modelo tumoral in situ em camundongos swiss de linhagem hela e

MODELO TUMORAL IN SITU EM CAMUNDONGOS SWISS DE
LINHAGEM HELA E POLICAPROLACTONA COMO
SUBSTRATO
Fernanda Lima de Souza Castro1, Patrícia Lima Falcão1, Tarcísio Passos Ribeiro de
Campos1.
1
Depto. de Engenharia Nuclear, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte (MG), Brasil
E-mail: [email protected]
Resumo. Atualmente o Núcleo de Radiações Ionizantes NRI/DEN-UFMG investiga o comportamento
biológico de linhagens de células tumorais em estudos in vitro e in vivo. Existem estudos que têm
demonstrado variações na resposta celular em decorrência de estímulos exógenos, como no caso das
radiações ionizantes. Estudos do NRI têm abordado o efeito biológico da indução de linhagens tumorais
in situ utilizando a policaprolactona como substrato. O presente estudo tem como objetivo avaliar o
perfil celular de tumores induzidos em camundongos SWISS utilizando uma matriz de policaprolactona e
a linhagem de tumor cervical HeLa. A linhagem HeLa foi expandida in vitro na presença e ausência do
substrato até alcançar a confluência celular e aderência de uma monocamada de células ligadas
covalentemente. No experimento-piloto, utilizamos um camundongo no qual foi implantado a matriz
polimérica com células aderidas através de uma incisão no dorso para indução de um tumor in vivo e
um segundo animal como controle. Nesse estudo forami avaliados o perfil de células adjacentes ao
tumor, através de biópsia, bem como a proliferação das células HeLa in situ e crescimento tumoral,
através de contagem do número absoluto de células do sistema imunológico antes e após a induçã.
Conclui-se que foi possível A monitorar a resposta celular e a resposta do animal à presença do tumor
induzido em matriz de policaprolactona.
Palavras-chave: Policaprolactona, Linhagem tumoral HeLa, Indução Tumoral.
1.
INTRODUÇÃO
O grupo de pesquisa NRI (Núcleo de Radiações Ionizantes/DEN/UFMG) tem
desenvolvido estudos que abordam o efeito biológico da indução de linhagem de tumor
cervical humano (HeLa) e a possibilidade do uso de matriz de biopolímero
policaprolactona como substrato em camundongos SWISS. Historicamente, a
experimentação animal se tornou ferramenta essencial em pesquisa. Ela possibilita a
descoberta, análise e simulação de reações in vivo das técnicas testadas e sua posterior
extrapolação para o modelo humano. Devido ao envolvimento de cobaias, para que o
modelo seja utilizado é necessária aprovação do Comitê de Ética em Experimentação
Animal, que avalia as diretrizes dos projetos e sua adequação ao modelo de bem estar
animal.
Segundo Tavares et. al (2011) os biopolímeros têm se revelado promissores na
engenharia de tecidos, em especial a policaprolactona. Isso se deve a certas
características desejáveis presentes nesses materiais, como a possibilidade de controle
da sua composição, biocompatibilidade, biodegradação, porosidade e habilidade de
servir como base para a adesão e proliferação celular. É importante que o polímero
permita que as células criem seu próprio microambiente, com agregação e migração
celular, entrega e retenção de fatores bioquímicos, distribuição de nutrientes celulares e
drenagem de metabólitos, o que possibilita seu uso como substrato.
O uso de matrizes poliméricas biocompatíveis como modelo de indução de
tumores possibilita ampliar a técnica de indução de tumores in vivo, pois um substrato
geometricamente definido permite maior controle da evolução da linhagem cancerosa e
seu status perante um agente exógeno antimitótico, como radiação ou quimioterápicos.
Neste contexto, temos como propósito a investigação do efeito biológico da indução de
tumor de linhagens tumorais in situ, utilizando a policaprolactona como substrato. A
princípio serão investigados os parâmetros celulares in vivo, com a contagem do
número absoluto de células obtidas de sangue total antes e após a indução, com o
objetivo de monitorar a resposta celular e o comportamento do sistema imunológico ao
implante do modelo tumoral. Será também investigada a resposta inflamatória in situ e
adjacente ao tumor induzido através de biópsia para monitoramento da resposta ao
tumor.
2.
MATERIAIS E MÉTODOS
Os principais materiais utilizados foram Polycaprolactone (SIGMA-ALDRICH,
EUA); Ketamina 10% (Francotar - Virbac, Brasil); Xilazina 2% (Virbaxyl - Virbac,
Brasil); Cloridrato de Lidocaína 2% sem vasoconstrictor (Xylestesin - Cristalia); Meio
de cultura DMEN (SIGMA, EUA).
2.1
Síntese da matriz polimerica
Para a confecção do disco de policaprolactona, amostras do polímero foram
moldadas após aquecimento e extrusão, até atingirem a espessura de laminas de 1mm. O
filme formado foi então cortado em discos de 4 mm de diâmetro. Esses foram
esterilizados por meio de radiação e mantidos de maneira asséptica.
2.2
Expansão celular no substrato polimérico
A linhagem HeLa foi expandida in vitro, em garrafas de 25cm³, na ausência e
presença do substrato pelo período de 07 (sete) dias corridos, em estufa a 37°C com
3.3% de CO2. As culturas foram suplementadas a cada 02 (dois) dias, com troca de
meio de cultura DMEN e repique das mesmas. Após a confluência das garrafas, um
polímero contendo uma monocamada celular ligada covalentemente foi coletado da
garrafa, com o auxílio de uma pinça anatômica, e reservado para a indução.
2.3
Animais
Para a realização deste estudo foram utilizados dois ratos machos da linhagem
SWISS com massa 50g, adquiridos do Centro de Bioterismo (CEBIO) do Instituto de
Ciências Biológicas da UFMG. Os animais foram mantidos em gaiolas plásticas, sob
condições constantes de temperatura, umidade, com livre acesso a ração e água. Este
trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CETEA) da
Universidade Federal de Minas Gerais.
2.4
Descrição do ato cirúrgico
O procedimento foi realizado no interior da capela de fluxo laminar previamente
limpa com álcool 70% e mantida sob lâmpada germicida durante 30min. O camundongo
foi previamente anestesiado, seguindo o protocolo do Comitê de Ética da UFMG
(CETEA), que determina o uso de Ketamina 10% (60 a 80mg/kg) e Xilazina 2% (8 a
15mg/kg), e os procedimentos de antissepsia realizados. Após incisão de
aproximadamente 0,5 cm, realizada com auxilio de um bisturi no dorso do animal, o
substrato foi implantado no interior. No local da incisão utilizou-se lidocaína 2%
(7mg/kg) sem vasoconstrictor, e utilizou-se sutura simples com fio agulhado de nylon.
O animal foi mantido em gaiola separada e em sala isolada para recuperação.
2.4 Monitoramento do sistema imune
O monitoramento do sistema imune consistiu em avaliar o número total de
células do animal (camundongo SWISS de 50 gramas de massa) antes e após o
implante. Sumariamente, a contagem das células foi determinada adicionando-se 01 µL
de solução cristal violeta a 0,5% em ácido acético glacial a 30% a 900 L de suspensão
celular. A contagem foi realizada em câmara hemocitométrica de Neubauer e os
resultados expressos em número absoluto de células. Para contagem diferencial, a
suspensão celular do animal foi ajustada para a concentração de 1 x 106 células/ml e 200
mL foram centrifugados por cinco minutos a 1.500 rpm. Em seguida, a lâmina foi
removida, fixada e corada para a contagem. Os percentuais de linfócitos e
polimorfonucleados (PMN) foram determinados contando-se 100 células com objetiva
de aumento 100x
3.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A Figura 1 ilustra a confluência das células de linhagem HeLa sobre a superfície
do polímero. Pode-se observa o total recobrimento da matriz polimérica com células
cancerosas.
Figura 1. Imagem da agregação celular (HeLa) ao disco de policaprolactona (200 x).
Qualitativamente, pôde ser observado o êxito da técnica de implante utilizando
esse tipo de substrato. A Figura 2 ilustra os procedimentos aplicados no ato cirúrgico.
Figura 2. Ato cirúrgico: incisão realizada no dorso do animal com o auxílio de uma
lâmina de bisturi; inserção do substrato no interior da incisão com o auxilio de uma
pinça anatômica; sutura simples realizada com fio de nylon no local de incisão.
A cinética de intumescimento tumoral foi avaliada in situ permitindo a
investigação do papel do sistema imune no controle do tumor. O diâmetro do
intumescimento foi mensurado com o auxílio de um paquímetro (Fig. 3), considerando
a proliferação celular e o número de camadas de subpopulações celulares específicas do
sistema imune que estejam adjacentes ao tumor, já recoberto com células HeLa. É
importante salientar que o monitoramento do tamanho tumoral, em princípio de forma
semi-qualitativa a partir de um índice a ser atribuído, foi um dado valioso através da
cinética de tempo pós-implante. Nos primeiros 20 dias pós implante observou-se que a
evolução do tumor ficou restrita a matriz polimérica.
Figura 3. Medição do intumescimento com o auxílio de um paquímetro.
Dentro do contexto de que o sistema imune participa do processo de modulação
de resposta tumoral, foi avaliada a cinética do número absoluto de células circulantes,
através de punções na veia caudal, com esfregaço obtido a cada 15 dias após o implante
até o sacrifício do animal, que ocorrerá em torno do sexagésimo dia pós-indução.
A Figura 4 mostrou aumento significativo do número absoluto de células da
linhagem linfocítica e granulocítica nas primeiras duas semanas após o implante,
sugerindo em princípio uma resposta ao próprio implante. A manutenção da linhagem
linfocítica observada posteriormente poderia ser considerada como resposta de
contenção e modulação do sistema imunológico do animal, com uma tendência a conter
o efeito deletério induzido pelas células tumorais, e também não podendo ser descartada
a hipótese de resposta da matriz polimérica. No entanto, a histologia do tumor, com a
posterior marcação de receptores tumorais, poderá dar suporte à inferência da
importância dos produtos secretados pelas próprias células no recrutamento da resposta
imune aos efeitos do tumor. Em contrapartida, observou-se uma pequena diminuição do
número absoluto de granulócitos, sugerindo que no primeiro momento, a resposta
ocorrida poderia ser de natureza inata, em decorrência do corpo estranho (polímero).
Vale salientar que o dado apresentado acima faz parte de um estudo preliminar e
que os efeitos toxicológicos do implante com linhagens tumorais, bem como o
monitoramento do tamanho do tumor dependem da resposta individualizada do animal,
da resistência das células tumorais e capacidade angiogênica das camadas que irão
recobrir o polímero ao longo do estudo.
Figura 4. Número absoluto de linfócitos e granulócitos de sangue total colhido
antes e após 15 (quinze) e 30 (trinta) dias pós-implante.
Como perspectiva, a etapa posterior consistirá na abordagem histológica do
tumor in situ, com a avaliação morfológica das monocamadas celulares de linhagem
tumoral, marcadas com anticorpo anti-receptor, bem como com a qualificação e
quantificação do perfil celular de células adjacentes.
CONCLUSÃO
Os dados apresentados nesse estudo são preliminares, e o número de animais e
de linhagens tumorais deverá ser ampliado, uma vez que a abordagem principal do
estudo é a avaliação piloto do comportamento do sistema imunológico frente à indução
de tumores com substratos específicos. Esse tipo de estudo torna-se de fundamental
importância no que diz respeito à avaliação da capacidade do sistema imunológico
responder de forma não imunossupressora aos efeitos de um tumor em modelo
experimental, utilizando camundongos que possuem grande homologia com o ser
humano, considerando o comportamento de algumas linhagens tumorais radioresistentes
ao tratamento que acometem os pacientes com câncer.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem ao CNPq e FAPEMIG pelo auxilio ao grupo de pesquisa
NRI/DEN-UFMG.
REFERÊNCIAS
1.
2.
3.
4.
5.
Comitê de Ética em Experimentação Animal – UFMG, Protocolos anestésicos.
<www.ufmg.br/bioetica/cetea>
D. S. Rosa, D. F. Penteado, M. R.. Calil, Propriedades Térmicas e Biodegradabilidade de PCL e
PHB em um Pool de Fungos, Revista de Ciência & Tecnologia, vol. 15, Junho de 2000.
E. J. Grant, K. Ozasa, D. L. Preston, A. Suyama, Y. Shimizu, R. Sakata, H. Sugiyama, T. M.
Pham, J. Cologne, M. Yamada, A. J. De Roos, K. J. Kopecky, M. P. Porter, N. Seixas, S. Davise,
Effects of Radiation and Lifestyle Factors on Risks of Urothelial Carcinoma in the Life Span
Study of Atomic Bomb Survivors, Radiation Research, 25 May 2012.
R. Langer, J. P. Vacanti, Tissue Engineering, Science, vol. 260, 14 May 1993.
V. A. C. D. Tavares, J. L. Ferreira, J. Carvalho e Silva, C. R. Henriques, J. P, Borges, Matrizes
de policaprolactona e quitosano para aplicação em engenharia de tecidos, Faculdade de ciências
e tecnologias, Universidade Nova de Lisboa, Setembro de 2011.
IN SITU MICE TUMORAL MODEL WITH HELA LINEAGE AND
POLYCAPROLACTONE AS SUBSTRATE
Fernanda Lima de Souza Castro1, Patrícia Lima Falcão1, Tarcísio Passos Ribeiro de
Campos1.
1
Depto. de Engenharia Nuclear, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte (MG), Brasil
E-mail: [email protected]
Abstract. Currently the Center for Ionizing Radiation (NRI) is investigating the biological behavior of
tumor cell lineages in vitro and in vivo. Studies have shown changes in cellular response due to
exogenous stimuli, such as ionizing radiation. NRI studies have addressed the biological effect of the
induction of tumor cell lineage in situ using the polycaprolactone as substrate. The present study aims to
evaluate the cellular profile of induced tumors in mice using the polymer polycaprolactone and the
lineage of cervical tumor HeLa. HeLa lineage was expanded in vitro in the presence and absence of the
substrate until reaching cell confluence and monolayer adherence of covalently bound cells. In this pilot
experiment, we used a mouse in which was implanted a polymer with adhered cells through an back
incision for induction of a tumor in vivo and a second animal as control. This study will assess the profile
of adjacent cells to the tumor, by biopsy, as well as HeLa cell proliferation and tumor growth in situ, by
counting the absolute number of cells of the immune system before and after induction in order to
monitor the cellular and animal response to the presence of induced tumor.
Keywords: Polycaprolactone, Tumor lineage HeLa, Tumor induction.