 4 cm-1 in transmission at 20° C using infrared spectroscopy SPECTRUM 2000 model of PERKIN ELMER. Other 36 spectrum of leaves of the second planting were obtained in the range of 400 to 1000 cm-1, with a resolution of 4 cm-1 at 20° C and the spectroscopy used was the model Spectrum Spotlight 400 FT-IR PERKIN ELMER. On visual analysis in the spectrum of the herbicide noted a band in the region of 1389 cm-1. In the spectrum of bean leaves that were treated with the herbicide showed a band of 1385 cm1 .The intensity of this band varies with the amount of herbicide applied. This result suggests that this band of 1384 cm-1 can be related to the presence of the herbicide on plant suggesting that there was a translocation of diuron for the structure of the plant. Thus, the band of 1385 cm-1 can be used as a herbicide marker band. Keywords: Diuron. Herbicide. Infrared Spectroscopy. Plants. LISTA DE FIGURAS Figura 1: Percentual de resíduos de agrotóxicos em amostras de alimento...........................15 Figura 2: Fórmula estrutural do diuron.................................................................................. 18 Figura 3: Modos vibracionais da molécula de água...............................................................22 Figura 4: Modos vibracionais do grupo CH2 em uma molécula mais complexa...................23 Figura 5: Diagrama representando os principais componentes de um espectrofotômetro de infravermelho com transformada de Fourier......................................................... 24 Figura 6: (A) Interferograma de uma radiação monocromática; (B) de uma radiação policromática; (C) de uma radiação policromática, com uma amostra entre o interferômetro e o detector.....................................................................................25 Figura 7: Espectro em transmitância do ácido lático............................................................. 27 Figura 8: Espectro em absorbância do ácido lático................................................................28 Figura 9: Imagens do 1º plantio após 7 dias...........................................................................32 Figura 10: Imagens do 2º plantio após 7 dias...........................................................................33 Figura 11: Imagem da jardineira B após 24 horas da aplicação do herbicida nas folhas........ 34 Figura 12: Imagem da jardineira C após 24 horas da aplicação do herbicida nas folhas........ 34 Figura 13: Espectrofotômetro no infravermelho modelo SPECTRUM 2000 da Perkin Elmer.................................................................................................................. 37 Figura 14: Acessório UATR.................................................................................................... 38 Figura 15: Espectrofotômetro Spectrum Spotlight 400 FT-IR da Perkin Elmer......................39 Figura 16: Espectro de absorção na região do infravermelho do herbicida à base de diuron.....................................................................................................................41 Figura 17: Espectro de absorção na região do infravermelho da amostra de folha de feijão A do primeiro plantio com lavagem.........................................................................44 Figura 18: Estrutura molecular da celulose e lignina..............................................................45 Figura 19: Espectros das amostras do primeiro plantio A, B e C com lavagem.....................46 Figura 20: Espectros das três amostras de folhas de planta do primeiro plantio com lavagem na região de 1300 – 900 cm-1.................................................................................46 Figura 21: Curva de calibração da concentração versus intensidade relativa das bandas de 1385 e 1650 cm-1 do primeiro plantio (herbicida aplicado no solo)......................48 Figura 22: Histograma da concentração versus intensidade relativa das bandas de 1385 e 1650 cm-1 do primeiro plantio (herbicida aplicado no solo)..................................48 Figura 23: Espectros das amostras do 2º plantio (herbicida pulverizado nas folhas) A, B e C com lavagem..........................................................................................................50 Figura 24: Histograma da concentração versus intensidade relativa das bandas de 1385 e 1650 cm-1 do segundo plantio (herbicida pulverizado na folha)...........................51 Figura 25: Dendrograma das amostras B e C com e sem lavagem do segundo plantio (herbicida pulverizado na folha)............................................................................53 Figura 26: Espectros médios da amostra A sem lavagem e das amostras B com e sem lavagem do 2º plantio (herbicida pulverizado na folha)........................................54 Figura 27: Espectros médios da amostra A sem lavagem e C com e sem lavagem do 2º plantio (herbicida pulverizado na folha)................................................................54 LISTA DE TABELAS Tabela 1: Classificação de agrotóxicos quanto a sua aplicação.............................................16 Tabela 2: Resumo do mecanismo de ação e forma de aplicação de herbicidas.....................16 Tabela 3: Classificação de agrotóxicos quanto à toxicidade e perigo ao meio ambiente......18 Tabela 4: Comprimentos de onda da radiação eletromagnética.............................................21 Tabela 5: Tabela dos parâmetros utilizados para os dois plantios.........................................31 Tabela 6: Amostras das folhas de feijão................................................................................35 Tabela 7: Número de ondas e descrição aproximada do espectro do herbicida.....................42 Tabela 8: Número de ondas e descrição aproximada do espectro da folha da planta do primeiro plantio (herbicida aplicado no solo) amostra A ( sem herbicida)............45 Tabela 9: Intensidade relativa das bandas 1385 e 1650 cm-1 em função da quantidade de herbicida aplicado no solo......................................................................................47 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO.............................................................................................................14 1.1 Mecanismo de ação e uso de herbicidas.......................................................................16 1.2 Herbicida diuron............................................................................................................17 1.3 Ecotoxicidade do diuron................................................................................................18 1.4 Radiação eletromagnética.............................................................................................20 1.5 Modos de vibração........................................................................................................22 1.6 Instrumentação..............................................................................................................23 1.7 Espectros de absorção no infravermelho.....................................................................26 1.8 Espectroscopia no infravermelho como ferramenta analítica...................................29 2 OBJETIVO.....................................................................................................................30 2.1 Objetivo geral.................................................................................................................30 2.2 Objetivos específicos......................................................................................................30 3 MATERIAL E MÉTODOS...........................................................................................31 3.1 Preparação das amostras..............................................................................................31 3.1.1 1º Plantio – Herbicida aplicado no solo.......................................................................32 3.1.2 2º Plantio – Herbicida pulverizado nas folhas............................................................33 3.1.3 Preparação das folhas....................................................................................................35 3.2 Obtenção dos espectros por absorção na região do infravermelho...........................35 3.2.1 Técnica FT-IR de transmissão utilizando pastilhas de KBr......................................36 3.2.2 Técnica FT-IR de reflexão (UATR).............................................................................37 3.2.3 Pré-processamento dos dados.......................................................................................39 3.3 Análise dos dados..........................................................................................................39 3.3.1 Inspeção visual direta....................................................................................................39 3.3.2 Cálculo de intensidade relativa.....................................................................................40 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................................................41 4.1 Espectros infravermelhos com técnica de transmissão..............................................41 4.1.1 Herbicida diuron............................................................................................................41 4.1.2 Interação herbicida – planta.........................................................................................43 4.2 Espectros infravermelhos com técnicas de reflexão (UATR).....................................51 5 CONCLUSÃO................................................................................................................56 REFERÊNCIAS............................................................................................................57 14 1 INTRODUÇÃO Em 2012 a área agrícola cultivada no Brasil correspondia a 4% (cerca de 50 milhões de hectare) da área cultivada dos 20 maiores países produtores e consumia 20% do de todo o veneno produzido no mundo. Isto colocou o Brasil em primeiro lugar no consumo de agrotóxicos, o que significa que cada brasileiro consome, anualmente, cerca de 4,5L de agrotóxicos. Enquanto no mundo o aumento do consumo de agrotóxicos foi de 96,7%, no Brasil cresceu 190% e segundo o SINDIVEG - Sindicato Nacional da Indústria de Produtos para Defesa Vegetal (2013), a previsão de investimentos na produção agrícola para o ano de 2015 é da ordem de 196 milhões de dólares. Estes dados foram divulgados em um relatório produzido pela ABRASCO (Associação Brasileira de Saúde Coletiva) e lançado na Conferência Mundial das Nações Unidas sobre Desenvolvimento Sustentável (Rio+20) – Cúpula dos Povos na Rio+20 por Justiça Social e Ambiental em junho de 2012 na cidade do Rio de Janeiro, Brasil. Apesar do crescimento na produção agrícola brasileira representar um aumento de oferta de trabalho no campo e diminuição da pobreza, o aumento do consumo de agrotóxico acarreta problemas de ordem ambiental e na saúde da população. Peres, Rozemberg e Lucca (2005) realizaram uma pesquisa com 120 pequenas propriedades na Microbacia do Córrego do São Lourenço no município de Nova Friburgo no estado do Rio de Janeiro com a intenção de avaliar a percepção dos trabalhadores rurais quanto aos riscos: ambiental, à saúde e as estratégias defensivas frente aos riscos. Eles observaram que os trabalhadores rurais até possuíam uma percepção do risco de contaminação da água e do solo, mas consideravam os efeitos menos agudos da atividade laboral envolvendo agrotóxicos como vômitos, dores de cabeça ou tonteiras como algo corriqueiro e sem maiores consequências. Em 2001 a ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária - iniciou o PARAPrograma de Análise de Registros de Agrotóxicos de Alimentos - que tem como objetivo avaliar os níveis de agrotóxicos presentes nos alimentos de origem vegetal. Em 2012 o PARA analisou 1665 amostras de alimentos oriundos dos 27 estados da federação, e 29% foram consideradas insatisfatórias (Figura 1). Foram consideradas insatisfatórias as amostras que apresentaram resíduos acima do limite máximo ( LMR) ou resíduos de produtos não autorizados pelo governo brasileiro (NA). 15 Figura 1: Percentual de resíduos de agrotóxicos em amostras de alimento. Resíduo dentro do LMR 2,5% 25 % 36% Sem Resíduo Resíduo acima do LMR 1,5% Resíduo de produtos NA Resíduo acima do LMR e produtos NA 35 % Fonte: (BRASIL, 2012). É importante ressaltar que esta análise considera satisfatória a amostra cuja quantidade de resíduo estiver dentro do LMR, ou seja, 65% dos alimentos consumidos no Brasil possui algum resíduo de agrotóxico. Intoxicações por agrotóxicos estão incluídas nas Enfermidades de Notificação Compulsória e em 2010, segundo a SINITOX - Sistema Nacional de Informações Tóxico Farmacológicas - foram registrados 5.463 casos de intoxicação por agrotóxicos no uso agrícola e 2.213 no uso doméstico dentre eles 8 casos chegaram a óbito. Dados reais de intoxicação por uso de agrotóxicos são difíceis de serem obtidos. A saúde humana pode ser afetada tanto pelo contato direto com o agrotóxico durante a atividade laboral como pelo contato indireto como o consumo de água, alimentos ou até mesmo animais contaminados. Outro problema também é o caso da intoxicação pelo uso ou exposição prolongada ao agrotóxico que muitas vezes os sintomas não são associados ao veneno. Para que os valores sejam mais próximos da realidade, alguns estudos revelam que os casos notificados devem ser multiplicados por 50, o que leva a um total de 383.800 casos de intoxicação por agrotóxico no ano de 2010 no Brasil (PERES et al., 2005; SISTEMA NACIONAL DE INFORMAÇÕES TÓXICAS FARMACOLÓGICAS, 2012). Uma das formas de se classificar os agrotóxicos é quanto a sua ação. A Tabela 1 apresenta os tipos de agrotóxicos mais utilizados na atividade agropecuária. Merece destaque os herbicidas que, segundo o SINDIVEG, o consumo no ano de 2012 foi de 939.438 t, um 16 aumento de 16,8 % em relação ao ano de 2010 (SINDICATO NACIONAL DA INDÚSTRIA DE PRODUTOS PARA DEFESA VEGETAL, 2013). Tabela 1: Classificação de agrotóxicos quanto a sua aplicação. Classificação Aplicação Inseticidas insetos,larvas com formigas Fungicidas Fungos Herbicidas Ervas daninhas Raticidas Roedores Acaricidas Ácaros diversos Nematicidas Nematóides Molusquicidas Moluscos, principalmente o caramujo da esquistossomose Fundgantes Insetos e bactérias Fonte: Organização Mundial de Saúde (1996). 1.1 Mecanismo de ação e uso dos herbicidas O modo de ação de um herbicida é o seu efeito final na planta. Herbicidas que possuem mesmo mecanismo de ação translocam na planta de forma semelhante e são classificados em uma mesma família. (MARCHI; MARCHI; GUIMARÃES, 2008). A Tabela 2 apresenta uma classificação resumida do mecanismo de ação do herbicida e sua forma de aplicação. Tabela 2: Resumo do mecanismo de ação e forma de aplicação de herbicidas. Forma de Aplicação Mecanismo de Ação I – No solo II – Aplicado às folhas III – Aplicado às folhas – sistêmico 1. 2. 3. 1. 2. 3. 1. 2. 3. Pigmentos Crescimento de Plantas FSII, sítios A e B FSII, sítio C Degradação de Membranas Metabolização do Nitrogênio Regula crescimento das plantas Síntese de aminoácidos aromáticos Síntese de aminoácidos de cadeia ramificada 4. Síntese de lipídios Fonte: Marchi, Marchi e Guimarães (2008). 17 Na presença de luz, plantas consomem água (H2O) e dióxido de carbono (CO2) produzindo gás oxigênio ( O2 ) e fixando carbono na forma de carboidrato, processo chamado de fotossíntese. Nas plantas verdes ela ocorre nos cloroplastos, organela celular onde estão localizadas as moléculas de clorofila que se excitam quando captam a energia luminosa e seus elétrons passam por uma série de aceptores que vão converter a energia eletrônica em energia química (VOET; VOET; PRATT, 2000). Na fotossíntese a energia da oxidação da água acionada pela luz é usada para produzir a Nicotiamida Adenina Dinueleotídeo Fosfato (NADPH) responsável pela redução do CO2 a carbono orgânico. Este processo ocorre em múltiplas etapas envolvendo dois centros de reação o Fotossistema II(FSII) e o Fotossistema I (FSI). No FSII a água é oxidada produzindo elétrons que são transportados para o FSI, onde o NADP+ é reduzido a NADPH. Cada fotossistema é ativado pela luz e os elétrons fluem do FSII para o FSI. Herbicidas da família das ureias bloqueiam o fluxo de elétrons do FSII para o FSI (VOET; VOET; PRATT, 2000). Quando as plantas emergem e começam realizar a fotossíntese, como o fluxo de elétrons está bloqueado, elas morrem devido a peroxidação dos lipídios na membrana. Herbicidas dessa natureza são aplicados no solo e na pós-emergência, são absorvidos pelas raízes e parte aérea e translocados pelo xilema (sistema vascular das plantas) (MARCHI; MARCHI; GUIMARÃES, 2008). 1.2 Herbicida diuron O diuron [ 3- (3,4-diclorofenil)-1,1-dimetiluréia], Figura 2, é um herbicida do grupo químico ureia, empregado para o controle de plantas daninhas em culturas de abacaxi, alfafa, algodão, banana, cacau, café, cana-de-açúcar, citrus, seringueiras e uva. Sendo também indicado também como dessecante de algodão e para fins não agrícolas como em ferrovias, rodovias, pista de aeroportos, etc (BRASIL, 2012). 18 Figura 2: Fórmula estrutural do diuron. Fonte: (BRASIL, 2012). Segundo a Du Pont do Brasil S.A. no ano de 2011 foram produzidos 9.245 t de diuron no Brasil (2011 apud ROCHA et al., 2013). 1.3 Ecotoxicidade do diuron Os agrotóxicos recebem classificações de acordo com a sua toxicidade à saúde humana e periculosidade ao meio ambiente, conforme indicado na Tabela 3. Tabela 3: Classificação de agrotóxicos quanto à toxicidade e perigo ao meio ambiente. Toxicidade Perigo ao Meio Ambiente Classe I – Extremamente Tóxico Classe II – Altamente Tóxico Classe III – Medianamente Tóxico Classe IV – Pouco Tóxico Classe I – Altamente Perigoso Classe II – Muito perigoso Classe III – Perigoso Classe IV – Pouco Perigoso Fonte: (BRASIL, 2012). Para classificar um agrotóxico quanto a sua toxicidade leva-se em conta sua capacidade de toxicidade aguda, mutagenicidade, carcinogenicidade, efeitos sobre a 19 reprodução e desenvolvimento e a neurotoxicidade. A toxicidade vai variar de acordo a quantidade do agrotóxico necessário para o desenvolvimento das patologias mencionadas acima. Esta quantidade é medida em DL50 que representa a dose letal do produto em 50% dos animais utilizados. O diuron recebe uma classificação III (BRASIL, 2012) em toxicidade, o que significa que a DL50 oral varia de 50 a 500 mg/Kg de massa corporal, o que numa pessoa adulta pode representa duas colheres de sopa. Ratos Wistar, machos com idade de 5 semanas tratados com doses diárias de diuron de 200 mg/Kg de peso corporal por 8 semanas desenvolveram necroses e hiperplasia em células da bexiga (ROCHA et al, 2013). Giacomazzi e Cochet (2004) realizaram uma extensa revisão bibliográfica com o objetivo de se levantar resultados das principais pesquisas realizadas no mundo sobre os efeitos tóxicos do diuron. A pesquisa revelou que diuron em humanos após sua ingestão crônica, observa-se perda de peso, anomalias no sangue, fígado e baço. Em cães observou-se hiperplasias no fígado e foi considerado moderadamente tóxico para peixes e invertebrados aquáticos. A classificação quanto o perigo ao meio ambiente avalia o potencial de transporte entre os diferentes compartimentos ambientais, potencial de persistência, solubilidade em água, adsorção/dessorção dos solos. O diuron recebe a classificação III (BRASIL, 2012), ou seja, é persistente no ambiente, se difunde na água do solo, sofre lixiviação e possui média solubilidade em água. A análise de solos de áreas cultivadas com cana-de-açúcar e com um histórico de utilização do herbicida diuron revelou que ele apresenta alta persistência e adsorção no solo colocando em risco até mesmo ambientes urbanos por contaminação do solo. A capacidade de persistência do diuron no solo foi medida através da reprodução, isolamento e caracterização de bactérias do tipo Acinetobater baumanni, responsáveis pela degradação do diuron. (ROQUE; MELO, 2000). Estudos de solo sob cultura de cebola na cidade de Ituporanga, SC, revelaram a presença de resíduos de diuron. O solo foi analisado em três profundidades: 0 a 20 cm, 40 a 60 cm e de 80 a 100 cm. O diuron foi detectado nas três profundidades, mas em maior quantidade na de 80 a 100 cm (PINHEIRO; MORAES; SILVA, 2011). Aplicando doses de diuron nas concentrações de 2mg/L e 20 mg/L em solos mais argilosos e determinando a relação entre a respiração básica e a biomassa microbiana do solo Vieira (1999) concluiu que o diuron prejudica a microflora do solo interferindo na sua fertilidade. 20 Field et al. (2003) ao estudar a ocorrência de diuron no solo, em águas superficiais e subterrâneas em áreas próximas a um cultivo de sementes de grama comercial, ele observou que o diuron aplicado no ano anterior ainda persistia no solo. Resíduos de diuron e seus metabólitos também foram detectados em águas superficiais e em lençóis freáticos rasos. 1.4 Radiação eletromagnética A radiação eletromagnética é o produto de campos elétricos e magnéticos oscilantes que atravessam o vácuo numa velocidade de 3,0.108 m.s-1, conhecida como a velocidade da luz. A luz visível é uma forma de radiação eletromagnética, que transfere energia de um espaço para outro (ATKINS; JONES, 2006). Um campo elétrico pode afetar partículas carregadas como o elétron, por esta razão a radiação eletromagnética é uma boa ferramenta para se estudar o átomo. Quando um elétron recebe um feixe de luz, é empurrado primeiro para uma direção e depois para outra oposta à da primeira periodicamente. Uma mudança completa de direção e intensidade até o retorno à situação inicial é chamado de ciclo, e o número de ciclos por segundos é chamado de frequência da radiação. A unidade de frequência, 1 hertz (1 Hz) é definida como um ciclo por segundo (ATKINS; JONES, 2006). 1 Hz = 1 s-1 (1) Como a radiação eletromagnética se propaga na velocidade da luz ( c ) e conhecendo a sua frequência ( f ) pode-se determinar o comprimento de onda (λ) pela fórmula: c=λ.f (2) Os olhos humanos são capazes de detectar a radiação eletromagnética de comprimento de onda entre 700 e 400 nm (ATKINS; JONES, 2006). Cada região do espectro eletromagnético corresponde a comprimentos de ondas diferentes, conforme indicado na Tabela 4. 21 Tabela 4: Comprimentos de onda da radiação eletromagnética. Tipo de Radiação Comprimento de onda (nm) Raios X e Raios ≤3 Ultravioleta 350 Luz Visível Violeta 420 Azul 470 Verde 530 Amarelo 580 Laranja 620 Vermelho 700 Infravermelho 1000 Microondas e ondas de rádio ≥ 3.106 Fonte: (ATKINS; JONES, 2006). De acordo com a teoria quântica, a radiação eletromagnética é formada por fótons, que são pacotes de energia e esta energia (E) é inversamente proporcional ao comprimento de onda conforme a equação 3: E = h. (3) Em que h é denominada constante de Planck e tem um valor aproximado de 6,63.10-34 J.s (BARBOSA, 2007). Pode-se concluir, portanto, que quanto maior o comprimento de onda, menor a energia associada a ela. Isto significa que se uma molécula for irradiada por um comprimento de onda na região do ultravioleta nem todos os comprimentos de onda serão absorvidos por ela causando transições eletrônicas. Por possuir comprimento de onda maior, a radiação na região do infravermelho apresenta menor energia e quando interage com a molécula causa alterações em seus modos vibracionais e rotacionais (BARBOSA, 2007). Quando a radiação no comprimento de onda na região do infravermelho interage com uma molécula ocorrem mudanças no seu momento dipolar devido a vibrações e rotações, dando origem a bandas de absorção na região do infravermelho (COTHULP; DALY; WIBERLY, 1997). 22 1.5 Modos de vibração Quando a radiação no comprimento de onda na região do infravermelho interage com uma molécula ocorrem mudanças no seu momento dipolar devido a vibrações e rotações. (STUART, 2004). Considerando uma molécula com N átomos ela terá 3N graus de liberdade. Como 3 deles são referentes à translação e três à rotação, o número de graus de liberdade da molécula referente a vibrações será de (3N – 6). Nas moléculas lineares os graus de liberdade referentes a rotações são dois, resultando em número de graus de liberdade correspondente a vibrações de (3N-5) (SAKANE et al., 2011). Tomando como exemplo a molécula de água (H2O) que é não-linear e possui 3 átomos o seu número de graus de liberdade será igual a 3: (a) estiramento simétrico; (b) estiramento assimétrico; (c)deformação angular; indicados pela Figura 3. Figura 3: Modos vibracionais da molécula de água. Fonte: (SAKANE et al., 2011). As vibrações dos estiramentos simétrico e assimétrico são devidas as alterações no comprimento da ligação O – H em que no simétrico as duas ligações apresentam sempre o mesmo tamanho e na assimétrica quando uma ligação se encurta a outra se alonga. A deformação angular é o resultado da variação no ângulo das ligações H – O – H (BARBOSA, 2007). 23 Outros modos de vibração ocorrem em moléculas mais complexas. Tomando como exemplo um hidrocarboneto em que o grupo CH2 é uma parte da molécula, somente ele apresenta dois modos de estiramento (simétrico e assimétrico) e quatro deformações angulares que podem ser simétricas e assimétricas, no plano e fora dele todos apresentados na Figura 4 (BARBOSA, 2007). Figura 4: Modos vibracionais do grupo CH2 em uma molécula mais complexa. Fonte: (BARBOSA, 2007). Modos vibracionais semelhante absorvem radiação em regiões semelhantes no espectro permitindo que certos grupos de átomos apresentem bandas em comprimentos de ondas semelhantes. Considerando os modos vibracionais de cada grupo de átomos, é possível, através do espectro no infravermelho determinar os grupos funcionais presentes na molécula possibilitando assim o uso da espectroscopia como uma ferramenta analítica. 1.6 Instrumentação 24 Espectrofotômetro no infravermelho é o instrumento utilizado para a obtenção do espectro no infravermelho. O modelo mais antigo, denominado espectrofotômetro de dispersão, era composto por uma fonte de radiação infravermelha contínua, um monocromador para dispersar a radiação e um detector sensível à radiação infravermelha. Este equipamento foi utilizado por muito tempo e, por apresentar algumas limitações, foi gradativamente sendo substituído pelo espectrofotômetro no infravermelho com Transformada de Fourier ou, simplesmente, FT-IR (sigla inglesa utilizada também no português) (SILVERSTEIN; WEBSTER; KIELMLE, 2005). O FT-IR (Figura 5) é composto por uma fonte de radiação, um separador de feixes (S) alinhado com a fonte de radiação, um espelho fixo, um espelho móvel perpendicular ao espelho fixo e um detector. O seu modo de funcionamento consiste no método interferométrico, que utiliza o interferômetro de Michelson (instrumento utilizado para realização de estudos sobre a luz, que foi aperfeiçoado pelo físico alemão naturalizado americano Albert Michelson em 1887). Figura 5: Diagrama representando os principais componentes de um espectrofotômetro de infravermelho com transformada de Fourier. Fonte: (HERLFER et al., 2006). 25 Quando uma radiação monocromática de comprimento deλ onda passa pelo instrumento, vai gerando um retardo no caminho óptico. À medida que este retardo aumenta, o sinal que chega ao detector irá variar de intensidade. Esse sinal vai passar por uma série de valores máximos e mínimos. Quando os retardos forem números inteiros múltiplos do comprimento de onda λ (δ = nλ; n = 0, ±1, ±2,...) os valores serão máximos e significa que os raios perpendiculares dos espelhos E1 e E2 estarão em fase quando chegarem ao separador de feixes S, proporcionando um valor máximo ao sinal quando o mesmo atinge o detector e por conseqüência a amplitude da radiação será duas vezes maior. 1 Quando δ = n + λ , para n = 0, ±1, ±2,etc, a intensidade do sinal cai a zero. O 2 sinal de interferência I(δ), a medida que E2 se move continuamente, varia de acordo com a equação 4: I(δ) = 0,5 I( ν ) cos 2πν δ (4) Onde I(δ) é a intensidade da fonte da radiação com número de onda ( ν = 1 ) e o fator λ 0,5 se justifica pelo fato de que somente 50% da radiação inicial chegam ao detector. O interferograma é o gráfico I(δ) versus δ ( Figura 6). Figura 6: (A) Interferograma de uma radiação monocromática; (B) de uma radiação policromática; (C) de uma radiação policromática, com uma amostra entre o interferômetro e o detector. Fonte: (STUART, 2004). 26 Se a fonte de radiação for policromática, o interferograma gerado é muito complexo devido ao número infinito de comprimentos de onda que passa ao mesmo tempo pelo interferômetro. Para a obtenção de um espectro no infravermelho utilizando o método interferométrico, é necessário primeiramente fazer o background, para a obtenção do interferograma sem a amostra, e em seguida, colocar a amostra entre o interferômetro e o detector. Como a amostra vai absorver alguns comprimentos de onda, suas intensidades serão reduzidas. Posteriormente, com a utilização de um método matemático chamado transformação de Fourier os interferogramas são transformados em espectros no domínio da frequência. O espectro de absorção da amostra é a subtração desses dois espectros. 1.7 Espectros de absorção no infravermelho A quantidade de energia absorvida está relacionada com a concentração de uma amostra, segundo a lei de Beer-Lambert. A absorbância (A) de uma amostra é diretamente proporcional à sua espessura (ℓ ) e concentração (c) conforme a equação 5: A = ε. c.ℓ (5) Em que ε representa a constante de proporcionalidade e é denominada a absortividade molar. Sendo assim, em um espectro de absorção na região do infravermelho pode se determinar a concentração através do número de onda e a absorbância (STUART, 2004). O espectro de absorção no infravermelho é um gráfico em que o eixo das abscissas é apresentado por número de onda (cm-1) que o inverso da frequência, e o eixo da ordenada, a porcentagem de Transmitância ( 0 a 100% ) ou valores de absorbância (BARBOSA, 2007). A absorbância (A) é a diferença entre os logaritmos da intensidade da luz que penetra na amostra (I0) e a intensidade de luz que é transmitida (I): I A = log I o − log I = log o I (6) 27 A transmitância (T) é definida, em %, como: T= I 100% Io (7) O que vale dizer que 50% de transmitância significa que metade da luz foi absorvida (STUART, 2004). As Figuras 7 e 8 representam os espectros do ácido lático em transmitância e absorbância, respectivamente. Figura 7: Espectro em transmitância do ácido lático. Fonte: (STUART, 2004). 28 Figura 8: Espectro em absorbância do ácido lático. Fonte: (STUART, 2004). Dois importantes métodos podem ser utilizados para a obtenção dos espectros: Espectroscopia de Transmissão e de Reflexão. Espectroscopia de transmissão baseia-se na absorção da radiação infravermelha em determinados comprimentos de onda à medida que a radiação atravessa a amostra, permitindo analisar amostras sólidas líquidas ou gasosas. Amostras sólidas podem ser analisadas através da técnica de pastilha (disco prensado) consiste em se misturar de brometo de potássio (KBr) à amostra que após a moagem em um gral de ágata liso é prensado à vácuo formando discos transparentes (STUART, 2004). A espectroscopia de reflexão se baseia no fato de que se uma amostra com índice de refração menor que o do meio transmissor é colocada em contato com uma superfície refletora, a luz atravessa a amostra produzindo um espectro de absorção (SILVERSTEIN; WEBSTER; KIELMLE, 2005). Segundo Sanches et al. (2008), a técnica FT-IR de Reflexão (UATR) é considerada de última geração. O alto índice de refração do elemento ATR propicia a obtenção de espectros de boa qualidade para a maior parte das substâncias. 29 1.8 Espectroscopia no infravermelho como ferramenta analítica Os espectros no infravermelho armazenam uma grande variedade de informações sobre a amostra, e aliado às aplicações de técnicas quimiométricas, ele se tornou uma ferramenta de análise qualitativa e quantitativa de química analítica. A análise espectroscópica no infravermelho é uma técnica analítica de resultados rápidos, que não gera subprodutos tóxicos e que vem sido aplicada em controle de qualidade, monitoramento ambiental e no estudo da adulteração da composição química de alimentos (COSTA FILHO; POPPI, 2002). Para Ferrão et al. (2003) técnicas espectroscópicas baseadas na radiação no infravermelha é uma ferramenta analítica que não causa impacto ambiental e apresenta vantagens como a não destruição da amostra e sem descartes de produtos nocivos ao meio ambiente. Morgano et al (2007) define a espectroscopia na região do infravermelho como método rápido, exato e com ampla aplicação em análises química e controle de qualidade de produtos da área de agricultura e alimentos. 30 2 OBJETIVO A seguir os objetivos que guiaram esta pesquisa. 2.1 Objetivo Geral Identificar a presença de herbicida residual em folhas de plantas (feijão) através da análise por espectroscopia no infravermelho com Transformada de Fourier (FT-IR), utilizando um herbicida formulado com o princípio ativo o diuron. 2.2 Objetivos específicos - Obter e analisar os espectros obtidos de amostras de herbicida - Identificar a banda marcadora do herbicida no FT-IR; - Avaliar, qualitativamente, por FT-IR, amostra de folhas de feijão que foram tratadas com o herbicida em questão ; - Verificar, por FT-IR, se existe alguma diferença em se aplicar herbicida no solo e diretamente na planta (feijão) ; - Verificar, por FT-IR, se a lavagem com água destilada de folhas de vegetais tratadas de diferentes formas com o herbicida é eficaz na remoção do herbicida diuron residual. 31 3 MATERIAL E MÉTODOS Os dados experimentais apresentadas neste trabalho foram obtidos de análises realizadas no Laboratório de Espectroscopia no Infravermelho do Instituto de Pesquisa & Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP) na cidade de São José dos Campos, estado de São Paulo e no Laboratório de Bioquímica das Faculdades Unificadas de Teófilo Otoni (FUTO) na cidade de Teófilo Otoni, estado de Minas Gerais. 3.1 Preparação das amostras O herbicida utilizado foi um formulado a base de diuron (46,8 %), que no Brasil é amplamente empregado em culturas de cana-de-açúcar. Para a obtenção de folhas de plantas tratadas pelo herbicida, foram necessários dois plantios com aplicações do herbicida de forma diferente : 1º Plantio - Herbicida aplicado no solo ; 2º Plantio - Herbicida pulverizado nas folhas. Os dois plantios foram realizados no Laboratório de Bioquímica das Faculdades Unificadas de Teófilo Otoni (FUTO) na cidade de Teófilo Otoni, estado de Minas Gerais, utilizando jardineiras com área de 4,32.10-2 m2 preenchidas com solo sem nenhum aditivo . Para cada plantio foram utilizadas três jardineiras diferenciadas pela quantidade do produto aplicado, a jardineira A não recebeu tratamento com o herbicida, a B recebeu tratamento com o herbicida na quantidade indicada pelo fabricante e a C recebeu tratamento com uma quantidade de herbicida 3,5 vezes maior que a recomendada pelo fabricante conforme indicado na Tabela 5. Os valores, em massa, contidos na Tabela 5 são proporcionais ao que está recomendado pelo fabricante que é de 2,5 Kg/ha (quilograma por hectare). Tabela 5: Tabela dos parâmetros utilizados para os dois plantios. Subgrupos Quantidade de Herbicida (g) A N.A. B 0,02 C 0,07 N.A. – não houve aplicação Fonte: A autora. 32 Nos dois plantios foram utilizados grãos de feijão do tipo carioca, escolhidos devido ao seu curto tempo de germinação e o pequeno porte. O herbicida aplicado nos dois plantios é um granulado dispersível e para ser utilizado deve-se preparar uma calda, que nada mais é que a sua dissolução em água. Numa balança eletrônica QUIMIS modelo BG2000 foi medido a massa do herbicida a ser utilizado, de acordo com a Tabela 5 e em seguida ele foi diluído em 2mL de água em um béquer de 10 mL. Nos dois plantios a calda foi preparada da mesma maneira como também o uso de equipamentos de proteção individual. 3.1.1 1º Plantio – Herbicida aplicado no solo Após o preenchimento das jardineiras (A, B, C ) com o solo e irrigação, foi aplicado, obedecendo as normas de segurança, diretamente no solo a calda preparada com as quantidades já estipuladas do herbicida e em seguida os grãos de feijão foram introduzidos no solo. As três jardineiras foram mantidas em laboratório sob mesma condição de iluminação conforme Figura 9. Figura 9: Imagens do 1º plantio após 7 dias. Fonte: A autora. Passados 15 dias foram colhidas as folhas de cada jardineira separadamente (A, B , C). 33 3.1.2 2º Plantio – Herbicida aplicado nas folhas Neste plantio os grãos de feijão foram introduzidos no solo irrigado nas três jardineiras. As jardineiras foram mantidas no laboratório por 7 dias nas mesmas condições de iluminação e irrigação do plantio anterior como mostra a Figura 10. Figura 10: Imagens do 2º plantio após 7 dias. Fonte: A autora. Após 7 dias a calda foi aplicada nas folhas. A aplicação aconteceu dentro de uma capela e a calda, preparada da mesma forma do 1º plantio, com o auxílio de um pequeno pulverizador com capacidade de 50mL, foi pulverizada sobre as folhas dos pés de feijão das jardineiras B e C separadamente . Após a aplicação da calda, as jardineiras foram mantidas no laboratório por mais 24 horas, para a secagem do herbicida e as folhas de cada jardineira foram colhidas separadamente (A, B, C). As Figuras 11 e 12 apresentam imagem dos pés de feijão 24 horas após a aplicação do herbicida, respectivamente. 34 Figura 11: Imagem da jardineira B após 24 horas da aplicação do herbicida nas folhas. Fonte: A autora. Figura 12: Imagem da jardineira C após 24 horas da aplicação do herbicida nas folhas. Fonte: A autora. 35 3.1.3 Preparação das folhas Após serem colhidas, as folhas foram separadas em duas categorias: (1) Sem lavagem: as folhas foram condicionadas, sem receber nenhum outro tipo de tratamento, em sacos de papel pardo, etiquetadas e levadas à estufa numa temperatura de 70ºC para secagem; (2) Com lavagem: antes de serem levadas à estufa a uma temperatura de 70 °C, as folhas foram lavadas em água corrente e posteriormente em água destilada e retirou-se o excesso de água retirado com o auxílio de papel toalha. Após a secagem, cada amostra de folha foi triturada em um almofariz preto de Agar e com um pistilo, também preto de Agar e condicionadas separadas e etiquetadas por grupos como mostra a tabela 6. Tabela 6: Amostras das folhas de feijão. Plantio Amostra Tratamento recebido A B C A B 1 C A B C A B 2 S. L. S.L. S.L. C.L. C.L. C.L. S. L. S.L. S.L. C.L. C.L. C.L. C S.L.- sem lavagem; C.L. – com lavagem Fonte: A autora. 3.2 Obtenção dos espectros por absorção na região do infravermelho 36 Neste trabalho foram utilizadas duas técnicas de obtenção de espectros: (1) Transmissão; (2) Reflexão. 3.2.1 Técnica FT-IR de transmissão utilizando pastilha de KBr As pastilhas utilizadas foram preparadas da seguinte forma: I.pesou-se em uma balança analítica METLER TOLED modelo AG135 1 mg da amostra e 150 mg de KBr (Brometo de Potássio) II. Em uma capela, verteu-se, primeiramente a amostra de herbicida e em seguida a de KBr em um almofariz preto de Agar e com um pistilo, também preto de Agar, a amostra foi submetida a maceração por 15 minutos. III.Após a maceração, em um laboratório com temperatura média de 20°C e umidade relativa do ar em 40 %, a amostra foi colocada em um pastilhador para ser prensada. Para tal procedimento foi utilizado uma prensa hidráulica PERKIN-ELEMER com capacidade de 15 ton e uma bomba à vácuo TECNAL modelo TE058 com 760 mmHg de capacidade. IV.Quando a amostra contida no pastilhador foi prensada, formou-se então a pastilha. Foi preparado uma pastilha de cada amostra de folha dos dois plantios (Tabela 6 ) e uma do herbicida puro, totalizando 13 pastilhas. Foram obtidos então 13 espectros, na faixa de 4000 a 700 cm-1 com resolução de 4cm-1 no modo de transmissão com 32 varreduras e temperatura de 20°C. O espectrofotômetro no infravermelho utilizado foi o modelo SPECTRUM 2000 da PERKIN ELMER (Figura 13). 37 Figura 13: Espectrofotômetro no infravermelho modelo SPECTRUM 2000 da PERKIN ELMER. Fonte: A autora. 3.2.2 Técnica FT-IR de reflexão (UATR) Das amostras de folhas do segundo plantio do tipo B e C conforme especificado na Tabela 6, foram obtidos espctros utilizando as técnicas FT-IR de Reflexão (UATR). As amostras trituradas foram simplesmente colocadas em contato a superfície do cristal de ZnSe com diamante e foi aplicado um torque correspondente a 100 N com o braço articulado (Figura 14 ). A dureza e a estabilidade química do diamante permite a obtenção direta de espectros de materiais com bom contato entre a amostra e o cristal (SANCHES et al., 2008). 38 Figura 14: Acessório UATR. Fonte: A autora. Com as técnicas FT-IR de Reflexão (UATR), foram obtidos 36 espectros infravermelhos faixa de 4000 a 700 cm-1, com resolução de 4 cm-1 com 32 varreduras a temperatura controlada a 20 oC. O espectrofotômetro utilizado foi Spectrum Spotlight 400 FT-IR da PerkinElmer (Figura 15). 39 Figura 15: Espectrofotômetro Spectrum Spotlight 400 FT-IR da Perkin Elmer. Fonte: A autora. 3.2.3 Pré-processamento dos dados Todos os espectros obtidos foram pré-processados com software Spectrum 5.3 (PerkinElmer) e realizadas as correções de linha de base, suavização espectral utilizando o algoritmo Savistzky Golay (9 pontos) e absorbância. 3.3 Análise dos dados Os espectros foram analisados através de dois métodos: (1) Inspeção visual direta e (2). Cálculo da intensidade relativa. 3.3.1 Inspeção visual direta 40 Segundo Barbosa (2007), a interpretação dos espectros poder ser feita pela observação visual de algumas bandas características para a confirmação da presença de grupos funcionais. Tendo como base a fórmula estrutural da molécula de diuron (Figura 2) , o espectro do herbicida foi analisado identificando bandas de grupos funcionais presentes na molécula do herbicida e suas respectivas atribuições aproximadas. A análise visual dos espectros obtidos das folhas de feijão foi também utilizada para a identificação de bandas de grupos químicos presentes em folhas de plantas. Os espectros de amostras das folhas de feijão com diferentes concentrações do herbicida foram comparados entre si com a finalidade de se identificar alterações nos contornos de banda que indicasse a possível presença do herbicida. 3.3.2 Cálculo da intensidade relativa Para Shepherd e Walsh (2007) é possível detectar, através dos espectros no infravermelho, alterações químicas no tecido das plantas observando o aumento ou diminuição da intensidade de algumas bandas. Portanto, os espectros obtidos das folhas de feijão foram comparados entre si procurando identificar a presença de bandas semelhantes com diferenças de intensidade. Para o cálculo da intensidade relativa, escolhe-se uma banda de maior intensidade, avaliada pela sua altura, e determina-se a razão entre a sua intensidade e a intensidade das demais bandas que se deseja avaliar. O cálculo da intensidade relativa possibilita também calcular a correlação entre os espectros, definindo uma proporcionalidade. 41 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO A seguir os resultados deste trabalho e as discussões acerca deles. 4.1 Espectros infravermelhos com técnicas de transmissão Abaixo, os espectros infravermelhos com técnicas de transmissão.’ 4.1.1 Herbicida diuron A Figura 16 apresenta o espectro de absorção na região do infravermelho do herbicida a base de diuron. Figura 16: Espectro de absorção na região do infravermelho do herbicida à base de diuron. 1.6 1.4 Absorbância 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 Número de onda cm-1 Fonte: A autora. A Tabela 7 apresenta as regiões espectrais onde se encontram bandas características dos grupos funcionais presentes na molécula de diuron e suas atribuições de algumas bandas (BARBOSA, 2007). 42 Tabela 7: Número de ondas e descrição aproximada do espectro do herbicida. Fórmula Estrutural do diuron Número de onda Atribuições aproximadas (cm-1) Região 1 :3600 a 3200 3621 3306 3285 Estiramento da ligação N-H 3093 Estiramento da ligação C-H em anéis aromáticos Estiramento assimétrico da ligação C-H no grupo –CH3 Estiramento simétrico da ligação C-H no grupo –CH3 Região 2: 3100 a 2850 2934 2878 Região 3: 2000 a 1600 1655 Estiramento da ligação C=O Deformação angular da ligação N-H em amida II 1587 Estiramento da ligação compostos aromáticos Região 4: 1590 a 1400 1524 1492 1477 C=C em Deformação angular assimétrica da ligação –C - H continuação Região 5: 1400 a 1300 1395 1389 Deformação ligação – C- H angular 1190 1160 1133 1010 Deformação angular ligação =C-H simétrica da Região 6: 1200 a 1000 no plano da Região 7: 900 a 690 903 866 814 783 757 724 Deformação angular fora do plano de ligações =C-H Estiramento da ligação C-Cl Deformação angular tipo balanço da ligação -CH Fonte: (Barbosa, 2007). 43 Grupos alquila apresentam absorções devido a vibrações de estiramento de ligações C – H e de deformações angulares do grupo CH3. No herbicida em estudo, as bandas de 2934 e 2878 cm-1 são atribuídas aos estiramentos assimétrico e simétrico da ligação C – H, respectivamente ; as bandas em 1477 e 1389 cm-1 às vibrações de deformações angulares assimétrica e simétrica da ligação C-H, respectivamente e a 724 cm-1 à vibração de deformação angular tipo balanço da ligação – C – H. A banda em 1395 cm-1 se desdobra em dubletes pela presença de vários grupos CH3 (BARBOSA, 2007). Em compostos aromáticos a absorção é devido aos modos de vibração do estiramento e da deformação angular das ligações C = C e = C – H. As bandas em 1587 e 1524 cm-1 correspondem ao estiramento da ligação C = C e as bandas na região de 1200 a 1000 cm-1, à deformação angular no plano da ligação = C – H e 1000 a 850 cm-1 à deformação angular fora do plano da ligação –C-H do anel benzênico presente no diuron (BARBOSA, 2007). A banda de 1655cm-1 é atribuída a um estiramento da ligação C=O e a deformação angular das ligações N-H devido as ligações de hidrogênio do grupamento amida também presente na molécula do diuron (BARBOSA, 2007). A vibração do estiramento da ligação CCl absorve aproximadamente em 780 cm-1 (BARBOSA, 2007). 4.1.2 Interação herbicida – planta Na figura 17 está representado o espectro obtido da amostra A do 1º plantio (herbicida aplicado no solo com lavagem. 44 Figura 17: Espectro de absorção na região do infravermelho da amostra de folha de feijão A do 1º plantio com lavagem. 1,6 1,4 Absorbância 1,2 -1 1384 cm 1,0 -1 1076cm -1 1055 cm 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 Numero de onda (cm-1) Fonte: A autora. Segundo Shulz e Branska (2007), os grupos de substâncias de uma planta pode ser dividido em duas etapas: (1) Metabólitos primários , substâncias importantes para o desenvolvimento inicial da planta e responsáveis pelo crescimento normal e reprodução, que , dentre outros, os mais importantes são as proteínas, lipídios e carboidratos; (2) Metabólitos secundários, possuem uma função ecológica e atuam na defesa das plantas. A Tabela 8 indica algumas bandas, presentes em plantas (SHULZ; BARANSKA, 2007) e que, por inspeção visual, foram identificadas no espectro da amostra A do 1º plantio (herbicida aplicado no solo). As bandas de 1076 e 1055cm-1 podem ser atribuídas ao estiramento das ligações C=O e C – C nas moléculas de celulose. 45 Tabela 8: Número de ondas e descrição aproximada do espectro da folha da planta do primeiro plantio (herbicida aplicado no solo) amostra A ( sem herbicida). Grupos Químicos Representação α-Helix Estrutura desordenada Lignina Polissacarídeos Proteínas Celulose Número de Onda (cm-1) 1649 1549 Atribuição Aproximada Referencia Amide I Amide II Shultz e Baranska (2007) 1384 C-H deformação Ramamurthy e dos grupos CH2 Kannan (2007) ou –CH3 1076 1055 estiramento (CO), Shultz e estiramento (CC), Baranska (2007) Fonte: A autora. A Figura 18 apresenta a estrutura molecular da celulose e lignina. Figura 18: Estrutura molecular da celulose e lignina. Fonte: A autora. Na Figura 19 estão apresentados os espectros das três amostras de folhas (A, B e C) do primeiro (herbicida aplicado no solo) com lavagem. 46 Figura 19: Espectros das amostras do primeiro plantio A, B e C com lavagem. 1385 cm-1 Absorbância Amostra C Amostra B Amostra A 4000 3500 3000 2500 2000 1500 Numero de Onda (cm-1) 1000 500 Fonte: A autora. As amostras A, B e C possuem uma concentração crescente de herbicida, em A ela é zero e aumenta de forma gradativa em B e em C ( Tabela 5 ). Numa inspeção visual nos três espectros do primeiro plantio com lavagem (Figura 19) observa-se alteração no contorno de algumas bandas, especialmente na região de 1000 – 1200 cm-1 conforme a Figura 20. Figura 20: Espectros das três amostras de folhas de planta do primeiro plantio com lavagem na região de 1300 – 900 cm-1. -1 1103 cm -1 1150 cm Amostra C Amostra B Amostra A 1300 1200 1100 1000 Numero de onda (cm-1) Fonte: A autora. 900 47 Além das alterações no contorno das bandas, as bandas de 1103 cm-1 e 1150 cm-1 presentes no espectro da amostra A não aparecem nos espectros das amostras B e C ( figura 20). Observou-se a presença das bandas entre 1105 cm-1 e 1110 cm-1 correspondentes a estiramento das ligações C – O e C – C da molécula de celulose (Tabela 8). A celulose (Figura 18) é um polímero presente na parede celular das plantas, altamente resistente que confere rigidez, e por consequência, proteção à estrutura vegetal. As alterações nas bandas desta região do espectro sugere que o diuron translocou para os tecidos das folhas, o que confere com Musumeci et al. (1995). Eles simularam um tratamento de pré-emergência cultivando cana-de-açúcar em lisímetros. A concentração do diuron aplicado no solo foi de 500 g/L. Análises dos extratos das folhas e dos colmos revelam a presença de diuron na concentração de 40%. Foram extraídos o caldo do colmo e nele não foi detectado a presença de diuron. Eles concluíram que houve a translocação do diuron e que ele foi metabolizado nos tecidos de cana através da conjugação com glucosídeos ou proteínas (RAVEN; RAY; EICHHORN, 2010). A Tabela 9 indica que a razão entre a intensidade das bandas de 1385 cm-1 e 1650 cm1 aumenta com o aumento da concentração de herbicida que foi aplicado no solo sinalizando uma forte correlação de proporcionalidade entre a intensidade relativa destas bandas com a quantidade de herbicida que foi aplicado no solo. Tabela 9: Intensidade relativa das bandas 1385 e 1650 cm-1 em função da quantidade de herbicida aplicado no solo. 1 Quantidade de herbicida(g) 0 Amostra 0,5446 A Amostra 0,02 1,404 B Amostra 0,07 2,664 C Fonte: A autora. A Figura 21 mostra a curva de calibração da massa versus intensidade relativa das bandas de 1385 e 1650 cm-1 com coeficiente de correlação 0,9955 comprovando a linearidade e consequente proporcionalidade. 48 Figura 21: Curva de calibração da concentração versus intensidade relativa das bandas de 1385 e 1650 cm-1 do primeiro plantio (herbicida aplicado no solo). 3,0 r = 0,9955 I1384/1650 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 -0,01 0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 Quantidade de Herbicida aplciado no solo (g) Fonte: A autora. Na Figura 22 fica ainda mais evidente a proporcionalidade entre a quantidade de herbicida aplicado no solo e a intensidade relativa das bandas de 1385 e 1650 cm-1. Figura 22: Histograma de concentrações versus intensidade relativa das bandas de 1385 e 1650 cm-1 do primeiro plantio (herbicida aplicado no solo). 2,5 I 1385/1650 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 A B Amostras Fonte: A autora. C 49 Assim, observa-se que o aumento da intensidade da banda de 1385 cm-1 é proporcional a quantidade de herbicida aplicado no solo. No espectro do herbicida puro (Figura 16) aparece uma banda de 1389 cm-1, o que pode sugerir, como a resolução do equipamento é de 4cm-1, que a banda de 1385 cm-1 é devido a interação do diuron com a estrutura da planta e que o aumento da intensidade desta banda pode ser devido à presença do diuron ou uma forma de defesa da planta mediante um agente externo. Ramamurth e Kannan (2007) utilizaram a espectroscopia por absorção na região do infravermelho para analisar os componentes químicos de plantas. A planta analisada foi a Calotropis Gigantea Linn, comumente encontrada em áreas rurais e a beira de estradas. Eles analisaram 6 amostras desta planta: cinco retiradas de regiões com alta concentração de indústrias na Índia e uma foi utilizada como controle. O objetivo era comparar a composição química da planta e avaliar como a poluição interage com a mesma através da espectroscopia no infravermelho. Em todas as amostras o espectro por absorção no infravermelho apresentou uma banda de absorção na região entre 1370 – 1434 cm-1 que recebeu a atribuição de deformação da ligação C-H, -CH2 ou –CH3 presente na lignina. A lignina (Figura 18) é um polímero de alto teor de carbono e o segundo componente mais abundante da parede celular depois da celulose. Ela aparece impregnando as paredes de alguns tecidos como o xilema (sistema vascular da planta) conferindo resistência e rigidez exercendo uma função mecânica ou de sustentação e proteção (RAVEN; RAY; EICHHORN, 2010). Diante dos apontamentos acima pode-se sugerir que o aumento da intensidade da banda de 1385 cm-1 pode ser atribuída a vibração da deformação angular da ligação C-H dos grupos – C-H, -CH2 ou –CH3 presentes na lignina. Segundo Shepherd e Walsh (2007), a análise das bandas de ligações do tipo N-H, O-H ou C-H pode ser utilizada para a análise de material biológico e os espectros podem fornecer informações sobre a interação entre o solo e a composição da planta. As variações da intensidade de banda em 1385 cm-1 atribuída à vibração da deformação angular da ligação C-H podem indicar a interação da planta com o diuron seja de defesa, ou de sobrevivência. Na Figura 23 estão representados os espectros das amostras A, B e C do 2º plantio (herbicida pulverizado nas folhas). 50 Figura 23: Espectros das amostras do 2º plantio (herbicida pulverizado nas folhas) A, B e C com lavagem. Absorbância 1385 cm-1 Amostra C Amostra B Amostra A 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 -1 Numero de Onda (cm ) Fonte: A autora. Visualmente não se observa muitas diferenças entre os espectros obtidos das amostras do 2º plantio A, B e C com lavagem (Figura 23). Nas folhas pulverizadas com o diuron, observou-se a formação de uma espécie de revestimento e a Figura 24 sinaliza que não existe uma correlação significativa entre a quantidade de herbicida pulverizado e a intensidade relativa das bandas de 1385 e 1650 cm-1. Diante desta observação, utilizou-se a análise multivariada para verificar o efeito de lavagem nas folhas pulverizadas com diuron. 51 Figura 24: Histograma da concentração versus intensidade relativa das bandas de 1385 e 1650 cm-1 do segundo plantio (herbicida pulverizado na folha). 0,7 0,6 I 1385/1650 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 A B Amostras C Fonte: A autora. 4.2 Espectros infravermelhos com técnicas de reflexão (UATR) A técnica de análise multivariada utilizada neste trabalho foi à análise de agrupamento hierárquico que possibilita construir agrupamentos entre as amostras de acordo com as suas similaridades representando-as de maneira bidimensional, através dos dendrogramas, que são diagramas que representam a similaridade entre pares de amostras (MOITA NETO; MOITA, 1998). Uma matriz Dmxn elementos (m são as linhas que correspondem às amostras e n as colunas que correspondem às variáveis executadas sobre a amostra) é construída a partir do conjunto de dados definida por: D= , (8) 52 A j-ésima variável é representada por um vetor coluna e a i-ésima amostra é representada por um vetor linha chamado de vetor resposta que representa um ponto no espaço n-dimensional. Cada ponto no espaço n-dimensional representa uma amostra que pode ser agrupada com outros pontos que estejam próximos e mais se assemelham a ele. Na análise de agrupamento hierárquico as amostras semelhantes , segundo as variáveis escolhidas, se agrupam produzindo um dendograma, uma ferramenta útil na visualização de semelhanças entre amostras representadas por ponto em espaço com dimensão maior que 3 (MOITA NETO; MOITA, 1998). Pares de pontos próximos são agrupados usando a medida de distância euclidiana (xab), = , (9) Substituídos por um novo ponto localizado na metade da distância entre eles. Repetese este procedimento até que os pontos estejam agrupados em um só ponto construindo assim um dendograma (MOITA NETO; MOITA, 1998). A classificação dos dados através de agrupamento hierárquico foi realizada pelo programa estatístico MINITAB 15. Os resultados mostrados na Figura 25 conseguiram diferenciar as amostras B e C sem lavagem das B e C com lavagem. As amostras B e C sem lavagem formaram um grupo e depois agruparam-se com o grupo C com lavagem e finalmente com o B com lavagem. 53 Figura 25: Dendrograma das amostras B e C com e sem lavagem do segundo plantio (herbicida pulverizado na folha). Dendrograma Distance 3.18 2.12 1.06 0.00 1 2 5 3 4 6 7 9 8 10 11 12 19 20 21 22 23 24 13 14 15 16 17 18 Amostra B Amostra B Amostra C Amostra C com lavagem Sem lavagem Sem lavagem com lavagem Fonte: A autora. Segundo Moita Neto e Moita (1998) amostras semelhantes segundo as variáveis escolhidas se agrupam entre si e quanto menor a distância entre os pontos, maior a semelhança entre as amostras. O primeiro agrupamento é observado entre os espectros das amostras B e C sem lavagem a uma distância de aproximadamente 2,5, indicando a maior semelhança nos espectros das amostras B e C sem lavagem. Houve uma separação nítida dos espectros das amostras que receberam ou não, lavagem, isto é, os espectros das amostras B e C sem e com lavagem são diferentes. Os espectros médios obtidos com a técnica de UATR das amostras A, B e C do 2º plantio (herbicida pulverizado na folha) respectivamente. estão apresentados nas Figuras 26 e 27 54 Absorbância Figura 26: Espectros médios da amostra A sem lavagem e das amostras B com e sem lavagem do 2º plantio (herbicida aplicado no solo). Amostra B com lavagem 1800 1600 1400 1200 1000 Amostra B sem lavagem Amostra A sem lavagem 800 -1 Numero de onda (cm ) Fonte: A autora. Absorbância Figura 27: Espectros médios das amostras A sem lavagem e C com e sem lavagem do 2º plantio (herbicida aplicado no solo). Amostra C com lavagem Amostra C sem lavagem Amostra A sem lavagem 1800 1600 1400 1200 1000 800 Numero de Onda (cm-1) Fonte: A autora. Para verificar se a lavagem diminuiu a quantidade de herbicida residual presente nas folhas, os espectros obtidos com técnicas de UATR de reflexão das amostras B e C sem e com lavagem foram comparadas com o espectro da amostra A sem lavagem. A diminuição das intensidades de bandas, provavelmente de diuron mostradas nas Figuras 26 e 27 foi 55 observado, o que indica o efeito de lavagem para diminuição de herbicida pulverizado nas folhas. Nos espectros médios obtidos com a técnica UATR ( Figuras 26 e 27) observa-se a diminuição de intensidade das bandas, provavelmente de diuron, nas amostras com lavagem. A semelhança dos espectros A e C sugere a eficiência de lavagem para diminuição de herbicida pulverizado nas folhas. 56 5 CONCLUSÃO Diante dos resultados obtidos, podem-se fazer algumas considerações: • O diuron interage com os tecidos da planta; • O diuron aplicado no solo interage de forma mais expressiva com a estrutura da planta do que quando aplicado nas folhas; • A banda 1385 cm-1 pode ser utilizada com marcadora do herbicida; • A lavagem com água pode ser eficiente para a remoção do herbicida. Portanto, a técnica de espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier pode ser utilizada como uma ferramenta analítica para a identificação da presença de herbicida diuron e sua alteração provocada na estrutura das plantas. Podendo ser utilizada como instrumento de análise de controle ambiental devido ao seu resultado rápido e exato. Fica como proposta futura, a análise, por espectroscopia no infravermelho, dos efeitos acumulativos do diuron em plantas. 57 REFERÊNCIAS ATKINS, P.; JONES, L. Princípios de química: questionando a vida moderna e o meio ambiente. 3. ed. Porto Alegre: Bookman, 2006. 968p. BARBOSA, L. C. A. Espectroscopia no infravermelho na caracterização de compostos orgânicos. Viçosa, MG: UFV, 2007. 189p. BÍBLIA. Português. Bíblia de estudo pentecostal. [s.l.]: CPAD, 2008. (Provérbios, 1:7a). BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA. Monografias de agrotóxicos. Disponível em: <http://portal.anvisa.gov.br/wps/wcm/connect/1145da0047458fc598e0dc3fbc4c6735/d25.pdf ?MOD=AJPERES>. Acesso em: 26 out. 2012. COSTA FILHO, P. A.; POPPI, R. J. 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