26-30 Chorilli - Latin American Journal of Pharmacy

Latin American Journal of Pharmacy
(formerly Acta Farmacéutica Bonaerense)
Trabajos originales
Recibido el 24 de marzo de 2006
Aceptado el 03 de agosto de 2006
Lat. Am. J. Pharm. 26 (1): 26-30 (2007)
Avaliação Histológica da Pele Após Exposição à Gel Acrescido
de Hialuronidase Associado ou Não a Ultra-Som
Marlus CHORILLI 1,2*, Vivian ZAGUE 1,
Maria Cristina de Almeida Prado RIBEIRO 1, Gislaine Ricci LEONARDI 1,
Maria Sílvia Mariani PIRES-DE-CAMPOS 1 & Maria Luiza Ozores POLACOW 1
Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade Metodista de Piracicaba,
Rodovia do Açúcar, km 156, 13400-911, Piracicaba - SP, Brasil.
2 Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas,
Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara, Departamento de Fármacos e Medicamentos,
Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho,
Rodovia Araraquara-Jaú, km 1, 14801-902, Araraquara - SP, Brasil.
1
RESUMO. O objetivo deste trabalho foi verificar os efeitos na pele de suínos machos de gel (G) contendo
hialuronidase (H) associado ou não ao ultra-som (US). Em diferentes áreas aplicou-se G; G+H; G+H+US e
mesoterapia (M). Fragmentos de pele foram processados em parafina. Para evidenciar ácido hialurônico
(AH) utilizou-se coloração com Alcian Blue (AB) e para morfometria coloração com Hematoxilina/Eosina.
Observou-se que G+H e G+H+US não reduziu coloração pelo AB nem apresentou diferenças significantes
pela morfometria. Já H aplicada mesoterapicamente diminuiu coloração pelo AB. Logo, o uso da H associada ou não com US não mostrou-se eficaz na redução de HA.
SUMMARY. “Histological Evaluation of the Skin After Exposition to the Gel Increased of Hyaluronidase Associated or not to Ultrasound”. The objective of this work was to verify the effect in the skin of male swines gel (G)
containing hyaluronidase (H) associated or not to ultrasound (US). In different areas was applied G; G+US;
G+H; G+H+US and mesotherapy (M). Skin fragment was processed in paraffin. To evidence hyaluronic acid
(HA) coloration with Alcian Blue (AB) was used and coloration with Hematoxilin/Eosin for morphometry. It
was observed that G+H and G+H+US did not reduce coloration for the AB nor presented significant differences
for the morphometry. When H was applied mesoteraphycally coloration for the AB diminished. Then, the use of
H associated or with US did not seem efficient in the HA reduction.
INTRODUÇÃO
Do ponto do vista clínico, a lipodistrofia ginóide, conhecida popularmente como celulite é
um espessamento não inflamatório das capas
subepidérmicas, às vezes doloroso, que se manifesta em forma de nódulos ou placas de variada extensão e localização 1.
A lipodistrofia ginóide, além de trazer desagrados do ponto de vista estético, pode também
acarretar complicações nas zonas acometidas e
conseqüente diminuição das atividades funcionais, podendo levar à quase total imobilidade
dos membros inferiores, além de dores constantes e problemas psicológicos. A alteração inicial
que leva à formação deste quadro parece ser a
deterioração da substância intersticial e rede ca-
pilar, levando à retenção excessiva de líquidos
na derme e em tecidos subcutâneos 2.
Para Lotti et al. 3 as mudanças patológicas
são edema, alargamento dos vasos linfáticos na
derme, e um aumento no volume de células
adiposas no subcutis.
O aspecto “casca de laranja” presente em um
tecido com lipodistrofia ginóide é formado pelas
alterações da arquitetura da derme e tecido subcutâneo associada à desidratação epidérmica 4.
Estudos de Rosenbaum et al. 5 apontam para
a anatomia topográfica do tecido adiposo, na
qual distingüem-se duas camadas que são separadas por uma fáscia superficial. A camada mais
externa, que fica em contato com a derme, chama-se areolar, sendo composta por adipócitos
PALAVRAS CHAVE: Hialuronidase, Histoquímica, Morfometria, Ultra-som.
KEY WORDS: Hyaluronidase, Histochemical, Morphometry, Ultrasound.
*
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Autor a quem dirigir correspondência: E-mail: [email protected]
ISSN 0326-2383
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globulares e volumosos, em disposição vertical,
com vasos sangüíneos numerosos e delicados.
Já a camada mais profunda, chamada de lamelar, apresenta células fusiformes, menores e com
disposição horizontal, onde os vasos são de
maior calibre.
Em mulheres, o limite derme-hipoderme é
irregular e os septos de tecido conjuntivo formam vigas verticais. Dessa forma, se houver hipertrofia da hipoderme, ocorrerá formação de
herniações para a derme reticular, resultando no
aspecto “casca de laranja” na pele. Em homens,
o limite derme-hipoderme é liso, os septos são
mais espessos e oblíquos e quando ocorre hipertrofia da hipoderme, esses septos, por serem
oblíquos, pressionam as células adiposas contra
a musculatura subjacente em direção à derme,
sem formar, portanto, herniações. Tais diferenças estruturais na fáscia superficial são diferenciadas por hormônio sexual feminino estrógeno 5. Isto explica a presença de lipodistrofia
ginóide mesmo em mulheres esbeltas, pois reflete a expansão do tecido adiposo para dentro
da derme, quando o próprio tecido e sua cápsula de tecido conjuntivo circundante se encontram comprimidos 5.
Alguns fatores como idade, hormônios, sol e
mudanças bruscas de peso provocam o relaxamento e estiramento do sistema fascial, já que
estão intimamente relacionados com as regiões
de aderência da fáscia superficial em virtude de
que as áreas de menor aderência têm menor
grau de estiramento e menor volume. Tais elementos, associados às áreas de gravidade, provocam ptose dos tecidos moles e formação de
lipodistrofia ginóide 6.
Com relação aos agentes etiológicos ou etiopatogenia da lipodistrofia ginóide, estão presentes os fatores desencadeantes, predisponentes e
agravantes 1,7,8.
Os fatores desencadeantes compreendem as
alterações de natureza hormonal que ocorrem
na adolescência. Dentre os hormônios envolvidos no processo de lipodistrofia ginóide, o principal é o estrógeno, que é o iniciador do processo e o principal responsável pelo agravamento da mesma, agindo ao nível de 8: a) substância fundamental amorfa, provocando alteração
do colágeno e das glicosaminoglicanas, ocasionando conseqüentemente o edema intersticial
(devido ao acúmulo de água) e levando a fibroesclerose característica da lipodistrofia, b) adipócitos, aumentando a resposta dos receptores
alfa-antilipolíticos e estimulando a LPL, enzima
responsável pela lipogênese e c) microcirculação, provocando diminuição do tônus venoso
e vasodilatação.
Os fatores predisponentes são os múltiplos
fatores hereditários como: sexo; raça; biotipo
constitucional; distribuição do tecido adiposo;
número, disposição e sensibilidade dos receptores das células afetadas pelos hormônios. Já entre os fatores agravantes estão hábitos alimentares, sedentarismo, fatores emocionais, hábitos
de vida, patologias, medicamentos e gravidez 8.
Uma das mais importantes unidades funcionais do tecido conjuntivo adiposo é a unidade
matriz-intersticial que é constituída por células
(especialmente fibroblastos), pela matriz extracelular, por uma parte fibrosa (fibras colágenas,
elásticas e reticulares) e por substância fundamental (constituída de proteoglicanas, glicoproteínas e ácido hialurônico) 8.
As glicosaminoglicanas (GAGs) são cadeias
de polissacarídios compostas de unidades repetidas de dissacarídeos, ligadas covalentemente
às proteínas para formar moléculas de proteoglicana com alta propriedade hidrofílica 9. Concentram-se principalmente na matriz extracelular,
na periferia e entre a elastina e o colágeno. Sete
grupos maiores de glicosaminoglicanas têm sido
distinguidos: ácido hialurônico, condroitina-4sulfato, condroitina-6-sulfato, dermatana sulfato,
heparana sulfato, heparina, queratana sulfato,
sendo que o principal deles é o ácido hialurônico 3. Na pele, o ácido hialurônico provê uma alta hidratação que facilita o movimento de células que ocorre em estágios prematuros de dano,
inflamação ou cicatrização de feridas. Ele também pode contribuir para as propriedades elásticas da derme por formação de uma rede de
estruturas helicoidais, e por diferenciação epidermal 10.
Na lipodistrofia ginóide, alterações nos fibroblastos causadas principalmente pelo estrógeno
levam a modificações estruturais das GAGs com
hiperpolimerização, elevando seu poder hidrofílico e a pressão osmótica intersticial. Essa capacidade hidrofílica das GAGs resulta em grande
incorporação de água na matriz celular o que a
torna a principal responsável pela pressão osmótica intersticial. Isso gera turgor que faz com
que a matriz resista às forças compressoras, demonstrando, portanto, que há aumento da concentração das GAGs 9.
Para atuar no tecido adiposo, principal região acometida pela lipodistrofia ginóide, a
substância ativa precisa permear a pele e por is-
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CHORILLI M., ZAGUE V., RIBEIRO M.C. de A.P., LEONARDI G.R., PIRES-DE-CAMPOS M.S.M. & POLACOW M.L.O.
so promotores físicos de absorção, como o ultra-som (US), vêm sendo utilizados como uma
alternativa à mesoterapia, técnica invasiva e bastante questionada nos dias atuais. A desorganização das células da camada córnea provocada
por esses agentes é um importante mecanismo
para acelerar a penetração cutânea 11.
A hialuronidase, enzima que despolimeriza o
ácido hialurônico, reduzindo a viscosidade do
meio intercelular, aumentando a permeabilidade
de membranas e vasos sangüíneos, levando à
reabsorção de excesso de fluidos e mobilizando
os edemas 10, tem sido utilizada em associação,
ou não, com o US na atenuação da lipodistrofia
ginóide.
Nas áreas afetadas pela lipodistrofia ginóide,
tem-se aumento de GAGs, sendo o ácido hialurônico a principal GAG no tecido conjuntivo.
Lotti et al. 3 observaram que o aumento da concentração das GAGs é a causa da retenção hídrica, edema e fibroesclerose.
Dentre as substâncias ativas usadas nas formulações tópicas para o tratamento da lipodistrofia ginóide tem-se a hialuronidase. Porém, a
hialuronidase é uma molécula muito grande e
para facilitar a penetração desta na pele tem-se
recorrido ao emprego de técnicas físicas como a
fonoforese e a iontoforese.
Trata-se também de uma molécula sensível
que necessita de cuidados especiais para manter-se estável na formulação. Logo, estudos de
eficácia são necessários para avaliar-se o efeito
desta enzima no tratamento da lipodistrofia ginóide.
O objetivo deste trabalho foi verificar, na
pele de suínos, os efeitos de um gel (G) contendo hialuronidase (100 UTR/g) associado ou não
ao uso do US através de análises histoquímica e
morfométrica. Foi realizado também um estudo
comparativo com a mesoterapia.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizados cinco suínos machos, híbridos (Landrace X Large White), com 35 dias.
Após tricotomia de 5 áreas (4 cm 2) no dorso dos
animais, realizou-se os seguintes tratamentos
diários em áreas padronizadas: gel, gel + US, gel
+ hialuronidase, gel + hialuronidase + US e mesoterapia (realizada em 4 sessões).
O gel foi constituído de 5% de propilenoglicol, 1% de ácido carboxivinílico, 0,2% de metil
dibromoglutaronitrila e fenoxietanol, água destilada e trietanolamina.
O gel foi acrescido, ou não, de hialuronidase
(100 UTR/g).
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O US utilizado foi o KW Sonomaster Microcontrolado, freqüência de 3 MHz, intensidade
de 0,2 W/cm2, com emissão contínua, por 2 minutos.
Para a mesoterapia, utilizou-se ampolas com
2 mL de hialuronidase a 5000 UTR por aplicação. Vale salientar que a concentração de hialuronidase utilizada para mesoterapia é diferente
da concentração da mesma no gel, pois em clínicas dermatológicas, até então, utilizavam-se
esta concentração do fármaco para mesoterapia 12.
Após 15 dias de tratamento, fragmentos de
pele tratados foram retirados dos animais. A fixação dos segmentos foi em BOUIN (24 h), sendo processados rotineiramente em parafina. Para evidenciar ácido hialurônico, utilizou-se Alcian Blue (AB) pH 2,5 13, com o propósito de,
através da intensidade da coloração, observar se
houve diminuição de ácido hialurônico.
Para as análises morfométricas e histopatológicas, por área de tratamento de cada animal,
obteve-se nove cortes de 6-7 µm de espessura,
não seriados e tratados com Hematoxilina e Eosina (HE). A espessura das camadas da pele foi
obtida através de vinte medidas feitas aleatoriamente nos cortes, usando-se uma ocular milimetrada da Zeiss 14. As espessuras da epiderme e
da camada córnea foram obtidas em micrômetros (µm). Já as espessuras da derme e hipoderme foram obtidas em milímetros (mm).
A camada córnea foi mensurada em áreas
onde esta se apresentava bem aderida à epiderme e foi considerada a distância entre a porção
superior da camada granulosa até a superfície.
Para a epiderme obteve-se medidas em áreas
planas, sem muitas papilas dérmicas, através da
distância entre a membrana basal até a borda
externa da camada córnea.
Para a derme, foram obtidas as distâncias entre a membrana basal até o limite da derme com
a hipoderme, incluindo, assim, a derme papilar
e reticular. Por fim, as espessuras da hipoderme
foram obtidas à partir do limite derme-hipoderme até a fáscia superficial, já que houve muitas
variações na coleta da pele. Portanto, as medidas obtidas referem-se à camada areolar (mais
externa), desprezando-se a camada lamelar
(mais profunda), pois esta não estava íntegra
em todos os cortes.
Realizou-se análise não paramétrica pelo teste de Friedman, já que a distribuição dos dados
não foi homogênea. Para comparação das médias dos tratamentos entre si, utilizou-se o teste
Dunnit’s de comparações múltiplas (p<0,05).
latin american journal of pharmacy - 26 (1) - 2007
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Em relação às lâminas coradas com AB observou-se nas áreas controle e tratadas com gel,
gel + US, gel + hialuronidase e gel + hialuronidase + US a presença de ácido hialurônico, evidenciado pela coloração azul, sendo que nos
grupos tratados com hialuronidase bem como
hialuronidase + US a intensidade da coloração
não diminuiu. Já nos fragmentos de pele tratados com mesoterapia, observa-se atenuação da
coloração entre os feixes de colágeno, principalmente na derme, o que comprova a eficácia do
método de coloração (Figs. 1 e 2). Estes resultados confirmam os de Godeau & Robert 15, que
observaram, através de um estudo por análise
informatizada de imagens, a redução de ácido
hialurônico entre as fibras de colágeno em derme de coelho após tratamento mesoterápico
com hialuronidase. Já trabalho de Laugier et al.
em cultura de pele e com aplicação tópica de
hialuronidase e ácido hialurônico, demonstraram que a hialuronidase veiculada em solução,
numa concentração de 100 UTR/mL, reduziu a
quantidade de ácido hialurônico, comprovado
pela redução de reação histoquímica.
Na análise morfométrica, as espessuras das
camadas da pele podem ser observadas na Tabela 1.
Na camada córnea, observa-se redução estatisticamente significante para o tratamento gel +
US. Provavelmente, isto se deve à ação do ultrasom que provoca desnaturação da queratina e
remoção das células mortas 16, levando à diminuição da espessura da mesma. Já na pele tratada com gel + hialuronidase + US não houve redução estatisticamente significativa. Porém, tes-
10
Figura 1. Fotomicrografias da pele de suínos. Observa-se principalmente nos tratamentos gel + hialuronidase e
gel + hialuronidase + US a presença de ácido hialurônico, evidenciado pela coloração azul - seta. Na pele tratada com mesoterapia, a intensidade da coloração azul é menor (AB, 400x). A: Controle, B: Mesoterapia - H, C:
Gel + H, D: Gel + H+ US.
Figura 2. Fotomicrografias da derme de suínos. Observa-se no grupo tratado com mesoterapia atenuação da co-
loração entre os feixes de colágeno, evidenciando diminuição de ácido hialurônico, sendo que os grupos controle e tratados com hialuronidase e hialuronidase + US mantiveram a coloração - seta (AB, 400x). A: Controle,
B: Mesoterapia - H, C: Gel + H, D: Gel + H+ US.
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CHORILLI M., ZAGUE V., RIBEIRO M.C. de A.P., LEONARDI G.R., PIRES-DE-CAMPOS M.S.M. & POLACOW M.L.O.
Epiderme
Camada córnea
Derme
Hipoderme
Controle
74,15±15,28
24,13±7,14
1,74±0,10
3,06±0,28
Gel
90,40±14,26
31,98±9,35
1,73±0,11
3,26±0,22
Gel + US
76,73±10,66
16,75±6,14*
1,44±0,16
3,12±0,24
Gel + Hialuronidase
81,70±10,78
22,58±8,68
1,71±0,17
3,10±0,30
Gel + Hialuronidase + US
74,33±9,97
19,78±5,46
1,58±0,17
2,97±0,30
Mesoterapia Hialuronidase
81,63±14,75
19,63±5,11
1,50±0,11
2,53±0,24
Tabela 1. Média ± desvio padrão da média da espessura da epiderme (µm), camada córnea (µm), derme (mm) e
hipoderme (mm) de pele de suínos nos vários tratamentos (n=5). * Diferença estatisticamente significante
(p<0,05).
tes anteriores constataram que a presença da
enzima no gel não ocasionou redução das ondas ultrassônicas.
Em relação à derme, não houve alterações
significativas nos tratamentos realizados. Este resultado corrobora os dados das lâminas tratadas
com AB, sugerindo a não eficácia da formulação
tópica nas condições experimentais (na concentração de 100 UTR de hialuronidase / g de gel).
Na hipoderme, também não houve alterações estatisticamente significantes, inclusive
no tratamento mesoterápico, resultado já esperado, pois não se observava, nos animais, excesso
de fluidos para ser diminuído com este fármaco.
CONCLUSÕES
Como não houve redução de ácido hialurônico nos fragmentos de pele tratados topicamente com hialuronidase e hialuronidase + US,
sugere-se que não houve a ação desta enzima
nas condições experimentais empregadas.
A hialuronidase aplicada através de mesoterapia provocou diminuição da coloração pelo
AB, evidenciando a atividade enzimática. Comprova-se, então, a eficácia desta enzima na mesoterapia.
Agradecimentos. Agradecemos ao CNPq e ao FAPUNIMEP pelo apoio financeiro.
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