Avaliação da presença de Papilomavírus bovino em sêmen de

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE GENÉTICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA
Avaliação da presença de Papilomavírus bovino
em sêmen de touros (Bos taurus)
Maria Angélica Ramos da Silva
Recife, PE
2008
Maria Angélica Ramos da Silva
Avaliação da presença de Papilomavírus bovino
em sêmen de touros (Bos taurus) em Pernambuco
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-
Graduação
em
Genética
da
Universidade Federal de Pernambuco
para a obtenção do grau de Mestre em
Genética.
Orientador: Prof. Dr. José Ferreira dos Santos, Depto. de Genética, Centro de Ciências
Biológicas, UFPE.
Co-Orientador: Prof. Dr. Antonio Carlos de Freitas, Depto. de Genética, Centro de Ciências
Biológicas, UFPE.
Silva, Maria Angélica Ramos da
Avaliação da presença de Papilomavírus bovino em sêmen de touros (Bos
taurus)/ Maria Angélica Ramos da Silva – Recife: O Autor, 2008
46 folhas: il., fig., tab.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCB.
Genética, 2009.
Inclui bibliografia e anexos
1. Papilomavírus bovino. 2. Touro-sêmen. 3. bovinos- infecção viral. 4.
vírus-genética I Título.
578.26
579.224 5
CDU (2.ed.)
CDD (22.ed.)
UFPE
CCB – 2009- 116
SUMÁRIO
Lista de Figuras
i
Lista de Tabelas
iii
Lista de Abreviações
iv
Resumo
v
1. Introdução
1 2.
Revisão da Literatura
2
2.1. Papilomavírus
2
2.2. Papilomavírus Bovino (BPV)
6
2.3. Trato Reprodutor Masculino
8
2.4. Infecções no Trato Reprodutor Masculino
9
2.5. Papilomavírus e Trato Reprodutor Masculino
12
2.6. Detecção de Papilomavírus
13
3. Referências Bibliográficas
15
4. Manuscrito de Artigo Científico
24
5. Conclusões
44
6. Abstract
45
7. Anexos
56
LISTA DE FIGURAS
Revisão da Literatura
Figura 1: Diagrama da organizaçao do genoma de BPV1. O genoma viral
3
está representado linearmente com as regiões abertas de leitura (ORF)
como retângulos.
Figura 2: Ciclo de vida do Papilomavírus Bovino.
4
Figura 3: Árvore Filogenética com a disposição dos grupos de
Papilomavírus Bovino
6
Manuscrito de Artigo Científico
Figura 1 – Amplificação por PCR de DNA de PV com os primers
42
MY09/11 em amostras de sêmen congelado (espermatozóide) de touros
(Bos taurus indicus) da raça Gir Leiteiro.
Figura 2 – Amplificação por PCR de DNA de BPV2 em amostras de
42
sêmen congelado (espermatozóide e plasma seminal) de touros (Bos taurus
indicus) da raça Gir Leiteiro.
Figura 3 – Amplificação por PCR de DNA de BPV3/6 em amostras de
42
sêmen congelado (espermatozóide e plasma seminal) de touros (Bos taurus
indicus) da raça Gir leitero.
Figura 4 – Amplificação por PCR de DNA de PV com os primers
42
MY09/11 em amostras de sêmen fresco (espermatozóide) de touros (Bos
taurus).
Figura 5 – Amplificação por PCR de DNA de BPV2 em amostras de
sêmen fresco (espermatozóide e plasma seminal) de touros (Bos taurus).
43
Figura 6 – Amplificação por PCR de DNA de BPV2 em amostras de
sêmen fresco (espermatozóide e plasma seminal) de touros (Bos taurus).
43
LISTA DE TABELAS
Artigo Científico
Tabela 1: Primers utilizados para detecção de Papilomavírus e
40
amplificação do gene β-globina bovina.
Tabela 2: Detecção de DNA de Papilomavírus em amostras de
40
espermatozóides e plasma seminal de sêmen fresco e congelado de touros
(Bos taurus).
Tabela 3 – Detecção de DNA de BPV em amostras de espermatozóides e
41
plasma seminal de sêmen congelado de touros (Bos taurus) em
Pernambuco.
Tabela 4 – Detecção de DNA de BPV em amostras de espermatozóides e
plasma seminal de sêmen fresco de touros (Bos taurus).
41
LISTA DE ABREVIAÇÕES
AVV: Vírus adeno associado
BHV: Vírus da herpes bovina
BIV: Vírus da imunodeficiência Bovina
BLV: Vírus da leucemia bovina
BPV: Papilomavírus bovino
BVDV: Vírus da diarréia bovina
CMVM: Citomegalovírus murino
COPV: Papilomavírus oral canino
CRPV: Papilomavírus do coelho cottontailI
DNA: Ácido desoxirribonucléico
E1 - 7: Genes de expressão imediata
GI: Gastrointestinal
HIV: Vírus da imunodeficiência humana
HPV: Papilomavírus humano
HSV: Vírus da herpes simples humana
Kb: Kilobase
kDa: Kilodalton
L1- 2: Genes de expressão tardia
LCR: Longa região de controle da transcrição
ORF: Quadro aberto de leitura (Open reading frame)
p53: Proteína 53 (fator de transcrição)
PCR: Reação em cadeia da polimerase
PCV: Circovírus suíno
pRB: Proteína do retinoblastoma (supressora de tumor)
PV: Papilomavírus
RNA: Ácido ribonucléico
VLP: Partículas semelhantes ao vírus (virus-like particles)
RESUMO
Os papilomavírus (PV) são vírus de DNA dupla fita que infectam o epitélio escamoso da
pele e mucosa. O papilomavírus bovino (BPV) apresenta 10 diferentes tipos (BPV-1 a 10) e
causam doenças em rebanhos de corte ou leiteiro, gerando grandes prejuízos econômicos aos
criadores. A presença de BPV já foi detectada em tecidos reprodutivos e fluídos corporais, tais
como sangue periférico, plasma sanguíneo, oócitos, ovário, útero, células do cúmulus, fluídos
uterinos, sêmen e espermatozóide, placenta e líquido amniótico. O objetivo deste trabalho foi
avaliar a presença do BPV, através da técnica PCR, em sêmen de touros (Bos taurus) fresco e
comercializado no Estado de Pernambuco. Para isso, foram utilizados primers de detecção geral
para PV e específicos para os tipos de BPV-1 a 6 em amostras de sêmen fresco e sêmen
comercial de touros da raça Gir Leiteiro. Foi detectada a presença de DNA de BPV em 100% das
amostras de sêmen analisadas. O tipo viral mais freqüente foi o BPV-2 em 100% das amostras
analisadas, seguido por BPV-3 em 48% das amostras e BPV- 4 presente em 6,9% das amostras
avaliadas. Houve detecção simultânea de mais um tipo de BPV em 51% das amostars de sêmen
analisadas. Estes resultados demonstram a importância do estudo e de um melhor detalhamento
da relação entre BPV e sêmen. Dada a grande utilização, a inseminação artificial com sêmen
contaminado com BPV pode ter importância similar à via sexual para a dispersão viral entre o
rebanho.
Palavras-chave: Papilomavírus Bovino, Touro sêmen, PCR
Silva, MAR
Avaliação da Presença de Papilomavírus ...
1. INTRODUÇÃO
Papilomavírus (PV) pertencem a um grupo altamente diverso e espécie-específico de
vírus que infectam o homem e outros animais. Possuem DNA dupla fita circular com tamanho
próximo a 8 Kb e peso molecular com cerca de 5,2x 106 daltons.
Os PV infectam o epitélio escamoso da pele e mucosas. Estas infecções são, em muitos
casos, assintomáticas, porém, também podem causar várias lesões benignas (papilomas) ou
malignas em várias espécies de mamíferos. Embora não caracterize um processo neoplásico, a
papilomatose bovina é uma doença importante economicamente por provocar desvalorização dos
animais. Estas lesões são geralmente benignas, mas se acompanhadas de outras modificações
celulares, induzidas por co-fatores ambientais, como por exemplo, o consumo da samambaia
(Pteridium aquilinum) podem evoluir para câncer e causar a morte do animal. Sendo assim, o
BPV tem sido estudado como um agente infeccioso e como modelo para se investigar a interação
do papilomavírus com seu hospedeiro natural e com co-fatores ambientais.
Atualmente, 10 tipos de Papilomavírus bovinos (BPV) já foram descritos com seus
materiais genéticos detectados em fluidos corporais e tecidos reprodutivos, além do tecido
epitelial, fonte natural de infecção do PV. Dessa forma, discute-se a possibilidade de
disseminação do vírus através de fluidos e tecidos não epiteliais.
A inseminação artificial (IA) e a transferência de embriões (TE) têm sido referidas como
maneira de controle de doenças entre animais de interesse zootécnico, principalmente bovinos.
Porém, é necessário um rigoroso controle sanitário do sêmen e/ou embriões para que estas
técnicas não possam agir como facilitadores para a transmissão de uma série de doenças, pois a
infecção do trato reprodutivo, bem como do sêmen por diversos tipos de vírus leva a
conseqüências graves, como: i) disseminação do agente infeccioso; ii) infertilidade/esterilidade;
iii) caquexia induzida por queda na produção de testosterona; iv) incorporação do genoma viral
na célula germinativa, com risco de transmissão vertical; v) infecção do ovo ou embrião, levando
a abortos ou anormalidades no desenvolvimento fetal.
Alguns trabalhos relatam a presença de papilomavírus no trato reprodutor masculino e a
associação com a queda da qualidade do sêmen e presença do vírus é discutida em humanos. Em
bovinos, as informações relacionadas aos BPV e sêmen são escassas, necessitando, portanto,
demaiores estudos para avaliar a real importância deste agente nos processos reprodutivos.
-1-
Silva, MAR
Avaliação da Presença de Papilomavírus ...
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Papilomavírus
Os papilomavírus (PV) formam um grupo altamente diversificado de vírus que infecta
mamíferos, aves e répteis (Bernard, 2005), porém são estritamente espécie-específicos e até
mesmo em condições experimentais, não infectam outro hospedeiro que não o seu natural. Os
casos conhecidos de infecção cruzada entre espécies são de cavalos e outros eqüídeos pelo
papilomavírus bovino (BPV) tipo 1 e 2 (Campo, 2002), e a infecção de bisão (Bison bonasus)
pelo recentemente descrito BPV 8 (Literak et al., 2006).
Inicialmente, os papilomavírus eram classificados na subfamília Papilomavirinae, dentro
da família Papovaviridade que incluíam os Polyomavírus (Bernard, 2005). Recentemente, os PV
foram re-classificados e formam a grande família Papilomaviridade, que compreende 16 gêneros
diferentes (Mayo, 2005), seguindo a nomenclatura com letras Gregas usadas para outras famílias
virais (de Villiers et al., 2004).
Para identificação de novos tipos de PV, tem sido utilizada a seqüência de nucleotídeos do
gene L1, por ser o mais conservado do genoma. Um PV isolado é reconhecido como novo se o
seu genoma completo for clonado e a seqüência da ORF (quadro aberto de leitura, de Open
Reading Frame) L1 divergir em mais de 10% do tipo de PV conhecido mais próximo. Diferenças
entre 2% e 10% de homologia definem um subtipo, e menor que 2% uma variante (de Villiers et
al., 2004).
Todos os PV contêm um DNA dupla-fita circular, com tamanho aproximado de 8Kb e
peso molecular de cerca de 5,6x102 Dalton e pode ser dividido, em geral, em três principais
regiões: precoce (E, do inglês early), tardia (L, de late) e longa região de controle (LCR, long
control region) (Figura 1). As três regiões são separadas por dois sítios de poliadenilação (pA): o
sítio na região precoce (pAE) e outro na região tardia (pAL) (Zheng & Baker, 2006). A
informação genética está distribuída em pelo menos oito ORF no genoma dos papilomavírus. Em
geral, cada ORF nos papilomavírus é freqüentemente referida como um gene. Os genes de
expressão precoce (E) codificam proteínas envolvidas na replicação do DNA (E1 e E2), na
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Silva, MAR
Avaliação da Presença de Papilomavírus ...
transcrição (E2 e E4) e no processo de transformação celular (E5, E6 e E7). Os genes de
expressão tardia (L) codificam as proteínas L1 e L2 que formam o capsídio viral (Campo, 2003).
A proteína L1, a principal, está arranjada em 72 pentâmeros (60 hexaméricos e 12 pentaméricos)
e possui capacidade de se auto-arranjar em VLPs (virus-like particles). A proteína L2 é uma
ligante de DNA, necessária para a encapsidação do genoma (Campo, 1995). A região LCR é um
segmento de cerca de 850 pb (10% do genoma de HPV), possui uma função não-codificante, mas
contém a origem de replicação, assim como muitos sítios ligantes de fatores de transcrição que
são importantes na regulação da RNA polimerase (Zheg & Baker, 2006). Os vírions possuem
uma estrutura não envelopada icosaédrica, com tamanho aproximado de 55nm, que contém o
DNA complexado com histonas do hospedeiro e condensado em nucleossomos (Chang, 1990;
zur Hausen, 1996).
Figura 1: Diagrama da organização do genoma de BPV1. O genoma viral está representado linearmente
com as regiões abertas de leitura (ORF) como retângulos. A função das proteínas codificadas pelas ORF
estão indicadas (Campo, 2006).
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Silva, MAR
Avaliação da Presença de Papilomavírus ...
A replicação do vírus ocorre nas células basais do epitélio, estimulando a divisão celular e
provocando hiperproliferação, crescimento excessivo dessas células, formando as verrugas ou
papilomas (Campo, 2002). Em geral, os papilomas regridem espontaneamente sem causar
problemas clínicos em seus hospedeiros (Campo, 1997). Esta hiperproliferação ocorre mais
freqüentemente nas células epiteliais da pele ou mucosas, mas alguns tipos de vírus podem
infectar fibroblastos. Os PV induzem tumores benignos que, eventualmente, quando fatores
genéticos ou ambientais estão envolvidos, podem resultar em conversão maligna (Campo, 2002).
O ciclo de vida dos PV está intimamente ligado à diferenciação epitelial, já que se
replicam no epitélio escamoso estratificado da pele e mucosas. As células infectadas se dividem e
espalham lateralmente (Figura 2). Algumas células migram para as camadas suprabasais e se
diferenciam onde genes virais são ativados formando o capisídio viral (zur Hausen, 2002). A
liberação dos vírions não envelopados depende da desintegração celular normal, tipicamente
observada próxima à superfície do epitélio. A dificuldade de mimetizar a diferenciação do
epitélio estratificado em culturas de células tem sido um desafio para o estudo do ciclo de vida
desses vírus. Dessa forma, muito do que se sabe sobre a morfogênese deriva do estudo de versões
recombinantes das proteínas estruturais L1 e L2 (Buck et al., 2005).
Figura 2: Ciclo de vida do Papilomavírus Bovino, seguindo a diferenciação do epitélio (Campo, 1997).
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Silva, MAR
Avaliação da Presença de Papilomavírus ...
Ainda não foi completamente elucidado como fatores carcinogênicos e agentes
promotores estão envolvidos em diferentes estágios do desenvolvimento de papilomas e
carcinomas, porém já foram descobertos dois estágios do mecanismo de carcinogênese, a
iniciação e a promoção, que têm componentes independentes (zur Hausen, 1996). A ação
oncogênica viral envolve a expressão de genes que codificam proteínas precoces (E6 e E7) dentro
da célula hospedeira. Estas oncoproteínas interferem no controle do ciclo celular através de
interação com proteínas celulares específicas, tais como a proteína 53 33(p53) e a proteína do
retinoblastoma (pRB) (Campo, 2003).
A transmissão das papilomaviroses é facilitada pela presença de abrasões na superfície do
epitélio. As infecções anogenitais são principalmente transmitidas pelo contato sexual (zur
Hausen, 1996). O papilomavírus humano (HPV) é a principal doença transmitida sexualmente
(Dunne et al., 2006) e também o principal agente etiológico de neoplasias do epitélio cutâneo e
mucoso. Mais de 200 tipos de HPV já foram descobertos e cerca de 35 deles estão associados
com o câncer (zur Hausen, 2002). Grande parte das infecções são assintomáticas ou subclínicas e
mantêm-se indetectáveis através do tempo. Os PV parecem coexistir com seus hospedeiros por
longos períodos de tempo, alguns ocorrem preferencialmente em um ciclo de vida latente, pois
uma grande variedade de tipos de PV já foi isolada de pessoas e animais aparentemente saudáveis
(Antonsson & Hansson, 2002; Antonsson et al., 2003a; Antonsson et al, 2003b; Ogawa et al.
2004).
Os PV que infectam animais têm tido grande importância na investigação da biologia do
vírus, da sua relação com o hospedeiro e sua resposta imune, além de possibilitarem o
desenvolvimento de vacinas anti-papilomavírus. A ligação entre infecção por PV e neoplasia e a
relação entre o vírus e co-carcinógenos ambientais foram primeiro estabelecidas para PV de
animais, particularmente os PV de coelho, cottontailI (CRPV), bovino (BPV) e oral canino
(COPV) (Campo, 2002).
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Silva, MAR
Avaliação da Presença de Papilomavírus ...
2.2 Papilomavírus bovino
Atualmente, existem 10 tipos de BPV (BPV-1 a 10) descritos na literatura. Originalmente,
os BPV foram classificados em dois subgrupos, A e B, tomando-se como base a estrutura
genômica e a patologia. O subgrupo A era compreendido pelos tipos 1, 2 e 5, os quais eram
definidos como fibropapilomavírus por infectarem tanto o epitélio como a subdérmica, formando
fibropapilomas. O subgrupo B compreendia os tipos 3, 4 e 6, por serem epteliotrópicos e
infectarem apenas células epiteliais (queratinócitos), induzindo a formação de papilomas
verdadeiros (Campo, 2002).
De acordo com a nomenclatura atual, que leva em consideração as propriedades
biológicas e organização do genoma, os BPV epiteliotrópicos (BPV-3, 4, 6, 9 e 10) são definidos
como Xi-papilomavírus, os BPV-1 e 2 como Delta-papilomavírus e os BPV-5 e 8 são
classificados no gênero Epsilon-papilomavírus (de Villers et al, 2004; Tomita et al., 2007;
Hatama et al, 2008). Análises filogenéticas baseadas na ORF L1 classificaram um isolado de
BPV do Japão como BPV7, originando um novo gênero na família Papillomaviridae (Ogawa et
al., 2007) (Figura 3). Além destes tipos bem caracterizados, 14 supostos novos tipos de BPV já
foram isolados, baseando-se em técnicas de PCR que amplificam uma região do gene L1
(Antonsson & Hansson, 2002; Ogawa et al, 2004; Ogawa et al., 2007; Tomita et al., 2007).
Figura 3: Árvore Filogenética com a disposição dos grupos de Papilomavírus bovino (Hatama et al.,
2008).
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Avaliação da Presença de Papilomavírus ...
A estrutura genômica viral dos BPV 1, 2 e 5 é semelhantes a outros PV possuindo
aproximadamente 8000 nucleotídeos. Já os BPV 3, 4 e 6 possuem cerca de 7300 nucleotídeos e
não possuem o gene E6, que codifica uma proteína precoce com função de transformação celular.
A região LCR dos BPV 1, 2 e 5 contém 12 sítios ligantes de DNA para E2 (E2BS), um regulador
da transcrição viral, enquanto os BPVs 3, 4 e 6 possuem apenas 4 E2BS, com um arranjo muito
semelhante aos HPV genitais. Embora os Xi-BPV não possuam a proteína E6, estes vírus
conseguem realizar seus ciclos infecciosos com sucesso e até mesmo causar a progressão de
papilomas a carcinoma (BPV4) (Campo, 2006).
As infecções pelos fibropapilomavírus começam por uma transformação inicial dos
fibroblastos sub-epiteliais seguida por acantose e então papilomatoses, enquanto que as infecções
pelos papilomavírus epiteliotrópicos induzem papilomas epiteliais sem envolvimento dos
fibroblastos. O BPV-1 e o BPV-2 são os principais agentes de fibropapilomas cutâneos. O BPV-1
também pode causar fibropapilomas nas mamas e no pênis e o BPV-2, fibropapilomas do trato
digestório. O BPV-5 causa fibropapilomas em forma de grão de arroz no úbere e os BPV-3, 4 e 6
foram isolados de papilomas epiteliais cutâneos, papilomas no epitélio alimentar e papiloma
epitelial na teta, respectivamente (Bloch et al., 1994; Campo, 1997).
Infecções persistentes induzidas por BPV estão arriscadas em progredir para o câncer,
principalmente quando associadas a co-fatores ambientais como o consumo do broto da
samambaia Pteridium aquilinum (Campo, 2006), uma planta invasora e cosmopolita de regiões
tropicais e temperadas que infesta campos e contém agentes imunossupressores e mutagênicos. O
consumo desta samambaia pelo gado pode levar ao desenvolvimento de hematúria enzoótica,
câncer de bexiga urinária, com a presença de aberrações cromossômicas no sangue periférico
(Stocco dos Santos et al., 1998; Borzachielo et al., 2003; Campo, 2006). Em gado que se
alimenta com samambaia, papilomas do trato gastro-intestinal superior induzidos por BPV-4 e
lesões na bexiga urinária induzidas por BPV-2 e 1 podem progredir para o câncer (Wosiacki et
al., 2002; Campo, 2006, Wosiacki et al., 2006; Borzacchielo, 2007).
Embora o BPV seja descrito com epitélio específico, a sua presença já foi encontrada em
diferentes tecidos e fluidos, tais como sangue periférico, plasma sanguíneo, leite e colostro
(Stocco dos Santos et al., 1998; Freitas et al., 2003; Wosiacki et al., 2005; Freitas et al., 2007) e
tecidos reprodutivos, incluindo oócitos, ovário, útero, células do cúmulus, fluidos uterinos, sêmen
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Silva, MAR
Avaliação da Presença de Papilomavírus ...
e espermatozóide (Carvalho et al., 2003; Yaguiu et al., 2006), bem como placenta e líquido
amniótico (Freitas et al., 2007).
2.3 Trato Reprodutor Masculino
O trato reprodutor masculino é composto por testículos que são formados por dois
compartimentos distintos: o primeiro é o interstício, que possui as células de Leydig,
responsáveis pela produção de testosterona, macrófagos, fibroblastos e vasos linfáticos; o
segundo compartimento são os túbulos seminíferos, que são circundados por células peritubulares
e contém várias gerações de células germinativas. Os espermatozóides, formados nos túbulos
seminíferos, passam através deles até o epidídimo, ducto deferente e uretra. O trato reprodutor
masculino é composto também por glândulas acessórias (glândulas bulbouretrais, vesícula
seminal e próstata) e o pênis, órgão sexual masculino externo (Deucq-Rainsford & Jégou, 2004).
O espermatozóide, gameta masculino, é uma célula altamente polarizada, sendo formada
na maioria dos mamíferos por três regiões distintas: a cabeça, contendo o núcleo da célula com
uma camada muito fina de citoplasma em seu redor, circundada pela membrana celular, além do
acrossomo, uma grande organela vesicular que reveste dois terços anteriores da cabeça do
espermatozóide e contém enzimas envolvidas no processo de fecundação; uma região mediana,
contendo mitocôndrias; e a cauda, que contém dois componentes principais, um esqueleto central
e uma delgada membrana celular, sendo responsável pela motilidade da célula. A cromatina
espermática é composta por uma estrutura compacta e altamente organizada de DNA e proteínas
heterogêneas (Evenson, 1999). Em alguns animais como estrela-do-mar e rãs, o DNA do
espermatozóide parece estar arranjado em nucleossomos, de uma maneira similar às células
somáticas. Já em outros animais, como mamíferos, o DNA parece estar arranjado de maneira
diferente, condensado de forma quase cristalina e associado com apenas um tipo de proteína, as
protaminas (Balhorn, 1982).
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Silva, MAR
Avaliação da Presença de Papilomavírus ...
2.4 Infecções no Trato Reprodutor Masculino
As infecções mais comuns que acometem o trato reprodutor masculino são sexualmente
transmissíveis. Os patógenos que causam infecções transmitidas sexualmente podem provocar
doenças fatais ou incuráveis e afetar a fertilidade. Além disso, pode ocorrer a transmissão dos
patógenos por processos de inseminação artificial e a transmissão vertical (Bezold et al, 2007).
Vários microrganismos causam infecções no trato reprodutor masculino, dentre eles as
bactérias Neisseria gonorreae e Chlamidia tracomatis, a mais freqüentemente transmitida
sexualmente em países industrializados, que causa uretrites e epidimites (Quinn et al, 1996),
micoplasmas como Ureoplasma urealyticum, responsável por mais de 25% dos casos de uretrite
não gonocócica (Keck, 1998) e vários vírus. Estes incluem citomegalovírus (CMV), vírus
Epstein-Barr (EBV), Papilomavírus (PV), vírus da hepatite B (HBV), vírus da hepatite C (HCV),
herpes simplex vírus tipo 2 (HSV-2) e vírus da imunodeficiência humana (HIV) (Dejug & Jégou,
2001). Em uma revisão, Dejucq & Jégou (2001) citam a presença de 27 diferentes tipos virais no
sêmen do homem, primatas, touros, porco do mato, rato, Xenopus laevis e gatos.
Existe uma variedade de implicações relativas às infecções virais no trato reprodutor e no
sêmen, que incluem a disseminação de doenças, infertilidade/esterilidade, caquexia resultante na
queda da produção de testosterona, incorporação do genoma viral nas células germinativas,
levando ao risco de transmissão para as gerações subseqüentes, infecções do ovo e embrião,
aborto e anormalidades embriônicas e fetais (Dejug & Jégou, 2001). A presença viral nos
testículos pode levar a orquite e possivelmente câncer testicular, e estes órgãos podem servir de
reservatórios para vírus devido à barreira testículo-sanguínea. Sobre a próstata, existem estudos
controversos que procuram demonstrar uma relação entre HPV e câncer de próstata (Griffthis &
Mellon, 2000; Dejug & Jégou, 2004). Papilomavírus também podem causar lesões na genitália
externa (verrugas), períneo, pênis, bexiga ou ânus. Certos tipos de HPV produzem displasias que
podem progredir para o câncer (zur Haussen, 1996; Schlehofer, 2003).
As infecções virais e bacterianas são postuladas como um importante fator etiológico para
a infertilidade masculina (Keck et al., 1998; Coskun & Ozkan, 2005). Esta pode se dar por
deterioração da espermiogênese, impedimento da função espermática e obstrução do trato
seminal (Bar-Chama & Fisch, 1993; Pruvis & Chritiansen, 1993). O aumento da concentração de
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Silva, MAR
Avaliação da Presença de Papilomavírus ...
leucócitos no trato seminal pode induzir a formação de anticorpos anti-espermatozóides. No
entanto, a associação de infecções no trato genital masculino e anticorpos antispermatozóide
ainda não foi bem estabelecida (Wolff et al., 1990).
Alguns vírus podem causar infecções subclínicas ou assintomáticas. Estas infecções são
muito comuns e podem contribuir para a infertilidade masculina, pois estão associadas com uma
redução na qualidade do sêmen e azoo/oligospermia, morfologia anormal espermática,
hematospermia, astenospermia e quebra no DNA da célula espermática (Schlehofer, 2003;
Bezold et al, 2007). Os vírus também estão implicados na transmissão vertical e possível causa
de abortos, visto que eles podem impedir a implantação normal do concepto e a placentação
(Arechavaleta-Velasco et al., 2002; Matovita et al., 2004; Chenoweth, 2007).
O HIV no sêmen pode não apenas ligar-se ao espermatozóide como também penetrá-lo.
Alguns vírus podem aderir à superfície do espermatozóide ou penetrá-lo e alguns estão
associados ao líquido seminal ou células não espermáticas presentes no sêmen (Bielanski, 2007).
Partículas virais podem ser transferidas para o ovócito (Bacetti et al., 1994). O Vírus adenoassociado (AVV) é citado como uma possível causa de infertilidade masculina devido a quebras
no DNA do espermatozóide (Rohde et al., 1999). Os vírus da herpes humano (HSV) e bovino
(BHV) são causas de infecções genitais e abortos (Marsi et al., 1996).
A origem da contaminação do sêmen pode ser infecções do trato reprodutor,
processamento incorreto do sêmen, presença de células sanguíneas, traumas no epitélio ou
inflamações
nas
glândulas
acessórias
(próstata,
vesícula
seminal
ou
bulbouretral),
microorganismos presentes na urina e cavidade prepucial, utilização de derivados de animais
como diluentes de sêmen ou contaminação resultante de laboratórios com pouca higiene
(Bielanski, 2007).
Embora os processos de reprodução assistida sejam usados para diferentes propósitos em
humanos e animais, um objetivo comum é a prevenção da transmissão de doenças.
Os
procedimentos sanitários adotados para controle e eliminação de microrganismos no sêmen
incluem lavagens que podem ser suplementadas com antibióticos e tratamentos enzimáticos,
utilização de anticorpos, acidificação do meio, ozonização, uso de agentes fotossensíveis,
ativados pela radiação luminosa e imunoextensores (anticorpos contra vírus). No entanto, ainda
se faz necessário melhor investigação e aprimoramento dos processos de desinfecção do sêmen
utilizado em técnicas de reprodução assistida (Bielanski, 2007). Processos de lavagem de sêmen
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Silva, MAR
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para eliminação do vírus da diarréia bovina (BVDV), HPV, vírus da leucemia bovina (BLV) e
vírus da imunodeficiência bovina (BIV) não resultaram muito sucesso para a eliminação desses
vírus (Bielanski, 2007).
Em animais, alguns vírus podem ser encontrados na próstata, como o vírus do tumor
mamário de ratos (MMTV), vesícula seminal e epidídimo, como o rubulavírus porcino. Em
touros, o vírus da diarréia bovina (BVD) foi encontrado na vesícula seminal e próstata (Dejucq &
Jégou, 2001). Nos testículos de animais já foram encontrados o vírus da influenza (ratos),
citomegalovírus (CMV) em ratos, vírus da sídrome respiratória reprodutiva porcina (PRRSV)
em porcos, rubulavírus porcino (porcos) e vírus da imunodeficiência de símios (SIV) em
macacos. No sêmen já foram detectados SIV (macacos), PRRSV (porcos), CMV (ratos), vírus da
imunodeficiência felina (FIV) em gatos. Em touros, foi encontrada a presença de vírus da
leucemia bovina (BLV), Bluetong virus (BT) vírus da diarréia viral bovina (BDVD), vírus da
imunodeficiência bovina (BIV) vírus da rinotraqueíte infecciosa bovina (IBRV), herpesvírus
bovino tipo 4 (BHV-4) e encefalopatia espongiforme bovina (BSE) (Dejucq & Jégou, 2001;
Bielanski, 2007).
Uma série de doenças pode ser transmitidas, em bovinos, tanto pelo acasalamento, quanto
pela
inseminação
artificial,
entre
elas:
febre
aftosa,
leucose
bovina,
rinotraqueíe
bovina/vulvovaginie pustular infecciosa, riderpest, bluetong, diarréia bovina a vírus, febre
catarral maligna, brucelose, tuberculose bovina, leptospirose, Johne’s disease, campilobacteriose
genital, septicemia hemorrágica e tricomonose genital (Wentink et al, 2000).
Existem alguns trabalhos que sugerem a possibilidade de alguns vírus penetrarem e
integrar seu DNA no genoma do espermatozóide, o que impossibilitaria a retirada desses vírus
por processos de lavagem. Esse vírus incluem HIV (Piomboni & Bacceti, 2000), HPV (Lai et al.,
1997), circovirus porcino (PCV) (Larochelle et al, 2000), HSV1 e 2 e citomegalovírus murino
(CMVM) (Bielanski, 2007).
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Silva, MAR
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2.5 Papilomavírus e trato reprodutor masculino
A presença de HPV em homens tem sido demonstrada na literatura (Watson, 2005; Dunne
et al, 2006). Estes vírus podem causar lesões externas no trato reprodutor, conhecidas como
condiloma acuminado, ou lesões que podem evoluir para o câncer na genitália externa, assim
como na região anal (Watson, 2005). Além disso, existem estudos controversos sobre o HPV
como agente etiológico do câncer de próstata (Griffthis & Mellon et al, 2000; Strickler et al,
1998). Estudos preliminares demonstram uma possível relação entre HPV e câncer de bexiga,
renal e de testículos (Griffiths & Mellon, 2000). Nielson et al (2007) detectaram a presença de
DNA de HPV em 65,4% de homens sem nenhum histórico de verrugas genitais em amostras de
pênis (49,9%), glande (35,8%), escroto (34,2%), área perianal (20%), canal anal (17,6%), uretra
(10,1%) e sêmen (5,3%). Outros trabalhos também descrevem a presença de HPV em pênis,
uretra, sêmen (Giovannelli et al, 2007) e vaso deferente (Rintala et al., 2002).
Vários outros trabalhos vêm demonstrando a presença do HPV no sêmen (Ostrow et al.,
1986; Green et a.l, 1991; Chan et al., 1994, Olatunbosun et al., 2001; Rintala et al., 2004;
Didelot-Rosseau et al., 2007; Giovannelli et al., 2007; Bezold et al., 2007), mesmo quando este é
submetido a uma rigorosa lavagem para separar os espermatozóides do plasma seminal (Chan et
al., 1994; Brossfield et al., 1999). A expressão de certos genes em células espermáticas tem sido
demonstrada (Lai et al., 1996). Segundo Lai et al. (1997), a presença de infecção por HPV pode
levar a alteração na motilidade dos espermatozóides, o que pode refletir numa diminuição da
capacidade reprodutiva. Connelly et al. (2001) demonstraram que o HPV estaria envolvido em
processos de fragmentação de DNA e apoptose de espermatozóides expostos ao vírus, causando
alterações em exons do gene p53. Porém, o HPV não foi associado com leucocitospermia, um
processo relacionado com a diminuição da qualidade do sêmen e com diminuição da motilidade
dos espermatozóides, sendo sua presença associada apenas com significante diminuição na
contagem de espermatozóides (Nielson et al., 2007). No entanto, embora sejam comuns na
literatura trabalhos com detecção de HPV em sêmen de homens que procuram tratamento para
fertilidade (Kyo et al., 1994; Lai et al., 1997; Tanaka et al., 2000; Didelot-Rousseau et al., 2007;
Bezold et al., 2007), Rintala et al. (2004) não encontraram nenhum efeito do HPV na qualidade
do sêmen.
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Silva, MAR
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A possibilidade dos espermatozódeis agirem como vetor na transmissão de DNA de HPV
para células do cumullus, podendo levar a falhas de implantação é discutida (Kadze et al., 2002),
assim como a presença do vírus em placenta e sua relação com abortos espontâneos (Matovina et
al., 2004). Chenoweth (2007) discute a influência da qualidade do sêmen e espermatozóide no
desenvolvimento normal do embrião e aponta as infecções virais como possíveis causas de aborto
no início da gestação. Medeiros et al. (2005), em uma revisão sistemática quantitativa, mostraram
a transmissão vertical de HPV e também mostraram que crianças nascidas de parto normal têm
maior risco de se contaminar com HPV. Freitas et al. (2007) detectaram a presença de BPV em
placenta, líquido amniótico e sangue de bezerro recém-nascido sugerindo assim a transmissão
vertical de BPV.
Os primeiro estudo buscando avaliar a relação do BPV e o trato reprodutivo em bovinos
verificou a presença de material genético de BPV 1 e 2 no trato reprodutivo e gametas de
fêmeas bovinas (Carvalho et al., 2003). Posteriormente, Yaguiu et al. (2006) verificaram a
presença de BPV 1 e 4 no trato reprodutivo de fêmeas e BPV2 em sêmem de bovinos e Freitas et
al. (2007) demonstraram a presença de BPV1 em amostras de anexos embrionários, leite e
colostro.
2.6 Detecção de papilomavírus
A identificação direta do DNA de PV é atualmente o método de escolha para a sua
detecção em esfregaços ou amostras de tecidos. A imunohistoquímica pode detectar o
revestimento protéico das partículas virais, porém somente detecta as fases epissomais do vírus,
não sendo um método de escolha para o diagnóstico de infecções pelo PV em virtude de sua
baixa sensibilidade (Lancellotti et al., 2000). Existem vários métodos moleculares para a
detecção do DNA do PV, dentre eles, seis métodos são considerados principais: 1) a hibridização
por Southern blot;, 2) hibridização por Dot blot; 3) hibridização in situ fluorescente (FISH) 4)
hibridização in situ (ISH); 5) hibridização sanduíche em meio fluído (HCA); 6) amplificação do
DNA viral pela reação em cadeia pela polimerase - PCR (Moljn et al., 2005).
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A PCR é uma técnica que permite a amplificação enzimática do DNA ou RNA in vitro,
elevando com grande rapidez o número de segmentos de ácidos nucléicos, que podem ser
visualizados após eletroforese (Hirigoyen et al., 1992; Gross & Barrasso, 1999). Esta técnica
permite detectar pequenas quantidades DNA viral presentes no material, amplificando-o em
quantidades identificáveis.
A PCR tornou-se a mais adequada técnica para a detecção do PV, devido ao alto nível de
sensibilidade e especificidade(Moljn et al., 2005). Existem diversos oligonucleotídeos iniciadores
(primers) para a detecção de PV em geral (Forslund et al, 1999; Gravitt et al, 2000; Antonsson &
Hansson, 2002, Ogawa et al, 2004, Maeda et al, 2007,) e diferentes seqüências de primers
específicos foram propostas por vários pesquisadores, com a finalidade de identificação de BPV1 e BPV-2 (Otten et al., 1993; Wosiacki et al, 2005), BPV-4 (Gaukroger et al., 1991) e BPV-5
(Bloch et al 1997). Neste trabalho, primers para detecção de BPV- 1 a 6 serão utilizados para a
detecção de tais vírus em sêmen de touros.
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Avaliação da Presença de Papilomavírus ...
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Silva, MAR
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4. MANUSCRITO DE ARTIGO CIENTÍFICO
Avaliação da presença de Papilomavírus Bovino no Sêmen
Fresco e Congelado Comercial de Touros (Bos taurus)
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Avaliação da Presença de Papilomavírus ...
Avaliação da presença de Papilomavírus Bovino em Sêmen Fresco e
Congelado Comercial de Touros (Bos taurus)
Silva, MAR1; Carvalho, CCR1, Stocco dos Santos, RC2, Beçak, W2, Guerra, MMP3, Freitas
AC1,2and Santos, JF1.
1
Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, PE
2
Laboratório de Genética, Instituto Butantan, São Paulo, SP
3
Laboratório de Andrologia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, PE
RESUMO
Papilomavírus são encontrados em lesões epiteliais e estão associados a diferentes processos
carcirnogênicos no homem e em outros animais. Atualmente, estão descritos dez tipos de
Papilomavírus bovino (BPV) que estão associados com lesões histológicas distintas. BPV tem
sido estudado como um agente infeccioso e como modelo no qual se investiga a interação de
papilomavírus com seu hospedeiro natural e com cofatores. Embora caracterizados como
epiteliotrópicos, a presença de DNA viral tem sido verificada em outros tecidos, incluindo sêmen
fresco. O objetivo deste trabalho foi avaliar a presença de BPV, através da técnica PCR, em
espermatozóides e plasma seminal de amostras obtidas de sêmen fresco e congelado de touros
(Bos taurus), bem como sua associação com a qualidade do sêmen. Para a realização das PCR,
foram utilizados primers de detecção geral para PV e específicos para os tipos de BPV-1 a 6 em
amostras de sêmen de touros da raça Gir Leiteiro. A qualidade do sêmen comercial foi avaliada
através dos parâmetros de motilidade, vigor e integridade do acrossoma e do DNA. Foi detectado
DNA de BPV em 100% das amostras de espermatozóide e 100% das amostras de plasma
seminal. Os tipos de BPV encontrados foram: BPV2 em 100% das amostras de espermatozóide e
100% das amostras de plasma seminal, BPV3/6 em 41,3% das amostras de espermatozóides e
42,8% das amostras de plasma seminal, BPV4 em 6,8% das amostras de espermatozóide. Houve
detecção simultânea dos BPV 2 e 3/6 em 30,0% das amostras de sêmen. A alta freqüência de
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sêmen de touros contaminado por BPV desperta a importância de se realizar estudos para avaliar
a viabilidade desse vírus e sua capacidade infectante pela via seminal.
INTRODUÇÃO
Papilomavírus (PV) são vírus de DNA dupla fita que infectam mamíferos, aves e répteis
(Bernard, 2005). Estes vírus estão associados ao desenvolvimento de lesões no epitélio e de
diferentes processos carcinogênicos no homem e em outros animais, incluindo bovinos (Campo,
2003).
Atualmente são conhecidos 10 tipos de papilomavírus bovino (BPV), sendo dois desses
recentemente descritos na literatura (Hatama et al., 2008). Desses 10 tipos, três estão envolvidos
em processos carcinogênicos. Em gado que se alimenta com o broto da samambaia Pteridium
aquilinium, papilomas do trato gastro-intestinal superior induzidos por BPV-4 e lesões na bexiga
urinária induzidas por BPV-2 e/ou 1 podem progredir para o câncer (Campo, 2006).
Embora os PV sejam descritos como epiteliotrópicos, sua presença já foi descrita em
diferentes tecidos e células (Freitas et al., 2003; Yaguiu et al., 2006; Freitas et al., 2007). Dessa
forma, discute-se a possibilidade de disseminação do vírus através de fluidos e tecidos não
epiteliais.
A infecção do trato reprodutivo por diversos tipos de vírus determina conseqüências
graves, como: i) disseminação do agente infeccioso; ii) infertilidade/esterilidade; iii) caquexia
induzida por queda na síntese de testosterona; iv) incorporação do genoma viral na célula
germinativa, com risco de transmissão vertical; v) infecção do ovo ou embrião, causando abortos
ou anormalidades no desenvolvimento do concepto (Dejucq & Jegou, 2001).
Existem vários trabalhos na literatura demonstrando a presença de HPV no sêmen de
humanos (Ostrow et al., 1986; Green et al., 1991; Chan et al., 1994, Olatunbosun et al., 2001;
Rintala et al., 2004; Bezold et al., 2007; Didelot-Rosseau et al., 2007; Giovannelli et al., 2007).
Em bovinos, existem poucos relatos da presença de BPV no sêmen (Carvalho et al., 2003;
Yaguiu et al., 2006).
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Embora os processos de reprodução assistida sejam usados com diferentes propósitos em
humanos e animais, um objetivo comum é a prevenção da transmissão de doenças pela via
seminal. No entanto, ainda se faz necessário um maior conhecimento em processos de
desinfecção do sêmen utilizado em técnicas de reprodução assistida (Bielanski, 2007).
Considerando a ampla utilização do sêmen congelado, a contaminação deste com BPV pode ter
grande importância para os processos de inseminação artificial (IA) e transferência de embriões
(TE). O objetivo deste trabalho foi avaliar a presença de BPV, através da técnica PCR, em
espermatozóides e plasma seminal de amostras obtidas de sêmen fresco e congelado de touros
(Bos taurus), bem como sua associação com a qualidade do sêmen.
MATERIAL E MÉTODOS
Amostras de sêmen
Foram utilizadas 20 amostras de sêmen congelado de touros (Bos taurus indicus) da raça
Gir Leiteiro, adquiridas de distribuidora nacional e 9 amostras de sêmen fresco de touros de
rebanho, pertencentes ao Estado de Pernambuco (Brasil). As amostras de sêmen fresco foram
coletadas por eletroejaculação e resfriadas por 24h até o processamento no laboratório.
Preparação das amostras
As amostras de sêmen congelado foram descongeladas em banho-maria a 37°C por 30
segundos. Para separação do plasma seminal dos espermatozóides, todas as amostras foram
centrifugadas a 1200 g por 10 min. Um volume de 200 µL do sobrenadante foi utilizado para
separação de DNA a partir do plasma seminal. O sedimento de células obtido após a
centrifugação foi submetido a lavagens com PBS (solução salina 0,9% tamponada com fostato,
pH 7,4) e novamente centrifugado a 1200 g por 10 min. O sedimento final obtido foi
ressuspendido em 200 µL de PBS para posterior extração de DNA.
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Extração de DNA
Todas as amostras foram submetidas à extração de DNA com o kit comercial “Qiagen
DNA Easy Blood and Tissues Kit” (Qiagen), utilizando a metodologia de acordo com o
protocolo do fabricante, onde em um microtubo foram utilizados 200 µL de semen, adicionados
25 µL de proteinase K e 200 µL de tampão AL, misturados vigorosamente e incubados a 65°C
por 10 min. Posteriormente, 200 µL de etanol absoluto foi adicionado e a mistura foi transferida
para a coluna QIAamp. Foi realizada centrifugação a 6000 g por 1 min. O microtubo foi
descartado e a coluna foi lavada duas vezes com os tampões AW1 e AW2. A eluição do DNA foi
realizada com 50 µL do tampão AE aquecido a 65°C. O DNA coletado após a centrifugação foi
utilizado diretamente para a PCR.
Detecção viral por PCR
Para controle da qualidade do DNA extraído, foi realizada PCR utilizando os primers
específicos para o gene da β -globina (Tabela 1) bovina que produzem um produto de
amplificação de 450 pb.
As amostras positivas foram avaliadas quanto à presença de BPV utilizando-se os pares
de primers genéricos MY11/MY09 (Manos et al., 1989) e FAP59/FAP64 (Tabela 1) (Forslund et
al., 1999) para detecção geral de papilomavírus. Para cada reação de 25 µL, foram utilizados 5
µL dos 50µL de DNA obtidos após extração, 0,25 µM de cada primer e 12,5µL de Master Mix
(Promega) de acordo com o protocolo do fornecedor. O perfil térmico das etapas de reações foi
seguido de acordo com o protocolo descrito em Ogawa et al. (2004).
Para a detecção de seqüências de DNA específicas paras os BPV-1 a 6 foram utilizados
primers específicos para cada tipo viral (Tabela 1). Reações de padronização para cada primer
foram realizadas, tendo sido ajustadas as temperaturas de anelamento para se obter especificidade
em cada reação. Clones de BPV-1 a 6 foram utilizados como controle positivo para cada primer e
reações cruzadas entre os clones de BPV e os primers para cada tipo viral foram realizadas para
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Avaliação da Presença de Papilomavírus ...
certificaçãoda especificidade de cada primer. Todos os primers se mostraram específicos para
cada tipo viral, com exceção do primers para BPV3 que amplificou os clones de BPV3 e 6. Para
cada reação de 25 µL, foram utilizados 5 µL dos 50µL de DNA obtidos após extração de DNA,
0,2 µM de cada primer e o 12,5µL do kit de reagentes Master Mix (Promega, EUA). O ciclo das
reações foi adaptado do protocolo descrito em Stocco dos Santos et al. (1998), e consistiu de uma
desnaturação inicial por 3 min a 95ºC, seguido por 35 ciclos de desnaturação a 94ºC por 40s,
anelamento por 40s a 68°C com os primers para BPV-1, 55°C com primers para BPV-2, 60°C
com os primers para BPV-3,4 e 5, e 65°C com os primers para BPV-6 e extensão por 1 min a
72ºC.
Os produtos de amplificação (10µL) foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a
2% em tampão TAE, corados com brometo de etídio, visualizados sob luz ultravioleta e
fotodocumentados.
Avaliação de vigor e motilidade espermática
A motilidade progressiva e o vigor espermático foram analisados de forma subjetiva em
um microscópio óptico (Olympus, Japão), entre lâmina e lamínula previamente aquecidas a 37°C.
A motilidade foi determinada pela estimativa da porcentagem de espermatozóides com
movimento progressivo retilíneo entre 0 a 100% em uma amostra de sêmen, enquanto o vigor foi
estimado pela velocidade de movimentação dos espermatozóides, em uma escala de zero (0) a
cinco (5), sendo o escore 0 equivalente à ausência total de movimento dos espermatozóides e o
escore 5 à movimentação intensa, vigorosa e progressiva (Souza et al., 2006).
Avaliação da integridade de acrossoma
Para confecção dos esfregaçosestiraços foram utilizados 10 µL de sêmen, os quais foram
armazenados a 4 oC, protegidos da luz e analisados utilizando-se a técnica de coloração FITCconjugada ao Peanut aglutinina (FITC-PNA; Roth et al., 1998). No momento da análise, as
lâminas foram coradas com 30 µL de solução de PNA (20 µL PNA + 480 µL PBS), sendo
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depositada no centro da lâmina e procedendo-se à homogeneização da amostra a fim de cobrir
grande extensão da lâmina. Em seguida, as lâminas foram refrigeradas (4 ºC) durante 20 minutos,
mergulhadas em 50mL de PBS e colocadas em caixa de isopor para secagem em temperatura
ambiente. Após secagem, alíquotas de 5 µL da solução UCD [5 mg Azida sódica, 0,5 mL PBS,
0,1 % w/v Fenilenediamina (Sigma, USA), 4,5 mL Glicerol; pH 8,0] foram colocadas entre
lâmina e lamínula e observadas em microscópio de fluorescência (Olympus, Japão), utilizando o
filtro de fluoresceína (450-490 nm, espelho dicromático de 510 nm), onde foram contados 200
espermatozóides/lâmina e classificados em: a) acrossomas intactos (AI), quando a região
acrossomal apresentava fluorescência verde; b) acrossomas reagidos (AR), quando nenhuma
coloração estivesse presente ou fosse observada apenas uma faixa verde fluorescente na região
equatorial da cabeça espermática.
Integridade de DNA espermático
Amostras de sêmen descongeladas (10µL) foram armazenadas em 990 µL de uma solução
TNE [0,877g de NaCl (0,15M); 0,1576g de TRIS-HCl (0,01M); 37,2 mg de EDTA.Na2.2H2O
(1mM); q.s.p. 100mL; em pH de 7,4] a -196 oC para posterior avaliação da integridade de DNA
espermático usando o corante Laranja de Acridina (Evenson et al., 2002). Alíquotas (100 µL) das
amostras foram descongeladas a 37 oC e transferidas para tubos de microcentrífuga colocados em
gelo, onde foram adicionados 200 µL da solução detergente [0,1 mL Triton X-100 (0,1% v/v);
0,877g de NaCl (0,15M); 8 mL 1N HCl (0,08N)], e incubados durante 30 segundos. Em seguida,
foram adicionados 600 µL da solução de Laranja de Acridina – solução C [60 µL da solução B
(1mg de Laranja de Acridina em 1 mL de água de miliQ) adicionado em 9940 µL da solução A
(37 mL 0,1M ácido cítrico; 63 mL 0,2 M fosfato de sódio; 0,877 g NaCl (0,15 M) e 37,2 mg
EDTA (1mM) em pH 6,0]. Após homogeneização, 200 células foram avaliadas em microscópio
de fluorescência (Olympus, Japão), utilizando o filtro de fluoresceína (450-490 nm, espelho
dicromático de 510 nm). As células coradas de verde fluorescente foram classificadas como
portadoras de DNA íntegros, enquanto aquelas que emitiram fluorescência vermelha, laranja ou
amarela foram classificadas como portadoras de DNA danificado.
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RESULTADOS
A presença de DNA de papilomavírus foi verificada em sêmen fresco e congelado de
touros tanto com os primers de detecção geral (MY09/11 e FAP59/64) (Figuras 1 e 4; Tabela 2)
quanto com os primers específicos para BPV-1 a 6 (Figuras 2 , 3, 5 e 6; Tabelas 3 e 4). Os
primers específicos para BPV mostraram-se mais sensíveis do que os de detecção geral,
alcançando o nível de detecção de 100% nas amostras analisadas (BPV2), contra 50,0%
utilizando os primers gerais MY09/11 em sêmen congelado e 77,0% nas amostras de sêmen
fresco.
Nas amostras de sêmen congelado comercial, o tipo viral mais freqüentemente encontrado
foi BPV-2, em 100% das amostras de espermatozóides, seguido por BPV-3 em 30% das
amostras. O DNA de BPV2 foi detectado em 100% das amostras de espermatozóide e 96% de
plasma seminal. O tipo viral BPV3 foi menos freqüente que o BPV2 tendo sido encontrado em
30% das amostras de espermatozóides e 20% das amostras de plasma seminal
Nas amostras de sêmen fresco houve detecção de BPV2 em 100% das amostras avaliadas
e de BPV3 em 91% destas. Em espermatozóides houve detecção de BPV2 e BPV3 em 100% das
amostras analisadas, e em plasma seminal houve detecção de BPV2 em 100% das amostras e
BPV3 em 66,0%.
Das 20 amostras de espermatozóides de sêmen congelado avaliadas, 3 (15%) foram
positivas para os tipos virais BPV-2 e 3 (amostras 6, 10 e 19; Figuras 2 e 3), e nas amostras de
plasma seminal houve co-detecção de BPV-2 e 3 em 25,0% do total (amostra 10P – Figuras 2 e
3). Nas amostras de espermatozóides obtidos de sêmen fresco houve detecção de DNA de BPV2 e 3 em 100% das amostras analisadas (Figuras 5 e 6), e duas amostras (25 e 27) foram positivas
para BPV-2, 3 e 4 (22,2%) (Figuras 5 e 6). Em plasma seminal de sêmen fresco houve detecção
de BPV-2 e 3 em 66,6% das amostras analisadas.
Os primers para β-globina amplificaram um fragmento de 450pb em todas as amostras de
espermatozóide utilizadas e em 25% das amostras de plasma seminal, sendo apenas as amostras
positivas utilizadas para as PCR de detecção de BPV para se evitar um resultado falso-negativo.
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Para os parâmetros de qualidade do sêmen congelado analisados, foram encontrados os
sequintes valores: motilidade espermática 60,0 ± 16,8%; vigor 3 ± 0,4; integridade acrossômica
68,5 ± 20,8% e integridade do DNA espermático 97 ± 3,8% das células analisadas.
DISCUSSÃO
Os Papilomavírus estão dispersos entre os vertebrados e se diversificaram ao longo da
história evolutiva desses grupos (Gottschling, 2007). Eles infectam queratinócitos e fibroblastos,
podendo causar lesões na pele e mucosa e estão envolvidos em processos neoplásicos, como
câncer do colo de útero em mulheres, cânceres de bexiga e do trato gastro-intestinal superior em
bovinos (zur Hausen, 1996; Campo, 2006).
Utilizando primers gerais para PV e primers específicos para BPV, foi avaliada a
presença de BPV no plasma seminal e em espermatozóides de sêmen fresco e congelado de
bovinos.
Os pares de primers FAP59/64 e MY09/11, embora tenham sido desenhados para
detecção de HPV em pele (FAP59/64) (Forslund et al., 1999) e epitélio mucoso (MY09/11)
(Manos et al., 1989) já foram utilizados para detecção de BPV em outros trabalhos, onde o nível
de detecção dos primers FAP59/64 para BPV variou de 21% a 100% e dos primers MY09/11 foi
de 8% (Antonsson & Hansson, 2002; Ogawa et al., 2004; Literak et al., 2006; Claus et al., 2007;
Maeda et al., 2007). Foi possível se detectar BPV em sêmen de touros utilizando esses pares de
primers, porém com uma menor sensibilidade do que utilizando-se os primers específicos para
BPV. Isto pode ser explicado devido ao tamanho do fragmento amplificado pelos primers
FAP59/64 e MY09/11, em torno de 450pb, e dos primers específicos para BPV, de 216pb a
300pb, como também pela constituição dos primers, sendo que os de detecção geral possuem
bases degeneradas em sua formação, o que pode diminuir sua sensibilidade ou por diferenças nas
sequências de nucleotídeos na região L1, onde os primers se anelam, visto que esses primers
foram desenhados para se anelarem em HPV.
Foi encontrada uma alta freqüência de BPV2 e BPV3/6 nas amostras analisadas, tendo
sido mais encontrados em amostras de espermatozóide do que em plasma seminal. Entre as
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amostras de o sêmen fresco obtidas de touros criados no Estado de Pernambuco e as de sêmen
congelado de touros comercializado por distribuidoras nacionais, houve uma diferença em
relação à detecção dos tipos virais BPV3/6, sendo estes mais freqüentes em amostras de sêmen
fresco obtidas de touros criados nesta região.
No Brasil, já foi detectada a presença de BPV1, 2, 4 e 6 nos Estados de São Paulo e
Paraná (Stocco dos Santos et al., 1998; Carvalho et al., 2003; Freitas et al., 2003; Wosiacki et al.,
2005, 2006; Claus et al., 2007). Os BPV do tipo 1, 2 e 4 são mais comumente estudados devido à
sua importância na etiologia do câncer de bexiga urinária e sarcóide eqüino (BPV1 e 2) e câncer
do trato gastro-intestinal superior (BPV4) (Campo, 1997; Campo, 2006; Borzacchielo, 2007). O
tipo viral BPV3 foi isolado na Austrália a partir de um papiloma epitelial de pele e pouco se sabe
a respeito da sua história natural (Campo, 2006). O BPV6 tem sido, com frequência, relacionado
com papilomas localizados no úbere e nos tetos, podendo causar problemas durante a ordenha das
vacas (Borzacchielo, 2007).
Embora os BPV sejam descritos como epitélio-específicos, sua presença já foi encontrada
em diferentes tecidos e fluidos corporais, sangue periférico, plasma sanguíneo, leite e colostro
(Stocco dos Santos et al., 1998; Freitas et al., 2003; Wosiacki et al., 2005; Freitas et al., 2007),
além de tecidos e células reprodutivas, incluindo oócitos, ovário, útero, células do cumullus,
lavado uterino (Carvalho et al., 2003; Yaguiu et al., 2006), placenta e líquido amniótico (Freitas
et al., 2007).
A detecção de material viral em espermatozóides levanta a questão de que o vírus não
somente pode estar presente no sêmen devido à liberação de material genético de células
epiteliais que revestem o trato reprodutor, como também evidencia a possibilidade desses vírus
estarem infectando células não-epiteliais, como espermatozóides. Outros trabalhos vêm
demonstrando a presença de BPV em espermatozóide (Carvalho et al., 2003; Yaguiu et al.,
2006), onde foi detectada a presença de BPV 2. Na literatura, já foi discutida a possibilidade de
células sanguíneas agirem como sítios de disseminação do vírus para tecidos não-epiteliais e
fluidos corporais, em especial o trato reprodutivo e gametas (Freitas et al., 2003; Bodaghi et al.,
2005; Freitas et al., 2007). Infecções no trato reprodutor e células sanguíneas são apontadas como
fontes de contaminação do sêmen por microrganismos (Bielanski, 2007).
Células espermáticas são capazes de adsorver DNA exógeno para seu interior tanto em
fase de formação (espermiogênse) quanto já formadas (Brackett et al., 1971; Spadafora, 1998;
- 33 -
Silva, MAR
Avaliação da Presença de Papilomavírus ...
Smith & Spadafora, 2005; Spadafora, 2007), processo facilitado após a lavagem do sêmen, em
virtude da retirada de moléculas inibidoras deste processo. Dessa forma, caso o DNA do vírus
esteja presente no plasma seminal, ele poderá passar para o espermatozóide. Neste estudo foi
verificada a presença do DNA de BPV em um número semelhante de amostras de
espermatozóide e plasma seminal, mostrando que o plasma seminal pode agir como fonte de
contaminação do espermatozóide.
A presença de HPV no sêmen tem sido demonstrada na literatura (Ostrow et al., 1986;
Green et al., 1991; Chan et al., 1994; Olatunbosun et al., 2001; Rintala et al., 2004; Bezold et al.,
2007; Didelot-Rosseau et al., 2007; Giovannelli et al., 2007). Há diversas implicações da
infecção viral para o espermatozóide, tais como queda na motilidade (Lay et al., 1996), aumento
na fragmentação do DNA e apotose (Connely et al., 2001) e diminuição na concentração de
espermatozóides (Nielson et al., 2007), refletindo na diminuição da capacidade reprodutiva do
animal.
Neste estudo, a presença de BPV em sêmen congelado parece não afetar a qualidade
espermática, uma vez que os parâmetros analisados de vigor, motilidade, integridade do
acrossoma e DNA estão dentro dos resultados esperados para amostras de sêmen comercializadas
(CBRA, 1998), com exceção de um animal que apresentou baixa motilidade (30%) e vigor (2) e
alto índice de células espermáticas com acrossomas reagidos (XX%). Rintala et al. (2004),
analisando a associação entre HPV de alto risco e qualidade do sêmen em humanos, não
observaram alteração na motilidade, vigor e concentração dos espermatozóides devido à presença
de HPV. Caso o BPV afetasse a qualidade do sêmen, isto poderia contribuir para selecionar
sêmen de touros que não possuíssem o vírus, visto que a Organização Mundial de Saúde Animal
(OIE) não exige notificação para as papilomaviroses (World Organisation for Animal Health,
2008), apesar das perdas econômicas causadas por estas doenças aos criadores.
É necessário compreender melhor os possíveis danos causados aos espermatozóides pela
presença de BPV, pois não existem dados na literatura para correlacionar a presença de um ou
mais tipos de BPV no sêmen com danos aos espermatozóides ou prejuízo do processo
reprodutivo. Neste trabalho, além de ter sido detectada a presença de BPV no sêmen, também foi
possível detectar a presença de mais de um tipo viral em algumas amostras. Outros trabalhos
detectaram a presença de um ou mais tipos de BPV em animais aparentemente saudáveis, o que
levou a se sugerir uma natureza comensal para esses vírus (Antonsson & Hansson, 2002; Ogawa
- 34 -
Silva, MAR
Avaliação da Presença de Papilomavírus ...
et al., 2004). Os animais utilizados para a colheita das amostras de sêmen fresco não
apresentavam nenhum sintoma clínico de papilomatose, apesar de ter sido detectada a presença
dos BPVs do tipo 2 e 3/6 nas amostras de sêmen de todos os animais e do BPV4 no sêmen fresco
de dois dos nove animais.
Há relatos na literatura demonstrando o potencial dos espermatozóides em transferir DNA
exógeno para células com as quais eles entrem em contato, inclusive DNA de papilomavírus
(Chan et al., 1996; Kadze et al., 2002). Além disso, também é discutida a possibilidade dos
espermatozóides agirem como vetor na transmissão de DNA de HPV para células do cumullus,
podendo determinar falhas de implantação (Kadze et al., 2002), além da presença do vírus em
placenta aparentemente ter relação com abortos espontâneos (Matovina et al., 2004). Uma outra
implicação da presença de BPV no sêmen é a possível disseminação deste vírus através da
inseminação artificial, metodologia reprodutiva intensamente aplicada em rebanhos bovinos.
Neste estudo, foi verificada a presença de DNA de pelo menos um tipo de BPV em todas
as amostras de sêmen fresco ou congelado comercializado no Estado de Pernambuco. Estes dados
estão em convergência com os obtidos por Carvalho (2008), onde o DNA destes mesmos tipos
virais encontrados no sêmen congelado foi detectado em verruga de bovinos criados na região,
sugerindo a possibilidade de que o sêmen contaminado possa estar disseminando o vírus. Este
achado aponta para a conclusão da urgente necessidade de mais estudos sobre a relação BPV e
sêmen bovino visando compreender melhor suas implicações, uma vez que os prejuízos causados
pela papilomaviroses são economicamente significativos.
- 35 -
Silva, MAR
Avaliação da Presença de Papilomavírus ...
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Tabela 1 – Primers utilizados para detecção de Papilomavírus e amplificação do gene β-globina bovina
Primer
Sequência
Região obtida
Tamanho do
fragmento
β-globina bovina
Fw: 5’ – AAC CTC TTT GTT CAC AAC CAG 3’
Rev 5’ – CAG ATG CTT AAC CCA CTG AGG 3’
Gene β-globina bovina
450 pb
FAP59/FAP64
FAP59 5’-TAA CWG TIG GIC AYC CWT ATT-3’
FAP64 5’- CCW ATA TCW VHC CAT ITC ICC ATC-3’
Gene L1 de
Papilomavírus
Cerca de 400 pb
MY09/MY11
MY115’-GCM CAG GGW CAT AAY AAT GG-3’
MY09 5’-CGT CCM ARR GGA WAC TGA TC-3’
Gene L1 de
Papilomavírus
Cerca de 400 pb
BPV1F/BPV1R
BPV1F – 5’ GGA GCG CCT GCT AAC TAT AGG 3’
BPV1R – 5’ ATC TGT TGT TTG GGT GGT GAC 3’
300 bp
BPV2F/BPV2R
BPV2F – 5’ GTT ATA CCA CCC AAA GAA GAC CCT 3’
BPV2R – 5’ CTG GTT GCA ACA GCT CTC TTT CTC 3’
Gene L1 (5721 – 6021nt
GeneBank Access
X02346)
Gene L1 (6888 – 7051nt
GeneBank Access
M20219)
BPV3F/BPV3R
BPV3F – 5’ CAG TCA ATT GCA ACT AGA TGC C 3’
BPV33R – 5’ GGC TGC TAC TTT CAA AAG TGA 3’
Gene L1 (6620 – 6836nt
GeneBank Access
AF486184)
216 pb
BPV4F/BPV4R
BPV4F – 5’ GCT GAC CTT CCA GTC TTA AT 3’
BPV4R – 5’ CAG TTT CAA TCT CCT CTT CA 3’
Gene E7 (642 – 812nt
GeneBank Access
X05817)
170 bp
BPV5F/BPV5R
BPV5F – 5’ GGC ATG TAG AGG AAT ATA AGC 3’
BPV5R – 5’ TTC TCT GAG ATC AAT ATT CC 3’
Gene L1 (6646 – 6908nt
GeneBank Access
AF457465)
262 bp
BPV6F/BPV6R
BPV6F – 5’ TTA GAG ACC TGG AAC TTG GG 3’
BPV6R – 5’ TAC GCT TTG GCG CTT TTT TGC 3’
Gene L1 (6829 – 7123nt
GeneBank Access
AJ620208)
294 bp
163 bp
Tabela 2 – Detecção de DNA de Papilomavírus em amostras de espermatozóides e plasma seminal de
sêmen fresco e congelado de touros (Bos taurus)
Amostras
Sêmen congelado positivo
Espermatozóides de sêmen
congelado positivos
Plasma seminal de sêmen congelado
positivo
Sêmen fresco positivo
Espermatozóides de sêmen fresco
positivos
Plasma seminal de sêmen fresco
positivo
Total de amostras analisadas
(espermatozóide + plasma seminal)
ND – Não determinado
Primers
MY09/11
12/24
(50%)
10/20
(50%)
2/4
(50%)
7 /12
(58%)
7/9
(77%)
0
FAP59/64
3/24
(12,5%)
2 /20
(10%)
1/4
(25%)
ND
36
(29+7)
24
(20+4)
ND
ND
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Tabela 3 – Detecção de DNA de BPV em amostras de espermatozóides e plasma seminal de sêmen
congelado de touros (Bos taurus) da raça Gir Leiteiro
Tipo viral
BPV1
BPV2
BPV3/6
BPV4
BPV5
0
24/24
4/24
0
0
(100%)
(17%)
20/20
3/20
0
0
(100%)
(15%)
4/4
1/4
0
0
(100%)
(25%)
24
24
24
24
24
(20+4)
(20+4)
(20+4)
(20+4)
(20+4)
Total de amostras
positivas
Total de amostras
0
espermatozóide
positivas
Total de amostras
0
plasma seminal
positivas
Total de amostras
analisadas
(espermatozóide
+ plasma seminal
Tabela 4 – Detecção de DNA de BPV em amostras de espermatozóides e plasma seminal de sêmen fresco
de touros (Bos taurus) criados em Pernambuco
Tipo viral
Total de amostras
BPV1
BPV2
BPV3/6
BPV4
BPV5
0
12/12
11/12
0
0
(100%)
(91%)
9/9
9/9
0
0
(100%)
(100%)
3/3
2/3
0
0
(100%)
(66%)
12
12
12
12
12
(9+3)
(9+3)
(9+3)
(9+3)
(9+3)
positivas
Total de amostras
0
espermatozóide
positivas
Total de amostras
0
plasma seminal
positivas
Total de amostras
analisadas
(espermatozóide
+ plasma seminal
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C+
Avaliação da Presença de Papilomavírus ...
M
6
7
8
9
10
11
12
14
16
17
18
19
20
C-
Figura 1 – Amplificação por PCR de DNA de PV com os primers MY09/11 em amostras de sêmen
congelado (espermatozóide) de touros (Bos taurus indicus) da raça Gir Leiteiro. M – marcador de
100pb, C+ controle positivo, C- controle negativo. Números 6 a 20 amostras de espermatozóide.
M
C+
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
C-
C+
M
1P
4P
8P
10P
C-
B
A
Figura 2 – Amplificação por PCR de DNA de BPV2 em amostras de sêmen congelado (espermatozóide e
plasma seminal) de touros (Bos taurus indicus) da raça Gir Leiteiro. 2.A Números 1 a 10 indicam amostras de
espermatozóide. 2.B Números 1P A 10P indicam amostras de plasma seminal. M – marcador de 100pb, C+
controle positivo, C- controle negativo.
C+ M
A
6
10
C-
C+ M
19
10P
C-
B
Figura 3 – Amplificação por PCR de DNA de BPV3 em amostras de sêmen congelado (espermatozóide e
plasma seminal) de touros. 3.A Números 6 e 10 indicam amostras de espermatoíde. 3.B Número 19 indica
amostra de espermatozóide e 10P indica amostra de plasma seminal M – marcador 100pb, C+ controle
positivo, C- controle negativo.
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Silva, MAR
C+
Avaliação da Presença de Papilomavírus ...
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
C-
Figura 4 – Amplificação por PCR de DNA de PV com os primers MY09/11 em
amostras de sêmen fresco (espermatozóide) de touros (Bos taurus). M – marcador de
100pb, C+ controle positivo, C- controle negativo. Números 1 a 9 amostras de
espermatozóide.
C+
M
21
22
23
24
25
26
27
28
29
C+
M
24P 26P 29P
B
A
Figura 5 – Amplificação por PCR de DNA de BPV2 em amostras de sêmen fresco
(espermatozóide e plasma seminal) de touros (Bos taurus). 5.A Números 21 a29 idicam amostras de
espermatozóide. 5.B Números 24P a 29P indicam amostras de plasma seminal. M – marcador de
100pb, C+ controle positivo, C- controle negativo.
C+ M
A
21
22
23
24
25 26
27
28
29
C-
C+ M 24P 26P 29P
B
Figura 6 – Amplificação por PCR de DNA de BPV3 em amostras de sêmen fresco
(espermatozóide e plasma seminal) de touros (Bos taurus). 6.A Números 21 a 29 indicam
amostras de espermatozóide. 6.B Números 24P a 29P indicam amostras de plasma
seminal. M – marcador de 100pb, C+ controle positivo, C- controle negativo.
- 43 -
Silva, MAR
Avaliação da Presença de Papilomavírus ...
5. CONCLUSÕES
Estes resultados apontam a importância de estudos detectando a presença de BPV no
sêmen e no trato reprodutor masculino visando uma maior compreensão no processo de
disseminação do papilomavírus e controle da papilomatose, uma vez que o sêmen com
contaminação tanto oriundo de centrais de comercialização quanto de touros criados no Estado de
Pernambuco pode estar agindo como um veículo de disseminação para o vírus.
- 44 -
Silva, MAR
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6. ABSTRACT
Papillomaviruses (PV) are viruses that contain double strand DNA and can infect the squamous
epithellium of the skin and mucosa. There are 10 different types of BPV (BPV-1 to 10) and they
can cause serious diseases in dairy herds or cutting, creating great economic losses to farmers in
Brazil and other countries. The presence of BPV has been detected in reproductive tissues and
body fluids, such as peripheral blood, blood plasma, oocytes, ovary, uterus, the cells cumullus,
uterine fluids, semen and sperm, placenta and amniotic fluid. Presumptive diagnosis of the
infection has been made based on histological findings of the lesions and alterations in cell
morphology. Conclusive diagnosis has been obtained by identification of viral DNA in tissue
fragments using techniques such as Southern blot and polymerase chain reaction (PCR). This
study aimed to evaluate the presence of BPV, using the PCR technique, in semen of bulls (Bos
taurus) marketed in the state of Pernambuco and evaluate the association pf BPV and quality of
semen. An set of primers for general detection of PV and specifics types of BPV1-6 was used in
samples of fresh semen and sperm from commercial bulls of the breed Gir Leiteiro. The quality
of semen was evaluated by the parameters of motility, vitality, verifying the integrity acrosome
and integrity of DNA. It was detected the presence of DNA of BPV in 100% of samples of semen
analyzed. The most frequent type virus was the BPV-2, followed by BPV-3 and BPV-4. The
presence of BPV did not affect the semen analysis. These results demonstrate the importance of
studying in better details the relationship between BPV and semen. Given the widespread use,
artificial insemination with BPV contaminated sperm can have similar importance as the sexual
route to the viral dispersion in the herd.
KeyWords: Bovine Papilomavirus, bulls, semen, PCR
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