Identificação genética de tubarões: monitoramento da pesca e

54º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 54º Congresso Brasileiro de Genética • 16 a 19 de setembro de 2008
Bahia Othon Palace Hotel • Salvador • BA • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
Identificação genética de tubarões:
monitoramento da pesca e conservação
Mendonça, FF¹; Hashimoto, DT²; Silvério, J¹; Oliveira, C¹; Porto-Foresti, F²; Gadig, OBF³; Foresti, F¹
Laboratório de Biologia e Genética de Peixes - Instituto de Biociências de Botucatu
2
Laboratório de Genética de Peixes - Depto de Ciências Biológicas
3
Campus Experimental do Litoral Paulista - UNESP
[email protected]
1
Palavras-chave: conservação genética, PCR-multiplex, Citocromo Oxidase I, pesca de tubarões e finning
Nas últimas décadas, a captura comercial de tubarões vem aumentando acentuadamente em todo o mundo, totalizando
quase 500 mil toneladas anuais. Dados estatísticos da FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations)
sobre a exploração pesqueira de elasmobrânquios registraram no ano de 2005 a captura mundial de 466.158 toneladas
de tubarões, sendo o Brasil responsável pela captura de 14.753 toneladas, o equivalente a 3.26% do total. Contudo,
as dificuldades na identificação morfológica de muitas espécies de tubarões exploradas pela pesca, associadas à prática
bastante usual de remoção da cabeça e das nadadeiras dos animais, antes do desembarque, tem resultado em uma escassez
global de informações sobre a intensidade de captura e comercialização, tornando quase impossível a avaliação de seus
efeitos. De acordo com os relatórios a respeito da produção pesqueira apresentados pelo IBAMA nos últimos anos,
apenas 22% de todos os tubarões capturados no Brasil recebem algum tipo de classificação, ainda assim relacionando
apenas um nome popular que em muitos casos refere-se a mais de uma espécie. Considerando a crescente demanda
pela carne e pelas nadadeiras de tubarões e o reconhecimento de que diferentes espécies respondem de formas diferentes
à explotação, torna-se imperativa a criação de ferramentas práticas de identificação ao seu menor nível taxonômico.
Buscando suprir essa lacuna metodológica, foram criadas bibliotecas de sequências de DNA mitocondrial utilizando o
gene citocromo oxidase subunidade I (COI) de diversas espécies de tubarões comumente pescados na costa brasileira
e a partir das características genéticas particulares de cada táxon foram desenhados “primers” de reconhecimento
espécie-específico que em reação de PCR-multiplex produzem fragmentos de tamanhos característicos para cada espécie
possibilitando, após corrida eletroforética, a identificação simultânea de diversas amostras. Seguindo esta metodologia,
as espécies Isurus oxirhynchus, Alopias superciliosus, Alopias vulpinus, Carcharhinus falciformes, Prionace glauca, Galeocerdo
cuvier, Rhizoprionodon lalandii, Rhizoprionodon porosus e Sphyrna lewini já podem ter sua identificação de forma simples,
sem necessidade de observação de caracteres morfológicos. Tal técnica, além de viabilizar a identificação das espécies de
tubarões a partir da carne comercializada, se mostra de fácil aplicabilidade e baixo custo, possibilitando sua utilização
no manejo adequado dos estoques explorados na costa brasileira e em programas globais de conservação.
Apoio Financeiro: FAPESP E CNPq.
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Identificação molecular do estoque de
cações (tubarões) explorados na costa norte
do Brasil: implicações para conservação
Rodrigues-Filho, LFS; Rocha, TC; Rego, PS; Schneider, H; Sampaio, MIC; Vallinoto, M
Universidade Federal do Pará, Campus de Bragança, Instituto de Estudos Costeiros (IECOS)
[email protected]
Palavras-chave: identificação, tubarões, mtDNA, pesca, conservação
Atualmente poucos estudos abrangem a influência da atividade pesqueira na diversidade de tubarões no Brasil.
Devido à ação antrópica desordenada, o declínio desses peixes tem aumentado, sendo agravado por características
peculiares deste grupo: crescimento lento, maturidade tardia e baixa fecundidade. Por este motivo, planos de manejo e
conservação têm sido desenvolvidos com a recomendação de coletar dados a nível de espécie. Infelizmente, os tubarões
apresentam grande similaridade morfológica, tornando a identificação muito difícil, principalmente quando estes são
processados em alto mar, método bastante difundido na pesca comercial. O objetivo principal deste trabalho foi usar
marcadores moleculares para identificar as principais espécies de tubarões exploradas na costa Norte do Brasil. Para
isto, seqüenciamos 1380 pares de bases do marcador 12S-16S de 169 amostras de tubarões, coletadas no mercado de
Bragança-PA. As análises filogenéticas foram feitas nos programas Paup 4b10 e Mr. Bayes 3.1.2. A análise permitiu a
identificação de dez espécies de tubarões, quando comparadas com seqüências de espécies depositadas no GenBank.
Destas, quatro são do grupo dos tubarões martelo (Sphyrna mokarran, S. tudes, S. tiburo e S. sp.), enauqnto as demais
foram da família Carcharhinidae. No enatnto, a espécie Galeocerdo cuvier (tubarão tigre), juntamente com uma espécie
do gênero Rhizopriondon, mostraram-se fora do clado desta família, sendo mais relacionados com a família Sphyrnidae.
Quanto ao gênero Carcharhinus, foram encontradas cinco espécies (C. falciformis, C. perezi, C. leucas, C. acronotus e
C. porosus), sendo C. porosus, assim como o gênero Rhizopriondon, as mais encontradas e comercializadas no mercado
de Bragança. Apesar destas espécies não constarem na lista vermelha da IUCN, o grande esforço de pesca, aliado a
suas características peculiares, podem colocá-las em risco de sobre-exploração em um curto período. Fato que já ocorre
para Isogomphodon oxyrhyncus, espécie outrora bastante encontrada na região e que não foi observada neste trabalho.
Os resultados tornam evidente que técnicas moleculares podem ser usadas para identificar espécies crípticas, e que este
marcador pode ser usado para realização de inferências filogenéticas para os tubarões.
Apoio financeiro: PIBIC/CNPq e CNPq (CT-Hidro n. 552126/2005-5).
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Houve radiação adaptativa na história
evolutiva das arraias de água doce da
família Potamotrygonidae?
Ribeiro, DT1; Farias, IP1; Hrbek, T1,2
2
1
Departamento de Biologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Amazonas 69077000, Manaus, AM, Brasil
Departamento de Biologia, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad de Puerto Rico Recinto de Rio Piedras, 00931-3360, San Juan, Porto Rico
[email protected]
A radiação adaptativa envolve a diferenciação de um ancestral em um grupo de espécies, que habitam uma variedade de
ambientes e que diferem em caracteres morfológicos e fisiológicos para explorar esses ambientes. O ancestral das arraias
de água doce da família Potamotrygonidae provavelmente invadiu águas continentais a partir do noroeste da América do
Sul há ~20 milhões de anos atrás (M.A.), período em que ocorreram transgressões marinhas na América do Sul. Seguindo
a adaptação desse ancestral à água doce, houve extensiva especiação, sendo hoje reconhecidas 18 espécies, distribuídas
em três gêneros, dois destes monotípicos. Toffoli (2006) propõe que a diversificação do gênero Potamotrygon começou
no noroeste da América do Sul, com algumas espécies surgindo por vicariância devido ao soerguimento das cordilheiras
orientais dos Andes. Posteriormente houve a colonização do Rio Orinoco e Negro e, finalmente, a colonização do baixo
e médio Amazonas e seus tributários, bem como as bacias do Paraná-Paraguai e Uruguai, há ~5 M.A.. Essa última fase de
colonização provavelmente ocorreu após profunda reorganização hidrológica da bacia Amazônica. Até aproximadamente
8 milhões de anos atrás, a bacia Amazônica apresentava configuração distinta da atual, sendo subdividida em duas
sub-bacias por uma elevação de terra (Arco do Purus) localizada aproximadamente onde hoje é a cidade de Manaus,
determinando a oeste um grande lago de água doce que drenava para o norte e desembocava no Caribe. Toffoli (2006)
sugere, baseado na topologia da árvore filogenética e idades de especiação, que houve uma radiação dentro do gênero
Potamotrygon, após o Arco do Purus deixar de ser barreira, originando o clado roseta-ocelado. Essa hipótese, entretanto,
não foi testada estatisticamente. No presente estudo foi gerada uma nova hipótese filogenética bayesiana com os genes
mitocondriais ATPase e COI e nuclear RAG1 totalizando 2486pb (MrBayesv3.1.2), com a adição de novos táxons.
As idades de especiação foram estimadas pelo método de likelihood penalizado (R8S 1.7), calibradas pelo fechamento
do Istmo do Panamá e soerguimento da cordilheira venezuelana. Para detectar e localizar mudanças rápidas nas taxas
de diversificação foi usada a estatística de Slowinsky e Guyer (Symmetree 1.1). A topologia encontrada foi similar a de
Toffoli (2006). Foi encontrado aumento significativo na taxa de diversificação no clado roseta ocelado (SG=0,36). Foi
encontrado dois pares de espécies-irmãs (rio Xingu e afluente do Tapajós) que ocorrem em simpatria mas que ocupam
nichos ecológicos distintos (uma espécie adaptada a ambientes de corredeiras e dieta malacofágica e a outra em ambientes
arenosos e insetívora), sugerindo especiação ecológica. A rápida diversificação do grupo roseta-ocelado, aliada ao fato de
que algumas espécies provavelmente surgiram por especiação ecológica, sugerem evento de radiação adaptativa dentro
da família Potamotrygonidae associada à transposição do Arco do Purus e à gama de novos ambientes disponíveis.
Orgão financiador: CAPES, BECA, IFS.
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Identificação das espécies Potamotrygon
motoro e Potamotrygon falkneri (Batoidei,
Potamotrygonidae) da bacia do alto Paraná
através de técnicas citogenéticas clássicas
Cruz, VP; de Rosa, L; Santos, NM; Oliveira, C; Foresti, F
Universidade Estadual Paulista, UNESP, Depto. de Morfologia, Botucatu, SP, Brasil
[email protected]
Palavras-chave: citogenética, raias, Ag-RONs, Potamotrygon motoro, Potamotrygon falkneri
Dentre os Elasmobrânquios, as raias da família Potamotrygonidae compreendem cerca de 16 a 20 espécies distribuídas
entre os gêneros Plesiotrygon, Paratrygon e Potamotrygon. As raias desta família são encontradas nos principais sistemas
fluviais da América do Sul. No Brasil, o maior número de espécies é encontrado na Bacia Amazônica (cerca de 13
espécies), além de outras em descrição e/ou ainda não descritas. Há poucos dados citogenéticos se considerarmos o
fato de ser conhecida a morfologia cariotípica de apenas 6% das 1.100 espécies viventes. Considerando a ausência
de informações cariotípicas nos representantes da família Potamotrygonidae, o presente projeto teve como objetivo a
caracterização citogenética de duas espécies do gênero Potamotrygon (P. motoro e P. falkneri), de ocorrência recente nos
componentes da bacia hidrográfica do Alto Paraná. As técnicas citogenéticas utilizadas foram a coloração convencional
com Giemsa, detecção das regiões organizadoras de nucléolos pela impregnação com nitrato de prata (Ag-RONs),
identificação dos padrões de distribuição de heterocromatina constitutiva (Banda C) e coloração com fluorocromo
base específico cromomicina A3 (CMA3). Os exemplares de P. motoro apresentaram um heteromorfismo cromossômico,
sendo as fêmeas portadoras do número diplóide de 2n=66 cromossomos (22M+8SM+20ST+16A), enquanto machos
apresentaram 65 cromossomos (20M+9SM+20ST=16A). As Ag-RONs foram encontradas em 2 pares metacêntricos
na posição terminal do braço longo, 1 metacêntrico na região terminal do braço curto e 1 acrocêntrico em sua região
terminal. A análise com CMA3 revelou marcações brilhantes nos 4 pares cromossômicos portadores das Ag-RONs,
confirmando a identidade deste fluorocromo com os segmentos cromossômicos das RONs em peixes, pela sua composição
de bases e independente de sua atividade e identificou mais 6 pares cromossômicos em posições intersticiais e terminais.
Os exemplares de P. falkneri também apresentaram um heteromorfismo cromossômico, sendo as fêmeas portadoras
de 2n=66 cromossomos (20M+10SM+18ST+18A) e os machos 2n=65 cromossomos (20M+10SM+17ST+18A). As
regiões organizadoras de nucléolos foram encontradas pela reação Ag-NOR e pela coloração com a CMA3 em 4 pares de
cromossomos metacêntricos na região terminal do braço curto, 1 par metacêntrico na região terminal do braço longo e 1
par acrocêntrico em sua região terminal. Em ambas as espécies a técnica de bandamento C, revelou a presença de blocos
heterocromáticos localizados nas regiões centromérica em quase todos os cromossomos.Os resultados obtidos poderão
auxiliar na compreensão dos processos envolvidos na diversificação da família Potamotrygonidae e tais informações
serão utilizadas na identificação dos mecanismos determinantes do processo de colonização e do estabelecimento das
formas colonizadoras deste ambiente.
Fonte financiadora: FAPESP, CNPq, CAPES.
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Identificação das Espécies de Raias-Viola
do Litoral Brasileiro Utilizando PCR-multiplex
e PCR-RFLP
Franco, BA¹; Mendonça, FF¹; Hashimoto, DT²; Porto-Foresti, F²; Oliveira, C¹; Foresti, F¹
Laboratório de Biologia e Genética de Peixes - Instituto de Biociências de Botucatu- UNESP
2
Depto. de Ciências Biológicas - UNESP
bfranco@ibb,unesp.br
1
Palavras-chave: PCR-multiplex, PCR-RFLP, Citocromo Oxidase I, Rhinobatidae, Conservação Genética
A exploração pesqueira sem controle representa atualmente a maior ameaça às populações de elasmobrânquios e em escala
mundial, o manejo adequado destes recursos é dificultado pela escassez de informações básicas. As raias-viola, família
Rhinobatidae, ocorrem na plataforma continental, principalmente no sudeste e sul do Brasil e tem sido amplamente
exploradas pela pesca. De acordo com os últimos relatórios do IBAMA, cerca oito mil toneladas de raias estão sendo
pescadas anualmente, sem qualquer registro por espécie. Tendo em vista a grande dificuldade na identificação das espécies
Rhinobatos horkelii, Rhinobatos percellens e Zapteryx brevirostris, objetivou-se desenvolver ferramentas práticas para a
distinção destas três espécies, mesmo na ausência de caracteres morfológicos. Desta forma, foram criadas bibliotecas de
sequências de DNA mitocondrial utilizando o gene citocromo oxidase subunidade I (COI) de espécimes capturados
em diferentes localidades do litoral brasileiro e a partir das características genéticas particulares de cada táxon foram
desenhados “primers” de reconhecimento espécie-específicos que em reação de PCR-multiplex produzem fragmentos
de tamanhos distintos para cada espécie. Como alternativa metodológica de distinção entre as espécies, e utilizando
protocolos de PCR-RFLP, foram determinadas as enzimas de restrição, que aplicadas nos produtos de amplificação do
gene COI produzem fragmentos diagnósticos de cada espécie. Tais técnicas, além de se mostrarem extremamente eficazes
na identificação das espécies de raias-viola do litoral brasileiro, mesmo na ausência de características morfológicas de
distinção do grupo, são de fácil aplicabilidade, baixo custo e constituem uma forma segura de avaliação dos estoques para
enriquecer as estatísticas da exploração pesqueira e sua ordenação. Além disso, tais informações poderão ser utilizadas
como ferramentas na formulação de programas adequados de manejo e conservação das espécies.
Apoio Financeiro: FAPESP, CNPq E CAPES.
5
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Evidência de colonização e baixa
variabilidade genética do pirarucu
(Arapaima gigas) em lagos do rio Araguaia
Leão, ASA1; Melo, ATO1,2; Neto, CMS1,2; Senhorini, JA3; Porto-Foresti, F4, Foresti, F4, Hrbek, T1,5; Farias, IP
Laboratório de Evolução e Genética Animal, Departamento de Biologia, Instituto de Ciências Biológicas,
Universidade Federal do Amazonas, Manaus, AM, Brasil
2
Universidade Federal de Goiânia, UFG
3
Centro Nacional de Pesquisa e Conservação de Peixes Continentais, CEPTA
4
Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP
5
Universidade de Porto Rico, San Juan, USA
[email protected]
1
Palavras-chave: Arapaima gigas, microssatélites, genética de populações, Lagos do Araguaia
Níveis de variabilidade genética são importantes parâmetros de classificação de espécies ameaçadas pela IUCN (União
Internacional para Conservação da Natureza). Sendo que baixos níveis de variabilidade genética associados a outros fatores,
como isolamento e estruturação genética, representam o passo inicial para extinção de espécies, subespécies ou grupos
populacionais. O pirarucu (Arapaima gigas), um dos maiores peixes de água doce da América do Sul, mas com uma longa
história de exploração comercial, é uma espécie de grande importância econômica e cultural para os povos da Amazônia.
Esta espécie é classificada pela IUCN na categoria “dados insuficientes” pela ausência de dados que retratem sua situação
na natureza, um desses dados de classificação está relacionado diretamente à variabilidade genética. Atualmente o pirarucu
é listado como uma espécie sobrexplorada pelo Ibama. Nosso objetivo é de estimar e comparar, a variabilidade genética
dos pirarucus entre as localidades da bacia do Araguaia. Para isto foram utilizadas 91 amostras, das seguintes localidades:
Lagoa da Ferradura, Lagoa do Taquaral, Lagoa do Acre, Lagoa da Égua, Lagoa da Montaria e Lagoa do Castor. As amostras
de DNA foram extraídas através do kit de extração da Qiagen. Foram amplificados 10 marcadores microssatélites já
desenvolvidos para a espécie. Em cada localidade entre 4 e 7 loci mostraram-se monomórficos, padrão incomum para esta
espécie em localidades da bacia amazônica. Valores da média da diversidade genética variaram de 0,52 a 0,08; valores de
heterozigosidade observada variaram de 0.47 a 0,12. Os baixos valores apresentados em tais parâmetros evidenciam uma
reduzida variabilidade genética nos indivíduos amostrados. O índice de Garza e Williamson (2001) é um valor que, quando
abaixo de 0.7, é normalmente associado a populações que sofreram uma recente redução de heterozigosidade. Para todas as
localidades amostradas esse índice foi abaixo de 0.7, exceto para Lagoa da Égua (0,77). O valor de FIS não foi significativo,
evidenciando ausência de endocruzamento nos indivíduos dos lagos amostrados. O baixo nível de variabilidade genética
observado parece ser um padrão para os indivíduos de pirarucus do rio Araguaia sugerindo que eventos históricos, como
colonização desta região por um número pequeno de indivíduos, possa ter gerado o padrão observado atualmente. Além
disso, o rio Araguaia apresenta em seu curso inferior uma série de corredeiras que poderiam funcionar como barreiras
ao fluxo gênico entre os indivíduos da bacia do Araguaia com a bacia Amazônica o que dificultaria a chance de troca de
alelos entre elas favorecendo a diferenciação entre as mesmas. Também não podemos descartar a possibilidade de que
a pesca intensa possa ter contribuído para o padrão observado. Nossos resultados contribuem para o esclarecimento da
distribuição da variabilidade genética do pirarucu na bacia do Araguaia, importante para as implementações de programas
de manejo e conservação desta espécie.
Apoio financeiro: FAPEAM/Temático, CNPq/PPG7, CNPq/CT-Amazônia.
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Desenvolvimento de marcadores
microssatélites a partir de bibliotecas
genômicas enriquecidas para o peixe
neotropical Arapaima gigas (Schinz, 1822)
(Actinopterygii, Osteoglossidae)
Santos, CHA*1; Sousa, CFS1; Ximenes, GS1; Lima, MP1; Campos, T2; Hrbek, T3; Farias, IP3; Almeida-Val, VMF1
1
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Laboratório de Ecofisiologia e Evolução Molecular, Av. André Araújo, 2936, Bairro: Aleixo,
CEP 69.060-001, Manaus - Amazonas
2
Universidade Estadual de Campinas, Departamento de Genética e Evolução, Cidade Universitária Zeferino Vaz, Bairro: Barão Geraldo,
CEP 13083-970, Campinas - São Paulo
3
Universidade Federal do Amazonas, Laboratório de Evolução e Genética Animal, Estrada do Contorno, 3000, Bairro: Aleixo,
CEP 69077-000, Manaus - Amazonas
*Bolsista CNPq, Doutorando em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva – GCBEv/INPA
[email protected]
Palavras-chave: biblioteca genômica, marcadores moleculares, microssatélites, peixe neotropical, pirarucu.
A utilização de marcadores moleculares para estudos em genética de população se tornou uma importante ferramenta
para avaliação da variabilidade genética de populações naturais e cativas. Dentre os vários tipos de marcadores existentes,
os microssatélites se destacaram por apresentar uma alta confiabilidade nas informações geradas e por serem de fácil
aplicação quando se tem os primers específicos para a espécie em estudo. No entanto, segundo a literatura científica
existem poucos trabalhos com espécies de peixes neotropicais utilizando este tipo de marcador. O objetivo deste trabalho
foi desenvolver marcadores microssatélites a partir de bibliotecas genômicas enriquecidas para o peixe neotropical
Arapaima gigas (pirarucu). A extração do DNA genômico foi realizada segundo o protocolo elaborado por Sambrook
e Russell (2001) com algumas adaptações e, em seguida, foi realizada a quantificação e análise de pureza do DNA
obtido. Após a quantificação do DNA, foi dado início ao processo de construção da biblioteca genômica enriquecida
de microssatélites, segundo metodologia adotada pelo laboratório de genética da UNICAMP. O seqüênciamento das
amostras foi realizado num o seqüenciador ABI 310. Os resultados mostraram que, das 96 amostras, 64 apresentaram
microssatélites, o que representa 66,7% de sucesso na obtenção de microssátelites pela metodologia adotada. Verificou-se
que 70,3% dos microssatélites eram simples-perfeitos, 15,6% simples-imperfeitos, 7,8% compostos-perfeitos e 6,3%
compostos-imperfeitos. Segundo a classificação dos microssatélites, 92% foram dinucleotídeos e 8% trinucleotídeos. No
que concerne aos pares de bases, observou que as seqüências mais comuns foram GT/TG e AC/CA, respectivamente.
Conclui-se que a construção de bibliotecas genômicas enriquecidas é um dos meios mais eficazes para se obter marcadores
microssatélites.
Apoio financeiro: PIATAM, PRONEX, CAPES, FAPEAM/CNPq, SEAP/PR, FINEP/Petrobrás.
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Diversidade genética e diferenciação em
populações naturais de Arapaima gigas
reveladas por marcadores microssatélites
Hamoy, IG1; Santos, EJM1; Sampaio, I2; Santos, SEB1
Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências Biológicas, Laboratório de Genética Humana e Médica, Belém, Pará, Brasil
2
Universidade Federal do Pará, Campus Universitário de Bragança, Bragança, Pará, Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: Arapaima gigas, microssatélites, diversidade genética
O Arapaima gigas, conhecido como Pirarucu no Brasil, é o maior peixe de água doce da América do Sul. Devido à
exploração comercial essa espécie tornou-se crescentemente escassa nas maiores cidades da bacia amazônica. Pouco é
conhecido sobre o nível de diversidade genética e estrutura populacional presente em populações naturais dessa espécie.
O objetivo do presente trabalho é avaliar o nível de diversidade genética e a diferenciação populacional presente em
duas populações naturais de Arapaima localizadas na região do Baixo Amazonas. Foram coletados 87 amostras de
tecido muscular de A.gigas, provenientes da pesca artesanal na região do Baixo Amazonas, Estado do Pará, Brasil,
sendo 46 do lago Parú e 41 do lago Grande Curuai. A extração do DNA das amostras de tecido muscular foi realizada
seguindo o método padrão de fenol/clorofórmio. Os indivíduos foram genotipados utilizando um painel multiplex
de oito marcadores microssatélites descrito na literatura. A diversidade genética foi avaliada com a heterosigozidade
observada (HO) e esperada (HE) e foram averiguados possíveis desvios do equilíbrio de Hardy-Weinberg (HW), foi
calculado ainda o número de alelos por locus (nA). A diferenciação genética entre as duas populações foi estimada com
o FST. Todas as análises foram realizadas com o programa Arlequin versão 3.01. A (HO) média encontrada na população
do lago Parú foi de 0.75 e na população do lago Grande Curuai foi de 0.79. Não ocorreram desvios significantes no
equilíbrio de HW na maioria dos loci analisados. Na população do lago Parú o nA vario entre cinco e dez alelos com
média de 7.2 alelos por locus. Na população do lago Grande Curuai o nA vario entre cinco e treze alelos, com média de
8.5 alelos por locus. O FST entre as duas populações foi de 0.06 (p=0). A média da diversidade genética de todos os loci
nas duas populações aqui investigadas foi elevada (HOmédia>70%). O FST significante encontrado no presente trabalho
esta de acordo com os dados da literatura e sugere que não existi panmixia entre as populações de A.gigas da região do
Baixo Amazonas. A conjunção da moderada diferenciação genética associada a alta variabilidade genética encontradas
nas duas populações de Arapaima da região do Baixo Amazonas corroboram os dados da literatura e são importantes
para elaboração de planos de manejo dessa espécie. É evidente a necessidade de futuros estudos para caracterização
populacional e monitoramento dos níveis de variabilidade genética de outras populações naturais de Arapaima gigas.
Apoio Financeiro: CNPq e FINEP.
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Considerações genéticas sobre o manejo
de pirarucus (Arapaima gigas)
na reserva Mamirauá
Araripe, J1; Watanabe, LA1; Carvalho, F1; Rêgo, PS1; Queiroz, HL2; Sampaio, I1; Schneider, H1
Lab. Genética e Biologia Molecular, IECOS, Campus de Bragança – UFPA
2
Instituto de Desenvolvimento Sustentável Mamirauá
[email protected]
1
Palavras-chave: pirarucus, Reserva Mamirauá, manejo, microssatélites
A pesca do pirarucu (Arapaima gigas) tem grande importância em toda a bacia amazônica, onde este recurso vem sendo
explorado desde o séc XIX. Atualmente esta espécie é considerada sobre-pescada, e o manejo é uma das estratégias
utilizadas para manter a viabilidade desta atividade. A Reserva de Desenvolvimento Sustentável Mamirauá (RDSM)
desenvolve o manejo para este peixe desde 1999, entretanto, nenhum estudo genético foi desenvolvido com esta
população visando monitorá-la e fornecer informações que auxiliem sua conservação. Neste trabalho caracterizamos
geneticamente as populações de pirarucus do setor Jarauá e Maraã, na Reserva Mamirauá, e comparamos com pirarucus
procedentes de Santarém e Tucuruí (PA). Para isso, isolamos o DNA de 463 indivíduos da RDSM (314 do Jarauá e
149 do Maraã) coletados anualmente entre 2002 e 2006. Foram amplificadas via PCR sete regiões contendo repetições
microssatélites, as quais foram genotipadas no seqüenciador MegaBACE 1000. Para caracterizar as duas populações
da reserva utilizamos o número absoluto, riqueza e freqüência dos alelos, a presença de alelos novos e exclusivos além
dos índices de heterozigosidade observada e esperada. Estes parâmetros foram comparados com os estimados para as
populações de Santarém (60 ind.) e Tucuruí (38 ind.) utilizando os mesmos locos. Foram realizados ainda testes para
verificar a diferenciação entre as populações, através de AMOVA, Fst, Análise Bayesiana, teste de Mantel e estimativa
do número de migrantes. Os programas utilizados foram Genepop, Fstat, Arlequin, Structure e Geneclass. As amostras
foram analisadas testando mudanças temporais (diferentes anos) e espaciais (diferentes localidades). A comparação
entre os anos amostrados indicou uma pequena variação nos parâmetros analisados, corroborando a idéia de que a
pesca manejada é capaz de manter a variabilidade genética deste estoque. A análise genética dos pirarucus de 15 lagos
do setor Jarauá também mostrou grande homogeneidade entre os mesmos. Apesar desta espécie ser sedentária, o
deslocamento lateral sazonalmente desempenhado por ela permite uma mistura entre os indivíduos de diferentes lagos.
Este comportamento permite a homogeneidade do estoque, sendo um aspecto desejável para o manejo. A comparação
entre os pirarucus de 15 lagos do Jarauá e do Complexo Lago Preto no Maraã mostrou uma pequena diferenciação entre
os mesmos, a qual foi atribuída à distância geográfica entre os pontos amostrados (cerca de 90 Km), sendo detectada
a presença de migrantes entre os dois estoques. Por outro lado, a comparação entre Jarauá, Maraã, Santarém e Tucuruí
mostrou que elas constituem duas populações distintas: uma composta pelos pirarucus da RDSM, e a outra constituída
pelos pirarucus de Santarém e Tucuruí. Apesar de terem sido identificados migrantes entre elas, testes comprovaram que
outros fatores, além da distância geográfica, devem ser considerados para justificar a diferenciação encontrada entre as
mesmas. Os resultados detectaram uma maior variabilidade genética entre os pirarucus da Reserva Mamirauá que em
Santarém e Tucuruí. O monitoramento durante cinco anos também confirma a eficiência da política de manejo para
manter a viabilidade desta população.
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Análise cariotípica de Geophagus brasiliensis
(Quoy e Gaimard, 1824) (Perciformes:
Cichlidae) do sistema lacustre do médio
rio Doce (MG)
Silva, APA1; Aguiar, HJAC1; Dergam, JA1
Departamento de Biologia Animal, Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
1
Palavras-chaves: Cromossomos sexuais; biodiversidade; evolução cromossômica; vicariância; Minas Gerais
O sistema de lagos quaternários do médio rio Doce é considerado único no Estado e, conseqüentemente, representam
área de importância biológica especial. O sistema de lagos está altamente impactado pela introdução de um conjunto
de peixes exóticos que tem eliminado comunidades de peixes em 90% dos lagos. Estudos citogenéticos sugerem que
este sistema de lagos pode ter favorecido a diferenciação citogenética de várias espécies de peixes, num intervalo de
tempo relativamente curto (10.000-3.000 anos). Dentre elas o acará, Geophagus brasiliensis, é uma das espécies de
maior distribuição nas lagoas isentas de espécies exóticas. O cariótipo dessa espécie caracteriza-se pelo número diplóide
2n=48. Estudo realizado em populações do alto Paraná indicou heteromorfismo sexual em indivíduos machos que
não foi ratificado em pesquisas posteriores. Com o objetivo de caracterizar o cariótipo em populações de acará nas
lagoas do médio rio Doce, foram coletados 25 espécimes nas lagoas Tiririca, Juiz de Fora, Curi, Lingüiça, Hortência
e Cristal, próximas ao município de Pingo d´Água. As lâminas foram coradas com Giemsa 5% por 10 minutos e as
metáfases foram fotografadas em microscópio Olympus BX60 e os cariótipos montados em Adobe Photoshop CS3.
Todos os cariótipos analisados apresentaram número diplóide 2n=48 e não foram encontradas diferenças na morfologia
cromossômica entre as populações das lagoas. Os indivíduos machos analisados apresentaram heteromorfismo sexual
enquanto as fêmeas apresentaram apenas cromossomos homomórficos, representando um sistema de cromossomos
sexuais do tipo XX/XY. Concluímos que as populações de G. brasiliensis do sistema de lagoas do médio do rio Doce
apresentam heteromorfismo sexual nos machos, fato este não confirmado para outras populações já estudadas.
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Levantamento cariotípico em perciformes
marinhos costeiros do estado da Bahia
Pires, AM; Sousa, KS; Almeida, JS; Affonso, PRAM; Silva Jr., JC
Departamento de Ciências Biológicas, Laboratório de Citogenética, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia
[email protected]
Palavras-chave: Carangidae, Scianidae, Haemulidae, cromossomos, heterocromatina
Os estudos citogenéticos em peixes marinhos ainda são escassos, particularmente na costa da Bahia, apesar de sua extensão
litorânea (cerca de 1.000km). Levando em conta essa condição, o presente estudo teve como objetivo a identificação do
cariótipo de três espécies de Perciformes marinhos comuns no litoral baiano: Pareques acuminatus (Scianidae); Caranx sp
(Carangidae) e Haemulon parrae (Haemulidae), a fim de identificar os padrões carioevolutivos e afinidades filogenéticas
com outras espécies de Perciformes. Os animais foram coletados em Barra Grande, Baía de Camamu, no litoral Sul
da Bahia, com armadilhas e tarrafas. Após a coleta, os animais foram colocados em aquário aerados e a obtenção de
cromossomos mitóticos a partir do tecido renal seguiu o procedimento in vivo após estimulação mitótica com suspensão
de levedura. Os cromossomos foram submetidos à coloração convencional com Giemsa, impregnação por nitrato de
prata (Ag-RON) e bandamento C. Pela análise dos resultados obtidos, constatou-se que Pareques acuminatus possui
um valor modal de 48 cromossomos, todos acrocêntricos, com NF=48. A região organizadora de nucléolos (RONs)
foi localizada na posição pericentromérica do cromossomo 2, coincidente com a região de constrição secundária. Após
bandamento C, observou-se que as regiões de heterocromatina estavam localizadas nas RONs e região centromérica.
Esses dados são idênticos aos descritos para essa espécie na costa do Rio Grande do Norte. Um cariótipo similar
foi observado em Haemulon parrae (2n=48a, NF=48), com blocos heterocromáticos nas regiões pericentroméricas.
Similarmente, na espécie Caranx sp. constatou-se o número diplóide de 48 cromossomos, do tipo subtelo/acrocêntrico
com heterocromatina na região centromérica e no braço curto de alguns cromossomos st/a..As três espécies são também
caracterizadas pela presença de um único par portador de RONs ativas. Comparando as três espécies, fica evidente o
elevado conservadorismo numérico e estrutural dos cromossomos dentro do grupo. Contudo, na família Carangidae,
observam-se pequenas modificações na morfologia dos cromossomos, provavelmente resultantes de inversões. O alto
conservadorismo encontrado entre as espécies parece estar relacionado com a ausência de barreira bem definidas, um
intenso fluxo gênico e a ocorrência de grandes populações no ambiente marinho. Entretanto, isto não impede que
alterações imperceptíveis pelas técnicas citogenéticas empregadas ocorram, justificando a realização de estudos futuros
mais detalhados da estrutura cromossômica dessas espécies.
Apoio: UESB, CNPq e FAPESB.
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Validação citogenética e molecular
da nova espécie Lutjanus alexandrei
(Lutjanidae, Perciformes)
Rocha, EC1; Souza, AS2; Dias Jr., EA2; Molina, WF2
Departamento de Tecnologia da Informação e Indústria, Centro Federal de Educação Tecnológica do Rio Grande do Norte (UNED/ZN)
2
Departamento de Biologia Celular e Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Norte
[email protected]
1
Palavras-chave: Citogenética de peixes, citotaxonomia, Lutjanus alexandrei, mtDNA
Os peixes que compõem a família Lutjanidae (Perciformes), também conhecidos como vermelhos ou pargos, habitam
predominantemente o ambiente marinho, com algumas espécies presentes em ambiente estuarino. Devido a sua grande
importância econômica, esse grupo vem sendo alvo de estudos em áreas relacionadas à pesca e a aqüicultura, contudo,
apesar disso, dados genéticos ainda são escassos para essa família. Estudos recentes baseados em caracteres morfológicos
sugerem uma nova espécie no litoral do Brasil, Lutjanus alexandrei (Moura e Lindeman, 2007), aparentemente endêmica
da costa brasileira e anteriormente mal identificada, com as espécies caribenhas, Lutjanus apodus e Lutjanus griseus, com
as quais compartilham inúmeras similaridades em caracteres merísticos. Visando dar suporte genético a esta proposição,
baseada em dados morfológicos, o presente trabalho analisou citogeneticamente, através de coloração convencional,
Ag-RONs e bandamento C, seis indivíduos coletados sobre fundo recifal no litoral do Rio Grande do Norte, com
intensa coloração vermelha, em alguns casos com pálidas listras verticais, cujo morfótipo anteriormente poderia ser
classificado como “L. apodus” e dez exemplares, provenientes do estuário do Rio Potengi, Natal-RN, que apresentavam
coloração acobreada, característica que poderia agrupá-los como “L. griseus”. Associado às análises citogenéticas, três
exemplares de cada uma das pretensas espécies tiveram seus DNAs extraídos e amplificados com primers específicos
para uma região parcial do gene mitocondrial 16S e comparados. Ambas as amostras apresentaram cariótipos, com
2n=48 cromossomos acrocêntricos, RONs em posição pericentromérica, sobre um mesmo par cromossômico (2º par)
e blocos heterocromáticos na região centromérica de todos os cromossomos. As seqüências parciais 16S das amostras
revelaram total similaridade entre todos os exemplares analisados. Os dados obtidos demonstram concordância genética
entre as amostras, validando a identidade única do novo táxon, L. alexandrei. A presença de sítios ribossomais simples
localizados em posição pericentromérica no segundo par cromossômico, observado nesta espécie, parece ser uma condição
ancestral para a família presente também nas espécies Lutjanus cyanopterus e Ocyurus chrysurus. Análises em andamento,
utilizando enzimas de restrição e mapeamento cromossômico de seqüências da subunidade ribossomal 5S, nesta e em
outras cinco espécies, propiciarão um quadro mais claro da evolução cariotípica dos Lutjanidae do Atlântico.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES, UFRN e CEFET/RN.
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Diversidade genética do pargo Lutjanus
purpureus (POEY, 1867) (Lutjanidae –
Perciformes) da costa norte do Brasil
Lopes, P; Gomes, G; Ferreira, AR; Sampaio, I; Schneider, H
Instituto de Estudos Costeiros, Laboratório de Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Pará (Campus de Bragança)
[email protected]
Palavras-chave: pargo vermelho, mtDNA, diversidade genética
Lutjanus purpureus (pargo vermelho) representa importante recurso pesqueiro ao longo das costas norte e nordeste do
Brasil. Assim como outros lutjanídeos, vem sendo bastante capturada em toda extensão de sua área de distribuição no
atlântico ocidental. Esta espécie tem sido amplamente estudada no que se refere a sua biologia reprodutiva, ecologia e
biologia pesqueira, no entanto, estudos utilizando marcadores moleculares a fim de se conhecer a estrutura genética da(s)
população(ões) são escassos até o presente. A presente análise teve como objetivo principal avaliar os níveis de diversidade
genética do estoque de pargo da costa norte do Brasil. Um fragmento de 405 pb da região controle mitocondrial foi
obtido para 47 indivíduos de L. purpureus coletados em 2007. Das 47 seqüências geradas, foram detectados 46 haplótipos,
destes, apenas dois foram mais freqüentes (haplótipos 4 e 37) ambos compartilhados por dois indivíduos. O estoque de
pargo analisado apresentou alta diversidade haplotípica (h = 0,998) e nucleotídica (π = 2,7%). De acordo com Grant
& Bowen (1998) este alto nível de divergência entre os haplótipos é sugestivo de uma população estável, com longa
historia evolucionária ou contato secundário entre diferentes linhagens alopátricas previamente diferenciadas. Os testes
de Fs (Fu, 1997) e D (Tajima, 1989) geraram valores negativos e significantes, o que indica desvio da neutralidade.
De acordo com esses resultados há um excesso de mutações recentes e variantes (haplótipos) com baixa frequencia e
conseqüentemente um indicativo dos desvios causados pelo crescimento populacional e/ou seleção (Tajima, 1989; Fu,
1997). Além disso, valores negativos e significantes de D também podem ser indicativo que a população experimentou
um gargalo de garrafa (Tajima, 1989). A hipótese de expansão populacional sugerida a partir dos resultados dos testes
de neutralidade é a mais provável, uma vez que outros testes não puderam rejeitá-la, como o padrão de curva unimodal
observado na análise da distribuição das diferenças par-a-par (Slatkin & Hudson, 1991; Rogers & Harpending, 1992).
Apesar dos altos valores de diversidade genética do estoque de pargo, não se pode afirmar que a pesca predatória não
esteja ameaçando esta população. Como mostram os resultados, este estoque experimentou uma redução no seu tamanho
efetivo, seguida de expansão recente. É possível que no passado a diversidade genética desta população fosse mais elevada
e que por conta de um gargalo de garrafa tenha reduzido podendo ser agravado pela pesca. Portanto, é necessário que
medidas de manejo sejam adotadas para gerenciar a pesca desta espécie ao longo de toda sua área de distribuição e que
os níveis de variabilidade genética deste estoque continuem sendo monitorados.
Apoio Financeiro: CNPq, FINEP, MCT, PIBIC-UFPA.
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Estrutura genética populacional da cioba
Lutjanus synagris (Lutjanidade - Perciformes)
da costa norte do Brasil: implicações para o
manejo e conservação da espécie
Gomes, G; Ferreira, AR; Lopes, P; Schneider, H; Sampaio, I
Instituto de Estudos Costeiros, Laboratório de Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Pará (Campus de Bragança)
[email protected]
Palavras-chave: cioba, região controle mitocondrial, estrutura genética populacional.
Lutjanidae representa uma diversificada e abundante Família de peixes da ordem Perciformes, com ampla distribuição
nos oceanos Atlântico, Índico e Pacífico. Inúmeras espécies desta Família representam importante recurso pesqueiro nas
áreas onde ocorrem, sendo intensamente capturadas, como é o caso de Lutjanus synagris, conhecida como cioba (norte
do Brasil) e/ou ariacó (nordeste do Brasil). São peixes demersais encontrados ao longo do Atlântico Ocidental (Carolina
do Norte, EUA, até o sudeste do Brasil). Apesar da importância econômica e ecológica desta espécie, trabalhos visando
conhecer a estrutura das populações, principalmente utilizando marcadores moleculares, são raros ou inexistentes até
o momento. O presente trabalho teve como principal objetivo analisar a estrutura genética de populações de cioba das
costas dos estados do Amapá e Pará (norte do Brasil) a partir de seqüências da região controle mitocondrial. Foram
obtidos 456 pares de base (pb) da porção inicial da região controle para 65 espécimes de cioba, sendo 32 indivíduos
do Amapá e 33 do Pará. Foram detectados 23 haplótipos dentre as 65 sequências obtidas, destes, o Haplótipo 1 foi o
mais freqüente, sendo compartilhado por 39 espécimes. Apenas uma, ou poucas mutações, o distinguiu dos demais
haplótipos encontrados. A divergência genética entre os haplótipos variou de 0,2% a 2,2%. De maneira geral, a
Variabilidade Genética da(s) população(ões) de cioba foi baixa, considerando tanto os índices de diversidade (π =
0,29%; h = 0,642), como a distância genética entre os haplótipos. Este padrão, de acordo com Grant & Bowen (1998),
sugere uma população que experimentou uma redução no seu tamanho efetivo (gargalo de garrafa ou efeito fundador),
seguida de expansão recente. Os testes de Neutralidade (Fu, 1997; Tajima, 1989), apresentaram valores negativos e
significantes para todas as populações, o que apóia a hipótese de expansão populacional. A distribuição de diferenças
par-a-par (mismatch) mostrou uma curva unimodal, o que também caracteriza um processo de expansão. Além disso,
a partir dos resultados da AMOVA e valores de Fst, constatou-se a presença de uma única população panmítica nas
costas do Amapá e Pará, com intenso fluxo gênico, o que foi corroborado pela ausência de estruturação filogeográfica
entre os haplótipos do Amapá e Pará na árvore filogenética (Agrupamento de Vizinhos). É possível que os baixos valores
de diversidade genética deste estoque de cioba sejam um reflexo da diminuição do tamanho efetivo populacional e
que vem sendo agravado pela pesca predatória. A partir destes resultados é necessário que medidas de gerenciamento
pesqueiro sejam adotadas para que a diversidade genética do estoque não seja reduzida a ponto de comprometer a
sustentabilidade deste recurso.
Apoio Financeiro: CNPq, Finep, MCT.
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Citogenética comparativa de peixes ciclídeos
africanos com ênfase na ocorrência de
cromossomos supernumerários
Ferreira, IA1; Poletto, AB1; Kocher, TD2; Martins, C1
1
Depto de Morfologia/IBB-UNESP, Botucatu, SP
Department of Biology, Bioscience Research Building, University of Maryland, College Park, MD, USA
[email protected]
2
Palavras-chave: evolução cromossômica, cromossomos supernumerários, citogenética
A família Cichlidae, pertencente a ordem Perciformes, contém mais de 3.000 espécies distribuídas pela América do Sul
e Central, sudeste da Índia, Madagascar e África. As espécies presentes nos grandes lagos africanos (Malawi, Tanganica e
Vitória) sofreram uma rápida radiação adaptativa, o que tornou estes peixes um modelo fundamental para os estudos de
biologia evolutiva. Além disto, esta família contém espécies, como Oreochromis niloticus, que são de grande importância
para a aqüicultura mundial. Os estudos genéticos realizados nesta família se concentram em análises moleculares dos
genomas e fazem referência principalmente a estudos em O. niloticus. Diante disto, o principal objetivo deste trabalho
foi a obtenção e análise de cromossomos metafásicos de diferentes espécies de ciclídeos africanos. Foram analisadas
as espécies Aulonocara baenschi, Metriaclima barlowi, M. callainos, M. fainzilberi, M. ‘gold’ zebra, M. ‘kompakt’, M.
lombardoi, M. pyrsonotus, Pseudotropheus polit provenientes do Lago Malawi, e Oreochromis mossambicus, O. Niloticus e
Tilapia mariae, provenientes de estoques de piscicultura de diversos países. Estoques das espécies analisadas são mantidas
no Laboratório do Prof. Thomas Kocher da Universidade de Maryland, USA. Além disso, foram analisadas as espécies
Gephirochromis moorii, Labeotropheus trewavase, Melanochromis auratus, Haplochromis obliquidens, Hemichromis bimaculatus
e Pseudotropheus tropheops obtidas em lojas de aquariofilia. Com exceção de Tilapia mariae, Haplochromis obliquidens
e Metriaclima lombardoi, todas as outras espécies apresentaram número diplóide 2n=44. Tilapia mariae possui 40
cromossomos, dos quais destaca-se a presença de 2 pares metacêntricos bem característicos, ausentes nas outras espécies
de tilapiíneos analisadas no presente trabalho. A redução do número diplóide associada a presença de cromossomos
metacêntricos já foi relatada para O. karongae. Tal característica cariotípica mostra que eventos de fusão cromossômica
estiveram presentes durante a história evolutiva dos tilapiíneos. Metriaclima lombardoi contém indivíduos com 44 e 45
cromossomos e Haplochromis obliquidens, espécimes com 44, 45 e 46 cromossomos. A diferença no número cromossômico
das duas últimas espécies está relacionada com a presença de grandes cromossomos metacêntricos supernumerários. Em
M. lombardoi este cromossomo está presente em todas as células da maioria das fêmeas analisadas enquanto que em
H. obliquidens os cromossomos B são encontrados tanto em indivíduos machos quanto fêmeas. Embora amplamente
distribuído entre diferentes espécies de peixes, a ocorrência de cromossomos supernumerários é relatada pela primeira
vez em ciclídeos africanos. Estudos mais detalhados destes cromossomos B estão sendo realizados para um melhor
entendimento sobre a origem, composição e organização das sequências de DNA presentes nos mesmos.
Apoio financeiro: FAPESP, CNPq e CAPES.
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Gene Dmrta2 em peixes ciclídeos:
identificação e mapeamento nucleotídico de
um gene candidato a determinação sexual
Valente, GT; Rodrigues, MI; Magalhães-Filho, G; Martins, C
Departamento de Morfologia, Universidade Estadual Paulista
[email protected]
Palavras-chave: Determinação sexual, Master Key Regulator (MKR), gene Dmrta2, mapeamento nucleotídico, família Cichlidae
Os mecanismos basais de diferenciação gonadal mostram-se amplamente conservados nos vertebrados. Nos peixes
teleósteos a diferenciação do sexo envolve desde a heterogametia feminina ou masculina, hermafroditismo, inversão
sexual, determinação ambiental e hormonal do sexo e diversos mecanismos de determinação cromossômica. Alguns
dos genes de determinação sexual de mamíferos (Sox9, Wt1, Dax1, Sf1, otCYP19, Wnt4, Dmrt1 e Amh) têm sido
identificado em outros vertebrados. O gene Sry, considerado o Master Key Regulator (MKR) do processo de diferenciação
sexual, não vem sendo encontrado em não mamíferos, porém Sox (relacionado ao Sry) tem sido estudado em vários
peixes. Dessa forma, acredita-se que existam vários MKRs em outros vertebrados. Os genes Dmrt1, Dmo e Wt1 foram
considerados candidatos a MKRs em Oreochromis niloticus, mas os mapeamentos de ligação não os sobrepuseram
com regiões QTL (quantitative trait loci) para determinação sexual ou mortalidade sexo específica. Os genes Dmrta2 e
Amh foram mapeados em distintas regiões do grupo de ligação 23 de O. niloticus, próximos a regiões de determinação
sexual, tal sobreposição tornou estes genes candidatos a MKRs nesta espécie. O gene Dmrta2 pertence à família
multigênica DM (doublesex/mab3), codifica um suposto fator de transcrição (motif zinc finger) e está envolvido com
regulação do desenvolvimento sexual em artrópodes, nemátodes e vertebrados. Foram descritas para vertebrados oito
formas deste gene dentro da família DM, sendo identificado 3 genes em O. niloticus (Dmrt1 [Dmt], Dmrt4 [Dmo] e
Dmrt2 [Dmrta2]). Assim, o presente trabalho teve por objetivo a identificação do gene Dmrta2 em outras espécies de
ciclídeos. Este gene foi identificado por PCR nos ciclídeos africanos O. karongae, O. mortimeri, O. mossambicus, Tilapia
rendalli, T. zilli e Sarotherodon galileus e nas espécies sul-americanas Astronotus oscelatus, Cichlassoma sp. e Geophagus
brasiliensis. O amplicon de Dmrta2 apresentou aproximadamente 600pb para todas as espécies e sua análise nucleotídica
mostrou correspondência com a região 1438-2024pb do gene completo de O. niloticus (GenBank AY149605). Análises
comparativas de Dmrta2 entre os ciclídeos demonstraram uma série de substituições de bases e inserções/deleções. O gene
Dmrta2 de ciclídeos apresentou alta similaridade com o gene Dmrt5 de Xiphophorus maculatus, Takifugu rubripes (85%
de similaridade), Oryzias latipes (95%) e ao Dmrt3 de Tetraodon nigroviridis (90%). Pesquisas em bancos de seqüências
permitiram identificar Dmrta2 de Xenophus tropicalis, Danio rerio, Homo sapiens, Bos taurus, e Pan troglodytes, entre
outras espécies. Tais seqüências estão dispostas em regiões diferentes do gene em comparação a região amplificada nos
ciclídeos alvos do estudo. Os estudos da estrutura genômica e expressão de Dmrta2 em peixes ciclídeos deve contribuir
significativamente para o avanço do conhecimento da origem e evolução dos mecanismos genéticos de determinação
sexual nos vertebrados.
Apoio financeiro: FAPESP, CNPq e CAPES.
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Caracterização cromossômica em duas
espécies de ciclídeos neotropicais
Soares, RX; Costa, GWWF; Molina, WF
Departamento de Biologia Celular e Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Norte
[email protected]
Palavras-chave: Aequidens, Cichlidae, Citogenética de peixes, Herichthys, Neotropical
Alguns grupos de peixes atraem grande atenção, seja por seus aspectos ecológicos, econômicos ou evolutivos. Entre
estes se destaca a família Cichlidae, com mais de 1.500 espécies, estimando-se para a América do Sul cerca de 450
espécies, distribuídas em 35 gêneros. Espécies nativas desta família são encontradas na América Latina e do Norte,
África e Madagascar, com algumas espécies nativas do Sul da Ásia e Oriente Médio, embora algumas formas tenham
sido disseminadas em todos os continentes, principalmente pela aquariofilia e aqüicultura, atividades onde representam
grande valor econômico. Estudos citogenéticos neste grupo, mesmo sendo estes de grande importância para a conservação
genética das populações naturais ainda são escassos, sobretudo em espécies das Américas, cujos padrões citogenéticos são
em grande parte desconhecidos. Neste trabalho análises citogenéticas foram realizadas nas espécies Aequidens rivulatus
(n=5; ♂=2 e ♀=3) e Herichthys carpintis (n=13; ♂=8 e ♀=5), originárias respectivamente, da América do Sul e sul
do Texas nos Estados Unidos, obtidas de importadores de peixes ornamentais. As preparações cromossômicas foram
precedidas por estimulação mitótica e figuras metafásicas obtidas in vitro pela técnica de curto termo. Os cromossomos
foram analisados através de coloração convencional, pelo Giemsa, técnica de Ag-RONs, bandamento C e hibridação
in situ (FISH) com sondas das subunidades ribossomais 18S e 5S. A espécie A. rivulatus apresentou um valor diplóide
modal de 2n=48, com fórmula cariotípica igual a 2m+10sm+24st+12a, NF=84. Esta espécie apresenta RONs simples
localizadas no braço curto de um par cromossômico de tamanho grande. Em ambas as espécies as sondas ribossomais
18S hibridaram em posição idêntica às observadas através do método de impregnação pela prata. H. carpintis exibiu
um cariótipo composto por 2n=48, com 8m+14sm+26a e NF=70. As RONs múltiplas foram localizadas sobre dois
pares cromossômicos em posição telomérica. FISH com rDNA 5S nesta espécie indicaram sítios presentes em apenas
um par cromossômico, de tamanho intermediário, em posição telomérica. Ambas as espécies apresentaram marcações
heterocromáticas pericentroméricas na maioria dos pares cromossômicos. Os resultados obtidos indicam as inversões
pericêntricas como um dos principais mecanismos na evolução cromossômica dos ciclídeos americanos, reforçando a
idéia da existência de um padrão cariotípico prevalente de 2n=48 para as espécies sul-americanas.
Apoio financeiro: CNPq, UFRN e PROPESQ.
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Reduzido valor diplóide no micro-ciclídeo
Sul-Americano Apistogramma cacatuoides
(Cichlidae, Geophaginae)
Costa, GWWF1; Marinho, LA1; Molina, WF1
Departamento de Biologia Celular e Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Norte
[email protected]
1
Palavras-chaves: Citogenética de peixes, Cichlidae, evolução cromossômica, Apistogramma, micro-ciclídeo
Os Cichlidae constituem um dos grupos de peixes mais diversificados da Ordem Perciformes e são distribuídos na África,
Ásia e América, ao longo da região neotropical. Suas espécies são importantes modelos de estudos comportamentais e
genéticos. Ainda persistem inúmeras questões sobre a evolução desta família. Já existe um número razoável de descrições
cariotípicas para os Ciclídeos sul-americanos, contudo dada a quantidade de espécies neste continente (450 spp), com
acréscimos constantes de novas formas, ainda são desconhecidos os aspectos citogenéticos de um considerável número
de grupos. Dados filogenéticos recentes, derivados de análises moleculares, sugerem uma origem monofilética para
os ciclídeos sul-americanos e uma das mais altas taxas evolutivas entre os ciclídeos neotropicais. Neste trabalho seis
exemplares (5♂ e 1 ♀) do micro-ciclídeo Apistogramma cacatuoides (Geophaginae), obtidos de comerciantes de peixes
ornamentais foram submetidos às análises citogenéticas através da coloração convencional, com Giemsa, bandamento
C, identificação de cístrons ribossomais através da impregnação por nitrato de prata (Ag-RONs) e por FISH, com
sondas da subunidade 18S. O cariótipo da espécie apresentou um valor diplóide modal de 2n=38 cromossomos
(18m+6sm+14a, NF=62). Os sítios Ag-RONs, são múltiplos, localizados em posição subtelomérica, no braço curto
de um par metacêntrico pequeno (5º) e em posição telomérica, no maior par submetacêntrico (10º). Segmentos
heterocromáticos estão distribuídos em regiões centroméricas e na constrição secundária do 10º par. FISH com sondas
18S revelou quatro marcações teloméricas, coincidentes com os sítios identificados através da técnica de Ag-RONs. O
valor diplóide obtido é significativamente diferente daquele, descrito na literatura, estimado através de análises meióticas
(n=23). Os dados ora obtidos (2n=38) possivelmente representam um dos menores valores diplóides encontrado para a
família, tendo em vista que a descrição de 2n=32, em Tilapia macrocephala, ocorrida na década de 50, antes do advento
de métodos citogenéticos mais confiáveis, deva ser vista com alguma reserva. A. cacatuoides apresenta uma evolução
cariotípica aparentemente mediada por fusões robertsonianas diferindo da macroestrutura cariotípica proposta para
os ciclídeos sul-americanos (2n=48) ou outras espécies do mesmo gênero (2n=46). O panorama formado pelos dados
citogenéticos desta família apóiam uma evolução cromossômica diversificadora com prevalência de mecanismos de
inversões pericêntricas e redução cromossômica e em menor escala aumento do número diplóide decorrentes de fissões
cromossômicas.
Apoio Financeiro: CNPq e PROPESQ/UFRN.
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Diferenciação citogenética em peixes
recifais do gênero Acanthurus (Perciformes,
Acanthuridae) do litoral da Bahia, Brasil
Affonso, PRAM; Almeida, JS; Viana, MVC; Guimar, EN; Silva Jr., JC
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, Jequié – BA
[email protected]
Palavras-chave: Especiação, evolução, rearranjos Robertsonianos, RON, heterocromatina
Três espécies da família Acanthuridae (Perciformes) são descritas associadas a recifes no litoral brasileiro, compondo um
dos grupos dominantes da ictiofauna recifal do oeste do Atlântico. Dados inéditos são apresentados no presente trabalho
sobre os padrões citogenéticos das espécies Acanthurus bahianus e A. coeruleus a partir de metodologias convencionais e de
bandamento. Os espécimes foram coletados por mergulho livre na região de Barra Grande (S 13º36’08”/O 38º55’41”),
litoral sul da Bahia. Após estimulação mitótica, os cromossomos obtidos a partir do tecido renal foram corados com
coloração convencional por Giemsa e submetidos à impregnação por nitrato de prata para detecção de sitos ativos de
RONs e bandamento C para caracterização da heterocromatina constitutiva. A espécie A. coeruleus apresentou um
cariótipo composto por 2n=48 e NF=52 (2sm+2st+44a), sugerindo a ocorrência de inversões pericêntricas em relação ao
padrão plesiomórfico proposto para Perciformes (2n=48, NF=48). De fato, alterações estruturais envolvendo inversões
são relativamente freqüentes em representantes dessa ordem. Por outro lado, o cariótipo de A. bahianus é composto
por 2n=36 cromossomos, sendo 12m+2sm+2st+20a (NF=52). Nesse caso, além de inversões pericêntricas, um grande
número de rearranjos Robersonianos teria ocorrido, reduzindo o número diplóide considerado basal e dando origem aos
grandes pares metacêntricos observados em A. bahianus. Os padrões heterocromáticos das duas espécies são similares,
com marcações discretas de banda C nas regiões centroméricas, sugerindo pouca participação da heterocromatina no
processo de diferenciação cromossômica de Acanthurus. De modo similar, as regiões organizadoras de nucléolos (RONs)
estão situadas no braço curto de um par de cromossomos subtelocêntricos, provavelmente homeólogos, em ambas as
espécies. Os resultados citogenéticos revelam um grau de diversificação cariotípica incomum entre Perciformes marinhos e
colocam A. bahianus como uma espécie mais derivada do ponto de vista cromossômico. Curiosamente, dados moleculares
indicam que a dispersão populacional de A. bahianus é muito superior àquela apresentada por A. coeruleus. A princípio,
essa condição conferiria maior tendência à manutenção de caracteres cromossômicos conservados (2n e NF próximos
a 48) na primeira espécie devido ao intenso fluxo gênico; uma situação exatamente oposta à observada. A discordância
aparente entre dados citogenéticos e capacidade dispersiva sugere a ocorrência de intrincados modelos de especiação e
padrões evolutivos no ambiente marinho, especialmente detectáveis em espécies recifais do Atlântico Sul.
Apoio Financeiro: UESB, CNPq e FAPESB.
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Aspectos cromossômicos de Apogon
americanus (Perciformes, Apogonidae)
através da banda C, Ag-RON, FISH 18S rDNA
e bandas de replicação
Araújo, WC; Molina, WF
Departamento de Biologia Celular e Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Norte
[email protected]
Palavras-chave: citogenética de peixes, Apogon, evolução cromossômica, FISH, bandas de replicação
Peixes recifais da ordem Perciformes possuem grande conservação cromossômica, onde um cariótipo com 48 cromossomos
acrocêntricos, tem sido considerado como condição basal. Inúmeras famílias dentro desta Ordem permanecem sem
informações citogenéticas, outras com dados apenas incipientes, sobretudo em grupos marinhos de pequeno porte.
Este é o caso da família Apogonidae, cujos poucos dados disponíveis para espécies não-Atlânticas indicam marcante
diversidade cromossômica. Visando contribuir para o conhecimento citogenético desta família foram realizadas análises
cromossômicas em 10 espécimes (2 machos, 4 fêmeas e 4 imaturos) de Apogon americanus, coletados no litoral de
Salvador (BA). Foram realizadas análises por coloração convencional, bandamento C, Ag-RON, FISH com sondas da
subunidade ribossomal 18S e de bandas de replicação, através da incorporação do análogo de base BrdU. A espécie
apresentou 2n=36 com a fórmula cariotípica constituída por 8m+10sm+12st+6a (NF=66). As RONs estão localizadas
em posição telomérica, no braço curto de um pequeno cromossomo subtelocêntrico, o que foi confirmado através do
FISH. A distribuição de heterocromatina no cariótipo é predominantemente pericentromérica. O padrão de replicação
inicial obtido pela incorporação do BrdU, seis horas antes das preparações cromossômicas apresentou bandas longitudinais
capazes de permitir um pareamento confiável entre os pares homólogos. As regiões centroméricas revelaram replicação
tardia na maioria dos pares cromossômicos. A macroestrutura cariotípica encontrado em A. americanus é compatível
com aquelas de outras espécies do gênero. A presença de grandes pares metacêntricos (>7µm) e reduzido valor diplóide
sugere uma evolução cariotípica mediada predominantemente por fusões robertsonianas. Análises de um maior número
de exemplares e de outras espécies, ora em andamento, proporcionarão maior clareza sobre a evolução neste grupo de
peixes marinhos.
Apoio Financeiro: CNPq.
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Ocorrência de cromossomo B no peixe
marinho Canthigaster figueiredoi
(Tetraodontiformes, Balistidae)
Neto, CCM; Martínez, PA; Molina, WF
Laboratorio de Genética de Recursos Marinhos, Universidade Federal do Rio Grande do Norte
[email protected]
Palavra-chave: Tetraodontiformes, Citogenética de peixes, Cromossomos B
Os Tetraodontiformes representam um grupo monofilético Pós-Perciformes que tem evidenciado diferentes tendências
de evolução cromossômica. Nesta Ordem poucos dados citogenéticos estão disponíveis para algumas famílias, sobretudo
Balistidae. No presente trabalho foram analisadas três fêmeas e um macho de Canthigaster figueiredoi (Balistidae),
coletados no litoral de Salvador (BA). As preparações cromossômicas seguiram a técnica de cultivo de curto termo a
partir células do rim cefálico. As análises citogenéticas foram realizadas através de coloração convencional, bandamento
C, impregnação argêntica e hibridação in situ com sonda ribossomal 18S. O complemento cariotípico de C. figueiredoi
apresentou 2n=36, com cariótipo constituído por nove pares subtelocêntricos e nove pares acrocêntricos. Em uma das
fêmeas estudadas observaram-se dois cromossomos Bs heteromórficos. A banda C revelou segmentos heterocromáticos
nas regiões centroméricas e pericentroméricas da maioria dos cromossomos. Em alguns exemplares foram observados um
segmento heterocromático conspícuo no braço longo de um cromossomo subtelocêntrico. A técnica Ag-RON evidenciou
marcações com prata em quatro pares cromossômicos, o que foi corroborado com a hibridação com sondas ribossomais
18S. O número cromossômico encontrado na espécie estudada é um dos menores nesta Ordem. Os resultados observados
apresentam uma condição ainda não descrita para Tetraodontiformes, a presença de sítios ribossomais múltiplos. A
ocorrência de cromossomos supranumerários em grupos marinhos não é habitual, este fato aliado ao polimorfismo
heterocromático e RONs múltiplas indica a existência de marcantes eventos de diversificação cariotípica nesta espécie.
Análises em andamento utilizando enzimas de restrição e aumento do número de espécimes propiciarão uma melhor
compreensão da origem e extensão da freqüência dos cromossomos B e polimorfismo heterocromático encontrados,
verificando possíveis associações a um dado sexo.
Apoio financeiro: CNPq.
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Estudo citogenético de Geophagus brasiliensis
da lagoa das bateias, Vitória da Conquista – BA
Dourado, TRS¹; Aleixo, LA¹
¹Departamento de Ciências Naturais, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia – UESB
[email protected]
Palavras-chave: Geophagus brasiliensis; Cichlidae; Perciformes; cariótipo; Lagoa das Bateias
A família Cichlidae engloba cerca de 1.300 espécies de peixes de água doce, apresentando ampla distribuição na região
neotropical. Esta família pertence à ordem Perciformes, a maior em número de espécies entre os Teleostei. Grande
parte das espécies desta ordem que foram cariotipadas, apresenta número diplóide igual a 48 cromossomos, sendo
a maioria deles acrocêntricos. Geophagus brasiliensis é uma das espécies de ciclídeos de água doce mais comuns nos
biomas aquáticos brasileiros; apresentam diferenças morfológicas que geram dúvidas taxonômicas. Neste contexto, o
objetivo deste estudo foi descrever o cariótipo de G. brasiliensis da Lagoa das Bateias situado no município de Vitória
da Conquista, Bahia. Esta área antes era uma região de charco, que foi represada formando a Lagoa das Bateias. Poucos
estudos têm sido feitos com as espécies de ciclídeos do interior da Bahia, e o presente trabalho visa contribuir com o
conhecimento citogenético da ictiofauna desta região. Seis espécimes, três fêmeas e três machos, foram coletados entre
os meses de dezembro de 2007 e maio de 2008. Os peixes foram estimulados com fermento e com Munolan (cloridrato
de Lisozima) 48 e 24 horas antes do sacrifício. A obtenção de cromossomos mitóticos foi feita segundo a técnica de
preparação direta. As lâminas foram coradas com Giemsa, e as melhores metáfases foram fotografadas para montagem
do cariótipo. Os espécimes de Geophagus brasiliensis, analisados apresentaram 2n=48 cromossomos, dos quais três pares
são submetacêntricos e 21 pares são subtelocêntricos/acrocêntricos. Não houve diferença entre o cariótipo de machos
e fêmeas, indicando ausência de cromossomos sexuais, conforme já evidenciado para outras populações desta espécie.
O número fundamental é igual a 54, resultado que coincide com o encontrado para G. brasiliensis de outras regiões do
país, evidenciando que o cariótipo desta espécie é bastante conservado. Isto sugere uma íntima relação filogenética entre
as populações de G. brasiliensis estudadas no Brasil. Embora todas as populações de Geophagus brasiliensis cariotipadas
apresentem número diplóide conservado, o NF varia entre populações, havendo aquelas que têm somente dois pares de
cromossomos submetacêntricos e portanto NF=52. O número de cromossomos das espécies ancestrais de Perciformes
era de 48 cromossomos acrocêntricos e consequentemente o número fundamental era igual a 48, uma característica
basal para essa ordem. As inversões pericêntricas são consideradas os principais rearranjos implicados na diversificação
do NF=48 dos ancestrais. Este mesmo evento também pode ser explicativo para os diferentes NF encontrados para as
populações de Geophagus brasiliensis.
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Estudo cromossômico em populações de
Geophagus brasiliensis (Perciformes, Cichlidae)
ao longo da bacia do Rio de Contas (BA)
Ferreira, JL; Reis, MA; Almeida, JS; Affonso, PRAM; Carneiro, PLS
Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, Dep. Ciências Biológicas – Jequié, BA
[email protected]
Palavras-chave: citogenética, peixes, cariótipo, RON, heterocromatina
A família Cichlidae (ordem Perciformes) está presente em diferentes continentes e apresenta um grande número de
espécies, particularmente nas regiões Neotropicais. No presente trabalho, estudos citogenéticos foram realizados em
uma espécie de ciclídeo extremamente comum nas bacias do leste do Brasil, Geophagus brasiliensis. Os indivíduos foram
coletados em lagoas marginais e afluentes da Bacia do Rio de Contas, na região sul da Bahia, sendo 9 indivíduos do
Rio Oricó (Ubaitaba-BA), 7 indivíduos da lagoa marginal do Rio Bom Sem Farinha (Ipiaú-BA), 9 indivíduos do Rio
Criciúma (Jequié-BA), 15 indivíduos do Rio Preto do Costa (Jequié-BA) e 5 indivíduos da calha principal do Rio das
Contas (Jequié-BA). Através da técnica convencional de coloração por Giemsa verificou-se um número diplóide de
2n=48 cromossomos, condição considerada plesiomórfica dentro de Perciformes.A fórmula cariotípica é composta por
4SM+44ST/A (NF=52) e a impregnação por nitrato de prata revelou marcações positivas de RONs no braço curto
de um par ST/A, na maioria das vezes indicando associação entre cromossomos homólogos portadores de constrições
secundárias.A técnica de bandamento C revelou blocos heterocromáticos reduzidos em regiões pericentroméricas de
todos os cromossomos e no braço curto do par portador de RONs. Os dados obtidos reforçam o caráter conservativo
do número cromossômico dessa espécie, mas demonstram diferenças de NF em relação a outras populações previamente
estudadas no Brasil. Sugere-se assim que as inversões pericêntricas tenham um papel fundamental no processo de
diferenciação populacional e formação de possíveis espécies crípticas nesse grupo.
Apoio financeiro: FAPESB e CNPq.
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Diversidade genética e estrutura populacional
em Chromis multilineata (Guichenot, 1853)
(Perciformes – Pomacentridae) no Atlântico
Ocidental: evidências de um passado
evolutivo instável
Molina, WF1; Cunha, IMC1; Souza, AS1; Dias Jr., EA1; Moraes, EM2
Departamento de Biologia Celular e Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN)
2
Universidade Federal de São Carlos (UFSCar), Campus Sorocaba
[email protected]
1
Palavras-chave: mtDNA, Chromis, genética de populações, Atlântico
A fauna de peixes recifais brasileiros compreende aproximadamente 320 espécies distribuídas ao longo da costa continental
e das ilhas oceânicas. Pouco se conhece sobre os níveis de conectividade entre suas populações, embora tenha sido
constante o interesse nas relações entre o continente e as ilhas oceânicas brasileiras, numa perspectiva biogeográfica. As
ilhas oceânicas brasileiras abrigam um considerável número de espécies endêmicas, as quais são localmente abundantes,
e repartem uma considerável porção de sua fauna de peixes recifais com o Atlântico Ocidental. Entre as famílias de
peixes recifais mais ricas em espécies estão os pomacentrídeos. O presente trabalho analisou, através de comparações das
seqüências da região controle do DNA mitocondrial (D-loop), os padrões genético-populacionais de C. multilineata
em diferentes áreas do litoral NE do Brasil, envolvendo tanto ilhas oceânicas (Fernando de Noronha e Arquipélago
de São Pedro e São Paulo), como regiões da plataforma continental (RN e BA). Para isso, foram utilizadas seqüências
nucleotídicas parciais da região HVR1 do mtDNA (312pb). A estrutura populacional e os parâmetros para as estimativas
da variabilidade genética, variância molecular (AMOVA), estimativa do índice de fixação (FST) e número de migrantes
foram determinados. As relações filogenéticas entre as populações foram estimadas utilizando-se o método de neighbourjoining (NJ). A análise de agrupamento Bayesiano foi utilizada para a verificação de estruturação populacional, segundo
a freqüência haplotípicas dos indivíduos. A variabilidade genética das populações de C. multilineata se mostrou
extremamente elevada. As populações revelaram moderada estruturação genética, com maior grau de divergência genética
sendo observado para a amostra do Arquipélago de São Pedro e São Paulo. Espécimes do litoral do Rio Grande do
Norte e do Arquipélago de Fernando de Noronha não apresentaram diferenciações genéticas. Três grupos populacionais
moderadamente diferenciados foram identificados: um grupo populacional (I), formado pelo Rio Grande do Norte
(I’) e o Arquipélago de Fernando de Noronha (I’’); e outros dois grupos distintos formados pela população insular do
Arquipélago de São Pedro e São Paulo (II) e pela Bahia (III). Os padrões genéticos encontrados sugerem que a espécie
sofreu uma radiação relativamente recente favorecendo a ausência de haplótipos compartilhados. C. multilineata parece
ser constituída por populações relativamente estruturadas ao longo costa Atlântica Ocidental, bem como em relação
ao Arquipélago de São Pedro e São Paulo.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES, SECIRM, UFRN.
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Diferenciação haplotípica de Plagioscion
squamosissimus (Sciaenidae, Perciformes)
em bacias hidrográficas da região nordeste
santos, SM; Barros, MC; Fraga, E
Laboratório de Genética e Biologia Molecular - CESC/UEMA
[email protected] e [email protected]
Palavras-chave: Plagioscion, Corvina, rRNA 16S
Plagioscion squamosissimus, é uma espécie originária da bacia amazônica, sendo introduzida nas bacias dos rios Paraná,
Paraguai e São Francisco, como também, em reservatórios da região Nordeste na década de 40. No gênero Plagioscion,
esta espécie é a mais comum e bastante explorada na pesca artesanal, sendo utilizada para peixamento em barragens e
açudes, por ter uma carne excelente e apresentar qualidades para a pesca esportiva. No entanto, a origem destes estoques
é desconhecida necessitando de estudos que possam fornecer informações sobre seus níveis de variabilidade genética
requisitos essenciais ao delineamento de propostas de manejo e conservação da espécie. Portanto, o presente estudo
objetivou-se a caracterização genética dos estoques de P. squamosissimus das bacias do rio Itapecuru/MA, Pindaré/
MA e Parnaíba/PI, determinando os níveis de variabilidade genética a partir de seqüências de DNA mitocondrial do
gene rRNA 16S. A amostragem constituiu-se de espécimes obtidos na bacia dos rios Itapecuru/MA, Pindaré/MA e
Parnaíba/PI. O DNA total foi isolado a partir de tecido muscular, utilizando-se o protocolo de fenol-clorofórmio e a
amplificação da região genômica foi realizada utilizando-se primers específicos por meio da técnica de PCR. Os produtos
da PCR foram purificados e seqüenciados utilizando-se o método didesoxiterminal com o Kit Big Dye. As seqüências
obtidas foram editadas e alinhadas usando-se o programa Bioedit e o polimorfismo de DNA determinado utilizandose o programa DnaSP. Os cladogramas filogenéticos foram obtidos através do programa MEGA4. A significância dos
agrupamentos foi estimada pela análise de bootstrap. Um fragmento de 563 pares de bases foi obtido em 16 espécimes
de P. squamosissimus com uma composição nucleotídica de 22,5 de timina, 26% de citosina, 29,1% de adenina e 22,4
de guanina. A análise do polimorfismo do fragmento do gene rRNA16S revelou a ocorrência de três haplótipos para
os espécimes analisados com uma diversidade haplotípica igual a 0,62, sendo cada haplótipo exclusivo para cada bacia
amostrada. As análises filogenéticas preliminares produziram árvores com topologia similar nos diferentes métodos
utilizados (máxima parcimônia e agrupamentos de vizinhos) mostrando que os haplótipos I (Rio Pindaré/MA) e II (Rio
Itapecuru/MA) são mais próximos (99% de bootstrap). A presente abordagem revelou-se informativa, pois mostra que
os estoques de P. squamosissimus possivelmente estejam se diferenciando nestas bacias estudadas e, portanto estratégias
de manejo e conservação deste estoques deverão considerar estes resultados.
Apoio Financeiro: BNB/UEMA e UFPA.
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Análise populacional de Scomberomorus
brasiliensis (Scombridae, Perciformes) da
costa brasileira através de seqüências da
alça D e do gene citocromo b
Cunha, DB; Vallinoto, M; Rego, PS; Schneider, H; Sampaio, I; Santa Brígida, EL
Instituto de Estudos Costeiros, Campus de Bragança, Universidade Federal do Pará
[email protected]
Palavras-chave: Scomberomorus brasiliensis, DNA mitocondrial, variabilidade genética
Os peixes marinhos da família Scombridae (Perciformes) estão entre os recursos pesqueiros mais explorados da costa
brasileira, dos quais se destaca a Scomberomorus brasiliensis (serra), a qual apresenta um grande porte e carne bastante
apreciada para o consumo. O presente trabalho analisou a variabilidade genética de três populações da costa brasileira
(Macapá-AP, Fortaleza-CE e Paranguá-PN), com base no gene mitocondrial citocromo b e a região da Alça – D.
Foram obtidos cerca de 410 pares de bases do citocromo b e 387 da região da Alça - D, sendo estes alinhados através
do programa Bioedit e ClustalW. As análises filogenéticas foram realizadas utilizando-se os programas Mega 3.1 e
Paup*4.0b10, enquanto que as análises populacionais foram implementadas nos programas Arlequin3.1 e Dnasp4.0.
Nas análises filogenéticas não se observou nenhum forte agrupamento, sendo observadas diversas politomias em
ambos os marcadores. Em termos de variabilidade genética, as análises revelaram alta variabilidade da alça D (h=0,98
e Pi=0,01) e moderada no citocromo b (h=0,70 e Pi=0,003) quando todas as amostras foram analisadas em conjunto.
Em relação a rede de haplótipos, a alça D mostrou-se inconclusiva em consequência do alto número de haplótipos da
alça D. As análises filogenéticas e populacionais revelaram uma população panmítica na costa brasileira e em expansão
demográfica, apoiada pelos testes de SSD e rg, e pelo teste Fs de Fu, onde se verificam altos valores negativos. O tempo
de expansão foi calculado apenas para os dados de Cit-b, no qual os haplótipos coalescem há cerca de 42-105 mil anos
atrás. Além disto, na porção 3´ da região da alça-D foi encontrada uma complexa repetição altamente variável que
poderá, possivelmente, ser usada em futuros trabalhos envolvendo populações geograficamente mais distantes.
Apoio Financeiro: CNPq/MCT (Projeto Milênio), CNPq/PNOPG, PIBIC/CNPq/UFPa.
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Desenvolvimento de marcadores
microssatélites para o tucunaré (Cichla
monoculus) da Amazônia
Lima, MP1; Silva, GMB2; Sousa, ACB2; Sousa, CFS1; Santos, CHA1; Santana, GX1; Ferreira-Nozawa, MS3; Almeida-Val, VMF1
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia - INPA
2
Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP
3
Centro Universitário Nilton Lins - CUNL
[email protected]
1
Palavras-chave: microssatélites, variabilidade genética, conservação, tucunaré, Amazônia
Pertencente à família Cichlidae, o tucunaré é um peixe carnívoro que pode alcançar até 80 cm de comprimento.
Apresenta manchas verticais escuras com cores amareladas e ventre claro. Originário da bacia amazônica e introduzido
em quase todas as regiões do país, o tucunaré é um peixe importante economicamente, despontando como um dos
principais recursos pesqueiros para a região amazônica, assim como para diversos países da América do Sul e Central.
Entre as espécies do gênero Cichla, o tucunaré é a que possui maior valor comercial, tornando importante o estudo
da variabilidade genética dessa espécie com o intuito de contribuir com informações relevantes para viabilizar uma
piscicultura sustentável e a preservação dos estoques naturais. Visando investigar a variabilidade genética do tucunaré na
Amazônia brasileira, foram desenvolvidos marcadores moleculares microssatélites para a espécie Cichla monoculus, por
meio de uma biblioteca genômica enriquecida com seqüencias CT e GT. O DNA total foi extraído a partir do tecido
muscular utilizando o protocolo descrito por Sambrook et al. (1989). Os fragmentos de interesse foram selecionados,
inseridos em bactérias competentes e depois seqüenciados em seqüenciador ABI 377, utilizando os primers SP6 e T7.
As seqüências foram editadas e clusterizadas utilizando os programas EditSeq e SeqMan do pacote Laser Gene vs.5.03
(DNASTAR Inc). Para encontrar as regiões com microssatélites, foi utilizado o programa SSRIT-Gramene, em seguida
os primers foram desenhados utilizando o programa Primer Select (DNASTAR Inc.). Após o sequenciamento de 96
clones, foi possível desenhar 40 pares de primers. Desse total, 87,5% eram dinucleotídeos, 1,2% trinucleotídeos,
0,4% tetranucleotídeos e 0,4% pentanucleotídeos, sendo 65% perfeitos e 35% imperfeitos. Depois de sintetizados, os
primers serão validados em uma população e utilizados para estudar a variabilidade genética de populações naturais e
de cativeiro, a fim de contribuir para programas de manejo e conservação genética dessa importante espécie de peixe
da Amazônia.
Apoio Financeiro: PIATAM, FINEP/PETROBRAS, CAPES, PRONEX, FAPEAM/CNPq.
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Origem do peixe amazônico tucunaré
introduzido nos açudes do Piauí: uma
abordagem genética
Rocha, RR1; Sampaio, I2; Fraga, E1; Barros, MC1
Laboratório de Genética e Biologia Molecular – CESC/UEMA
2
Instituto de Estudos Costeiros/UFPA Bragança/PA
[email protected]
1
Palavras-chave: DNA mitocondrial, rRNA 16S, Cichla
Os peixes do gênero Cichla, tucunaré, são endêmicos da região Amazônica e ocupam posição de destaque dentre as
espécies de maior tamanho e alto valor comercial. A introdução do tucunaré fora do seu habitat natural tem sido
bastante comum, pois vem sendo frequentemente utilizado para o povoamento de açudes e barragens. A origem
desses estoques é bastante desconhecida devido à carência de dados dessas introduções. Portanto, o estudo genético
da origem desses estoques é de grande relevância para um monitoramento sustentável da piscicultura do tucunaré.
Neste contexto, temos como objetivo a caracterização genética das populações de tucunarés introduzidas nos açudes
do Piauí a fim de contribuir com o conhecimento da origem dos estoques. As amostras foram obtidas de populações
artificiais de tucunarés dos açudes: cajazeiras – Pio IX/PI, barreiras - Fronteiras/PI e açude Ingazeiras - Paulistana/PI.
O isolamento e amplificação da região genômica a partir de DNA total foi realizado através da técnica de Reação em
Cadeia da Polimerase (PCR) usando-se combinações de primers específicos. Os produtos da PCR foram seqüenciados
utilizando-se o método didesoxiterminal. As seqüências obtidas foram editadas e alinhadas usando-se o programa
Bioedit. Os cladogramas filogenéticos foram obtidos no programa Mega e a significância dos agrupamentos foram
estimadas pela análise de bootstrap. Seqüências de populações naturais dos rios Tocantins, Uatumã, Trombetas e Xingu
foram incorporadas na análise para verificar a similaridade genética entre os estoques introduzidos e os naturais. Um
fragmento de 422 pares de bases do gene rRNA 16S foi obtido com composição nucleotídica de 21,9 % de timina,
25,2% de citosina, 31,6% de adenina e 21,3% de guanina. Apenas um haplótipo foi observado para as populações
de tucunarés artificiais analisadas. As análises filogenéticas produziram árvores com topologia similar nos diferentes
métodos utilizados (parcimônia e agrupamentos de vizinhos). O haplótipo das populações artificiais foi identificado
como Cichla kelberi e agrupou fortemente (99%) com um dos haplótipos da população natural do rio Tocantins/PA.
Um estudo com ênfase em uma análise genética de populações de tucunarés introduzidos na região Nordeste, bacias
dos rios Parnaíba e São Francisco, identificou o haplótipo da bacia do rio Parnaíba como C. kelberi oriunda do rio
Tocantins. Nossos resultados a partir da análise do gene rRNA 16S indicam que apenas uma espécie C. kelberi oriunda
do rio Tocantins foi utilizada para peixamento nos açudes do Piauí e contribuem para a confirmação de que esta nova
espécie tem sido amplamente utilizada para peixamento em açudes do Nordeste. Considerando sua freqüência nas três
populações analisadas concluiu-se que grande parte dos estoques de tucunarés introduzidos nos açudes do Nordeste
está constituído pela espécie C. kelberi.
Apoio financeiro: PPG7, UFPA e UEMA.
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Identificação genética dos estoques de
tucunarés introduzidos em lagos das
hidrelétricas de Boa Esperança/PI e Itaipu/PR
Almeida, CG1; Sampaio I2; Barros, MC1; Fraga, EC1
Laboratório de Genética e Biologia Molecular – CESC/UEMA
2
Instituto de Estudos Costeiros/UFPA Bragança/PA
[email protected]
1
Palavras – chave: Cichla, Tucunaré, haplótipo, DNA mitocondrial, rRNA 16S
Uma recente revisão do gênero Cichla valida várias espécies e descreve nove novas espécies, dentre estas, a espécie Cichla
kelberi para o rio Tocantins/PA com introdução nos Rios Paraná, Paraíba do Sul e na Região Nordeste. Estes peixes
são constantemente utilizados para peixamento em praticamente todas as bacias hidrográficas brasileiras, podendo
ocorrer hibridizações entre as espécies, necessitando assim, de monitoramento genético. Neste contexto, temos como
objetivo a identificação genética dos estoques de tucunarés introduzidos em lagos das hidrelétricas de Boa Esperança/
PI e Itaipu/PR. As amostras foram obtidas nos lagos das hidrelétricas de Boa Esperança/PI e Itaipu/PR. O DNA
total foi isolado a partir do tecido muscular. A amplificação da região genômica foi realizada através da técnica de
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) usando-se combinações de primers específicos. Os produtos da PCR foram
seqüenciados utilizando-se o método didesoxiterminal. As seqüências obtidas foram editadas e alinhadas usando-se o
programa Bioedit e os cladogramas filogenéticos gerados no programa Mega 4.0. A significância dos agrupamentos foi
estimada pela análise de bootstrap. Seqüências de populações naturais: alto Rio Negro (F049017), Rio Tocantins/PA
e Rio Uatumã foram incorporadas na análise para verificar a similaridade genética entre os estoques introduzidos e os
naturais. Um fragmento de 478 pares de bases do gene rRNA 16S foi obtido com composição nucleotídica de 21,8%
de timina, 25,7% de citosina, 30,9% de adenina e 21,6% de guanina. As análises filogenéticas produziram árvores com
topologias similares nos diferentes métodos utilizados parcimônia e agrupamentos de vizinhos. Através desta análise
observou-se dois haplótipos, onde o lago da hidrelétrica de Boa Esperança/PI apresentou haplótipo único e o lago da
hidrelétrica de Itaipui/PR dois haplótipos sendo um destes de ocorrência no lago da hidrelétrica de Boa Esperança/
PI. O haplótipo de ocorrência nos dois lagos agrupou fortemente com um haplótipo do rio Tocantins/PA identificado
como C. kelberi, o outro haplótipo presente apenas no lago da hidrelétrica de Itaipu/PR agrupou fortemente com outro
haplótipo do rio Tocantins/PA identificado como Cichla monoclus. Portanto, a partir destes resultados conclui-se que
os estoques introduzidos de tucunarés nos lagos das hidrelétricas de Boa Esperança/PI e Itaipu/PR são provenientes
do rio Tocantins/PA.
Apoio financeiro: PPG7, CNPq, UFPA e UEMA.
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Caracterização molecular da introdução do
peixe amazônico tucunaré
no sudeste brasileiro
Carvalho, DC1, Oliveira, DAA1; Santos, JE3; Teske, P4; Beheregaray, LB4; Schneider, H2; Sampaio, MI2
Escola de Veterinária, Departamento de Zootecnia, Universidade Federal de Minas Gerais, Brasil
Universidade Federal do Pará, Instituto de Estudos Costeiros, Brasil
Programa de Pós-graduação em Zoologia dos Vertebrados da PUC Minas, Brasil
Molecular Ecology Lab, Department of Biological Sciences, Macquarie University, Australia
[email protected]
Palavras-chave: espécies introduzidas e nativas, mtDNA, microssatélites, cichla, tucunaré
A manutenção dos estoques de espécies nativas de peixes tem sido comprometida em todo o mundo pela introdução
e dispersão de espécies exóticas, sejam elas de outros países ou provenientes de diferentes bacias do mesmo país. Um
exemplo brasileiro é o tucunaré, espécie amazônica introduzida em diversas bacias brasileiras, que se estabeleceu e
provocou a extinção de algumas espécies de peixes nativos nesses locais. Neste trabalho, realizamos a caracterização
da introdução de populações de tucunarés em quatro bacias do sudeste brasileiro (Paranaíba, São Francisco, Doce e
Grande). Para a determinação da origem geográfica/genética foram utilizados o mtDNA (16S e Região Controle) e dez
microssatélites que foram recentemente obtidos para a espécie Cichla piquiti e também otimizados para espécie Cichla
kelberi e utilizados na caracterização genética dos estoques introduzidos e nativos.Os resultados mostraram que todos
os estoques analisados apresentaram haplótipos similares aos dos peixes do Rio Tocantins. Nas populações introduzidas,
apenas em Itumbiara (Rio Paranaíba) foi detectado mais de um haplótipo na espécie C. kelberi. Merece atenção o fato
de que, apesar das duas espécies ocorrerem em simpatria no Rio Tocantins, em Minas Gerais elas foram detectadas
nessa situação apenas na represa de Itumbiara.Os marcadores microssatélites indicaram nos resultados genéticos uma
correlação negativa entre a distância da fonte introdutória (população nativa - Rio Tocantins) e os índices de riqueza
alélica (Na) e heterozigosidade (H) dos estoques introduzidos - quanto maior a distância do Rio Tocantins menor Na
e H. A única exceção foi o estoque proveniente da represa de Furnas (Rio Grande), que apresentou Na e H maiores
para a espécie C. piquiti do que outros sítios mais próximos do Rio Tocantins (e.g Rio Doce, São Francisco), indicando
introduções múltiplas para este local. As perspectivas desse trabalho são de que esses dados moleculares possam ser úteis
na elaboração de futuras diretrizes para o controle de espécies invasoras no Brasil.
Apoio: Capes, CNPq, Fapemig (APQ-3950-3.12/07), FEP-MVZ.
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Variabilidade genética de populações
artificiais de tucunaré com base na região
controle do DNA mitocondrial
Passos, JFA1; Almeida, CG1; Sampaio, I2; Fraga, E1; Barros, MC1
Laboratório de Genética e Biologia Molecular – CESC/UEMA
2
Instituto de Estudos Costeiros/UFPA Bragança/PA
[email protected]
1
Palavra-chave: DNA mitocondrial, Cichla, D-loop
O gênero Cichla, conhecido como tucunaré é originário da Bacia Amazônica, são peixes de alto valor econômico. O
cenário atual mostra que os tucunarés foram amplamente introduzidos ao longo das bacias hidrográficas brasileiras e a
origem destes estoques é desconhecida, porém sabe-se que a introdução de espécies exóticas tende a alterar a estrutura
de um ecossistema, além de causar impactos genéticos, como hibridação, redução da eficiência de acasalamentos, baixo
rendimento evolutivo entre outros efeitos que podem variar de acordo com a população. Neste estudo utilizamos
seqüências da região controle (D-loop) do DNA mitocondrial com o objetivo de estimar a variabilidade genética dos
estoques artificiais de tucunarés bem como sugerir a origem destes estoques. As amostras foram obtidas na bacia do rio
São Francisco (Petrolina/PE e Bahia) bacia do rio Parnaíba (açude Cajazeiras, Pio IX/PI, açude Barreiras, Fronteiras/PI,
açude Ingazeiras, Paulistana/PI), Rio Paraná/PR, UHE Itaipu e Rio Tocantins/PA. O DNA total foi isolado a partir do
tecido muscular, a amplificação da região genômica foi realizada através da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase
(PCR) usando-se combinações de primers específicos. Os produtos da PCR foram seqüenciados utilizando-se o método
didesoxiterminal. As seqüências obtidas foram editadas, alinhadas e analisadas a partir de vários programas, como:
BIOEDIT, MEGA e DnaSP 4.0. Foram incorporadas ao nosso banco de dados seqüências do Genbank oriundas do Rio
Tocantins e alto Rio Paraná. Dentre as 56 seqüências com 347 pb amostradas foram encontrados 72 sítios polimórficos,
16 haplótipos, diversidade haplotípica de 0,8006 e nucleotídica 0,05092 onde o haplótipo 8 (H8) mostrou-se como
o mais freqüente, seguido pelos haplótipos 10 (H10) e 6 (H6), vários haplótipos únicos também foram observados.
Quando analisadas como duas populações distintas, observou-se em uma das populações (amostras oriundas do rio
Paraná e UHE Itaipu) três sítios polimórficos, três haplótipos, diversidade haplotípica de 0,4643 e nucleotídica de
0,00217 os haplótipos agruparam fortemente com haplótipo do rio Tocantins identificado como C. piquiti. Para a outra
população (amostras oriundas das bacias dos rios São Francisco, Parnaíba, Paraná e UHE/PR) foi observado 11 sítios
polimórficos, 13 haplótipos, diversidade haplotípica de 0,7411 e nucleotídica de 0,00480 com os haplótipos agrupando
com a espécie do rio Tocantins identificada como C. kelberi. A magnitude das diversidades haplotípica e nucleotídica
encontradas para as populações de Cichla indicam diferenças entre as populações analisadas. Nossos resultados indicam
a ausência da espécie C. piquiti no Nordeste brasileiro e sua presença no Sul do Brasil, enquanto a espécie C. kelberi
está tanto no Nordeste quanto no Sul do Brasil. Os estoques encontrados no Nordeste e Sul do Brasil de acordo com
os nossos dados são oriundos da bacia do rio Tocantins.
Apoio financeiro: PPG7, CNPq, UFPA e UEMA.
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Desenvolvimento de primers de microssatélites
a partir de biblioteca genômica enriquecida
para Astronotus crassipinis (Heckel, 1840)
Sousa, CFS1-2; Santana, GX1; Santos, CHA1; Lima, MP1; Silva, MNP1; Nozawa, MFS2; Almeida-Val, VMF1
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Laboratório de Ecofisiologia e Evolução Molecular
2
Centro Universitário Nilton Lins, Laboratório de Expressão Gênica
[email protected]
1
Palavras-chave: Microssatélites, Biblioteca Genômica, Acará-açú
A espécie Astronotus crassipinis é conhecida como Oscar (inglês) e Acará-açú (português) e pertence à família Cichlidae,
ordem dos Perciformes. Apresenta um interesse comercial por ser muito usada pela população amazônica na alimentação
e procurada internacionalmente para fins ornamentais. Microssatélites são seqüências de DNA, usualmente menores
que 100 pares de bases, formadas por um conjunto de 1 a 6 nucleotídeos repetidos “in tandem”. Características como
distribuição aleatória no genoma, co-dominância e elevado grau de polimorfismo fazem dos microssatélites os marcadores
mais apropriados para estudos sobre freqüência gênica, evolução e conservação. Com isso, o objetivo deste trabalho é
desenvolver primers de microssatélites (DNA) a partir de biblioteca genômica enriquecida para Astronotus crassipinis.
Para a construção da biblioteca, foi realizada a extração do DNA genômico segundo o protocolo de Sambrook e Russel
(2001), com algumas modificações. Após a extração, o material foi digerido com enzima de restrição RsaI e enriquecida
em GT e CT via técnica de hibridização com sonda acoplada a esferas magnéticas recobertas de streptavidina. As amostras
obtidas foram submetidas ao seqüênciamento para análise. Após essa etapa, foi possível a anotação das seqüências
adjacentes aos microssatélites e assim desenhados primers para as regiões flanqueadoras (5’-3’ e 3’- 5’), para posterior
validação. Dos primers desenhados, 90% eram perfeitos e 10% imperfeitos. Em uma segunda classificação pode-se
perceber 50% de dinucleotídeos, 15% de tertanucleotídeos, 25% de pentanucleotídeo e 1% de hexanucleotídeo.
Apoio Financeiro: PIATAM, FINEP/Petrobrás, PRONEX, FAPEAM, CAPES, CNPq, INPA/LEEM.
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Caracterização citogenética de Astyanax
asuncionenses no córrego bocaiuval (Bacia
do Paraguai) em Tangará da Serra – MT
Giongo, P1; Sampaio, WMS1; Fernandes, A1; Lima, CB2; Dergam, JA2
Universidade do Estado de Mato Grosso/Departamento de Ciências Biológicas
Universidade Federal de Viçosa/Departamento de Biologia Geral
[email protected]
Palavras-chave: Citogenética, Bacia do Paraguai, Astyanax asuncionenses, Córrego Bocaiuval, Mato Grosso
A ictiofauna neotropical é a mais rica e diversificada do mundo. No entanto, é pouco conhecida devido ao tamanho dos
sistemas fluviais, a dificuldade de acesso aos locais de coleta e ao elevado custo logístico. Paralelo a grande diversidade
numérica e morfológica, ainda é encontrado uma considerável variabilidade cromossômica inter e intra-populacional.
As espécies de Astyanax é um grupo diversificado e amplamente distribuído, apresentando plasticidade morfológica
e cromossômica, variando entre 2n=36 a 2n=50. Este trabalho teve por objetivo estudar citogeneticamente a espécie
de A. asunsionenses. Os espécimes foram coletados, no córrego São José e Bocaiuval na região de Tangará da Serra –
MT. Os peixes coletados foram submetidos às técnicas de obtenção de cromossomos mitóticos metafásicos segundo
Bertollo et al. (1978) e analisados segundo Levan et al. (1964). Observou-se número cromossômico 2n=50, Fórmula
Cariotípica=6m+10sm+20st+14a e número fundamental (NF) =86. Os resultados quanto a número cromossômico
estão dentro da variação esperada para o gênero na Bacia do Paraguai-Paraná e de acordo com os estudos realizados para
a mesma espécie em outros rios Mato-grossenses. Já os resultados quanto à fórmula cariotípica e conseqüentemente
quanto ao número fundamental divergem dos resultados encontrados para espécie na Bacia do Paraguai. A variação dos
resultados aqui encontrados pode ser conseqüência de rearranjos cromossômicos do tipo fusão e fissão cromossômica.
Os resultados evidenciam uma variação da macroestrutura cariotípica em Astyanax asuncionenses, situação comum para
o gênero e poderia ser explicada pelo fato das espécies do gênero Astyanax poderem formar complexos específicos em
seus locais de ocorrência e pela plasticidade genômica comum ao grupo de peixes.
Apoio Financeiro: UNEMAT, FAPEMAT e UFV.
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Citogenética de Astyanax altiparanae
(Characidae) da população do córrego dos
Caetanos em Uberlândia-MG
Oliveira, DM1; Furtado, ST1; Santos, LP1; Oliveira-Júnior, RJ1; Morelli, S1
Universidade Federal de Uberlândia – Instituto de Genética e Bioquímica
[email protected]
1
Palavras-chave: Astyanax altiparanae, Citogenética, NOR; Hoechst, Uberlândia
O Brasil apresenta uma ampla diversidade biológica onde se encontram cerca de 8000 espécies de peixes de água
doce, que se dividem em alguns grupos principais. A família Characidae, na qual o gênero Astyanax se esta inserido,
é objeto constante de estudos devido à sua complexidade e ao grande número de espécies encontradas, muitas delas
nem mesmo nomeadas oficialmente. Exemplares pertencentes ao gênero Astyanax são encontrados desde o território
Argentino até a fronteira do México com os Estados Unidos, sendo representado por mais de 100 espécies diferentes.
Estudos citogenéticos nestas espécies possibilitaram uma grande evolução no conhecimento taxonômico. O presente
estudo objetivou analisar citogeneticamente a população da espécie de Astyanax altiparanae, encontradas no Córrego
dos Caetanos, no município de Uberlândia-MG por meio das técnicas de Giemsa convencional, detecção das regiões
organizadoras de nucléolos e marcação com um fluorocromo AT específico. As coletas foram realizadas em diferentes
meses do ano a fim de permitir a captura de espécies com diferentes estágios de desenvolvimento reprodutivo. Os
animais coletados apresentaram um número diplóide de 2n= 50 e uma pequena variedade cariotípica em relação aos
de outras populações. Quando os cromossomos foram submetidos à coloração com nitrato de Prata, observou-se a
presença de NOR múltipla na região terminal de pelo menos quatro cromossomos. A coloração com o fluorocromo
Hoechst 33252 não permitiu a visualização de blocos de heterocromatina constitutiva “rica” em AT. A caracterização
citogenética da população pode servir como instrumento de grande importância na comparação entre as populações
de diferentes locais.
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Estudo cariotípico de Astyanax sp. da lagoa
das Bateias, Vitória da Conquista, - BA
Andrade, KAO¹; Andrade, JM¹; Aleixo, LA¹
¹Departamento de Ciências Naturais, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia – UESB
[email protected]
Palavras-chave: Astyanax; citogenética; Lagoa das Bateias
O gênero Astyanax compreende cerca de 60 espécies no Brasil, todas elas consideradas incertae sedis, uma vez que sua
taxonomia é bastante controversa. Este gênero apresenta ampla distribuição na região Neotropical, e compreende
organismos muito similares morfologicamente, sendo, portanto, um grupo complexo do ponto de vista taxonômico. O
cariótipo de várias espécies de Astyanax vem sendo estudado visando elucidar as relações filogenéticas entre elas. O número
cromossômico deste gênero varia desde 2n=36, observado em A. schubert, até 2n=50, observado em A. scabripinnis, A.
fasciatus, A. bimaculatus e A. altiparanae. Tanto o número diplóide de cromossomos (2n) quanto o número fundamental
(NF), têm permitido o estabelecimento de inferências citotaxonômicas e evolutivas para este gênero. O objetivo deste
trabalho foi cariotipar a população de Astyanax sp. da Lagoa das Bateias, uma represa localizada no município de Vitória
da Conquista, Bahia. Poucos estudos têm sido realizados com os peixes da região Sudoeste da Bahia, sendo este estudo
uma importante contribuição para o conhecimento da ictiofauna desta localidade. Dez espécimes de Astyanax sp. foram
coletados nos meses de janeiro e fevereiro de 2008. Todos eles apresentaram uma mancha umeral conspícua, sendo por
isso identificados como pertencentes ao complexo de espécies anteriormente denominados Astyanax bimaculatus. Para
a análise citogenética, os espécimes foram estimulados com fermento biológico sacarosado 48 horas antes do sacrifício.
Passado este tempo, os indivíduos foram colchicinizados e submetidos à técnica de preparação direta das células do
rim cefálico. As lâminas foram coradas convencionalmente com Giemsa e as melhores metáfases foram fotografadas e
utilizadas no estudo cariotípico. Foram observados 2n=50 cromossomos e NF=92 em todos os espécimes analisados.
Do total, 10 cromossomos são metacêntricos, 26 são submetacêntricos, 6 são subtelocêntricos e 8 são acrocêntricos.
Este resultado condiz com a diversidade cariotípica observada neste gênero. Segundo a literatura, o complexo Astyanax
bimaculatus apresenta número cromossômico bastante conservado, ao contrário do que se observa para outros grupos,
como Astyanax aff. fasciatus e A. scabripinnis. Portanto, embora o número diplóide observado neste estudo seja coincidente
com o encontrado em outras populações de 2n=50 cromossomos, rearranjos cromossômicos, especialmente inversões
pericentroméricas, certamente foram importantes eventos ocorridos durante a diversificação deste complexo.
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Estudo citogenético de Astyanax fasciatus
do Rio Gavião, Bahia
Andrade, JM; Aleixo, LA
Departamento de Ciências Naturais, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia
[email protected]
Palavras-chave: Astyanax fasciatus; Characidae; cariótipo; variabilidade; rio Gavião
O gênero Astyanax é um dos mais numerosos da família Characidae, englobando inúmeras espécies com grande
variabilidade cariotípica. Este gênero é bastante comum e diversificado na região neotropical, onde apresenta ampla
distribuição geográfica. Evidências cromossômicas indicam que Astyanax aff. fasciatus corresponde a um complexo de
espécies, uma vez que têm sido identificadas diferenças cariotípicas consideráveis entre as inúmeras populações estudadas.
Diferentes citótipos vivendo em simpatria já foram detectados, o que corrobora a hipótese de que A. fasciatus engloba
várias espécies diferentes. O presente trabalho teve por objetivo descrever o cariótipo de Astyanax fasciatus do rio Gavião,
no município de Anagé. Este estudo irá contribuir para a elaboração de estratégias de conservação da ictiofauna do
rio Gavião, um importante rio intermitente do semi-árido baiano. Para isso, espécimes de Astyanax fasciatus coletados
abaixo da barragem de Anagé, no rio Gavião, foram trazidos para o laboratório, onde foram estimulados com solução
de fermento sacarosado 48 e 24 horas antes do sacrifício. Para a obtenção de células em metáfase mitótica, o rim cefálico
foi coletado e submetido à técnica de preparação direta. As lâminas foram pingadas e coradas convencionalmente
com Giemsa. As melhores metáfases foram fotografadas e utilizadas na montagem do cariótipo desta população.
Foram observados 2n=48 cromossomos em todos os espécimes analisados e número fundamental (NF) igual a 86.
Dos 24 pares encontrados, 4 pares são metacêntricos, 9 pares são submetacêntricos, 6 pares são subtelocêntricos e 5
pares são acrocêntricos. Segundo a literatura, A. fasciatus apresenta variação no número diplóide, de 2n=46 a 2n=50
cromossomos e NF variando de 84 a 96, o que evidencia sua grande variabilidade cariotípica. Supõe-se que rearranjos
cromossômicos, incluindo fissões e fusões cêntricas tenham sido relevantes no processo evolutivo de Astyanax fasciatus.
Diferentes citótipos têm sido descritos e apresentam particularidades que os caracterizam como entidades distintas. A
citogenética, aliada a estudos morfológicos e moleculares, é uma ferramenta relevante que vem contribuindo para a
elucidação das complexas relações filogenéticas do gênero Astyanax.
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A citogenética de Astyanax sp gr A. paranae
(Pisces, Characidae)
Torres-Mariano, AR¹; Morelli, S²
Departamento de Psicologia, União Educacional Minas Gerais – Faculdade de Ciências Aplicadas de Minas (UNIMINAS-FACIMINIAS)
2
Instituto de Genética e Bioquímica, Universidade Federal de Uberlândia
[email protected]
1
Palavras-chave: Citogenética, Astyanax, AgNORs, Heterocromatina, A. paranae
Na América do Sul, o gênero Astyanax se destaca entre os caracídeos por sua ampla distribuição geográfica e diversidade
cariotípica inter e intraespecifica Dentre as espécies deste gênero, Astyanax scabripinnis, tem sido amplamente estudada
devido a sua ampla distribuição geográfica, diversidade cariotípica em relação ao número diplóide, que varia entre 46,
48 e 50 nas diversas populações; às fórmulas cariotípicas, que às vezes determinam diferentes citótipos simpátricos, aos
polimorfismos de banda C e NORs e à presença de cromossomos Bs. A grande variabilidade morfológica e citogenética
permitiram a identificação de pelo menos seis subespécies de Astyanax scabripinnis, incluindo A. scabripinnis paranae,
as quais constituem um “complexo de espécies”. Com o intuito de descrever citogeneticamente uma população do
“complexo scabripinnis”, foram coletados 21 exemplares (15 fêmeas, 5 machos e 1 sexo indeterminado) de Astyanax
sp gr A. paranae da população do córrego dos Caetano (18°44’56’’S/048°18’39’’W - Uberlândia, MG). Com a
coloração Giemsa convencional, foi possível observar um número diplóide de 50 cromossomos, sem dimorfismo sexual
cromossômico. O tratamento com nitrato de Prata marcou até quatro cromossomos em região telomérica, entre eles o
braço menor de um par de cromossomos submetacêntricos e o braço maior de um cromossomo subtelo/acrocêntrico,
determinando um sistema de NOR múltipla. A hibridação “in situ” fluorescente (FISH) com sonda 18S mostrou cinco
marcações. O bandamento C destacou regiões de heterocromatina constitutiva próximas aos centrômeros da maioria
dos cromossomos e nos telômeros de alguns deles. Os cromossomos portadores das Ag-NORs se mostraram banda C
positivos. Estes dados contribuem na diferenciação das espécies do complexo scabripinnis.
Apoio Financeiro: FAPEMIG, CNPq, UFU, UNIMINAS.
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Seleção de primers e repetibilidade
de marcadores ISSR para análise
genético-populacional da espécie
de Astyanax bimaculatus
Martelli-de-Paula,V; Batista, EC; Telles, MPC; Resende, LV
Laboratório de Genética & Biodiversidade, Universidade Católica de Goiás
[email protected]
Palavras-chave: Astyanax bimaculatus, ISSR, caracterização molecular, seleção de primers
A caracterização genética de comunidades aquáticas é fundamental para revelar a história evolutiva das populações.
A utilização de marcadores moleculares possibilita o conhecimento da distribuição da variabilidade genética de uma
espécie. Com o aprimoramento das técnicas de marcadores moleculares, houve uma ampliação de seu uso na ecologia,
com diversas abordagens. O marcador molecular ISSR (inter simple sequence repeat) possui herança de padrão
dominante e baseia-se na amplificação de fragmentos distribuídos no genoma entre regiões repetitivas do DNA. Este
marcador é indicado para estudos com espécies selvagens endêmicas do cerrado, além de ser uma técnica relativamente
rápida, barata e simples. O objetivo desse trabalho foi selecionar primers de ISSR que amplifiquem regiões entre
blocos microssatélites em indivíduos Astyanax bimaculatus. Foram utilizados três indivíduos para os testes de primers
e a otimização das temperaturas de anelamento para essa espécie. A extração do DNA dos indivíduos foi feita a partir
de tecidos musculares com o Kit illustra tissue & cells genomicPrep Mini Spin, fornecido pela GE Healthcare. Após a
extração as amostras foram submetidas à eletroforese em géis de agarose a 1% para comprovar a qualidade do DNA.
Com essas amostras foram testados 30 primers de ISSR ancorados sintetizado pela RW genes. Cada primer foi utilizado
na amplificação das regiões ISSR, via PCR (reação de cadeias em polimerase), com a sua temperatura de anelamento
específica (www.rwgenes.com.br- oligo calculator). Além disso, foram testadas com todos os primers outras temperaturas,
abaixo e acima da TM, para otimizar a amplificação dessas regiões para essa espécie. Para Astyanax bimaculatus foram
selecionados 10 primers (864; 868; 825; 808; 811; 827; 861; 862; 840; 852) pelo bom padrão da amplificação e pelo
número de fragmentos. Após a seleção as amplificações foram feitas novamente a fim de analisar a robustez e o índice
de repetibilidade dos locos e dos marcadores. A codificação dos locos foi feita pela presença e ausência dos fragmentos
amplificados, gerando uma matriz de dados binários, que permite a análise da repetibilidade por loco e por primer. A
escolha dos locos foi feita a partir das bandas mais nítidas que não fossem maiores que 2.000 bp (pares de bases) nem
inferiores a 300 bp. Os 10 primers selecionados serão importantes em estudos futuros acerca da diversidade genética das
populações de Astyanax bimaculatus. Essa diversidade de diversas populações de peixes está ameaçada principalmente
pela poluição, pela introdução de espécies exóticas e pela destruição dos habitats. A perda da mesma reduz a habilidade
da espécie à adaptação às mudanças ambientais. Assim torna-se indispensável o estudo da variabilidade nas populações
de A. bimaculatus para garantir a sua manutenção e propor possíveis medidas conservacionistas.
Orgão financiador: Universidade Católica de Goiás.
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Cariótipo e AgNOR da população de
Astyanax fasciatus (Pisces-TeleosteiCharacidae) do Rio Tijuco (Uberlândia-MG)
Bernardes, LS; Oliveira-Júnior, RJ; Morelli, S
Instituto de Genética e Bioquímica, Universidade Federal de Uberlândia-MG
[email protected]
Palavras-chave: Astyanax, AgNOR, Cariótipo, Rio Tijuco, Citogenética
Os peixes neotropicais apresentam uma grande variabilidade quanto à morfologia. Essa diversidade pode ser produzida
por fatores genéticos, resultado de diferentes biologias e diversos fatores abióticos nos habitats aquáticos. O estudo
citogenético animal visa complementar estudos de aspectos evolutivos, filogenéticos e taxonômicos. O gênero Astyanax
é um dos mais numerosos da família Characidae. Os membros deste gênero são semelhantes na morfologia, no entanto
apresentam amplas variações cariotípicas quanto ao número e à estrutura cromossômica. O presente trabalho visou
determinar o número cromossômico, o cariótipo e caracterizar as localizações das Regiões Organizadoras de Nucléolos
(NORs) da população estudada. Os espécimes de Astyanax fasciatus, popularmente chamado de lambari, foram coletados
através de pesca com isca e anzol e mantidos em aquários aerados. Os exemplares foram coletados no Rio Tijuco, no
município de Uberlândia-MG. Os cromossomos mitóticos foram obtidos através da técnica de preparações diretas e
corados com Giemsa. A caracterização das Regiões Organizadoras de Nucléolos (NORs) foi feita através da técnica de
impregnação com nitrato de Prata. As análises realizadas em metáfases mitóticas mostraram um número diplóide de
2n=46 cromossomos, assim como observado nos estudos de populações próximas como no rio Araguari e no córrego
Lageado. Na presente população, foram detectadas NORs múltiplas, localizadas em pelo menos cinco cromossomos do
complemento, dois cromossomos submetacêntricos pequenos e um cromossomo subtelocêntrico grande com a região
telomérica do braço maior marcado e dois cromossomos submetacêntricos médio com o braço menor inteiramente
marcado prata. Os dados obtidos no presente estudo poderão ser utilizados como ferramentas para melhor caracterizar
a espécie Astyanax fasciatus.
Apoio Finaceiro: CNPQ, FAPEMIG.
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Ocorrência de triploidia natural em Astyanax
scabripinnis (Characiformes, Characidae)
Santos, NM; De Rosa, L; Cruz, VP; Oliveira, C; Foresti, F
Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, 18618-000, Botucatu, SP, Brazil
[email protected]
Palavras-chave: Citogenética, Triploidia, Astyanax scabripinnis
Astyanax scabripinnis é uma espécie de peixe de pequeno porte, vive em diferentes ambientes, a maioria é onívora e
muita ativa, sendo popularmente conhecidos como lambaris. Vem sendo muito estudada pelos pesquisadores com
grande interesse por possuir uma grande diversidade cariotípica numérica, apresentando 2n=46, 2n=48 e 2n=50, e
morfológica com diferenças no número fundamental e ainda por ser comum a presença de cromossomo supranumerário.
Exemplares apresentando triploidia natural entre os indivíduos diplóides já foram encontrados em outras localidades
previamente descritas. Assim o trabalho desenvolvido teve como objetivo caracterizar citogeneticamente exemplares
da espécie Astyanax scabripinnis coletados na localidade do córrego da Igreja Santo Antonio componente de bacia
do rio Tietê. Foi encontrado um indivíduo apresentando triploidia natural com a presença de dois cromossomos
supranumerários um metacêntrico e outro acrocêntrico, este ultimo não foi encontrado em indivíduos diplóides. Sua
fórmula cariotipica é igual aos individuos diplóides encontrados nessa mesma localidade (6M, 26SM, 8ST, 10A). A
distribuição da heterocromatina constitutiva foi visualizada, através da técnica de Banda C em ambos os peixes tanto
o individuo triplóide como o individuo diplóide foram marcados revelando blocos de heterocromatina constitutiva
distribuídos em diversos cromossomos do complemento. Com a marcação da região organizadora nuclear (NOR) corada
através da impregnação pelo nitrato de Prata foi possível observar marcação na região telomérica do braço curto dos
cromossomos de 1 par do tipo submetacêntrico. Outras análises estão sendo realizadas utilizando as técnicas de CMA3
e FISH 18S e novas coletas serão realizadas, para propor comparações dos dados encontrados na população estudada
com os descritos na literatura, para esta espécie, podendo contribuir para a melhor compreensão do processo de origem
desses indivíduos que apresentam triploidia natural em Astyanax scabripinnis.
Apoio financeiro: FAPESP, CNPq, CAPES.
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Avaliação da transferibilidade
de locos em regiões microssatélites
de Astyanax bimaculatus
Gouveia, FO; Boni, TA; Resende, LV; Telles, MPC; Soares, TN; Silva-Jr, NJ; Rosa, FF
Laboratório de Genética & Biodiversidade, Universidade Católica de Goiás
[email protected]
Palavras-chave: Amplificação cruzada, Astyanax, microssatélites, peixe, PCR
Os corpos aquáticos de diversas regiões do mundo têm apresentado uma significativa redução na diversidade de peixes
nativos, devido principalmente à degradação dos habitats, à sobrepesca dos estoques e à introdução de espécies exóticas,
que juntos, provocam desestruturação das comunidades e/ou populações locais, podendo levar à extinção local. O
gênero Astyanax é o mais comum e diversificado da família Characidae na área de abrangência da região neotropical,
e congrega aproximadamente uma centena de espécies que são abundantes nas bacias hidrográficas brasileira. Dentre
elas está Astyanax bimaculatus que tem ampla distribuição geográfica na América do Sul e comumente é denominada
de piaba-do-rabo-amarelo ou lambari-do-rabo-amarelo. Os marcadores moleculares têm sido utilizados como uma
importante ferramenta para a quantificação da variabilidade genética presente nas populações naturais da ictiofauna. O
objetivo deste trabalho foi testar a transferibilidade de marcadores moleculares microssatélites para a espécie Astyanax
bimaculatus, a partir de iniciadores desenvolvidos originalmente para Astyanax fasciatus (Ast), Prochilodus argenteus
(Par), Prochilodus lineatus (Pl), Prochilodus costatus (Pcos), Leoporinus macrocephalus (Lmac), Poecilia reticulata (Pre).
Foram extraídos DNA de amostras de tecido muscular de três indivíduos através do kit de purificação de DNA (GFX),
e quantificados com o auxílio do marcador de peso molecular Low DNA Mass. Depois de diluídos os DNA´s foram
utilizados para a montagem das reações de amplificação, via PCR (Reação em Cadeia da Polimerase), dos iniciadores
para avaliar possíveis amplificações heterólogas. Os produtos de PCR foram separados em gel de poliacrilamida 6% e
corados com nitrato de prata. Para os testes de amplificação dos iniciadores de regiões microssatélites foram utilizados
um total de 46 locos. Para a obtenção dos genótipos, após a revelação e secagem dos géis, foi utilizada luz branca e a
comparação como o padrão de peso molecular 10bp (InvitrogenTM), para a determinação do tamanho do alelo. Os
testes de amplificação foram iniciados com uma temperatura de anelamento igual a 45ºC e após algumas amplificações,
alguns locos apresentaram amplificação com um grande número de bandas (fragmentos) no gel, havendo necessidade de
elevação na temperatura de anelamento até o momento de individualizar o loco e possibilitar a sua codificação. Do total
de iniciadores testados, foi possível detectar que 76% (35 locos) exibiram amplificações inespecíficas, impossibilitando
a sua codificação, ou seja, sem sucesso de transferibilidade, embora haja produto de amplificação. Os 11 locos (24%)
restantes (Par12, Par13, Par43, Lmac3, Lmac7, Ast1, Ast4, Ast10 a 54ºC, Par14, Lmac4, Lmac6 a 56ºC) foram
transferidos com sucesso para a espécie Astyanax bimaculatus. Os alelos encontrados variaram entre 120 e 330 pares de
bases. A próxima etapa é avaliar a segregação de alelos em um número de indivíduos maior, confirmando a possibilidade
de utilização desses locos em estudos genético-populacionais e de conservação da espécie A. bimaculatus.
Apoio financeiro: Systema Naturae Consultoria Ambiental Ltda, CNPq (proc. 152441/2007-7), PROPE/UCG.
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Análise citogenética comparativa entre
populações de Astyanax fasciatus da bacia
do rio Araguari (Uberlândia- MG)
Santos, LP¹; Torres-Mariano, AR¹; Oliveira-Júnior, RJ¹; Morelli, S¹
¹Instituto de Genética e Bioquímica, Universidade Federal de Uberlândia
[email protected]
Palavras-chave: Heterocromatina, NORs, Astyanax, citogenética, cromossomos
O gênero Astyanax é um dos mais comuns e numerosos da família Characidae e apesar de serem conhecidas mais de 100
espécies, somente 15% foram estudadas citogeneticamente. Os estudos cromossômicos deste gênero são completamente
heterogêneos, evidenciando sua complexidade e alta variedade numérica e estrutural do complemento cromossômico.
Encontram-se descritas na literatura espécies com número diplóide de 2n= 45 a 2n= 48 cromossomos. As NORs
apresentam quase sempre mais de um par de cromossomos marcados indicando sistema de NORs múltiplas. As regiões
organizadoras de nucléolo (NORs) abrigam o DNA ribossômico, que transcreve o RNA ribossômico, componente
fundamental dos ribossomos, os quais atuam na tradução do RNA mensageiro produzindo as proteínas. Esta importância
do DNA ribossômico justifica o enorme interesse pelo estudo dessas regiões cromossômicas. Sendo assim, o objetivo
deste trabalho foi comparar os padrões de marcação das NORs de três populações de Astyanax fasciatus que ocorrem
no rio Araguari, no córrego do Panga e no córrego do Lajeado, descrever o padrão de cromomicina (CMA3) das duas
últimas. Estas populações possuem 2n= 46 cromossomos, NORs múltiplas com até cinco cromossomos marcados na
população do rio Araguari, três na população do córrego Panga e duas em cromossomos não homólogos na população
do córrego Lajeado. O tratamento por CMA3 permitiu evidenciar blocos brilhantes na população do córrego Lajeado e
do Panga onde 3 cromossomos foram marcados, sendo eles correspondentes aos cromossomos nucleolares. Desta forma
verificou-se que existem regiões de heterocromatina constitutiva “rica” em GC associada às NORs destas populações. As
diferenças no padrão de distribuição das NORs, podem auxiliar na distinção destas populações e fornecem uma ferramenta
importante para uma melhor compreensão dos mecanismos de evolução cariotípica ocorrido nas espécies.
Apoio financeiro: CNPq, FAPEMIG, CAPES, UFU.
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Análise molecular de espécies da
subfamília Bryconinae baseada em genes
do DNA mitocondrial
Abe, KT; Oliveira, C; Foresti, F
Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências, UNESP- Botucatu
[email protected]
Palavras-chave: Bryconinae, Sistemática, Filogenia, Peixes, Characiformes
A família Characidae é o grupo mais especioso entre os Characiformes, abrangendo cerca de 65% das espécies da
ordem. Entre os Characidae, a subfamília Bryconinae inclui 42 espécies válidas sendo que 40 pertencem ao gênero
Brycon, uma ao gênero Henochilus e uma ao gênero Chilobrycon. Considerando a importância econômica e ecológica
das espécies da subfamília Bryconinae e os resultados controvertidos presentes na literatura quanto à composição desta
subfamília, a obtenção de longas seqüências de DNA para os grupos em questão pode ser de extrema valia para um
melhor conhecimento da relação entre seus componentes e de seu relacionamento com outros Characiformes. No presente
estudo foi amplificado, pela técnica de PCR, um fragmento mitocondrial de aproximadamente 9200pb de sete espécies
da subfamília Bryconinae (seis pertencentes ao gênero Brycon e uma ao Henochilus), todas depositadas na coleção do
Laboratório de Biologia de Peixes de Botucatu. Uma seqüência adicional de Chalceus macrolepidotus (NC_004700),
servindo como grupo externo, foi obtida no GenBank. As análises filogenéticas, pelo método de parcimônia e Mínina
Evolução foram realizadas pelo programa MEGA versão 3.1. O alinhamento de todos os genes resultou numa matriz de
8331 pb, da qual foram removidos os sítios com problemas de alinhamento. No final restaram 2501 sítios conservados,
3012 são variáveis e 1320 são informativos do ponto de vista filogenético. A proporção transição/transversão (Ti/Tv)
observada foi de 0,8. A composição média, em porcentagem, de bases para este gene foi de 29,8% de adenina (A),
27,8% de citosina (C), 16,2% de guanina (G) e 26,2% de timina (T). A partir da análise de todos esses parâmetros,
os seguintes resultados foram obtidos: a hipótese do monofiletismo da subfamília Bryconinae foi corroborada; Brycon
changresis e Brycon petrosus, ambas do Panamá, formaram o grupo-irmão de todas as outras espécies de Brycon analisadas
(brasileiras e venezuelas). O gênero Henochilus formou um grupo-irmão com as espécies de Brycon encontradas nos estados
de Minas Gerais e Rio de Janeiro com as espécies da região do Orinoco (Venezuela) sustentando a hipótese levantada
em estudo anterior que indica a necessidade de incorporação do gênero Henochilus à Brycon. Estudos complementares
estão sendo realizados para elaboração de uma hipótese mais robusta de relacionamento entre as espécies e gêneros de
Bryconinae e destes com outros grupos de Characiformes.
Apoio financeiro: FAPESP.
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Avaliação da diversidade genética intra e
inter populacional da piraputanga (Brycon
hilarii) na Bacia do Alto Paraguai por meio de
microssatélites para o seu manejo sustentado
Okazaki, TI1; Resende, EK2; Hilsdorf, AWS1
Laboratório de Genética de Peixes e Aqüicultura, Núcleo Integrado de Biotecnologia, Universidade de Mogi das Cruzes, Mogi das Cruzes, SP
2
EMBRAPA Pantanal, Corumbá, MS
[email protected]
1
Palavras-chave: Brycon hilarii, piraputanga, microssatélites, genética de populações, conservação
A piraputanga (Brycon hilarii), espécie pertencente a subfamília Bryconinae, distribuída nos rios do Pantanal
Matogrossense na bacia hidrográfica do Alto Paraguai, é importante tanto para pesca comercial da região como para o
turismo ecológico. A manutenção dos estoques naturais de piraputanga em um nível de uso sustentável depende dentre
outras da conservação da variabilidade genética intra e inter populacional. Para isso, é necessário o conhecimento da
estrutura e do grau de diferenciação genética destas, o que pode ser conseguido através do uso de marcadores moleculares,
como os microssatélites, e assim, serem desenvolvidas estratégias de manejo sustentado para estas populações. Para a
amostragem foram coletados tecidos da nadadeira caudal de 30 amostras de espécimes do rio Paraguai, 54 do rio Cuiabá,
73 do rio Taquari e 47 do rio Miranda, sem o sacrifício dos mesmos. Após a extração do DNA total das amostras os
primers (Bh15 e Bh16) desenhados para a espécie (Sanches com. pes., 2005) foram utilizados para a amplificação dos
loci microssatélites e os produtos amplificados visualizados em gel de poliacrilamida. Após determinados os tamanhos
dos alelos com o programa Alpha Index 6.5, as análises estatísticas foram conduzidas por meio dos programas HWQuickCheck, Arlequin v3.11 e GENEPOP v3.4. Os dois loci estudados são polimórficos para a espécie estudada, com 4
alelos genotipados em cada locus. Para o locus Bh15, a heterozigozidade observada (Ho) foi de 0.50 com heterozigozidade
esperada (He) de 0.49, já para o para o locus Bh16 a Ho foi de 0.43 e a He 0.42 sem desvio significativo do equilíbrio de
Hardy-Weinberg. Altos valores de Ho indicam alta variabilidade genética intrapopulacional, o que foi comprovado com
a análise AMOVA, que mostrou que 100% do total da variação encontra-se entre indivíduos dentro das localidades. A
diversidade gênica média das 4 populações avaliadas foi de 0,455285 (46%), sendo considerado um valor baixo para
peixes de água doce, mas que pode ser explicado pela natureza tri- e tetranucleotídica dos loci usados. O valor médio
de Fis para o locus Bh15 foi de -0.0299 e para o locus Bh16 foi de -0.0126, mostrando que a endogamia nas populações
estudadas ocorre com menos freqüência do que o esperado ao acaso. O valor calculado de Fst = -0.00344 (P>0,05)
sugere uma total panmixia entre as populações (Fst=0), já que o valor estatístico não é significativamente diferente de
zero. A análise dos dois loci indica ausência de estruturação genética entre as populações estudadas. Com esses dados
em mãos, indica-se como principal estratégia de manejo para a piraputanga a preservação das 4 populações como parte
de apenas uma unidade de manejamento ou como uma metapopulação, já que como indicado, não existe estruturação
gênica populacional ou nos subgrupos.
Apoio financeiro: CNPq, FAEP e EMBRAPA Pantanal.
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PCR-RFLP no diagnóstico de híbridos entre
as espécies Matrinxã (Brycon amazonicus)
e Piraputanga (Brycon microlepis):
implicações para conservação
Reis, LCJ1; Hashimoto, DT1; Mendonça, FF2; Senhorini, JA3; Bortolozzi, J1; Foresti, F2; Porto-Foresti, F1
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual Paulista, Bauru/SP
2
Departamento de Morfologia, Universidade Estadual Paulista, Botucatu/SP
3
Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade, CEPTA, Pirassununga/SP
[email protected]
1
Palavras-chave: conservação genética, genética forense, híbridos interespecíficos
A produção de híbridos interespecíficos de peixes atualmente já se tornou uma prática muito comum no Brasil, visando,
principalmente, o aumento da produtividade e a obtenção de linhagens estéreis. Contudo, os híbridos podem realizar
retrocruzamentos bem-sucedidos com os tipos parentais, provocando contaminação genética dos estoques selvagens, ou ainda
competir de diversas formas com as linhagens parentais. Desta forma, faz-se necessário a criação de programas efetivos de
caracterização e monitoramento desses animais e a avaliação correta do uso desses indivíduos em projetos de piscicultura, de
forma a evitar potenciais riscos para o meio ambiente. O monitoramento genético de processos de hibridação interespecífica
consiste no uso de metodologias que possibilitam encontrar características genéticas diagnósticas na clara identificação de parentais
e híbridos. No presente estudo, através de técnicas moleculares de PCR-RFLP de genes mitocondrial e nuclear, caracterizouexemplares da linhagem híbrida, diferenciando-a de seus respectivos parentais, Matrinxã (Brycon amazonicus) e Piraputanga
(Brycon microlepis). Inicialmente, foram criadas bibliotecas de seqüências de DNA nuclear (gene α-tropomiosina) e mitocondrial
(gene ribossômico 16S) que permitiram verificar algumas diferenças de composição nucleotídica entre as espécies parentais.
Em seguida, através de mapas de restrição foram feitas a seleção por sítios de clivagem espécie-específicos, que permitiram
encontrar em exclusividade para o gene mitocondrial de Brycon amazonicus um sítio de clivagem de enzima classificada de B1 e
para o gene nuclear de Brycon microlepis um sítio de restrição para outra enzima, classificada de B2. Deste modo, amplificações
destes genes via PCR e uma posterior digestão pelas enzimas, para o gene 16S e α-tropomiosina, respectivamente, resultaram
em diferentes padrões para as espécies parentais. Os resultados para o gene mitocondrial em B. amazonicus revelaram um
padrão eletroforético de duas bandas (marcadores), enquanto que, em B. microlepis observou-se apenas um fragmento, não
digerido pela endonuclease. Para o gene nuclear, em B. microlepis encontrou-se um padrão eletroforético de duas bandas
(marcadores), enquanto que, em B. amazonicus observou-se apenas um fragmento. Consequentemente, no híbrido analisado
verificou-se para o gene nuclear um padrão de três marcadores, sendo dois provenientes de B. amazonicus e um de B. microlepis,
possibilitando sua identificação pelo diagnóstico heterozigótico aos parentais. Já em relação ao gene mitocondrial, o híbrido
apresentou o mesmo perfil eletroforético observado pelo parental materno, o que mascara sua identificação, no entanto, dada
a característica de transmissão materna dos genes mitocondriais, as análises puderam confirmar quem é o parental materno
de forma precisa, complementando as análises de identificação dos híbridos. Esses estudos envolvendo genética aplicada à
piscicultura fornecem subsídios para a fiscalização e monitoramento de projetos de hibridação em pisciculturas, para um
manejo adequado dos estoques de peixes e na orientação de programas de conservação biológica.
Apoio financeiro: FAPESP, CNPq e ICMBio.
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Genética populacional de Brycon amazonicus
na calha do rio Amazonas e tributários
MOTA, EP1,2 I; FARIAS, IP1
Universidade Federal do Amazonas, Laboratório de Evolução e Genética Animal
2
Instituto de Pesquisa da Amazônia
[email protected]
1
A subfamília Bryconinae pertence à grande família dos characídeos os quais possuem a característica de realizar migrações,
sejam elas para fins reprodutivos ou de alimentação. Esta subfamília abriga 40 espécies, dentre essas se destaca a espécie
Brycon amazonicus que se distribui na America do Sul em grandes bacias hidrográficas como a bacia do rio Amazonas. A
espécie B. amazonicus é muito apreciada na alimentação das populações locais tendo grande importância em sistemas de
pesca comercial. Estudos sobre a genética populacional dessa espécie na bacia do rio Amazonas podem contribuir para o
conhecimento da constituição genética, o grau de variabilidade genética e ainda verificar se as populações se encontram
estruturadas ou não. Para realizar tal estudo foram amostrados 95 indivíduos coletados na calha do rio Amazonas:
Tabatinga (n=14), Coari (n=13), Tefé (n=8), e Lago Janauacá (n=17); no rio Madeira: Borba (n=12) e Humaitá (n=9);
no rio Japurá: RDS Amanã (n=14); e no rio Purus: Boca do Acre (n=8). De cada indivíduo foram coletadas amostras de
tecido muscular e estocados em tubos de 2,5 ml, contendo álcool 95%. Todas as amostras tiveram o DNA total extraído
pelo método de Fenol/Clorofórmio e quantificadas em gel de agarose 1%. Em seguida foram realizadas as amplificações
via reação em cadeia da polimerase, utilizando primers para região codificante da ATPase 6 e 8 do DNA mitocondrial.
As amostras foram seqüenciadas em seqüenciador automático ABI que produziu seqüências nucleotídicas de 587 pares
de bases, por meio das quais foi verificado a existência de 27 haplótipos e 25 sítios polimórficos que foram analisados no
programa DNASP. As análises de genética de populações foram realizadas no programa ARLEQUIN onde realizamos
o teste de AMOVA o qual mostrou que a maior parte da variabilidade genética se encontra distribuída dentro das
populações (FST 0.089 P<0,05), indicando que as populações se encontram estruturadas geneticamente. Entretanto,
as comparações de FST evidenciaram fracas estruturações genéticas entre as localidades as quais não foram significantes
após a correção de Bonferroni (P<0,006). Nas análises par a par do número de migrantes por geração (Nm) todos os
pares de comparações apresentaram valores de Nm que variaram de 2 a infinito. Nossos resultados indicam que as
populações de Brycon amazonicus provavelmente constituem uma única população. Novas análises com amostragem de
outros tributários e novos pontos na calha principal podem fornecer informações adicionais para confirmar a panmixia
nas populações através deste marcador genético.
Apoio/Financiamento: CT Amazônia/CNPq, PPG7/CNPq.
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Variabilidade haplotipica de Leporinus piau
Fowler, 1941 (Characiformes, Anostomidae)
da bacia do rio Itapecuru/MA
Silva, LMM; Barros, MC; Fraga, E
Laboratório de Genética Biologia Molecular – CESC/UEMA
[email protected] e [email protected]
Palavras-chave: Haplótipo, DNA mitocondrial, Piaus
Na região Neotropical ocorrem 12 gêneros e aproximadamente 140 espécies de peixes da família Anostomidae. Nesta
família o gênero Leporinus agrupa 87 espécies sendo o mais diversificado integrando espécies de taxonomia complexa,
onde representantes juvenis apresentam morfologia similar e adultos diferem apenas em alguns caracteres morfométricos
e padrão de coloração. A espécie Leporinus piau encontra-se amplamente distribuída em bacias hidrográficas da região
Nordeste e constituem importantes recursos pesqueiros. Este trabalho teve como objetivo determinar os níveis de
variabilidade genética de Leporinus piau da bacia do rio Itapecuru por meio de seqüências do gene mitocondrial rRNA
16S. As amostras foram obtidas na bacia do rio Itapecuru e a extração de DNA a partir do tecido muscular foi realizada
utilizando-se o protocolo de fenol-clorofórmio. A amplificação do gene rRNA 16S foi realizada via PCR e seqüenciado
usando-se o método didesoxiterminal com o Kit Big Dye. As seqüências geradas foram editadas e alinhadas no programa
BioEdit. A diversidade haplotipica (h) e nucleotídica (π) foram determinadas no programa DnaSP e a análise filogenética
realizada no programa PAUP 4,0b10. A significância dos agrupamentos foi estimada pela análise de bootstrap. Um
fragmento de 481 pares de bases foi obtido para o gene mitocondrial rRNA 16S em 21 espécimes de L. piau. Foram
encontrados 10 haplótipos e doze sítios variáveis com uma diversidade haplotípica (h) e nucleotídica (π) de 0,867 e
0,00571, respectivamente. A reconstrução filogenética gerou árvores com a mesma topologia nos diferentes métodos
utilizados, mostrando que os haplótipos de Leporinus piau foram fortemente agrupados com 98% de bootstrap em todas
as análises realizadas. Elevados índices de divergência nucleotídica foram observados entre os haplótipos de L. piau,
com valores variando de 0,2 a 1,8%. Portanto, os resultados do presente estudo com rRNA 16S gerou informações
que confirmam uma maior diferenciação da espécie L. piau o que contribui para esclarecer questões taxonômicas da
família Anostomidae e também subsidiar programas de manejo e conservação destes recursos pesqueiros.
Apoio Financeiro: BNB/UEMA/UFPA.
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Padronização da amplificação
de locos microssatélites transferidos
para Leporinus friderici
Telles, MPC; Gouveia, FO; Resende, LV; Soares, TN; Silva-Jr, NJ
Laboratório de Genética & Biodiversidade, Universidade Católica de Goiás
[email protected]
Palavras-chave: ictiofauna, microssatélites, peixe, transferibilidade
Um dos problemas enfrentados por programas que visam à manutenção da biodiversidade é a necessidade de se conservar
o máximo de recursos com o mínimo de gastos. Estudos sobre a estrutura das populações de peixes são muito importantes,
pois vários aspectos da estratégia de vida das espécies na alocação de energia, seja para o crescimento, reprodução ou
manutenção, são interpretados através da análise da estrutura populacional. Esses resultados fornecem importantes
subsídios ao dimensionamento dos estoques e a medidas eficientes na administração, proteção, monitoramento e
estratégias de conservação dos recursos pesqueiros. O Leporinus friderici, conhecido popularmente como piava, piaba,
piau-de-três-pintas ou simplesmente piau, é uma espécie encontrada na bacia dos rios Paraíba, Mogí–Iguaçú, Pardo,
Grande, Piracicaba, Paraná e rios da bacia Amazônica e do Nordeste brasileiro. Alimenta-se de insetos e vegetais e é uma
espécie bastante apreciada na pesca esportiva. Os marcadores moleculares têm sido utilizados como uma importante
ferramenta para a quantificação da variabilidade genética presente nas populações naturais e, nos últimos anos, permitiu
a realização de experimentos que busquem a amplificação cruzada de regiões microssatélites entre espécies próximas do
ponto de vista evolutivo. Nesse sentido, o presente estudo tem por objetivo padronizar a amplificação de iniciadores de
regiões microssatélites transferidos para o genoma da espécie Leporinus friderici, além de testar a amplificação cruzada
de iniciadores desenvolvidos para diversas outras espécies de peixes. A extração de DNA foi realizada a partir de uma
pequena amostra de tecido muscular, utilizando-se um Kit de purificação específico. Depois de extraído, o DNA
foi quantificado com o auxílio do marcador de peso molecular para, então, ser utilizado nas reações de amplificação
dos locos. Os testes de amplificação, via reação em cadeia da polimerase (PCR), foram iniciados com os 46 locos, a
partir da temperatura de anelamento igual a 45ºC. Os produtos de PCR foram separados em gel de poliacrilamida
6% e corados com nitrato de prata. Do total de iniciadores testados 55% dos locos (25) exibiram muitos fragmentos
de amplificações inespecíficas. Os 21 locos (45%) restantes apresentaram um bom padrão de amplificação, sendo,
portanto transferidos com sucesso para a espécie Leporinus friderici. Esses locos foram padronizados com diferentes
temperaturas de anelamento, conforme descrito a seguir: Pre26 (68ºC); Pcos18, Lmac3 e Lmac5 (66ºC); Par3, Par12,
Par35 e Lmac6 (64ºC); Par26, Par53 e Pcos14 (62ºC); Lmac9 e Ast2 (60ºC); Par21 (58ºC); Par14 e Lmac8 (52ºC);
Ast9 e Pre18 (50ºC); Ast10 (48ºC); Ast1 (45ºC). Esses resultados indicam que há um grande potencial de amplificação
heteróloga desses marcadores microssatélite entre diferentes espécies, inclusive de níveis taxonômicos mais distantes.
Estas informações são indispensáveis para subsidiar estratégias de manejo em populações naturais de peixes, no sentido
de garantir a manutenção da diversidade genética desta espécie.
Apoio financeiro: Systema Naturae Consultoria Ambiental Ltda, PROPE/UCG.
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Identificação de uma seqüência de dna
repetitivo no genoma de Leporinus elongatus
através da enzima SmaI (Characiformes:
Anostomidae)
Busso, AF; Parise-Maltempi, PP
Instituto de Biociências, Departamento de Biologia, Universidade Estadual Paulista
[email protected]
Palavras-chave: seqüências repetitivas, Leporinus, heterocromatina
Uma característica interessante do genoma de eucariotos é a presença de grande quantidade de seqüências de DNA
repetitivo, as quais são compostas por regiões não codificantes. Essas seqüências podem ser bons marcadores para estudos
evolutivos, identificação de rearranjos cromossômicos e de diferenças entre machos e fêmeas, além de outras aplicações
genéticas. Embora DNAs repetitivos tenham sido muito estudados em invertebrados e mamíferos, em peixes ainda
é pequeno o número de informações que se têm a respeito dessas seqüências quando comparado ao grande número
de espécies existentes. A espécie Leporinus elongatus apresenta uma macroestrutura cariotípica bastante conservada,
composta por 2n=54 cromossomos e um peculiar mecanismo de cromossomos sexuais ZW, onde o W é totalmente
heterocromático. Considerando-se a grande quantidade de heterocromatina constitutiva presente em seu genoma,
esta espécie é um interessante modelo para estudos de seqüências repetitivas. Desta forma, o presente trabalho teve
como objetivo a obtenção de seqüências repetitivas através da utilização de enzimas de restrição. O DNA genômico foi
digerido com diferentes enzimas de restrição e o produto das digestões submetido à eletroforese em gel de agarose 1%
para a visualização de possíveis bandas de DNA repetitivo. Foi observada uma banda de aproximadamente 500 pares de
bases obtida com a enzima SmaI, que foi clonada no plasmídeo pMOS e será seqüenciada e localizada em cromossomos
metafásicos através da técnica de hibridação in situ. Estudos no gênero Leporinus envolvendo as seqüências repetitivas
podem contribuir para o entendimento da organização estrutural e funcional e evolução do genoma dos peixes, em
particular no que se refere à heterocromatina e cromossomos sexuais.
Apoio financeiro: FAPESP.
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Análise filogenética dos gêneros Myloplus
e Metynnis de ocorrência na bacia do rio
Itapecuru, Maranhão
Lima, JR; Barros, MC; Fraga, E
Laboratório de Genética e Biologia Molecular – CESC/UEMA
[email protected]
Palavras-chave: Characiformes, Pacu, Filogenia, Myloplus, Metynnis
A família Characidae é a mais complexa e numerosa da ordem Characiformes, com um grande número de subfamílias,
entre elas a Serrasalminae. Os pacus peixes desta subfamília compreendem oito gêneros e aproximadamente trinta espécies.
São endêmicos das regiões neotropicais e bem distribuídos na maioria dos rios da América do Sul. As características
básicas desse grupo é corpo bastante comprimido e alto, quase redondo, uma série de escudos ósseos no ventre, dentes
incisivos que se distribuem em duas fileiras na maxila superior e apenas uma na maxila inferior. Este trabalho teve como
objetivo caracterizar molecularmente as amostras de pacus com a finalidade de gerar informações que possam subsidiar
estratégias de manejo e conservação para este grupo. Os espécimes foram coletadas ao longo do rio Itapecuru no estado
do Maranhão, identificados utilizando chaves dicotômicas especializadas. O DNA foi isolado utilizando-se o protocolo
de fenol-clorofórmio e o gene rRNA 16S foi amplificado utilizando a técnica de Reação em Cadeia de Polimerase
(PCR) com iniciadores específicos. Os produtos de PCR foram seqüenciados utilizando-se o método didesoxiterminal.
As seqüências foram editadas e alinhadas no programa Bioedit. A análise filogenética foi obtida através do programa
MEGA 4.0. com matriz filogenética estimada pelo algoritmo de Kimura 2-parâmetros, a significância dos agrupamentos
foi verificada através do bootstrap. Foi incorporada na análise uma seqüência do GenBank (AF283933) para verificar
similaridade genética com os estoque do Rio Itapecuru. Um fragmento de 504 pares de bases do gene rRNA 16S foi
obtido em 16 espécimes, apresentando a seguinte composição nucleotídica 20,7 % de timina 25 % de citosina, 30,1 %
de adenina e 24,2 % de guanina. As árvores filogenéticas obtidas pelos Métodos de Máxima Parcimônia e Agrupamento
de Vizinhos apresentaram topologias similares, onde foi observada a formação de dois clados fortemente apoiados. A
divergência nucleotídica entre os gêneros foi de 6,1%. A magnitude da divergência e a reconstrução filogenética para
os gêneros Myloplus e Metynnis confirmam a sua caracterização quanto ao status de gênero, sendo assim, pode-se pensar
em estratégias de manejo e conservação para este grupo.
Apoio financeiro: BNB, UFPA e UEMA.
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Análise do cromossomo B de Cyphocharax
nagelii (Characiformes, Curimatidae)
utilizando microdissecção e hibridação
in situ fluorescente
Oliveira, RM1; Júnior Sobrinho, IS1; Laudicina, A2; Buckup, PA3; Moreira-Filho, O1
Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos
2
Centro Atômico Constitugentes, Buenos Aires, Argentina
3
Departamento de Vertebrados, Universidade Federal do Rio de Janeiro
[email protected]
1
Palavras-chave: microdissecção, cromossomo B, DOP-PCR, FISH, evolução
Os cromossomos B são considerados por muitos autores como elementos dispensáveis, presentes em alguns indivíduos de
algumas populações de uma determinada espécie, os quais surgiram provavelmente dos cromossomos do complemento A
e seguiriam um caminho evolutivo independente. No presente trabalho foram analisados exemplares machos e fêmeas de
Cyphocharax nagelii coletados excepcionalmente na Bacia do Rio São Francisco. As técnicas empregadas foram: coloração
convencional Giemsa, impregnação pela prata, bandamento C, microdissecção cromossômica, DOP-PCR (Degenerate
Oligonucleotid Primer) e hibridação in situ fluorescente. O número diplóide obtido foi 2n=54 com cromossomos
meta- e submetacêntricos. Este número foi interindividualmente variável devido a presença de cromossomos B. Estes
elementos adicionais variaram de 0 a 4. A aplicação das técnicas de bandamento C e impregnação pela Prata mostrou
resultados coincidentes com a maioria das espécies de Curimatidae até o presente analisadas. A impregnação pela
Prata mostrou regiões organizadoras de nucléolos (RON) na região distal do par cromossômico 24. O bandamento C
evidenciou heterocromatina na região pericentromérica de todos os cromossomos do complemento A; adicionalmente
blocos heterocromáticos distais em ambos os braços dos cromossomos do par 3 e em um dos braços cromossômicos do
par 24 foram observados. Os cromossomos B não foram impregnados pela prata sugerindo a ausência de RON ativas
nestes elementos. A técnica de bandamento C evidenciou cromossomos B heterocromáticos. O resultado preliminar
da hibridação in situ fluorescente utilizando o produto do DOP-PCR da microdissecção de um cromossomo B, foi a
hibridação quase total deste cromossomo. As análises iniciais não permitiram confirmar se a região centromérica do
cromossomo B também foi hibridada. As seqüências do cromossomo B utilizadas na hibridação in situ não foram capazes
de se ligar a nenhuma região de nenhum dos cromossomos do complemento A. A falta de homologia das seqüências do
cromossomo B microdissectado com os cromossomos do complemento A pode ter relação com a evolução independente
desse elemento adicional. Considerando que os resultados foram baseados na microdissecção de um cromossomo B de
um determinado exemplar e que existem até 4 cromossomos B na espécie C. nagelii, muitas perguntas ainda terão que
ser respondidas para que se possa entender a dinâmica deste elemento no cariótipo desta espécie.
Apoio financeiro: CNPq.
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Microdissecção e pintura cromossômica
total (WCP). análise dos cromossomos
sexuais em Triportheus (Characiformes,
Characidae)
Diniz D1; Laudicina A2; Cioffi, MB3; Bertollo, LAC3
Departamento de Morfologia, IBB, UNESP
Comision Nacional de Energía Atómica, Buenos Aires, Argentina
3
Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Triportheus, FISH, cromossomos sexuais, microdissecção
As espécies de peixes do gênero Triportheus apresentam 2n=52 cromossomos e uma macroestrutura cariotípica semelhante,
com um sistema de cromossomos sexuais ZZ/ZW que constitui uma provável sinapomorfia para esse grupo. Uma sonda
específica do cromossomo Z de T. nematurus foi obtida por microdissecção, seguida de amplificação inespecífica por
DOP-PCR (Degenerate Oligonucleotid Primer-PCR). Preparações cromossômicas de T. nematurus (rio Piracicaba,
SP) foram transferidas para uma lamínula limpa e coradas com Giemsa 5%. A microdissecção foi feita no cromossomo
Z, o qual é facilmente identificado por corresponder ao maior cromossomo do cariótipo em todas as espécies desse
gênero. O material microdissectado foi transferido para um tubo contendo o mix para DOP-PCR. As reações de PCR
foram realizadas em um Termociclador MasterCycler Gradient (Eppendorf ). Após a amplificação inicial dos produtos
microdissectados (DOP-PCR) uma segunda PCR foi realizada, com a finalidade de manter um estoque da sonda.
Finalmente, a terceira reação de PCR visa marcar o produto de microdisseção a ser utlilizado como sonda na FISH
(Fluorescent In situ Hybridization). Após cada PCR as amostras amplificadas foram submetidas a uma eletroforese em
gel de agarose 1% para a verificação da qualidade da mesma. Neste caso, os fragmentos devem apresentar cerca de 300
a 600 pb para que a hibridação sonda/alvo seja mais eficiente. Esta sonda foi utilizada para WCP (Whole Chromosome
Painting) em deferentes espécies de Triportheus, através da FISH, com o objetivo de analisar a diferenciação do sistema
ZW no grupo. Foi também testada a homologia desta sonda em algumas outras espécies de Characidae filogeneticamente
próximas de Triportheus, procurando evidências sobre a evolução desse sistema. O cromossomo Z mostrou hibridação
completa em todas as espécies de Triportheus analisadas, enquanto que o cromossomo W apresentou apenas uma marcação
reduzida no braço curto, ou na região adjacente ao centrômero, conforme a espécie. Os cromossomos das espécies de
outros gêneros de Characidae não evidenciaram nenhuma hibridização detectável. Os resultados obtidos reforçam as
hipóteses sobre a sinapomorfia do sistema ZZ/ZW em Triportheus e a conservação do cromossomo Z neste grupo.
Ficou também evidenciado que, além da redução no tamanho, o cromossomo W passou por alterações acentuadas na
composição do material genético, considerando sua possível condição ancestral de homologia ao cromossomo Z. Assim
sendo, apenas uma pequena região homóloga está hoje presente entre esses dois cromossomos nas diferentes espécies,
predominantemente situada no braço curto do cromossomo W.
Apoio financeiro: CAPES.
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Contribuições ao estudo do gênero
Characidium: análise cariotípica de
Characidium lauroi (Characiformes,
Crenuchidae)
Oliveira, KC1; Buckup, PA2; Almeida-Toledo, LF1
Instituto de Biociências, Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Universidade de São Paulo
2
Museu Nacional do Rio de Janeiro, Universidade Federal do Rio de Janeiro
[email protected]
1
Palavras-chave: Characidium, citogenética, FISH, CMA3, conservação cariotípica
O gênero Characidium, pertencente à família Crenuchidae, é composto de pequenos peixes que raramente excedem
um tamanho padrão de 10 cm e que usualmente ocorrem em cabeceiras de pequenos rios. Poucos estudos citogenéticos
foram feitos sobre essa família, sendo esses concentrados no gênero em questão. Os estudos mostram, para as espécies
analisadas, número diplóide constante (2n = 50), sendo a estrutura cariotípica variável. Essas variações são relativas às
formas cromossômicas, à presença de sistema de cromossomos sexuais, ao número e posição das regiões organizadoras
de nucléolo (RONs), aos blocos de heterocromatina constitutiva (bandamento C), e à presença de cromossomos
supranumerários. O objetivo do presente trabalho é analisar exemplares de Characidium lauroi, capturados na Bacia do
Rio Paraíba do Sul, por meio de técnicas citogenéticas e citogenético-moleculares, a fim de ampliar os estudos no gênero e
contribuir para o melhor entendimento da genética desse grupo. Os resultados obtidos evidenciaram número diplóide de
2n=50, com a presença de 1-2 cromossomos supranumerários. Por meio do bandamento C, foi possível visualizar blocos
de heterocromatina localizados na posição centromérica de quase todo o conjunto diplóide, com alguns cromossomos
apresentando blocos C-positivos nas regiões terminais. As RONs foram localizadas terminalmente no braço longo do
primeiro par de cromossomos submetacêntricos, localização essa confirmada pela detecção do DNAr 18S e pela técnica
que evidencia regiões ricas em C-G (CMA3). O DNAr 5S foi localizado em um par de cromossomos submetacêntricos
pequeno. Esses resultados confirmam a alta variabilidade cariotípica presente no gênero Characidium, muito embora
esse grupo se comporte de forma conservada em relação ao seu número diplóide. Os dados indicam que as espécies
desse gênero são bastante relacionadas, apesar de serem isoladas geograficamente. Estudos genéticos mais aprofundados
são necessários para um entendimento mais amplo das relações entre as espécies do gênero Characidium.
Auxílio financeiro: Capes, FAPESP.
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Análise filogenética dos gêneros
Psectrogaster e Curimata da família
Curimatidae (Characiformes) na bacia do
Itapecuru, Maranhão
Santos, KC; Barros, MC; Fraga, E
Laboratório de Genética e Biologia Molecular – CESC/UEMA
[email protected] e [email protected]
Palavras-chave: Branquinha, Psectrogaster, Filogenia
Os curimatídeos são peixes da ordem Characiformes amplamente distribuídos na América Central e do Sul. Esta família
inclui oito gêneros e cerca de 140 espécies de peixes de pequeno porte que apresentam corpo curto, alto e comprimido,
revestido de escamas prateadas. Na família curimatidae as espécies Psectrogaster rhomboides e Curimata macrops popularmente
conhecidos como branquinha, tapiaca e choradeira encontram-se distribuídas pelo Norte e Nordeste do Brasil. Na bacia
do rio Itapecuru representantes desta família pertencentes ao gênero Psectrogaster e Curimata ocorrem com freqüência,
no entanto, pouco se conhece as relações filogenéticas destes. Portanto o objetivo deste estudo foi gerar informações
que contribuam para o esclarecimento de sua filogenia, usando como ferramenta o gene rRNA 16S. Os espécimes
foram obtidos na bacia do Rio Itapecuru e o DNA foi extraído a partir do tecido muscular utilizando-se o protocolo
de fenol-clorofórmio, a amplificação do gene rRNA 16S foi realizada via PCR usando primers específicos. O produto
da PCR foi seqüenciado usando-se o método didesoxiterminal. As seqüências geradas foram editadas e alinhadas no
programa Bioedit. As análises filogenéticas foram realizadas no programa MEGA4 e três seqüências do Genbank foram
incorporadas à análise e usadas como grupo externo Prochilodus nigricans/AY788075, Pygocentrus nattereri/AY788074 e
Leporinus sp./AY788044. Um fragmento de 575 pb do gene mitocondrial rRNA 16S foi obtido para 10 espécimes de
Psectrogaster rhomboides e 14 de Curimata macrops. A composição nucleotídica foi de 22,2% T, 23,6% C, 30,9% A e
23,3% G e os dados não mostraram saturação. Para P. rhomboides foram encontrados dois haplótipos e para C. macrops
observou-se apenas um. A reconstrução filogenética gerou árvores com a mesma topologia usando tanto o algoritmo de
distância, como pela análise de máxima parcimônia, onde os dois gêneros foram fortemente agrupados, tendo como
grupo irmão a seqüência de Prochilodus nigricans, mostrando assim que as famílias Curimatidae e Prochilodontidae
são muito próximas. A divergência genética variou de 4 a 5 % entre os gêneros Psectrogaster e Curimata, e de 6 a 7
% com Prochilodus, reforçando a forte similaridade entre estas familias. Portanto, nossos resultados confirmam que
dentre os Characiformes, Curimatidae e Prochilodontidae estão fortemente relacionados corroborando com os dados
morfológicos.
Apoio Financeiro: UEMA, BNB e UFPA.
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Caracterização genética de Pygocentrus
nattereri (Characidae) da bacia do rio
Itapecuru/MA
da Luz, LA; Barros, MC; Fraga, E
Laboratório de Genética e Biologia Molecular – CESC/UEMA
[email protected] e [email protected]
Palavras-chave: Pygocentrus nattereri, DNA, Genoma mitocondrial, PCR
A Família Characidae, ordem Characiformes, compreende cerca de 30 subfamílias e 250 gêneros amplamente distribuídos
na América do Sul. As espécies desta família são de alto valor econômico e constituem importantes recursos pesqueiros que
tem sido constantemente explorado na pesca artesanal e comercial, como é o caso de Pygocentrus nattereri, vulgarmente
conhecida como piranha. O presente trabalho tem como objetivo identificar e caracterizar molecularmente os estoques
de Pygocentrus nattereri da bacia do rio Itapecuru/MA, por meio de sequências do DNA mitocondrial do gene rRNA
16S, gerando informações que possam contribuir para futuros programas de manejo e conservação destes recursos
pesqueiros. As amostras foram obtidas no alto, médio e baixo curso da bacia do rio Itapecuru/MA. O DNA foi isolado
utilizando-se o protocolo de fenol-clorofórmio e a amplificação do rRNA 16S foi realizada através da técnica de PCR
usando-se primers específicos. Os produtos das PCRs foram seqüenciados utilizando-se o método didesoxiterminal. As
seqüências foram editadas e alinhadas no programa BioEdit e as análise filogenéticas realizadas no programa MEGA4.
Uma seqüência retirada do GenBank (AY788074/Pygocentrus nattereri) foi incorporada na análise para verificar a
similaridade genética com o estoque do rio Itapecuru.Um fragmento de 415 pares de bases do gene 16S foi obtido em
oito espécimes identificados como Pygocentrus nattereri com a seguinte composição nucleotídica: 20,6% de timina,
24,2% de citosina, 31,6% de adenina e 23,6% de guanina. Um único haplótipo foi observado para a bacia do rio
Itapecuru agrupando fortemente com a seqüência do GenBamk, tratando-se assim de uma única espécie e corroborando
com as informações disponíveis na literatura através de estudos morfológicos. Considerando os resultados desta análise,
observou-se que os espécimes apresentaram uma baixa variabilidade genética com apenas um haplótipo, para a espécie
Pygocentrus nattereri, portanto, as informações aqui obtidas contribuem para o conhecimento da constituição genética
dos estoques de Pygocentrus nattereri da bacia do rio Itapecuru.
Apoio Financeiro: BNB/UEMA/FAPEMA e UFPA.
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Caracterização citogenética e molecular
de cromossomos B em Moenkhausia
sanctaefilomenae (Characiformes, Characidae)
Sobrinho-Scudeler, PE1; Oliveira, C1; Foresti, F1
Departamento de Morfologia, IBB-UNESP
[email protected]
1
Palavras-chave: Moenkhausia sanctaefilomenae, heterocromatina, DNA satélite, cromossomos B, fluorocromo
A presença de cromossomos B tem sido descrita em animais e plantas. Estes elementos estruturais extras constituem
materiais genéticos de origem e função pouco conhecidas. Entre os peixes, principalmente os da ictiofauna neotropical, a
presença desses cromossomos é expressiva entre várias espécies, se tornando de grande interesse para estudos relacionados
a sua estrutura, origem e função. O presente trabalho tem por objetivo a caracterização dos microcromossomos B de
Moenkhausia sanctaefilomenae através do uso de técnicas de citogenética molecular, como microdissecção cromossômica
e prospecção de DNA satélite. Os exemplares coletados no ribeirão Araquá, região de Botucatu,SP, apresentaram
um número diplóide de 2n=50 cromossomos e número fundamental NF=100. Todos os indivíduos analisados
mostraram microcromossomos B, os quais foram variáveis inter e intra-individualmente com freqüência de zero até
06 (seis) microcromossos. Utilizando metodologias citogenéticas convencionais de análises, tais como bandamentos
cromossômicos e localização dos cístrons de DNA ribossômico 18S e 5S, foram observadas algumas peculiaridades dos
microcromossomos B nesta espécie. A presença de sítios de rDNA 18S, heterocromatinização parcial ou total e coloração
diferencial após a utilização de DAPI/CMA3 são algumas peculiaridades dos cromossomos B de M. sanctaefilomenae.
Considerando as diferenças observadas entre os cromossomos B de M. sanctaefilomanae o isolamento de seqüências
repetitivas (DNA satélite), através do uso de enzimas de restrição, tem sido utilizado. Foram testadas 19 enzimas de
restrição (AluI, Bsh1236, Csp6I, HhaI, RsaI, HaeIII, MspI, ApaI, HinfI, HindIII, KpnI, PvuII, PstI, SacI, NruI, XmnI,
EcoRV, BamHI e EcoRI) e somente a enzima Hinf I, mostrou padrão de DNA repetitivo, evidenciando bandas de
200pb, 400pb e 600pb. Os resultados obtidos com a enzima Hinf I corroboram a hipótese de que os cromossomos B
encontrados em M. sanctaefilomenae são estruturalmente diferentes entre si. O DNA utilizado para a clivagem com a
Hinf I foi obtido de 4 exemplares (3 machos e 1 fêmea) e em somente um dos exemplares macho foi possível detectar
as bandas descritas acima. Portanto, a somatória dos dados obtidos de técnicas citogenéticas e moleculares permitirão
analisar o quanto de homologia existe entre os cromossomos B de M. sanctaefilomenae e ainda uma possível homologia
com regiões dos cromossomos do complemeto A. Assim, inferências sobre a evolução, origem e segregação desses
cromossomos poderão ser elaboradas.
Apoio: FAPESP.
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Identificação do estoque de curimatá da
bacia do rio Itapecuru/MA a partir de
marcadores moleculares
Silva, MML; Barros, MC; Fraga, E
Laboratório de Genética e Biologia Molecular - CESC/UEMA
[email protected] e [email protected]
Palavras-chave: Prochilodus, DNA mitocondrial, PCR
Os prochilodontídeos encontram-se largamente distribuídos na América do Sul e sua ocorrência tem sido registrada em
todas as bacias hidrográficas constituindo-se em um dos mais importantes recursos da pesca comercial e de subsistência
em ambientes de água doce. O gênero Prochilodus inclui cerca de 13 espécies válidas comumente conhecidas como
curimatá ou curimbatá. São peixes detritívoros com grande capacidade de migração e de fundamental importância
ecológica. A espécie Prochilodus nigricans encontra-se distribuída em toda bacia Amazônica e na região Nordeste a
espécie Prochilodus lacustris ocorre com freqüência nas bacias do rio Mearim/MA e Parnaíba/PI. O presente estudo teve
como objetivo a identificação específica do estoque de Prochilodus sp. de ocorrência na bacia do rio Itapecuru/MA, que
apresentam-se morfologicamente similar a Prochilodus lacustris, por meio de seqüências de DNA mitocondrial do gene
rRNA 16S, considerando que a identificação correta das espécies é o primeiro passo para o sucesso de programas de
manejo e conservação dos recursos pesqueiros. A amostragem foi constituída de espécimes obtidos no baixo, médio e
alto curso da bacia do rio Itapecuru e após a identificação, utilizando-se chaves específicas, foi realizada a extração de
DNA a partir do tecido muscular, utilizando-se o protocolo de fenol-clorofórmio. O isolamento e amplificação da região
genômica, a partir de DNA total foi realizada através da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) usando-se
primers específicos. As seqüências geradas foram editadas e alinhadas no programa Bioedit e os cladogramas gerados
no programa MEGA4. Uma seqüência retirada de Prochilodus nigricans (AY788075) do GenBank foi incorporada na
análise para verificar a similaridade genética com as seqüências dos espécimes da bacia do rio Itapecuru. Um fragmento
de 510 pares de bases do gene rRNA 16S foi obtido em dezesseis espécimes com a seguinte composição nucleotídica:
21% de timina, 23,6% de citosina, 31,5% de adenina e 23,8% de guanina. Um único haplótipo foi observado para
a bacia do rio Itapecuru agrupando fortemente com a seqüência do GenBamk com 0% de divergência genética,
mostrando-se assim que a espécie que ocorre na da bacia do rio Itapecuru é Prochilodus nigricans. Portanto, os resultados
da presente análise, contribuem para o conhecimento do status específico do estoque de Prochilodus desta importante
bacia hidrográfica do Estado do Maranhão.
Apoio Financeiro: BNB/UEMA/FAPEMA e UFPA.
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Utilizaçao de marcadores cromossômicos e
moleculares para identificaçao do sexo em
Salminus brasiliensis (Characiformes)
De Rosa, LV1; Wasko, AP2; Oliveira, C1; Cruz,VP1; Santos, NM1; Portela, PM4; Senhorini, JA3; Foresti, F1
Departamento de Morfologia-UNESP, Instituto de Biociências de Botucatu/SP
2
Departamento de Genética-UNESP, Instituto de Biociências de Botucatu/SP
3
CEPTA-IBAMA, Pirassununga, SP
4
Facultad de Veterinaria, Departamento de Genetica, Campus Lugo, Espanha
[email protected]
1
Palavras-chave: Salminus brasiliensis, AFLP, citogenética, marcadores sexuais, peixe
A espécie Salminus brasiliensis, conhecida como dourado, representa um dos principais peixes de pesca de subsistência,
pesca esportiva e piscicultura no Brasil devido ao sabor de sua carne, ao grande porte e à beleza de seu tegumento de cor
amarelo-dourada. É caracterizada com um predador voraz, nada em cardume e realiza longas migrações reprodutivas.
Apesar de sua importância econômica e esportista, os estudos genéticos nesta espécie ainda são extremamente escassos e
se restringem a poucos dados citogenéticos. Neste trabalho aborda-se a caracterização citogenética e o desenvolvimento
de marcadores moleculares (AFLP) para a identificação molecular do sexo e, de forma mais geral, para o estudo da
organização genômica da espécie. Todos os indivíduos analisados foram capturados do Rio Mogi-Guaçu, SP e mantidos
nas intalações do CEPTA-IBAMA, em Pirassununga, SP. Os resultados evidenciaram um cariótipo composto por 50
cromossomos dos tipos metacêntrico (7 pares), submetacêntrico (15 pares) e subtelocêntrico (3 pares). As análises
cromossômicas com coloração Giemsa não evidenciaram quaisquer elementos diferenciais entre os cariótipos de
machos e fêmeas. A aplicação da técnica de bandamento C revelou grandes blocos centroméricos e pericentroméricos
de heterocromatina constitutiva, distribuídos em diversos cromossomos do complemento cariotípico de ambos os
sexos. Um bloco adicional de heterocromatina foi identificado no braço longo do cromossomo do par 2 em machos e
não evidenciado nos cariótipos das fêmeas. Para a aplicação da técnica de AFLP foram utilizadas amostras obtidas de
3 “pools” de machos e 3 “pools” de fêmeas, constituídos por 4 indivíduos cada um, totalizando 121 combinações de
primers. Em uma análise preliminar detectou-se uma banda com aproximadamente 158 pb nos “pools” de machos,
ausentes nos “pools” das fêmeas, utilizando a combinação do primer Eco RI (final ACC) e do primer Taq I (final AAT).
A presença desta banda associada ao sexo foi confirmada mediante amplificação individual das amostras nos conjuntos
de indivíduos. Atualmente esta banda está sendo clonada e sequenciada para sua transformação em SCAR (desenho
de regiões amplificadas de sequência caracterizada). Tal procedimento poderá gerar informações que resultem num
avanço do conhecimento sobre a base genética da determinação do sexo nesta espécie e servirá eventualmente para o
desenvolvimento de uma técnica simples para a identificação molecular do sexo dos indivíduos. Dados complementares
incluem novas aplicações da técnica de AFLP em S. brasiliensis para comprovar a presença desta banda nos indivíduos.
Considera-se que os dados obtidos contribuem à caracterização citogenética e genética de S. brasiliensis e podem ser
utilizados para a compreensão da origem e evolução dos mecanismos de diferenciação sexual.
Financiamento: Fapesp.
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Análise citogenética de Serrasalmus
manuelli na microbacia do Araguaia-Bananal
Sampaio, WMS1; Giongo, P1; Fernandes, A1; Lima, MRL1; Lima, CB2; Dergam, JA2
Universidade do Estado de Mato Grosso/Departamento de Ciências Biológicas
Universidade Federal de Viçosa/Departamento de Biologia Geral
[email protected]
Palavras-chave: Citogenética, Araguaia-Bananal, Peixes Neotropicais, Serrasalminae, Serrasalmus manuelli
O rio Araguaia faz parte da bacia hidrográfica do Araguaia-Tocantins que é considerada como um dos sistemas fluviais
de grande importância da América do Sul por sua complexa formação geomorfológica que tem uma intrínseca relação
com o fato de sua área de drenagem incluir importantes regiões fitogeográficas como o Cerrado e Floresta Amazônica.
Além de ecótonos, áreas de transição entre esses grandes biomas brasileiros, concentrando dessa forma uma importante
biodiversidade. A Bacia do Araguaia-Tocantins está ligada ao sistema de rios Amazônicos pela região da foz do Amazonas
esta condição garante que maioria das suas espécies presentes nos rios amazônicos ocorra na Bacia do TocantinsAraguaia. No Brasil, pouco tem sido feito no sentido de melhor utilizar os dados disponíveis sobre a variabilidade
genética de populações naturais de peixes, especialmente em relação à citogenética e sua relação com o ambiente. Nesse
contexto o presente trabalho objetivou estudar citogeneticamente a espécie Serrasalmus manuelli na região microbacia
do Araguaia–Bananal. Para realização do estudo os espécimes foram coletados na região de confluência do rio Campo
Alegre com rio Araguaia e conduzidos ao laboratório, onde foram submetidos ás técnicas de obtenção de cromossomos
mitóticos metafásicos segundo Bertollo et al. (1978). A técnica de Banda NOR foi realizada segundo Howell &
Black (1980). A classificação cromossômica foi realizada segundo Levan et al. (1964). Os resultados encontrados
possibilitaram a determinação do número cromossômico de 2n=58, fórmula cariotípica 8m+24sm+16st+10a e número
fundamental igual a 106. Para a técnica com impregnação com Nitrato de prata registrou padrão de NOR múltiplo.
Os resultados encontrados para número cromossômico e para impregnação com nitrato de prata estão dentro da
variação esperada para a família Serrasalminae e de acordo com outras espécies do gênero. Porém diverge de resultados
encontrados para a espécie S. manuelli na Bacia Amazônica, onde foi registrado 2n= 60 e número Fundamental (NF)
de 112 com concentração de cromossomos metacêntricos e submetacêntricos. A variação encontrada para o número
cromossômico pode ser conseqüência de rearranjos cromossômicos do tipo fissão/fusão. Quanto à variação na fórmula
cariotípica e conseqüentemente do número fundamental podem ser resultados de rearranjos cromossômicos do tipo
inversão pericêntrica, pois registrou-se uma diferença do número de cromossomos submetacêntrico e subtelocêntrico
quando comparado com resultados obtidos por outros autores. Dentro das possíveis explicações não se pode descartar
a importância da área que é uma região de confluência entre rios, que pode funcionar como uma zona de hibridação,
contribuíndo para o aparecimento dessa diferença na estrutura cariotípica. Estudos para outras espécies do gênero
Serrasalmus e da família Serrasalminae na microbacia do Araguaia-Bananal sugerem que essa região seja um ponto
estratégico para se entender o processo de diversificação dos peixes neotropicais.
Apoio Financeiro: UNEMAT, FAPEMAT e UFV.
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Amplificação cruzada de iniciadores para
regiões microssatélites em Serrasalmus
elongatus (Characidae: Serrasalminae)
Castro, TG1,2; Resende, LV2; Telles, MPC2, Silva, NJ2,3; Costa, MC3
1
Mestranda em Genética, Universidade Católica de Goiás
Laboratório de Genética e Biodiversidade, Universidade Católica de Goiás
3
Systema Naturae Consultoria Ambiental Ltda
[email protected]
2
Palavras-chave: Transferibilidade, microssatélites, Serrasalmus elongatus, peixe, variabilidade genética
Os recursos genéticos de animais aquáticos são pouco conhecidos no Brasil e, ao mesmo tempo, encontram-se cada
vez mais ameaçados por drásticas alterações ambientais antropogênicas. Adicionalmente, a caracterização genética de
espécies aquáticas é fundamental para revelar a história filogenética das populações, visto que a variação genética é
essencial para sobrevivência e adaptação a possíveis mudanças do ambiente, sendo também a base para o desenvolvimento
de programas de conservação. Os marcadores microssatélites têm sido amplamente utilizados em estudos que visam
à determinação da variabilidade genética e compreensão da dinâmica e estrutura populacional de diversas espécies.
No entanto, como o desenvolvimento destes marcadores é um processo caro e oneroso, uma alternativa é a tentativa
de amplificação cruzada de iniciadores desenhados para outras espécies filogeneticamente próximas. O objetivo deste
trabalho foi padronizar reações de amplificação de regiões microssatélites em Serrasalmus elongatus (piranha-comprida),
a partir de testes com iniciadores desenvolvidos para outras espécies da ictiofauna. Para a padronização das reações de
amplificação cruzada, via reação em cadeia da polimerase (PCR), foram utilizados três indivíduos de Serrasalmus elongatus.
O DNA foi extraído da musculatura e/ou escamas com o kit Illustra Tissue & Cells Genomic Prep (GE Healthcare) e
quantificados por eletroforese. A temperatura de anelamento inicial para todos os 77 locos testados foi igual a 54ºC,
seguidas de ajustes abaixo e acima, quando necessários, a fim de padronizar as condições e permitir a visualização dos
alelos dos locos transferidos. Os fragmentos foram separados por eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida
6%. Os resultados preliminares levaram ao descarte de 22 locos que não apresentaram produtos de amplificações. Após
os ajustes necessários 13 locos foram considerados transferidos com sucesso. A seguir serão descritos a temperatura
de anelamento padronizada e o tamanho do(s) respectivo(s) alelo(s): Par03 (60ºC e 250pb), Par34 (56ºC e 260pb),
Par35 (60ºC e 215pb), Par54 (62ºC e 196pb), Pcos18 (56ºC e 162), Hg_E04 (52ºC e 236/238pb), Hg_E23 (56ºC e
>330pb), Pre15 (58ºC e 210pb), AG04 (50ºC e >330pb), Pme04 (50ºC e >330pb), Pme05 (45ºC e 238pb), Pme14
(54ºC e >330pb) e Pme20 (60ºC e 205pb). A disponibilização desses locos transferidos e padronizados permitiram a
realização de diferentes estudos genético-populacionais com a espécie Serrasalmus elongatus, na busca por polimorfismos
informativos que auxiliem a compreensão tanto dos processos microevolutivos, quanto a definição de estratégias de
conservação, manejo de estoques e melhoramento genético da espécie.
Apoio Financeiro: Systema Naturae Consultoria Ambiental Ltda, PROPE/UCG.
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Análise da herdabilidade de alelos
de microssatélite em Curimbatá,
Prochilodus lineatus (Teleostei,
Characiformes, Prochilodontidae)
Henriques, JM1; Sirol, RN2; Foresti, F1; Oliveira, C1
Departamento de Morfologia, Universidade Estadual Paulista – UNESP (Botucatu)
2
Duke Energy International, Geração Paranapanema S/A
[email protected]
1
Palavras-chave: microssatélite, herança mendeliana, curimbatá, Prochilodus lineatus, peixamento
A intensificação do uso de recursos aquáticos tem produzido um grande impacto sobre as comunidades de peixes.
Dentre as ações antrópicas mais impactantes destacam-se a construção de barragens, a sobrepesca, o mau uso do solo na
agricultura, o descarte de esgoto sem tratamento prévio, a construção de hidrovias e a introdução de espécies exóticas.
Diante do decréscimo dos desembarques pesqueiros, um aumento na conscientização geral sobre a necessidade de
conservação da diversidade biológica tem surgido na última década de forma que o futuro das populações selvagens
depende grandemente da variação genética das populações naturais e o estudo dessa variação é assim fundamental para
o desenvolvimento de projetos de manejo sustentável. O objetivo do presente trabalho é analisar a distribuição de alelos
de microssatélites de seis loci em casais de curimbatás (Prochilodus lineatus) e sua respectiva progênie. Foram analisadas
famílias compostas de um macho, uma fêmea e 35 exemplares da geração F1. O DNA genômico foi extraído com a
resina Chelex 100 (5%) a partir de amostras de tecido preservadas em etanol 95%. Um microlitro de sobrenadante foi
utilizado em cada reação em cadeia da polimerase (PCR). Os primers utilizados foram: Plin36, Plin44, Plin52, P119,
P190 e P202. Os produtos de PCR foram resolvidos em um gel de poliacrilamida a 6% e corados com nitrato de prata.
Os alelos foram identificados visualmente com referência a um ladder de 10 pares de bases utilizando o programa
computacional Kodak Molecular Imaging Software. Indivíduos com genótipos diferentes do esperado por herança
Mendeliana foram observados em uma freqüência de 62,85% para o locus Plin36, de 25,25 % para o locus Plin44, de
10,45% para o locus Plin52, de 62,85% para o locus P119, de 5,71% para o locus P190 e de 1,71% para o locus P202.
Embora pequenas freqüências de indivíduos portadores de genótipos não esperados, observadas em algumas análises,
possam ser explicadas pela ocorrência de mutações nos indivíduos da geração F1, as elevadas freqüências de indivíduos
portadores de genótipos não esperados, observadas em alguns experimentos, podem estar associadas à presença de alelos
nulos, descritos em diversos sistemas de microssatélites, tendo origem em mutações, tais como substituição, inserção
e deleção em uma ou em ambas as regiões de anelamento dos primers no DNA.
Apoio Financeiro: CNPq, Fapesp e Duke Energy International.
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Isolamento e caracterização de marcadores
moleculares de Prochilodus lineatus
e Salminus franciscanus para análise
genética de populações
Dias, F; Veloso, A; Barroca, TM; Racioppi, L; Kalapothakis, E
Laboratório de Biotecnologia e Marcadores Moleculares
Departamento de Biologia Geral – Genética
Instituto de Ciências Biológicas
Universidade Federal de Minas Gerais
[email protected]
Palavras-chave: Prochilodus lineatus, Salminus franciscanus, Marcadores Moleculares, Microssatélite, Genética de Populações
Estudos genéticos sobre peixes podem auxiliar importantes decisões de manejo, principalmente em áreas modificadas ou
de forte influência humana, como por exemplo, as represas. No estado de Minas Gerais uma área que merece atenção
engloba os Rios São Francisco, Paraopeba e Rio das Velhas. No presente trabalho descrevemos a busca por marcadores
de DNA para as espécies Prochilodus lineatus (Curimba) e Salminus brasiliensis (Dourado). A escolha das espécies foi
baseada na sua importância econômica, social e ambiental. Utilizando bibliotecas genômicas feitas com o DNA de cada
espécie e buscas realizadas com oligonucleotídeos marcados, analisamos por meio de sequenciamento de DNA dezenas
de clones positivos para o sinal radioativo que possivelmente indicava uma região de microssatélite. Aproximadamente
34% dos clones positivos apresentaram regiões de microssatélites com potencial de uso para estudos de genética
populacional; sendo 36% de P. lineatus e 64% de S. brasiliensis. No presente trabalho desenhamos 23 iniciadores para
regiões de microssatélites em P. lineatus e 6 para S. brasiliensis. A seqüência de DNA dos clones isolados foram também
analisadas em bancos de dados de DNA e proteína e os resultados enriquecem o conhecimento “genômico” das duas
espécies de peixes utilizadas. Os marcadores desenhados para P. lineatus foram testados e a análise foi realizada por
seqüenciamento da região. Verificamos que os iniciadores amplificam uma região de microssatélite variável na população
e que será somado aos marcadores já existentes no nosso grupo para análise populacional de P. costatus. O nosso grupo
possui e utiliza para análise populacional o total 35 microssatélites de Curimba e 21 de Dourado, sendo que a grande
maioria revelou alta variabilidade.
Apoio Financeiro: PRONEX, FAPEMIG, CNPq, CAPES, CEMIG.
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Análise da variabilidade genética da curimatã
Prochilodus nigricans (Agassiz, 1829) na
calha do rio Amazonas e tributários
Machado, VN1; Vasconcelos, W1; Saturnino, A 2; Farias, IP1
Universidade Federal do Amazonas, Laboratório de Evolução e Genética Animal
2
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
[email protected]
1
A espécie Prochilodus nigricans é uma espécie de peixe migradora encontrada no rio Amazonas e seus principais tributários
incluindo o rio Tocantins, em altitudes de até 700m na Amazônia brasileira, peruana, colombiana e boliviana. O habitat
principal da espécie é o rio Amazonas, seus tributários de água branca e suas várzeas. É um dos peixes mais populares e
de maior importância econômica em vários mercados pesqueiros da região amazônica, chegando a dominar a produção
em determinadas épocas do ano, quando os cardumes estão migrando. Para realização desse estudo foram coletadas
amostras de nadadeira de 178 indivíduos distribuídos em 06 localidades da calha do rio Amazonas: Tabatinga (n=10),
Lago Acará (Baixo Japurá, n=29), Ilha Juçara (n=14), Ilha Capivara (n=16), Lago Janauacá (Médio Amazonas, n=18) e
Santarém (n=25); uma localidade no médio Tapajós: Arapiara (n=12) e três localidades no rio Madeira: Borba (Baixo
Madeira, n=11), Humaitá (Médio Madeira, n=10) e Alto Madeira (P. Velho (n=09), rio Guaporé (n=10), e GuajaráMirim, (n=14)). Todas as amostras tiveram o DNA total extraído seguindo o protocolo de extração por CTAB. Em
seguida foram realizadas as amplificações via PCR, utilizando primers para região controle do DNA mitocondrial. As
seqüências obtidas foram editadas no programa BioEdit e alinhadas no programa Clustal W. As análises de genética de
populações foram realizadas no programa ARLEQUIN. A diversidade gênica encontrada variou de 0,5758+/-0,1634
na localidade de Arapiara, a 0,9890+/-0,0314 em Guajará-Mirim. AMOVA mostrou que a maior parte da variabilidade
genética se encontra distribuída dentro das populações com 68,87% e 31.13% entre populações evidenciando
estrutura genética (FST 0.31125, P< 0,000). Nas análises par a par os valores de FST mostraram que as localidades de
Arapiara (médio rio Tapajós), Guaporé e Guajará-Mirim (alto rio Madeira) encontram-se geneticamente estruturadas
em comparação as outras localidades. Esses resultados indicam que as populações de Prochilodus nigricans do médio
Tapajós e do alto rio Madeira possuem um fluxo gênico restrito em relação às populações da calha do rio Amazonas.
Essas localidades apresentam em seu curso corredeiras que provavelmente estão funcionando como barreiras ao fluxo
gênico. Os indivíduos de curimatã das outras localidades amostradas da calha do rio Amazonas, localidades abaixo das
cachoeiras do rio Madeira e rio Japurá, apresentaram elevado número de migrantes por geração e ausência de estruturação
genética. Tais resultados sugerem que mesmo se tratando de uma espécie migradora os indivíduos de curimatã podem
apresentar limitações para transpor corredeiras presentes em alguns tributários do rio Amazonas. Considerando que
os indivíduos destas localidades apresentam-se geneticamente estruturados os mesmos devem ser considerados como
unidades diferentes durante as tomadas de decisões sobre o manejo desta espécie.
Apoio/Financiamento: CT-Amazônia/CNPq.
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Amplificação cruzada e caracterização
de locos microssatélites em Prochilodus
nigricans do Rio Caiapó
Batista, EC1; Resende, LV1,2; Telles, MPC1; Gouveia, FO1; Silva-Júnior, NJ2; Costa, MC2; Lima, JS1; Castro, TG1
Laboratório de Genética & Biodiversidade, Universidade Católica de Goiás
2
Systema Naturae – Consultoria Ambiental LTDA
[email protected]
1
Palavras-chave: ictiofauna, microssatélites, peixe, transferibilidade
O Prochilodus nigricans ou curimatã é um peixe de escamas, de coloração prateada, tamanho médio, boca protrátil, em
forma de ventosa, com numerosos dentes. É uma espécie detritívora, que se alimenta de matéria orgânica e microorganismos
associados à lama do fundo de lagos e margens de rios, realizando longas migrações para reprodução. Os marcadores
de regiões microssatélites têm sido freqüentemente escolhidos para quantificar a variabilidade genética em populações
naturais devido ao seu alto índice informativo e pela facilidade com que o polimorfismo pode ser detectado. Diversos
estudos têm mostrado sucesso na possibilidade de transferir marcadores desenvolvidos para outras espécies. O objetivo
deste trabalho foi testar a amplificação cruzada, em amostras de Prochilodus nigricans (Pnig), de 46 locos microssatélites
desenvolvidos para as seguintes espécies: Prochilodus argenteus (Par), Prochilodus costatus (Pcos), Prochilodus lineatus
(Pl), Leporinus macrocephalus (Lmac), Astyanax fasciatus (Ast) e Poecilia reticulata (Pre, AG e AC), provenientes do
Rio Caiapó. Para testar a amplificação cruzada foram montadas reações de PCR utilizando três indivíduos, com uma
amplitude de variação na temperatura de anelamento dos primers entre 45 a 68ºC. Os produtos da amplificação
foram separados em gel de poliacrilamida 6% e visualizados por coloração com nitrato de prata. Os locos transferidos
foram utilizados para uma análise com 24 indivíduos. Do total de locos avaliados, 23 foram transferidos com sucesso,
apresentando regiões com a aparência de um loco. Entretanto, quando os locos foram avaliados na população apenas
15 apresentaram um bom padrão de amplificação: Par10 (54°C), Par12, Par14, Par15, Par31, Par35, Par43, Pcos18
(56°C), Par21, Par26, Pcos03 (60°C), Par54 (61°C), Pcos20 (64°C), Par04 (66°C), Par05 (68°C). A maioria dos locos
apresentaram alto polimorfismo, com um total de 128 alelos, gerando uma média de 8,5 alelos por locos, variando
entre 1 (Par05) e 20 (Par54). Considerando os 15 locos analisados a heterozigosidade observada (Ho) apresentou-se
com uma média igual a 0,47, variando entre 0,0 a 0,82 e a heterozigosidade esperada (He) mostrou valores médios igual
a 0,65, variando entre 0,0 a 0,94. A freqüência de alelos nulos apresentou valores próximos a zero, a probabilidade de
exclusão de paternidade (PE), variou entre 0,0 e 0,84, com PE combinada de 0,9999. A PI variou entre 1,0 e 0,24,
com PI combinada de 0,00000023. A partir desses resultados, foi possível confirmar que existe uma grande potencial
de transferibilidade de marcadores microssatélites entre as espécies mais próximas do ponto de vista evolutivo. Esses
locos podem ser úteis para outros pesquisadores que trabalham com estas espécies, pois diminuem os custos, agilizando
o processo de obtenção de dados moleculares para o estudo das populações naturais.
Apoio financeiro: Systema Naturae Consultoria Ambiental Ltda, PROPE/UCG.
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Isolamento e caracterização de
microssatélites na Tabarana, Salminus
hilarii (Characiformes: Characidae)
da Silva, JV1; Hilsdorf, AWS1
Núcleo Integrado de Biotecnologia, Laboratório de Genética de Peixes e Aqüicultura, Universidade de Mogi das Cruzes
[email protected]
1
Palavras-chave: Salminus hilarii, microssatélites, conservação
A espécie Salminus hilarii conhecida popularmente como tabarana é um peixe de clima tropical que habita principalmente,
os rios das Bacias do alto Paraná bem como a Bacia do Rio São Francisco. Por ser uma espécie de piracema, o
comportamento migratório reprodutivo da tabarana é fortemente afetado pela construção de barragens, que além de
alterações no regime hídrico e bloqueio de rotas migratória destes peixes, podem levar ao isolamento de populações
nativas e consequentemente gerarem efeitos como perda de variabilidade genética e depressão endogâmica. Apesar de
sua importância ecológica no ecossistema, não há estudos genéticos desta espécie. Os marcadores moleculares do tipo
microssatélite vêm sendo amplamente utilizados em análise populacional de várias espécies, pois apresentam alto grau
de polimorfismo, sendo que os loci são geralmente caracterizados por uma alta heterozigosidade. O presente trabalho
objetivou isolar e caracterizar loci de microssatélites de Salminus hillari. Para isto, o DNA genômico extraído de um
indivíduo de S. hilarii foi digerido com RsaI e os fragmentos gerados foram ligados a adaptadores específicos. Fragmentos
contendo repetições AC e AG foram selecionados por meio da hibridização com oligonucleotídeos marcados com biotina
e ligados a esferas magnéticas recobertas com estreptavidina. Os fragmentos selecionados foram amplificados e clonados
em vetor pGEM-T easy. Os clones recombinantes foram submetidos à minipreparação de DNA por lise alcalina. A
partir da biblioteca enriquecida, 30 insertos clonados foram seqüenciados e destes 18 possuíam microssatélites. Sete
loci foram inicialmente selecionadas para o desenvolvimento de primers complementares às regiões flanqueadoras dos
microssatélites. Análises preliminares de 3 loci mostram que dois são polimórficos. Novos loci serão testados, com o
objetivo de desenvolver cerca de 10 marcadores microssatélites polimórficos. Os loci microssatélites gerados serão úteis
para futuros estudos genéticos populacionais da tabarana cuja ocorrência de populações selvagens no Alto Paraná e
Alto São Francisco ainda não foram geneticamente avaliadas.
Apoio financeiro: FAEP, FAPESP.
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Primers para marcadores microssatélites de
tambaqui Colossoma macropomum Cuvier,
1816 (Characidae: Serrasalminae)
Santana, GX1; Campos, T2; Santos, CHA1; Lima, MP1; Sousa, CFS1,3; Nozawa, MFS3; Almeida-Val, VMF1
Laboratório de Ecofisiologia e Evolução Molecular, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
2
Departamento de Genética e Evolução, Universidade Estadual de Campinas
3
Laboratório de Expressão Gênica, Centro Universitário Nilton Lins
[email protected]
1
Palavras-chave: marcadores moleculares, tambaqui
O tambaqui vem se destacando atualmente, como uma das espécies de peixe amazônico mais exploradas comercialmente.
Hoje, em projetos de piscicultura no Brasil, ele ocupa o terceiro lugar em peixes cultivados, ficando atrás somente da
Carpa e Tilápia respectivamente. Dessa forma, o conhecimento da variabilidade genética das populações de tambaqui
em cativeiro permite uma melhor descrição da estrutura genética da espécie. Os microssatélites são sequências repetidas,
contendo de um a seis motivos de repetição, estando distribuídos por todo o genoma de procariotos e eucariotos. Esses
marcadores são bastante sensíveis para estudos de variabilidade genética. No presente trabalho, objetivou-se desenhar
pares de primers de locos de marcadores microssatélites, para a espécie de peixe neotropical Colossoma macropomum,
a partir de indivíduos da natureza, os quais venham a ser utilizados em futuros estudos genéticos populacionais, tanto
em populações naturais como em animais de piscicultura. O DNA foi extraído a partir de fragmentos de músculo em
peixes de populações naturais e sumetido a processamento, conforme protocolo de extração. Em seguida, uma blibioteca
genômica foi construída para obtenção de sequências contendos os locos de microssatélites, a identificaçao dos locos foi
realizada após sequenciamento e os primers desenhados com auxílio do software Oligo Explorer. Ao final, 17 pares de
primers específicos foram obtidos para os locos contendo os microssatélites com mais de 10 motivos repetidos. Sendo
assim, espera-se que estes primers possam contribuir para o desenvolvimento de estudos futuros sobre a varibilidade
genética de tambaqui com esse marcador molecular e permita seu possível uso também em espécies relacionadas ao
taxon.
Apoio Financeiro: PIATAM, PRONEX, CAPES, FAPEAM/CNPq, FINEP/Petrobrás.
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Marcadores microssatélites para tambaqui
(Colossoma macropomum), peixe de
importância econômica e ambiental para
região amazônica
Santos, MCF; Farias, IP & Hrbek, T
Instituto de Ciências Biológicas, Univ. Federal do Amazonas, Manaus-Amazonas, Brasil
[email protected]
Palavras-chave: Colossoma macropomum, microssatélites
O frugívoro tambaqui (Colossoma macropomum) tem papel fundamental nas áreas de várzeas, na Amazônia, por ser
um dos principais dispersores de sementes. É considerado um peixe semi-migratório e compreende uma única e
grande população na calha principal da bacia Amazônica. O monitoramento do desembarque pesqueiro ao longo de
30 anos indicam uma sobre-exploração nos estoques naturais. A importância de C. macropomum para o ecossistema
amazônico e economia regional trazem a necessidade de desenvolvimento de marcadores moleculares eficientes que
podem ser usados para gerar dados que responderão às questões ecológicas e ajudarão na administração sustentável e
conservação da espécie. Além disso, estes marcadores moleculares podem ser usados satisfatoriamente em estudos de
seleção assistida no processo de domesticação e estabelecimento de características favoráveis para piscicultura. Com
estes propósitos, foram desenvolvidos 14 locos de microssatélites altamente polimórficos. O DNA genômico total foi
extraído através da metodologia de Sambrook et al. (1989), com adaptações. Para o desenvolvimento dos microssatélites
foi utilizada a técnica descrita por Farias et al., (2003), onde o DNA genômico foi digerido com a enzima de restrição
SAU3A1. Fragmentos de 300pb a 1000pb foram selecionados, ligados a oligonucleotídeos adaptadores e hibridizados
com a sonda CT10 ligada ao complexo biotina-estreptavidina. Os produtos da hibridização foram ligados a plasmídios
pJET (Fermentas, Hanover, ME) e inseridos em células de Escherichia coli quimicamente competentes (Promega,
Maddison, WI). Foram escolhidas colônias individuais, e recultivadas por 16 h em solução 1 x LB/Amp (100 ug/mL).
Amplificação foi realizada diretamente das culturas de bactérias usando primer de amplificação pJET. A purificação do
produto de PCR foi feita com ExoSap (Invitrogen, Carlsbad, a CA), e sequenciados com primers de sequênciamento
pJET, seguindo protocolo de sequenciamento BigDye, no ABI 3730xl (Amersham, Foster City, CA). Um total de 27
clones foram selecionados para o desenho dos primers e depois de otimizados, 14 foram funcionais e todos mostraramse polimórficos, com um número de alelos por loco variando de 4 a 21. Os pares de locos não estão em desequilíbrio
de ligação, com exceção dos pares de locos Cm1F5 com Cm1A8, P significativo (<0,016). O loco Cm1F5 apresentou
excesso de homozigotos e a possível ocorrência de alelos nulos. O teste de transferibilidade foi realizado para piranha
(Pygocentrus nattereri), pacu (Mylossoma aureum) e pirapitinga (Piaractus brachypomus). Os locos de microssatélites
desenvolvidos para o tambaqui, mostraram-se marcadores potencialmente informativos para estas espécies.
Apoio financeiro: FAPEAM, CNPq.
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Amplificação heteróloga e padronização de
marcadores microssatélites em Colossoma
macropomum (tambaqui)
Lima, JS; Resende, LV; Telles, MPC; Gondim, SGCA; Sanches, AC; Vasconcellos, BF; Pádua, DMC
Laboratório de Genética & Biodiversidade, Universidade Católica de Goiás
[email protected]
Palavras-chave: Amplificação cruzada, microssatélites, peixe, tambaqui, variabilidade genética
A espécie Colossoma macropomum é amplamente distribuída na América do Sul e uma das maiores da família Characidae.
O tambaqui encontra-se sob risco de superexploração devido ao seu alto valor comercial e já se observa perda da
variabilidade genética em algumas pisciculturas. Estudos realizados mostram que populações naturais de tambaqui
apresentam maior variabilidade genética que as artificiais, o que representa ausência de acompanhamento genético na
criação dessa espécie, podendo levar à endogamia excessiva, perda de adaptabilidade e queda do número de animais a
cada geração, o que se traduz diretamente em contratempo na piscicultura. Assim, qualquer informação adicional que
possa representar facilidade e melhoria na sua produção e melhoramento genético é fundamental para o sucesso da
atividade. Atualmente os métodos de detecção, baseados em dados moleculares, vêm sendo utilizados e considerados
como vantajosos sobre os métodos antigos devido ao maior número de caracteres estudados. Os microssatélites ou
SSR (Simple Sequence Repeats) são marcadores moleculares baseados em reação em cadeia da polimerase (PCR), cujos
iniciadores possuem seqüências conhecidas e específicas para cada espécie de interesse e altos níveis de polimorfismo,
o que comprova que se trata de uma ferramenta molecular bastante eficiente, com pelo menos o dobro de informação
obtida mais rapidamente do que outros marcadores. O presente trabalho tem como objetivo testar a amplificação
cruzada de 77 iniciadores (locos) para a espécie Colossoma macropomum, desenvolvidos originalmente para as espécies
Prochilodus argenteus (Par), Prochilodus lineatus (Pl), Prochilodus costatus (Pcos), Astyanax fasciatus (Ast), Leporinus
macrocephalus (Lmac), Poecilia reticulata (Pre), Piaractus mesopotamicus (Pme) e Hypostomus gymnorhynchus (Hg). Para
tanto, 45 indivíduos de tambaqui foram coletados. A extração do DNA foi feita a partir de tecido muscular, utilizando
um kit de purificação de DNA. Os produtos de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) foram separados em gel de
poliacrilamida 6% e visualizados por coloração com nitrato de prata. Para os primeiros testes de amplificação cruzada
foram realizados utilizando uma temperatura de anelamento igual a 54°C e, quando necessário, as temperaturas de
cada loco foram alteradas, buscando uma padronização da amplificação e permitindo a individualização dos alelos
de cada loco. Dos 77 locos testados 14 apresentaram resultados satisfatórios de amplificação cruzada que permitiu a
obtenção dos genótipos. A padronização aconteceu em diferentes temperaturas de anelamento, conforme descrito a
seguir: Par13 (52°C), Par10, Pme4 (56°C), Par03, Par31 (58°C), Pcos18, Ast1, Pcos14 (60°C), Par35 (62°C), Pme14,
Pme20 (63°C) e Par05, Pme21, Pme32 (65°C). Os alelos observados nos 14 locos variaram entre 118 e 370 pares
de bases. Estes resultados preliminares indicam que, ao término deste trabalho, haverá possibilidade de obtenção de
bons marcadores genéticos para auxiliarem nos estudos genético-populacionais desta espécie e consequentemente, nos
programas de conservação, manejo e melhoramento desse recurso pesqueiro.
Apoio financeiro: FINEP/MCT, Systema Naturae Consultoria Ambiental Ltda.
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CD pirata até na água? O que a piscicultura
tem a ver com isso?
Santos, P; Sampaio, D; Queiroz, C; Schneider, H; Sampaio, I
Instituto de Estudos Costeiros, Universidade Federal do Pará, Campus de Bragança
[email protected]
Palavras-chave: Híbridos de Tambaqui, Piscicultura, DNA mitocondrial, D-loop, Rio Quatipuru
O Rio Quatipuru está localizado no nordeste paraense, com sua nascente situada nas cercanias dos municípios de
Bonito e Capanema. Em sua trajetória em direção ao Oceano Atlântico, este rio passa por pequenos vilarejos como
Vila Fátima, Mirasselvas e Curral Velho, concluindo seu curso a cerca de 60 km de sua nascente, na zona estuarina do
município de Quatipuru. Até 20 anos atrás a ictiofauna típica de água doce do Quatipuru era representada por lambaris,
acarás, jacundás, traíras e jandiás, dentre outros pequenos peixes, comumente usados para a subsistência de habitantes
dos pequenos vilarejos ao longo do rio. Mais recentemente, há cerca de 10 anos, surgiu um novo peixe no rio, que em
decorrência do formato discóide e achatado de seu corpo foi apelidado pela população local de “CD”. Curiosamente,
o Quatipuru não possui conexão com qualquer outra rio de água-doce da região, somente com o ambiente marinho do
Atlântico, o que exclui a possibilidade dos CDs do Quatipuru terem chegado até aí por migração de outras bacias. Resta
então a hipótese de que a piscicultura tenha sido a fonte geradora desta nova biodiversidade. Uma análise mais detalhada
da morfologia destes novos peixes mostrou grande similaridade com os dois híbridos de Tambaqui atualmente usados
em larga escala em pisciculturas por todo o estado do Pará: Tambacu (Tambaqui x Pacu) e Tambatinga (Tambaqui x
Pirapitinga). Para elucidar a origem dos exóticos CDs do Quatipuru, analisamos o DNA de 10 exemplares coletados em
Mirasselvas, vila situada às margens do Rio Quatipuru. Um fragmento de cerca de 300 pares de bases da região D-loop
mitocondrial foi isolado através de PCR e seqüenciado no ABI377. A análise através do Blast revelou que as seqüencias
de DNA geradas eram 100% similares às de Colossoma macropomum depositadas no Genbank. Nesta primeira etapa
revelamos parte da identidade dos CDs, a linhagem mitocondrial materna vinda de uma matriz de Tambaqui. Como
a morfologia dos peixes não é compatível com o fenótipo de um Tambaqui típico, tudo indica que estamos diante de
um dos dois híbridos acima mencionados. Para desvendar a origem paterna do genoma do CD, usaremos os iniciadores
de microssatélites desenvolvidos por Calcagnotto et al (2001) para Pacu (Piaractus mesopotamicus), e que funcionam
também para Pirapitinga (Piaractus brachipomus) e Tambaqui (Colossoma macropomum). Fatos como este podem estar
ocorrendo em outras áreas da bacia amazônica onde a piscicultura vem sendo incentivada, e merecem uma abordagem
cuidadosa já que a presença de uma espécie exótica pode vir a ser é um problema para a cadeia trófica local.
Apoio: CNPq/MCT (PPG7), FINEP.
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Genômica associada ao cultivo do tambaqui
(Colossoma macropomum): Obtenção
de 166 etiquetas de seqüências expressas
(ESTs) à partir de biblioteca de cDNA
de cérebro e hipófise
Bentes-Sousa, AR1; Astolfi-Filho, S2; Porto, JIR1,3
Laboratório Temático de Biologia Molecular (LTBM), Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
2
CAM, Laboratório de DNA Bloco G, Universidade Federal do Amazonas
3
Coordenação de Pesquisas em Biologia Aquática (CPBA) Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
[email protected]; [email protected]
1
Palavras-chave: Colossoma macropomum, ESTs, biblioteca cDNA, Genômica
O Tambaqui (Colossoma macropomum) é um peixe amazônico bastante explorado comercialmente, com grande aceite
no mercado nacional, sendo criado em cativeiro em grande escala. Atualmente vários estudos genéticos a respeito desta
espécie, têm sido avaliados, tanto de amostras selvagens quanto de pisciculturas, com o objetivo de caracterização e
conhecimento de sua estrutura genética populacional e de seus genes. No presente trabalho foi desenvolvida uma
biblioteca de cDNA de cérebro de tambaqui, afim de gerar etiquetas de seqüências expressas (EST), que auxiliem na
identificação e caracterização de genes de interesse biotecnológico. A construção da biblioteca foi feita a partir de cérebros
de tambaquis juvenis, utilizando Kits de Extração de RNA e de confecção da biblioteca de cDNA. A clonagem foi feita
com o vetor pCMV Sport6 e inseridas em E. coli. Aproximadamente 960 clones recombinantes foram seqüenciados
no seqüenciador automático MegaBace® 1000. O processo de anotação foi seqüencial e automatizado, englobando as
etapas: 1) Validação da entrada do sistema e 2) Identificação de regiões de baixa qualidade. A validação do arquivos
com os cromatogramas compactados no formato ESD (Megabace), foi feita através de um “pipeline” disponível no
site https://www.biomol.unb.br/FP/e https://www.bioinformatica.ufam.edu.br para análise conjunta do Phred e do
CAP 3. Os produtos seqüenciados foram analisadas através da bioinformática obtendo-se aproximadamente 300
“reads”. Deste total, foi possível caracterizar 166 ESTs (146 singletons e 20 contigs) com homologia a genes de peixes,
particularmente das ordens Cypriniformes, Siluriformes e Characiformes. As ESTs foram caracterizadas e agrupadas em
categorias funcionais de acordo com o COG (banco de proteínas), e várias seqüências foram agrupadas nas seguintes
categorias: [J] Tradução, estrutura e biogênese dos ribossomos; [A] Modificação e processamento do RNA[K]; Transcrição,
Metabolismo, outras com função desconhecida e Proteínas hipotéticas. Será dado continuidade ao sequenciamento
das ESTs e análises mais detalhadas serão efetuadas afim de classificar as proteínas e os genes e auxiliar no para futuro
potencial biotecnológico desta espécie. Adicionalmente, serão enviadados esforços para clonar e expressar o hormônio
de crescimento (GH) do tambaqui que foi encontrado dentre as ESTs sequenciadas.
Financiamento: CAPES, CNPq e INPA.
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Design and evaluation of degenerate
primers for trypsin gene of Colossoma
macropomum (Tambaqui)
Cunha, WL1; Alecrim, FM1; Batista, MVA1; Cardoso, MV1; Costa-Júnior, CRL1; Figueirêdo-Júnior, CAS1; Oliveira, APA1;
Tenório, KER1; Carvalho, EVMM2; Marcuschi, M2; Balbino, VQ1
1
Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco
Departamento de Bioquímica, Universidade Federal de Pernambuco
[email protected]
2
Key words: Colossoma macropomum, trypsin, degenerate primers, bioinformatics, CODEHOP
Tambaqui (Colossoma macropomum) is one of the most important products of the fish farm of the North and Northeast
regions of Brazil, mainly in the Amazon region, where it represents more than 40% of the volume of commercialized
fishes. For being a tropical teleostei, it presents alkaline proteases that possess interesting characteristics for commercial
applications, such as: thermal stability, long life of shelf and high enzymatic activity. Amongst these proteases, one of the
most important is the trypsin that already is used in some industrial processes, as in the formularization of detergents,
confection of foods, pharmaceutical products and in bioremediation. The most applied enzymes in the industry are those
originated from microorganisms. However, some enzymes with potential for industrial applications can be obtained
from the processing of aquatic organisms (e.g. crustaceans, fishes and clams). In function of the scarcity of studies in
genomic scale of C. macropomum and in view of the physical-chemistry characteristics of its trypsin (high catalytic activity,
stability in temperatures until 60ºC and broad spectrum of pH performance), this work aimed at the determination
of degenerate primers that would made possible the accomplishment of expression studies. Primers were drawn based
on the multiple alignment of trypsin sequences of six species of fish obtained in the data base of the National Center
for Biotechnology Information - NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), selected for presenting morphophysiological
characteristics similar to those of C. macropomum. Program MEGA v. 4.0 (http://www.megasoftware.net) was used in
the accomplishment of the multiple alignment, that served of entry for the program Consensus Degenerate Hybrid
Oligonucleotide Primers - CODEHOP (http://bioinformatics.weizmann.ac.il/blocks/codehop.html) and Codon Usage
(http://www.bioinformatics.org/sms2/codon_usage.html), utilized in the process of degeneration and refinement of
primers. After definition of the primers, it was used a consensus sequence generated with CAP3 program (http://genome.
cs.mtu.edu/cap/cap3.html) to determine the place of primers pairwising, foreseeing the obtainment of a fragment of
601 base pairs. The use of these primers will allow the full sequencing of the gene that codifies trypsin, supplying the
base for future innovations of industrial applications, in ambient decontamination processes and genetic analyses in
population of C. macropomum.
Supported by: CNPq, FACEPE.
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Genética da piscicultura no Pará: Tambaqui
nativo ou híbridos?
Cunha, F; Castro, L; Sombra, A; Santos, S; Schneider, H; Sampaio, D; Sampaio, I
Instituto de Estudos Costeiros, Laboratório de Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Pará (Campus de Bragança)
[email protected]
Palavras-chave: Tambaqui, Colossoma macropomum, Piscicultura, Tambacu, DNA mitocondrial
O Tambaqui (Colossoma macropomum) tem sido o peixe de escolha para cultivo em empreendimentos de piscicultura
no estado do Pará, mas a tendência atual tem sido o uso de híbridos com esta espécie, sendo os mais usados o Tambacu
(fêmea de Tambaqui x macho de Pacu) e a Tambatinga (fêmea de Tambaqui x macho de Pirapitinga). A espécie de Pacu
utilizada é Piaractus mosopotamicus, enquanto a de pirapitinga é Piaractus brachypomus. O presente estudo utilizou uma
abordagem molecular para identificar as linhagens mitocondriais maternas de peixes criados em cativeiro em vários
municípios do estado do Pará, comparando estas linhagens com espécimes nativos de Tambaqui de vários locais da
Amazônia. Novas sequências de DNA mitocondrial foram geradas para Tambaquis nativos de Santarém (Pará), sendo
também utilizadas sequências da literatura para várias populações naturais de Tambaqui ao longo da calha do Rio
Amazonas (Santos et al. 2007). Para os espécimes de cativeiro foram selecionados cultivos do oeste do Pará (Santarém)
e do nordeste do estado (São Domingos do Capim, Castanhal, Capitão Poço, Augusto Corrêa, Vizeu e Bragança). A
maioria das amostras de cativeiro foi identificada historicamente (informações do produtor) e com base na morfologia
como sendo híbridos, Tambatinga ou Tambacu. O DNA total de pelo menos cinco espécimes de cada cultivo foi extraído
via fenol-clorofórmio, e um fragmento de cerca de 300 pares de bases da região D-loop mitocondrial foi sequencido
no ABI377. Comparando as sequências de DNA com as do Genbank, constatamos uma similaridade de 99 a 100%
com as de Colossoma macropomum (Tambaqui), confirmando a origem materna dos cruzamentos para obtenção dos
híbridos Tambaqui e Tambacu. Com relação à origem geográfica das matrizes de Tambaqui usadas na alevinagem no
município de Santarém, encontramos um haplótipo de D-loop muito frequente, que é 100% similar ao do estoque
nativo de Parintins (Amazonas), mostrando que as populações naturais estão bem representadas nas matrizes produtoras
de alevinos. Os resultados deste estudo serão importantes para que se construa um cenário da genética da piscicultua
no estado do Pará, uma atividade que é de certa forma ainda emergente na região.
Apoio: CNPq/MCT (PPG7), FINEP.
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Caracterização genética de híbridos
entre os peixes neotropicais Pirapitinga
(Piaractus brachypomus) e Tambaqui
(Colossoma macropomum) através de PCRRFLP: implicações para a conservação
Rodrigues, A1; Hashimoto, DT1; Bortolozzi, J1; Senhorini, JA2; Foresti, F3; Porto-Foresti, F1
Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Ciências, Universidade Estadual Paulista, (UNESP), Campus de Bauru, Bauru, SP
Centro de Pesquisa e Gestão de Recursos Pesqueiros Continentais, Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade, Pirassununga, SP
3
Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, (UNESP), Campus de Botucatu, Botucatu, SP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Hibridação interespecífica de peixes; PCR-RFLP; Colossoma; Piaractus
O monitoramento genético de produtos resultantes de processos de hibridação interespecífica consiste no uso de
metodologias que possibilitam encontrar características genéticas, que identifiquem, de maneira clara e acessível,
parentais e híbridos. No presente estudo, através de técnicas moleculares de PCR-RFLP (Restriction Fragment Lenght
Polymorphism - Polymerase Chain Reaction) de genes mitocondriais e nucleares, procurou-se caracterizar a linhagem
híbrida de exemplares de “tambatinga” e diferenciá-las de seus respectivos parentais Colossoma macropomum (tambaqui)
e Piaractus brachypomus (pirapitinga). Primeiramente, foram realizadas extrações de DNA genômico de tecidos sólidos e
de sangue dos exemplares em estudo, utilizando-se diferentes protocolos, que permitiram o isolamento de DNA de alta
qualidade. Dada às características únicas de transmissão materna do DNA mitocondrial, a aplicação da técnica de PCRRFLP do gene mitocondrial DNAr 16S mostrou-se útil para identificação de híbridos recíprocos, porém esta técnica não
demonstrou ser uma ferramenta valiosa na distinção clara entre híbridos e parentais, tornando-se necessário a utilização
do marcador de gene nuclear α-tropomiosina. A aplicação da técnica de PCR-RFLP do gene nuclear α-tropomiosina
permitiu avaliar não só a herança materna do híbrido, mas também sua herança paterna, identificando de maneira clara
amostras de híbridos e parentais. Assim como demonstrado nos resultados deste trabalho através da diferenciação das
espécies parentais, a análise de RFLP de fragmentos de PCR, ou seja, a combinação das técnicas de PCR e RFLP pode
ser aplicada com sucesso para diferenciação de espécies. Esta metodologia oferece a vantagem de ser mais barata, simples
e especialmente útil nas análises de rotina de um grande número de amostras. O uso destas ferramentas moleculares no
diagnóstico de híbridos demonstrou que misturas ocasionais de exemplares híbridos e parentais em estoques de cultivo
de pisciculturas realmente podem ocorrer, sendo que esses estudos envolvendo genética aplicada a piscicultura poderão
fornecer subsídios para o monitoramento de projetos de hibridação em pisciculturas, na orientação de programas de
conservação biológica e um manejo adequado dos estoques naturais e cultivado de peixes.
Apoio financeiro: FAPESP.
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Análise da estrutura populacional do pacu
(Piaractus mesopotamicus) na bacia do
Alto Paraguai por meio de marcadores
moleculares do DNA mitocondrial
iervolino, F1; Resende, KE2; Hilsdorf AWS1
Laboratório de Genética de Peixes e Aqüicultura, Núcleo Integrado de Biotecnologia, Universidade de Mogi das Cruzes.
2
EMBRAPA Pantanal, Corumbá, MS.
[email protected]
1
Palavras-chave: Piaractus mesopotamicus, mtDNA, genética de população
Entre os vertebrados os peixes são os que apresentam a maior riqueza de espécies. Os peixes neotropicais compõem a ictiofauna
mais diversificada e rica do mundo. Contudo, apesar desta diversidade de espécies de peixes e da sua grande importância
econômica para o homem, ainda pouco se conhece sobre suas características biológicas, ecológicas e genéticas. A identificação
e a conservação de estoques geneticamente diferenciados e adaptados ao seu habitat representam um ponto fundamental para
o setor pesqueiro, pela sua relação direta com a produtividade total e o uso sustentável dos recursos. O pacu é uma espécie de
grande ocorrência nos rios da bacia hidrográfica do Alto Paraguai. A pesca do pacu tem sido monitorada e vem mostrando
a grande importância desta espécie para a pesca. A manutenção dos estoques de pacu em nível de uso sustentável depende
dentre outras da conservação da variabilidade genética populacional. Para isso, é necessário o conhecimento do grau de
diferenciação genética das populações de pacu, o que pode ser conseguido por meio de marcadores moleculares. O presente
estudo foi realizado com o objetivo de avaliar a estrutura intra e inter populacional do pacu por meio de análises de seqüências
da região controle (d-loop) do mtDNA. As seguintes seqüências de iniciadores foram desenhadas a partir da seqüência do d-loop
depositada no GeneBank (AF283959): L2910 – 5´CTAACTCCCAAAGCTAGTATTC3´ H3010 - 5´CTTCAGTGTTAT
GCTTTATTTAAGCTAC3´. Dez amostras de quatro sub-bacias, Cuiabá, Taquari, Negro e Miranda mais do Rio Paraguai
foram escolhidas para a avaliação. O DNA total das amostras foi extraído da nadadeira caudal, os iniciadores desenhados
para a espécie (P. mesopotamicus) foram utilizados para a amplificação da região do d-loop, foi feita a purificação das amostras
amplificadas e estas foram então seqüenciadas em um seqüenciador automático ABI3100. Cada amostra foi seqüenciada
duas vezes, assim através do programa CodonCode (versão 1.4.1) foi gerada uma seqüência consenso para cada amostra. As
seqüências foram alinhadas pelo método de ClustalW através do programa MEGA (versão 3.0). As análises estatísticas foram
conduzidas por meio dos programas Arlequin (versão 3.01) e DnaSP (versão 4.50.1). Os resultados da análise AMOVA
mostraram que 100% da variabilidade está dentro das populações, indicando que as populações não são variáveis entre si. O
valor calculado de ΦST = -0,00121 (P<0,05) é indicativo de baixa estruturação genética entre as populações avaliadas (Wright,
1978). Valores de moderada estruturação (ΦST = 0,04807 P<0,05) foram revelados pela comparação entre indivíduos do Negro
e do Paraguai. O teste de mantel (r = 0,50) mostrou que não há correlação entre distância genética e distância geográfica.
A falta de estruturação pode ser explicada pela característica migradora da espécie em conjunto com a topografia da região
pantaneira. Desta forma, pela análise das seqüências as populações devem ser manejadas com uma meta-população.
Apoio Financeiro: EMBRAPA, FUNDECT.
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Resumos do 54º Congresso Brasileiro de Genética • 16 a 19 de setembro de 2008
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Filogenia molecular preliminar dos
grandes bagres neotropicais do gênero
Pseudoplatystoma Bleeker,
1862 (Teleostei: Pimelodidae)
Carvalho-Costa, LF1; Willis, SC2; Piorski, NM1; Ortí, G2; Galetti Jr, PM3
1
Universidade Federal do Maranhão
School of Biological Sciences, University of Nebraska-Lincoln, EUA
3
Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos
[email protected]
2
Palavras-chave: Filogenia Molecular, citocromo b, Pseudoplatystoma
Pseudoplatystoma possui peixes amplamente distribuídos pelos rios da América do Sul. Em recente revisão taxonômica,
o número de espécies, até então considerado três (P. corruscans; P. fasciatum e P. tigrinum), foi aumentado para oito
(P. fasciatum, P. punctifer, P. orinocoense, P. magdaleniatum, P. reticulatum, P. tigrinum, P. metaense e P. corruscans),
com base em sinapomorfias não compartilhadas. Visando avaliar essa situação, este resumo apresenta uma hipótese
filogenética do grupo com base em um marcador de DNA mitocondrial. Para isso, utilizamos o gene do citocromo
b (citb) (953 pares de base), o Método de Evolução Mínima (EM) para estimar a filogenia e seqüências de Zungaro e
Brachyplatystoma como grupos externos. A identificação das espécies seguiu a classificação antiga. As 179 seqüências
do grupo interno corresponderam a 81 haplótipos, cuja árvore filogenética apresentou dois clados de alto suporte. O
primeiro, e mais basal, agrupa as populações de P. corruscans, com dois sub-clados monofiléticos pertencentes aos Rios
Paraguai e São Francisco, respectivamente. Essa forte divergência no gene citb é evidência de ausência de fluxo gênico,
via fêmeas, entre essas duas populações. Entretanto, nenhuma diferença morfológica entre esses grupos foi encontrada
pelos autores da revisão. O outro clado agrupa as espécies irmãs P. fasciatum e P. tigrinum. Contudo a população de P
tigrinum do Rio Orinoco não formou um grupo monofilético, pois um dos seus haplótipos agrupou com os espécimes
do Rio Amazonas, contrariando o argumento de que P. tigrinum do Orinoco é uma espécie (P. metaense) diferente da
que ocorre na bacia Amazônica. No outro sub-clado, que inclui peixes de P. fasciatum de várias bacias da América do
Sul, foi observada a formação de grupos de suporte moderado a alto, em geral ligados à bacia de origem das amostras.
Assim, houve agrupamentos nas bacias do Maranhão (Pindaré, Mearim e Itapecuru), do Paraguai, do Orinoco, e uma
politomia envolvendo os haplótipos do Amazonas, Turiaçu (Maranhão) e Tocantins-Araguaia. As conexões entre as fozes
dos Rios Amazonas e Tocantins-Araguaia explicam parte desse resultado. Contudo, a visível diferenciação dos peixes
do Rio Turiaçu em relação às outras bacias maranhenses e sua proximidade evolutiva com os peixes do Amazonas e
Tocantins-Araguaia sugere uma história de colonização recente dessa bacia. Portanto, nossos dados, ainda que preliminares,
mostram a existência de grupo monofiléticos dentro de Pseudoplatystoma que podem ou não representar diferentes
unidades evolutivas do gênero. Para dar maior suporte às nossas conclusões, estão sendo obtidas seqüências de dois
marcadores nucleares (íntrons dos genes rag1 e S7), e também a inclusão de amostras do Rio Magdalena (Colômbia)
e da região das Guianas, onde, segunda a revisão taxonômica, existem duas espécies diferentes.
Apoio financeiro: FAPESP, CNPq, BASA, CAPES, NSF.
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Marcadores genéticos no estudo de
retrocruzamentos envolvendo híbrido entre
as espécies Pseudoplatystoma reticulatum
e Pseudoplatystoma corruscans
(Pisces, Siluriformes)
Prado, FD1; Senhorini, JA2; Foresti, F3; Bortolozzi, J1, Porto-Foresti, F1
1
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual Paulista
Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade, Centro Nacional de Pesquisa e Conservação de Peixes Continentais, CEPTA
3
Departamento de Morfologia, Universidade Estadual Paulista
[email protected]
2
Palavras-chave: Híbridos de peixes, fertilidade em híbridos, retrocruzamentos, marcadores genéticos, conservação genética
Os bagres de grande porte Pseudoplatystoma corruscans (pintado) e Pseudoplatystoma reticulatum (cachara) possuem alto potencial
para a piscicultura, apresentando grande interesse em seu cultivo e na produção de híbridos interespecíficos entre estas espécies,
principalmente devido ao vigor híbrido que apresentam. Recentemente verificou-se que estes híbridos podem apresentar fertilidade,
o que representa alto risco de contaminação genética de estoques selvagens e cultivados via retrocruzamentos bem sucedidos com
as espécies parentais. O uso de marcadores genéticos nos produtos resultantes da hibridação em peixes é uma das principais etapas
a serem realizadas, com o objetivo de avaliar os reais riscos que esses animais representam, com isso, o presente estudo procurou
caracterizar, através de técnicas citogenéticas, as espécies parentais P. corruscans e P. reticulatum, seus híbridos interespecíficos “cachapinta”
(cruzamento do cachara fêmea com pintado macho) e “pintachara” (cruzamento do pintado fêmea com cachara macho) e híbridos F2
resultantes de retrocruzamentos do “cachapinta” fêmea com o pintado macho e do “cachapinta” macho com o pintado fêmea. Todos
os indivíduos analisados apresentaram 2n=56 cromossomos, entretanto diferentes fórmulas cariotípicas foram verificadas entre os
parentais pintado e cachara, sendo que os híbridos interespecíficos apresentaram um cariótipo intermediário em relação aos parentais.
Os híbridos F2 apresentaram grande variação no cariótipo, com fórmulas cariotípicas similares ao pintado e “cachapinta” ou com
morfologia cromossômica variando interindividualmente. O fato dos híbridos F1 apresentarem o mesmo número cromossômico
de 2n=56 e elementos do complemento cromossômico muito similares aos parentais indica alto grau de compatibilidade genética
entre as espécies parentais, o que provavelmente possibilitou a produção de gametas viáveis pelo híbrido “cachapinta”. Esta hipótese
enfatiza o aspecto de que, em peixes, mesmo os gametas com complementos cromossômicos desequilibrados mantêm parcialmente
suas capacidades genéticas e funcionais, podendo gerar descendentes viáveis. A variação de cariótipos observada nos híbridos F2 pode
ser devida à falta de pareamento de alguns cromossomos do híbrido “cachapinta” durante a formação de seus gametas, ocasionando
eventos de não-disjunção cromossômica, resultando em diversos tipos de gametas e consequentemente em diferentes cariótipos nos
híbridos F2. Tais resultados indicam a primeira ocorrência, reprodução e fertilidade de híbridos nesse grupo de peixes indicando a
possibilidade de retrocruzamentos bem sucedidos entre o híbrido interespecífico “cachapinta” e o parental pintado, confirmando os
riscos causados por estes híbridos, que podem variar de introgressões genéticas até a eliminação da espécie nativa e substituição pelos
híbridos. A partir desses estudos torna-se possível fornecer subsídios para um manejo adequado destes espécimes, que representam
um grande risco ao ambiente, se forem produzidos e utilizados de forma indiscriminada, portanto o uso de marcadores genéticos
se torna importante na orientação de programas de conservação biológica.
Apoio Financeiro: FAPESP e ICMBio.
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Análise citogenética em duas espécies de
Siluriformes da bacia do Alto Paraná
Andari, VCM1; Blanco, DR1; Lui, RL1; Moreira-Filho, O1
Citogenética, Departamento Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos
[email protected]
1
Palavras-chave: Citogenética, Siluriformes, banda C, Ag-NOR, FISH 18S
A Bacia do Alto Paraná é um complexo hidrográfico com marcado endemismo, que contém 310 espécies de peixes
distribu­ídas em 38 famílias e 11 ordens. Dentre elas, a ordem Siluriformes é uma das mais representativas incluindo os
peixes conhecidos como bagres, mandis, cascudos e acaris. Estudos cariotípicos revelam número cromossômico modal
de 2n=58 para Siluriformes, e as maiores variações em relação a este valor ocorrem em Siluroidei, sugerindo que as
mudanças cromossômicas freqüentemente estão associadas com o processo de especiação neste grupo e que ocorreu em
paralelo em diferentes famílias a partir de um ancestral 2n=56±2. O presente trabalho tem por objetivo caracterizar através
citogenética duas espécies da ordem Siluriformes, uma pertencente ao gênero Megalonema (família Pimelodidae) do rio
Mogi Guaçu e outra pertencente ao gênero Pseudopimelodus (família Pseudopimelodidae), proveniente do rio PassaCinco, ambos da bacia do Alto Paraná – SP. Essas populações ainda não haviam sido caracterizadas citogeneticamente.
Para tanto, foram utilizadas técnicas básicas de coloração convencional por Giemsa para determinação do número e
morfologia cromossômicos; bandamento C para determinar o padrão de distribuição de heterocromatina e coloração
com nitrato de prata para evidenciar as regiões organizadoras de nucléolo funcionais na intérfase anterior a mitose
(Ag-NORs). Além disso, foi realizada a caracterização citogenética molecular através da hibridação in situ fluorescente
(FISH) com sonda de rDNA 18S. A espécie de Pseudopimelodus sp. apresentou 2n=54 cromossomos (40m/sm+14st/a),
enquanto a espécie de Megalonema sp. 2n=56 cromossomos (42m/sm+14st/a), não sendo encontrado dimorfismo sexual.
Com relação às regiões heterocromáticas, Pseudopimelodus sp. evidenciou bandas teloméricas no braço curto de alguns
cromossomos, enquanto que para Megalonema sp. bandas teloméricas, ocorrendo em alguns cromossomos do complemento
bandas biteloméricas. Entretanto, esse padrão de distribuição de heterocromatina difere do padrão encontrado em
Pseudopimelodidae e Pimelodidae, que apresentam predominância de bandas pericentroméricas. Pseudopimelodus sp.
apresentou um par Ag-NORs positivo no braço curto de um cromossomo submetacêntrico, enquanto Megalonema sp.
apresentou marcação no braço longo de um par também submetacêntrico, com evidente constrição secundária. A sonda
de DNAr 18S revelou apenas um par de cromossomos marcados para Megalonema sp. e três pares para Pseudopimelodus
sp.. Deste modo, é pertinente ressaltar que a citogenética consiste em uma ferramenta extremamente importante no
conhecimento da diversidade ictiofaunística auxiliando, desta forma, em um melhor entendimento da evolução desse
grupo de peixes neotropicais. Inclusive como auxílio à taxonomia e sistemática de peixes.
Apoio financeiro: CNPq.
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Caracterização citogenética
de Parauchenipterus galeatus (Pisces,
Siluriformes, Auchenipteridae) da bacia do
Alto rio São Francisco em uma área
de transposição de rios
Lui, RL1; Blanco, DR1; Bellafronte, E1; Andari, VCM1; Margarido, VP2; Moreira-Filho, O1
Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos
Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Estadual do Oeste do Paraná
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Citogenética, Auchenipteridae, Transposição de rio, Alto rio São Francisco, Cromossomos B
A construção da Hidrelétrica de Furnas, que foi a primeira usina de grande porte do Brasil, causaria graves conseqüências
quando as comportas de seu reservatório fossem fechadas, pois inundaria parte da cidade de Capitólio (interior de Minas
Gerais) e conectaria a bacia do Paraná à bacia do São Francisco. Para evitar, foi construído um dique próximo a essa cidade,
no rio Piumhi, e suas águas foram transpostas para a bacia do São Francisco. O rio Piumhi, fazia parte da bacia do Paraná até
meados da década de 60 e devido a sua transposição passou a fazer parte da bacia do São Francisco. Como conseqüência, a
ictiofauna do rio Piumhi e de seus afluentes, que representa parte das espécies de peixes da bacia do Alto rio Paraná, também
foi transposta para a bacia do rio São Francisco, causando uma mistura de ictiofaunas que estavam separadas a milhões de
anos. Entre os Siluriformes, que representam o segundo maior grupo de peixes na região Neotropical com mais de 3000
espécies distribuídas em 36 famílias, vários grupos relacionados à região de transposição vem sendo estudados para mapear
até onde espécies de peixes relacionadas à bacia do rio Piumhi avançaram dentro da bacia do São Francisco. Em relação à
família Auchenipteridae, a espécie Parauchenipterus galeatus, que apresenta ampla distribuição no território brasileiro e hábito
sedentário está sendo estudada. Os estudos citogenéticos nessa família estão restritos a apenas quatro gêneros demonstrando
número diplóide conservado de 58 cromossomos, sem nenhuma descrição de sistema de cromossomos sexuais ou presença
de cromossomos supranumerários. No presente trabalho, está sendo analisado várias populações dessa espécie de diferentes
localidades em distintas bacias hidrográficas. Para a bacia do Alto rio São Francisco foram coletados 11 exemplares (4 machos
e 7 fêmeas) no município de Lagoa da Prata, na bacia do rio Jacaré, um afluente da margem direita do São Francisco. Foram
realizadas as seguintes técnicas, análise convencional por Giemsa, impregnação por nitrato de prata e o bandamento - C. O
número diplóide encontrado foi 2n=58, apresentando 22 cromossomos metacêntricos, 16 submetacêntricos, 12 subtelocêntricos
e 8 acrocêntricos. As AgRONs mostraram-se simples em um par subtelocêntrico. Em relação à heterocromatina, apresentou-se
distribuída em regiões pericentroméricas de pares subtelocêntricos/acrocêntricos e telomérica na maioria dos cromossomos do
cariótipo, apresentando marcação bitelomérica em alguns metacêntricos e submetacêntricos. Foi também verificada a presença
de pequenos cromossomos B totalmente heterocromáticos em indivíduos dessa população com variação de 0 a 2, tanto intra
quanto interindividualmente. Até o momento, a presença de cromossomos B na família Auchenipteridae ainda não havia
ocorrido e pode ser considerado um importante marcador para análise da dispersão e distribuição geográfica das populações de
Parauchenipterus galetaus da bacia do Alto São Francisco e Alto Paraná.
Apoio Financeiro: FAPESP e CNPq.
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Isolamento e mapeamento cromossômico
dos retrotransposons Rex1 e Rex3 do
genoma em espécies de peixes da Subfamília
Hypoptopomatinae (Teleostei: Siluriformes)
Ferreira, DC; Oliveira, C; Foresti, F
Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências de Botucatu, Universidade Estadual Paulista, IBB/UNESP
[email protected]
Palavras-chave: Hypoptopomatinae, elementos transponíveis
Elementos repetitivos dispersos, transposons e retrotransposons, representam uma grande porção do genoma eucariótico.
Esses elementos repetitivos são chamados de seqüências de transposição e podem ser definidos como entidades genéticas
capazes de inserir-se em posições diferentes dentro do genoma e alterar a função de genes com os quais são associados.
Tais elementos transponíveis têm um papel importante na manutenção estrutural e funcional do genoma e seu estudo
tem permitido conhecer tanto aspectos da sua organização nos peixes, quanto da dinâmica do processo evolutivo destas
seqüências nestes organismos. Desta forma, o objetivo do presente trabalho foi isolar, identificar e mapear fisicamente as
seqüências de elementos transponíveis presentes no genoma de treze espécies de peixes da subfamília Hypoptopomatinae,
pertencentes a Ordem Siluriformes. As espécies desta subfamília apresentam uma ampla distribuição na América na Sul.
Os elementos retrotransponíveis foram identificados através da amplificação com os primers Rex1 e Rex3 e a composição
nucleotídica dos retrotransposons nas treze espécies foi determinada por seqüênciamento. Foi verificado em todas as
espécies analisadas que o elemento retrotransponível Rex1 contém 560pb, enquanto o Rex3 apresentou 448pb. A análise
comparativa destes retroelementos com informações já disponíveis na literatura revelou que o retrotransposon Rex1 tem
similaridade de 81% com a espécie Anguilla japonica pertencente à família Anguillidae (Ordem Anguilliformes), enquanto
o retrotransposon Rex3 tem similaridade de 86% com a espécie Oryzias latipes, um membro da família Adrianichthyidae
(Ordem Beloniformes). Em relação aos demais grupos de peixes, esses elementos transponíveis apresentam similaridade
apenas em pequenas e distintas regiões da seqüência. Experimentos de hibridação in situ fluorescente foram realizados
apenas na espécie H. leucofrenatus, utilizando como sonda os elementos retrotransponíveis isolados para a espécie. Os
elementos retrotransponíveis Rex1 e Rex3 apresentaram um padrão de dispersão similar e tanto Rex1 quanto o Rex3,
estão dispersos em todos os cromossomos da espécie. A ampla distribuição destes retrotransposons nos peixes sugere
que os elementos Rex podem ter sido incorporados há muito tempo em seus genomas e que vem desempenhando um
papel importante na evolução deste grupo.
Apoio financeiro: FAPESP.
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Relações filogenéticas em
Hypoptopomatinae e Neoplecostominae
(Teleostei: Siluriformes: Loricariidae)
baseadas em seqüências de DNA nuclear
Chiachio, MC1; Montoya-Burgos, JI2; Foresti, F1; Oliveira, C1
Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Instituto de Biociências, Departamento de Morfologia,
Laboratório de Biologia e Genética de Peixes, Botucatu, SP
2
Department of Zoology and Animal Biology, University of Geneva, Switzerland
[email protected]
1
Palavras-chave: Sistemática Molecular, Siluriformes, Seqüências, Nuclear
A família Loricariidae é a maior em número de espécies entre os Siluriformes e também uma das maiores famílias da
ictiofauna mundial. Seus representantes estão distribuídos na América do Sul e na América Central, ocorrendo numa
grande variedade de habitats. Apesar dos loricariideos terem ampla distribuição, muitas espécies são características
por formarem populações restritas a pequenas áreas. Isto provavelmente faz com que apresente uma das maiores
diversidades de formas de todos os peixes do mundo. A família Loricariidae apresenta inúmeros problemas de classificação
principalmente quando se trata das subfamílias. Recentemente, alguns trabalhos levantaram problemas nas relações
de duas importantes subfamílias, Hypoptopomatinae e Neoplecostominae. Os dados sugerem, entre outras coisas,
que Hypoptopomatinae está intimamente relacionada com espécies da subfamília Neoplecostominae, e seu status de
subfamília deve ser reavaliado, pois se admitirmos Hypoptopomatinae como subfamília a subfamília Neoplecostominae
torna-se parafilética. Baseando-se nesses questionamentos, o presente trabalho foi elaborado com o intuito de ampliar
as análises moleculares do grupo em questão e construir uma árvore filogenética robusta englobando representantes
de quase todos gêneros dessas duas subfamílias, e, assim, testar as hipóteses sobre as relações entre os gêneros dessas
subfamílias, propondo uma hipótese de consenso para o grupo. A reconstrução filogenética, baseada em seqüências
da região nuclear correspondente ao gene F Reticulon-4, foi realizada para 16 dos 17 gêneros de Hypoptopomatinae,
num total de 33 espécies e 40 indivíduos da subfamília. Paralelamente, também foram utilizados representantes
da subfamília Neoplecostominae para as mesmas análises a fim de se comparar as relações dos hypoptopomatíneos
com seu grupo conflitante. Nossos resultados mostram que Hypoptopomatinae é parafilético, já que a subfamília
Neoplecostominae aparece dentro de Hypoptopomatinae, formando grupo irmão com a tribo Otothyrini com valor
de bootstrap extremamente alto (98,5). A tribo Hypoptopomatini aparece monofilética e irmã de Neoplecostominae
mais Otothyrini. Neoplecostominae não aparece monofilético devido à presença de Pseudotocinclus tietensis como
grupo irmão das espécies do gênero Pareiorhina, relação fortemente suportada pelo valor de bootstrap (98,7). Todo
o clado formado por Neoplecostominae mais Pseudotocinclus tietensis aparece como irmão da tribo Otothyrini onde
as relações internas entre gêneros e espécies não se alteraram quando analisadas sem a subfamília Neoplecostominae.
Nossos dados comprovam que a subfamília Hypoptopomatinae não é monofilética como definida atualmente havendo
assim a necessidade de uma redefinição deste grupo.
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Estudo comparativo citogenético-molecular
em espécies do gênero Rineloricaria
(Siluriformes, Loricariidae) das Bacias dos
rios Paraíba do Sul (RJ) e Nhundiaquara (PR)
Rodrigues, RM; Almeida-Toledo, LF
Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo – USP, São Paulo, SP, Brasil
[email protected]
Palavras-chave: Rineloricaria, citogenética, variação cariotípica, rearranjos Robertsonianos, FISH
O gênero Rineloricaria, pertencente à família Loricariidae (Siluriformes, Pisces), é composto por 57 espécies que
ocorrem do Panamá ao norte da Argentina. Este gênero possui uma ampla variação cariotípica, com o menor número
diplóide equivalente a 2n=36 (Rineloricaria latirostris) e o maior apresentando 2n=70 (Rineloricaria sp.). Apesar dessa
complexidade taxonômica e citogenética, e da ampla distribuição geográfica, poucos estudos foram feitos sobre o
gênero. A fim de melhor compreender tal complexidade, duas espécies, uma (Rineloricaria sp. A) proveniente da Bacia
do Paraíba do Sul/RJ, e outra (Rineloricaria sp. B) proveniente da Bacia do Rio Nhundiaquara, na região do litoral
paranaense, tiveram seus números diplóides determinados, sendo as preparações cromossômicas submetidas às técnicas
de Bandeamento C, localização de Ag-RONs, coloração por fluorocromos GC e AT específicos e a hibridação “in situ”
fluorescente (FISH) com sondas de DNAr 5S e 18S. Rineloricaria sp. A apresentou 2n=62 cromossomos, constituição
cariotípica com 2M+60ST/A, número fundamental igual a 64 e DNAr 5S em posição pericentromérica no braço curto
de um pequeno par de acrocêntricos. Rineloricaria sp. B apresentou 2n=68 cromossomos, constituição cariotípica com
2M+66ST/A, número fundamental igual a 70 e DNAr 5S também em posição pericentromérica, porém, no braço curto
de dois pares de acrocêntricos pequenos. Em ambas as espécies, as RONs localizaram-se em posição terminal no braço
curto do primeiro par de cromossomos ST/A, caracterizando um sistema simples e sendo estas regiões confirmadas por
FISH com sonda de DNAr 18S e CMA3; a coloração por DAPI mostrou-se homogênea, com as RONs DAPI negativas
e o bandeamento C evidenciou existência de blocos heterocromáticos em posição pericentromérica na maioria dos
cromossomos, inclusive no par de submetacêntricos, sendo as RONs heterocromáticas. A comparação acima demonstra
uma conservação de um par de metacêntricos no cariótipo de ambas as espécies, bem como a localização e quantidade
de RONs e o modo de distribuição da heterocromatina constitutiva, sugerindo que estas espécies possam estar muito
próximas filogeneticamente. Em contrapartida, o número diplóide, a fórmula cariotípica e a quantidade de sítios de
DNAr 5S variam entre essas espécies, e esta variação pode estar relacionada com os possíveis rearranjos Robertsonianos
que possam ter ocorrido na evolução cariotípica deste grupo, pois, os dados encontrados na literatura e neste trabalho
indicam que à medida que o número diplóide aumenta, aumenta o número de acrocêntricos e diminui o número
de cromossomos com dois braços; além disso, a variação no número de sítios de DNAr 5S entre as duas espécies de
Rineloricaria deste trabalho pode ser resultado desses rearranjos. Os números diplóides aqui apresentados são inéditos
na literatura, reforçando a ampla variação cariotípica do grupo, entretanto, mais espécies precisam ser estudadas para
uma melhor compreensão de suas relações filogenéticas e de tais rearranjos.
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Caracterização citogenética de quatro
populações de Hypostomus unae
(Hypostominae, Loricariidae) da bacia
do Rio das Contas
Bitencourt, JA; Affonso, PRAM; Carneiro,PLS; Giuliano-Caetano, L.; Dias, AL
Departamento de Biologia Geral-CCB, Universidade Estadual de Londrina
[email protected]
Palavras–chave: Loricariidae, Hypostomus unae, Cariótipo, Heterocromatina, NOR
Os Loricariidae, comumente conhecidos como cascudos ocupam o segundo lugar em número de espécies entre os
Teleostei e apresentam uma grande diversidade cariotípica, com um numero modal variando de 2n=34 a 2n=96. Apesar
da sua importância biológica, funcional e evolutiva, os estudos realizados sobre essa família de peixes neotropicais são
reduzidos. O gênero Hypostomus é considerado um dos mais complexos e abundantes da ictiofauna neotropical, sendo
assim, o presente estudo teve por objetivo caracterizar citogeneticamente quatro populações de Hypostomus unae ao
longo da bacia do rio das Contas (BA). Foram coletados três exemplares no canal principal do rio das Contas, 12 no
rio Preto do Costa, 12 no rio Oricó e 11 no rio Preto do Criciúma. Os três últimos são afluentes do rio das Contas. A
obtenção de cromossomos mitóticos seguiu o procedimento descrito por BERTOLLO et. al. (1978). Os cromossomos
foram identificados de acordo com a nomenclatura proposta por LEVAN et al. (1964), através de coloração convencional
por Giemsa. As regiões organizadoras de nucléolos (RONs) foram identificadas pela impregnação por nitrato de prata
(HOWELL & BLACK, 1980) e a heterocromatina foi visualizada de acordo com a técnica descrita por SUMNER
(1972). Os espécimes analisados apresentaram 2n=76, com três citótipos distintos. Os exemplares do canal principal
do rio das Contas e do rio Preto do Costa apresentaram a fórmula cariotípica de 06m+16sm+16st+38a (NF=114),
enquanto os exemplares do rio Oricó, apresentou 08m+16sm+16st+36a (NF=116) e do rio Preto do Criciúma apresentou
12m+16sm+14st+34a (NF=118). A impregnação por nitrato de prata revelou RONs simples na região telomérica do
braço longo de um par de cromossomos submetacêntricos em todas as populações, caracterizando uma tendência à
manutenção da condição plesiomórfica da família Loricariidae. O padrão de distribuição de heterocromatina diferiu
entre as populações, onde os espécimes do canal principal, do rio Oricó e Preto do Costa mostraram marcações mais
evidentes restritas às regiões intersticiais e teloméricas de cromossomos acrocêntricos, e equivalentes às RONs, sendo
concordante com o padrão comumente descrito na literatura neste grupo, enquanto que a população do rio Preto
do Criciúma apresentou marcações mais evidentes em regiões intersticiais. Essas variações podem ser provenientes
de diferentes níveis de condensação dos cromossomos ou podem representar polimorfismos envolvendo inversões
pericêntricas e/ou translocações, caracterizando citótipos distintos.
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Caracterização citogenética de triploidia
natural em Rhamdia sp. (Pisces,
Siluriformes, Heptapteridae)
Blanco, DR1; Lui, RL1; Traldi, JB1; Martinez, JF1; Andari, VCM1; Bertollo; LAC1; Moreira-Filho, O1
Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos - UFSCar
[email protected]
1
Palavras-chave: Triplóide, Rhamdia, Citogenética, Siluriformes, Heptapteridae
A poliploidia é um evento comum em plantas e, entre os mamíferos, sua ocorrência está freqüentemente relacionada
com a morte do embrião ou nascimento seguido por morte. Porém entre os peixes neotropicais, a triploidia é a forma
mais comum de poliploidia e parece ser compatível com a viabilidade. Entre os Cyprinidae, há uma clara divisão em dois
clados: um deles mais representativo, constituído por indivíduos diplóides e um outro menor, composto por indivíduos
poliplóides, sendo sugerida a existência de um possível ancestral poliplóide para o grupo. Em Siluriformes, a poliploidia
tem sido considerada um evento importante no processo de evolução cromossômica. Entre os peixes hermafroditas, a
poliploidia parece ser um fenômeno mais freqüente, sendo mais rara entre as espécies com sexo separado. Duas hipóteses
parecem ser mais viáveis para a origem de peixes poliplóides: a fertilização de um gameta diplóide (oriundo de uma
não-disjunção meiótica) por um gameta haplóide, ou a retenção do segundo corpúsculo polar durante a gametogênese
na formação do ovócito seguida pela fecundação por um gameta haplóide. Até o presente momento, 15 espécies,
pertencentes a diferentes ordens e famílias registram casos de triploidias naturais. O presente trabalho teve como
objetivo caracterizar, através de ferramentas citogenéticas, um triplóide natural (2n=3x=87) de Rhamdia sp., coletado no
ribeirão dos Negros, pertencente à bacia do rio Mogi Guaçu–SP. O cariótipo deste exemplar é constituído por trincas
de cromossomos, sendo 11 metacêntricas, 12 submetacêntricas e 6 subtelo-acrocêntricas. A coloração com nitrato de
Prata evidenciou três NORs ativas no braço curto de 3 cromossomos homólogos submetacêntricos. O bandamento
C evidenciou pouca quantidade de heterocromatina, sendo destacadas bandas centroméricas em vários cromossomos
e bandas teloméricas em algumas trincas do complemento. Entre os cromossomos metacêntricos pequenos ocorrem
bandas-C biteloméricas, situação esta que parece ser uma característica peculiar em várias espécies de Siluriformes. Um
bloco mais proeminente de heterocromatina ocorre no braço curto dos cromossomos portadores da NOR, coincidente
com a região organizadora do nucléolo. A temperatura tem sido considerada um fator determinante na ocorrência de
triploidia natural em peixes neotropicais. A maioria destes organismos apresenta fecundação externa e o término da
segunda divisão meiótica somente ocorre após a desova. Desta forma, as células gaméticas femininas são mais suscetíveis
às variações de temperatura, podendo resultar na retenção do segundo corpúsculo polar. Este fato é mais provável entre
os peixes de riachos e ribeirões, pois em tais ambientes à variação de temperatura ocorre mais bruscamente do que na
calha principal dos rios.
Apoio financeiro: FAPESP e CNPq.
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Relações filogenéticas no gênero Rhamdia
(Pisces, Siluriformes, Heptapteridae) com
base nos genes mitocondriais ATPASE,
citocromo B e ND2
Garcia, C1; Trajano, E2; Almeida Toledo, LF1
Instituto de Biologia, Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Universidade de São Paulo
2
Instituto de Biologia, Departamento de Zoologia, Universidade de São Paulo
[email protected]
1
Palavras-chave: Siluriformes, Rhamdia, Filogenia, DNA mitocondrial, Espécies crípticas
Espécies pertencentes ao gênero Rhamdia ocorrem desde a região centro-sul da Argentina até o sul México. De maneira
geral, a sistemática deste gênero permanece confusa, principalmente devido a falhas na identificação das espécies por
conflitos taxonômicos. Dessa forma estão descritas atualmente, 11 espécies válidas para a região Neotropical. Rhamdia
quelen é umas das espécies mais amplamente distribuídas, estando descrita para os principais sistemas hidrográficos
brasileiros. Este peixe, que pode atingir até 50 cm e apresenta hábitos migratórios (que dependem de seu período
reprodutivo e/ou condições ambientais), compõem, para alguns autores, que se baseiam em estudos morfológicos e
citogenético-moleculares, um possível complexo de espécies ainda pouco explorado. Já R. enfurnada consiste em uma
espécie troglófila encontrada na Gruta do Enfurnado/BA. Os principais objetivos do presente trabalho consistem em
contribuir para o esclarecimento das relações filogenéticas entre populações geograficamente distintas de Rhamdia,
bem como identificar a possível ocorrência de espécies crípticas. Para tal, foram analisados segmentos das seqüências
de três genes mitocondriais (ND2, ATPase e Citocromo B) num total de 2065pb, de 113 exemplares de R. quelen e 24
exemplares de R. enfurnada. Estudos com o gene nuclear S7 estão sendo iniciados. O programa Mega 4.0 foi utilizado
para a construção das árvores filogenéticas através do método de Neighbour-Joining, com bootstrap calculado a partir
de 1000 replicações e utilizando o modelo de Jukes-Cantor. Acentronichthys, Imparfinis, Microglanis e Pimelodella
foram utilizados como grupos externos nas análises. A reconstrução das árvores filogenéticas foi semelhante para os
três genes e demonstrou a formação de grandes grupos, nos quais a maioria das populações pertenciam a uma mesma
bacia hidrografia, embora em alguns casos, estivessem presentes populações de localidades bastante distantes. Um dos
grupos foi composto por R. enfurnada e duas populações de R. quelen. Os resultados encontrados reforçam a proposta
de que a divergência destas populações encontra-se intimamente relacionada com a história das bacias hidrográficas
onde são encontradas e que a espécie R. quelen, provavelmente compõe um conjunto de espécies crípticas uma vez que
algumas das populações estudadas mostraram-se mais relacionadas com R. enfurnada.
Apoio Financeiro: CAPES, CNPq e FAPESP.
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Análises citogenéticas e moleculares
em duas espécies de siluriformes
da bacia do rio Paranaíba
Molina, RAS1; Faria, RCB1; Morelli, S1
Instituto de Genética e Bioquímica – Universidade Federal de Uberlândia/MG
[email protected]
1
Palavras-chave: citogenética, cromossomos, Pinirampus, Trachelyopterus, RAPD
A ordem dos siluriformes é um grupo de peixes que consiste de 34 famílias com cerca de 412 gêneros e 2405 espécies,
das quais 1300 habitam a região neotropical. No presente trabalho foi realizado um estudo citogenético em duas espécies
de peixes pertencentes à ordem Siluriformes, Pinirampus pirinampu (Barbado), da família Pimelodidade e Trachelyopterus
galeatus (Jauzinho), da família Auchenipteridae. Os dados cariotípicos de Pinirampus pirinampu mostram um padrão
conservado tanto para a população do rio Araguari como para a do rio Paranaíba, comparado a outras populações
estudadas. O cariótipo é constituído por 2n=50 cromossomos, distribuídos em 22m + 12sm + 4st + 12a, com NF = 88.
A NOR apresenta o mesmo padrão em ambas as populações, localizada na região telomérica no braço curto de um par
de subtelocêntricos. O padrão de distribuição da heterocromatina foi distinto, podendo separar as duas populações por
este padrão. Na população do rio Araguari, notou-se a presença de dois pares cromossômicos com marcas intersticiais,
ausentes na população do rio Paranaíba, que por sua vez apresentou um polimorfismo em tamanho em um par de
cromossomos, com um homólogo fortemente marcado na região intersticial e ausência de marcação no homólogo
correspondente. Observou-se ainda diferenças quanto ao tamanho comparado dos cromossomos, sugerindo variações
quanto à distribuição da heterocromatina. Pelo tratamento com CMA3, foi possível identificar blocos brilhantes nas
regiões teloméricas. O padrão de digestão por AluI evidenciou algumas marcações positivas nas regiões teloméricas e
centroméricas nas duas populações, e alguns sítios de clivagem em regiões pericentroméricas. Com o uso do Hoechst,
não se evidenciou blocos ricos em AT, mas uma marcação negativa na população do rio Araguari. A população de
Trachelyopterus galeatus do rio Araguari, mostrou-se com número diplóide de 2n=58 cromossomos, distribuídos em 24m
+ 12sm + 6st + 10a, com NF=106. Embora esta população apresente certo grau de semelhança com a população do rio
São Francisco, nota-se uma distinta variabilidade cariotípica nesta população quando comparada a outras populações
estudas. A NOR é do tipo simples, em um par de cromossomos acrocêntricos. A banda-C evidenciou fracos blocos
heteroromáticos na região telomérica na maioria dos cromossomos. O tratamento com AluI permitiu localizar alguns
sítios de clivagem e algumas marcações positivas. Por meio do Hoechst, foi possível identificar fracas marcações em
alguns cromossomos. Através das análises moleculares por RAPD, obteve-se um padrão bandas polimórficas, sendo
possível distinguir tanto as populações de Pinirampus pirinampu (distância genética de 0,183) entre si bem como da
população de Trachelyopterus galeatus (distância genética de 0,735), gerando um dendograma representativo da distância
genética entre as espécies estudadas. As análises moleculares reforçaram os estudos citogenéticos, funcionando como
um sistema adicional de marcadores genéticos, permitindo separar claramente as populações estudadas.
Apoio Financeiro: CNPq, FAPEMIG e UFU.
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Caracterização genética de
Pseudoplatystoma cf. punctifer de bacias
da região nordeste, Brasil baseado em
sequências do DNA mitocondrial
Aragão, DG; Barros, MC; Fraga, EC
Laboratório de Genética e Biologia Molecular – CESC/UEMA
[email protected], [email protected]
Palavras-chave: Pseudoplatystoma, rRNA 16S, DNA mitocondrial
Os Siluriformes compreendem um grupo de peixes bastante diversificado com cerca de 34 famílias, 412 gêneros e
aproximadamente 2.400 espécies, distribuídas em vários continentes. Na família Pimelodidae o gênero Pseudoplatystoma
Bleeker (1862) agrupava apenas três espécies, P. fasciatum (Linnaeus, 1766), P. tigrinum (Valenciennes, 1840), e P.
corruscans (Spix & Agassiz, 1829). Recentemente este gênero foi revisado acrescentado mais cinco espécies, P. punctifer
(Castelnau, 1855), P. reticulatum Eigenmann & Eigenmann, P. orinocoense n. sp., P. metaense n. sp. e P. magdaleniatum
n.sp., sendo a espécie P. punctifer (Castelnau, 1855) amplamente distribuída na região nordeste e bastante explorada
na pesca artesanal e comercial. Os peixes deste gênero são economicamente importantes por sua carne possuir valor de
mercado bastante atrativo. No entanto, pouco se conhece sobre o perfil genético dos estoques de P. punctifer distribuídos
no nordeste necessitando de informações que possam subsidiar programas de conservação e manejo desta espécie. As
amostras foram obtidas nas bacias dos rios Itapecuru/MA, Pindaré/MA e Parnaíba/PI. A extração de DNA foi realizada a
partir do tecido muscular utilizando-se o protocolo de fenol-clorofórmio e a amplificação do gene rRNA 16S foi realizada
via PCR usando iniciadores específicos. O produto da PCR foi seqüenciado usando-se o método didesoxiterminal
com o Kit Big Dye. As seqüências geradas foram editadas e alinhadas no Clustal W do programa Bioedit. As análises
filogenéticas foram realizadas no programa MEGA4 e uma seqüência de Hemisorubim platyrhynchos e outra de Sorubim
lima/AY264132 do Genbank foram incorporadas ao banco de dados e usadas como grupo externo. Um fragmento com
361 pares de bases foi obtido em 23 amostras de P. cf punctifer com uma composição nucleotídica de T = 22,6%, C =
24%, A= 30,9% e G = 22,5%. Foram observados dois haplótipos, onde o haplótipo 1 (H1) mostrou-se como o mais
freqüente e compartilhado pelas três bacias analisadas. Já o haplótipo 2 (H2) foi encontrado somente na do Parnaíba e
do Itapecuru. A análise filogenética gerou árvores com topologia similar nos diferentes métodos analisados mostrando
um forte agrupamento entre os três haplótipos (bootstrap 98%). Dessa forma, os dados da presente análise confirmam
a ocorrência de uma única espécie nas bacias estudadas.
Apoio Financeiro: BNB, FAPEMA, UFPA e UEMA.
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Análise do mtDNA no gênero Pimelodella
(Pisces, Siluriformes, Heptapteridae): uma
abordagem filogenética
Peixoto, MS1; Garcia, C1; Trajano, E2; Almeida Toledo, LF1
Dep. de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo
2
Dep. de Zoologia, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo
[email protected]
1
Palavras-chave: Siluriformes, Pimelodella, ictiofauna, mtDNA, filogenia
Os peixes representam o grupo mais diversificado e um dos mais interessantes para estudos da genética e de evolução
entre os vertebrados. Estimativas da diversidade de espécies da ictiofauna de água doce Neotropical são propostas
dentro do contexto de uma taxa acelerada de descrição de novas espécies nos últimos anos. Na ordem Siluriformes
encontram-se as espécies de peixes mais amplamente distribuídos. Os representantes desta ordem são popularmente
conhecidos como bagres, cascudos, entre outros. Os Siluriformes Neotropicais compreendem oito grupos monofiléticos:
Diplomystidae, Cetopsidae, Loricaridae, Doradeidae, Aspredinidae, Pimelodidae, Heptapteridae e Pseudopimelodidae.
Pimelodella é um dos gêneros pertencentes à família Heptapteridae, contando com cerca de 60 espécies distribuídas
desde o sul da América do Sul até o Panamá e América Central. Os dados citogenéticos disponíveis demonstram uma
grande variabilidade cariotípica, marcada por variações no número diplóide, presença de um sistema de cromossomos
sexuais diferenciados morfologicamente e cromossomos B. Os estudos citogenéticos e moleculares neste gênero
sugerem a possível ocorrência de um complexo de espécies. Nos últimos anos, tem sido observado um considerável
aumento na aplicação de marcadores moleculares de DNA na análise de problemas relativos à Genética de Populações
e à Sistemática. Neste trabalho estudos moleculares preliminares de diferentes espécies de Pimelodella que ocorrem nos
rios das principais bacias hidrográficas do Estado de São Paulo foram realizados, utilizando-se amplificação de genes
mitocondriais englobando ATPase 6 e 8, Citocromo b e ND2. Estudos com o gene nuclear S7 estão sendo iniciados. Os
produtos da PCR foram seqüenciados em seqüenciador automático modelo ABI-PRISMA 3100. As seqüências obtidas
foram verificadas no GenBank para confirmação da similaridade com as seqüências mitocondriais de outros peixes.
As seqüências foram alinhadas no programa MEGA 4, com a ferramenta CLUSTAL W, disponível no programa. Os
gêneros Ancestronychthys, Imparfinis, Microglanis e Rhamdia foram utilizados como grupos externos. Para a inferência
filogenética foi utilizado o método Neighbour-Joining com o modelo Jukes e Cantor. Os dados obtidos sobre as
seqüências sugerem que, apesar do isolamento geográfico, ocorrem agrupamentos entre populações que se encontram
separados por bacias hidrográficas. As relações entre as famílias dos Siluriformes são pobremente conhecidas e os dados
moleculares devem ajudar para o entendimento das relações entre as famílias.
Apoio Financeiro: FAPESP, CNPq e CAPES.
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A espécie Sorubim lima (Pimelodidae) em
diferentes bacias do estado do Maranhão/
Brasil: uma abordagem molecular
Santos, RS; Fraga, EC; Barros, MC
Laboratório de Genética e Biologia Molecular – CESC/UEMA
[email protected]
Palavras-chave: Pimelodidae, Sorubim lima, gene 16S
A família Pimelodidae pertencente à ordem Siluriformes agrupa atualmente 31 gêneros e 90 espécies. Como membro
da família Pimelodidae, o gênero Sorubim possui cinco espécies válidas, sendo Sorubim lima (Bloch & Schneider, 1801)
uma espécie amplamente distribuída e que vive em diferentes habitat: lagos, rios e bocas de igarapés. A espécie S. lima
é predadora dos grandes rios da América do Sul, faz parte do comércio de peixes ornamentais e é importante fonte de
proteína sendo vendido em muitos mercados de peixes ao longo da América do Sul. Estudos genéticos desta espécie
ainda são incipientes, portanto, objetivou-se caracterizar molecularmente a espécie Sorubim lima em diferentes rios do
estado do Maranhao por meio de seqüências do DNA mitocondrial do gene rRNA 16S. As amostras foram provenientes
das bacias dos rios Itapecuru e Pindaré e identificadas através de chaves específicas. O DNA total foi extraído a partir
do tecido muscular utilizando o protocolo de fenol-clorofórmio, o isolamento e amplificação do gene rRNA 16S foi
realizada através da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) usando combinações de primers específicos.
O produto da PCR foi seqüenciado usando-se o método didesoxiterminal. As seqüências geradas foram editadas e
alinhadas no Clustal W do programa Bioedit. Uma seqüência de Sorubim lima/AY264132 retirada do Genbank foi
incorporada ao banco de dados. Um fragmento de 450 pares de bases foi obtido em 24 amostras, sendo sete do rio
Pindaré, 16 do rio Itapecuru e uma oriunda dos rios neotropicais (AY264132). Uma baixa variabilidade genética com
apenas quatro sítios polimórficos (239, 244, 249 e 292) ao longo do fragmento analisado foi verificado. No entanto
quando analisado apenas os espécimes dos rios Itapecuru e Pindaré um único haplótipo foi observado tratando-se assim
de uma única espécie ao longo das duas bacias e corroborando com as informações disponíveis na literatura através de
estudos morfológicos o que confirma o status específico.
Apoio financeiro: BNB, UFPA e UEMA.
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Amplificação heteróloga e caracterização
de locos microssatélites em piraíba
- Brachyplatystoma filamentosum –
(Siluriformes: Pimelodidae) para estimativa
da variabilidade genética
Filgueiras-Souza, RJ1; Batista, JS1; Formiga-Aquino, K1; Farias, IP3; Alves-Gomes, JA2
Laboratório Temático de Biologia Molecular/Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – LTBM/INPA
Coordenação de Pesquisas em Biologia Aquática/Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia CPBA/INPA
3
Laboratório de Evolução e Genética Animal/Universidade Federal do Amazonas – LEGAL/UFAM
[email protected]
1
2
Palavras-chave: microssatélites, piraíba, Amazônia
Dentre as diversos grupos de peixes conhecidos da Amazônia, um é o dos grandes bagres migradores que pertencem à
ordem dos Siluriformes, família Pimelodidae, o qual, encontra-se a Piraíba, Brachyplatystoma filamentosum peixe liso, de
grande porte. Assim como outros bagres (dourada e piramutaba) estima-se que a piraíba realiza migrações reprodutivas
na calha do rio Amazonas/Solimões e seus tributários, percorrendo mais de 5 mil km em direção às cabeceiras. No
intuito de disponibilizar marcadores moleculares microssatélites para futuros estudos de genética populacional e definição
de estoques pesqueiros, este trabalho teve por objetivo verificar a amplificação heteróloga de 11 locos microssatélites,
desenvolvidos para a dourada (B. rousseauxii) em piraíba, bem como caracterizar os locos microssatélites polimórficos.
Esses marcadores, também chamados de SSR (Simple sequence repeat), apresentam numerosas vantagens quando
comparados a outros tipos de marcadores. Foi extraído o DNA total de 38 espécimes de piraíba, provenientes do rio
Madeira. A reação de amplificação dos locos de SSR seguiu as condições de temperatura utilizadas com as amostras de B.
rousseauxii. As análises dos genótipos incluíram os seguintes parâmetros: número de alelos, heterozigosidade observada
e esperada bem como, o teste de equilíbrio de Hardy-Weinberg, Entre os 12 marcadores SSR testados, foi obtida a
amplificação heteróloga para oito locos. Destes, sete apresentaram-se polimórficos com um número de alelos variando
entre 2 a 6 em um total de 10 a 38 indivíduos analisados. Os níveis de heterozigosidade observada foram entre 0.06
(BR02) a 0.8000 (BR17) e três locos apresentaram desequilíbrio de Hardy-Weinberg (BR01, BR04 e BR16). O loco
BR17 apresentou os maiores níveis de heterozigosidade enquanto o BR16 os menores níveis. Os locos microssatélites
caracterizados em B.filamentosum podem ser utilizados como marcadores moleculares no estudo de genética populacional
e delimitação de estoques pesqueiros dessa espécie, contribuindo para futuros planos de conservação e manejo desse
recurso pesqueiro.
Apoio Financeiro: Governo do Estado/SECT/FAPEAM, CNPq/PPG7, CNPq/CT-Amazônia, MCT-INPA.
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Caracterização molecular da espécie
Hemisorubim platyrhynchos (Pimelodidae)
da bacia do rio Itapecuru Maranhão - Brasil
Santos, SM; Fraga, EC; Barros, MC
Laboratório de Genética e Biologia Molecular – CESC/UEMA
[email protected]
Palavras-chave: Hemisorubim platyrhynchos, Pimelodidae, rRNA 16S, Jurupoca, Rio Itapecuru
A família Pimelodidae, possui 30 gêneros e aproximadamente 85 espécies amplamente distribuídas na região Neotropical.
Entre estas espécies Hemisorubim platyrhynchos (Valenciennes, 1940) conhecida popularmente como jurupoca, lírio
e bico de pato. É um peixe de corpo curto e distendido na região abdominal com focinho muito achatado, de cor
acinzentada para cinza-rosada no dorso e parte dos flancos, apresentando cerca de oito máculas longitudinalmente.
Esta espécie apresenta grande potencial de consumo com representativo valor na produção pesqueira de águas interiores
devido o seu tamanho e a qualidade de sua carne. Apesar de sua larga distribuição e da vasta gama de habitat explorados
por esta espécie estudo relacionado à genética ainda é bastante incipiente, sendo assim objetivou-se caracterizar
molecularmente esta espécie. As amostras foram obtidas ao longo da bacia do Rio Itapecuru no estado do Maranhão.
O isolamento e amplificação da região genômica a partir do DNA total foi realizado através da técnica de Reação em
Cadeia da Polimerase (PCR) usando-se iniciadores universais O produto da PCR foi seqüenciado usando-se o método
didesoxiterminal, as seqüências obtidas foram editadas e alinhadas usando-se o programa Bioedit. Um fragmento de
563 pares de bases para o gene rRNA 16S foi obtido em 14 espécimes identificados como H. platyrhynchos com uma
composição nucleotídica de 23,2% de Timina, 23,5% de Citosina, 31,3% de Adenina e 22,0% de Guanina. Um único
haplótipo foi observado para a bacia do rio Itapecuru tratando-se assim de uma única espécie ao longo da bacia o que
confirma o status específico.
Apoio financeiro: BNB, UFPA e UEMA.
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Análise populacional de Hypostomus
ancistroides (Pisces, Siluriformes)
Brandão, KO; Kavalco, KF; Almeida Toledo, LF
Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo – USP, São Paulo, SP, Brasil
[email protected]
Palavras-chave: Hypostomus, rearranjos cromossômicos
O gênero Hypostomus apresenta imensa variabilidade cariotípica, tanto intra como interespecífica. Essa variabilidade
interespecífica é observada quando é analisado o número diplóide de diferentes espécies de Hypostominae. Nesse grupo
os rearranjos Robertsonianos são os principais responsáveis pela evolução cariotípica, resultando na ampla variação
do número diplóide (2n=52 a 2n=80 cromossomos). Não é possível concluir o mesmo em relação à variabilidade
intra-específica, uma vez que não há estudos citogenéticos de abordagem interpopulacional e os poucos estudos do
gênero revelam a conservação do número diplóide em diferentes populações da mesma espécie. O presente trabalho é
o primeiro a realizar um estudo da estrutura cariotípica dessas espécies, com enfoque populacional. Para esse estudo,
três populações de Hypostomus ancistroides foram analisadas através de métodos citogenéticos clássicos e moleculares.
Foram coletados 10 machos, 12 fêmeas e 8 indivíduos jovens, provenientes da bacia do rio Tietê, Botucatu/SP; bacia
do rio Mogi-Guaçu, Araras/SP; e da bacia do rio Pardo, Terra Roxa/SP. Cada bacia apresentou um cariótipo distinto
do cariótipo das demais. Entretanto todos os indivíduos apresentaram um número diplóide igual a 68 cromossomos,
sendo as fórmulas cariotípicas: 14M+16SM+12ST+26A para os exemplares de Araras, 16M+10SM+12ST+30A para
Botucatu e 14M+12SM+10ST+32A para Terra Roxa. Os resultados obtidos pela hibridação in situ fluorescente com
sonda de DNAr 18S mostraram sistema múltiplo de RONs para as populações de Araras e Botucatu. Sistema simples
de RONs foi, porém observado nos espécimes de Terra Roxa, sendo apenas o par acrocêntrico maior portador do
gene. Ainda referente ao padrão de localização cromossômica dos genes ribossômicos, identifica-se um acentuado
polimorfismo no sítio do par 18 na população de Araras, podendo este estar ausente, presente em um dos homólogos
ou presente no par cromossômico. Os resultados para o cístron 5S evidenciaram conservação do cromossomo portador
assim como de sua posição intersticial em um cromossomo submetacêntrico. Com a análise desses dados podemos
inferir que as pequenas diferenças observadas na fórmula cariotípica das populações analisadas, podem estar relacionadas
com eventos de vicariância, gerados por isolamento geográfico, uma vez que os cascudos são peixes de baixa vagilidade,
embora apresentem ampla distribuição. Essas variações seriam resultados de rearranjos não Robertsonianos, uma vez
que, é mantido o número diplóide em todas as populações conhecidas de H. ancistroides, porém ocorrem divergências
na estrutura cariotípica. Em relação ao padrão de localização de genes ribossomais, a grande variabilidade vista para o
cístron 18S é um caráter marcante para o gênero Hypostomus. O mesmo não ocorre para o gene 5S, cuja localização e
posição são conservadas; essa conservação pode indicar um marcador para a espécie, porém a análises de outras espécies
de Hypostomus revelaram o mesmo padrão de marcação. Portanto, a localização e posição do DNA 5S se apresentam,
possivelmente, como um marcador de gênero.
Apoio Financeiro: CNPq e Fapesp.
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Padronização das condições de amplificação
da técnica ISSR, para obtenção de marcadores
moleculares espécie-específicos em
populações de Hypostomus da bacia do rio Ivaí
Avanzi, VM1; Bimbato, EP1; Castro, NK1; Guedes, AAS1
Departamento de Ciências Biológicas- Centro Universitário de Maringá-CESUMAR
[email protected]
Palavras-chave: ISSR, Hypostumus, marcadores moleculares, rio Ivaí, extração de DNA
Atualmente diversas técnicas de biologia molecular têm sido utilizadas na análise genética de populações, bem como na
identificação e caracterização molecular de indivíduos. A ISSR ou SPAR (Single Primers Amplifications Reactions) tem
se mostrado eficiente na produção de padrões polimórficos informativos intraespecíficos e interespecíficos. O gênero
Hypostomus apresenta alta variabilidade interespecífica na morfologia e no padrão de cores, o que causa problemas de
identificação taxonômica no grupo, como ocorre na bacia do rio Paraná. A correta identificação de espécies e populações
é condição básica necessária para estudos de ecologia e elaboração de práticas de manejo para o grupo na região. Por
isso o objetivo deste trabalho foi padronizar as condições ideais de amplificação da técnica ISSR, utilizando DNA
de espécimes de Hypostomus coletadas no rio Ivaí para a obtenção de marcadores moleculares espécie-específicos que
possam ser utilizados para a identificação de espécimes dentro do gênero. A extração de DNA dos espécimes foi baseada
em fenol/clorofórmio e a amplificação foi realizada utilizando primers de seqüências de microssatélites. Foram obtidos
marcadores diagnósticos para 6 diferentes espécies do gênero Hypostomus do rio Ivaí, que será útil na identificação de
indivíduos na região, solucionando boa parte da problemática existente em relação à taxonomia do gênero.
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Isolamento e caracterização de regiões
microssatélites em Hypostomus
gymnorhyncus
Resende, LV1,3; Brondani, R2; Melo, DB1; Telles, MPC1; Borba, TCO2; Soares, TN1; Silva-Jr., NJ3
Laboratório de Genética & Biodiversidade, Universidade Católica de Goiás
2
Embrapa Arroz e Feijão
3
Systema Naturae – Consultoria Ambiental LTDA
[email protected]
1
Palavras-chave: ictiofauna, microssatélites, peixe, transferibilidade, PCR
As regiões microssatélites são multi-alélicos, codominantes e evoluem através de processos mutacionais decorrentes
dos escorregões da DNA polimerase (slippage) ou de crossing-over desigual. Apesar de suas altas taxas evolutivas, os
microssatélites são conservativos em suas regiões flanqueadoras e podem persistir por um longo período sem modificações.
Os marcadores microssatélites constituem a classe de marcadores moleculares mais polimórficos conhecidas atualmente.
As diversas aplicações, tais como mapeamento genético, investigação forense, análise populacional, estudos ecológicos,
paternidade e biologia da conservação, dependem, portanto do desenvolvimento de primers espécie-específicos para estas
regiões genômicas serem amplificadas através da PCR. Neste contexto, o trabalho tem por objetivo desenvolver primers
para Hypostomus gymnorhyncus, além de testar a amplificação cruzada de 46 iniciadores desenvolvidos originalmente
para outras espécies da ictiofauna. Para os testes de amplificação desses primers e da amplificação cruzada dos outros 46
primers, foram montadas reações de PCR utilizando três indivíduos, com uma amplitude de variação na temperatura
de anelamento do primers entre 45 a 68ºC. Os produtos da amplificação foram separados em gel de poliacrilamida 6%
e visualizados por coloração com nitrato de prata. Para o desenvolvimento dos primers o DNA foi extraído, a partir de
tecido muscular, de um único indivíduo. Esse DNA primeiramente sofreu fragmentação com a utilização do sonicador,
para a seleção de fragmentos de tamanho entre 1 a 2Kb, depois foi feito o tratamento das extremidades dos fragmentos
de DNA, seguida da ligação dos fragmentos de DNA com o vetor, transformação em células competentes, de acordo
com as especificações do pMOSBlue Blunt Ended Cloning Kit, fornecido pela Amersham Biosciences. Posteriormente
foram selecionados as colônias positivas, que foram colocadas para crescer, em seguida, o DNA foi extraído, produzindo
um total de 1536 clones. Desses, apenas 668 apresentaram qualidade para serem montadas as reações de PCR com o
Kit DYEnamic ET Termintor (GE Healthcare), para serem submetidos ao processo de seqüenciamento no seqüenciador
automático ABI 3100. As sequências foram depositadas no Sistema Genoma BioFoco, no qual foi realizada uma busca
por regiões microssatélites. Essa busca possibilitou o isolamento e desenho de 24 primers flanqueadores de regiões
microssatélites no genoma de Hypostomus gymnorhyncus (Hg_E01 a Hg_E24), compostas por motivos com dois a seis
nucleotídeos. Do total de locos desenvolvidos 15 produziram alelos individualizáveis, com amplitude de variação no
tamanho entre 161 e 494 nucleotídeos. Os locos foram padronizados em quatro grupos com relação às temperaturas
de anelamento: 1º) 56ºC (Hg_E05, Hg_E07, Hg_E09, Hg_E16, Hg_E17); 2º) 64ºC (Hg_E04, Hg_E18, Hg_E24);
3º) 66ºC (Hg_E02, Hg_E19) e 4º) 68ºC (Hg_E08, Hg_E11, Hg_E12, Hg_E14, Hg_E22). Os testes de amplificação
cruzada produziram resultados satisfatórios para 13 locos, disponibilizando, assim um total de 28 locos para a realização
de análises genético-populacionais em Hypostomus gymnorhyncus.
Apoio financeiro: Systema Naturae Consultoria Ambiental Ltda, PROPE/UCG.
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Estrutura genética de populações
fragmentadas do mapará Hypophthalmus
marginatus (Siluriformes) do rio Tocantins
Hernández-Ruz, EJ; Gonçalves, EC; Silva, ALC; Schneider, MPC
Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará, Campus Universitário do Guamá. Rua Augusto Corrêa, 01- CEP 66075-900
Caixa postal 8607. Bairro Guamá. Belém - Pará - Brasil
[email protected]
Desde a década de 80, o Rio Tocantins experimenta uma marcada fragmentação de hábitat relacionada à construção
da usina hidrelétrica (UHE) de Tucuruí, Pará, Brasil. Neste trabalho, foi avaliado o padrão de diversidade genética de
um fragmento do gene mitocondrial citocromo b e sua aplicação na análise da estrutura genética de populações do
mapará Hypophthalmus marginatus (Siluriformes) impactadas pela construção desta usina. Amostragens a jusante da
UHE Tucuruí foram feitas na altura das cidades de Abaetetuba (n = 26) e Cametá (n = 30) e a montante na altura de
Tucuruí (n = 24) e Itupiranga (n = 26), de onde foram tomadas as medidas de diversidade nucleotídica e haplotípica.
Uma análise da variância molecular AMOVA foi realizada incluindo-se as duas populações a jusante em um grupo e
as duas populações a montante em um segundo grupo. O alinhamento das 106 seqüências resultou em um fragmento
de 356 pares de bases, com diversidade haplotípica igual a 0,47 para somente 6 haplótipos (dois exclusivos a diferentes
populações, 1 compartilhado por todas e outros 4 compartilhados por duas ou mais populações). Com respeito à
diversidade nucleotídica, foi observado um padrão de equivalência entre Tucurui (π = 0,31) e Cametá (π = 0,37), e entre
Itupiranga (π = 0,66) e Abaetetuba (π = 0,65), que por sua vez foram aproximadamente duas vezes maiores que aqueles
das populações mais próximas da usina (Tucurui e Cametá). Não havendo evidências de maior pressão de pesca nestas
duas regiões, é provável que esta redução nos níveis de diversidade nucleotídica possa ser um efeito da construção da
UHE Tucuruí, embora isso deva ser confirmado com a análise de outras espécies. Quanto aos níveis de diferenciação
genética, com um valor de Fst igual a 0,19, a AMOVA indicou maior variação entre grupos do que dentro dos grupos
de populações, o que é congruente com um limitado ou mais provavelmente inexistente fluxo gênico entre os grupos
a montante e a jusante. Isto sugere que a fragmentação impactou negativamente as populações de mapará naquela
região. Adicionalmente, com base no conjunto de resultados deste estudo, é sugerido que estes níveis de diversidade
sejam continuamente monitorados e que medidas efetivas sejam tomadas no caso de maior redução de variabilidade
genética, em especial das populações a jusante da usina.
Apoio financeiro: CAPES; CNPq.
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Sistemática molecular de peixes da ordem
Gymnotiformes na bacia do rio Itapecuru/MA
Silva, SCR; Fraga, E; Barros, MC
Laboratório de Genética e Biologia Molecular - CESC/UEMA
[email protected]
Palavras-chave: Rio Itapecuru, Gymnotiformes, Genética, rRNA 16S, Peixes
Os peixes da ordem Gymnotiformes, comumente chamados como “sarapós” e “tubis” são peixes de água doce, originados
da América do Sul, com espécies que invadiram posteriormente a América Central, constituem um grupo interresante,
por apresentarem órgãos geradores de eletricidade localizados na pele que lhes permite formar um campo elétrico ao redor
do corpo e uma grande capacidade de regeneração quando são lesados por predadores. Atualmente o grupo é constituído
de seis famílias (Gymnotidae, Electrophoridae, Apteronotidae, Sternopygidae, Hypopomidae e Rhamphichthyidae.
É consideravelmente um grupo bastante diverso com 135 espécies válidas. O presente trabalho teve como objetivo
caracterizar os Gymnotiformes da Bacia do Rio Itapecuru. A amostragem foi constituída de espécimes obtidas ao longo
do rio Itapecuru. O DNA foi isolado utilizando-se o protocolo fenol-clorofórmio e a amplificação do rRNA 16S foi
realizada através da técnica de PCR. Os produtos da PCR foram seqüenciados utilizando-se o método didesoxiterminal.
As seqüências foram editadas e alinhadas no programa BioEdit. Seqüências foram retiradas do GenBank SSU15228/
Sternopygus sp; RSU15233/Rhamphichthys sp; AAU15226/Apteronotus albifrons e AFO72154 Apteronotus hasemani
e incorporadas na análise para verificar a similaridade genética entre este e os estoques do da bacia do rio Itapecuru.
Uma seqüência de Siluriformes foi usada como grupo externo. Um fragmento de 301 pares de bases do gene rRNA
16S foi obtido a partir de 22 seqüências de peixes da ordem gymnotiformes, distribuídos em 3 gêneros (Sternopygus,
Rhamphichthys e Apteronotus) com a seguinte composição nucleotídica 25,0 % de Timina, 23,2 % de Citosina, 29,3% de
Adenina e 22,6% de Guanina. A análise filogenética gerou árvores de Máxima Parcimônia e Agrupamento de vizinhos
com o algoritmo de Jukes-cantor. A confiabilidade dos ramos foi obtido através do bootstrap. As topologias geradas
foram bastante similares nos diferentes métodos de análise gerando três clados monofiléticos fortemente suportados
(100% de bootstrap) para cada gênero. A distancia genética variou de 10,8 a 11,7% entre Rhamphichthys e Sternopygus e
de 16,8 a 17,8% entre Rhamphichthys e Apteronotus. No entanto, valores maiores de divergência genética foi observado
entre Sternopygus e Apteronotus (18,8 %). A magnitude desta divergência corrobora o status destes gêneros em famílias
distintas como estabelecido por suas características morfológicas.
Apoio Financeiro: BNB/UEMA e UFPA.
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Filogenia de Steatogenini Alberts, 2001
(Gymnotiformes) com notas sobre sua
diversidade: DNA Barcode e marcadores
mitocondriais e nuclear
Schmitt, R1; Alves-Gomes, JA
Laboratório de Fisiologia Comportamental e Evolução – LFCE/Coordenação de Pesquisas em Biologia Aquática – CPBA/Instituto Nacional de
Pesquisas da Amazônia – INPA
[email protected]
1
Palavras-chave: D-Loop, RAG-1, peixe elétrico, espécies crípticas e Gymnotiformes
Assim como os demais exemplares da ordem Gymnotiformes (peixes elétricos sul americanos), as espécies da tribo Steatogenini
Alberts, 2001 possuem aptidão para produzir e detectar descargas elétricas alternadas de fraca intensidade no meio em que
vivem como resultado da ação direta do Sistema Eletrogênico Eletrosensório (SEE) - um mecanismo sensitivo especializado
utilizado prioritariamente durante as interações comportamentais. Ainda que esta peculiaridade seja responsável por
motivar e acumular inúmeros conhecimentos em neurobiologia, os aspectos biológicos básicos da ordem como o número
de espécies válidas, a distribuição das espécies, o relacionamento filogenético em diversos níveis taxonômicos e o número
de famílias atualmente reconhecidas têm suscitado discussões entre especialistas. A tribo Steatogenini (Hypopomidae)
congrega seis espécies distribuídas entre três gêneros (Steatogenys, Stegostenopos e Hypopygus), contudo estudos recentes
discordam com relação a seu posicionamento filogenético dentro da superfamília Rhamphicthyoidea (Rhamphicthyidae +
Hypopomidae). Sendo assim, os objetivos deste trabalho foram (1) determinar o monofiletismo da tribo Steatogenini (2)
determinar o posicionamento filogenético da mesma dentro da superfamília Rhamphicthyoidea e (3) validar o fragmento
de DNA Barcode CO-I como um marcador sensível no reconhecimento de linhagens de Gymnotiformes intimamente
relacionadas. Para tanto, foram obtidas seqüências para marcadores moleculares 12S, 16S, D-loop, CO-I e RAG-1 de
30 indivíduos (três de cada espécie da tribo e de um a dois exemplares de cada gênero dos demais representantes de
Rhamphicthyoidea). Os resultados das análises filogenéticas de Máxima Parcimônia (MP) e Máxima Verossimilhança
(MV) conduzidas no programa PAUP 4.0b10 foram consistentes na determinação de três grupos monofiléticos dentro
de Rhamphicthyoidea, sendo o monofiletismo da tribo Steatogenini confirmado com a seguinte topologia (Steatogenys
(Stegostenopos, Hypopygus)). Em relação ao posicionamento de Steatogenini dentro da superfamília, a tribo aparece inserida
junto à família Rhamphicthyidae e não junto à Hypopomidae como atualmente é reconhecida. Estes resultados concordam
com as hipóteses filogenéticas apresentadas por Alves-Gomes et al. (1995) e Sullivan (1997) e não com a proposta atual.
As análises também demonstraram o parafiletismo de Hypopygus, uma vez que o gênero Stegostenopos foi recuperado nas
topologias obtidas como grupo irmão da espécie Hypopygus neblinae discordando com os resultados de Triques, 1994
que o descreve como grupo irmão do gênero Hypopygus (H. lepturus + H. neblinae). Os resultados também identificaram
diferentes linhagens de Hypopygus lepturus com distâncias genéticas tão grandes quanto aquelas obtidas entre as duas espécies
de Hypopygus. As análises de DNA barcode realizadas foram eficientes para identificar estas linhagens confirmando sua
sensibilidade na identificação de linhagens intimamente relacionadas. Os resultados apresentados no presente trabalho
recomendam fortemente uma revisão sistemática e taxonômica do grupo incluindo a descrição de novas espécies.
Apoio financeiro: CNPq, FINEP, INPA e CAPES.
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Molecular markers based on SPAR (single
primer amplification reaction) indicate a new
species of Gymnotus (Pisces: Gymnotiformes)
from the Recôncavo Norte/BA
Araújo, TM1, Santana, TJ1, Cunha, GM1, Zuculoto, RB2, Fernandes, FMC1,2
Escola Bahiana de Medicina e Saúde Pública
Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal da Bahia
1
2
The order Gymnotiformes is a monophyletic group of electrogenic freshwater fish. It comprises five families. Gymnotus
and Electrophorus are the two genus of Gymnotidae, and Gymnotus is the most widely distributed in Neotropical region.
Gymnotus, until now, encompasses about 32 nominal species, although many undescribed species probably still exist.
The species diversity of Gymnotus is well known in the Amazon basin, but few data are available about species diversity,
distribution and population structure of this genus in other Neotropical basins. A very good species specific molecular
marker, obtained by the single primer amplification reaction (SPAR) technique, was described by Fernandes-Matioli
et al. (2000). This technique is based on polymerase chain reaction (PCR) amplification of DNA markers using single
primers of simple sequence repeats (SSR) or microsatellites. This molecular marker was named micro11. Recently, new
populations of Gymnotus had being identified from the Recôncavo Norte/BA. New patterns of micro11 amplification
were found over these populations, what might indicate the occurrence of new species of Gymnotus in the Northeastern,
Brazil. The present work outlines the first steps of an appropriate application of a molecular technique to improve the
understanding of species diversity and geographic distribution of Gymnotus species in the Recôncavo Norte/BA, an
approach which may be very useful in conservation programs involving communities of Neotropical freshwater fish.
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Estudo Populacional em Gymnotus
pantherinus (Gymnotiformes, Gymnotidae)
das pequenas drenagens costeiras do leste
e sudeste do Brasil
Baroni, S1; Almeida-Toledo, LF1
Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo
[email protected]
1
Palavras-chave: Gymnotus, filogeografia
Os peixes de água doce têm naturalmente sua distribuição fragmentada de acordo com a hidrografia, o que limita o fluxo
gênico entre populações confinadas em drenagens diferentes e acentua a divergência populacional dessas espécies. O fluxo
gênico é ainda mais limitado em populações de baixa dispersão ou que enfrentam barreiras físicas e comportamentais.
Um estudo populacional foi conduzido na tentativa de elucidar o papel relativo dos processos históricos e do atual
fluxo gênico na estruturação de populações de Gymnotus pantherinus, uma espécie que ocorre em riachos da costa leste
e sudeste do Brasil. Habitat de características peculiares, os riachos de mata atlântica apresentam uma fauna endêmica
e restritiva, que depende da floresta para sua sobrevivência. A destruição das matas provoca a descontinuidade desse
habitat, causando uma drástica redução da ictiofauna e, consequentemente, alterando o fluxo gênico das populações
naturais. No presente estudo foram amostrados 260 indivíduos, representantes de 24 localidades distribuídas desde o sul
da Bahia até Santa Catarina. Baseado no gene mitocondrial citocromo b, verificou-se a ocorrência de 37 haplótipos, com
48 sítios segregantes e 51 mutações, e diversidade haplotípica e nucleotídica igual a 0.915 e 0.01226, respectivamente.
Haplótipos exclusivos foram encontrados em 6 localidades, embora haja um notório compartilhamento de haplótipos
na região que abrange as drenagens do Alto Tietê, Alto Paraíba do Sul e sul do estado de São Paulo, Paraná e Santa
Catarina. Valores significativos de Fst foram registrados na maioria das comparações entre pares de populações, com
exceção de Santos x Juréia x Paranaguá, Ariri x Cananéia, Eng. Marcilac x Juquitiba x S. Lourenço da Serra x Natividade
da Serra. A hipótese de neutralidade não pôde ser rejeitada pelos testes de Tajima e de Fu e Li’s, sugerindo que a variação
observada seja seletivamente neutra. A relação entre os haplótipos evidencia 4 agrupamentos principais, constituídos
por: 1. Rios costeiros do sul de São Paulo, Paraná e Santa Catarina, Alto Tietê, Alto Paraíba do Sul e Alto Iguaçu; 2. Rio
de Janeiro; 3. Rios costeiros do litoral norte de São Paulo; 4. Bahia e Espírito Santo. De um modo geral, os resultados
sugerem uma acentuada estruturação entre as populações de G. pantherinus. Por outro lado, acredita-se que os eventos
de captura de cabeceiras envolvendo Alto Tietê, Alto Paraíba e riachos costeiros do litoral sul de São Paulo possam ser
responsáveis pelo contato recente e falta de estruturação verificada nessa região.
Apoio Financeiro: Fapesp; Capes.
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Um novo cariótipo indica a ocorrência
de uma espécie não descrita de Gymnotus
(Gymnotidae-Gymnotiformes)
na Amazônia Oriental
MIlhomem, SSR3; Silva, DS4; Pieczarka, JC1,2; Nagamachi, CY1,2
Laboratório de Citogenética, ICB, UFPA
2
Pesquisador do CNPq
3
Bolsista de Doutorado (CNPq) em Genética e Biologia Molecular
4
Bolsista de Mestrado (CAPES) em Genética e Biologia Molecular
[email protected]
1
Palavras-chave: Citogenética, Gymnotus, Bandeamentos, Peixe elétrico, FISH
Das 33 espécies de Gymnotus descritas atualmente, cerca de 18 já foram catalogadas na Bacia Amazônica. É um gênero
que apresenta extensa variabilidade citogenética. Com o intuito de se conhecer melhor a evolução cariotípica deste
gênero, foram estudados citogenéticamente quatro exemplares (3 fêmeas e 1 macho) de Gymnotus sp., provenientes do
Município de Capanema-Pará na Amazônia Oriental. Realizou-se experimentos de coloração convencional, bandeamento
C, CMA3 (Cromomicina A3), DAPI (4´6-Diamidino-2-phenylindole) e FISH (Hibridização in situ por fluorescência)
telomérico e com sonda de rDNA 18S. Os resultados mostram que a espécie apresenta 2n=34 ZZ/ZW (20-21M/
SM+13-14ST/A), número diplóide e sistema sexual inédito para o gênero. A Heterocromatina Constitutiva ocorre nas
regiões centroméricas de todos os cromossomos, pericentroméricas e em todo o braço curto de alguns cromossomos.
Essas regiões são ricas em pares de bases A-T, visto que são DAPI positivas. A NOR, evidenciada pela CMA3 e FISH
de rDNA 18S, ocorre no braço curto do par 15. A FISH com sondas teloméricas mostra marcações distais em todos os
cromossomos, não sendo evidenciadas marcações intersticiais (ITS), embora o número de cromossomos seja reduzido
em relação aos cariótipos de outras espécies de Gymnotus. Apesar de poucas espécies de Gymnotus terem sido estudados
citogeneticamente (21,2%), os resultados já mostram uma grande variabilidade cariotípica no gênero. Neste contexto,
a presença de cromossomos sexuais é uma característica de grande importância. Isso demonstra o grande valor dos
estudos citogenéticos como ferramenta auxiliar na identificação taxonômica, assim como nos estudos filogenéticos
dessas espécies. Em virtude dos espécimes apresentarem sistema sexual cromossômico e um número diplóide bem
diferente em relação aos outros Gymnotus, os exemplares podem ser considerados como uma nova espécie. Essa imensa
diversidade cromossômica nos instiga a investigar a evolução cariotípica deste grupo e consequentemente fazer inferências
taxonômicas e/ou filogenéticas. Um estudo morfológico e osteológico poderá complementar informações sobre o grau
de diversidade da nova espécie em relação aos demais Gymnotus.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES, UFPA.
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Evidência de sistema de cromossomos
sexuais em uma nova espécie de Gymnotus
(Teleostei: Gymnotiformes) da Bahia, Brasil
Almeida, JS; Migues, VH; Bitencourt, JA; Affonso, PRAM; Carneiro, PLS
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, Jequié, BA – Brasil
[email protected]
Palavras-chave: Gymnotidae, sistemas múltiplos, cariótipo, heterocromatina, RONs
Dentre as seis famílias da ordem Gymnotiformes, a família Gymnotidae é a mais amplamente distribuída na região
neotropical e representada por um único gênero - Gymnotus. Este gênero engloba pelo menos 18 espécies nominais
e outras ainda não descritas. As espécies de Gymnotus apresentam elevada variabilidade cariotípica, incluindo um
caso de sistemas de cromossomos sexuais em G. pantanal (sistema X1X1X2X2/X1X2Y). No presente trabalho, foi
caracterizada citogeneticamente uma espécie de Gymnotidae (Gymnotus sp.) de dois afluentes da bacia do rio de
Contas no Sul da Bahia. As análises cromossômicas envolveram coloração convencional por Giemsa, identificação das
regiões organizadoras de nucléolos (RONs) por nitrato de prata e detecção da heterocromatina por bandamento C.
Números diplóides distintos foram identificados de acordo com o sexo do indivíduo, ou seja, fêmeas apresentaram 36
cromossomos e machos apresentaram 37 cromossomos. O cariótipo das fêmeas é composto por 30 cromossomos m/
sm, e 6 st (dois pares grandes e um par portador de constrições secundárias no braço curto). Nos machos, o cariótipo
é formado por 32 cromossomos m/sm e 5 st, com três cromossomos não homólogos (1 st grande, 1 sm médio e 1
m pequeno). Constrições secundárias no braço curto do par 10 (st) também foram identificadas nos machos. Dessa
forma, essa espécie é caracterizada pela presença de um sistema de cromossomos sexuais do tipo XX/XY1Y2, onde o
cromossomo X corresponderia ao grande par de cromossomos subtelocêntricos presente nas fêmeas e sem homólogo
nos machos. Os cromossomos Y1 e Y2 seriam, respectivamente, o cromossomo sm médio e o m pequeno, também sem
homólogos, presentes exclusivamente nos machos. Os sítios de Ag-RONs foram identificados na região de constrição
secundária do par 10 em ambos os sexos. Os blocos heterocromáticos foram detectados, de forma discreta, nas regiões
centroméricas de todos os cromossomos em ambos os sexos e populações. A espécie estudada apresenta um cariótipo
altamente diferenciado, por possuir o menor número diplóide já descrito para Gymnotus (♀: 2n=36 e ♂: 2n=37) e
um sistema de cromossomos sexuais até então inédito dentro do gênero (XX/XY1Y2). No entanto, alguns caracteres
conservados para o grupo estão presentes, como RONs simples e heterocromatina constitutiva na região centromérica.
Os dados apresentados indicam que Gymnotus sp. da bacia do rio de Contas (BA) provavelmente corresponde a uma
nova espécie, ainda não descrita dentro do gênero.
Apoio: UESB, CNPq e Fapesb.
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Isolamento e análise de DNA satélite presente
em cromossomos sexuais recentes no gênero
Eigenmannia (Teleostei: Gymnotiformes)
Henning F1; Peixoto M2; Madalena CRG3; Almeida-Toledo LF2
1
Lehrstuhl für Zoologie & Evolutionsbiologie, Universität Konstanz, DE
Laboratório de Ictiogenetica, Depto de Genética e Biologia Evolutiva, USP
3
Lab. de Biol. Mol. de Dípteros, Depto de Genética e Biologia Evolutiva, USP
2
O gênero Eigenmania apresenta diversos sistemas cromossômicos de determinacao sexual de origens independentes
e recentes (<16maa). Uma das espécies, Eigenmannia virescens, apresenta um sistema XY que se diferenciou devido à
heterocromatinização do cromossomo X. A heterocromatina é geralmente composta de repetições de seqüências de DNA
satélite, onde o número de repetições é influenciado pela interação de diversos mecanismos de amplificação, deleção e
homogeneização, sendo que o acúmulo é esperado com a inibição, ou diminuição da freqüência de recombinação. Neste
estudo, o padrão geral da heterocromatina foi investigado com o intuito de caracterizar a heterocromatina presente em
grandes blocos no cromossomo X. Duas seqüências (335 e 278pb), foram isoladas por digestão de DNA genômico
utilizando HaeIII, seqüenciadas, analisadas por Southern blotting e analisadas por FISH em diversas populações.
As seqüências repetitivas isoladas não mostram similaridade entre si, ou quando comparados em bases de dados e,
provavelmente, representam os primeiros elementos repetitivos isolados em Gymnotiformes. Ambas as seqüências
mostraram padrões idênticos quando hibridadas em DNA genômico digerido com três enzimas distintas (HaeIII, SmaI
e XhoIII), sendo que um sítio para SmaI é encontrado apenas na seqüência de 335pb e um sítio de XhoI é encontrado
apenas na seqüência de 278pb mostrando que ambas são parte de uma unidade maior de repetição em tandem. Ambas
as seqüências foram hibridadas in situ, e marcaram regiões peri-teloméricas e os blocos heterocromáticos do cromossomo
X, além de regiões periteloméricas de 17 autossomos, um deles, presumivelmente o Y. A hibridação in situ em um
outro citótipo (2n=38) (população mais próxima) revelou que as seqüências isoladas estão presentes, embora restritas
a três pares de cromossomos. A distribuição destas seqüências foi ainda investigada em duas outras espécies do gênero
Eigenmannia onde se observou um grande número de cromossomos com marcações nas regiões peri-centroméricas.
Os dados aqui apresentados ilustram mais uma vez a labilidade de cromossomos sexuais em Eigenmannia (e dos peixes
em geral) e dão suporte à hipótese de que seqüências já presentes no cromossomo X foram amplificadas após inibição
da recombinação (presumivelmente por uma inversão na região peri-telomérica), levando à formacão de um par sexual
heteromórfico.
Apoio Financeiro: CNPq e FAPESP.
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Resumos do 54º Congresso Brasileiro de Genética • 16 a 19 de setembro de 2008
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Citogenética e distribuição de Eigenmannia
virescens (Sternopygidae-Gymnotiformes)
em sistemas de rios da Amazônia Oriental
Silva, DS3; Pieczarka, JC1,2; Milhomem, SSR4; Silva, PC5; Cardoso, AL6; Nagamachi, CY1,2
Laboratório de Citogenética, ICB, UFPA
2
Pesquisador do CNPq
3
Bolsista de Mestrado (CAPES) em Genética e Biologia Molecular
4
Bolsista de Doutorado (CNPq) em Genética e Biologia Molecular
5
Bolsista de Mestrado (CNPq) em Genética e Biologia Molecular
6
Bolsista de IC-CNPq
[email protected]
1
Palavras-chave: Citogenética, Eigenamnnia, FISH, Distribuição, Cromossomos sexuais
O gênero Eigenmannia Jordan & Evermann é endêmico das principais bacias hidrográficas da América do Sul (Madalena,
Orinoco, Amazonas e Paraná). As espécies deste gênero emitem descargas do órgão elétrico (DOE) em forma de onda,
úteis na comunicação e na eletrolocalização. O gênero é formado por oito espécies válidas, sendo considerado um grupo
taxonomicamente confuso devido à pequena variação morfológica entre as espécies. Estudos citogenéticos prévios em
espécies de Eigenmannia indicam variação no número diplóide, que vai de 2n=28 para populações de Eigenmannia
sp1. (Rio Mogi-Guaçu-SP) a 2n=38 para Eigenmannia virescens da Ilha do Marajó (PA), do Rio São Francisco (MG),
do Médio Amazonas (PA), do Rio Mogi-Guaçu (SP) e do Rio Tietê (SP), tendo sido descritos sistemas cromossômicos
sexuais simples do tipo ZZ/ZW e XX/XY e múltiplos do tipo X1X1X2X2/X1X2Y. Com o objetivo de conhecer melhor
a evolução cromossômica desse grupo de peixes, foram analisados espécimes de E.virescens coletados em Rios da Bacia
Amazônica no Estado do Pará, Amazônia Oriental: Rio Muruni (2 machos), Rio Guamá (2 machos) e Rio Anequara
(2 machos e 2 fêmeas). Foram realizadas as técnicas de coloração convencional, Bandeamento C (BC), impregnação
por Nitrato de Prata (Ag-NOR), Cromomicina A3, DAPI e Hibridização in situ Fluorescente (FISH) com sondas de
rDNA18S+28S e de seqüências teloméricas (TTAGGG)n. Os resultados mostram que a espécie apresenta 2n=38, sistema
ZZ/ZW (14-15M/SM+23-24ST/A). A Heterocromatina Constitutiva (HC) está presente na região centromérica de
todos os cromossomos e um grande bloco heterocromático na porção proximal do braço curto do cromossomo W nas
fêmeas. Essas regiões são ricas em pares de bases A-T, visto que são DAPI positivas. A região organizadora de nucléolo
mostra uma marcação forte na porção distal do cromossomo do par 15. A CMA3 coincide com a NOR, confirmando
que os genes de rDNA são interespaçados por seqüências ricas em G-C. A FISH com sondas de rDNA 18S + 28S
também evidenciou o par da NOR, o que confirma que estas seqüências são conservados na maioria dos vertebrados.
A FISH com seqüências teloméricas mostrou somente marcações distais, não sendo observada a presença de seqüências
intersticiais. Estudos citogenéticos no gênero Eigenmannia têm mostrado ser de grande contribuição na diferenciação
de espécies indistinguíveis morfologicamente, mas cromossomicamente bastante diferenciados.
Apoio Financeiro: CNPq, CAPES, UFPA.
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Análise meiótica em peixes elétricos
(Eigenmannia sp. 2N = 38; Pisces:
Gymnotiformes), proveniente de igarapés
de terra firme da Amazônia Oriental
Silva, PC3; Noronha, RCR4; Milhomem, SSR5; Silva, DS6; Nagamachi, CY1,2; Pieczarka, JC1,2
Laboratório de Citogenética, ICB, UFPA
2
Pesquisador do CNPq
3
Bolsista de Mestrado (CNPq) em Genética e Biologia Molecular
4
Bolsista de Fixação de Recursos Humanos na Amazônia (CNPq)
5
Bolsista de Doutorado (CNPq) em Genética e Biologia Molecular
6
Bolsista de Mestrado (CAPES) em Genética e Biologia Molecular
1
Palavras-chave: Eigenmannia, sistema XX/XY, meiose, corpo sexual
Os Gymnotiformes são os peixes elétricos da região Neotropical. Os representantes desta ordem são encontrados com
grande abundância e diversidade, principalmente na bacia Amazônica. Os gêneros que apresentam a maior diversidade
cariotípica são Gymnotus e Eigenmannia tanto no que se refere às variações no número, como na estrutura dos
cromossomos. Cromossomos sexuais foram observados em três famílias: Sternopygidae, Hypopomidae e Gymnotidae,
sendo encontrados sistemas do tipo XX/XY com a heterocromatinização do X, ZZ/ZW e sistemas sexuais múltiplos.
Ao contrário de aves e mamíferos, de uma forma geral os peixes não apresentam cromossomos sexuais, sendo estes
observados esporadicamente e sem nenhuma correlação filogenética entre as espécies que os possuem. Portanto concluise que estes sistemas surgiram de forma independente e repetidas vezes durante a evolução dos peixes. Em nossos
estudos Eigenmannia sp proveniente do município de Capanema-PA, apresenta 2n= 38 com a fórmula cariotípica
13M/SM+25ST/A e NF=51. Com o objetivo de descrever o comportamento meiótico, identificar a possível formação
da vesícula sexual (VS) e caracterizar o tipo de sistema sexual nesta espécie, foram feitas análises com coloração
convencional de vários sub-estágios meióticos. Nas células em leptóteno e zigóteno pode-se observar que a condensação
mais acentuada de um dos bivalentes caracteriza a formação da VS do tipo XY, a qual apresenta um comportamento
precoce em relação aos bivalentes autossômicos. No paquíteno inicial a VS geralmente forma uma alça em forma de 9
(nove), onde provavelmente a região em anel representa os segmentos não homólogos do bivalente. No paquíteno tardio
a VS apresenta-se bem mais condensada, semelhante ao comportamento do corpo sexual de células de mamíferos. As
células diplotênicas foram observadas com 19 bivalentes, 18 autossômicos com quiasmas dispostos em vários pontos
ao longo dos bivalentes e 1 bivalente sexual. A figura do bivalente sexual destaca uma região de homologia média entre
os eixos de X e Y. Assim, considera-se que nos cromossomos sexuais de Eigenmannia desenvolveram-se mecanismos
que bloqueiam a recombinação gênica dentro de determinados segmentos cromossômicos, provavelmente aqueles onde
se situam genes relacionados ao mecanismo de diferenciação sexual. Quando os cromossomos formam o bivalente na
meiose, observa-se que uma parte do par cromossômico permanece não-pareada (XY), constituindo os genes diferenciais,
enquanto o restante dos cromossomos pareia normalmente (segmentos homólogos). Esses resultados confirmam o
sistema sexual do tipo XX/XY em Eigenmannia sp.
Apoio Financeiro: CNPq, CAPES, UFPA.
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Variabilidade genética de Microsternarchus
bilineatus (Gymnotiformes: Hypopomidae)
em diferentes tributários no Rio Negro,
Amazônia, Brasil
Maia, CR1; Alves-Gomes, JA1; Schmitt, R1
Laboratório de Fisiologia Comportamental e Evolução (LFCE)/Coordenação de Pesquisas em Biologia Aquática (CPBA)/Instituto Nacional de
Pesquisas da Amazônia (INPA)
[email protected]
1
Palavras-chave: peixes elétricos, DNA mitocondrial, região controle, espécies crípticas e filogenia
A ordem dos peixes elétricos Neotropicais, os Gymnotiformes, apresenta distribuição restrita à região Neotropical,
alcançando maior diversidade e abundância na bacia Amazônica. O gênero Microsternarchus é classificado dentro
da família Hypopomidae e apresenta apenas uma espécie nominal descrita, denominada Microsternarchus bilineatus
Fernández-Yépez, 1968. No entanto, estudos recentes, fundamentados principalmente na Descarga do Órgão Elétrico
(DOE), sugerem que o gênero Microsternarchus pode apresentar espécies ainda não descritas. Com o objetivo de se
verificar se os diferentes padrões de descarga se constituem em linhagens geneticamente diferenciáveis, e de se obter uma
estimativa da variabilidade genética da região controle (D-Loop) de Microsternarchus bilineatus, foram selecionados para
este estudo indivíduos de quatro tributários localizados ao longo do alto e médio rio Negro: Mapí (N = 10) e Aduiá (N
= 12) na margem esquerda e Açaituba (N = 17) e Quimicuri (N = 10) na margem direita, totalizando 49 indivíduos.
A extração de DNA foi realizada seguindo o protocolo de fenol-clorofórmio com modificações e a amplificação dos
fragmentos de DNA foi realizada pela técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) com os primers FTTF e 12SR1. A
leitura automática dos fragmentos foi realizada no seqüenciador de DNA MegaBACE 1000 (GE-Healthcare) após um
tratamento de precipitação, para a eliminação do produto não incorporado durante a reação de seqüenciamento. Depois
de conferidas e editadas, as seqüências foram alinhadas manualmente no programa BIOEDIT 6.0.7 e submetidas a
análises filogenéticas e de diversidade genética com o auxílio dos programas PAUP 4.0b10, MEGA 3.1 e ARLEQUIN
2.0. A topologia obtida pelo método da Máxima Parcimônia (MP) recuperou pelo menos três grupos monofiléticos
distintos, separando os indivíduos do alto rio Negro (tributários Mapí e Açaituba) dos indivíduos do médio rio Negro
(Aduiá e Quimicuri). A divergência genética entre estes grupos mostra valores elevados, sugerindo que Microsternarchus
necessita de uma revisão taxonômica com a descrição de novas espécies. A Análise de Variância Molecular (AMOVA)
mostrou valores significativos de variabilidade genética entre as localidades (FST = 0,7664), sugerindo uma estruturação
genética para a espécie. Os valores de FST evidenciados entre os pares de localidades, corroborados pelo número de
migrantes (Nm) entre as mesmas, mostram fluxo genético entre as localidades do alto rio Negro (Açaituba e Mapí),
porém isolamento genético entre estes dois tributários e os tributários do médio rio Negro (Aduiá e Quimicuri).
Esta análise também indica fluxo genético entre os tributários Aduiá e Quimicuri, ainda que menos evidente. Estes
resultados indicam a necessidade de uma revisão sistemática do grupo e chamam atenção para um problema que tem
se tornado comum, a subestimativa da biodiversidade amazônica, uma vez que o conhecimento da biologia das espécies
é fundamental para políticas públicas de manejo e conservação.
Apoio financeiro: CNPq, FINEP e INPA.
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Descrição cariotípica de Steatogenys
elegans Steindachner, 1880 (Hypopomidae,
Gymnotiformes), uma espécie de peixe
elétrico da Amazônia Oriental
Cardoso, AL1,3; Pieczarka, JC1,2; Milhomem, SSR.1,4; Silva, DS1,5; Nagamachi, CY1,2
Laboratório de Citogenética, ICB, UFPA – Belém
2
Pesquisador CNPq
3
Bolsista IC – CNPq
4
Bolsista Doutorado – CNPq em Genética e Biologia Molecular
5
Bolsista Mestrado CAPES em Genética e Biologia Molecular
1
Palavras-chave: Citogenética, Steatogenys, Bandeamentos cromossômicos, FISH, Gymnotiformes
O gênero Steatogenys é constituído por três espécies (S. duidae, S. elegans, S. ocellatus) de ocorrência na bacia Amazônica e que
se caracterizam pela presença de um focinho curto, cabeça arredondada, boca subterminal, padrão de pigmentação bastante
característico e um órgão elétrico acessório na região humeral e submental na forma de filamento. Além disso, esses peixes
compartilham com os demais Gymnotiformes a presença de um sistema eletrogênico-receptivo utilizado na comunicação,
forrageio, navegação e detecção de objetos. Até o presente momento, dados citogenéticos conhecidos são restritos a espécie
S. duidae. Portanto é necessário conhecer as características cromossômicas das demais espécies desse gênero. Com este intuito
descrevemos neste trabalho as características cromossômicas de um macho da espécie Steatogenys elegans, proveniente do
Rio Anequara (01°40’42.6”S, 049°00’16.6”W), Município de Abaetetuba, no Estado do Pará, Brasil. Foram realizadas as
técnicas de Bandeamento C, Ag-NOR, Cromomicina A3 (CMA3), DAPI e FISH com sondas de rDNA 18S. Os resultados
mostram um número diplóide (2n) igual a 50 cromossomos, divididos em dois grupos: meta-submetacêntricos (M-SM)
(6 pares) e acrocêntricos (19 pares) com o número fundamental (NF) = 62. A distribuição da heterocromatina constitutiva
(HC) é centromérica em todos os cromossomos. Além disso, foi observado um bloco heterocromático intersticial no braço
longo do par 1 e um bloco na região proximal no braço curto de dois pares de M/SM. A marcação Ag-NOR mostra que
apenas os sítios de rDNA de um par dos homólogos exercem função transcricional durante a intérfase e aponta que a Região
Organizadora de Nucléolo (NOR) está localizada no braço curto do 2º par. A Hibridização in situ fluorescente com sondas
de rDNA 18S indica que um dos cromossomos portadores da NOR possui o sítio localizado na região intersticial, e no
outro cromossomo do par, a NOR é também intersticial, entretanto é dividida em dois segmentos que são intercalados por
um segmento cromossômico. Esse heteromorfismo pode ser explicado por uma possível inversão paracêntrica envolvendo
os sítios de rDNA. O fluorocromo GC específico CMA3 marcou regiões coincidentes com a HC (com exceção do 5° par)
e regiões intersticiais e/ou terminais de alguns cromossomos. A CMA3 marcou também a NOR, mostrando que genes de
DNA ribossômico (rDNA) são interespassados por seqüências ricas em GC. O fluorocromo AT específico DAPI marcou
a região pericentromérica do 5º par cromossômico. Os resultados encontrados para CMA3 e DAPI são incomuns entre os
Gymnotiformes. Considerando-se os resultados encontrados, podemos concluir que a análise citogenética é uma ferramenta de
grande valor para o conhecimento da biodiversidade, para a identificação das espécies, bem como para futuros entendimentos
sobre os processos evolutivos cromossômicos e conseqüentemente sobre as relações filogenéticas entre essas espécies.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES e UFPA.
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Herança genética da coloração vermelha
em tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus)
de stirling e seu valor para produção de
alevinos ornamentais
Zagolin, GB; Hilsdorf, AWS
Núcleo Integrado de Biotecnologia, Laboratório de Genética de Peixes e Aqüicultura, Universidade de Mogi das Cruzes.
[email protected]
Palavras-chave: Herança genética, Tilápia Vermelha, Peixes ornamentais, Piscicultura, O. niloticus
Na América do Sul, a criação de peixes ornamentais em cativeiro tem sido pouco explorada, provavelmente pelo fato
que grande parte desse comércio é proveniente de extrativismo. Por essas razões existe uma busca contínua por novas
espécies com um bom desempenho como peixe ornamental, ou seja, que apresentem requisitos importantes como,
resistência a condições de confinamento e colorações variadas que as tornem atrativas para a aqüariofilia Um exemplo de
organismo com essas características é a tilápia vermelha que é uma variedade mutante da espécie Oreochromis niloticus
descoberta em Taiwan em 1968. Com base nesses dados esse trabalho teve como objetivo estudar a herança genética do
fenótipo vermelho na espécie Oreochromis niloticus em cruzamentos entre uma variedade vermelha (Red-Stirling) e uma
selvagem (Chitralada), buscando avaliar o padrão de manchas nas tilápias vermelhas produzidas, que podem ser mais
bem aceitas pelo comércio de peixes ornamentais. Foram então adotados os seguintes cruzamentos para o estudo de
herança: Red-Stirling x Chitralada, entre os híbridos F1 (Red-Stirling x Red-Stirling), retrocruzamento 1 (Red-Stirling
com F1) e retrocruzamento 2 (Chitralada com F1). A razão de segregação dos fenótipos foi obtida de alevinos com um
mês cuja coloração do corpo foi examinada em com lupa e separada em selvagem (preta), vermelha (vermelha) e vermelha
com manchas pretas no corpo. Em relação à segregação fenotípica, para geração parental vermelho x selvagem toda a
progênie apresentou fenótipo vermelho. Já o resultado do cruzamento F1 x F1 gerou uma progênie com 294 alevinos
de fenótipo selvagem e 102 de fenótipo vermelha. O teste de χ2 (0,1185, p<0,05) não mostrou desvio significativo da
proporção 3:1 na F2. O retrocruzamento 1 apresentou uma progênie toda composta de indivíduos vermelhos (1457) e
o retrocruzamento 2 uma segregação fenotípica de 2048 vermelho e 1697 selvagens (χ2= 33, p>0,05). Para esta última
segregação, esperava-se uma razão de 1:1, o resultado significativo de χ2 talvez possa ser explicado pela mortalidade
de indivíduos antes da coleta. Contudo os resultados obtidos corroboram a hipótese de uma herança mendeliana para
o fenótipo vermelho, sendo este dominante sobre o selvagem. Dos cruzamentos mencionados o que apresentou uma
maior variedade de indivíduos com mancha foi o vermelho puro com o selvagem (selvagem 0, vermelho sem mancha
0 e vermelho manchado 100%). Já o F1 x F1 apresentou: fenótipo selvagem 25,76%, vermelho sem mancha 30,56%,
vermelho manchado 43,69%. O R1 apresentou: selvagem 0, vermelho manchado 45,22% e vermelho sem mancha
54,77% e o R2 apresentou: vermelho manchado 7,29%, vermelho sem mancha 47,40% e selvagem 45,31%). Desta
forma, um programa de seleção genética de indivíduos manchados para aqüarofilia deve ser iniciado com o cruzamento
vermelho puro com chitralada que apresentou uma variação maior de padrões de manchas.
Apoio: FAEP.
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Baixo nível de diversidade genética em
um cianídeo (Cynoscion acoupa) muito
explorado na costa norte do Brasil
Rodrigues, R1; Schneider, H1; Santos, S1; Vallinoto, M1; Saint-Paul, U2; Sampaio, I1
Laboratório de Genética e Biologia Molecular, Instituto de Estudos Costeiros, Universidade Federal do Pará, Campus de Bragança
2
Center for Marine and Tropical Ecology, Fahrenheitstr, Bremen, Germany
[email protected]
1
Palavras-chave: Pescada amarela, Cianídeo, D-loop, Diversidade genética, Costa Norte
A pescada amarela (Cynoscion acoupa – Sciaenidae) é um peixe marinho e estuarino-dependente, encontrado no Atlântico
Ocidental do Panamá até a Argentina, sendo o cianídeo mais explorado na costa norte do Brasil (Cervigón et al., 1993;
Menezes & Figueiredo, 1980). Neste estudo, seqüências da região controle do DNA mitocondrial (D-loop) de 297
indivíduos coletados na costa norte do Brasil (Pará e Amapá) entre Dezembro de 2003 e Agosto de 2005 foram utilizadas
para avaliar o nível de diversidade genética da pescada amarela na costa norte brasileira. O DNA foi isolado pelo método
com fenol/clorofórmio, a amplificação dos fragmentos de D-loop foi feita através da PCR, e o seqüenciamento no ABI
377. Para cada ano foi verificada alta diversidade haplotípica (h= 0,87; 0,89 e 0,90) e diversidade nucleotídica muito
baixa (π = 0,002). A AMOVA não mostrou diferença entre as amostras dos diferentes anos, indicando ausência de
estruturação genética e a presença de um único estoque de C. acoupa dentro da área amostrada. A árvore de agrupamento
de vizinhos dos 83 haplótipos mostrou uma topologia não resolvida com nenhum suporte estatístico, apresentando uma
filogenia do tipo estrela. Parâmetros de expansão demográfica (SSD, índice de Raggedness, Theta), testes de neutralidade
(D = -1,82; Fs = -16, 62, P < 0,05) e a curva de distribuição par-a-par unimodal são consistentes com a hipótese de
expansão demográfica súbita para esta população. A variabilidade genética da pescada amarela (expressa por h e π) foi
muito baixa quando comparada com de outros peixes também bastante explorados no oeste do atlântico e leste da Ásia.
As estimativas de diversidade haplotípica de C. acoupa foram 10 a 15% mais baixa do que as registradas em outros
estudos, enquanto, a diversidade nucleotídica foi 3 a 10 vezes inferior. Identificar os fatores responsáveis pelo baixo nível
de diversidade genética encontrado no estoque de C. acoupa não é simples, porém, a sobre-exploração pode ser um dos
fatores, pois as capturas têm declinado progressivamente ao longo dos últimos anos. Esses resultados demonstram a
necessidade de monitoramento para C. acoupa e a preservação dos estuários dentro deste alcance geográfico, considerando
que esta espécie depende do ecossistema estuarino durante parte do seu ciclo de vida.
Apoio financeiro: UFPA, CNPq.
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Mapeamento cromossômico da espécie
Pithecia irrorata por bandeamentos
cromossômicos e Zoo-Fish
Finotelo, LFM3; Amaral, PJS4; De Oliveira, EHC1; Pissinatti, A5; Rissino, JD1; Pieczarka, JC1, 2; Nagamachi, CY1, 2
Laboratório de Citogenética-UFPA
2
Pesquisador CNPq
3
Bolsista de Doutorado (FAPESPA) Neurociência e Biologia Celular
4
Bolsista de Doutorado (FAPESPA) Genética e Biologia Molecular
5
Centro de Primatologia do Rio de Janeiro
[email protected]
1
Palavras-chave: Citogenética, Primatas, Pitheciinae, Pintura Cromossômica
A subfamília Pitheciinae é constituída de três gêneros: Pithecia com cinco espécies, Chiropotes e Cacajao com duas
espécies, cada. Estes gêneros incluem espécies ameaçadas de extinção, com distribuição geográfica restrita à região
amazônica. Conhecidos vulgarmente como parauaçus, os animais do gênero Pithecia são de pequeno a médio porte,
frugívoros, que vivem em grupos que raramente ultrapassam quatro indivíduos, formando famílias monogâmicas que
dificilmente são encontradas em associação com outras espécies. No presente trabalho foi analisado o cariótipo da espécie
Pithecia irrorata por citogenética clássica (bandeamentos G, C e NOR) e molecular (FISH com sondas teloméricas
e com sondas cromossomo-específicas humanas). Os resultados obtidos permitiram determinar as características
cromossômicas da espécie em estudo, além de permitir uma análise cromossômica comparativa entre a mesma e
Chiropotes utahicki, observando assim suas homeologias e diferenças cariotípicas, além de contribuir para uma melhor
definição da filogenia desse grupo. A espécie P. irrorata apresenta 2n=48 (nove pares mais o X de dois braços e os 14
pares acrocêntricos), enquanto que C. utahicki apresenta 2n=54. Os resultados da citogenética clássica em P. irrorata
revelam que a heterocromatina constitutiva (HC) ocorre em pequenas quantidades na região centromérica de todos
os cromossomos e intersticial do par acrocêntrico 18 e que a NOR é múltipla, ocorrendo na região proximal do braço
longo de pelo menos três pares acrocêntricos. A FISH telomérica mostra ausência de seqüência intersticial (ITS). Os
experimentos com sondas cromossomo-específicas humanas (22 autossomos e o cromossomo X) evidenciaram 32 sinais
de marcação no conjunto haplóide de P. irrorata, sendo que 14 autossomos mais o X apresentam sintenia conservada
(oito pares hibridizando um cromossomo inteiro e seis em associação com outros cromossomos) e os oito restantes
fornecem sinais múltiplos em diferentes cromossomos de P. irrorata. Os resultados demonstram ainda que, semelhante
ao observado em C. utahicki, única espécie de pitecíneo com dados de pintura cromossômica, P. irrorata apresenta
todas as associações encontradas no suposto cariótipo ancestral dos Primatas do Novo Mundo. A análise comparativa
mostra que a diferença entre os cariótipos das duas espécies deve-se a múltiplos e complexos rearranjos cromossômicos,
tais quais, fusões e fissões cêntricas, inversões paracêntricas e pericêntricas, fusões in tandem e translocação simples, do
tipo Y autossomo.
Apoio financeiro: UFPA-FAPESPA.
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Comparação molecular de populações
naturais de “jaú” (Zungaro) das bacias
Amazônica e do Paraná-Paraguai
Boni, TA; Prioli, AJ; Prioli, SMAP; Lúcio, LC; Maniglia, TC
Laboratório de Genética, Universidade Estadual de Maringá
[email protected]
Palavras-chave: Zungaro; D-loop; ATPase 6; diferenciação molecular; Bacia do Paraná-Paraguai, Bacia Amazônica
O peixe conhecido popularmente por “jaú” pertence ao gênero Zungaro e tem grande importância pesqueira e econômica
no Brasil. Além de ser um dos maiores peixes migradores do país, têm sua distribuição ao longo das bacias Amazônica
e do Paraná-Paraguai. Este sempre foi um peixe encontrado com relativa abundância na bacia do Paraná-Paraguai,
mas após a construção de uma série de barragens no rio Paraná tem-se registrado uma diminuição do tamanho efetivo
dessa população. Além disso, esse grupo apresenta sérios problemas taxonômicos, como constantes mudanças no
nome científico dos mesmos. Neste trabalho foram caracterizadas molecularmente populações de “jaú” das bacias do
Paraná-Paraguai e Amazônica, para auxiliar na resolução de problemas taxonômicos, além de gerar informações, que
são quase inexistentes, sobre a diversidade genética das populações naturais desse gênero. Foram analisadas as seqüências
mitocôndrias de quatro indivíduos do rio Manso e três do rio Tocantins para a região do D-loop (~355 pb), e de 11
indivíduos do rio Manso e 5 do rio Tocantins para a região da ATPase 6 (~204 pb). O número de nucleotídeos polimórficos
e as distâncias-p foram calculados com o programa MEGA 4.0. Com os programas PAUP 4.0 e Modeltest 3.7 foram
selecionados os modelos evolutivos, utilizando-se os procedimentos Akaike Information Criterion corrigido (AICc) e
Bayseian Information Criterion (BIC). Os valores de distância genética obtidas com D-loop e ATPase 6, tanto com a
distância p quanto com a distância HKY + I, são consistentes em indicar diferenciação genética entre as populações de
Zungaro do rio Tocantins e do rio Manso. Ainda, a magnitude da divergência encontrada está em patamar equivalente
ao registrado na literatura entre muitas espécies próximas entre si. Com as diferenciações nos níveis encontrados nesse
trabalho, é possível concluir que as populações das bacias Amazônica e do Paraná-Paraguai estão isoladas geograficamente
por tempo suficiente para que ocorresse a especiação. Portanto, é inevitável concluir que a população de Zungaro da
bacia do Paraná-Paraguai não pertence à espécie de Zungaro zungaro da bacia Amazônica, mas sim à espécie Z. jahu.
Esse fato torna-se de importância elevada, pois a espécie de “jaú” encontrada na bacia do Paraná-Paraguai está sob o
risco de extinção local. Assim, outros estudos da diversidade genética dessa espécie tornam-se imprescindíveis para que
possam ser propostas ações que possibilitem a recuperação da diversidade genética de Z. jahu.
Apoio Financeiro: CAPES, NUPELIA/UEM.
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Descoberta de sistema de cromossomos
sexuais XY em citótipo 40F de traíra
Hoplias malabaricus (Bloch, 1794)
(Teleostei: Erythrinidae)
Santos, U; Dergam, JA
Laboratório de Sistemática Molecular Beagle, Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
Palavras-chave: citogenética, evolução cariotípica
Hoplias malabaricus é considerado um complexo de espécies devido à sua grande variabilidade cariotípica. Os padrões
cariotípicos podem revelar eventos de vicariância e da história paleohidrológica das bacias, auxiliando na compreensão
dos mecanismos responsáveis pelos padrões biogeográficos atuais. Na revisão mais abrangente sobre citótipos, Bertollo
et al. (2000) reconheceram sete citótipos (nomeados de A-G) para este complexo de espécies. No rio São Francisco
ocorrem populações 2n=40, classificadas como 40F pela morfologia dos pares cromossomos e até o presente, sem
cromossomos sexuais identificados. No presente trabalho identificamos a presença de sistema XY para o citótipo 40F
em populações coletadas no rio Pandeiros e Pará, ambos afluentes do leste e do sul respectivamente da bacia do rio
São Francisco. A metodologia utilizada seguiu protocolos para obtenção de cromossomos metafásicos de Bertollo et al.
(1978), bandamento-C segundo Sumner (1972) e DAPI por Schweizer (1976). Ambas as populações apresentaram
2n=40 e morfologia compatível com o citótipo 40F. O padrão de heterocromatina constitutiva é similar ao registrado
na população de Três Marias indicado por Dergam e Bertollo (1990), exceto pela presença de um bloco heterocromático
num membro do primeiro par de metacêntricos nos machos. Este padrão foi reproduzido em marcações negativas pela
técnica de DAPI. Devido a este padrão de marcação ocorrer apenas nos machos, este padrão foi interpretado como
um sistema de cromossomos sexuais XY não detectado por Dergam e Bertollo (1990) na represa de Três Marias. Neste
trabalho os braços cromossomos encotram-se sobrepostos, não permitindo a identificação da existência deste sistema de
cromossomos sexuais nesta população. A extensa região entre os rios Pandeiros e Pará inclui a represa de Três Marias e
portanto, é provável que este sistema de cromossomos sexuais caracterize as populações 40F da bacia do São Francisco.
Numa escala continental, outro citótipo com o sistema de cromossomos sexuais envolvidos com o primeiro par do
cariótipo é o citótipo G com fêmeas 2n=40 e machos 2n=41 e sistema sexual XX/XY1Y2. Este citótipo ocorre na bacia
amazônica nos rios Trombetas, Madeira e Aripuanã (Bertollo et al., 2000) e apresenta um grande primeiro par de
metacêntricos, sendo todos os autossomos semelhantes ao citótipo 40F. Considerando que em ambos citótipos o sistema
de cromossomos sexuais envolve o primeiro par de metacêntricos e que os autossomos apresentam-se morfologicamente
semelhantes, sugerimos que a macroestrutura do 2n=40F representa um estado de caráter pleisomórfico e o citótipo
G, a condição derivada. Conforme esta hipótese, os cromossomos Y1 Y2 originaram-se de fissão do cromossomo sexual
masculino (identificado pela banda-C e DAPI), seguida por uma inversão pericentromérica no cromossomo Y2. Esta
hipótese é consistente com a dados moleculares preliminares que indicam alto grau de parentesco filogenético entre o
citótipo 40F e outros haplótipos da bacia amazônica.
Apoio Financeiro: PAPq e CNPq.
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Análise citogenética em peixes recifais
(famílias Pomacentridae e Serranidae) da
costa da Bahia, Brasil
Ribeiro, MS; Almeida, LAH; Almeida, JS; Affonso, PRAM; Silva Jr., JC; Carneiro, PLS
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, Jequié, BA – Brasil
[email protected]
Palavras-chave: Perciformes, dispersão, cariótipo, heterocromatina, RONs
A ordem Peciformes, apesar do grande número de espécies, dispõe de poucos estudos citogenéticos, os quais abrangem
cerca de somente 10% das espécies conhecidas. Os estudos para peixes marinhos são ainda mais escassos. Este trabalho
tem como objetivo caracterizar citogeneticamente duas espécies da Perciformes (Stegastes fuscus, família Pomacentridae, e
Epinephelus adscensionis, família Serranidae) associadas a áreas recifais em Barra Grande, Baía de Camamu, no sul da Bahia,
região caracterizada por uma grande diversidade de ictiofauna, praticamente desconhecida do ponto de vista genético.
Os exemplares dessas espécies foram coletados por mergulho livre e a estimulação mitótica foi realizada pela inoculação
de suspensão de levedura. Os cromossomos mitóticos foram obtidos pelo método direto, utilizando o rim anterior, e
visualizados através de técnica convencional de coloração com Giemsa, bandamento C e impregnação por nitrato de
prata (Ag-RON). As análises cromossômicas em S.fuscus e E. adscensionis revelaram um valor diplóide modal igual a 2n
= 48 para ambas. S.fuscus apresentou uma fórmula cariotípica de 20m+22sm+6a (NF=90), revelando a ocorrência de
múltiplas inversões pericêntricas em relação ao cariótipo considerado primitivo para a ordem (2n=48a). O cariótipo de
E. adscensionis é constituído exclusivamente por cromossomos acrocêntricos (NF=48), seguindo o padrão comumente
descrito para serranídeos. A técnica de bandamento C detectou, em E. adscensionis, blocos heterocromáticos nas regiões
centroméricas de todos os cromossomos, enquanto S.fuscus apresentou marcações centroméricas e teloméricas. As regiões
organizadoras de nucléolos (RONs) são simples nas duas espécies analisadas, ocupando posição intersticial no braço
curto do primeiro par de submetacêntricos em S. fuscus e intersticial no braço longo de um par de acrocêntricos em.
E. adscensionis. Os dados apresentados são semelhantes aos disponíveis para outras populações dessas espécies na costa
do Rio Grande do Norte (a cerca de 1.400km de distância), reforçando o caráter conservado dos padrões cariotípicos
intra-específicos em peixes marinhos, possivelmente associados à capacidade de dispersão das espécies.
Apoio: UESB, CNPq e Fapesb.
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Estimativa da variabilidade genética
da garoupa vermelha (Epinephelus
morio, Serranidae) de população
da Costa Norte do Brasil
Azevedo, LS; Silva-Oliveira, GC; Rêgo, PS; Sampaio, I; Scheneider, H; Vallinoto, M
Instituto de Estudos Costeiros, Campus de Bragança, Universidade Federal do Pará
[email protected]
Palavras-chave: garoupa vermelha, Epinephelus morio, Cit b, genética de populações, Near Threatened
O Epinephelus morio (Valenciennes, 1828) habita águas tropicais e subtropicais do oceano Atlântico, ocorrendo desde
a Carolina do Norte, nos EUA, até o Sul do Brasil. É um peixe de grande longevidade, que pode atingir cerca de 30
anos. Os adultos são encontrados em águas profundas de até 300m, contudo, durante a época reprodutiva deixam as
profundezas e deslocam-se para águas mais rasas próximas à praia para desovarem. Possuem maturação sexual tardia, sendo
as fêmeas aos quatro anos e os machos por volta dos 11. Diferentemente de outras espécies de Epinephelus, E. morio não
forma agregados reprodutivos, no entanto é durante a época de reprodução que é capturado em grandes quantidades.
Esta captura desordenada ocasionou a sobre-exploração destes estoques em algumas áreas do Golfo do México e nos
EUA, onde ocorreu redução de 50% nos últimos 55 anos, e no Brasil esse declínio chega a 89%. A inserção da espécie
na categoria Near Threatened (NT) pela IUCN, alerta quando a sua vulnerabilidade, pois a extração exarcebada de
indivíduos acentua a problemática que envolvem espécies hermafroditas protogênicas e que possuem longo tempo de
geração. Considerando a carência de estudos genéticos populacionais para esta espécie, o objetivo deste trabalho foi
estimar a variabilidade genética de uma população de E. morio da Costa Norte do Brasil. Foram seqüenciados cerca
de 395pb do gene Cit b do mtDNA de 39 exemplares de E. morio provenientes de empresas de pesca do Municipio
de Bragança, Pará. Identificaram-se seis sítios variáveis, sendo dois informativos e um total de sete haplótipos, sendo
o mais freqüente com 30 indivíduos e quatro únicos. Os indices de diversidades genética foram baixos (h= 0.4076 ±
0.097; π= 0.001 ± 0.001) e os testes de neutralidade identificaram desvios do equilíbrio neutro, apresentando valores
negativos e significativos. O modelo de expansão foi rejeitado e o gráfico de diferenças par a par mostrou uma curva
em L. De acordo com os dados da literatura para outras espécies de serranídeos, os valores de diversidade estão entre
os mais baixos observados. Sendo assim, futuros trabalhos devem incluir outras populações para a confirmação dos
possiveis efeitos da pesca sobre este importante item da pesca nas diferentes regiões brasileiras.
Apoio financeiro: CNPq-PIBIC.
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Variabilidade genética da espécie Epinephelus
itajara (Serranidae) da Costa Norte e
Nordeste do Brasil através de análises do
mtDNA: Implicações para a conservação
Silva-Oliveira,GC; Azevedo, LS; Rêgo, PS; Nunes, ZMP; Sampaio, I; Schneider, H; Vallinoto, MS
Instituto de Estudos Costeiros, Campus de Bragança, Universidade Federal do Pará
[email protected]
Palavras-chave: Mero, Epinephelus itajara, Goliath grouper, DNA mitocondrial, conservação
O mero (Epinephelus itajara) é uma espécie de peixe criticamente ameaçada de extinção. Apresenta grande porte,
chegando a medir 2,5 metros e pesar 400 quilos. Ocorre em águas tropicais e subtropicais do Oceano Atlântico e Pacífico
e no Brasil do Amapá a Santa Catarina, sendo considerado um importante item para a pesca comercial e esportiva.
Geralmente, abriga-se em cavernas, embarcações naufragadas e recifes de corais a mais de 40 metros de profundidade,
o que dificulta a sua captura. Contudo, durante a época reprodutiva, são facilmente capturados nas regiões estuarinas,
onde formam agregados reprodutivos para desovarem. É durante esta época que ocorre a captura em massa da espécie,
considerada a principal causa do declínio populacional. Estimativas mostram que as populações de mero podem sofrer
redução de 80% nos próximos 10 anos. Diante desse cenário, o propósito deste estudo foi estimar a variabilidade
genética, identificar padrões migratórios e estabelecer aspectos estruturais e demográficos de populações de E. itajara
do Norte e Nordeste do Brasil a partir de seqüências da região controle do mtDNA. Após sequenciamento de 499 pb
da porção 3’ da região controle de 116 exemplares, foram identificados 17 sítios variáveis e 8 informativos. Estes sítios
geraram 27 haplótipos: 4 bem representativos e 15 únicos. Os índices de variabilidade genética (h=0.80; π=0.004)
foram inferiores ou similares aos encontrados para outras espécies aparentadas e também ameaçadas como Epinephelus
marginatus. As populações do Norte do Brasil apresentaram maior diversidade, que pode ser reflexo da boa conservação
dos manguezais dessa região. Apesar de haver diferenças de Φst observada na AMOVA, nenhuma estrutura de grupo
analisadas foi significativa. No entanto, o NCA revelou uma associação significativa entre a variabilidade genética e
a distribuição geográfica entre as populações analisadas. Indícios de sobrepesca puderam ser evidenciados através de
análises de flutuações demográficas em localidades da Costa Nordeste. Desta forma, medidas de manejo e conservação
devem ser implementadas, considerando os níveis de variabilidade genética e de estruturamento dos estoques. Tais
ações, somadas à preservação dos manguezais e dos pontos de agregação reprodutiva, além de uma política de controle
de pesca, são aspectos chave na elaboração de futuros projetos de conservação para esta espécie.
Apoio financeiro: CNPq; CNPq-PIBIC.
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Caracterização de marcadores moleculares
para análise genética de populações de
peixes migratórios do rio Pará (Brasil)
Barroca, TM¹; Estanislau, A¹; Carmo, AO¹; Dias, F¹; Moreira, JP¹; Racioppi, L¹; Santos, GB²; Godinho, AL¹; Kalapothakis, E¹
¹Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Geral-Genética, Universidade Federal de Minas Gerais
²Programa de Graduação em Zoologia dos Vertebrados, Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais
[email protected]
Palavras-chave: microssatétites, piracema, biblioteca genômica, Prochilodus costatus, Prochilodus lineatus
O manejo racional de espécies silvestres de peixes deve prevenir a perda da diversidade genética. Para isso, é necessário
se fazer um estudo genético das mesmas, podendo auxiliar importantes decisões a serem tomadas em áreas onde a
atividade humana levou à mudança do habitat do rio; por exemplo regiões onde ocorreu a construção de usinas
hidroelétricas, podendo causar a fragmentação e o isolamento de populações por barramento do mesmo. Neste estudo
descrevemos a busca e utilização de marcadores moleculares de DNA para a espécie de piracema Prochilodus costatus do
rio Pará, endêmica da América do sul e de grande importância comercial, social e ambiental. Utilizou-se uma biblioteca
genômica primária não-enriquecida feita com o DNA da espécie Prochilodus lineatus e triada radioativamente para
temas repetitivos. Foram analisados 73 clones positivos por meio de sequenciamento automático e 26% dos clones
apresentaram regiões de microssatélites com potencial de uso para estudos de genética populacional. Iniciadores para
PCR foram desenhados para várias regiões, como por exemplo: 2M3, 2V35 e 2X7. Foram determinadas as melhores
condições de amplificação das regiões em questão, testando-se o tipo de tampão e a temperatura de anelamento. A
utilização de microssatélites sugere uma baixa variabilidade genética para a população de Prochilodus costatus do rio
Pará. O seqüenciamento de regiões isoladas, como por exemplo 2V35, tem mostrado diferenças que poderão gerar
informações mais precisas sobre a população em questão. Esses marcadores moleculares que estão sendo utilizados
são ferramentas importantes, auxiliando nas decisões a serem tomadas em relação ao manejo e conservação da espécie
anteriormente mencionada.
Apoio Financeiro: CEMIG, PRONEX, CAPES, CNPq, FAPEMIG.
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Análise citogenética preliminar em peixes
marinhos de fundo arenoso de Barra
Grande, região sul da Bahia
Mascarenhas, ALS; Mendes, LAM; Almeida, JS; Affonso, PRAM; Silva Jr., JC
Departamento de Ciências Biológicas, Laboratório de Citogenética, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia
[email protected]
Palavras-chave: Perciformes, Pleuronectiformes, cariótipo, heterocromatina, evolução
O presente trabalho faz parte de um projeto de levantamento citogenético da ictiofauna marinha do estado da Bahia,
já que esta é pouco conhecida. Para isto, selecionou-se a área de Barra Grande, localizada na Baía de Camamu ao sul
do estado, terceira maior baía do Brasil, apresentando uma grande diversidade de hábitat e riqueza de espécies. Foram
estudadas três diferentes espécies de duas importantes ordens de peixes marinhos: Pleuronectiformes (Citharichthys
arenaceus, família Paralichthidae) e Perciformes (Eucinostumus melanopterus e Diapterus rhombeus, ambos da família
Gerreidae). Os exemplares foram coletados por tarrafa em praias da região. Após estimulação mitótica com suspensão de
levedura, overnight, os cromossomos mitóticos foram obtidos através da técnica de preparação in vivo, utilizando tecido
renal, e visualizados através das técnicas de coloração convencional Giemsa e bandamento C. As análises cromossômicas
nos representantes da família Gerreidae evidenciaram 48 cromossomos acrocêntricos (2n=48a), sem diferenças aparentes
entre as espécies. Já a espécie C. arenaceus apresentou um valor diplóide de 2n=28 e fórmula cariotípica 14m/sm+2st+2a
(NF=34). A partir do bandamento C foi possível detectar pequenos blocos heterocromáticos nas regiões centroméricas
de todos os cromossomos em Gerreidae. Em C. arenaceus, além de marcações centroméricas foram visualizadas bandas C
na região telomérica de alguns pares cromossômicos. Os dados na família Gerreidae corroboram o caráter conservado da
evolução cariotípica das espécies deste grupo, com manutenção de características cromossômicas consideradas primitivas
para os teleósteos marinhos (2n e NF = 48). Por outro lado, uma tendência na redução do número cromossômico a
partir, principalmente, de fusões cêntricas é verificada no representante da família Paralichthidae (Pleuronectiformes).
Os resultados, inéditos para estas espécies, permitiram ampliar os dados citogenéticos disponíveis sobre peixes de fundo
arenoso na costa brasileira, fornecendo subsídios para caracterização detalhada da ictiofauna marinha com ocorrência
no estado da Bahia.
Apoio financeiro: UESB, CNPq, FAPESB.
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Filogenia dos Sciaenidae da costa brasileira
usando a região nuclear TMO-4C4
Ferreira, ARS; Alencar, SSC; Cunha, MFG; Sampaio, I; Schneider, H; Santos, S
Instituto de Estudos Costeiros - Universidade Federal do Pará - Campus de Bragança
Laboratório de Genética e Biologia Molecular
[email protected]
Palavras-chave: Filogenia, Sciaenidae, DNA nuclear, TMO-4C4, Costa brasileira
A família Sciaenidae possui uma grande diversidade de espécies nos estuários do Atlântico Ocidental. São peixes
demersais, carnívoros e habitam tanto ambientes marinhos como de água doce. Apesar da grande diversidade de
cianídeos na costa brasileira, estudos de filogenia molecular para esclarecer as relações de parentesco evolutivo entre os
táxons ainda são incipientes. O objetivo deste trabalho foi avaliar as relações filogenéticas entre os cianídeos da costa
brasileira utilizando o marcador nuclear TMO-4C4. O DNA total foi extraído através da técnica que utiliza fenolclorofórmio e precipitação com acetato de sódio e etanol. O isolamento e amplificação da região TMO-4C4 foi realizado
através da reação em cadeia da polimerase e as amostras positivas foram sequenciadas pelo método didesoxiterminal no
MegaBACE 1000. As seqüências foram editadas e alinhadas no Bioedit e após os testes de qualidade dos dados, teste
de saturação e PTP, as análises filogenéticas e de divergência nucleotídica foram realizadas no programa PAUP* 4.0b10.
Foram obtidos 401 pb do gene TMO-4C4 para 70 espécimes de cianídeos. Os resultados de divergência genética
mostram uma total similaridade entre as espécies P. squamosissimus e P auratus, o que nos leva a propor que ambas
pertencem à mesma espécie e que as diferenças morfológicas estejam associadas ao tipo de habitat dos indivíduos. Um
elevado valor de divergência genética foi observado entre indivíduos L. breviceps de São Paulo e L. breviceps do Pará,
provavelmente resultante de uma especiação alopátrica, onde barreiras, que precisam ser identificadas, podem ter
causado a diferenciação genética dessas espécies. Apesar do arranjo politômico das árvores obtidas, pôde-se confirmar
a monofilia dos gêneros Plagioscion e Menticirrhus, como já evidenciado em outros trabalhos. A ausência de monofilia
para as espécies de Cynoscion da costa norte sugere que tenha ocorrido uma diversificação explosiva para este gênero. A
estreita relação entre os gêneros Stellifer, Ophioscion e Bairdiella vem corroborar com trabalhos anteriores que utilizaram
dados moleculares e morfológicos. O padrão politômico observado na presente análise já foi verificado por outros
autores que utilizaram genes mitocondriais, como rRNA 16S e COI, o que reforça a hipótese de um intenso padrão
de diversificação para os Sciaenidae do oeste do Atlântico Sul.
Apoio Financeiro: PIBIC/UFPA.
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Filogenia molecular de Clupeiformes a
partir do gene mitocondrial 16S rDNA
Queiroz, C; Schneider, H; Santos, P; Santos, S; Rego, PS; Sampaio, I
Instituto de Estudos Costeiros, Universidade Federal do Pará – Campus de Bragança
[email protected]
Palavras-chave: Clupeiformes, Filogenia, Mitocondrial 16S rDNA, Sardinhas
A ordem Clupeiformes (Teleostei, Actinopterygii) encontra-se atualmente dividida em subordens Denticipitoidei e
Clupeoidei. Os peixes pertencentes a esta ordem são conhecidos vulgarmente como sardinhas, arenques e anchoas, e têm
como principal e exclusiva característica morfológica à presença do recessus lateralis - um canal cefálico sensorial que faz
uma conexão otofísica de vários sensores na região ótica cerebral. Os Clupeiformes exibem corpo achatado ou roliço,
vivem agrupados em grandes cardumes, e alimentam-se majoritariamente de plâncton. Os indivíduos pertencentes a
está ordem são cosmopolitas, com aproximadamente 400 espécies descritas. Possuem hábitat primariamente marinho,
costeiro ou pelágico, embora existam espécies estuarinas e de água doce, sendo um grupo muito importante na pescaria
comercial em todo o mundo. A taxonomia de sardinhas vem sendo amplamente estudada, porém, as relações filogenéticas
entre a maioria dos táxons não é bem resolvida. A presente análise reúne todas as espécies da subordem Clupeoidei com
seqüências disponíveis até o presente para o gene mitocondrial 16S rDNA. Foi utilizado um total de 54 espécies de todas
as famílias e subfamílias viventes; sequências novas foram geradas pelo nosso grupo para mais de 50 exemplares de 14
espécies neotropicais (marinhas e de água-doce), sendo que 10 espécies aparecem pela primeira vez em uma filogenia
molecular. Denticeps clupeoides (Denticipitoidei, Clupeiformes), apontada em estudos prévios como a linhagem irmã
dos Clupeoidei (Chirocentridae, Clupeidae, Engraulidae Pristigasteridae e Sundasalangidae), foi usada como grupo
externo em todas as análises. Os resultados a partir de análise bayesiana, máxima parcimônia e máxima verossimilhança
sugerem fortemente a monofilia das famílias Pristigasteridae e Engraulidae, mas não da família Clupeidae. As famílias
Chirocentridae e Sundasalangidae, aqui representadas cada uma por apenas uma espécie, posicionam-se entre as
linhagens de Clupeidae. Odontognathus mucronatus, uma espécie do Atlântico ocidental pela primeira vez incluída
em uma filogenia molecular, aparece inserida entre espécies de Pellona e Ilisha (família Pristigasteridae), gerando uma
grande politomia com estes dois gêneros, não sendo possível demonstrar a monofilia de ambos, e, conseqüentemente
da subfamília Pelloninae. Outros casos de politomia foram observados em algumas subfamílias, como Dorosomatinae,
Pellonulinae e Dussumieriinae (família Clupeidae), assim como de parafilia em alguns gêneros, Anchoa e Engraulis
(Engraulidae), e Sardinella (Clupeidae). Considerando que esta ordem de peixes tem distribuição mundial e grande
quantidade de táxons, a presente análise esclarece alguns pontos relevantes da taxonomia deste grupo (monofilia das
famílias Engraulidae e Pristigasteridae), e aponta à necessidade de estudos adicionais para estes peixes, na tentativa de
resolver as freqüentes situações de politomia/parafilia.
Apoio Financeiro: CNPq, CAPES e FINEP.
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Identificação genética de peixes comerciais
da costa norte brasileira
Soares, LFA; Rêgo, PS; Schneider, H; Sampaio, I
Instituto de Estudos Costeiros, Universidade Federal do Pará, Campus de Bragança
[email protected]; [email protected]
Palavras-chave: Coleção de Peixes, DNA mitocondrial, rRNA 16S, Costa norte brasileira, Identificação molecular
Levantamentos da fauna pesqueira no Estuário do Rio Caeté, Bragança, Pará tem demonstrado a ocorrência de pelo
menos 70 espécies importantes no desembarque, sendo a grande maioria com hábito estuarino-dependente e de grande
importância econômica para a região norte brasileira. O presente trabalho tem como objetivo gerar uma base de dados
contendo Fotografia em alta resolução, Voucher depositado em coleção, Banco de tecidos, e Seqüência de DNA do
gene mitocondrial 16S para cada uma das espécies de peixes de interesse econômico do litoral bragantino. Além do
Código de Barras de DNA, que poderá ser usado para estudos filogenéticos, esta base de dados será uma importante
coleção de referência didático-científica para a ictiofauna da região. Foram catalogados até o presente, usando-se todos
os procedimentos acima, representantes das famílias Sciaenidae (15 espécies), Lutjanidae (seis espécies), Carangidae
(quatro espécies), Clupeidae (cinco espécies), Pristigasteridae (cinco espécies), Engraulidae (oito espécies) Serranidae
(duas espécies), Achiridae (duas espécies), Mugilidae (seis espécies) e Ariidae (seis espécies). O DNA total foi extraído
através do método Fenol-Clorofórmio, e um fragmento de cerca de 500 pares de bases do gene mitocondrial 16S isolado
através de PCR e seqüenciado pelo método didesoxiterminal no ABI377. As seqüências de DNA foram editadas e serão
submetidas oportunamente ao Genbank. Como produto deste trabalho será gerado também um catálogo fotográfico
contendo as principais características de cada espécie da Coleção e seu respectivo Código de Barras de DNA.
Apoio: CNPq/PIBIC, FINEP.
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DNA como ferramenta para identificar
larvas de peixes em nível de espécie
Costa, AJG1; da Costa, RM2; Santos, S1; Schneider, H1; Pereira, LCC2; Sampaio, I1
Laboratório de Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Pará
Laboratório de Oceanografia Ecosteira e Estuarina, Universidade Federal do Pará
3
Laboratório de Plâncton e Cultivo de Microalgas, Universidade Federal do Pará
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Larvas de peixes, DNA mitocondrial, Estuário Taperaçu, Costa amazônica
O ictioplâncton compreende os ovos, larvas, pós-larvas e, em certa medida, os juvenis de peixes. A identificação
taxonômica de larvas de peixes é uma tarefa difícil e complexa, principalmente pelo fato da grande similaridade morfológica
encontrada nos primeiros estágios de desenvolvimento das diferentes espécies, e pela carência de chaves de identificação
para formas larvais. Como forma de contribuir com dados robustos para este campo da ictiologia, o presente trabalho
tem como objetivo a utilização de seqüenciamento de DNA para realizar uma identificação de forma inequívoca das
larvas em nível de espécies. As larvas de peixes foram coletadas no estuário do Taperuçu (Bragança-Nordeste do Pará),
através de arrastos horizontais sub-superficiais com duas redes de plâncton cônico-cilíndricas, com aberturas de malha
de 300 μm e 500 μm. Após triagem e registro fotográfico, as larvas foram submetidas à extração de DNA pelo método
Fenol/Clorofórmio. Um fragmento do gene mitocondrial rRNA 16S foi isolado utilizando-se a técnica da reação em
cadeia da polimerase (PCR) e submetido ao seqüenciamento de DNA pelo método didesoxiterminal, com leitura das
seqüências no MegaBace 1000 (GE Healthcare). Para a identificação das larvas em nível de espécie usou-se o BLAST
(para seqüências do Genbank) e também o banco de dados do Laboratório para seqüências de espécimes adultos ainda
não depositadas no Genbank. Com base em 100% de similaridade nas seqüências de DNA, foram identificadas até
o presente larvas de 12 espécies de peixes: Cynoscion acoupa, Stellifer stellifer, Cynoscion microlepidotus, Micropogonias
furnieri, Diapterus auratus, Chaetodipterus faber, Elops saurus, Sphoeroides annulatus, Hemicaranx amblyrhynchus, Oligoplites
saurus e Achirus declivis. Outro conjunto de larvas só foi identificado em nível de gênero ou família, mostrando que é
alta a diversidade de espécies de peixes que visitam o estuário durante seu ciclo de vida. Para as espécies já identificadas
está sendo construído um catálogo com descrição detalhada da morfologia das larvas, que servirá de grande subsídio
para os estudos de ecologia de plâncton desenvolvidos nas áreas estuarinas da zona costeira amazônica.
Apoio Financeiro: PIBIC/CNPq; MCT, FINEP.
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Marcadores moleculares para o
monitoramento de programas de hibridação
em peixes: ferramentas para genética
forense e conservação
Hashimoto, DT1; Mendonça, FF2; Senhorini, JA3; Bortolozzi, J1; Foresti, F2; Porto-Foresti, F1
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual Paulista, Bauru/SP
2
Departamento de Morfologia, Universidade Estadual Paulista, Botucatu/SP
3
Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade, CEPTA, Pirassununga/SP
[email protected]
1
Palavras-chave: conservação genética, genética forense, híbridos interespecíficos
A hibridação interespecífica é considerada uma das clássicas metodologias de manipulação genética mais aplicada nas pisciculturas,
visando principalmente ao aumento da produtividade e obtenção de linhagens estéreis. Entretanto, híbridos de peixes
também podem se constituir em sérios riscos biológicos ao meio ambiente e às populações naturais, de forma a “contaminar
geneticamente” os estoques e competir de diversas maneiras com as linhagens parentais. A grande semelhança morfológica dos
híbridos com seus parentais podem causar uma mistura ocasional entre estes, o que torna a produção e comercialização destes
animais um processo crítico e sem qualquer controle. Assim sendo, a caracterização e monitoramento genético de linhagens
híbridas produzidas artificialmente nas pisciculturas são considerados de grande relevância e essenciais para o preciso diagnóstico
dos componentes das gerações parentais e híbridas. No presente estudo, foram estabelecidos marcadores de PCR-Multiplex e
PCR-RFLP para a identificação de híbridos interespecíficos resultantes de cruzamentos entre espécies de peixes Neotropicais
atualmente produzidos nas pisciculturas brasileiras. Entre estes estão cruzamentos envolvendo espécies de Anostomidae
(Leporinus macrocephalus x Leporinus elongatus), Pimelodidae (Pseudoplatystoma reticulatum x Phractocephalus hemioliopterus)
e Serrasalminae (Colossoma macropomum x Piaractus mesopotamicus x Piaractus brachypomus). Primeiramente, foram obtidas
seqüências parciais de DNA nuclear (gene α-tropomiosina e RAG – recombination activating gene) e DNA mitocondrial
(gene ribossômico 16S e citocromo B) permitindo verificar diferenças de composição nucleotídica entre as espécies parentais
estudadas. Em seguida, primers espécie-específicos foram desenhados para serem empregados simultaneamente em reações
PCR-Multiplex, e mapas de restrição foram criados possibilitando a seleção de enzimas com sítios de clivagem espécie-específicos
para reações de PCR-RFLP. Em ambas as metodologias, análises envolvendo o DNA nuclear e mitocondrial demonstraram
diferentes perfis eletroforéticos entre as espécies parentais, evidenciado por fragmentos de DNA com diferentes tamanhos
e de padrões característicos para cada espécie. Entretanto, somente análises do DNA nuclear permitiram o diagnóstico e a
precisa identificação dos produtos híbridos, pois estes revelaram um perfil heterozigótico com bandas diagnósticas herdadas
de suas respectivas espécies parentais. Em relação ao DNA mitocondrial, dada a característica de transmissão materna destes
segmentos genômicos, os híbridos apresentaram o mesmo padrão dos parentais maternos, mascarando a identificação, porém
demonstrando o potencial uso deste marcador na diferenciação de híbridos recíprocos. A rapidez e baixo custo destas técnicas
poderão facilitar a implementação rotineira do monitoramento e fiscalização da produção de híbridos nas pisciculturas, e por
fim, delinear planos de conservação biológica para um manejo adequado destes animais, de forma a minimizar os impactos
negativos aludidos com a implantação de projetos de hibridação interespecífica em pisciculturas.
Apoio financeiro: CNPq, FAPESP e ICMBio.
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Efeito da exposição ao cobre sobre a
expressão de genes relacionados ao
metabolismo da glutationa em hepatócitos
de zebrafish (Danio rerio)
Rola, RC1; Rosa, CE1,2; Sandrini, JZ1,2; Trindade, GS1,2; Nery, LEM1,2; Marins, LF1,2
Departamento de Ciências Fisiológicas – Universidade Federal do Rio Grande (FURG)
Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas – Fisiologia Animal Comparada, (FURG)
[email protected]
1
2
Palavras-chave: glutationa, expressão gênica, cobre, estresse oxidativo, Danio rerio
O cobre (Cu) é considerado um elemento traço essencial, pois é um co-fator comum de muitas enzimas. Paralelamente,
também é considerado um elemento potencialmente tóxico por vários mecanismos, incluindo a geração de espécies
reativas de oxigênio (EROs). Dentre os mecanismos não-enzimáticos de combate as EROs, pode-se destacar o tripeptídeo
glutationa (GSH). A GSH é o tiol não-protéico intracelular mais abundante, cuja síntese acontece constitutivamente na
maioria das células, mas pode ser aumentada em resposta a diversos estressores. Esta molécula é considerada a primeira
linha de defesa de um organismo contra as EROs, pois funciona como um “seqüestrador” destas moléculas, é co-substrato
de outras enzimas antioxidantes de detoxificação celular, desempenha papel na reativação de outras enzimas inibidas
durante uma situação de estresse oxidativo e tem papel importante na regeneração da vitamina E, outro antioxidante
não-enzimático. O objetivo deste estudo foi avaliar a expressão de genes envolvidos na síntese e reciclagem da GSH
em hepatócitos de peixe (Danio rerio), após exposição ao cobre. Previamente, as células (densidade de 1,0 x 106 células/
poço, em placas de 24 poços) foram expostas ao cobre na concentração de 20 mg/L. Após 24 horas de exposição, as
amostras de hepatócitos do grupo controle e as expostas a 20 mg/L foram homogeneizadas em TRIZOL, para extração
do RNA total e conseqüente síntese do cDNA, o qual foi utilizado para realização dos testes de expressão gênica por
RT-PCR semiquantitativa dos seguintes genes: subunidade catalítica da glutamato cisteína ligase (GCLC), glutationa
sintase (GS), glutationa peroxidase selênio dependente (GPx), glutationa redutase (GR) e diferentes isoformas da
glutationa S-transferase (GST-α, GST-ρ, GST-μ e GST-π). A expressão destes genes foi normalizada pela expressão
do gene da β-actina. A expressão dos genes da via de síntese da GSH (GCLC e GS), bem como da enzima GPx foi
significativamente (p<0,05) induzida no grupo exposto a 20 mg/L de cobre em relação ao grupo controle. Já a expressão
de genes de fase II de detoxificação celular (GST-α, e GST-ρ) foi reduzida (p<0,05) nas mesmas condições, enquanto
que a expressão dos genes GR, GST-μ e GST-π não foi alterada (p>0,05) pelo tratamento com cobre. Estes resultados
indicam que a exposição dos hepatócitos ao cobre acarretou uma situação de estresse oxidativo, que estaria alterando
o perfil de expressão de genes do sistema antioxidante a fim de aumentar o nível de GSH intracelular e contrabalançar
os efeitos tóxicos do poluente.
Apoio Financeiro: CNPq e FAPERGS.
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Construção e caracterização estrutural
de bibliotecas genômicas enriquecidas
em microssatélites nas espécies Rhinella
schneideri e Leptodactylus chaquensis
(Amphibia)
Arruda, MP1; Morielle-Versute, E1; Schneider, MPC2; Gonçalves, EC2
Laboratório de Chiroptera, Instituto de Biociências Letras e Ciências Exatas, Universidade Estadual Paulista
2
Laboratório de Polimorfismo de DNA, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará
[email protected]
1
Palavras-chave: microssatélites, variabilidade genética, Amphibia, conservação
A classe Amphibia tem sofrido nas recentes décadas um declínio global e desproporcionalmente maior quando comparada a outros
grupos de vertebrados, devido a um conjunto de fatores de afetam suas comunidades naturais. Esse fato aliado a características
morfofisiológicas do grupo, permite a sua utilização como bioindicador de ambientes alterados. Os programas de preservação ressaltam
a importância da manutenção da máxima quantidade de diversidade genética, assim sendo, a primeira etapa de um programa
conservacionista, consiste na avaliação dessa variabilidade dentro das populações. Particularmente os marcadores moleculares do
tipo microssatélite (SSRs), caracterizados pela abundante distribuição no genoma, alto nível de polimorfismo, herança mendeliana
co-dominante e neutralidade típica, tem permitido o acesso com êxito à variabilidade genética das populações. Baseado nos
pressupostos apresentados, esse estudo desenvolveu quatro bibliotecas genômicas parciais enriquecidas em SSRs para as espécies
de anuros Rhinella schneideri (2 bibliotecas: CAn CTn) e Leptodactylus chaquensis (2 bibliotecas: Can CTn), a partir do método de
hibridização seletiva, com sondas biotiniladas repetitivas do tipo (CA)15 e (CT)12 conjugadas à contas magnéticas revestidas por
estreptavidina. Após a hibridização, os insertos enriquecidos em seqüências microssatélites foram amplificados via PCR, ligados ao
vetor pGEM-T Easy Vector e transformados em bactérias eletrocompetentes Escherichia coli TOP10 por eletroporação. As bactérias
transformadas foram plaqueadas em meio sólido 2XYT-ágar contendo ampicilina + X-gal, e após crescimento, as colônias brancas
(positivas) foram transferidas e crescidas em placas de 96 poços com caldo enriquecido Tartoff-Hobbs Broth/Ampicilina. As placas
foram glicerolizadas e acondicionadas à -20ºC. Foram seqüenciados 480 (R. schneideri) e 288 (L. chaquensis) clones positivos. O
programa Tanden Repeats Ocurrence Locator “Troll” foi utilizado para rastrear os microssatélites nos clones. A sonda CA isolou
um número maior de SSRs (61% CA e 43% CT), com as bibliotecas (CA)n apresentando, predominantemente, motivos repetidos
do tipo dinucleotídeo (57% - preferencialmente CA5 e CA6), enquanto que nas bibliotecas (CT)n a unidade repetida comumente
encontrada foi a mononucleotídica (52%). Os microssatélites foram classificados como: puros (89%), interrompidos (8%), compostos
interrompidos (2%) e compostos (1%). Na comparação entre as bibliotecas das duas espécies, L. chaquensis obteve uma maior
porcentagem de SSRs (60% e 47%), assim como exibiu unidades repetidas pentanucleotídicas (TCACA25) e hexanucleotídícas
(CACACG8), enquanto que as bibliotecas de R. schneideri caracterizaram-se pelo número maior de motivos tetranucleotídicos (17%
à 8%). 9% do total dos microssatélites encontrados exibiram repetições longas (> 15 nucleotídeos), potencialmente polimórficas.
Esses microssatélites foram editados e alinhados no software Bioedit, os clones redundantes removidos e os iniciadores desenhados
pelo programa Primer 3. Os iniciadores serão otimizados e utilizados para posterior genotipagem de populações naturais dessas
espécies. Esses lócis poderão ser utilizados em sistemas de manejo genético norteando programas de conservação.
Apoio Financeiro: FAPESP, CNPq.
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Desenvolvimento de bibliotecas enriquecidas
em seqüências microssatélites na espécie
Leptodactylus podicipinus (Amphibia)
Arruda, MP1; Schneider, MPC2; Gonçalves, EC2; Morielle-Versute, E1
Laboratório de Chiroptera, Instituto de Biociências Letras e Ciências Exatas, Universidade Estadual Paulista
2
Laboratório de Polimorfismo de DNA, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará
[email protected]
1
Palavras-chave: microssatélites, variabilidade genética, Amphibia, conservação
Os microssatélites ou SSRs consistem em motivos de 1-6 nucleotídeos repetidos em tandem no genoma, caracterizados
por apresentarem ampla distribuição, alto nível de polimorfismo informativo e padrão co-dominante. Por essas
particularidades essa classe de marcadores moleculares tem sido extensamente utilizada em estudos populacionais. Os
anfíbios constituem excelentes modelos para a investigação genética de populações selvagens, pois são distribuídos na
maioria dos ecossistemas, frequentemente filopátricos, gerando níveis elevados de estruturação genética populacional e,
apesar do grande interesse focado na conservação, esta área de pesquisa está sub-representada. Leptodactylus podicipinus
é uma espécie abundante e amplamente distribuída na América do Sul, estendendo-se da Argentina e Uruguai até a
altura dos rios amazônicos. Espécies localmente abundantes e extensamente distribuídas podem servir como organismosmodelo para elucidar processos de fragmentação da paisagem e da perda de hábitats. O atual estudo desenvolveu duas
bibliotecas genômicas parciais enriquecidas (CAn e CTn) em SSRs para L. podicipinus. 10 microgramas de DNA genômico
foram digeridos com Sau3AI e fragmentos de 300-1000 bp selecionados e ligados a adaptadores da enzima. Esses
fragmentos foram enriquecidos via PCR com um número reduzido de ciclos. O produto amplificado foi denaturado
e hibridizado com sondas de seqüências repetidas (CA15 e CT12) marcadas com biotina. Os fragmentos enriquecidos
foram recuperados utilizando contas magnéticas revestidas por estreptavidina. Foi conduzida uma PCR utilizando o
iniciador direto dos adaptadores para promover a conformação de dupla-fita nos fragmentos. O produto da PCR foi
ligado ao vetor pGEM-T Easy Vector e introduzido em bactérias eletrocompetentes Escherichia coli cepa TOP10 por
eletroporação. As bactérias transformadas foram plaqueadas em 2XYT/agar/Ampicilina/X-gal e decorrido o período
de crescimento, as colônias positivas foram repicadas em placas de 96 poços com caldo nutritivo Tartoff-Hobbs Broth/
Ampicilina. As bibliotecas foram glicerolizadas e estocadas à -20ºC. 384 clones foram seqüenciados e analisados pelo
programa Troll que encontrou 148 regiões ricas em regiões repetitivas. A sonda CA obteve maior eficiência no número de
microssatélites capturados (111 motivos/58%) em relação à sonda CT (37 motivos/19%). As bibliotecas desenvolvidas
apresentaram a seguinte composição quanto aos tipos de motivos: dinucleotídeos (55%), mononucleotídeos (22%),
tetranucleotídeos (16%), trinucleotídeos (6%) e pentanucleotídeos (1%), e os microssatélites classificados como puros
em 90% dos casos. As sondas utilizadas divergiram quanto à prevalência de motivos capturados, na sonda CA os
motivos dinucleotídeos (63%) e mononucleotídeos/tetranucleotídeos (17%) foram os mais freqüentes, enquanto que
para sonda CT, os mononucleotídeos (37%), dinucleotídeos (29%) e trinucleotídeos (21%) foram os prevalentes. Os
maiores microssatélites em número de repetições foram editados e alinhados pelo programa Bioedit. Os iniciadores
foram desenhados baseados nas regiões flanqueadoras dos SSRs pelo programa Primer 3. Os iniciadores serão otimizados
e utilizados na genotipagem de populações naturais de L. podicipinus.
Apoio Financeiro: FAPESP, CNPq.
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Comparative cytogenetics of three species
of Phyllomedusa hypochondrialis group
(Anura, Hylidae, Phyllomedusinae)
Bruschi, DP1; Siqueira, S2; Del-Grande, ML3; Andrade, GV4; Recco-Pimentel, SM2; Busin, CS1
1
Instituto de Ciências Biológicas, UPF, Passo Fundo, RS
Departamento de Biologia Celular, IB, UNICAMP, Campinas, SP
3
Departamento de Ciências Naturais, UESB, Vitória da Conquista, BA
4
Departamento de Biologia, UFMA, São Luis, MA
[email protected]
2
Palavras-chave: cromossomos, cariótipo, Phyllomedusa, NOR, heterocromatina
Os representantes do gênero Phyllomedusa caracterizam-se por apresentarem morfologia externa peculiar quando
comparadas a outros hilídeos neotropicais. A maioria das espécies desse gênero está alocada em cinco clados conforme
similaridades morfológicas. No clado “hypochondrialis” estão P. ayeaye, P. azurea, P. centralis, P. hypochondrialis, P.
megacephala, P. nordestina, P. oreades, P. palliata e P. rohdei. Entretanto, as relações intra-e interespecíficas ainda são
discutidas. Freqüentes mudanças taxonômicas e/ou revalidação de espécies são relatadas o que sugere a necessidade da
utilização de outras e diferentes ferramentas que possam contribuir para o melhor entendimento da sistemática do gênero
e, mais especificamente, do clado “hypochondrialis”. Neste trabalho analisamos citogeneticamente onze espécimes de
P. rohdei (Ilhéus, BA), seis de P. hypochondrialis (Urbano Santos, MA) e sete espécimes de P. azurea (Uberlândia, MG).
As metáfases foram obtidas por suspensão de células de epitélio intestinal e de testículos e submetidas à coloração
convencional com Giemsa, impregnação por prata (Ag-NOR) e bandamento C. As três espécies apresentaram o mesmo
número cromossômico (2n=26) com fórmulas cariotípicas muito semelhantes: P. rohdei apresentou 2n=3M+10SM,
P. hypochondrialis 2n=6M+7SM e P. azurea 2n=5M+7SM+1ST. O padrão de bandamento C revelou a presença de
heterocromatina na região centromérica de todos os cromossomos das três espécies com pequenas diferenças na localização
de blocos pericentroméricos e/ou teloméricos. Um dos homólogos dos cromossomos do par 1, de todos os espécimes de
P. azurea analisados, apresentou, adicionalmente, um bloco heterocromático na região subterminal do braço longo que
altera a morfologia do cromossomo (M/SM). Um único par de NORs ativas foi detectado em cada uma das espécies,
em P. rohdei, na região subtelomérica dos braços longos dos homólogos 9, em P. hypochondrialis na região intersticial dos
braços curtos dos cromossomos do par 6 e, em P. azurea, na região pericentromérica dos braços curtos dos homólogos
3. Embora a morfologia e o padrão heterocromático dos cromossomos sejam semelhantes, a localização das NORs
separa cada uma das espécies, corroborando resultados de análise morfológica realizadas por outros autores.
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Estrutura e distribuição das regiões
organizadoras de nucléolos em quatro
espécies do Gênero Phyllomedusa (Anura:
Hilidae) encontradas no estado da Bahia
Barth, A; Solé, M; Costa, MA
Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular – Universidade Estadual de Santa Cruz, UESC
[email protected]
Palavras-chave: citogenética, CMA3, NOR, anuros, evolução
O gênero Phyllomedusa compreende vinte e quatro espécies que apresentam ampla distribuição, sendo encontradas
na América Central desde o Panamá, e na América do Sul a leste dos Andes, além da Colômbia, Trindade, Argentina
e Uruguai. O presente trabalho teve como objetivo estudar as regiões organizadoras de núcleos (NOR) nas espécies
do gênero Phyllomedusa encontradas no Estado da Bahia - Brasil. Neste sentido, foram analisados onze indivíduos da
espécie Phyllomedusa rohdei, cinco de P. nordestina, dez de P. burmeisteri e dez de P. bahiana coletados nos municípios de
Ilhéus, Ituberá, Camacan, Feira de Santana e Vitória da Conquista. Células do intestino em suspensão de etanol/ácido
acético foram gotejadas em lâminas histológicas e submetidas às técnicas de banda NOR e fluorocromos CMA3 e DAPI.
Todas as espécies estudadas apresentaram 2n=26 cromossomos. As espécies P. burmeisteri e P. bahiana apresentaram
marcações AgNOR positivas na região pericentromérica do braço longo de um par de cromossomos submetacêntricos.
Todos os indivíduos de P. bahiana analisados apresentaram pares cromossômicos heteromórficos para comprimento da
NOR. Esta variação também foi observada em alguns indivíduos de P. burmeisteri. Na espécie Phyllomedusa nordestina
pode-se observar variação intrapopulacional com relação ao número de NORs ativas. Nas populações de Vitória da
Conquista e Camacan observou-se marcações AgNOR na região intersticial de um par de cromossomos metacêntricos
e na população de Ituberá, observou-se três cromossomos metacêntricos marcados nesta mesma região. Em P. rohdei,
a técnica de banda NOR revelou alta variabilidade no padrão de atividade das NORs, a qual apresentou variação
no número e na morfologia dos cromossomos marcados. Entre os espécimes analisados foram observados de dois a
quatro cromossomos marcados na região terminal, que mostraram morfologias metacêntrica ou submetacêntrica nos
diferentes indivíduos. Em cinco indivíduos desta espécie, observou-se também uma marcação pericentromérica em
um cromossomo submetacêntrico. Em todas as espécies analisadas observou-se marcações CMA3 positivas nas regiões
marcadas pelo nitrato de prata, demonstrando que as NORs são ricas em pares de bases GC conforme já descrito na
literatura para anuros e outros organismos. O fluorocromo CMA3 marcou ainda, a região centromérica e telomérica
de todos os cromossomos. O fluorocromo DAPI não apresentou marcações específicas. As NORs são úteis em estudos
evolutivos para realizar inferências sobre as relações de ancestralidade. Neste sentido, para a família Hylidae, NORs
simples seriam tidas como uma característica de espécies mais ancestrais e as NORs múltiplas seriam uma condição
encontrada em grupos que teriam um tempo menor de divergência. Alguns eventos como inversões, translocações,
elementos genéticos transponíveis e amplificação de cístrons de rDNA são alternativas para explicar a origem das NORs
múltiplas em algumas espécies.
Apoio: UESC, CAPES, FAPESB.
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Estudo das relações de parentesco
intragenéricas de Pseudopaludicola (Anura,
Leiuperidae), com evidências para
a redução do número cromossômico
Veiga-Menoncello, ACP1; Lourenço, LB1; Strüssmann, C2; Rossa-Feres, DC3; Lima, JRF4; Recco-Pimentel, SM1
Departamento de Biologia Celular, IB – UNCAMP, Campinas, SP – Brasil
Departamento de Produção Animal, FAMEV – UFMT, Cuiabá, MT – Brasil
3
Departamento de Zoologia, IBILCE – UNESP, São José do Rio Preto, SP – Brasil
4
Instituto de Pesquisas Científicas e Tecnológicas do Estado do Amapá, Macapá, AP - Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Anura, Pseudopaludicola, DNAmt, cromossomo
Atualmente o gênero Pseudopaludicola é formado por 12 espécies divididas em dois grupos: grupo “pusilla”, o qual é
considerado monofilético e contem cinco espécies incluindo apenas um representante brasileiro, P. canga e o grupo
“falcipes” composto pelas demais espécies, as quais não compartilham nenhum caracter derivado. As relações de
parentesco intragenéricas de Pseudopaludicola permanecem pouco entendidas, principalmente em relação às espécies
do sudeste da América do Sul pertencentes ao grupo “falcipes”. Neste estudo nós associamos dados cromossômicos
de algumas espécies de Pseudopaludicola às análises filogenéticas baseadas em dados moleculares dos genes ribossomal
mitocondrial 12S e citocromo b como parte de uma investigação sobre as relações de parentesco intragenéricas de
Pseudopaludicola. Uma significante variação no número de cromossomos é observada nesse gênero. Pseudopaludicola
falcipes, P. mineira e P.saltica apresentam 2n=22 cromossomos, P. ameghini (sensu Cope, 1887) e P. ternetzi, 2n=20, P.
canga e Pseudopaludicola sp.n. 2n=18, enquanto P. mystacalis e Pseudopaludicola sp. (aff. mystacalis) possuem 2n=16
cromossomos. Quando associados aos dados moleculares, os quatro grupos caracterizados pelos diferentes números
cromossômicos (2n = 22; 20; 18 e 16) foram identificados em clados distintos. A presença de 2n=18 cromossomos
somente em P. canga e em Pseudopaludicola sp.n. associada a localização dessas espécies em um mesmo clado,
corrobora o monofiletismo do grupo “pusilla” previamente proposto com base em dados morfológicos. Por outro
lado, o grupo “falcipes”, cujas espécies apresentam diferentes números de cromossomos, mostrou-se parafilético
em relação ao grupo “pusilla”. Os dados moleculares parecem ser úteis para explicar a radiação cromossômica nesse
gênero, uma vez que nossas análises indicam P. falcipes, que possui o maior número de cromossomos (2n=22),
como um táxon basal dentro de Pseudopaludicola, sugerindo uma progressiva redução no número cromossômico na
divergência evolutiva nesse gênero.
Apoio financeiro: FAPESP.
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Caracterização cromossômica
de Pseudopaludicola ameghini (sensu
Cope, 1887), P. ternetzi e de populações
de Pseudopaludicola sp. (aff. mystacalis),
Pseudopaludicola sp. (aff. falcipes) e
Pseudopaludicola sp. (Anura - Leiuperidae)
Fávero, ER1; Veiga-Menoncello, ACP1; Strüssmann, C2; Andrade, GV3; Giaretta AA4; Rossa-Feres, DC5; Recco-Pimentel, SMR1
Departamento de Biologia Celular, IB, UNICAMP, Campinas, SP
Departamento de Produção Animal, FAMEV, UFMT, Cuiabá, MT
3
Departamento de Biologia, Centro de Ciências da Saúde, UFM, São Luis, MA
4
Departamento de Biociências, Instituto de Biologia, UFU, Uberlândia, MG
5
Departamento de Zoologia, IBILCE, UNESP, São José do Rio Preto, SP
[email protected]; [email protected]
1
2
Palavras-chave: Citogenética, Pseudopaludicola, Anura
O gênero Pseudopaludicola (Leiuperidae), possui atualmente 12 espécies de rãs diminutas, que ocorrem na região oriental
da América do Sul. Estas espécies muito se assemelham, sendo algumas vivendo simpatricamente. Com o intuito de
caracterizar citogeneticamente as espécies do gênero, visando contribuir com a sistemática do grupo, analisamos o
cariótipo de exemplares de P. ameghini (sensu Cope, 1887), atualmente tida em sinonímia de P. mystacalis, provenientes
de sua localidade-tipo, região da Chapada dos Guimarães (MT), além de P. ternetzi de Uberlândia (MG) e exemplares
de populações tidas como Pseudopaludicola sp. (aff. falcipes), da região noroeste de São Paulo, Pseudopaludicola sp. (aff.
mystacalis) de Barreirinhas e Urbano Santos (MA) e Pseudopaludicola sp., provenientes de Poconé e Santa Terezinha
(MT). As preparações cromossômicas foram obtidas a partir do epitélio intestinal e gônada masculina e submetidas às
técnicas de coloração convencional com Giemsa, impregnação por prata (AgNOR) e bandamento C. Os cariótipos de
P. ameghini (sensu Cope, 1887) e P. ternetzi apresentaram 2n=20 cromossomos e a NOR localizada na região telomérica
do braço longo do par 9. Em P. ameghini, bandas pericentroméricas foram detectadas nos braços curtos dos pares 1 e
2 e nos braços longos dos pares 3, 4 e 5, enquanto P. ternetzi apresentou marcação pericentromérica apenas nos braços
curtos dos pares 1 e 2. Todos os exemplares das populações de Pseudopaludicola sp. (aff. falcipes), Pseudopaludicola sp.
(aff. mystacalis) e Pseudopaludicola sp., além de compartilharem o mesmo número de cromossomos de P. mystacalis
(2n=16), apresentaram também a NOR na região pericentromérica do braço curto do par 4 e o mesmo padrão de
distribuição de heterocromatina. Os resultados obtidos indicam que P. ameghini (2n=20) e P. mystacalis (2n=16) são
unidades taxonômicas distintas, assim como P. ternetzi, a qual já foi considerada sinônima de P. ameghini. Além disso,
os espécimes tidos como Pseudopaludicola sp. (aff. falcipes), Pseudopaludicola sp. (aff. mystacalis) e Pseudopaludicola sp.,
mostraram-se citogeneticamente relacionados à P. mystacalis e não à P. falcipes que possui 2n=22 cromossomos. Desta
forma, os nossos dados indicam a necessidade de uma revisão taxonômica no gênero Pseudopaludicola.
127
Apoio: FAPESP.
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Evidências sobre os relacionamentos Intere Intragenéricos de Pristimantis crepitans
e Ischnochnema paulodutrai e sobre a
existência de novas espécies de Barycholos
e Pristimantis (Anura, Terrarana), inferidas
por dados citogenéticos
Siqueira, S1; Aguiar, O2; Strüssmann, C3; Pansonato, A3; Del-Grande, ML4; Giaretta, AA5; Martins, I6; Recco-Pimentel, SM1
Departamento de Biologia Celular, IB, UNICAMP, Campinas, SP
2
Departamento de Biociências, UNIFESP, Santos, SP
3
Departamento de Ciências Básicas e Produção Animal, UFMT, Cuiabá, MT
4
Departamento de Ciências Naturais, UESB, Vitória da Conquista, BA
5
Departamento de Biociências, IB, UFU, Uberländia, MG
6
Departamento de Biologia, UNITAU, Taubaté, SP
[email protected]; [email protected]
1
Palavras-chave: cromossomos, Pristimantis, Barycholos, Ischnocnema
As 882 espécies descritas de “eleutherodactyline” foram recentemente alocadas no grande táxon Terrarana e redistribuídas em quatro
famílias, Eleutherodactylidae (Caribe), Craugastoridae (América Central), Strabomantidae (América do Sul) e Brachycephalidae
(Sudeste do Brasil), com base em análises de filogenia molecular. Entretanto, os relacionamentos das espécies da América do Sul,
principalmente do Brasil, permanecem pouco esclarecidos. No presente trabalho foram analisadas nove populações de espécies
dos gêneros Ischnocnema, Pristimantis e Barycholos, contribuindo com dados citogenéticos adicionais para o entendimento dos
relacionamentos intra- e intergenéricos e diferenciação entre espécies brasileiras. Os cariótipos foram analisados por coloração
com Giemsa, Ag-NOR e bandamento C. Os espécimes de I. juipoca (Atibaia e Campos do Jordão, SP), B. ternetzi (Uberlândia,
MG e Porto Nacional, TO) e P. crepitans (Chapada dos Guimarães e São Vicente, MT), apresentaram 2n=22 cromossomos,
metacêntricos, submetacêntricos e telocêntricos (NF= 40, 38 e 44, respectivamente), enquanto P. dundeei (Chapada dos Guimarães,
Rondonópolis e Aripuanã, MT) e I. paulodutrai (Ilhéus, BA – espécimes com dois padrões de morfologia externa) apresentaram,
respectivamente, 2n=28 e 2n=30 cromossomos telocêntricos, excetuando-se o par 4, subtelocêntrico em I. paulodutrai (NF= 28 e
32). Cariótipos com 2n=28 e 2n=30 são descritos pela primeira vez para espécies brasileiras de Terrarana, que apresentam 2n=20, 22
ou 34 cromossomos. Diferenças na localização da NOR e padrão de heterocromatina entre populações de B. ternetzi e de P. dundeei
sugerem a existência de espécies novas. Ischnocnema juipoca, B. ternetzi, P. crepitans (2n=22) diferiram entre si e P. dundeei (2n=28)
diferiu de I. paulodutrai (2n=30) também na localização da NOR e no padrão de banda C. Verificou-se que os dois morfotipos de
I. paulodutrai são citogeneticamente idênticos. Os dados de P. crepitans, única espécie do gênero até o momento a apresentar 2n=22,
indicam que essa espécie não é citogeneticamente próxima dos seus congêneres e nem de Ischnocnema. Por outro lado, o alto número
cromossômico (2n=30) encontrado apenas em I. paulodutrai, incomum para outros Ischnocnema já cariotipados, sugere que esta
espécie também pode estar impropriamente alocada nesse gênero. Portanto, os dados citogenéticos apontam para a necessidade
de estudos taxonômicos adicionais, em especial para esclarecer o posicionamento sistemático de P. crepitans e I. paulodutrai, bem
como para descrição de possíveis espécies novas entre as populações atribuídas a B. ternetzi e P. dundeei.
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Apoio financeiro: Capes, Fapesp.
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Citogenética de microhilídeos pertencentes aos
gêneros Chiasmocleis e Myersiella (Anura)
Gazoni, T1; Campos, JRC1; Haddad, CFB2; Kasahara, S1
Departamento de Biologia , Instituto de Biociências, UNESP, Rio Claro, SP
Departamento de Zoologia, Instituto de Biociências, UNESP, Rio Claro, SP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: anfíbios, Microhylidae, cromossomo, cariótipo, coloração diferencial
Revisões recentes de taxonomia e sistemática de anuros com base em dados moleculares resultaram em modificações
na família Microhylidae. Entre outras mudanças, houve a transferência do gênero Chiasmocleis de Microhylinae para
uma nova subfamília, a Gastrophryninae. No entanto, existem ainda questões não resolvidas, como é o caso do gênero
monotípico Myersiella, que não foi alocado em nenhuma subfamília, pela ausência de análises ou dados inconclusivos.
Os estudos citogenéticos de Microhylidae são escassos, especialmente no que se refere às espécies do Novo Mundo,
sendo raros os dados de bandamento. Foram cariotipados pela primeira vez C. carvalhoi (quatro machos e uma fêmea
de Ubatuba, SP), C. albopunctata (um jovem de Descalvado, SP), e M. microps (um macho de São José do Barreiro,
SP). Chiasmocleis albopunctata e C. carvalhoi apresentaram 2n=24 e NF=46, com cinco pares grandes e médios e sete
pequenos. Os cariótipos são praticamente indistingüíveis entre si, com pares 1 e 5 metacêntricos, 2-4 submetacêntricos,
e os demais pares metacêntricos ou submetacêntricos, com exceção do par 11, inequivocamente telocêntrico. A análise
meiótica em C. carvalhoi mostrou 12 bivalentes em diplóteno/metáfase I e 12 cromossomos em metáfase II. A coloração
diferencial, obtida apenas em C. carvalhoi, evidenciou Ag-RON na região terminal 2p e banda C centromérica, bem
como marcações intersticiais em 4p, 4q e 10q. A constituição cariotípica no gênero Chiasmocleis parece ser altamente
conservada, pois a similaridade entre os cariótipos das duas espécies estende-se aos de C. bicegoi, C. schubarti e C.
leucosticta, esse último com 2n=4x=48. Adicionalmente, nossos dados mostram que a posição da Ag-RON é invariável,
pelo menos para C. carvalhoi e C. schubarti, únicas espécies estudadas sob coloração diferencial. Myersiella microps
apresentou 2n=26 e NF=50, sendo cinco pares grandes e médios e oito pequenos. Os pares 1 e 5 são metacêntricos,
os pares 2-4, submetacêntricos, e os demais pares, metacêntricos ou submetacêntricos, exceto o par 8 que é do tipo
subtelocêntrico. Foram analisadas células em metáfase I, porém, essas mostraram um número grande de bivalentes,
possivelmente, resultante de poliploidização induzida pela colchicina. A coloração diferencial evidenciou Ag-RON
nas regiões terminais 2p e 8p e banda C predominantemente centromérica, bem como nos sítios coincidentes com a
Ag-RON. O número cromossômico de M. microps difere dos de todos os microhilídeos brasileiros já cariotipados, os
quais apresentam, em sua maioria, 2n=22 e 24. Os dados obtidos para as três espécies são de grande importância para
o conhecimento da evolução cromossômica nos microhilídeos. É importante que se estendam as análises citogenéticas
com técnicas mais resolutivas, não só para as espécies aqui analisadas, como também para outros microhilídeos, a fim
de se identificar marcadores adequados para a distinção entre os cariótipos.
Apoio financeiro: FAPESP (06/56932-5, 01/13341-3, 07/54374-8) e CNPq.
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O cariótipo de Holoaden luederwaldti
(Anura, Strabomantidae), com relato de
triploidia natural
Campos, JRC1; Martins, IA2; Haddad, CFB3; Kasahara, S1
Departamento de Biologia, UNESP, Rio Claro, SP
Departamento de Biologia-IBB, UNITAU, Taubaté, SP
3
Departamento de Zoologia, UNESP, Rio Claro, SP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: citogenética, cromossomos, anfíbios, poliploidia, coloração diferencial
Dentre as recentes mudanças na taxonomia e sistemática de alguns anuros está a inclusão do gênero Holoaden,
anteriormente pertencente à família Brachycephalidae, na nova família Strabomantidae. O gênero Holoaden compreende
H. bradei e H. luederwaldti, ambas endêmicas da Mata Atlântica, na região sudeste do Brasil. Os cromossomos de cinco
machos e duas fêmeas de H. luederwaldti, provenientes de Campos do Jordão, SP, foram analisados. Em quase todos
os exemplares, o cariótipo tem 2n=18, com um par metacêntrico grande, seis pares grandes e médios com variação
gradativa de tamanho, sendo o 6º inequivocamente telocêntrico e os demais submetacêntricos, e dois pares pequenos,
praticamente do mesmo tamanho, porém, enquanto o 9º é metacêntrico, o 8º é submetacêntrico ou subtelocêntrico,
tendo sido observadas as combinações subtelocêntrico/subtelocêntrico e subtelocêntrico/submetacêntrico, nos dois
sexos. Células em meiose mostraram nove bivalentes em diplóteno/metáfase I e nove cromossomos em metáfase II. Um
único macho possui cariótipo com 2n=3x=27, com cromossomos idênticos aos dos demais animais, sendo o terceto 8
composto por um cromossomo submetacêntrico e dois subtelocêntricos. A preparação citológica do testículo mostrou
que o triplóide apresenta fases meióticas, além de espermátides e espermatozóides. A Ag-RON está presente nos
cromossomos 8, na região 8q intersticial quando subtelocêntrico ou 8q proximal quando submetacêntrico, sendo que
nesse cromossomo, invariavelmente com uma acentuada constrição secundária, a marcação de Ag-RON é bem grande.
Um fato interessante é que quando nos diplóides um dos 8 é do tipo submetacêntrico, esse cromossomo é o único a
apresentar Ag-RON. No exemplar triplóide, a marcação da Ag-RON ocorre também apenas no 8 submetacêntrico,
estando ausente nos dois cromossomos subtelocêntricos. O bandamento C revelou leves marcações centroméricas e
nos sítios correspondentes a Ag-RON, nos dois tipos de cromossomos 8. É importante enfatizar que os resultados
aqui apresentados em H. luederwaldti são inéditos e constitui o primeiro relato de triploidia natural em anuros, a qual
poderia ser conseqüência da fecundação de um gameta não reduzido, decorrente da não eliminação do corpúsculo
polar na gametogênese. Vale ressaltar que a localidade de coleta dos animais está a cerca de1800m acima do nível do
mar, sujeita à queda brusca de temperatura, como já relatado na literatura. A variação intraespecífica do par 8 é, muito
provavelmente, decorrente de inversão pericêntrica. O cromossomo 8 do tipo submetacêntrico está presente em H.
bradei, cujo cariótipo, também com 2n=18, é similar ao de H. luederwaldti, apresentando, porém, o par 6 do tipo
metacêntrico e não telocêntrico. A análise de novos exemplares será importante para se avaliar a extensão da variabilidade
morfológica do par 8, o qual nunca foi observado na combinação submetacêntrico/submetacêntrico, e se a triploidia
é um caso esporádico dentro da espécie.
Apoio Financeiro: FAPESP (06/56193-8, 07/54374-8, 01/13341-3, 06/56007-0) e CNPq.
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Filogeografia comparada de anuros do sul
da Mata Atlântica: contrastando hipóteses
de diversificação biológica
Marcelino, VR1; Giovanelli, JG2; Haddad, CFB3; Alexandrino, JMB4
Instituto de Biociências, Departamento de Zoologia, Universidade Estadual Paulista, Rio Claro SP
[email protected]
Palavras-chave: Diversificação genética, Mata Atlântica, Filogeografia, Anura
A biodiversidade resulta de processos históricos e evolutivos ainda pouco conhecidos, que podem ser em parte elucidados
pela filogeografia comparada, através do estudo de padrões de diversificação de diversos organismos. Este trabalho
compara informação genética mitocondrial (ND2: c.a. 1000 pb) e nuclear (beta-fibrinogênio: c.a. 500 pb) para estudar
a diversificação de 4 espécies de anfíbios endêmicos da Mata Atlântica. Duas formas morfologicamente distintas do
anuro Hypsiboas bischoffi são geograficamente separadas por uma fronteira latitudinal ao sul da Mata Atlântica. Análises
filogenéticas através dos métodos de Máxima Verossimilhança, Máxima Parcimônia e de inferências Bayesianas revelaram
um padrão filogeográfico concordante com a diversidade fenotípica observada: duas linhagens divergentes (Da=4.6%)
ao sul e ao norte da fronteira entre os estados de São Paulo e Paraná. Adicionalmente, a linhagem do sul apresentou
subclados bem suportados e geograficamente estruturados. Inferências coalescentes da demografia histórica não suportam
as hipóteses de expansão em larga escala a partir de refúgios quartenários espacialmente isolados, mas suportam hipóteses
de expansão em menor escala em diversos subclados. O nível de polimorfismo do marcador nuclear é reduzido quando
comparado com o DNA mitocondrial e não permite distinguir linhagens divergentes. Três outras espécies de anuros
apresentaram um padrão de divergência genética semelhante, em linhagens geográficas que são concordantes com H.
bischoffi e alguns outros organismos na Mata Atlântica. Os padrões filogeográficos revelados até o momento sugerem
que a diversificação dos organismos em estudo está mais associada com processos neotectônicos passados e recorrentes
da costa brasileira do que previsões de flutuações demográficas sugeridas por modelagem paleoclimática.
Apoio Financeiro: FAPESP.
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Diversidade no gênero Enyalius
(Leiosauridae, squamata) endêmico do
Brasil, revelada por seqüências do DNA
mitocondrial e nuclear
Bertolotto, CEV1,3; Rodrigues, MT2; Yonenaga-Yassuda, Y; Pellegrino, KCM4
Depto. Genética e Biologia Evolutiva e
Depto. Zoologia do Instituto de Biociências da USP, São Paulo
3
Universidade de Santo Amaro, São Paulo
4
Depto. Ciências Biológicas, Universidade Federal de São Paulo, Campus Diadema, SP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Enyalius, filogenia molecular, diversidade de espécies
Enyalius é um gênero de lagartos endêmico do Brasil que, segundo a última grande revisão (1978), apoiada em caracteres
morfológicos, possui seis espécies, duas delas politípicas: E. bilineatus, E. brasiliensis (duas subespécies), E. catenatus (três
subespécies), E. iheringii, E. leechii e E. perditus. Exceto E. leechii que é amazônica, as demais espécies distribuem-se ao
longo da Mata Atlântica, do Rio Grande do Norte ao Rio Grande do Sul, em hábitats florestados do Brasil Central, da
Serra do Espinhaço e da Caatinga. Neste trabalho, foram coletadas seqüências parciais de genes do DNA mitocondrial
(16S, citocromo b, NADH4) e nuclear (C-mos) de 116 exemplares, pertencentes a nove espécies coletadas em 58
localidades brasileiras: Na Mata Atlântica: E. catenatus (BA, AL, PE, RN), MG, BA, ES), E. pictus (MG, BA, ES)
E. bibronii (BA, CE, PI), aqui consideradas espécies válidas, E. brasiliensis (ES), E. bilineatus (MG, DF, ES, GO), E.
iheringii (SP), E. perditus (SP, PR, MG, ES), e a espécie recentemente descrita, E. erythroceneus (BA); na Amazônia, E.
leechii (MT). As análises filogenéticas, utilizando seqüências concatenadas (2.146 pb) de 42 exemplares selecionados
(haplótipos não redundantes), foram realizadas no PAUP 4.0 para Máxima Parcimônia (MP) e Verossimilhança (MV)
e no MrBayes v.3.0 para a inferência Bayesiana (MB), considerando modelos de evolução específicos por partição nesta
última. Os modelos evolutivos foram selecionados no MODELTEST v.3.06 e valores de bootstrap e de probabilidade
a posteriori foram usados como índices de confiabilidade nos ramos recuperados por MP/MV e MB, respectivamente.
Urostrophus vautieri e duas espécies de Anolis foram usadas como grupos-externos. As análises de MV e MB resultaram
em topologias mais resolvidas. Dois grandes clados foram observados: clado 1 composto pelas espécies E. brasiliensis,
E. iheringii e E. perditus e o clado 2, formado por E. bibroni, E. bilineatus, E. catenatus, E. pictus, E. erythroceneus e duas
novas espécies. E. leechii da Amazônia é a espécie mais basal desse clado. Delimitando geograficamente a ocorrência
desses dois clados está o Rio Doce: ao sul deste está o clado 1 e ao norte, o clado 2. Os rios Jequitinhonha e o Rio
São Francisco delimitam a ocorrência das espécies E. pictus e E. catenatus, respectivamente. Com base nessa filogenia
molecular e em análises morfológicas, o gênero Enyalius seria composto de, pelo menos, 11 espécies, e sugere que os rios
da costa atlântica brasileira podem ter atuado no processo de diferenciação no gênero. Enyalius também se caracteriza
por uma conspícua diversidade cariotípica: 2n=36 (12M+24m), 2n=38 (14M+24M) e 2n=46 (22M+24), sugerindo
o envolvimento de rearranjos do tipo fusão/fissão cêntrica.
Apoio financeiro: FAPESP, CNPq.
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Alelos exclusivos indicam introgressão em
espécies de tartarugas marinhas
Vargas, SM1; Soares, L2; Santos, FR1
Laboratório de Biodiversidade e Evolução Molecular, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais
2
Fundação Pró-Tamar
[email protected]
1
Palavras-chave: hibridização, introgressão, microssatélites, Eretmochelys imbricata, Caretta caretta
A tartaruga de pente, Eretmochelys imbricata, é considerada criticamente ameaçada pela IUCN, e no Brasil, devido à
pesca e captura para peças de artesanato, são poucas as desovas remanescentes. Já a tartaruga cabeçuda, Caretta caretta
é considerada em perigo pela IUCN e pelo IBAMA. Hibridização entre essas duas espécies já foi relatada em estudos
utilizando DNA mitocondrial, mas a natureza uniparental deste marcador limita a resolução dos resultados exigindo
análises adicionais com marcadores nucleares autossômicos. Neste estudo buscamos identificar alelos exclusivos em
populações das espécies parentais (E. imbricata e C. caretta) através do uso de 5 loci de microssatélites (OR1, OR2,
OR3, Cc1G02 e Cc1G03). Foram analisados 134 indivíduos da espécie E. imbricata (com DNAmt de E. imbricata),
71 indivíduos da espécie C. caretta (com DNAmt de C. caretta) e 53 indivíduos híbridos do litoral norte da Bahia
(anteriormente identificados morfologicamente como E. imbricata, mas com DNAmt de C. caretta). Para os 5 loci
foram encontrados 37 alelos na população de E. imbricata (média de 7,4 alelos/locus), dentre os quais, 18 alelos eram
exclusivos para esta espécie (média de 3,6 alelos exclusivos/locus). Na população de C. caretta foram encontrados 41
alelos (média de 8,2 alelos/locus) dentre os quais, 21 alelos exclusivos (média de 4,2 alelos exclusivos/locus). A população
híbrida apresentou 40 alelos (média de 8 alelos/locus) sendo, 13 alelos exclusivos de E. imbricata, 12 exclusivos de C.
caretta, 15 compartilhados entre as duas espécies e nenhum exclusivo de híbridos. As médias das heterozigosidades
observadas (Ho) e esperadas (He) para as três populações estudadas foram 0,39 e 0,51 para a população de C. caretta
(sendo um locus monomórfico e 2 loci em Equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW)), 0,42 e 0,44 para E. imbricata (4
loci em EHW) e 0,89 e 0,7 para híbridos (apenas 1 locus em EHW), fato este que demonstra claramente a natureza
híbrida desta população que apresenta a grande maioria de seus indivíduos heterozigotos por possuírem alelos específicos
tanto da espécie C. caretta como de E. imbricata. Mesmo com uma freqüência de 11% de indivíduos homozigotos,
nenhum indivíduo da população híbrida apresentou homozigose para mais de 2 loci e no mínimo 5 indivíduos híbridos
apresentaram possível introgressão (cruzamento com uma das espécies parentais) com E. imbricata e 2 com C. caretta
para pelo menos 1 locus. Em larga escala, este processo de hibridização com subseqüente introgressão pode colocar em
risco a identidade das espécies parentais, bem como afetar o valor adaptativo populacional. Caso sejam detectadas,
futuramente, conseqüências deletérias deste processo de hibridização, medidas de conservação devem ser tomadas no
sentido de diminuir o impacto deste evento para garantir a integridade destas duas espécies ameaçadas de extinção.
Apoio financeiro: FAPEMIG e CAPES (custeio de laboratório e bolsa), CENPES/PETROBRAS (coleta do material
biológico).
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Estudo cariotípico em Podocnemis expansa
e Podocnemis sextuberculata (Testudines,
Podocnemididae), tartarugas
da Amazônia Brasileira
Rezende, CF; Monjeló, LAS
Universidade Federal do Amazonas
[email protected]
Na América do Sul encontramos seis espécies do gênero Podocnemis: Podocnemis vogli, P. lewyana, P. expansa,
P. unifilis, P. sextuberculata e P. erythrocephala; sendo as quatro últimas encontradas no Brasil, principalmente na
Amazônia. Apesar dos quelônios de água doce da Amazônia serem relativamente grandes e de grande utilidade
para o homem, existem poucos estudos sobre a sua biologia. Poucos são os estudos citogenéticos desenvolvidos
entre os quelônios. No ponto de vista da citotaxonomia, genotoxicidade e citogenética molecular, este é o grupo
mais desprezado entre os répteis. Isto se deve, talvez a dificuldade de se obter material para a análise citogenética,
entre algumas espécies. Uma outra dificuldade entre os répteis está na obtenção de células metafásicas para o estudo
cariotípico através da indução da cultura de células, principalmente por apresentarem variação de temperatura corporal
de acordo com o meio ambiente e exibirem um ciclo de divisão celular lento. São limitados os dados publicados
sobre a morfologia dos cromossomos e a evolução cariotípica entre as tartarugas, principalmente entre as espécies do
gênero Podocnemis. Estudos citogenéticos foram realizados em Podocnemis expansa e Podocnemis sextuberculata,
tartarugas da Amazônia brasileira, para uma melhor caracterização dos cromossomos destas espécies. Este trabalho
traz a caracterização do cariótipo e a localização da NOR em duas espécies do gênero Podocnemis, com o objetivo de
ampliar os estudos citogenéticos em tartarugas da região amazônica, complementando os poucos estudos realizados
anteriormente, contribuindo para estudos futuros em citotaxonomia e polimorfismo cromossômicos entre quelônios.
Para a obtenção de cromossomos mitóticos foi utilizada a técnica de cultura de linfócitos em meio de cultura para
cariótipo (RPMI) e os resultados mostraram que o número cariotípico para P. sextuberculata e P. expansa é 2n=28
cromossomos, que consiste de 5 pares de macrocromossomos e 9 pares de microcromossomos, sendo 22M + 2SM +
4A e NF=52. O estudo da região organizadora de nucléolo nestas duas espécies se deu por meio da impregnação pelo
nitrato de prata e evidenciou uma NOR simples na região centromérica do primeiro par cromossômico. O número
diplóide encontrado foi o mesmo descrito na literatura. Entretanto, os dados de NOR são descritos pela primeira vez
entre as duas espécies.
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Caracterização cariotípica de duas espécies
do Sub-ordem Cryptodira (Testudines)
da República Argentina: Trachemys dorbigni
(Emydidae) e Chelonoidis donosobarrosi
(Testudinidae)
Martinez, PA1; Boeris, J1; Sánchez, J2; Bolzan, AD2; Ledesma, MA3
1
Departamento de Citogenética general, F.C.E.QyN, UNAM, Misiones, Argentina
Instituto Multidisciplinario de Biología Celular (IMBICE), La Plata, Bs. As., Argentina
3
Laboratorio de Genética. Estación de Hidrobiología y Piscicultura, Centro de Rehabilitación y Recría de Animales, Parque Ecológico El Puma. Ruta
Nacional 12, Candelaria, Misiones, Argentina
[email protected]
2
Na Argentina encontram-se doze espécies continentais, das quais cinco correspondem à Suborden Cryptodira e nenhuma
delas foi estudada citogenéticamente. No presente trabalho foram analisados quatro indivíduos de Trachemys dorbigni
coletados na cidade de Chajari – Entre Rios, e dois de Chelonoidis donosobarrosi em “Los 2 pinos” Rio Negro, Argentina.
Para a obtenção do material do estudo foi empregada a técnica de cultivo de longa duração de linfócitos de sangue
periférico. A análise citogenética realizou-se mediante coloração convencional, banda C, Ag-RON, fluorocromo de base
específica (DAPI) e Hibridação in situ com sondas teloméricas (TTAGGG)n. O complemento cariotípico de T. dorbigni
foi 2n=50 (8:5:12), o bandamento C permitiu localizar as regiões heterocromáticas nas regiões centroméricas da maioria
dos cromossomos, com exceção do quinto par do grupo B que foi totalmente heterocromático, o qual apresentou as
regiões organizadoras do nucléolo. C. donosobarrosi mostrou um número diplóide 2n=52 (6:5:15), a partir da banda
C mostraram-se marcações positivas nas regiões centroméricas da maioria dos cromosomos, com exceção de um par
de microcromossomo que foi totalmente heterocromático. Na análise sequencial Giemsa – RON se pode observar
marcações positivas num par de microcromossomo. Nas duas espécies analisadas com DAPI não apresento marcação
positiva, evidenciando a ausência de regiões ricas em A-T heterocromáticas, e a partir do FISH com sondas teloméricas
observaram-se marcações nos quatro telómeros de todos os pares, em nenhum caso foi observada marcas intersticiais.
Ao comparar os dados obtidos no presente trabalho com as restantes espécies analisadas da família Emydidae mostrase uma grande homologia cariotípica. Na família Testudinidae não se observam variações no número diplóide, mas
existem grandes diferenças na morfologia cromossômica e a localização das RON. A partir da análise de hibirdação in
situ com sondas teloméricas (TTAGGG)n em T. dorbigni e C. donosobarrosi não observaram-se marcações intersticiais
nos pares cromossômicos, se bem este fato não refuta a idéia de eventuais fusões cêntricas, é possível que este grupo de
quelonios não se caracterize por apresentar este tipo de reestruturação cromossômica.
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Resumos do 54º Congresso Brasileiro de Genética • 16 a 19 de setembro de 2008
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Análise do cariótipo de Chelonoidis
carbonaria (Chelonia, Testudines)
Azeredo-Oliveira, MTV; Bonini-Domingos, CR; Vizotto, LD; Santos, JR; Lucena-Silva, T; Chessa, AF; Quintino, FH; Zago, CES
Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas (IBILCE) - Departamento de Biologia – Universidade Estadual Paulista (UNESP)
[email protected]
Palavras-chave: Chelonia, Chelonoidis carbonaria, cariótipo, Bandamento NOR, BandamentoG
A identificação citogenética é um dos parâmetros importantes para a conservação dos organismos no seu habitat
natural. O primeiro passo para a análise de uma espécie refere-se ao estudo do cariótipo dos cromossomos mitóticos
que permite conhecer a organização do genoma no nível citológico. Os quelônios (tartarugas, cágados e jabutis) tem
sido um dos grupos reptilianos mais negligenciados em relação aos estudos citotaxonômicos. Com o objetivo de ampliar
os conhecimentos sobre a estrutura cromossômica desses animais, utilizando uma técnica pouco invasiva, a partir da
cultura de linfócitos do sangue periférico, no presente trabalho foi realizado o estudo do cariótipo de machos e fêmeas
da espécie Chelonoidis carbonaria (Chelonia, Testudines). Esses animais são terrestres, popularmente conhecidos por
“jabuti piranga” ou “jabuti de patas vermelhas”, distribuídos em regiões de cerrado de vários países da América Central e
do Sul, incluindo o Brasil. Foram utilizados três casais procedentes do criatório do Japurá (Tabapuã – SP). O sangue foi
coletado por punção da veia margino-costal, inoculado em meio de cultura de tecidos com adição de fitohemaglutinina
para estimular a divisão celular e, posteriormente, de colchicina. Após os procedimentos rotineiros de hipotonização
as lâminas foram preparadas e o material foi fixado com metanol-ácido-acético. Para as análises cromossômicas foram
utilizadas as seguintes técnicas: coloração convencional para Giemsa; Bandamentos G e NOR. As análises citogenéticas
resultantes da coloração convencional e Bandamento G indicaram que o número cromossômico diplóide padrão para
a espécie estudada é de 2n = 52 cromossomos para machos e fêmeas. O cariograma dos machos apresentou a seguinte
distribuição: Grupo A: 14 pares de macrocromossomos (3 pares metacêntricos; 10 pares submetacêntricos e 01 par
acrocêntrico); Grupo B: 07 pares de macrocromossomos acrocêntricos; Grupo C: 05 pares de microcromossomos
(posição centromérica desconhecida). O cariograma das fêmeas apresentou uma classificação semelhante em relação
aos Grupos A e C, no entanto, os sete pares de macrocromossomos do Grupo B apresentaram-se metacêntricos. A
técnica de bandamento NOR identificou os cromossomos portadores da Região Organizadora Nucleolar (RON),
que são representados por um par de cromossomos acrocêntricos pequenos nos machos e apenas um cromossomo
acrocêntrico nas fêmeas e pertencem ao Grupo B. O presente trabalho revelou que é possível estudar o cariótipo desses
quelônios utilizando protocolos econômicos e viáveis para cultura de células, sem agredir o animal e preservando-o no
seu próprio habitat.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES e FUNDUNESP.
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Diversidade de microssatélites em
tartarugas de couro, Dermochelys coriacea
(Reptilia: Dermochelyideae)
Molfetti, E1; Vargas, SM1; Monteiro, DS2; Estima SC2; Soares LS3; Santos, FR1
Laboratório de Biodiversidade e Evolução Molecular, ICB, UFMG, Belo Horizonte, MG, Brasil
2
Núcleo de Educação e Monitoramento Ambiental, NEMA, Rio Grande, RS, Brasil
3
Fundação Pró-Tamar, Salvador, BA, Brasil
1
Palavras-chave: Dermochelys, microssatélites, diversidade genética, genética de populações, conservação
Dermochelys coriacea é a espécie de tartaruga marinha mais ameaçada de extinção no Brasil e no mundo, considerada
“criticamente em perigo” pela IUCN e pelo IBAMA. A população de desova no Brasil é bastante restrita (cerca de 10
indivíduos por ano), ocorrendo apenas na costa do Espírito Santo. Apresenta larga distribuição pelos oceanos, por ser
melhor adaptada a águas frias do que as outras espécies. No Brasil, também são observados na costa das regiões sul,
sudeste e nordeste. Com o objetivo de analisar a diversidade genética da população de desova (Espírito Santo) e de um
agregado pelágico (principalmente da costa do Rio Grande do Sul) foram usados quatro loci de marcadores microssatélites
autossômicos (Nigra32, Nigra200, Dc99 e P186). Biópsias de pele coletadas de 10 indivíduos da área de desova e 39
indivíduos do agregado foram processadas e genotipadas para todos os loci. O locus Nigra32 apresentou 4 alelos e os
loci Nigra200, Dc99 e P186 apresentaram 5 alelos cada. Para a área de desova, as heterozigosidades observadas (Ho) e
esperadas (He) foram respectivamente, 0,56 e 0,66 para o locus Nigra32, 0,38 e 0,46 para Nigra200, 1,00 e 0,76 para
Dc99 e 0,44 e 0,45 para P186, estando a população em equilíbrio de Hardy-Weinberg (HW) para todos os loci. A
média da He para esta população foi 0,58. Já para o agregado pelágico, as Ho e He foram 0,47 e 0,52 para Nigra32,
0,13 e 0,36 para Nigra200, 0,30 e 0,59 para Dc99 e 0,26 e 0,48 para P186, estando a população em equilíbrio de HW
apenas para o locus Nigra32. A média da He para esta população foi 0,49. O fato de não ser observado o equilíbrio
de HW para o agregado pelágico indica que há uma subestruturação populacional, isto é, estas tartarugas devem ser
oriundas de distintas localidades, tal como indicado por estudos prévios com o DNA mitocondrial (DNAmt). Estes
resultados também mostram índices de diversidade relativamente baixos quando comparados com indivíduos de uma
área de alimentação de Caretta caretta (espécie considerada “em perigo de extinção”) que apresentou He média igual a
0,89. As conclusões são relevantes, pois mostram a necessidade urgente da conservação da espécie D. coriacea em nível
global. Como são animais migratórios que ocorrem nos vários oceanos e zonas costeiras dos diferentes continentes, o
esforço e a conscientização devem ser em escala mundial, para que não se perca ainda mais diversidade genética desta
espécie, aumentando suas chances de sobrevivência na natureza.
Apoio Financeiro: CNPq, CAPES, PROBIO, CMA/ICMBio e CENPES/PETROBRAS.
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Caracterização da região controle do DNA
mitocondrial e análise de estoque misto de
tartarugas-verdes (Chelonia mydas) da Ilha
do Arvoredo, SC
Proietti, MC1; Lara-ruiz, P; Reisser, JW; Pinto, L DA S; Dellagostin, OA; Marins, LF
Departamento de Oceanografia, Programa de Pós-Graduação em Oceanografia Biológica, Universidade Federal do Rio Grande (FURG)
[email protected]
1
Palavras-chave: tartaruga-verde, área de alimentação, mtDNA, estoque misto, origens natais
Foram determinadas as características genéticas de uma agregação alimentar de tartarugas-verdes (Chelonia mydas) no
sul do Brasil, empregando-se seqüências da região controle do DNA mitocondrial (mtDNA) de 49 animais capturados
manualmente na Ilha do Arvoredo (SC). Oito haplótipos foram identificados, com dominância de 64% do haplótipo
mais comum encontrado no Oceano Atlântico equatorial sul, o CM-A8. Esta dominância foi seguida por uma
ocorrência de 22% do haplótipo CM-A5; os haplótipos restantes (CM-A9, CM-A10, CM-A24, CM-A32, CM-A39
e CM-A45) estiveram presentes em baixas freqüências (< 5%). Diversidade haplotípica (h) e nucleotídica (π) foram
0,5570 ± 0,0697 e 0,0021 ± 0,0016, respectivamente. Testes de diferenciação entre a área de estudo e dez outras áreas
de forrageio do Oceano Atlântico revelaram que a primeira é significativamente diferente (P < 0,05) da maior parte
das áreas, exceto Ubatuba (SP), Atol das Rocas (RN), Cananéia (SP) e Argentina, que se encontram próximas à área
de estudo, no Atlântico Sudoeste. AMOVA revelou valores de ΦST semelhantes, sem diferenças significativas entre
a área de estudo e áreas de alimentação mais próximas (P > 0,05). A análise de estoque misto (mixed stock analysis
– MSA) foi efetuada incorporando como possíveis populações-fontes nove áreas de desova do Atlântico e uma do
Mediterrâneo: Ilha Trindade (ES), Atol das Rocas (RN), Ilha Ascension (Reino Unido), Polião (Guinea Bissau), Ilha
Bioko (Guinea Equatorial), São Tomé, Ilha Aves Island, Matapica (Suriname), Quintana Roo (México), Tortuguero
(Costa Rica), Flórida (Estados Unidos) e Baía Lara (Cyprus). Esta análise indicou as ilhas Ascension e Aves (68.82% e
22.8%, respectivamente) como os principais contribuintes para a agregação mista da Ilha do Arvoredo, com menores
contribuições de Guinea Bissau (2.96%) e Trindade (1.8%) e contribuições praticamente nulas das outras áreas avaliadas.
Estes resultados demonstram as extensas relações entre o local de estudo e outras áreas de alimentação e reprodução
do Oceano Atlântico; tal entendimento é essencial para o estabelecimento de estratégias adequadas para o manejo e
conservação desta espécie ameaçada.
Apoio financeiro: CNPq, Rufford Small Grants (RSG) e People’s Trust for Endangered Species (PTES).
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Genética da Conservação de Podocnemis
unifilis (Testudines, Pleurodira)
da Amazônia Brasileira
Viana, MNS1; dos Santos, RC1; Monjeló, LAS1; de Andrade, PCM1; Vogt, RC2; Hrbek, T1; Farias, IP1
1
Laboratório de Genética, Universidade Federal do Amazonas, Manaus-AM
Laboratório de Ecologia de Quelônios, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
[email protected]
2
A América do Sul comporta aproximadamente 20% de todas as espécies de tartaruga existentes no mundo e, no
Brasil, estes animais também têm grande importância devido à utilização de sua carne e ovos na alimentação de
populações ribeirinhas e por possuir um alto valor no comércio. Na Amazônia brasileira os quelônios mais utilizados
na alimentação são os do gênero Podocnemis, dentre eles P. unifilis, conhecida popularmente como tracajá. Esta espécie
tem ampla distribuição nos rios da Amazônia, podendo ser encontrada em rios de água preta, clara e branca, em lagos
e reservatórios. Esta espécie vem sendo explorada permanentemente pelo homem, sendo classificada como vulnerável
pela União Internacional para a Conservação da Natureza e dos Recursos Naturais (IUCN). Como a exploração pode
causar profundas modificações na densidade e na estruturação populacional de espécies, estimar e comparar a variação
genética existente dentro e entre as populações é de suma importância para diagnosticar a situação atual das espécies
e planejar práticas conservacionistas como elaboração de projetos de manejo adequados para cada espécie. O presente
trabalho teve como objetivo caracterizar e analisar os níveis de variabilidade genética intra e interpopulacional em
populações naturais de P. unifilis. Amostras de sangue foram coletadas dos animais durante os trabalhos de manejo dos
filhotes realizados pelo IBAMA, sem que houvesse a necessidade de sacrificar nenhum animal. As localidades amostradas
foram Terra Santa (rio Nhamundá-PA), Oriximiná (rio Trombetas e rio Jarauacá-PA), Parintins (rio Amazonas-AM),
Barreirinha (rio Andirá-AM), Manicoré (rio Madeira-AM), Itamarati (rio Juruá-AM), Juruá (rio Juruá-AC). Um total
de 117 amostras foi seqüenciada para a Região Controle do genoma mitocondrial (487 pares de bases). Os níveis de
variabilidade genética foram bastante altos em todas as populações amostradas. Os resultados de AMOVA indicaram que
grande parte da variação genética encontra-se dentro das populações (74%) enquanto que entre populações a variação foi
pequena (26%). Tais resultados evidenciaram uma forte estrutura genética entre as populações (FST= 0,2592, P<0,001).
Os valores do índice de fixação FST foram significativos nas comparações entre a população de Jarauacá com todas as
outras populações, esta também mostrou limitado fluxo gênico (baixos valores de Nm) com as demais localidades, isto
indica que esta população se encontra estruturada geneticamente. Para algumas outras localidades amostradas também
foram observados baixos valores para o Nm, mas estes valores foram observados apenas entre as populações que estão
mais distantes geograficamente, indicando que este isolamento pode ser provocado pela distância. O fato da população
do Jarauacá mostrar estruturação genética sugere que a mesma deve ser considerada como uma Unidade de Manejo
diferenciada nas práticas conservação visando preservar seu patrimônio genético.
Orgão financiador: CNPQ/UFAM.
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O papel de barreiras geográficas na estrutura
genética de irapuca (P. erythrocephala) em
ecossistemas fluviais amazônicos
Santos, RC1,2; Viana, MNS2; Monjeló, LAS2; Andrade, PCM3; Oliveira, PHG3; Sites, J4; Vogt, RC1; Pezzuti, JCB5; Hrbek, T2,6; Farias, IP2
1
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia/INPA, Manaus, Amazonas, Brasil
Laboratório de Evolução e Genética Animal/LEGAL, Universidade Federal do Amazonas/UFAM, Manaus, Amazonas, Brasil
3
Projeto Pé-de-Pincha, Faculdade de Ciências Agrárias, Universidade Federal do Amazonas/UFAM, Manaus, Amazonas, Brasil
4
Department of Integrative Biology, Brigham Young University, Provo, UT, USA
5
Núcleo de Altos Estudos Amazônicos, Universidade Federal do Pará/UFPA, Belém, Pará, Brasil
6
University of Puerto Rico - Rio Piedras, San Juan, PR
2
Das quatro espécies do gênero Podocnemis encontradas na Amazônia brasileira, a espécie que apresenta distribuição
mais restrita é a irapuca (Podocnemis erythrocephala), que vive em água preta e em água clara. A irapuca é altamente
explorada e nas cidades pequenas existe pouco ou nenhum controle sobre esta exploração. Esta espécie é classificada
pela União Internacional para Conservação da Natureza dentro da categoria vulnerável, devido à pressão de coleta
de seus ovos e da caça dos indivíduos adultos pelos ribeirinhos. No intuito de determinar a diferenciação genética de
P. erythrocephala como um efeito da atuação de cachoeiras e/ou corredeiras e de rios como barreiras geográficas, dez
localidades distribuídas ao longo da bacia Amazônica brasileira foram estudadas com o auxílio de um marcador de
linhagem materna. Duzentos e quarenta e seis espécimens foram seqüenciados para a região controle mitocondrial e as
análises de variância molecular revelaram alto grau de subdivisão populacional (ФST = 0,27931, P < 0,001). Os valores
do índice de fixação ФST foram significativos para as localidades do Parque Nacional do Jaú, São Gabriel da Cachoeira
e Barreirinha, que evidenciaram também limitado fluxo gênico (Nm) em comparação com as outras localidades.
Isto demonstra que estas populações são distintas entre si, ou seja, estão diferenciadas geneticamente. No entanto, o
isolamento por distância não é o fator responsável para explicar este padrão, uma vez que não houve correlação entre
a variação genética e a distância geográfica segundo o teste de Mantel. Neste caso, a diferenciação genética encontrada
pode ser explicada pela presença de cachoeiras e corredeiras no entorno das localidades do Parque Nacional do Jaú e
São Gabriel da Cachoeira. No caso da localidade de Barreirinha, a diferenciação genética fornece considerável suporte
para a hipótese do rio Amazonas como barreira. Estas estruturas geomorfológicas (cachoeiras e/ou corredeiras da bacia
do rio Negro e o rio Amazonas) parecem constituir barreiras físicas eficientes limitando o fluxo gênico de indivíduos de
irapuca entre estas e as demais localidades. Para as comparações entre as outras localidades os valores do ФST não foram
significantes contrastando com os altos valores de Nm (número de migrantes por geração). Este resultado indica que
não existe estrutura genética entre as demais localidades e que o número de migrantes estabelece elevado fluxo gênico
entre as amostras. Tais localidades compõem uma grande população panmítica e fazem parte de um mesmo estoque
que ocorre ao longo da Amazônia brasileira. Entretanto, entre as amostras populacionais de irapuca analisadas na região
Amazônica existem subpopulações demograficamente distintas (Parque Nacional do Jaú, São Gabriel da Cachoeira e
Barreirinha) e que devem ser tratadas como unidades de manejo separadas no intuito de monitorar as populações e
designar políticas de conservação que mantenham a viabilidade das populações e da espécie.
Financiamento: FAPEAM, CNPq.
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Diferenciação de espécies de crocodilianos
brasileiros pela análise de polimorfismos
de comprimento de fragmento
de restrição (RFLP)
Villela, PMS; Silva, NA; Verdade, LM; Coutinho, LL
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Departamento de Zootecnia, Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: PCR-RFLP, Citocromo b, crocodilianos brasileiros
Os crocodilianos brasileiros, chamados de jacarés, pertencem à subfamília Alligatorinae (King & Burke, 1989). No
Brasil encontram-se as seguintes espécies: P. palpebrosus (jacaré-paguá), P. trigonatus (jacaré-coroa), M. niger (jacaréaçu), C. crocodilus (jacaré-tinga), C. yacare (jacaré-do-pantanal) e o C. latirostris (jacaré-de-papo-amarelo). Um aspecto
importante da conservação da biodiversidade é a formulação de leis de controle do uso, comércio e exportação de
produto de animais. A identificação correta dessas espécies é de fundamental importância para a escolha de métodos de
controle mais adequados. O problema com crocodilianos é que existem espécies próximas cujo comércio é legalizado
ou a espécie protegida pode ser comercializada se proveniente de cultivo. Nesses casos, as fazendas de cultivo podem ser
usadas para a legalização fraudulenta das espécies protegidas. Já se observou que a comercialização mundial de peles de
jacaré (gênero Caiman) é superior a um milhão de pele por ano, das quais apenas a metade vem de fontes legalizadas
(Brazaititis et al., 1998).Às vezes, a identificação das peles pode ser feita pelo padrão de manchas e pelo seu relevo. No
entanto, em outras situações, como na comercialização da carne, essa identificação não é tão simples. Nesses casos,
marcadores moleculares podem ser de extrema valia, pois permite a identificação não ambígua mesmo de produtos
industrializados. No intuito de diferenciar as seis espécies de crocodilianos brasileiros, foram desenhados primers que
amplificam 357 pares de bases do Citocromo b, que é considerada uma região conservada do DNA mitocondrial. Foi
realizado a amplificação e o sequenciamento de 10 indivíduos de cada espécie, de distribuição diferente. As análises dos
sítios de restrição destas seqüências foram feitas com o auxílio do programa Pdraw 32. As enzimas que apresentavam
sítios polimórficos em determinada espécie e ausência nas demais, ou que gerassem fragmentos de tamanhos diferentes
de acordo com o local do sítio de restrição em cada espécie, foram selecionadas. As enzimas AluI, HaeIII e TaqI e AciI
foram utilizadas para análise de polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição (RFLP), e permitiram uma
diferenciação visual clara dos fragmentos em gel de agarose, uma metodologia mais acessível para a identificação das
espécies, pois não é necessário o sequenciamento do DNA dos indivíduos. Sendo assim a diferenciação das espécies foi
realizada com sucesso. Esta técnica poderá ser utilizada pelo IBAMA (Instituto brasileiro do meio ambiente e recursos
renováveis) para controle de comercialização de carne e couro de jacaré, estimulando a comercialização legalizada do
animal e punindo as fazendas de cultivo que são usadas para a legalização fraudulenta.
Apoio financeiro: FAPESP.
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Filogeografia do gavião-real (Harpia
harpyja) nas florestas do Brasil: uma
abordagem para a conservação
Banhos, A1,2,3; Toffoli, D2; Hrbek, T2,4; Sanaiotti, T1; Farias, IP2
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA, Manaus – AM, Brasil
2
Universidade Federal do Amazonas – UFAM, Manaus – AM, Brasil
3
Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade – ICMBio, Brasil
4
University of Puerto Rico, Río Piedras, San Juan, Puerto Rico
[email protected]
1
Palavras-chave: harpia, filogeografia, Amazônia, floresta Atlântica, conservação
O gavião-real é uma das maiores águias do mundo, habita o dossel das florestas neotropicais e possui ampla distribuição no Brasil.
Na Amazônia, os registros de gavião-real são relativamente freqüentes, facilitado pelo intenso processo antrópico de exploração
florestal que expõem os indivíduos da espécie. Entretanto, na floresta Atlântica, os registros nas últimas décadas se tornaram
extremamente raros devido ao acentuado desflorestamento. Nós analisamos 200pb da porção mais variável da região controle
do DNAmt de 106 indivíduos da natureza, criadouros e museus, procedentes da distribuição histórica e atual da espécie no
Brasil. Encontramos 13 sítios segregantes entre as seqüências analisadas e 17 haplótipos em toda a amostragem. O haplótipo
mais freqüente (51%) se apresentou bem distribuído dentro da área geográfica amostrada. Observamos nove haplótipos para
32 indivíduos da floresta Atlântica, onde cinco são exclusivos. Destes haplótipos exclusivos, três são de indivíduos mantidos
em cativeiro (dois da Bahia e um do Paraná) e dois são de três indivíduos depositados em museus (um indivíduo datado de
1997 e outros dois compartilhando o mesmo haplótipo, sendo que um indivíduo é datado de 1949 e outro de 1970, todos
do Espírito Santo). Para a Amazônia encontramos oito haplótipos exclusivos entre os 74 indivíduos analisados, um valor
proporcional ao encontrado na floresta Atlântica. As diversidades haplotípicas (Ĥ=0,13954) e nucleotídicas (π=0,009070)
referentes a toda a amostragem foram relativamente altas se comparadas aos valores encontrados para outras aves de rapina
em outros estudos. Na Nested Clade Phylogeographic Analysis, a hipótese nula de não associação da distância geográfica e a
distribuição da diversidade genética não pode ser rejeitada para os clados de níveis hierárquicos inferiores, mas para o nível
hierárquico mais abrangente o resultado aponta para restrição no fluxo gênico com isolamento por distância. Na amostragem
previamente subdividas para teste de estrutura populacional através da Análise de Variância Molecular, detectamos significativa
estrutura (Fst =0,05802; p= 0,01662). Na análise pair-wise Fst, a floresta Atlântica norte e Amazônia central-oriental foram os
únicos grupos que apresentaram estrutura populacional significativa após a correção de Bonferroni (Fst= 0,33890; p<0,00001).
Detectamos significante desvio negativo do equilíbrio genético do DNAmt no teste de Fu (Fs=-20,38757; p<0,00001), indicando
recente expansão populacional. Análises prévias que realizamos através de loci microssatélites corroboram com os resultados
apresentados acima. Os resultados são coerentes com a alta capacidade de dispersão do gavião-real e sugerem que corredores
de florestas conectam ou conectaram a Amazônia e a floresta Atlântica permitindo o fluxo gênico da espécie. Dos indivíduos
amostrados na floresta Atlântica, apenas um encontra-se livre na natureza, na floresta do sul da Bahia. Recomendamos que
sejam planejadas estratégias de recuperação populacional da espécie na floresta Atlântica, tornando-a viável para persistir em
longo tempo e visando conservar a variabilidade genética encontrada exclusivamente na região.
Apoio financeiro: Fundação O Boticário; Cleveland Zoological Society; CAPES; FAPEAM; Programa BECA/IEB; Fundação
Djalma Batista.
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Padrões de bandeamento C e hibridização
in situ com sondas de rDNA em Caracará
plancus e Milvago chimachima
(Falconidae, Polyborinae)
Araújo,CCD 3; Moura, SP 3; Pieczarka, JC 1,2; Rissino, J.D.1; Nagamachi, CY 1,2; de Oliveira, EHC1
Laboratório de Citogenética, ICB, UFPA
Bolsista Produtividade Científica, CNPq
3
Bolsista PIBIC/CNPq
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Falconidae, Polyborinae, rDNA, bandeamento C
Falconidae é uma família de aves de rapina diurnas que conta com dez gêneros e 61 espécies. É dividida em duas
subfamílias: Falconinae, com quatro gêneros e 45 espécies e Polyborinae que compreende seis gêneros e 16 espécies.
A distinção dessas subfamílias também é apoiada pelos dados citotaxonômicos, visto que Falconinae apresenta em
média 2n=48-50, enquanto as espécies de Polyborinae mostram números diplóides elevados, próximos a 90. Apesar
da grande diferença entre os números diplóides de Falconinae e Polyborinae, há algumas características em comum
entre os cariótipos, como a presença do cromossomo Z acrocêntrico e a dominância de pares de um braço. De todo
modo, a maioria dos dados existentes se baseia somente na descrição do número diplóide e morfologia cromossômica,
principalmente em Polyborinae. Além disso, há discrepâncias nos números diplóides descritos para espécies dessa
subfamília. Dessa forma, este trabalho teve como objetivo a análise do cariótipo de duas espécies de Polyborinae,
Caracara plancus e Mivalgo chimachima, através de coloração convencional, bandeamento C e hibridização in situ com
sondas de rDNA. Amostras de polpa dérmica foram utilizadas para cultura de fibroblastos e obtenção de cromossomos.
Os resultados obtidos mostram que as duas espécies apresentaram 2n=92, com um grande número de cromossomos
puntiformes. Todos os cromossomos das duas espécies, autossomos e sexuais, são acrocêntricos, com exceção do par 6
de C. plancus, que é metacêntrico. Os blocos de heterocromatina constitutiva foram observados na região centromérica
de todos os pares. Em C. plancus o cromossomo W mostrou um grande bloco heterocromático intercalar. As sondas
de rDNA hibridizaram em um par de microcromossomos em M. chimachima e em dois pares de microcromossomos
em C. plancus.
Apoio Financeiro: CNPq (472544/2006-3), CAPES, UFPA.
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Sexagem cromossômica de Amazona aestiva e
Ara chloroptera (Psittacidae) do zoológico da
Universidade de Passo Fundo, com descrição
do padrão heterocromático em A. aestiva
Souza, VT; Bruschi, DP; Porto, M; Busin, CS
Instituto de Ciências Biológicas, Universidade de Passo Fundo, RS
[email protected]
Palavras-chave: Sexagem, Heterocromatina, Cariótipo, Psittacidae, Taxonomia
A citogenética tem contribuído de forma eficiente na determinação sexual de aves monomórficas mantidas em
cativeiro. Além disso, contribui ainda no entendimento taxonômico e filogenético do grupo, um dos menos estudados
citogeneticamente. A determinação sexual é fundamental em instituições envolvidas na conservação animal, uma
vez que a implementação de programas de reprodução em cativeiro precisa da sexagem para garantir a eficiência
dos mesmos. Com o objetivo de sexar e de contribuir com dados cromossômicos para o melhor entendimento da
taxonomia dos psitacídeos, analisamos citogeneticamente três espécimes de Amazona aestiva e um espécime de Ara
chloroptera pertencentes ao plantel do Zoológico da UPF. As células em divisão foram obtidas por meio de cultura
de longa duração de linfócitos de sangue periférico. As metáfases foram submetidas à coloração convencional com
Giemsa 10% e ao bandamento C. O cariótipo de A. chloroptera é constituído por 2n=70 cromossomos dos quais, 12
pares são macrocromossomos e 20 são microcromossomos. Os cromossomos dos pares 1, 7, 8 e 11 são metacêntricos,
dos pares 5, 6, 9 e 10 submetacêntricos e dos pares 2, 3 e 4 subtelocêntricos. O cromossomo Z é metacêntrico com
tamanho semelhante ao par 5 enquanto que o W é um pequeno submetacêntrico. O cariótipo de A. aestiva apresenta
2n=70 cromossomos, destes, nove pares são macrocromossomos autossômicos. Os cromossomos dos pares 1, 5, 6, 7
e 8 são telocêntricos, dos pares 2, 3 e 4 são subtelocêntricos, enquanto que o par 9 é metacêntrico. O cromossomo Z
é metacêntrico, com tamanho semelhante aos cromossomos do par 3. A distribuição da heterocromatina no genoma
de A. aestiva é essencialmente centromérica. Os dados obtidos para o cariótipo de A. aestiva corroboram os de
outros autores, exceto na morfologia dos cromossomos do par 5, porém os de A. chloroptera diferem na morfologia
dos cromossomos dos pares 3, 6, 9 e do W. O espécime de A. chloroptera do plantel do Zoológico da UPF é uma
fêmea (ZW) enquanto que os três espécimes de A. aestiva analisados, são machos (ZZ).
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Caracterização de locos de microssatélite
em duas espécies brasileiras de Amazona
(Psittaciformes: Aves) ameaçadas de
extinção por meio de iniciadores heterólogos
Matos, MR; Caparroz, R; Collevatti, RG
Pós-graduação em Ciência Genômicas e Biotecnologia, Universidade Católica de Brasília
[email protected]
Palavras-chave: Amazona rhodocorytha, Amazona vinacea, microssatélite, iniciadores heterólogos, transferibilidade
O papagaio-chauá (Amazona rhodocorytha) é endêmico da Mata Atlântica do Brasil oriental e atualmente encontrase classificado na lista nacional de espécies da fauna brasileira ameaçadas (MMA/IBAMA) como espécie em perigo. O
papagaio-de-peito-roxo (Amazona vinacea) também é endêmico da Mata Atlântica e está classificado na lista nacional de
espécies da fauna brasileira como espécie vulnerável. Além da perda de hábitat natural em decorrência do desmatamento da
Mata Atlântica como conseqüência do crescimento da agricultura e de grandes centros urbanos, como Rio de Janeiro e São
Paulo, essas espécies são fortemente ameaçadas pela captura de filhotes para abastecer o tráfico ilegal de animais silvestres.
Os marcadores moleculares do tipo microssatélite têm sido muito utilizados na estimativa da variabilidade genética e na
determinação da vulnerabilidade genética de populações naturais, proporcionando subsídios importantes para auxiliar
programas de conservação de espécies ameaçadas. Contudo, o processo de desenvolvimento deste tipo de marcador molecular
é oneroso e laboratorialmente complexo. A utilização de iniciadores heterólogos tem se mostrado uma alternativa eficiente
para a aplicação deste tipo de marcador em estudos populacionais. No presente trabalho, foi avaliado a transferibilidade
de 18 pares de iniciadores heterólogos para amplificação de locos de microssatélite em Amazona rhodocorytha e Amazona
vinacea. Destes 18 pares, 13 foram desenvolvidos para Amazona guildingii e cinco para Ara ararauna. Inicialmente, o sucesso
de amplificação via PCR destes pares de iniciadores foi avaliado em dois indivíduos de cada espécie. Dos 18 iniciadores
testados, 13 (72%) amplificaram com sucesso em Amazona rhodocorytha e 16 (88%) em Amazona vinacea. Encontra-se
em andamento a caracterização do polimorfismo destes locos. Contudo, os resultados obtidos evidenciam um alto sucesso
na transferibilidade destes pares de iniciadores e apontam para um grande potencial de aplicação em futuros estudos em
que se avalie o status genético das populações naturais das espécies estudadas.
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Isolamento de marcadores moleculares em
Amazona aestiva (Papagaio verdadeiro)
para ciência forense
Pena, IF; Kalapothakis, E
Laboratório de Biotecnologia e Marcadores Moleculares, Instituto de Ciências Biológicas,
Departamento de Biologia Geral – Genética, Universidade Federal de Minas Gerais
[email protected], [email protected]
Palavras-chave: Amazona aestiva, marcadores moleculares
Marcadores moleculares são aplicados a um grande número de questões biológicas, como reconstruções filogenéticas,
genética de populações e genética da conservação, para, por exemplo, planejamento e monitoramento de programas
de reprodução em cativeiro. Na área forense esses marcadores são amplamente utilizados em testes de paternidade e
identificação de indivíduos. Neste estudo descrevemos o isolamento de marcadores moleculares para a ave Amazona
aestiva, espécie muito visada no comércio ilegal de animais. Sendo assim, foi realizada a construção de uma biblioteca
genômica primária não-enriquecida com DNA de Amazona aestiva que foi triada com sondas radioativas de temas
repetitivos. Os plasmídeos com resultado positivo foram selecionados e vários deles foram submetidos ao sequenciamento
automático. A biblioteca construída possui 5.173 clones independentes, e, após análise, foram obtidos 656 plasmídeos
com resultado positivo para as sondas utilizadas. Inicialmente foram escolhidos para sequenciamento 30 clones que
apresentaram sinal positivo, e foi utilizado iniciadores direto e reverso. Os clones seqüenciados até o momento indicam
o sucesso do processo utilizado, revelando microssatélites com grande potencial para estudos em genética de população
e forense animal. Foram encontrados microssatélites perfeitos e imperfeitos como (CCAT)14, (AAAAT)15(AAAT)
(AAAAT)7(AAAT), (CCA)3(CCCA)5(CCCCCTCC)(CCCACA)5. Este trabalho é uma parceria entre a UFMG e o
IBAMA e objetiva a fiscalização da origem dos espécimes comercializados, para inibir o tráfico ilegal dessa ave. Portanto
os marcadores descritos nesse trabalho serão uma ferramenta importante para a conservação da espécie em questão.
Apoio financeiro: IBAMA, PRONEX, Fapemig, CNPq, CAPES. Pena, I.F é aluna do programa de Pós-Graduação
em Genética da UFMG.
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Variação geográfica em comportamento
de corte e divergência genética entre
populações do uirapurú-de-coroa-azul
(Lepidothrix coronata, Aves: Pipridae)
Fortuna, JR1; Anciães, M1; Cohn-Haft, M1; Farias, IP2
Programa de Acervos e Coleções, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia - INPA
Laboratório de Genética Animal, Departamento de Biologia, Universidade Federal do Amazonas – UFAM
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Biogeografia, sistemática, seleção sexual, conservação
Comportamentos de corte são considerados caracteres evolutivamente plásticos entre táxons com sistema reprodutivo
não-baseado em recursos, sendo observada grande diversidade fenotípica em características sexuais secundárias entre
espécies relativamente próximas. Variação geográfica em corte entre populações deste grupo de espécies tem sido
foco de poucos estudos, os quais, entretanto, já embasaram práticas de conservação como a definição da distribuição
de unidades evolutivas independentes. Adicionalmente, observa-se nestas espécies estrutura genética independente
de barreiras geográficas ao fluxo gênico, indicando que a diversificação entre populações não se explica somente
por eventos vicariantes. O uirapurú-de-coroa-azul distribui-se da Amazônia brasileira à América Central, apresenta
considerável variação em plumagem e reproduz-se em leques poligínicos, como a maioria dos pássaros de sua família.
Estudamos a variação geográfica em seu comportamento de corte e a comparamos ao nível de divergência genética
entre 24 populações da Amazônia brasileira. Reconstruímos uma hipótese filogeográfica para a espécie, com base
em 900 pb do gene mitocondrial Cyt-b, e estimamos a distância genética entre populações, bem como sua causa.
Comparamos o repertório de exibição de cortes amostrados para três populações. Inferências filogenéticas indicaram
considerável estrutura genética, não correlacionada à distância geográfica entre populações, sendo apontada restrição
ao fluxo gênico devido à barreira geográfica entre clados distribuídos em margens opostas dos rios Negro (Mantel Z =
1.6; r2 = 0.074; p = 0.932) e Japurá-Solimões (Mantel Z = 28.45; r2 = 0.101; p = 0.998). Machos de duas populações
separadas pelo rio Negro exibiram cortes consistentemente diferentes quanto à forma e frequência de exibição de
elementos (e.g. “bandeira”, “gangorra”), além de diferenças no repertório (e.g. “salto- lateral”, “piscar-de-asa”). Uma
diferença em corte mais marcante foi observada comparando-se ambas populações a um clado mais distante, tanto em
forma e freqüência de elementos exibidos (e.g. “bandeira”, “giro-lateral”, “piscar-de-asa”, “salto-lateral”), quanto em
repertório (e.g. “vôo-tremido-rápido”, “vôo-espiral-coordenado”, “esticada-de-asa-com-salto-vertical”) e freqüência do
contexto social das exibições (e.g. solitário x grupo). Entretanto, a última população também compartilhou elementos
(“salto-lateral”, “piscar-de-asa”) exclusivamente com a população da margem oposta do rio Negro, em relação à sua
distribuição. Os resultados indicam correspondência entre variação comportamental e genética entre populações e que
caracteres comportamentais são relativamente plásticos. Estudos futuros devem testar se estas exibições estão sujeitas
a forte seleção sexual por fêmeas, e se contribuem para o isolamento reprodutivo de populações em ausência de
barreiras geográficas.
Apoio Financeiro: CNPq e FAPEAM.
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Lepidothrix vilasboasi (Sick, 1959): espécie
válida? Uso de marcadores moleculares
no estudo de uma ave amazônica, endêmica
e ameaçada
Bandeira, RS1; Rego, PS1; Aleixo, A2; Schneider, H1; Sampaio, I1; Vallinoto, M1
Laboratório de Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Pará – Campus de Bragança
2
Museu Paraense Emílio Goeldi - MPEG
[email protected]
1
Palavras-chave: Lepidothrix vilasboasi, filogenia, DNA mitocondrial
Descrita pelo ornitólogo alemão Helmut Sick em 1959 como Pipra vilasboasi, a espécie Lepidothrix vilasboasi foi redescoberta no sudoeste da Amazônia após quase meio século de ausência de registros. Considerada como uma das espécies
menos conhecidas do planeta, principalmente devido à ausência de estudos, L vilasboasi também figura como espécie
ameaçada e de grande vulnerabilidade em decorrência da grande pressão antrópica sobre a região de sua ocorrência.
Apesar de classificada como espécie, seu status taxonômico não é totalmente reconhecido, sendo considerada por muitos
pesquisadores como um híbrido entre Lepidothrix iris e Lepidothrix nattereri. Tal incerteza taxonômica tem dificultado
a aprovação e execução de projetos de conservação para esta ave endêmica do Estado do Pará. Com o intuito de testar
a validade do táxon L. vilasboasi e esclarecer o seu posicionamento taxonômico dentro do gênero Lepidothix, realizamos
uma análise filogenética com marcadores moleculares. No presente estudo foram utilizadas amostras de tecido das
espécies L. vilasboasi, L. iris (representada pelas subespécies L. iris iris e L. iris eucephala), L. nattereri e L. serena, cedidas
pelo Museu Paraense Emílio Goeldi (MPEG). Para avaliação do status filogenético foram utilizados os marcadores
rRNA 16S, citocromo b e ND2. Os resultados das árvores filogenéticas agrupam L. vilasboasi e L. iris eucephala em
um mesmo clado, apesar de não formarem grupos monofiléticos distintos. L. nattereri aparece como grupo irmão
destas duas (L. vilasboasi, L. iris eucephala), enquanto que L. iris iris surge como um ramo monofilético mais distante
dos demais. As topologias das árvores encontradas indicam que L. iris eucephala e L. iris iris são espécies distintas e
que não formam um grupo monofilético, como descrito na literatura. Os dados moleculares indicam que L. vilasboasi
não é um hibrido entre L. iris eucephala e L. nattereri, estando mais intimamente relacionada com a primeira. Através
dos dados moleculares, duas hipóteses podem explicar os resultados obtidos: hipótese de retenção de polimorfismo
ancestral entre L. vilasboasi e L. iris eucephala; ou hipótese de viés em cruzamento interespecífico, em decorrência da
herança materna dos marcadores utilizados.
Apoio Financeiro: CNPq-Pibic e UFPA.
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Biogeografia histórica e diversidade
genética do complexo Basileuterus
culicivorus (Aves, Parulidae)
Vilaça, ST; Santos, FR
Departamento de Biologia Geral, ICB, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG, Brasil
[email protected]
Palavras-chave: Basileuterus culicivorus, biogeografia histórica, Parulidae, diversidade genética, expansão populacional
O complexo Basileuterus culicivorus envolve duas espécies reconhecidas: B. culicivorus (do Uruguai ao norte do México)
e B. hypoleucus (sul e sudeste do Brasil, Paraguai e Bolívia), cuja separação taxonômica é questionada. Apesar da
existência de vários estudos genéticos na família Parulidae, poucos abordam os processos de diversificação das espécies
neotropicais. Para investigar a história evolutiva deste complexo, foram analisados 82 indivíduos do Brasil, Venezuela,
México, Paraguai, Argentina e El Salvador. Foram obtidas seqüências do gene mitocondrial citocromo b (cytb), do
íntron 5 do gene nuclear β-fibrinogênio (BF5), e foram genotipados seis loci de microssatélites. As análises estatísticas
foram realizadas nos programas Arlequin e DNAsp. O cytb revelou um total de 77 haplótipos com h= 0,998 e π=
0,036 e o BF5 apresentou 39 haplótipos com 30 sítios polimórficos. Entre os Ioci de microssatélites, o número de alelos
variou de 5 a 27, com média de 15 alelos, sendo que três loci não estavam em equilíbrio de Hardy-Weinberg, sugerindo
subestruturação populacional. Reconstruções filogenéticas baseadas em máxima verossimilhança (ML) e neighbor-joining
(NJ) para cytb feitas nos programas PHYML e Mega indicaram quatro grandes clados: Norte do México (NM); Sul do
México e El Salvador (MS); Venezuela e Norte do México (VM); Brasil, Argentina e Paraguai (BP). A posição basal dos
clados NM e MS sugerem uma origem ao norte de sua distribuição, com posterior colonização do Brasil, Paraguai e
Argentina, e uma possível recolonização mais recente da Venezuela. Os clados do México apresentaram alelos exclusivos
de BF5, que em uma árvore de ML tiveram uma posição mais basal em relação aos demais alelos. O teste de AMOVA
feito com cytb indicou um alto φst para esses agrupamentos (0,41; p<0,001), enquanto que para BF5 e os seis loci de
microssatélites o φst não foi significativo. O teste Fs de Fu sugeriu uma expansão populacional somente para o clado BP,
também indicada pela topologia do clado nas árvores filogenéticas. Foi usado o programa Beast para estimar os tempos
ao mais recente ancestral comum (TMRCA) para os vários clados, com uma taxa de substituição constante recentemente
estabelecida para Passeriformes de 2,07% mutações/sítio/milhão de anos. Os resultados sugerem que o TMRCA para
o clado BP foi há aproximadamente 1,8 milhões de anos, indicando que o final do Plioceno e início do Pleistoceno
foi um período importante na diversificação desse táxon. Os resultados desse estudo indicam que a colonização dessa
espécie na América do Sul se deu de forma rápida e em um período de grande importância para a expansão dos táxons
que se originaram na América do Norte e atualmente também habitam a América do Sul.
Apoio financeiro: CNPq, Fapemig.
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Filogeografia de aves do gênero Myrmotherula
(Thamnophilidae) no leste da Amazônia
Almeida, MCE1; Sampaio, I1; Schneider, H1;Pimentel, L1; & Figueiredo WMB1
Universidade Federal do Pará, Instituto de Estudos Costeiros, Campus de Bragança, PA
1
Palavras-chave: Filogeografia, Myrmotherula, Amazônia, Citocromo b, Linhagens Populacionais
Myrmotherula é um gênero Neotropical de aves seguidores de formigas que, por encontrar-se amplamente distribuído e
altamente diversificado na Amazônia, estudos sobre sua filogeografia podem ser úteis para elucidar o contexto espacial e
temporal dos processos de diversificação na região. Este trabalho avalia a história evolutiva de quatro espécies simpátricas
de Myrmotherula no leste amazônico, usando uma metodologia filogeográfica comparativa. As quatro espécies em foco
apresentam características ecológicas distintas e respondem de forma diferenciada às mudanças na cobertura vegetal.
Amostras de DNA foram obtidas em uma localidade ao Norte do Amazonas, no Escudo Guiano, e em três ao sul
deste rio: nas margens direita e esquerda do Rio Tapajós e no extremo leste da região, município de Santa Bárbara. Um
fragmento de cerca de 500 pares de base do gene mitocondrial codificador do Citocromo b amplificado por PCR e
sequenciado pelo método didesoxiterminal. As sequencias obtidas foram submetidas à análise filogenética com métodos
de máxima parcimônia, máxima verossimilhança e por meio de análises bayesianas. Àrvores de haplótipos foram
construídas com critérios de parcimônia e o cálculo de tempos de divergência e coalescência nas linhagens foi feito
com o auxílio de métodos bayesianos. Em Myrmotherula axillaris, que possui hábitos generalistas e boa capacidade de
tolerância às modificações na paisagem florestada, não encontrou-se evidências de estruturação genética nas populações
estudadas. Por sua vez, para Myrmotherula leucophthalma, M. hauxwelli e M. longipennis, que ocupam diferentes estratos
na floresta e são menos resistentes a distúrbios, os resultados sugeriram forte estruturação filogeográfica, sendo o Rio
Tapajós a barreira mais eficiente encontrada. As análises de tempos de divergência mostram diferentes períodos para a
diversificação genética nas espécies, sugerindo que diferentes eventos, em diferentes épocas, provocaram a separação e
surgimento de linhagens nas populações estudadas.
Apoio: UFPA, IECOS, PARD.
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Análise cromossômica em Cathartidae:
distribuição de blocos heterocromáticos e
rDNA e mapeamento genômico
Tagliarini, MM3; Pieczarka, JC1,2; Nagamachi, CY 1,2; Rissino, JD1; de Oliveira, EHC1
Laboratório de Citogenética, ICB, UFPA
Bolsista Produtividade Científica, CNPq
3
Aluna de Mestrado, Programa de Pós-Graduação em Neurociências e Biologia Celular
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Cathartidae, Falconiformes, rDNA, microcromossomos, bandeamento C
A família Cathartidae inclui sete espécies de abutres do Novo Mundo. Sua posição taxonômica é alvo de controvérsias,
visto que as propostas clássicas a incluem entre os Falconiformes, enquanto dados moleculares a posicionam próximo
à família Ciconiidae (Ciconiiformes). Os dados citogenéticos, que se limitam a coloração convencional na maioria das
espécies já analisadas, mostram uma constância no número diplóide, com 2n=80. Dessa forma, o presente trabalho
teve como objetivo uma melhor caracterização do complemento cromossômico genômica de três espécies dessa família:
Cathartes aura, Cathartes burrovianus e Sarcoramphus papa, através de técnicas de bandeamento G, C e aplicação de
sondas cromossomo-específicas de Gallus gallus (GGA1 a GGA10 e Z) e rDNA. Os resultados mostram que, apesar do
número diplóide constante e similaridade no padrão de bandeamento G, essas espécies diferem quanto à distribuição dos
blocos heterocromáticos, que nos autossomos se restringem às regiões centroméricas de S. papa, enquanto C. aura e C.
burrovianus apresentam grandes blocos heterocromáticos nos pares 6 e 7. O cromossomo W apresentou um grande bloco
heterocromático. Esses blocos mostraram-se DAPI positivos, o que sugere uma riqueza em pares A-T. Todas as espécies
apresentaram apenas um par de microcromossomos marcados pelo r-DNA. As sondas correspondentes aos primeiros dez
pares de macrocromossomos de Gallus foram utilizadas em experimentos de FISH em metáfases de C. aura. Cada sonda
de GGA marcou somente um par, com exceção da sonda GGA4, que marcou dois pares de cromossomos em C. aura
(CAU4 e CAU9). Esses dados mostram que Cathartidae reteve um complemento cromossômico similar ao cariótipo
ancestral hipotético das Aves, e coloca essa família em uma posição mais basal em relação a Accipitridae e Falconidae.
Entretanto, os dados citogenéticos não são capazes de esclarecer a relação filogenética desta família com outros grupos,
como Ciconiidae, considerado seu grupo-irmão de acordo com análises de hibridização de ácidos nucléicos.
Apoio: CNPq, UFPA, CAPES.
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Análise da diversidade genética em
populações de Chiroxiphia caudata (Aves,
Pipridae) em uma região de Mata Atlântica
do estado de São Paulo
Fazza, AC1; Carvalho-Costa, LF2; Francisco, MR3; Galetti Jr, PM2
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos
3
Universidade Federal de São Carlos, Campus Sorocaba
[email protected]
1
2
Palavras-chave: genética da conservação, diversidade genética, aves, DNA mitocondrial
Por se tratar de um bioma altamente ameaçado e considerando-se sua grande diversidade biológica, a Mata Atlântica
é uma área prioritária para conservação. Possui uma das mais altas taxas de endemismo de espécies de aves em todo o
mundo, que podem estar sofrendo efeitos drásticos pela degradação do seu ecossistema. O estudo genético de populações
de aves nos permite fazer inferências sobre a viabilidade de espécies e a capacidade de responder a alterações ambientais.
No presente trabalho, utilizamos um marcador mitocondrial para avaliar a diversidade genética do Tangará-dançarino
(Chiroxiphia caudata), uma espécie neotropical não migratória. Foram estudas três populações localizadas no maior
contínuo remanescente de Mata Atlântica do Estado de São Paulo (Parque Estadual da Serra do Mar – núcleo Picinguaba,
Parque Estadual de Carlos Botelho e Parque Estadual Turístico Alto do Ribeira). Foi utilizado DNA de 15 indivíduos,
cinco de cada uma das três populações estudadas. Parte do gene do citocromo b do DNA mitocondrial foi amplificada
e seqüenciada. Dos 439 sítios analisados, sete foram polimórficos, dos quais um foi parcimoniosamente informativo. Os
resultados permitiram a discriminação de 6 haplótipos e indicaram uma alta diversidade haplotípica total de 0,762. Três
haplótipos foram exclusivos da população de Carlos Botelho, a localidade de maior diversidade. Esta localidade também
apresentou a maior diversidade nucleotídica (0,00548), ao passo que Picinguaba mostrou baixa variabilidade neste índice
(0,00091). A diversidade nucleotídica total foi relativamente baixa (0,00291), mas similar a de outras espécies neotropicais.
A distribuição do número observado de diferenças entre os pares de haplótipos apresentou uma distribuição unimodal
indicando uma possível expansão populacional recente. De modo geral, os testes de neutralidade não foram significativos,
ou seja, não há evidência de que a seleção natural tenha moldado o padrão de polimorfismo observado. A maior parte da
variação genética foi intrapopulacional (89%), porém a variação interpopulacional atingiu 11%, que pode ser atribuído
ao comportamento não migratório da espécie em estudo. As análises de divergência genética não produziram valores
significativamente diferentes de zero nas comparações pareadas do FST e foi estimado um número de migrantes em 47,50
indivíduos por geração. Estes resultados indicam alto fluxo gênico histórico entre essas populações ou tempo insuficiente
para a separação das linhagens, entretanto, as diferentes freqüências haplotípicas, com diferentes distribuições, sugerem que
estas populações possuem uma identidade, inclusive com a presença de haplótipos privados. Em conclusão, os valores obtidos
de diversidade e estruturação genética nas populações de Chiroxiphia caudata sugerem alta diversidade intrapopulacional e
diferenças genéticas não significativas entre as populações. Este estudo nos permitiu reforçar a importância da manutenção
do contínuo de Mata Atlântica para a conservação desta espécie.
Apoio Financeiro: CNPq e FAPESP.
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Desenvolvimento de marcadores moleculares
do tipo microssatélite para Neothraupis
fasciata (Emberizidae, Passeriformes)
Corrêa, CL; Collevatti, RG; Caparroz, R
Pós-graduação em Ciência Genômica e Biotecnologia, Universidade Católica de Brasília
[email protected]
Palavras-chave: Microssatelite, Neothraupis fasciata, Emberizidae, Cerrado, Cigarra-do-campo
A cigarra-do-campo (Neothraupis fasciata) é endêmica do Cerrado e ocorre em áreas com pouca interferência antrópica.
Tais características tornam esta espécie um modelo biológico ideal para avaliar os possíveis efeitos da fragmentação do
Cerrado sobre a diversidade genética de aves. Além disso, esta espécie apresenta sistema de reprodução cooperativo.
Marcadores moleculares do tipo microssatélite apresentam altos níveis de variabilidade, sendo uma ferramenta
apropriada para identificação das relações genéticas entre indivíduos, importantes em estudos de parentesco, estudos
de comportamento reprodutivo e na estimativa da variabilidade genética dentro e entre populações. Contudo, existem
poucos locos microssatélites disponíveis para aplicação em espécies de aves neotropicais. O objetivo deste trabalho
foi avaliar a eficiência de identificação de locos microssatélites em N. fasciata a partir de uma biblioteca genômica
não enriquecida. A biblioteca genômica foi construída com a utilização do vetor plasmidial pCR4Blunt-TOPO com
auxílio do TOPO Shotgun Subcloning Kit. Os insertos purificados foram seqüenciados utilizando os iniciadores T3
e T7 e o kit DYEnamic ET Terminator. As amostras foram analisadas em um seqüenciador automático (MegaBACE
500). Foram seqüenciados 278 insertos, dos quais 51 (18,3%) continham locos microssatélite, sendo esses: 27 di,
16 tri, quatro tetra e quatro pentanucleotídeos. Foram desenhados 17 pares de primers e esses foram utilizados para
amplificação dos locos via PCR. Apesar do baixo rendimento em relação ao número de clones seqüenciados/número
de clones com microssatélites identificados quando comparado com a técnica de biblioteca enriquecida, a metodologia
foi considerada satisfatória, uma vez que possibilitou a identificação de locos microssatélites com diferentes unidades
de repetição sem a necessidade da construção de diferentes bibliotecas enriquecidas para diferentes repetições. E ainda,
não exige a realização de uma etapa de enriquecimento (diminuindo os custos). Está em andamento a caracterização
de polimorfismo para os locos identificados e subsequentemente a análise genética de populações.
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Taxonomia por DNA em espécies de
Furnarídeos (Passeriformes: Furnariidae)
Chaves, BRN; Chaves, AV; Santos, FR
Laboratório de Biodiversidade e Evolução Molecular, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Minas Gerais.
[email protected]
Palavras-chave: Furnariidae, Barcode, COI
Os furnarídeos compreendem uma grande família de passeriformes encontrados nas Américas Central e do Sul, com
102 espécies distribuídas entre 38 gêneros, segundo o Comitê Brasileiro de Registros Ornitológicos (CBRO). Exibem
uma característica ecológica única, que os une aos dendrocolaptídeos: a reprodução no interior de ninhos fechados,
ao invés do uso de uma cavidade ou na vegetação. Com base em dados morfológicos, formam parte de um grupo
monofilético dentro de Suboscines, juntamente com as famílias Dendrocolaptidae, Formicariidae, Thamnophilidae,
Rhinocryptidae e Conopophagidae. Estudos moleculares recentes indicam que a família Furnariidae pode ser dividida em
três grupos, dois sem nome formal e o terceiro compreendido pelo gênero Xenops, mais próximo aos dendrocolaptídeos.
Por esse motivo, acredita-se que Furnariidae e Dendrocolaptidae sejam grupos parafiléticos.A sistemática e a taxonomia
molecular contam atualmente com o auxílio dos códigos de barra de DNA (DNA barcodes) para discriminação de
espécies dos mais diversos grupos de animais e plantas. Vários trabalhos utilizaram com sucesso o gene do Citocromo
Oxidase c subunidade I (COI) do DNA mitocondrial (DNAmt) para identificação e discriminação de espécies de aves
neotropicais.Neste estudo foram analisadas 24 espécies de Furnariidae com DNA barcodes de COI para avaliar sua
eficiência na identificação e discriminação destas espécies de aves neotropicais. Indivíduos de mesma espécie foram
amostrados preferencialmente a partir de diferentes localidades do Sudeste do Brasil, sendo que para a maioria das
espécies havia indivíduos testemunhos. Foram obtidos fragmentos de 436 pb de COI de 42 indivíduos e a maior parte
das espécies apresentou seqüências nucleotídicas características. As divergências inter-específicas variaram de 0,6%, entre
Heliobletus contaminatus e Sclerurus scansor, a 20,9%, entre Anabacerthia amaurotis e Synallaxis ruficapilla, com uma
média de 14%, enquanto as divergências intra-específicas variaram de 0%, em cinco espécies, a 0,8%, em S.scansor,
com uma média de 0,2%.Apesar do gene mitocondrial COI não possuir resolução apropriada para reconstruções
filogenéticas, observou-se que os dados corroboram estudos anteriores, mostrando a existência de alguns gêneros não
monofiléticos nessa família. Observamos que o gênero Philydor apresentou a maior divergência intra-genérica entre
espécies (9,2%) e não se agrupam em uma árvore Neighbor Joining (NJ), sugerindo uma possível parafilia. No entanto,
H.contaminatus agrupou-se com S.scansor suportado por um alto valor de bootstrap. Nesta mesma árvore, observa-se
também o agrupamento do gênero Xenops com dendrocolaptídeos, mas novos marcadores são necessários para um maior
detalhamento filogenético.Finalmente, este estudo mostra que DNA barcodes de COI têm um potencial discriminatório
suficiente para identificar a maior parte das espécies da família Funariidae.
Apoio financeiro: CNPq e FAPEMIG.
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Pintura cromossômica comparativa em duas
espécies de corujas (Aves, Strigiformes)
Moura, SP 3; Araújo, CCD 3; Pieczarka, JC 1,2; Rissino, JD2; Nagamachi, CY 1,2; De Oliveira, EHC 1
Laboratório de Citogenética, ICB, UFPA
Bolsista Produtividade Científica, CNPq
3
Bolsista PIBIC/CNPq
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Strigiformes, pintura cromossômica, corujas, cariótipo
Corujas pertencem à ordem Strigiformes. Embora as suindaras (Tyto alba) e as chamadas corujas verdadeiras já tenham
sido freqüentemente incluídas em subfamílias dentro da família Strigidae, a classificação mais aceita atualmente
considera esses dois grupos como famílias distintas, Tytonidae e Strigidae. Análises cromossômicas corroboram essa
classificação, visto que as espécies de Strigidae apresentam cariótipos relativamente semelhantes ao de Gallus gallus,
com números diplóides próximos a 80, e clara distinção entre macro e microcromossomos. Já os membros da família
Tytonidae apresentam um cariótipo mais derivado, com o número diplóide igual a 90-92 e diminuição gradual dos
cromossomos. Pouco se sabe sobre os rearranjos que originaram essa diferença cariotípica entre os dois grupos. No
presente trabalho foram utilizadas sondas cromossomo-específicas dos pares autossômicos de 1 a 9 de Gallus gallus
(GGA), em experimentos de hibridização in situ por fluorescência em cromossomos metafásicos de espécies pertencentes
às duas famílias de Strigiformes: Pulsatrix perspicillata (2n=76), da família Strigidae, e Tyto alba (2n=92), Tytonidae.
A análise comparativa dos resultados da FISH mostra a ocorrência de vários rearranjos cromossômicos no processo
de diferenciação das duas espécies. Em ambas as espécies, as sondas GGA6, GGA7, GGA8 e GGA9 produziram uma
única marcação cada. Em T. alba, o restante das sondas (GGA1 a GGA5) marcou entre dois e três pares distintos.
Em P. perspicillata, as sondas GGA2 e GGA3 mostraram conservação de sintenia, marcando um par cada, enquanto
as sondas GGA1, GGA4 e GGA5 produziram dois sinais distintos, cada. Além disso, várias fusões cêntricas foram
observadas em P. perspicillata, formando as associações GGA1/GGA2, GGA4/GGA5, GGA4/GGA9, GGA5/GGA8
e GGA6/GGA7. Estes resultados mostram que apesar dos números diplóides muito diferentes, houve fissões cêntricas
em alguns pares cromossômicos em relação ao cariótipo hipotético ancestral das Aves (2n=80) em ambas as famílias.
Entretanto, a ocorrência de várias fusões cêntricas no cariótipo de P. perspicillata resultou numa diminuição do número
diplóide. Futuras análises com sondas região-específicas poderão revelar se as fissões observadas em ambos os cariótipos
são sinapomórficas, tendo ocorrido em um cariótipo ancestral à dicotomia Tytonidae-Strigidae.
Apoio Financeiro: CNPq (472544/2006-3), CAPES, UFPA.
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Análise da performance de modelos
evolutivos mistos e amostragem de táxons
no estudo da filogenia de mamíferos
Loss-Oliveira, L1; Soares, AER1; Schrago, CG1
Lab. Biodiversidade Molecular, Dep. Genética, IB, Universidade Federal do Rio de Janeiro
[email protected]
1
Palavras-chave: CAT, LBA, modelos de misturas, mamíferos, amostragem de táxons
A inferência de árvores filogenéticas envolve dois tipos básicos de erro: estocástico e sistemático. O primeiro é decorrente
de amostragem insuficiente de sítios, que resulta em árvores com baixo suporte estatístico. O segundo, por sua vez, está
relacionado à incapacidade dos modelos evolutivos incorporarem toda complexidade do processo de substituição, mesmo
quando o número de sítios estudados é elevado. Isso freqüentemente reflete em estimativas topológicas enviesadas.
Um exemplo clássico é o fenômeno da atração dos ramos longos (LBA), que ocorre quando um ou mais táxons
filogeneticamente distantes apresentam taxas de substituição significativamente maiores e, por evolução convergente,
tendem a se posicionar como grupos próximos na árvore gerada. Uma alternativa para diminuir erros sistemáticos é a
adoção de modelos de misturas que permitem a categorização de sítios em conjuntos que compartilham parâmetros
evolutivos específicos. Dessa forma, esses modelos estimam os tamanhos de ramos com maior acurácia, evitando
problemas de saturação das seqüências. Análises filogenéticas recentes indicam a existência de quatro superordens de
mamíferos placentários: Afrotheria, Xenarthra, Laurasiatheria e Euarchontoglires, mas a relação entre as ordens ainda
não foi bem elucidada. O problema é acentuado pela amostragem reduzida de táxons, que resulta na dissolução de
Euarchontoglires (Primates + Rodentia). Nesse trabalho, averiguamos o desempenho de modelos de misturas (e.g., modelo
CAT) na recuperação das relações filogenéticas entre as ordens de mamíferos através de uma amostragem crescente de
táxons. Para isso, foram utilizadas seqüências de aminoácidos de mamíferos disponíveis em bancos de dados públicos.
Os programas PhymL, MrBayes e Phylobayes foram usados para gerar as topologias. Nossos resultados mostram que
mesmo modelos complexos de evolução de seqüências são incapazes de superar o efeito da amostragem de táxons e a
estabilidade das quatro superordens é diretamente influenciada pelo número de seqüências analisadas.
Apoio financeiro: FAPERJ.
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Estudos citotaxonômicos de pequenos
mamíferos não-voadores de um fragmento
de Mata Atlântica de Minas Gerais
Stumpp, R¹; Eduardo, AA¹; Lessa, G¹; Dergam, JA
Departamento de Biologia Animal, Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
1
Palavras-chave: roedores, marsupiais, citogenética, Mata Atlântica, diversidade
Apesar da grande importância ecológica dos pequenos mamíferos não-voadores, sua taxonomia, em particular a de
roedores, é relativamente pouco conhecida, principalmente devido a dificuldade na detecção de variações discretas na
morfologia externa e interna. Em alguns casos, duas espécies podem apresentar padrões morfológicos com diferenças
tão sutis ou mesmo indistinguíveis, que são consideradas espécies crípticas. Em função da grande dificuldade na
distinção de dessas espécies, técnicas citogenéticas e de biologia molecular têm sido empregadas para uma melhor
definição das espécies e seu relacionamento filogenético. Neste sentido, este trabalho apresenta dados cariotípicos sobre
os pequenos mamíferos não-voadores da Estação de Pesquisa Treinamento e Educação Ambiental Mata do Paraíso,
um pequeno fragmento de Mata Atlântica localizado no município de Viçosa, Minas Gerais. Foram realizadas análises
citogenéticas de coloração convencional em 9 espécies visando a determinação do número diplóide (2n) e número
fundamental autossômico (NFa). Os cariótipos obtidos foram: Akodon cursor (2n=14; NFa=18-20), Bibimys labiosus
(2n=70; NFa=76), Calomys tener (2n=66; NFa=66), Cerradomys subflavus (2n=54; NFa=62), Gracilinanus agilis (2n=14;
NFa=24), Gracilinanus microtarsus (2n=14; NFa=24), Monodelphis americana (2n=18; NFa=32), Oligoryzomys flavescens
(2n=66; NFa=70), e Oligoryzomys nigripes (2n=62; NFa=79-80). Os marsupiais amostrados (G. agilis, G. microtarsus
e M. americana) apresentaram pouca variação cariotípica entre si, como é característico dos animais da ordem, sendo
que o número diplóide mais freqüente para estes animais é 14. Os roedores apresentaram uma variação bastante maior.
A. cursor é reconhecido por apresentar alta variabilidade cromossômica em diferentes populações. Dos 18 citótipos
conhecidos para a espécie, a população da Mata do Paraíso apresentou 3, com no número fundamental variando de 18
a 20. O. nigripes também apresentou uma variação no número fundamental, com NFa=79-80, resultado semelhante ao
que ocorre em outros fragmentos de Mata Atlântica do Sudeste. A análise cariotípica das espécies da Mata do Paraíso
foi relevante para compreensão dos padrões citogenéticos e da riqueza das comunidades de pequenos mamíferos,
reforçando sua utilização em inventários mastofaunísticos. Exemplo disso foi a distinção de O. flavescens e O. nigripes,
espécies sintópicas do fragmento, que apresentam pequena variação morfológica.
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Desenvolvimento de primers para o gene D-loop
para amplificação do fragmento mitocondrial
em detrimento de cópias nucleares para o
estudo dos efeitos da fragmentação florestal
sobre a estrutura genética de populações de
Micoureus paraguayanus no Parque Estadual
Morro do Diabo, SP
Cattony Neto, PQ; Galetti Junior, PM; Rodrigues, FP
Laboratório de Biodiversidade Molecular e Citogenética, Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos
[email protected]
Palavras-chave: Micoureus Paraguayanus, marcador mitocondrial, D-loop, cópia nuclear, estrutura populacional
Os marcadores mitocondriais têm sido amplamente utilizados em estudos populacionais devido a características como herança materna,
ausência de recombinação e altas taxas evolutivas. Estas podem fornecer informações relativas à diversidade, estruturação genética e
dispersão diferencial dos sexos (DOWLING et al., 1996). Para avaliar os efeitos que a fragmentação florestal recente e o isolamento
por distância entre demes possuem sobre a diversidade genética das populações naturais, analisamos o marsupial arborícola Micoureus
paraguayanus em áreas do Parque Estadual Morro do Diabo e do seu entorno através do uso do gene mitocondrial D-Loop. A baixa taxa
de recombinação, associada à alta taxa evolutiva deste gene é atraente à construção de genealogias recentes e permitem uma avaliação
mais acurada dos eventos promovidos pelo processo de fragmentação ambiental. Entre os marsupiais neotropicais, os representantes do
gênero Micoureus são considerados animais de médio porte com atividade crepuscular ou noturna e dieta insetívora/frutívora (Emmon
& Feer,1997). Apresentam gestação e intervalo entre gerações curtos e capacidade de dispersão limitada quando comparados a outras
espécies, o que os tornam um modelo interessante para estudos relativos à estrutura e variabilidade genéticas de populações afetadas
pelo processo de fragmentação (Fernandez et al., 1998; Pires & Fernandez, 1999). Todavia, como descrito para o gênero Didelphis, o
gênero Micoureus também parece apresentar fragmentos mitocondriais com cópias nucleares de tamanhos variados. Como essas cópias
ocorrem frequentemente em grande número, são amplificadas erroneamente e a escolha equivocada de um desses fragmentos para
análises populacionais pode diminuir a variação esperada para o fragmento mitocondrial, levando à obtenção de resultados que não
refletem os verdadeiros efeitos da fragmentação. Resultados para o sequenciamento de duas bandas obtidas a partir de primers descritos
por FUMAGALLI et al. (1997) mostraram que os indivíduos eram todos iguais para o menor fragmento, enquanto há certa variação
para o maior. Para amplificar apenas o fragmento mitocondrial, descrevemos um novo conjunto de primers específicos para a segunda
metade do gene D-Loop através do alinhamento das seqüências obtidas. O DNA nuclear provavelmente possui variação menor nas
taxas de transversão e transição devido a seus mecanismos de reparo durante o processo de replicação. Assim, os novos primers foram
desenhados com parte de suas bases sobre regiões de inserção/deleção da cópia paráloga para evitar que eles se liguem aos fragmentos
nucleares novamente. Resultados preliminares indicam que os novos primers foram capazes de amplificar apenas um fragmento, todavia
será realizada a confirmação de sua origem via sequenciamento e posterior “Blast” no “Gene Bank”.
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Filogeografia comparativa de marsupiais do
interflúvio Madeira-Tapajós
Pimentel, L¹; Nobre, K¹; Scheneider, H¹ ²; Sampaio, I¹,²; Figueiredo, WM¹,²
IECOS -Instituto de estudos Costeiros
Universidade Federal do Pará, Campus de Bragança
lucy.pimentel @gmail.com
1
2
Palavras-chave: endemismo, linhagens, marsupiais
De acordo com estudos baseados em distribuições geográficas, o interflúvio Madeira-Tapajós é considerado como
uma área de endemismo que abriga elevados índices de diferenciação biológica. Contudo, os estudos para avaliar esta
distinção ainda são escassos e fragmentários. No intuito de testar e quantificar a diferenciação desta área em relação
às outras porções da Amazônia utilizamos a fauna de marsupiais como modelo comparativo. Um fragmento de 520
pares de bases do gene mitocondrial codificador do citocromo b foi sequenciado para representantes de seis espécies
de marsupiais, coletados em duas localidades neste interflúvio. As sequencias foram comparadas às disponíveis na
literatura para as outras áreas amazônicas de endemismo. A diferenciação foi avaliada por meio de análise de distâncias
genéticas, cálculos de tempos de divergência entre linhagens e verificação de monofilia recíproca em linhagens separadas
geograficamente. Para as inferências filogenéticas usou-se os métodos de máxima parcimônia, máxima verossimilhança
e análises bayesianas implementados nos programas Paup* e MrBayes. Os exemplares oriundos do interflúvio MadeiraTapajós apresentaram graus variáveis de divergência genética em relação a representantes conspecíficos e congenéricos
de outras partes da Amazônia, sendo que o valor mínimo de distância corrigida entre as linhagens do interflúvio e as de
outras regiões variou entre cerca de 2 e 12%. Comparações entre os tempos de separação entre linhagens e a topologia das
árvores confirmam a distinção biológica da área e indicam que sua biodiversidade possui diferentes origens geográficas
e é produto de sucessivos eventos de cladogênese.
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Cariótipo de quatro espécies de marsupiais
da Família Didelphidae do nordeste brasileiro
Borges, JAT1; Sousa, MAN2
Curso de Ciências Biológicas, Centro de Ciências Biológicas e Sociais Aplicadas, Universidade Estadual da Paraíba
2
Centro de Ciências Biológicas e Sociais Aplicadas, Universidade Estadual da Paraíba
1
Bolsista PROINC/UEPB
[email protected]
1
Palavras-chave: Cromossomos, Didelphimorphia, Didelphidae, Nordeste, Brasil
Os marsupiais da Ordem Didelphimorphia, Família Didelphidae são um grupo bastante conservativo do ponto de
vista citogenético com três tipos de complemento, 2n=14,18 e 22. Grande parte da informação citogenética, obtida
ao longo de anos de estudos, encontra-se armazenada no Banco de Células e Tecidos do Laboratório de Citogenética
do Departamento de Sistemática e Ecologia - DSE da Universidade Federal da Paraíba – UFPB, na forma de 2942
lâminas preparadas. Onde, 137 são de marsupiais. O resgate destas informações pode contribuir para o aumento da
informação sobre a citotaxonomia dos Marsupiais, pontuando novas localidades. Neste grupo, a morfologia de alguns
pares autossômicos e a do par sexual pode auxiliar na diferenciação entre as espécies. Foram analisadas lâminas preparadas
de quatro espécies da família Didelphidae do banco de células do DSE de três estados do Brasil (PE, PB e BA). O número
modal foi estabelecido examinando-se 20 metáfases de cada exemplar. As metáfases mais elucidativas foram fotografadas
em fotomicroscópio digital Olympus. As imagens foram ampliadas em papel fotográfico em laboratório comercial para
montagem dos cariótipos levando-se em consideração o número diplóide (2n) e o número de braços autossômicos (NA).
3 machos e 3 fêmeas de Marmosa murina de Mamanguape e João Pessoa, PB mostraram 2n=14 e NA=20, com 3 pares
de submetacêntricos grandes, 1 par metacêntrico médio e 2 pares de acrocêntricos pequenos, o X é um acrocêntrico
pequeno e o Y é puntiforme. Um macho e uma fêmea de Micoureus cinereus, de Rio Tinto, PB mostraram 2n=14 e
NA=20 com 2 pares de submetacêntricos grande, 2 pares de metacêntricos médios, 2 pares de acrocêntricos pequenos.
O X é um acrocêntrico pequeno e o Y é um dos menores do complemento. Um macho de Metachirus nudicaudatus de
Gandu, BA mostrou um 2N=14 e NA=20 com 3 pares de submetacêntricos grandes, 1 par de metacêntricos médios, 2
pares de acrocêntricos pequenos. O X e o Y são acrocêntricos pequenos. Uma fêmea de Didelphis marsupialis mostrou
2n=22 e NA=20, com todos os cromossomos acrocêntricos com variação decrescente de tamanho. M. nudicaudatus
do Espírito Santo, São Paulo e Mato Grosso; M. murina do Ceará, Espirito Santo e Mato Grosso e D. marsupialis de
São Paulo, mostram cariótipo semelhante ao encontrado neste trabalho. Observamos que, M. cinereus de São Paulo
apresenta diferenças na morfologia de um dos pares de submetacêntricos, que neste trabalho é metacêntrico. Embora
o 2n e o NA seja o mesmo. Observamos que o cariótipo dos marsupiais é bastante conservativo e destacamos que as
informações apresentadas neste trabalho ainda não foram descritas para as localidades apresentadas.
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Divergências morfométricas e moleculares
em preguiça-comum (Bradypus variegatus):
evidências de linhagens evolutivas
independentes?
Moraes-Barros, N1; Martin, P2; Vaughan, C2; Ramirez, O3; Morgante, JS1
Laboratório de Biologia Evolutiva e Conservação de Vertebrados (LABEC), Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo
2
Department of Forest and Wildlife Ecology, University of Wisconsin
3
Universidad Nacional Heredia
[email protected]
1
Palavras-chave: preguiças, linhagens evolutivas, DNA mitocondrial, morfometria
A preguiça-comum, Bradypus variegatus, é um animal típico da fauna brasileira, encontrada também em áreas florestadas de
quase toda a América Latina. Trabalhos recentes sobre filogeografia deste grupo apontam a divergência genética entre populações
de preguiça-comum distribuídas ao longo das florestas brasileiras e, a partir disso, propõem a existência de divisões intraespecíficas, caracterizadas como unidades de manejo (MUs).Neste trabalho apresentamos os resultados de um estudo similar
realizado numa escala geográfica maior, envolvendo análises morfométricas e moleculares de preguiças-comuns amostradas
na América Central e Norte da América do Sul.As análises moleculares abordaram o estudo de seqüências da região controle
do DNA mitocondrial (DNAmit) de 17 indivíduos de preguiças-comuns distribuídas na Costa Rica, comparando-as às
populações brasileiras previamente analisadas. Os resultados indicaram haver diferença genética significativa entre preguiças
da Costa Rica em relação a todas as demais populações de preguiças. O valor de distância genética par-a-par, obtido ao
comparar o grupo da Costa Rica às populações brasileiras, foi significativamente maior aos obtidos quando comparamos as
preguiças brasileiras à outra espécie simpátrica à B. variegatus na região Norte do Brasil, a preguiça-do-norte (B. tridactylus).
A partir de tal evidência, foram realizadas análises morfométricas com o intuito de investigar se esta diferenciação genética
observada era também acompanhada de diferenciação morfológica. Para tanto, foram analisados 143 crânios de espécimes
da preguiça-comum provenientes de diferentes localidades da América Central e América do Sul, e da preguiça-do-norte.
Análises de morfometria geométrica revelaram resultados congruentes aos do estudo molecular, evidenciando três grupos
significativamente divergentes, representados pelos espécimes de preguiça-do-norte, espécimes de preguiça-comum da América
Central e preguiças-comuns da América do Sul. Estes resultados suscitam a hipótese da preguiça B. variegatus da América
Central representar uma linhagem evolutiva distinta daquela constituída pelas preguiças-comuns da América do Sul. De fato,
a filogenia molecular estimada a partir de aproximadamente 900 pb de genes mitocondriais (citocromo b e 16S) indica haver
duas linhagens mitocondriais distintas, sustentadas por altos valores de suporte estatístico, representadas respectivamente
por preguiças da Costa Rica e do Brasil, sendo que esta última posiciona-se como grupo irmão de B. tridactylus (valores de
bootstrap em verossimilhança, distância e parcimônia: 0,90 a 0,95). É importante ressaltar que como não foram analisados até o
momento marcadores moleculares independentes ao DNAmit não foi possível descartar eventos, como a introgressão, os quais
podem estar associados ao padrão filogenético de parafilia. Ainda assim ao considerar a divergência genética e a congruência
aos dados morfométricos, a existência de linhagens evolutivas independentes, restritas a regiões geográficas distintas, dentro
da espécie B. variegatus, é uma hipótese consistente e de grande interesse para maiores investigações.
Apoio Financeiro: Fapesp.
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Sexagem molecular de preguiça-decoleira (Bradypus torquatus): uma nova
perspectiva para a conservação da espécie
Martinelli, AB¹,²; Alvarenga, CS1; Chaves, PB1; Santos, LAD3; Fagundes, V¹
Laboratório de Genética Animal, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Espírito Santo
2
Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica (PIBIC CNPq/UFES)
3
Instituto de Pesquisas da Mata Atlântica, IPEMA, ES
[email protected], [email protected]
1
Palavras-chave: Bradypus torquatus, sexagem molecular, conservação, zinc-finger Y-linked gene, zinc-finger X-linked gene
Bradypus torquatus (preguiça-de-coleira) é uma espécie ameaçada de extinção, pertencente à Ordem Xenarthra e habita
as florestas tropicais das Américas do Sul e Central. Uma dificuldade na avaliação do status de conservação dessa espécie
é estimar a razão sexual de uma população, já que há ausência de dimorfismo sexual em jovens e adultos. Nosso objetivo
foi padronizar um método de sexagem molecular em preguiças a partir de amostras de DNA de sangue. Utilizamos perfis
de RFLP-PCR dos genes ZFX (zinc finger X-linked) e ZFY (zinc finger Y-linked) para determinar o sexo de 12 espécimes
de preguiças de Santa Maria de Jetibá, no Espírito Santo (SMJ-ES). Inicialmente, foi realizada a sexagem citogenética
de quatro espécimes (sexo pré-determinado pelo comportamento de cópula) a partir de cultura de linfócitos, para serem
usados como controle no estudo molecular. A sexagem molecular consistirá em identificar sítios de clivagem distintos
na seqüência dos genes ZFX e ZFY, e consequentemente, gerar perfis distintos de RFLP-PCR entre machos e fêmeas.
Estudos prévios mostraram que o polimorfismo existente entre os genes ZFX (presente no X) e ZFY (presente no Y),
que são co-amplificados pelo mesmo par de primers (P1-5EZ/P2-3EZ), possibilitou o uso de uma enzima de restrição
que cortasse distintamente os fragmentos dos genes ZFY e ZFX em mamíferos placentários, como o homem. Nesse
sentido, usamos o DNA de um homem e uma mulher como controle para o presente estudo. A sexagem citogenética das
quatro preguiças revelou um macho e três fêmeas, todos com 2n=50. A análise das seqüências dos fragmentos de 440pb
foi feita pelo programa Sequencher 4.7 e revelou um dos sítios de restrição da enzima HaeIII que foi distinto
entre homem e mulher. Para as preguiças, a enzima HaeIII também revelou um sítio polimórfico distinto, embora o
mesmo tenha ocorrido nas fêmeas, ao invés do macho. Em humanos, foram observados dois fragmentos (380 e 60pb)
para mulher e cinco fragmentos (380, 290, 90, 60 e 60pb) para o homem. Inversamente, em preguiças o produto da
digestão do fragmento de 440 pb com a enzima HaeIII revelou cinco fragmentos (380, 290, 90, 60 e 60pb) em fêmeas
e dois fragmentos (380 e 60pb) em machos, permitindo definir com sucesso os perfis de RFLP-PCR sexo-específicos.
A análise dos 12 exemplares da população de SMJ-ES revelou oito fêmeas e quatro machos. Essa técnica mostrou-se
eficiente para ser utilizada na investigação da razão sexual de preguiças, informação valiosa para estudos ecológicos, de
estrutura populacional e de conservação. Ainda, nossos dados levantam questionamentos sobre a evolução dos genes
ZFY e ZFX já que esses genes se localizam em autossomos em marsupiais (não placentários) e em cromossomos sexuais
em placentários mais recentes, mas nunca foram investigados em placentários tão antigos como Xenarthra.
Apoio Financeiro: FACITEC/ES, FAPES/ES e CEPF/CONSERVATION INTERNATIONAL.
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A pintura cromossômica com sondas
humanas em duas espécies de preguiças
(Bradypus variegatus e Bradypus torquatus)
Azevedo, NF; Vianna-Morgante, AM
Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: Pintura cromossômica, mamíferos, Xenarthra
As preguiças são mamíferos pertencentes à ordem Xenarthra que, juntamente com Afrotheria, representam os grupos mais
basais entre os mamíferos placentários (Eutheria). Os cariótipos de espécies pertencentes a esses grupos devem, portanto,
ser os mais próximos de um provável cariótipo ancestral de Eutheria. Neste trabalho apresentamos resultados preliminares
da comparação dos cromossomos humanos com os cromossomos das espécies de preguiça Bradypus. variegatus (2n=54)
e B. torquatus (2n=50), por meio de hibridação in situ fluorescente (FISH) de sondas cromossomo específicas humanas
(pintura cromossômica). Em B. variegatus, a comparação foi realizada com a maioria dos cromossomos humanos, com
exceção dos cromossomos 3, 8, 16 e 21. Em B. torquatus, foram realizadas hibridações com as sondas dos cromossomos
humanos 1, 6, 7, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 22 e X. As associações dos cromossomos humanos 12/22 (em dois
cromossomos) e 14/15 (em um único cromossomo) foram observadas nas duas espécies de preguiça. Essas associações
de cromossomos já foram relatadas em espécies de Xenarthra e Afrotheria (Svartman et al., PloS Genetics, 2:1006,
2006, Yang et al., Chromosome Research 14: 283, 2006, Yang et al., PNAS 100: 1062, 2003; Kellogg et al., BMC
Evolutionary Biology 7:6, 2007) e figuram nos cariótipos ancestrais propostos de Eutheria (Murphy et al., Genome
Research 13: 1880, 2003; Wienberg, Current Opinion in Genetics & Development 14: 657, 2004). Observamos
também uma associação entre os cromossomos humanos 17/19 tanto em B. variegatus como em B. torquatus. Essa
associação 17/19 parece ser característica do gênero Bradypus, uma vez que não está presente nas preguiças Choloepus
hoffmanni e C. didactylus, nem nas outras espécies de Xenarthra e Afrotheria estudadas. Os cromossomos humanos 6,
9, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 20 e X corresponderam a um único cromossomo ou região cromossômica nas duas preguiças,
sendo considerados como conservados. A principal diferença detectada entre B. variegatus e B. torquatus foi relativa ao
cromossomo 1 humano, que está conservado em apenas um cromossomo de B. torquatus, como nos cariótipos propostos
como ancestrais de Eutheria, e corresponde a dois cromossomos de B. variegatus, como observado anteriormente em
C. didactylus. Considerando os tempos de divergência dessas espécies de preguiças, baseados em dados moleculares,
deve ter havido rearranjo recorrente do cromossomo 1. Assim, ao lado de associações e conservações cromossômicas já
registradas em espécies de Xenarthra e Afrotheria, identificamos particularidades dos cariótipos de preguiças.
Apoio Financeiro: Fapesp.
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Isolamento e caracterização de
microssatélites em preguiça-comum
(Bradypus variegatus): reduzida diversidade
genética em marcadores hipervariáveis
Silva, S1; Moraes-Barros, N2; Godinho, R3; Dávila, J4; Morgante, JS2; Ferrand, N1,3
Faculdade de Ciências da Universidade do Porto
Laboratório de Biologia Evolutiva e Conservação de Vertebrados do Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo
3
Centro de Investigação em Biodiversidade e Recursos Genéticos da Universidade do Porto
4
Instituto de Investigación en Recursos Cinegéticos da Universidade de Castilla La Mancha
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Bradypus, Microssatélites, Mata Atlântica
Recentemente surgiram as primeiras publicações abordando a diversidade genética da preguiça-comum. A análise da
variabilidade de minissatélites e de DNA mitocondrial revelou a existência de uma clara diferenciação entre o Norte e o Sul
da Mata Atlântica, embora sem grande variabilidade dentro de cada um desses grupos. Assim, tornou-se necessária a descrição
de marcadores hipervariáveis espécie-especificos para investigar a subestruturação populacional desta espécie e compreender
a influência da fragmentação contemporânea da Mata Atlântica.Neste trabalho, descrevemos a análise de microssatélites
desenvolvidos a partir de uma biblioteca genômica enriquecida. Dos 37 microssatélites isolados foram selecionados oito. Estes
loci foram genotipados em 33 indivíduos, previamente analisados com DNA mitocondrial, provenientes de 3 regiões da Mata
Atlântica (Norte: Minas Gerais e Bahia e Sul: São Paulo).Ao contrário do que seria de esperar de um marcador hipervariável,
há uma notória homogeneidade genética entre populações distribuídas por fragmentos isolados. Este resultado restringiu
o uso destes marcadores para o estudo de subestruturação na Mata Atlântica. De facto, apenas 2 microssatélites possuem
variabilidade (locus 248: 2 alelos em 33 indivíduos da Mata Atlântica e 1 alelo em 1 espécime externo ao bioma; locus 249: 3
alelos em 32 indivíduos da Mata Atlântica e 3 alelos em 2 espécimes externos) com sinais de perda de heterozigose. Os restantes
6 marcadores apresentaram-se monomórficos, sendo que 2 desses microssatélites possuem variação quando se adicionam à
análise indivíduos externos ao bioma Atlântico (loci 149 e 176: 2 alelos cada em um individuo externo).A baixa variabilidade,
associada à diminuta diversidade mitocondrial, suporta a hipótese anteriormente publicada de que as populações de preguiça
teriam sido sujeitas a diversos eventos de bottleneck, inclusive após a colonização do habitat Atlântico.Por outro lado, estes
resultados levam ainda a supor que a baixa diversidade genética poderia ser uma característica da própria espécie, à semelhança
do reportado em outros mamíferos. No entanto, esta hipótese não pode ser ainda testada, uma vez que foi analisado até ao
momento um número insuficiente de indivíduos externos ao bioma Atlântico.Ainda assim, os microssatélites corroboraram os
resultados da análise mitocondrial, apresentando alguma separação entre as populações do Norte e do Sul. O primeiro grupo
apresenta alelos exclusivos e o segundo uma menor diversidade genética. Estes marcadores também foram amplificados com
sucesso em preguiça-de-dois-dedos (Choloepus didactylus) e preguiça-de-coleira (B. torquatus), endêmica da Mata Atlântica e
com estatuto de ameaça, estendendo assim os estudos populacionais a outros taxa deste grupo de mamíferos Neotropicais.
Ademais, a disponibilização de microssatélites é uma contribuição importante deste trabalho para outras questões sobre as
preguiças, como sistemas de acasalamento, análise de parentesco, dispersão, identificação, entre outras.
Apoio Financeiro: FAPESP e FCT.
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Filogenia da família Dasypodidae
(Xenarthra) através de gene mitocondrial
Costa, JF; Fraga, EC; Barros, MC
Laboratório de Genética e Biologia Molecular – CESC/UEMA
[email protected]
Palavras chave: Dasypodinae, Tolypeutinae, Euphractinae, Xenarthra e rRNA 16S
Os tatus são membros da família Dasypodidae a mais diversificada da ordem Xenarthra, compreendendo três subfamílias
(Dasypodinae, Tolypeutinae e Euphractinae), oito gêneros e 21 espécies. Algumas espécies como Dasypus novemcinctus
apresentam uma ampla distribuição encontrado da Patagônia ao centro sul dos Estados Unidos, outras são endêmicas
como Chlamyphorus truncatus das planícies da Argentina e Tolypeutes trincinctus do nordeste brasileiro. Técnicas modernas
de sistemática molecular têm sido aplicadas à filogenia de Xenarthra na tentativa de compreender a sistemática da ordem.
Dessa forma objetivou-se contribuir no esclarecimento das relações filogenéticas da família Dasypodidae usando como
ferramenta o gene mitocondrial rRNA 16S. Um fragmento de 424 pares de base do gene rRNA 16S foi seqüenciado
para 18 espécimes de tatus, adicionou-se a estas, seqüências do GenBank. Didelphis marsupialis foi usado como grupo
externo. O alinhamento e análise das seqüências foram feitos através de vários programas, tais como: Bioedit, Clustal,
Mega e Paup. Fez-se análises filogenéticas baseadas em Máxima Parcimônia e Agrupamento de vizinhos. Os resultados
mostraram que a subfamília Dasypodinae é monofilética com o clado robustamente apoiado (100%) em todas as
análises, porém a subfamília Tolypeutinae não se agrupou significativamente com quaisquer das subfamílias da família
Dasypodidae apresentadas na análise. Este estudo indica que se faz necessário um aumento da densidade dos táxons, bem
como outras regiões genômicas analisadas, para melhor esclarecer as relações filogenéticas da família Dasypodidae.
Apoio financeiro: UFPA e UEMA.
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Estudos filogeográficos em tamanduábandeira (Myrmecophaga tridactyla)
indicam redutos de diversidade no cerrado
Clozato, CL; Lara-Ruiz, P; Miranda, FR; Collevati, R; Santos, FR
[email protected]
O tamanduá-bandeira, Myrmecophaga tridactyla, é o maior representante da família Myrmecophagidae, ordem
Xenarthra. Linhagem basal de placentários, a ordem representa grande importância histórico-evolutiva para a
conservação da diversidade filogenética dos eutérios. A espécie M. tridactyla é amplamente distribuída pelas Américas
do Sul e Central, porém, apesar de sua aparente abundância, já está extinta em muitos locais da distribuição original.
No Brasil suas populações são, majoritariamente, restritas a reservas, e já não existem em muitos estados. Já consta
na lista dos mamíferos brasileiros ameaçados de extinção do IBAMA, e é considerado “quase ameaçado” (NT) na
lista vermelha da IUCN. As principais ameaças à integridade da espécie são: contínua deterioração, fragmentação e
diminuição do hábitat natural, alastramento de fogo nos campos e caça antrópica.Poucos estudos genéticos foram
feitos com o tamanduá-bandeira, e sua diversidade e estrutura populacional não é conhecida em nível nacional. Este
estudo visa o conhecimento da variabilidade genética e caracterização das distintas populações ao longo da distribuição
geográfica da espécie, informação importante para o estabelecimento de estratégias de manejo conservacionistas.Para
tanto, foram utilizadas amostras de sangue e/ou tecido de 70 indivíduos, distribuídos pelo Brasil em nove estados
(MG, SP, MT, MS, GO, PR, PA, AM, RR). A partir do DNA extraído foram amplificados por PCR e seqüenciados
dois marcadores mitocondriais (450 pb da região hipervariável (HVI) e 570 pb do gene Citocromo b (Cyt-b)), um
marcador molecular autossômico (700 pb do gene de ativação de recombinação(RAG2)), outro no cromossomo sexual
X (520 pb do íntron do gene polilipoproteína (iPLP)) e, para os machos, outro marcador presente no cromossomo Y
(509 pb do íntron do gene amelogenina (iAMELY)). Todos os marcadores apresentaram pelo menos um polimorfismo
parcimoniosamente informativo, exceto o iPLP, que se apresentou monomórfico para os indivíduos amostrados.Para
os marcadores mitocondriais, foram encontrados 20 haplótipos para HVI e 7 para Cyt-b. Para os nucleares, iAMELY
e RAG2 foram observados 4 e 3 haplótipos/genótipos, respectivamente.Os dados obtidos com HVI, Cyt-b e RAG2
indicam um processo histórico de expansão recente. Identificou-se que os mais prováveis haplótipos ancentrais de HVI
e Cyt-b são oriundos do Cerrado, sugerindo que este bioma é a fonte de expansão e diversificação populacional de
M. tridactyla. Além disso, os parques nacionais amostrados que se localizam no Cerrado (Parque Nacional das Emas e
Parque Nacional da Serra da Canastra) apresentam alta diversidade em relação às demais localidades, apontando para a
importância das reservas naturais como redutos para a manutenção da diversidade da espécie e para a recolonização das
demais localidades de ocorrência.Este estudo contribuiu na identificação de populações de interesse conservacionista,
além de valorizar o papel dos parques e reservas naturais na preservação desta “espécie bandeira” do Cerrado.
Suporte financeiro: CNPq e FAPEMIG.
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Tamanho populacional e variação genética de
Puma concolor na região nordeste do estado
de São Paulo – resultados preliminares
Miotto, RA1; Cervini, M1; Ciocheti, G2; Galetti Junior, PM1
Laboratório de Biodiversidade Molecular e Citogenética, Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos
2
Laboratório de Ecologia da Paisagem e Conservação, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo
[email protected]
1
Palavras-chave: DNA fecal, microssatélites, metapopulação, onça-parda, conservação
Nos últimos 70 anos, a região nordeste do estado de São Paulo apresentou um grande crescimento populacional, bem
como a expansão de áreas de cultivo de cana-de-açúcar e eucalipto, e a implementação de grandes rodovias. Nesse
período, a vegetação natural foi reduzida a pequenos fragmentos florestais ou a poucas unidades de conservação como a
Estação Ecológica de Jataí, o Parque Estadual do Vassununga e a Estação Ecológica de Itirapina. No entanto, pouco se
sabe sobre como as populações de grandes carnívoros, por exemplo, a onça-parda (Puma concolor), estão se comportando
frente a essas grandes alterações em seu hábitat natural. Nesse trabalho, pretendemos então, a partir do DNA obtido
de fezes coletadas em campo e da análise de dez loci específicos de microssatélites, estimar o número de indivíduos que
atualmente ocorrem na região nordeste do estado de São Paulo, testar a existência de subestruturação populacional,
e estimar a variação genética entre as possíveis subpopulações existentes. Do ano de 2006 até o presente momento,
analisamos 68 amostras de fezes para seis loci polimórficos de microssatélites e pudemos identificar dentre elas 21
indivíduos diferentes de P. concolor. Ainda, somamos a esses indivíduos, outros 10 animais vítimas de atropelamentos
nesse período, aparentemente a maior causa de mortalidade desses animais na região. Desse modo, até o momento 31
indivíduos foram caracterizados pra os loci Pco C112 (range de 170–198, 6 alelos), Pco C217 (211-257, 6 alelos), Pco D217
(266-278, 4 alelos), Pco D103 (291-305, 7 alelos), Pco C209 (264-292, 7 alelos), Pco C108 (141-177, 9 alelos), todos
eles tetranucleotídeos. Continuaremos coletando amostras em campo por, no mínimo, mais um ano e caracterizaremos
cada indivíduo para mais 4 novos loci, momento em que constataremos a presença ou não de estruturação populacional
e a possibilidade da espécie estar estabelecida como uma metapopulação. O alto número de animais encontrado até o
momento, aparentemente, corrobora a hipótese da grande capacidade desses animais em percorrer e utilizar matrizes
antrópicas, apesar de rodovias representarem uma grande ameaça à sua sobrevivência.
Apoio financeiro: Capes e CNPq.
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Amplificação cruzada de microssatélites de
gato doméstico (Felis catus) em jaguatirica
(Leopardus pardalis)
Figueiredo, MG¹; Cervini, M¹; Rodrigues, FP; Galetti Junior, PM¹
Laboratório de Biodiversidade Molecular e Citogenética, Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos
[email protected]
1
Palavras-chave: amplificação cruzada, Leopardus pardalis, microssatélites
Atualmente vários marcadores genéticos têm sido utilizados com o intuito de compreender aspectos ecológicos e genéticos.
Os microssatélites, que são seqüências repetitivas encontradas no genoma dos eucariotos, têm sido um dos principais
marcadores utilizados, principalmente, devido a expressão codominante e a conservação dos seus sítios em espécies
relacionadas. A amplificação cruzada, ou seja, o uso de microssatélites desenvolvidos para uma espécie amplificados
em espécies relacionadas, é desejável em estudos de conservação, devido ao alto custo para se isolar novos marcadores.
O principal motivo de falha na amplificação cruzada entre espécies próximas é a fixação dos alelos nulos, que são
provenientes de mutação nos sítios onde os microssatélites se anelam no genoma. No presente estudo objetivou-se observar
a ocorrência de amplificação cruzada de microssatélites desenvolvidos para gatos domésticos (Felis catus) em jaguatirica
(Leopardus pardalis), espécie que ainda não possui marcadores específicos isolados. A utilização desses microssatélites
possibilitará estudos conservacionistas para a espécie L. pardalis, como por exemplo, análise da diversidade genética,
do fluxo gênico e da estruturação populacional. Foram testados nove locos de microssatélites (FCA008, F42, FCA053,
FCA77, FCA96, FCA 124, FCA 391, FCA 424, FCA 441, FCA 453). Todos os locos se mostraram polimórficos,
com uma variação de 2 a 12 alelos por loco. Os tamanhos dos alelos encontrados em L. pardalis foram diferentes dos
tamanhos dos alelos encontrados no gato doméstico para esses mesmos microssatélites. O estudo mostrou que esses
marcadores são adequados para análises genéticas populacionais de L. pardalis.
Apoio financeiro: FAPESP e CNPq.
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Uso de armadilhas de pêlos para obtenção
de amostras de onça-parda (Puma concolor)
Martins, N1,2; Miotto, RA2; Galetti Junior, PM2
Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Federal de São Carlos
2
Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos
[email protected]
1
Palavras-chave: armadilha de pêlos, Puma concolor, métodos não-invasivos, conservação, citocromo b
O primeiro passo para o desenvolvimento de planos de conservação é a determinação da presença e abundância de
espécies ameaçadas. Porém, a detecção de grandes carnívoros é dificultada pela baixa densidade de indivíduos, além
dos hábitos elusivos e de difícil observação que apresentam. Freqüentemente, estudos populacionais são realizados com
base na captura dos indivíduos, expondo os animais a riscos ou ferimentos. Para resolver esse problema vêm sendo
desenvolvidos métodos não-invasivos para o estudo populacional por meio de marcadores moleculares. Nosso objetivo
foi testar a eficiência de armadilhas de pêlos distribuídas em campo para a obtenção de pêlos de onças-pardas (Puma
concolor), espécie cuja distribuição tem sido afetada pela crescente expansão das populações humanas. Distribuímos,
aleatoriamente, dez armadilhas de pêlos em uma unidade de conservação do estado de São Paulo, a Estação Ecológica
do Jataí. Para a extração de DNA das amostras de pêlos utilizamos um protocolo de extração por nós padronizado,
em um projeto anterior, tomando como base o protocolo convencional de extração de DNA de fenol/clorofórmio/
álcool isoamílico. Utilizamos a amplificação de um fragmento específico de 146 pb do gene citocromo b do genoma
mitocondrial para confirmação da espécie doadora dos pêlos. Foram analisadas cinco amostras obtidas em duas coletas.
Dessas cinco amostras, a amplificação do citb confirmou que os pêlos eram de P. concolor. A ausência de amplificação
para as outras três amostras de pêlos pode ter ocorrido pela baixa quantidade de DNA (apenas um pêlo por armadilha)
ou por não pertencerem a P. concolor. Embora a quantidade de material obtido seja baixa, o processo de obtenção do
DNA para análises posteriores mostrou-se satisfatório. Sendo assim, o uso de armadilhas de pêlos mostrou ser um
método não-invasivo de obtenção de amostras muito promissor e de grande importância em projetos de genética na
conservação desses animais.
Apoio: PIBIC-CNPq/UFSCar, CAPES, CNPq.
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Canis familiaris GNB3 polymorphisms
as candidate polymorphisms for primary
hypertension and diabetes mellitus
Sousa, TA1; Fonteles, RS1; Corrëa, RB1; Pereira, SRF1; Fischer, E2; Ammer, H2; Uhrig, J2; Schulz, R2; Kuppinger, O1,2
Departamento de Biologia, Universidade Federal do Maranhão
2
University of Munique
[email protected]
1
Palavras-chave: Canis familiaris, GNB3 allele variance, primary hypertension, diabetes mellitus
Hypertension and diabetes mellitus are multifactorial diseases involving complex interactions between genetic and
environmental factors. Heterotrimeric G proteins composed of distinct α and βγ subunits are recognised to the
function of numerous hormones involved in human diseases such as primary hypertension and diabetes mellitus. A
C5501T Single Nucleotide Polymorphism (SNP) located at exon 10 in the β3 - subunit of the G protein gene (GNB3)
was reported to be associated with primary hypertension and diabetes mellitus type 2 in man. Although, the described
cytosine to thymine substitution does not cause an exchange in the amino acid serine, but it does cause a 41 amino
acid shortened GNB3 polypeptide (Gβ3s) by alternative splicing. In a previous study we cloned and analyzed the dog
genomic GNB3 DNA by DNA sequencing. The aim of this study was to search for canine GNB3 allele- and mRNA
splice variants, which are possibly associated with primary hypertension and diabetes mellitus. The complete canine
GNB3 nucleotide sequence of a primary hypertensive, a diabetes mellitus and a control dog were analyzed by DNA
sequence analysis and compared by nucleotide sequence alignment. In the canine GNB3 gene, 4 distinct allele variants,
a C/T nucleotide substitution located in exon 3, a C/T substitution located in intron 6 as well as a TTA nucleotide
deletion and a cytosine nucleotide insertion were identified in the 3`- untranslated region (UTR), respectively. The
C/T SNP in exon 3 is of particular interest, since it causes an amino acid exchange in the GNB3 polypeptide. Allele
frequency analysis either by direct PCR product sequencing or PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP)
of 5 primary hypertensive, 36 diabetes mellitus and 36 control dogs revealed that there may be an association of the
described polymorphism with primary hypertension and diabetes mellitus in dog. To confirm this data statistically,
more specimens from primary hypertensive, diabetes mellitus and control dogs have to be studied. The search for
potential differentially spliced GNB3 transcripts in blood cells detected 2 translatable mRNA species with a size of
1901 and 1445 bp and an untranslatable transcript (pseudogene) with a length of 2177 bp. In contrast to man we
failed to identify the analogous hypertension and diabetes mellitus associated human C5501T GNB3 allele and their
respective 41 amino acid truncated Gβ3s splice variant. The present study suggests that different molecular mechanisms
may be responsible for the pathophysilogy of the described diseases in dog and man.
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Diversidade genética de Sotalia guianensis
da Baía de Sepetiba e Sotalia fluviatilis
da Amazônia brasileira baseadas na análise
do DNA mitocondrial
Hollatz, C; Flach, L; Gomes, JD; Marmontel, M; Santos, FR
Instituto de Biologia, Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Minas Gerais
[email protected]
Palavras-chave: Sotalia, DNA mitocondrial
O gênero Sotalia (tucuxi ou boto-cinza) compreende atualmente duas espécies: i) a marítima, Sotalia guianensis, que
se distribui ao longo da costa Atlântica da América do sul, de Florianópolis no Brasil à Nicarágua na América Central,
e ii) a espécie de água doce, Sotalia fluviatilis, encontrada nas bacias do Amazonas e do Orinoco. Ambas estão listadas
no Apêndice I da Convenção Internacional de Comércio de espécies ameaçadas da Fauna e Flora Silvestre (CITES) e
são consideradas pela IUCN como deficientes de dados, o que indica uma necessidade de mais estudos para definição
do status de conservação destas espécies. As principais ameaças que afetam a espécie de água doce estão relacionadas à
captura incidental por redes de pesca. A espécie marítima sofre mais diretamente com a destruição dos hábitats ao longo
de sua área de distribuição, incluindo a poluição por efluentes industriais e agrotóxicos, etc. O presente trabalho visou
estudar geneticamente a diversidade das populações da Amazônia brasileira e da Baía de Sepetiba, esta última possui
a maior população marinha estimada de botos-cinza no Brasil. Para tanto, 64 amostras de DNA de boto-cinza foram
submetidas à amplificação por PCR e posterior sequenciamento da região controladora (RC) e do gene Citocromo
b (Cit-b) do DNA mitocondrial. Destas, seis amostras são da espécie S. fluviatilis e o restante da espécie marítima S.
guianensis. A análise de um segmento de 478 pb da RC de S. fluviatilis permitiu a identificação de 7 sítios variáveis e
três haplótipos distintos. Para o Cit-b, a análise de 1140 pb revelou três haplótipos distintos definidos por 30 sítios
variáveis. Tanto a análise da RC como do gene Cit-b do DNAmt de S. guianensis revelaram um único haplótipo. Para
a Amazônia, alguns haplótipos novos foram identificados, sugerindo uma estruturação que possa estar relacionada a
diferentes ambientes fluviais ou mera separação geográfica. A ausência de diversidade encontrada para a Baía de Sepetiba
corrobora as conclusões de artigos previamente publicados para outras populações marinhas desta espécie, nas quais
apenas um haplótipo da RC e de Cit-b foi encontrado para a Região Sudeste.
Agradecimentos: Juliana Marigo e Projeto Biopesca.
Apoio Financeiro: FAPEMIG, CAPES, CNPq e Vale.
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Validação de marcadores microssatélites
para golfinho rotador (Stenella longirostris)
Santoro, A1; Farro, APC2; Bortoloto, TM1; Rollo Jr, MM3; Silva Jr, JM4; Marino, CL1
1
Instituto de Biociências, Departamento de Genética, UNESP, Botucatu-SP
Centro de Ciências Humanas e Naturais, Universidade Federal do Espírito Santo (UFES), Vitória-ES
3
Campus do Litoral Paulista, UNESP, São Vicente-SP
4
Centro Golfinho Rotador, Fernando de Noronha-PE
[email protected]
2
Palavras-chave: microssatélites, Stenella longirostris, golfinho rotador, cetáceos, conservação
A utilização de marcadores microssatélites tem auxiliado os programas de conservação, colaborando na definição de
estratégias para proteção e manejo de populações de animais silvestres. Microssatélites já foram desenvolvidos para
algumas espécies de cetáceos, inclusive para os golfinhos rotadores (Stenella longirostris), para os quais foram recentemente
publicados nove microssatélites espécie-específicos. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi caracterizar e validar primers
de microssatélites desenvolvidos para S. longirostris. O material, tecido epidérmico de golfinhos rotadores, foi coletado
no Arquipélago de Fernando de Noronha pelo método de raspagem da pele e a extração do DNA das amostras foi
realizada com o uso da resina Chelex. Foram analisados seis primers: quatro (67%) resultaram em amplificações com
bandas inespecíficas e necessitam de padronização (Slo5, Slo6, Slo7 e Slo12) e os outros dois (Slo8 e Slo10) apresentaram
um padrão de bandas ideal para análise populacional. O marcador Slo8 foi validado em 12 indivíduos e apresentou dois
alelos que segregaram nessa população. O Slo10 está sendo avaliado, apresentando um padrão monomórfico, trata-se
de dados preliminares que necessitam ser validados em um maior número de indivíduos.
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Ocorrência de Stenella clymene em
Fernando de Noronha, PE, Brasil, sugerida
por identificação molecular
Farro, APC1; Silva Jr., JM2; Marino, CL3
Centro de Ciências Humanas e Naturais, Departamento de Biologia, UFES,Vitória, ES
2
Centro Mamíferos Aquáticos - ICMBio, Fernando de Noronha, PE
3
Instituto de Biociências, Departamento de Genética, UNESP, Botucatu, SP
[email protected]
1
Palavras-chave: Citocromo b; Fernando de Noronha; Golfinho-de-Clymene; Stenella clymene;
O gênero Stenella compreende cinco espécies distribuídas em oceanos de águas tropicais, subtropicais e temperadas.
Devido à similaridade do padrão de coloração externo e a sobreposição de faixas de fatores osteológicos entre algumas
destas espécies erros de identificação podem ocorrer. Um dos exemplos é a espécie Stenella clymene que pode ser
confundida com Stenella longirostris ou Delphinus spp. No Brasil a distribuição do golfinho-de-Clymene abrange
quase todo o litoral (máximo de 29°59’ S), tendo o maior número de registros no nordeste do País. No Arquipélago
de Fernando de Noronha, onde um grande número de golfinhos-rotadores (S. longirostris) é avistado diariamente, não
há registros consistentes da ocorrência de S. clymene. No entanto, um estudo recente relata a presença de um suposto
golfinho híbrido entre estas duas espécies, o que sugere a presença de S. clymene nestas águas. O objetivo do presente
estudo foi identificar molecularmente a espécie de um golfinho encontrado encalhado no Arquipélago. A amostra de
DNA foi analisada a partir de marcador mitocondrial de citocromo b. Para comparação foram utilizadas duas amostras
de referência de golfinhos já identificados: uma de S. longirostris e outra de S. clymene. Os fragmentos amplificados,
depois de purificados e seqüenciados, foram submetidos aos bancos de dados GenBank e DNA Surveillance. As espécies
das duas amostras de referência foram confirmadas. A amostra do golfinho encontrado encalhado teve maior homologia
com Stenella clymene. Considerando a inexistência de registros consistentes de tal espécie em Fernando de Noronha
este resultado contribui como importante indício da ocorrência de S. clymene no Arquipélago.
Financial support: CAPES; PETROBRÁS.
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Diversidade genética e estrutura populacional
de peixes-boi baseado no uso
de microssatélites
Gomes, JD1; Meirelles, ACO2; Marmontel, M3; Santos, FR1
1
Departamento de biologia geral, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG
Associação de Pesquisa e Preservação de Ecossistemas Aquáticos – Aquasis, SESC Iparana, Praia de Iparana s/n, Caucaia, CE
3
Instituto de Desenvolvimento Sustentável Mamirauá – Tefé, AM
[email protected]
2
Palavras-chave: Microssatélites, Sirênios, peixe-boi, estruturação populacional, Trichechus.
No Brasil existem duas espécies de Sirênios: Trichechus inunguis, encontrado na bacia amazônica e de hábito tipicamente
fluvial, e T. manatus, espécie marinha encontrada ao longo da costa Atlântica desde o estado de Alagoas no Brasil
até a Flórida nos Estados Unidos. Nos últimos anos, estudos foram feitos para acessar a diversidade genética dessas
espécies, porém em boa parte desses, os dados foram obtidos através do estudo do DNA mitocondrial. Os resultados
encontrados até agora mostraram que T. inunguis possui uma diversidade genética muito maior do que a encontrada
para T. manatus. Além disso, foi demonstrada na espécie marinha, a existência de uma significativa diferenciação
genética entre as populações a leste e a oeste das Antilhas, bem como a ocorrência de híbridos entre as duas espécies. No
presente estudo foram usados marcadores do tipo microssatélites para avaliar a variabilidade e a estrutura genética das
duas espécies. Foram analisados quatro locos de microssatélites em 43 de T. inunguis provenientes da região amazônica,
e 53 indivíduos de T. manatus provenientes do Brasil, Guianas, Belize e Estados Unidos. Para a espécie amazônica o
número de alelos encontrados variou entre três e sete sendo a heterozigosidade média 0,472. Para espécie marinha o
número de alelos variou entre quatro e cinco, com heterozigosidade média de 0,318, no entanto também apresentou um
excesso de homozigotos, o que condiz com um possível aumento da endogamia nesta espécie. Análises de divergência
populacional considerando que os indivíduos foram agrupados entre leste e oeste das Antilhas (Trinidad) resultaram
em um Rst de 0,367, evidenciando uma estruturação significante entre essas duas porções da distribuição populacional
da espécie marinha. Sendo assim, esses resultados reforçam a idéia de que a população existente nas Guianas e no
Brasil corresponde a uma linhagem evolutivamente separada das demais populações de T. manatus, o que aumenta sua
importância em termos de conservação da espécie marinha como um todo.
Apoio financeiro: CNPq, FAPEMIG.
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Estudo citogenético e citoquímico do
ciclo nucleolar no epitélio seminífero
de Oryctolagus cuniculus (Mammalia,
Lagomorpha)
Peruquetti, RL; Azeredo-Oliveira, MTV
Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas (IBILCE), Departamento de Biologia, Universidade Estadual Paulista (UNESP)
[email protected]
Palavras-chave: Nucléolo, Nucleologênese, Corpo cromatóide, Espermatogênese, Oryctolagus cuniculus
O nucléolo é um território do núcleo relacionado com a compartimentalização das funções nucleares. A formação do
nucléolo é um processo dinâmico no ciclo celular eucariótico denominado nucleologênese. Alguns autores acreditam que
o corpo cromatóide (CB), uma estrutura citoplasmática de células espermatogênicas que possuem um provável papel na
reserva de RNAs e proteínas durante a espermatogênese, é formado pela migração de material nucleolar do núcleo para
o citoplasma. Entretanto, a origem e o papel do CB ainda permanecem controversos. O objetivo do presente estudo foi
acompanhar o ciclo nucleolar no epitélio seminífero de Oryctolagus cuniculus. Os testículos foram removidos, fixados em
Karnovsky e, posteriormente, incluídos em historesina. Cortes histológicos foram obtidos em micrótomo Leica RM 2155 e
submetidos a algumas técnicas citoquímicas: Hematoxilina-eosina (HE), Azul de toluidina (AT), Variante da Concentração
Eletrolítica Crítica (CEC), reação de Feulgen e impregnação por íons prata (AgNOR). Alguns fragmentos testiculares foram
preparados para análises citogenéticas, sendo tratados com solução hipotônica de KCl 0,075 M e, posteriormente, fixados em
metanol:ácido acético (3:1) recém preparado. O material fixado foi fragmentado para obtenção de uma suspensão celular e,
com uma pipeta Pasteur, três gotas dessa suspensão foram colocadas em uma lâmina aquecida (30-35ºC). Posteriormente,
essas lâminas foram submetidas à técnica de impregnação por íons prata (AgNOR). Nos cortes histológicos, a técnica de
HE proporcionou uma análise geral do epitélio seminífero e as demais técnicas citoquímicas (AT, variante de CEC, reação
de Feulgen e AgNOR) demonstraram uma fragmentação do material nucleolar nos espermatócitos primários, a distribuição
desse material fragmentado dentro do núcleo celular e uma redução da área nucleolar nas espermátides iniciais. Essa redução
da área nucleolar indica que pode ter ocorrido migração do material nucleolar do núcleo para o citoplasma. Na preparação
citogenética não foram encontradas espermatogônias em mitose, porém, o número cromossômico da espécie foi determinado
como sendo 2n=44. As espermatogônias em intérfase apresentaram um nucléolo central organizado. Espermatócitos primários
em zigóteno apresentaram material nucleolar fragmentado distribuído no interior do núcleo, porém os espermatócitos primários
em paquíteno apresentaram corpúsculos nucleolares distribuídos, preferencialmente, pela periferia da região nuclear. Durante
a metáfase I não foi detectada a presença de material nucleolar organizado. Espermátides iniciais (redondas) e espermátides
em alongamento foram observadas apresentando vários corpúsculos nucleolares, sendo os corpúsculos distribuídos com
maior freqüência pela periferia do núcleo. Os espermatozóides apresentaram uma forte impregnação pela prata na região da
formação da peça intermediária e cauda dos espermatozóides. Em conclusão, esses resultados demonstraram que ocorre uma
fragmentação do material nucleolar durante a espermatogênese de Oryctolagus cuniculus, e que, provavelmente, uma parte desse
material fragmentado migre para o citoplasma, onde ajuda a formar a estrutura conhecida como corpo cromatóide (CB).
Apoio: CNPq/FAPESP/CAPES.
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Análise mitótica e meiótica de híbridos
cromossômicos de veado-mateiro
(Mazama americana)
Abril, VA1,2; Salviano, MB2; Ferreira, JC2; Duarte, JMB2
1
Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento Animal, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinária, Universidade Estadual Paulista
Núcleo de Pesquisa e Conservação de Cervídeos, Departamento de Zootecnia, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinária, Universidade Estadual Paulista
[email protected]
2
Palavras-chave: variação cromossômica, complexo sinaptonêmico, Mazama americana
Entre os cervídeos neotropicais, a espécie Mazama americana mostra-se uma das mais interessantes do ponto de vista
citogenético. Distribuída por todo o território brasileiro, é possível reconhecer cinco citótipos com números diplóide e
fundamental distintos. Com o objetivo de avaliar a compatibilidade cromossômica entre as variantes foram produzidos
animais F1, híbridos entre os diferentes citótipos, sendo que 3 machos foram avaliados neste trabalho (MatFap 02, 04,
06). A análise mitótica foi realizada a partir de culturas de fibroblastos, contagem dos cromossomos e montagem dos
cariótipos, enquanto que o estudo meiótico foi a partir de biópsias testiculares aspirativas, com os paquítenos identificados
em microscópio de luz e analisados em microscópio eletrônico de transmissão. Nos paquítenos do animal MatFap02
(2n=44, NF=47), além da trivalente sexual (XY1Y2) foi identificado um único trivalente para autossomos, e ambas
as configurações apareceram na forma cis. O pareamento na forma de bivalentes entre a maioria dos cromossomos se
deve à proximidade cariotípica entre os animais parentais (um macho do citótipo Juína 2n=45 e NF=48 e uma fêmea
do citótipo Rondônia 2n=42 e NF= 48). O animal MatFap 04 (2n=44, NF=49) foi produto do cruzamento entre
um macho com 2n=45 e NF= 48 e uma fêmea com 2n=42 e NF=49 pertencentes aos citótipos Juína e Rondônia,
respectivamente. A análise do pareamento meiótico revelou vários problemas de sinapse entre os cromossomos
homólogos. Alguns apareceram com as extremidades não pareadas, outros na forma de univalentes não pareadas e
também, regiões não pareadas no meio dos braços com formato de bolhas. Dentre os três produtos F1 analisados, o
animal MatFap 06 é o único proveniente de cruzamento entre parentais com mesma constituição cromossômica (macho
2n=45; NF= 48 e fêmea 2n=44; NF=48, ambos do citótipo Juína). A análise meiótica mostrou pareamento normal, na
forma de bivalentes para todos os cromossomos autossomos. O trivalente sexual foi identificado a partir do pareamento
do Y1 na região pseudo-autossômica e do Y2 no terço distal do cromossomo X. A possibilidade de que exista várias
espécies distintas dentro do táxon “americana” seria real caso se confirmasse a existência de esterilidade híbrida devido
às incompatibilidades cromossômicas (anomalias meióticas) ou gênicas entre as espécies parentais. Os resultados de
pareamento meiótico apresentados até o presente momento corroboram os trabalhos que mostram que quanto maior
a divergência cariotípica entre os animais parentais, maior o número e os tipos de configurações de pareamento no
paquíteno. Entretanto, ainda é cedo para afirmar que essa diferença cromossômica entre os animais da geração parental
é suficiente para causar problemas de fertilidade nos F1.
Apoio Financeiro: FAPESP.
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Elucidação das homeologias cromossômicas
entre os morcegos hematófagos: Zoo-Fish
com sondas cromossômicas de Carollia
brevicauda e Phyllostomus hastatus
(Phyllostomidae-Chiroptera)
Sotero-Caio, CG1; Pieczarka, JC2; Nagamachi, CY2; Gomes, AJB2; Lira, TC3; O´Brien, PCM4;
Ferguson-Smith, MA4; Souza, MJ1; Santos, N1
Laboratório de Citogenética e Genética Animal, CCB/UFPE, Recife, Pernambuco – Brazil
2
Laboratório de Citogenética, CCB/UFPA, Belém, Pará – Brazil
3
Laboratório de Estudo e Conservação de Mamíferos, CCB/UFPE, Recife, Pernambuco – Brazil
4
Molecular Cytogenetics Laboratory, Department of Clinical Veterinary Medicine, University of Cambridge, UK
[email protected]
1
Palavras-chave: Desmodus, Diaemus, Diphylla, homeologias cromossômicas, pintura cromossômica
A família Phyllostomidae constitui a terceira maior dentre os Chiroptera, sendo caracterizada por exibir mais variações morfológicas
do que qualquer outro grupo de mamíferos, o que gera considerável discordância no estabelecimento de suas relações sistemáticas e
evolutivas. Citogeneticamente é caracterizada por cariótipos conservados entre espécies proximamente relacionadas, bem como por
intensa variabilidade intergenérica, o que dificulta o estabelecimento de suas relações evolutivas por bandeamentos clássicos. A partir
da análise comparativa de cariótipos com bandeamento G tem-se tentado estabelecer relações entre as várias espécies da família,
entretanto a similaridade entre bandas não homeólogas dificulta o esclarecimento da história evolutiva de segmentos cromossômicos.
Recentes estudos têm contornado este problema através do emprego da pintura cromossômica para a detecção de segmentos sintênicos
entre espécies. Dessa forma, neste trabalho foi realizada a pintura cromossômica comparativa para a identificação de homeologias
cromossômicas entre cinco espécies, pertencentes a três subfamílias de Phyllostomidae. A partir do emprego de sondas cromossômicas
totais de Phyllostomus hastatus (Phyllostominae) e Carollia brevicauda (Carolliinae) foram discutidos os prováveis eventos ocorridos
na diferenciação dos cariótipos de Desmodus rotundus, Diphylla ecaudata e Diaemus youngi (Desmodontinae). As sondas de P. hastatus
detectaram 23, 22 e 21 segmentos conservados nos cariótipos de D. rotundus, D. ecaudata e D. youngi, respectivamente, enquanto 28,
27, e 27 segmentos conservados foram respectivamente detectados com sondas de C. brevicauda. Os dados obtidos evidenciaram certa
conservação cariotípica entre os membros de Desmodontinae, com D. rotundus apresentando o cariótipo mais rearranjado das três
espécies. Com base nas relações evolutivas propostas por dados moleculares, morfológicos e citogenéticos são apresentadas as possíveis
seqüências de eventos, incluindo rearranjos do tipo inversão e translocação, que ocorreram durante a evolução cromossômica dos
morcegos hematófagos. Adicionalmente, o estudo comparativo entre as cinco espécies mostrou um maior número de cromossomos
compartilhados entre Desmodontinae e P. hastatus, o que provavelmente está relacionado à maior proximidade de Desmodontinae à
subfamília Phyllostominae do que a Carolliinae. A integração dos dados de pintura cromossômica aos de localização das RONs nas
cinco espécies mostrou que a variação na localização das RONs parece acompanhar os rearranjos cromossômicos ocorridos durante a
diferenciação dos cariótipos de algumas espécies, podendo, em outras, ser resultado de mecanismos de movimentação de seqüências
repetitivas entre cromossomos não-homólogos. Os resultados obtidos no presente estudo mostram que as sondas cromossômicas de P.
hastatus e C. brevicauda são ferramentas úteis no estudo da evolução cariotípica dos morcegos da família Phyllostomidae.
Apoio financeiro: FACEPE e CNPq.
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Estudo citogenético comparativo entre duas
espécies do Gênero Artibeus (Chiroptera,
Phyllostomidae) do Parque Estadual da
Fonte Grande, Vitória, ES
Pagnozzi JM1; Selvatici, LS1; Ditchfield AD2
Faculdade Salesiana de Vitória, FSV
Universidade Federal do Espírito Santo, UFES
[email protected]
1
2
Palavras-chave: citogenética, chiroptera, cromossomos, morcegos, Artibeus
O Parque Estadual da Fonte Grande (PEFG) localiza-se no município de Vitória (ES) e sua área pertence ao complexo
cristalino da Serra do Mar, sendo um resquício de Mata Atlântica preservada dentro de uma área urbana. A comunidade
de morcegos do PEFG foi inventariada no período de janeiro a dezembro de 2003. Os morcegos foram coletados
utilizando-se redes de neblina, e as preparações cromossômicas foram obtidas a partir de medula óssea ou baço, após
injeção sub-cutânea in vivo de colchicina. Duas espécies do gênero Artibeus Leach, Artibeus lituratus Olfers, 1818
(2 machos e 2 fêmeas) e Artibeus fimbriatus Gray, 1838 (1 macho e 1 fêmea) foram selecionadas para estudo citogenético.
Empregou-se a técnica de coloração convencional para se estabelecer o número cromossômico e morfologia. O padrão de
bandas CBG foi obtido após tratamento das lâminas em Hidróxido de Bário. As duas espécies apresentaram 2n=30/31,
XX/XY1Y2 e NF=56, constituído por autossomos meta/submetacêntricos. O cromossomo X é submetacêntrico médio
para ambas as espécies, e o Y1 acrocêntrico pequeno para Artibeus lituratus e um pouco menor para Artibeus fimbriatus.
Y2 é puntiforme em A. fimbriatus e A. lituratus. O padrão CBG, nas duas espécies, mostrou heterocromatina constitutiva
(HC) localizada na região pericentromérica de todos os autossomos e pequenos blocos de HC na região telomérica do
braço curto dos pares 5, 6 e 7. Este é o primeiro estudo citogenético comparativo entre morcegos do Espírito Santo.
Apoio financeiro: FACITEC e FAPES.
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Estrutura genética em populações
de Phyllostomus discolor
(Chiroptera: Phyllostomidae)
Brina, LPS; Redondo, RAF; Santos, FR
Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Minas Gerais
letí[email protected]
Palavras-chave: Phyllostomus discolor, DNA mitocondrial, D-loop, estrutura populacional, filogeografia
Phyllostomus discolor (Wagner, 1843) é um morcego de hábitos generalistas e muitas vezes descrito como onívoro,
pertencente a família Phyllostomidae e amplamente distribuido na América do Sul, ocorrendo em todos os biomas
brasileiros. Devido ao seu modo de vida e hábitos alimentares ele é responsável pela polinização e dispersão de várias
espécies, incluindo espécies de importância econômica como o pequi (Caryocar brasiliensis). Neste estudo, vinte indivíduos
de P. discolor, de oito localidades diferentes, foram seqüenciados para 413 pares de bases da região D-loop mitocondrial
com intuito de verificar padrões filogeográficos da espécie. Dos 413 pares de bases seqüenciados, 394 são monomórficos,
19 são variáveis e destes 12 são informativos de parcimônia. Oito hapótipos diferentes foram identificados, com uma
diversidade haplotípica (h) de 0,7 e diversidade nucleotídica (π) de 0,011, indicando que os haplótipos são muito
pouco divergentes entre si. Foram encontradas três linhagens diferentes para a espécie, que se distanciam em média
em 2,5%. Uma destas linhagens consiste exclusivamente de indivíduos da região nordeste. Em outra linhagem, existe
um haplótipo muito freqüente, compartilhado por 11 indivíduos e encontrado na maioria das localidades, inclusive
na região nordeste. A terceira linhagem parece ser intermediária nas análises. Esta situação é diferente da encontrada
para outras espécies de morcegos na Mata Atlântica, na qual existem duas linhagens distintas, uma da região nordeste e
outra da região sudeste do país. Tal circunstância é explicada pela fragmentação da Mata Atlântica durante os períodos
Pleistoceno e Plioceno, que levou a eventos vicariantes. Um possível cenário para estes resultados seria uma situação de
isolamento e divergência das linhagens, com posterior recolonização de uma região gerando contato secundário.
Apoio financeiro: CNPq e FAPEMIG.
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Comparação entre filogenias nuclear
e mitocondrial de roedores do Gênero
Phyllomys (Echimyidae)
Loss, ACC1; Leite, YLR1
Lab. Mastozoologia e Biogeografia, Universidade Federal do Espírito Santo
[email protected]
1
Palavras-chave: citocromo b, IRBP, Rodentia, Mammalia
O gênero Phyllomys corresponde a uma radiação arborícola dos roedores equimídeos e é endêmico de áreas de Mata
Atlântica. Possui 13 espécies e suas relações filogenéticas ainda não estão bem esclarecidas. O DNA mitocondrial tem
sido amplamente utilizado como ferramenta para determinação de relações evolutivas, porém trabalhos recentes sugerem
também a utilização de genes nucleares para inferir filogenias. Estudos preliminares com citocromo b resultaram em
uma politomia basal para as espécies de Phyllomys e, sendo assim, o objetivo do presente trabalho foi comparar as
filogenias geradas através de seqüências de DNA de genes nucleares e mitocondrias das espécies do gênero. Para isso,
foram analisados os genes do citocromo b (mitocondrial) e do exon 1 da proteína ligante do fotorreceptor retinóide
(IRBP, nuclear) de espécies do gênero Phyllomys. Como grupo externo utilizamos seqüências do GenBank de Capromys
pilorides e Echimys chrysurus. Foram construídos filogramas utilizando máxima parcimônia e máxima verossimilhança para
cada gene e também para os dados concatenados. O apoio estaístico dos clados foi estimado através de 100 replicações
de bootstrap. Os resultados das árvores obtidas foram semelhantes para os dados concatenados e para o citocromo b,
apontando a monofilia do gênero e também de cada uma das espécies de Phyllomys estudadas, sendo P. lamarum grupo
irmão de P. blainvilli e P. pattoni um clado basal. De modo geral, os clados encontrados tiveram suporte elevado de
bootstrap (acima de 90%). Esses resultados corroboram os dados da literatura. Porém, as árvores resultantes das análises
com o gene nuclear IRBP apresentaram uma politomia para as espécies de Phyllomys, confirmando apenas a monofilia
do grupo em relação aos grupos externos utilizados. Os resultados apontam que genes nucleares e mitocondriais são
úteis para adicionar resolução em diferentes níveis na filogenia, apesar das diferentes taxas de evolução.
Apoio financeiro: CEPF, FAPES e CAPES.
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ZOO-FISH em meiose: análise de pintura
cromossômica do X humano em Artibeus
obscurus (Phyllostomidae, Chiroptera)
Noronha, RCR1,4; Pereira, AL1,2; Nagamachi, CY1,3; Pieczarka, JC1,3
Laboratório de Citogenética, ICB, UFPA, Belém
2
Bolsista IC, UFPA
3
Pesquisador CNPq
4
Bolsista de Fixação de Recursos Humanos na Amazônia, CNPq
1
Palavras-chave: ZOO-FISH, meiose, Artibeus obscurus, XY1Y2, citogenética
Apesar do cromossomo X corresponder a 5% do complemento haplóide na maioria dos mamíferos euterianos, já
foram encontradas situações em que este valor é ultrapassado, chegando a 10%, 15% e até 20%. Uma das explicações
para este aumento seriam as translocações autossomos/X. Uma revisão citogenética de 9 espécies de morcegos
filostomídeos destaca variações de tamanho do cromossomo X, com magnitude de 4,9% a 15,7%, todas decorrentes de
translocações autossomos/X. A identidade dos cromossomos envolvidos no sistema sexual múltiplo de algumas espécies
de Stenodermatinae, e a possível distribuição desse sistema entre os Artibeus foi descrita por pintura cromossômica de
células meióticas com sondas específicas de cromossomos sexuais de Phyllostomidae. Neste trabalho objetivamos analisar
as fases da meiose e comparar as regiões homeólogas do cromosomo X humano (sistema XX/XY) com o X de Artibeus
obscurus (XX/XY1Y2). Exemplares de A. obscurus foram coletados em Santa Bárbara, estado do Pará, e depositados no
Museu Paraense Emílio Goeldi. Foi aplicada a técnica de hibridização in situ com fluorocromo (FISH) com a utilização
da sonda do cromossomo X de Homo sapiens em células meióticas de A. obscurus. Os resultados mostram vários
sub-estágios meióticos com pintura cromossômica de X em um braço cromossômico do X composto de A. obscurus,
confirmando a sintenia de X conservado por cerca de 170 milhões de anos. Contudo, além da marcação de um dos
braços do cromosomo X composto, foram observadas outras regiões hibridizadas. Nos paquítenos iniciais a marcação
envolve um bloco condensado, provavelmente por autopareamento do X original e em outro segmento cromossômico
autossômico. Em paquítenos mais tardios observa-se uma marcação nítida em uma região central entre os segmentos
do autossomo translocado (X-Y2) e do Y1 e em outra região cromossômica, semelhante ao observado nos diplótenos e
metáfase II. Portanto, neste trabalho observou-se que a sonda do cromossomo X de humano além de sua homeologia
ao X de Artibeus obscurus, marca outras regiões autossômicas que serão definidas após pintura cromossômica em células
mitóticas desse animal.
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Evolução cromossômica e relação de
parentesco em três morcegos da Família
Phyllostomidae (Mammalia, Chiroptera):
Evidências por citogenética clássica e
pintura cromossmômica multidirecional
Gomes, AJB 1,3; Rodrigues, LRR4; Nagamachi, CY1,2; Pieczarka, JC1,2
Laboratório de Citogenética, UFPA-Belém
2
Pesquisador do CNPq
3
Bolsista Mestrado CAPES em Genética e Biologia Molecular
4
Laboratório de Genética & Biodiversidade, UFPA-Santarém
1
Palavras-chave: Citogenética, Phyllostomidae, Pintura cromossômica
A família Phyllostomidae corresponde o mais diverso e abundante grupo de morcegos neotropicais, apresentando mais
variações em caracteres morfológicos do que qualquer outro grupo, ao nível de família, dentre os mamíferos. No presente
trabalho são apresentados dados de bandeamento cromossômico e pintura cromossômica multidirecional, usando
sondas de cromossomos totais de Carollia brevicauda (CBR) e Phyllostomus hastatus (PHA) no genoma de Rhinophylla
pumilio (Chiroptera, Phyllostomidae). São feitas inferências sobre a evolução cromossômica e relação de parentesco em
representantes de três subfamilias de Phyllostomidae previamente mapeadas: Phyllostominae (Phyllostomus hastatus PHA), Glossophaginae (Glossophaga soricina - GSO) e Carolliinae (Rhinophylla pumilio - RPU). Rhinophylla pumilio,
citótipo 2n= 34, NF=62, apresenta um complemento cromossômico consistindo em sua maioria de cromossomos de
dois braços, sendo o par 16 um acrocêntrico e o Y um metacêntrico pequeno. Hibridização In Situ Fluorescente (FISH)
com sondas de DNA telomérico evidenciaram marcações na região distal de todos os cromossomos não ocorrendo
marcações intersticiais. Impregnação com nitrato de prata e hibridização com sondas de rDNA 18S e 28S mostraram
marcações na região distal do braço longo do par 15, estando associada com heterocromatina constitutiva, e no braço
curto do par 16. Pintura cromossômica multidirecional com sondas de PHA e CBR no genoma de Rhinophylla pumilio
evidenciaram 17 e 26 sinais de hibridização, respectivamente. A análise comparativa usando bandeamento G e pintura
cromossômica sugere que grande parte do complemento cromossômico de RPU está conservado no cariótipo de GSO e
PHA, apontando para uma história evolutiva em comum entre os representantes destas três subfamílias. Aparentemente
RPU seria mais relacionado com PHA do que com GSO. Uma análise cladística das associações cromossômicas é
necessária para caracterizar Rhinophylla pumilio do ponto de vista filogenético, pesquisa esta em andamento.
Apoio Financeiro: CNPq; CAPES; UFPA.
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Análise filogenética de morcegos da família
Molossidae baseada em seqüências de DNA
nuclear RAG2 e mitocondrial citocromo b
Leme, FLJ; Morielle-Versute, E; Langeani, F; Marchesin, SRC
Depto. de Zoologia e Botânica –UNESP – Universidade Estadual Paulista. Campus de São José do Rio Preto-SP
[email protected]
Palavras-chave: Chiroptera, variabilidade genética, filogenia
A maior diversidade dos morcegos ocorre em regiões neotropicais, parte desta diversidade encontra-se no Brasil, devendo-se
principalmente as famílias Phyllostomidae, Molossidae e Vespertilionidae. As espécies de Molossidae vivem em grandes
colônias, sendo considerados os morcegos mais comuns. Entretanto, muitos táxons estão pobremente representados e
pouco se sabe sobre as interpretações taxonômicas e filogenéticas. O presente trabalho propõe a utilização de caracteres
moleculares mitocondrial (citocromob) e nuclear (RAG2) para a caracterização dos agrupamentos formados pelas
espécies, Molossus molossus, M. rufus, Eumops glaucinus, E. perotis, E. auripendulus, Nyctinomops laticaudatus, N. macrotis,
Cynomops abrasus, C. planirostris, Molossops temminckii, para as quais pouca ou nenhuma informação filogenética é
reportada. Trinta e duas seqüências foram geradas obtendo-se a partir delas, seqüências consenso de cada espécie para
os dois genes, estas foram editadas e alinhadas nos programas BioEdit e Clustal W. As análises de distância, Máxima
Parcimônia e Verossimilhança foram realizadas no programa PAUP. Na análise de distância foi utilizado o algoritmo de
Neighbor-joining, para a análise de parcimônia o algoritmo de busca de árvores foi o branch and bound e na análise de
verossimilhança o modelo evolutivo escolhido foi o HKY85. Os suportes dos ramos foram obtidos a partir de bootstrap
com 1000 réplicas. Foram analisados 472 caracteres do citocromob destes, 109 foram informativos filogeneticamente,
com índices de consistência de 0,60 e homoplasia de 0,41. Para o RAG2 foram analisados 638 caracteres sendo 41
informativos, com índices de consistência de 0,90 e homoplasia de 0,10. Os valores de distância obtidos para os dois
genes apresentaram-se baixos, variando de 0,0633 (C. abrasus/C. planirostris) a 0,184 (M. temminckii/E. auripendulus)
para o citocromob e 0,0038 (N. laticaudatus/M. temminckii) a 0,0626 (M. rufus/C. abrasus) para o RAG2, indicando
que este último apresenta maior conservação. Esta condição aparece também, nas topologias obtidas pelos diferentes
métodos, visto que alguns táxons não apresentaram resolução gerando politomias, contudo, táxons como os pertencentes
aos gêneros Molossus e Eumops formaram grupos com suporte variando de 60 a 100%. As topologias obtidas a partir
das análises com os diferentes métodos e dados do citocromob foram semelhantes, com agrupamentos bem definidos e
índices de bootstrap consistentes (77 a 100%). As diferenças encontradas entre os genes nuclear e mitocondrial refletem
as diferentes taxas de evolução a que estes marcadores estão submetidos. Os agrupamentos bem definidos gerados
pelo citocromob indicam a possibilidade de ocorrência de eventos evolutivos recentes nos diferentes táxons. Os baixos
índices de diversidade encontrados entre os gêneros estudados refletem o conservacionismo já observado em algumas
espécies de Chiroptera por outros estudos, caracterizando a complexidade da família. Contudo, os genes, mitocondrial
e nuclear foram eficientes na detecção de polimorfirmos nos diferentes táxons, o que auxilia no estabelecimento dos
limites das variações em espécies conservadas.
Apoio financeiro: CNPq.
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Caracterização citogenética de
Rhynchonycteris naso (Chiroptera:
Emballonuridae) da Amazônia brasileira
de Araujo, REF1,4; Gomes, AJB1,3; Nagamachi, CY1,2; Pieczarka, JC1,2
Laboratório de Citogenética, UFPA-Belém
2
Pesquisador do CNPq
3
Bolsista Mestrado CAPES em Genética e Biologia Molecular
4
Bolsista PIBIC-CNPq
1
Palavras-chave: Chiroptera, Citogenética, Cromossomo, Biodiversidade
A Ordem Chiroptera constitui a segunda maior ordem em diversidade de espécies dentro da classe Mammalia. É uma
das ordens de mamíferos mais dispersos, apresentando grande importância em florestas tropicais e subtropicais devido
a atuarem como dispersores de sementes, polinizadores e predadores naturais de insetos. A família Emballonuridae
compreende uma das famílias de morcegos mais primitivas, sendo estritamente insetívoros e apresentando pouca
aversão à luz, diferindo assim das demais famílias de quirópteros. Os estudos citogenéticos têm trazido grande
contribuição para a caracterização de táxons e desenvolvimento de hipóteses de relação de parentesco e filogenia,
visto que caracteres cromossômicos estão menos sujeitos a ação do meio ambiente. No Brasil ocorrem sete gêneros
e 15 espécies de Emballonuridae, sendo que nenhuma descrição citogenética foi realizada para nosso território. O
presente trabalho analisou quatro espécimes fêmeas de Rhynchonycteris naso, coletados no município de Benevides, Pará
(S 1º 23’06.06”; W 48º 15’ 58.7”). Os cromossomos metafásicos foram obtidos pela técnica de extração direta da medula
óssea. As preparações cromossômicas foram coradas com Giemsa. Foram realizados bandeamentos C, G e marcação
das regiões organizadoras de nucléolos (Ag-NOR). Os resultados mostram que a espécie apresenta 2n = 22 e NF = 36,
sendo cinco pares de cromossomos metacêntricos maiores, três pares de cromossomos metacêntricos menores e dois
pares de cromossomos acrocêntricos pequenos. O cromossomo X é um acrocêntrico médio. O padrão de bandeamento
C mostra que a heterocromatina constitutiva ocorre na região pericentromérica de todos os cromossomos e na região
intersticial em um dos cromossomos acrocêntricos. As regiões organizadoras de nucléolo foram observadas na porção
distal do segundo par metacêntrico. A análise do padrão de bandeamento G foi semelhante ao descrito na literatura.
Os mecanismos de evolução cromossômica da família ainda permanecem desconhecidos, não havendo trabalhos que
enfatizem o conhecimento dos cariótipos de morcegos Emballonurídeos, com base nos padrões de bandeamento e pintura
cromossômica. Tais dados são extremamente importantes para determinar as relações evolutivas entre os morcegos desta
família, para, sobretudo auxiliar na compreensão da biodiversidade de morcegos da Amazônia, contribuindo assim para
o entendimento da evolução dos quirópteros como um todo.
Apoio Financeiro: CNPq; CAPES, UFPA.
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Pintura cromossômica utilizando três sondas
cromossômicas totais de Phyllostomus
hastatus no cariótipo de Uroderma
magnirostrum (Chiroptera-Phyllostomidae)
da Amazônia Brasileira
Silva, NN 1,3; Gomes, AJ1,4; Nagamachi, CY 1,2; Pieczarka, JC1,2
Laboratório de Citogenética, UFPA
2
Pesquisador do CNPq
3
Bolsista PIBIC-CNPq
4
Bolsista de Mestrado CAPES em Genética e Biologia Molecular
1
Palavras-chave: Pintura cromossômica, Uroderma, morcego, citogenética, FISH
A família Phyllostomidae é exclusiva do Novo Mundo, apresentando no Brasil, cerca de 90 espécies. A subfamília mais
especiosa é Stenodermatinae, com 33 espécies. O gênero Uroderma apresenta duas espécies: Uroderma bilobatum e
Uroderma magnirostrum, com cariótipos bastante diferenciados em relação a outros gêneros da subfamília Stenodermatinae
(Chiroptera, Phyllostomidae). Apesar das técnicas de bandeamentos cromossômicos serem importantes no entendimento
das relações de parentesco entre os grupos, a ocorrência de processos extensos de rearranjo cromossômico e variabilidade
intragenérica dificultam as análises comparativas utilizando somente essa metodologia. Com o desenvolvimento das técnicas
de Hibridização In Situ Fluorescente (FISH) a identificação de segmentos homeólogos entre cariótipos diferenciados se
tornou possível, utilizando sondas que detectam grandes regiões de homologia, demonstrando as seqüências conservadas
entre as espécies. No presente trabalho foram hibridizadas três sondas cromossomo-específicas de Phyllostomus hastatus
(Phyllostominae) no cariótipo de Uroderma magnirostrum (Stenodermatinae) para identificação de blocos sintênicos
comuns entre estas espécies. Os estudos envolveram a obtenção do padrão de bandeamento G e citogenética molecular
de um espécime macho, que apresentou cariótipo com 2N=36/NF=62. O complemento autossômico é constituído por
quatro pares metacêntricos, dez submetacêntricos e três acrocêntricos. O X é um submetacêntrico de tamanho médio e
o Y submetacêntrico pequeno. O padrão de bandeamento G mostra-se similar ao descrito na literatura. Os resultados
da análise por ZOO-FISH, utilizando sondas cromossômicas totais correspondendo aos cromossomos PHA8, PHA9 e
PHA11 da espécie Phyllostomus hastatus, revelaram dois segmentos conservados no cariótipo de Uroderma magnirostrum
(PHA8=UMA2 e PHA11=UMA4). Já o resultado do PHA9 evidenciou dois sinais de hibridização, um no braço longo
do cromossomo UMA3 e outro na região proximal do cromossomo UMA15. Esta distribuição de sinais indica que
teria ocorrido uma fissão do cromossomo PHA9, com cada um dos dois segmentos resultantes sofrendo translocação
com outros cromossomos. Hibridizações com as demais sondas de PHA estão sendo realizadas visando o mapeamento
completo no cariótipo de U. magnirostrum. Esses resultados permitirão uma análise comparativa mais precisa e melhor
compreensão dos mecanismos de evolução cromossômica que atuaram na diversificação dessas espécies.
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Descrição cariotípica de Micronycteris
homezi (Chiroptera - Phyllostomidae)
da Amazônia Oriental, PA
Benathar, TCM3; Gomes, AJB4; Noronha, RCR1,2; Rodrigues, LRR4; Nagamachi, CY1,2; Pieczarka, JC1,2
Laboratório de Citogenética, ICB, UFPA
2
Pesquisador do CNPq
3
Bolsista IC-CNPq
4
Bolsista Mestrado CAPES em Genética e Biologia Molecular
5
Laboratório de Genética & Biodiversidade, UFPA-Santarém
[email protected]
1
Palavras-chave: Chiroptera, Micronycteris, Citogenética, FISH, Biodiversidade
O gênero Micronycteris (Chiroptera - Phyllostomidae) atualmente inclui dez espécies: M. brosseti, M. hirsuta, M. homezi,
M. matses, M. megalotis, M. microtis, M. minuta, M. sanbornii, M. schmidtorum e M. giovanniae. Os morcegos deste
gênero apresentam distribuição nos neotrópicos, mais precisamente do México ao norte da América do Sul e Brasil.
Vários estudos citogenéticos foram realizados em espécies do gênero Micronycteris revelando uma extensa variação
cariotípica, tanto no que diz respeito ao número diplóide, como ao número fundamental. O presente trabalho reporta,
pela primeira vez, o número cromossômico e a morfologia básica do cariótipo de um exemplar macho de Micronycteris
homezi. Esta espécie foi coletada em um fragmento de floresta no município de Santa Bárbara do Pará (latitude
01º13’25” sul e longitude 48º17’40” oeste). Preparações cromossômicas foram realizadas a partir da técnica de medula
óssea. O cariótipo foi analisado através das técnicas de coloração convencional, bandeamento G, C e Hibridização
in situ Fluorescente (FISH) com sondas telomérica e de rDNA. M. homezi apresenta 2n = 28 e número fundamental
NF = 52. O complemento cromossômico autossômico é formado por cromossomos de dois braços, organizados no
cariótipo por tamanho decrescente (meta/submetacêntricos e subtelocêntricos), sendo o X um submetacêntrico médio
e o Y um acrocêntrico pequeno. A análise por bandeamento C permitiu identificar a presença de heterocromatina na
região pericentromérica de todo o complemento cromossômico. FISH com sondas teloméricas evidenciaram marcações
na região distal de todos os cromossomos e uma marcação intersticial em um par de cromossomos metacêntricos
pequenos, enquanto que sondas de rDNA 18S evidenciaram marcações na região proximal do braço curto de dois
pares de cromossomos médios. O padrão de bandeamento G sugere que grande parte do complemento cromossômico
autossômico de M. homezi é homeólogo aos de M. minuta, sugerindo uma relação de parentesco próxima. Para melhor
interpretação dos possíveis mecanismos de evolução cariotípica neste gênero, torna – se necessário estudar um maior
número de indivíduos e espécies relacionadas, devido à grande variação cariotípica observada.
Apoio: CNPq, CAPES, UFPa.
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Análise comparativa do comportamento
meiótico dos sistemas cromossômicos
sexuais XY1Y2 e Neo-XY em Stenodermatinae
(Chiroptera) da Amazônia Oriental
Pereira, AL3; Pieczarka, JC1,2; Nagamachi, CY1,2; Rodrigues, LRR5; Noronha, RCR1,4
Lab. de Citogenética, ICB, UFPA
2
Pesquisador do CNPq
3
Bolsista PIBIC-UFPA
4
Bolsa de Formação de recursos humanos na Amazônia-CNPq
5
Laboratório de Genética & Biodiversidade, UFPA-Santarém
1
Palavras-chave: Meiose, Stenodermatinae, XY1Y2, Neo-X Y, FISH
Em quirópteros da família Phyllostomidae são encontrados três sistemas sexuais diferentes, simples XX/XY, múltiplo
XX/XY1Y2 e o composto neo-XX/XY. Visando comparar o comportamento dos cromossomos sexuais, analisamos a
meiose de cinco espécies de quirópteros da subfamília Stenodermatinae, por coloração convencional e por hibridização in
situ fluorescente (FISH) com sondas dos cromossomos X e 15 de Phyllostomus hastatus (PHAX, PHA15) e Y de Carollia
brevicauda (CBRY). As espécies Artibeus obscurus e Artibeus jamaicensis apresentam sistemas sexuais do tipo múltiplo
(2n=30/31, XY1Y2) e as espécies Artibeus cinereus, Platirrhinus helleri e Sturnira lilium com sistema composto (2n=30,
neo-XY). A análise da meiose convencional mostra que nas espécies com sistema composto, as células paquitênicas
apresentam um corpo sexual (CS) característico em forma de anel com cauda, diferente do observado nas espécies com
sistema múltiplo onde, muitas vezes, não é detectado o corpo sexual. Nos diplótenos de espécies com sistema múltiplo
XY1Y2, foram visualizadas duas regiões de pareamento no trivalente sexual, a região de pareamento ponta a ponta
(X-Y1- PAR) e outra região de pareamento entre o autossomo translocado para o X e seu homólogo neste sistema
chamado Y2 (X-Y2). Ao compararmos com o sistema composto, observamos a mesma disposição do múltiplo, o qual
mantém o pareamento X-Y1, sendo que, o pareamento dos autossomos translocados já foi finalizado, divergindo dos
bivalentes autossômicos, com pontos de quiasmas ao longo de suas extensões. Após hibridização in situ fluorescente
(FISH), os resultados revelam que o cromossomo X das cinco espécies descritas acima compartilha homeologia com o
X de PHA. O comportamento meiótico do corpo sexual nos sistemas múltiplo e composto é bem diferente em relação
ao sistema simples (XY) no qual, dados da literatura revelam a ocorrência da inativação do cromossomo sexual meiótico
(ISCM), detectável por uma heteropicnose acentuada. Além do cromossomo X, as espécies A. obscurus e A. jamaicensis,
compartilham homeologia com o Y de C. brevicauda. Em A. obscurus o comportamento do CS no paquíteno confirma
o visualizado em células diplotênicas, com pareamento de Y1 e Y2 nas duas extremidades do X. Em A. cinereus, o CS
representa o eixo de X original (anel), o eixo de Y original ligado ao X e o bivalente autossômico ligado aos sexuais
originais, contudo com um comportamento independente, bem distendido, semelhante aos bivalentes autossômicos.
Assim, o cromossomo 15 de PHA rearranjado em Xq de A. obscurus e A. cinereus representa uma sinapomorfia que
provavelmente mantém-se conservada em todas as espécies da subfamília Stenodermatinae.
Apoio Financeiro: CNPq, CAPES, UFPA.
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Implicações da filogeografia para
a conservação do macaco-prego (Cebus)
na Mata Atlântica
Oliveira, CG; Gaiotto, FA; Martinez, RA
Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular, Universidade Estadual de Santa Cruz-UESC
[email protected]
Palavras-chave: Cebus, filogeografia, conservação, microssatélites, extinção
A preservação de áreas que incorporam o maior número de espécies ameaçadas de extinção tem sido uma das estratégias
mais comuns para conservação de organismos. Essa abordagem é pouco eficiente significativa em termos de evolução
dos seres vivos, pois não leva em consideração a história biogeográfica das espécies e suas populações, sendo considerado
enfoque incompleto e sua validade se limita em curto prazo de tempo. Assim, os estudos de filogeografia possibilitam
o entendimento da evolução das diferentes linhagens e sua relação com os eventos históricos determinantes de sua
diversificação, fornecendo importantes informações para orientar programas visando a sua conservação. Este trabalho
teve como objetivo a análise preliminar da filogeografia do Gênero Cebus na Mata Atlântica. As análises foram realizadas
a partir da genotipagem de 67 indivíduos coletados em toda extensão de distribuição das espécies, com seis locos
microssatélites, A estrutura populacional foi verificada através da GST de Nei (1978) com auxilio do programa Genetix
V. 4.02. O GST entre as espécies C. xanthosternos e C. libidinosus foi 0.0652. Já entre as espécies C. xanthosternos e C.
apella, GST = 0.0689, C. xanthosternos e C. nigritus foi GST = 0.1221 e C. xanthosternos e C. robustus GST = 0.1044. Os
valores obtidos do GST corroboraram a análise de barreiras, pois mostraram que as espécies que estão distribuídas mais
próximas geograficamente (C. apella e C. libidinosus) apresentam diversidade genética menor quando comparadas às
espécies mais distantes fisicamente (C. nigritus e C. robustus). Algumas evidências geológicas indicam que a formação
de refúgios durante o Pleistoceno pode ser uma possível explicação para a maior diversidade genética entre algumas
espécies. O que indica que num tempo passado essas populações eram contínuas e existia fluxo gênico entre elas.
Apoio financeiro: Fapesb, Margot Mash e CEPF.
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Caracterização de haplótipos específicos
de macaco-prego-do-peito-amarelo,
Cebus xanthosternos Wied-Neuwied, 1826
(Platyrrhini:Cebidae) via
marcadores moleculares
Nink, RA; Oliveira, CG; Gaiotto, FA; Martinez, RA
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Santa Cruz
[email protected]
Palavras-chave: Cebus xanthosternos, mtDNA, D-loop, haplótipos específicos, marcadores moleculares
Cebus xanthosternos é um primata platirrino endêmico da Mata Atlântica que se encontra criticamente ameaçado de
extinção (Rylands et al., 2005). Pertence a um gênero com alta plasticidade fenotípica, tornando a sua classificação confusa
e difícil (Silva Jr., 2001). A utilização da informação genética é muito requisitada para espécies ameaçadas e que apresentam
grande variação fenotípica, como é típico em Cebus. A análise do mtDNA têm sido bastante utilizada em estudos voltados
à biologia da conservação, pois o genoma mitocondrial não sofre recombinação, tem herança exclusivamente materna e
é altamente susceptível a mutações (Ballard & Kreitman, 1994). A região do mtDNA conhecida como D-loop é alvo de
vários estudos evolutivos e filogeográficos por ser a mais variável do genoma mitocondrial, sendo flanqueada por dois genes
altamente conservados (tRNAphe e tRNApro), podendo ser amplificada com a utilização de primers universais (Avise,
1994; Kocher et al., 1989). A caracterizaçãode haplótipos específicos de C. xanthosternos pode ajudar na identificação de
indivíduos com fenótipo confuso, bem como esclarecer os padrões de variabilidade genética dentro de populações naturais,
habitantes de áreas isoladas de vegetação e com poucas possibilidades de fluxo gênico na atualidade. Utilizando-se uma
variação do protocolo CTAB (Oliveira et al., 2007) e o método fenol-clorofórmio (Sambrook et al., 1989), extraiu-se
DNA a partir de amostras de bulbos pilosos e/ou sangue de 30 exemplares, dos quais 20 foram positivamente identificados
como C. xanthosternos pela análise de caracteres morfológicos e devido ao conhecimento exato da sua origem geográfica; e
10 foram classificados como potenciais “híbridos”. Dessas amostras, amplificou-se a região D-loop utilizando os primers
universais L15996 (5’-CTCCACCATTAGCACCCAAAGC-3’) e H00651 (5’-ATCTTAACATCTTCAGTG -3’).
Posteriormente, fez-se uma PCR aninhada com os primers L16209 (5’-CCCCATGCTTACAAGCAAGT-3’) e HD2 (5’CCTGAAAAAAGAACCAGATG-3’) amplificando-se uma região de aproximadamente 420 pares de bases. Selecionou-se,
então, amostras de DNA de 6 exemplares (3 C. xanthosternos e 3 “híbridos”) para sequenciamento. As seqüências obtidas
foram alinhadas com a ferramenta ClustalW (Thompson et. al, 1994) e analisadas com o programa MEGA 3.1 (Kumar et
al., 2004), evidenciando a existência de 4 haplótipos bastante diversos dentro de cada grupo. Foram encontrados 48 sítios
polimórficos, sendo 14 de transversões e 12 de transições. Denotou-se a presença de dois grandes blocos de seqüências
conservadas e três palíndromos ATGTA, que fazem parte do elemento regulatório TAS (Saccone et al., 1991). Dois
haplótipos específicos foram caracterizados para C. xanthosternos. Contudo, é preciso aprofundar as análises de seqüências
do mtDNA para estabelecer a sua utilidade para os planos de manejo e conservação.
Apoio: CEPF, Margot Marsh e CNPq.
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Análise do éxon 1 do gene do fotopigmento
opsina S (Short-Wavelength Sensitive) em
macaco-prego Cebus apella
Corso, J1; Buchmann, D2; Bartholomei-Santos, ML2
Curso de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Santa Maria
Programa de Pós-graduação em Biodiversidade Animal, Universidade Federal de Santa Maria
[email protected]
1
2
Palavras-chave: opsina S, primatas
Em primatas, o fotopigmento S é codificado por um gene autossômico, enquanto o fotopigmento L é codificado pelo
cromossomo X. Nos primatas antropóides do Velho Mundo (Catarrhines) a visão tricromática foi adquirida a partir da
duplicação do gene do fotopigmento L no cromossomo X, resultando em um pigmento adicional M. Entretanto, na
maioria dos primatas do Novo Mundo (Platyrrhines), incluindo o macaco-prego, há um único gene codificador para
fotopigmento no cromossomo X, mas este gene é polimórfico e codifica diferentes fotopigmentos M e L, de forma
que fêmeas heterozigotas são tricromáticas e fêmeas homozigotas e machos são dicromáticos. A opsina S está associada
à absorção de comprimento de onda para a faixa azul à ultravioleta. Para a funcionalidade do fotopigmento, diversos
sítios-chave de interação entre aminoácidos devem estar conservados. O objetivo deste trabalho foi isolar e seqüenciar
o éxon 1 do gene da opsina S em macaco-prego Cebus apella e compará-lo com as seqüências ortólogas depositadas no
GenBank para outros primatas (Cebus olivaceus, Saimiri boliviensis, Alouatta palliata e Homo sapiens), a fim de verificar
o nível de conservação da seqüência, as freqüências de substituições sinônimas (Ks) e não sinônimas (Ka), bem como a
conservação de sítios-chave dentro desse éxon. O éxon 1 foi amplificado por PCR, a partir de amostras de DNA de três
indíviduos diferentes, utilizando-se um par de primers degenerados. Produtos de PCR de três reações distintas, para cada
indivíduo, foram seqüenciados. Não foi encontrado polimorfismo no éxon 1 do gene da opsina S entre os indivíduos
analisados. A seqüência de DNA obtida, assim como a seqüência inferida de aminoácidos da proteína, foi alinhada com
seqüências de Cebus olivaceus, Saimiri boliviensis, Alouatta palliata e Homo sapiens. As seqüências de nucleotídeos e de
aminoácidos codificada em C. apella foram idênticas à de C. olivaceus (Ka = 0, Ks = 0), mas apresentaram diferenças
em relação às seqüências de S. boliviensis (Ka = 0,0415, Ks = 0,0658), A. palliata (Ka = 0,0175, Ks = 0,0320) e H.
sapiens (Ka = 0,0565, Ks =0,1501). Em todos os casos, as substituições sinônimas foram em maior número que as não
sinônimas. A diversidade nucleotídica entre as seqüências foi 0,08429. Todos os sítios críticos de aminoácidos no éxon
1 apresentaram-se conservados em C. apella, quando comparados às outras espécies, indicando que, pelo menos em
relação à porção da proteína codificada por esse éxon, a opsina S é funcional no macaco-prego.
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Análise filogenética do gênero Cebus
(Platyrrhini:Cebidae) baseada em
seqüências do gene citocromo B
Queiroz, MG; Ferreira, WAS; Borges, BN; Harada, ML
Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências Biológicas, Laboratório de Biologia Molecular, Belém, Pará
[email protected]
Palavras-chave: Cebus, Citocromo B, Platyrrhini, Filogenia, Subgêneros
O gênero Cebus (Platyrrhini:Cebidae) é um dos primatas do Novo Mundo mais generalista quanto à exploração de hábitats
e recursos alimentares. Essa flexibilidade lhe confere uma ampla distribuição geográfica, ocorrendo em praticamente
toda a América do Sul e parte da América Central. Poucos estudos têm sido realizados no sentido de avaliar a sistemática
deste grupo de primata. A classificação mais utilizada divide o gênero em dois grupos, de acordo com a presença ou
ausência de tufos. Recentemente, foi proposta a elevação destes dois grupos ao nível de subgênero. O presente estudo visa
contribuir para o esclarecimento das relações filogenéticas das espécies que compõem este gênero a partir de espécimes
coletados em diferentes localidades e que fazem parte do banco de amostras do Laboratório de Biologia Molecular da
Universidade Federal do Pará. O DNA foi extraído de tecido muscular pelo método do fenol-clorofórmio e o gene
mitocondrial citocromo b foi amplificado via PCR para posterior seqüenciamento. A análise filogenética foi feita pelo
método de agrupamento de vizinhos, com bootstrap de 1.000 réplicas. No arranjo filogenético obtido com base em
seqüências parciais, há uma clara divisão dos espécimes em dois grupos. O primeiro agrupamento, apoiado com 98% de
bootstrap reune as espécies C. capucinus, C. albifrons, C. olivaceus e C. kaapori, todas “sem tufo”. O segundo grupo, com
apoio de 69% de bootstrap, engloba as espécies “com tufo”C. apella, C. nigritus, C. xanthosternus, e C. macrocephalus,
Os valores de divergência variam de 0% a 6%, com média de 3%, para o primeiro grupo, e de 5% a 24%, com média
de 9%, no segundo; a divergência entre os grupos varia de 9 a 12%. Estes dados apóiam a divisão do gênero em dois
subgêneros, como proposto por análises baseadas em características morfológicas, citogenéticas e moleculares da literatura:
Cebus Cebus, que inclui as espécies “sem tufo” e Cebus Sapajus, que engloba as espécies “com tufo”. Vale ressaltar que
o grupo Sapajus, constituído por espécies anteriormente consideradas subespécies de C. apella, representa um grupo
bastante heterogêneo, o que pode observado pelo valor de bootstrap e valores de divergência, sendo necessário ampliar
o número de representantes do subgênero de diferentes localidades para confirmar esses resultados.
Orgão financiador: UFPA.
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Expressão tecidual dos antígenos de grupos
sanguíneos ABH em espécies da Família
Cebidae provenientes do Centro Nacional
de Primatas (Belém-PA)
Aguiar DCF1; Pereira, WLA2; Matos, GCB1; Loiola, RSP3; Corvelo, TCO1
Universidade Federal do Pará
Universidade Federal Rural da Amazônia
3
Laboratório Central do Estado do Pará
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Grupo Sanguíneo ABH, Primatas do Novo Mundo, Imunohistoquímica
Os antígenos de grupos sanguíneos ABO foram descritos por Landsteiner (1900) inicialmente sobre a superfície dos
eritrócitos humanos. Porém, estes antígenos estão amplamente distribuídos nos tecidos do corpo. Evolutivamente, estas
moléculas são expressas apenas pelas hemácias humanas e de alguns primatas antropóides. Em primatas do Velho e
Novo mundo, a expressão está restrita às secreções e tecidos. O sistema ABO é gerado pela ação dos loci gênicos ABO,
H e Secretor, produzindo diversos oligossacarídeos através de uma biossíntese complexa. Esta via ocorre de maneira
diferenciada nas hemácias e em células de outros tecidos. Particularmente, em primatas do Novo Mundo, existem poucos
estudos descrevendo a expressão tecidual destes antígenos. Assim, a caracterização tecidual deste sistema nestes animais,
é importante para o entendimento de sua origem e evolução. Órgãos de diferentes origens embriológicas, das espécies
Cebus apella, Saimiri sciureus e Aotus infulatus foram investigados através da técnica de imunohistoquímica quanto à
expressão e distribuição dos antígenos A, B e H. Nas espécies C. apella e S. sciureus houve um padrão polimórfico de
expressão dos antígenos A, B e H. Em A. infulatus, apenas os genes B e H foram expressos. Quanto aos tecidos de origem
endodermal de epitélio estratificado, houve expressão dos antígenos ABH principalmente nas camadas superficiais e
intermediárias, sendo que a expressão do antígeno H mostrou-se heterogênea em alguns indivíduos. Nos tecidos de
origem mesodermal de epitélio simples, como a trompa de falópio, também houve a expressão dos antígenos ABH,
porém na espécie S. sciureus, não foi detectado o antígeno H neste órgão. Neste estudo, apesar da descrição tecidual
destes antígenos ser compatível, na maioria, com o modelo genético indicado para humanos, onde tecidos de origem
mesodermal estão sob controle do gene H e tecidos de origem endodermal serem controlados pelo gene Secretor, foram
verificadas algumas variações de expressão em alguns órgãos destas espécies; provavelmente, refletindo padrões genéticos
diferenciados de controle nestes compartimentos.
Apoio Financeiro: UFPa, Centro Nacional de Primatas.
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Análise por pintura cromossômica
em Callicebus torquatus (Primates Platyrrhini) da Amazônia
Malcher, SM4; Nagamachi, CY1,2; Pieczarka, JC1,2; Pereira, AL4; de Oliveira, EHC1; Rodrigues, LRR3
Lab. de Citogenética, ICB, UFPA
2
Pesquisador do CNPq
3
Laboratório de Genética & Biodiversidade, UFPA-Santarém
4
Bolsista PIBIC-UFPA
[email protected]
1
Palavras-chave: Callicebus, FISH, Citogenética, Primata, Biodiversidade
A Ordem Primata representa o terceiro grupo mais diversificado de mamíferos em número de espécies. Dentro de
Platyrrhini o gênero Callicebus é um dos grupos de primatas neotropicais mais complexos, com grande diversidade
morfológica, ecológica e genética. Estudos citogenéticos neste gênero demonstraram uma extensa variação do número
diplóide entre as espécies, de 2n=16 em C. lugens até 2n=50 em C. donacophilus, C. hoffmannsi e C. pallescens. Sua
distribuição estende-se, de forma descontínua, entre as florestas da região Amazônica e da Mata Atlântica brasileira.
As espécies desse gênero são divididas em cinco grupos, sendo que desses o grupo torquatus destaca-se por apresentar
cariótipos altamente reorganizados por múltiplos eventos de rearranjos cromossômicos, que ainda são pouco conhecidos.
Estudos genéticos de mapeamento genômico comparativo por pintura cromossômica têm sido utilizados com grande
êxito na elucidação dos processos de evolução cromossômica de diversos grupos de mamíferos. Neste gênero a aplicação
desta técnica foi realizada, até o momento, apenas as espécies C. cupreus, C. pallescens, C. donacophilus e C. lugens esta
última sendo a única representante do grupo torquatus. O objetivo do presente trabalho é estudar o cariótipo de C.
torquatus (2n=22) por citogenética clássica (bandeamento G e C) e molecular (Hibridização in situ fluorescente - FISH),
visando mapear o cariótipo com sondas de cromossomos totais de humano. Até o momento foram hibridizadas sondas
de 9 cromossomos: HSA 3, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 e 16. As preparações cromossômicas foram obtidas através de
cultura temporária de linfócitos de uma fêmea mantida no Centro Nacional de Primatas (Ananindeua-PA). Os resultados
mostram que os padrões de bandeamento C e G estão de acordo com os já descritos na literatura. As hibridizações
já revelaram três associações, 3/9, 10/16 e 14/15, sendo que cada uma dessas sondas marcam outros segmentos além
das associações. A sonda HSA 11 também marcou mais de um par cromossômico. Já as sondas HSA 12 e HSA 13
produziram apenas um sinal cada. Na análise comparativa prévia com o mapeamento de C. lugens, verifica-se que C.
torquatus compartilha as associações 3/9 e 14/15, mas apresenta padrão divergente quanto à associação 10/16 e ao
padrão de hibridização do outro segmento do HSA 16 em dois acrocêntricos. Contudo esses resultados preliminares
ainda são insuficientes para realizar uma ampla comparação entre C. torquatus e C. lugens. As hibridizações com as
demais sondas permitirão o mapeamento completo do cariótipo de C. torquatus, assim como uma análise comparativa
em relação ao C. lugens descritos na literatura. Essa análise permitirá uma melhor compreensão dos mecanismos de
rearranjos cromossômicos envolvidos na diferenciação dessas espécies.
Apoio Financeiro: CNPq, CAPES, UFPa.
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Brachyteles hypoxanthus, o maior primata
americano criticamente ameaçado
de extinção: três populações revelam-se
potenciais reservatórios do patrimônio
genético da espécie
Alvarenga, CS1,4; Dias, LG2; Mendes, SL3; Fagundes, V1
Laboratório de Genética Animal, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Espírito Santo
2
Fundação Biodiversitas/PROBIO “Conservação e Manejo do Muriqui em Minas Gerais”
3
Laboratório de Biologia da Conservação de Vertebrados, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Espírito Santo
4
Programa Institucional de Iniciação Científica (PIBIC/CNPq-UFES) e Programa de Pós-graduação em Biologia Animal (PPGBAN-UFES)
[email protected]
1
Palavras-chave: Brachyteles hypoxanthus, DNA mitocondrial, diversidade genética, fluxo gênico, conservação
O gênero Brachyteles (Primates: Atelidae) compreende os maiores primatas não-humanos dos Neotrópicos e está dividido em duas
espécies endêmicas da Mata Atlântica: B. arachnoides (muriqui-do-sul) e B. hypoxanthus (muriqui-do-norte). A espécie B. hypoxanthus
está criticamente em perigo de extinção e menos de 900 indivíduos viventes estão distribuídos em 12 pequenas populações isoladas
pelo desmatamento e redução do habitat. Estudos preliminares indicaram grande estruturação genética com baixa diversidade
intrapopulacional em duas populações (Estação Biológica de Caratinga/EBC-MG, n=64; e Santa Maria do Jetibá/SMJ-ES, n=20),
embora a amostragem de SMJ-ES fosse pequena. Foram objetivos do presente estudo caracterizar geneticamente novas populações
de B. hypoxanthus, aumentar a amostragem da população de SMJ-ES, verificar se há fluxo gênico (número de migrantes por geração,
Nm) entre as populações e contribuir para a elaboração de medidas conservacionistas para a espécie. Utilizamos 66 amostras de fezes
coletadas entre maio/2002 a outubro/2007 em seis das 12 localidades de ocorrência da espécie: Parque Estadual Serra do Brigadeiro/
PESB-MG (n=17), Parque Estadual Rio Doce/PERD-MG (n=23), Reserva do Patrimônio Natural Mata do Sossego/MG (n=11),
SMJ-ES (n=13), Parque Nacional do Caparaó/PNC-ES (n=1) e Parque Estadual de Ibitipoca/MG (n=1). O DNA, depois de extraído
das amostras fecais, foi usado para amplificar e sequenciar a região hipervariável-I da alça D-loop do DNA mitocondrial (460pb). Aos
66 exemplares, somamos as seqüências de 85 indivíduos analisados previamente de EBC-MG (n=64), SMJ-ES (n=20) e PNC-ES
(n=1); e uma seqüência de um exemplar da Fazenda Esmeralda-MG obtida do GenBank (AF213966), totalizando 152 indivíduos de
oito populações. Encontramos 23 haplótipos, sendo 19 exclusivos para populações específicas, conferindo alta diversidade haplotípica
global (h=0,9045+/-0,0113), com poucos sítios polimórficos responsáveis por tal diversidade (dn=0,014314+/-0,007704). As
populações divergem entre si significativamente (0,15426≤FST≤0,60447) e apresentam fluxo gênico de até três migrantes por geração,
sugerindo contato recente entre as populações, apesar de desconectadas atualmente. As populações do PESB-MG, PERD-MG e
SMJ-ES destacaram-se por apresentar (1) alta diversidade genética intrapopulacional (0,7424≤h≤0,8456), responsável por mais de
80% da diversidade genética total encontrada para a espécie; e (2) forte estruturação genética devido ao grande número de haplótipos
exclusivos (cinco para cada população), quando comparadas às outras populações, que mostraram em média 1,6 haplótipos. Nesse
sentido, verificamos que as populações do PESB-MG, PERD-MG e SMJ-ES são os potenciais reservatórios do patrimônio genético
da espécie, podendo ser tratadas como Unidades de Manejo distintas. Esses dados são valiosos para serem utilizados pelo Comitê para
Conservação e Manejo do Muriqui (Brachyteles arachnoides e Brachyteles hypoxanthus), criado pelo IBAMA desde 2002, ao indicar que
essas populações merecem ser reconhecidas como áreas prioritárias para a conservação do muriqui-do-norte.
Apoio Financeiro: FACITEC/ES, FAPES/ES, CEPF/Conservation International/Washington, DC e PROBIO/FNMA-MMA.
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Estudo do cromossomo Y em macacos
brasileiros da família Atelidae (Platyrrhini)
por microdissecção cromossômica
Gifalli-Iughetti, C1; Teixeira, RHF2; Nunes, ALV2; Pessutti, C2; Koiffmann, CP1
Centro de Estudos do Genoma Humano, Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências,
Universidade de São Paulo, São Paulo/SP, Brasil
2
Zoológico Municipal Quinzinho de Barros, Sorocaba/SP, Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: Microdissecção cromossômica, Hibridação in situ fluorescente, Cross-FISH, Atelinae, Cromossomo Y
As relações na família Atelidae, composta pelas subfamílias Atelinae (Ateles, Lagothrix e Brachyteles) e Alouattinae
(Aloautta) não estão claramente estabelecidas. Várias filogenias agrupam estes quatro gêneros de maneiras diferentes.
Uma comparação entre os complementos cromossômicos dos três gêneros que compõem a subfamília Atelinae, Ateles
(2n = 32-34), Lagothrix (2n = 62) e Brachyteles (2n = 62), indica que houve uma redução no número diplóide durante
a evolução de Ateles, com Lagothrix e Brachyteles mantendo os 62 cromossomos. O menor número cromossômico de
Ateles resultou de inúmeros rearranjos cromossômicos complexos. Com a finalidade de identificar o cromossomo Y
no cariótipo de espécies do gênero Atelinae, utilizamos a técnica de microdissecção cromossômica, uma vez que este
cromossomo não é hibridado pela biblioteca humana do Y. Células obtidas de cultura de linfócitos de Brachyteles arachnoides
(2n = 62) foram pingadas sobre lamínula e coradas. A raspagem dos cromossomos foi feita com micro-agulha, com
auxílio do Micromanipulador Transferman NK2 (Eppendorf ) acoplado a um microscópio invertido (Axiovert S100,
Zeiss). Os três cromossomos Y microdissecados foram amplificados por DOP-PCR (“Degenerate OligonucleotidePrimed PCR”), que consiste de 8 ciclos de baixa estringência com “primers” degenerados seguidos por 30 ciclos de alta
estringência. Para a utilização do material amplificado na Hibridação in situ fluorescente (FISH), a marcação foi feita
tanto por PCR (usando o produto da DOP-PCR como molde de DNA) com o mesmo perfil e “primers” dos ciclos
de alta estringência da DOP-PCR com nucleotídeos conjugados a biotina (Biotin 16-dUTP, Roche, USA) quanto por
“nick translation” (DIG-Nick translation mix, Roche, USA). A sonda produzida foi hibridada em metáfases do próprio
Brachyteles arachnoides, para confirmar a eficácia da microdissecção, em metáfases do gênero congenérico, Lagotrhix
lagothricha (2n = 62), e em metáfases do terceiro gênero que forma a subfamília Atelinae, Ateles belzebuth marginatus
(2n = 34). A detecção da marcação foi feita com Avidina-FITC ou Antidigoxigenina-Rodamina. As lâminas foram
analisadas em microscópio Zeiss Motorizado (Axiophot 2) e as metáfases capturadas por vídeo-câmara CCD de alta
resolução com auxílio do programa ISIS (MetaSystems). Visualizamos uma marcação no cromossomo Y das três espécies
e nenhuma homeologia foi identificada nos demais cromossomos, mostrando a exatidão da microdissecção. Sabemos
que poucas sondas produzidas pela microdissecção são capazes de revelar homeologia entre espécies de diferentes taxa.
Mesmo após várias tentativas de hibridação desta sonda do Y em metáfases de espécies da subfamília Aloauttinae, não
obtivemos resultados. O uso de caracteres citogenéticos-moleculares pode proporcionar informações valiosas para a
elucidação das relações filogenéticas na subfamília Atelinae. Os nossos dados mostram que o cromossomo Y nesta
subfamília compartilha uma história comum, devendo mostrar o mesmo padrão filogenético, corroborando a separação
da família Atelidae nas subfamílias Atelinae e Alouattinae.
Apoio Financeiro: FAPESP, CEPID/FAPESP, CNPq.
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Confrontos e concordâncias gerados
pela utilização do DNAmt e STRs na
análise genética de populações de sagüis
introduzidos na área de proteção ambiental
da bacia do rio São João/mico-leãodourado, no estado do Rio DE Janeiro
Andrade, CCF1; Grativol, AD1; Monteiro, LR1; Ruiz-Miranda, CR1; Miyaki, CY2
Laboratório de Ecologia e Recursos Naturais. Universidade Estadual do Norte Fluminense
2
Laboratório de Genética e Evolução Molecular de Aves. Universidade de São Paulo
[email protected]
1
Palavras chaves: DNA mitocondrial, microssatélites, estrutura genética, espécies introduzidas, Saguis
Sagüis (Callithrix spp.) nativos do Nordeste e do Cerrado brasileiros, foram introduzidos na área de proteção ambiental
da Bacia do rio São João/Mico-leão-dourado, Rio de Janeiro. A presença dos sagüis pode prejudicar o sucesso do
esforço que tem sido feito para a conservação do mico leão dourado. O principal objetivo deste trabalho foi conhecer
a estrutura genética das populações de sagüis introduzidos na região para identificar o padrão de colonização e auxiliar
o plano de erradicação dessa espécie não nativa. Foram utilizados oito “primers” polimórficos de microssatélites e o
seqüenciamento do fragmento de DNA correspondente a uma parte das porções central e esquerda da região controladora
do DNA mitocondrial. Informações sobre a estrutura genética das populações foram geradas a partir de uma matriz
de distância genética (valores de Fst) gerada pelo programa Arlequin, e de uma análise de agrupamentos baseada em
modelos (model-based clustering) gerada pelo programa Structure. Os valores de Fst obtidos para as populações de Rio
Vermelho e Imabú através do DNAmt foi de 0.47 e, através do DNA microssatélites foi de 0,1084. Este fato pode ser
explicado através de duas hipóteses: essa diferença possivelmente reflete a situação das populações de onde esses animais
foram trazidos, juntamente com o padrão de introdução destes nos fragmentos analisados; ou reflete uma ausência de
migração das fêmeas no local estudado. Portanto, é importante a realização da análise do cromossomo Y para elucidar a
diferença entre os valores de Fst gerados pelo DNAmt e pelo DNA microssatélites. Apesar desta diferença, ficou claro,
através da análise de agrupamentos, que o melhor cenário para representar a estrutura das populações estudadas é o de
quatro populações genéticas (Rio Vermelho e Vendaval como uma única população; Imbaú, Vale do Cedro e Igarapé
como populações distintas). Também foi possível observar, através das duas metodologias, que a introdução dos sagüis
na região estudada ocorreu por meio de várias introduções independentes. A implantação de um corredor florestal na
região estudada é uma situação preocupante, pois pode facilitar a dispersão dos sagüis e trazer maiores complicações
para conservação do mico leão dourado, além de dificultar a elaboração do plano de manejo para os sagüis.
Apoio Financeiro: UENF, FAPERJ, Associação Mico Leão Dourado (AMLD), Lion Tamarin of Brazil Fund, Frankfurt
Zoological Society, FNMA-MMA.
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Investigando a validade dos gêneros
Sphiggurus e Coendou (Rodentia:
Hystricognathi) através de dados moleculares
Bernabé, CS1, 2; Fagundes, V1
Laboratório de Genética Animal, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Espírito Santo
2
Programa Institucional de Iniciação Científica (PIBIC CNPq-UFES)
[email protected]
1
Palavras-chave: Sphiggurus, Coendou, DNA mitocondrial, filogenia, diversidade genética
A família Erethizontidae (Rodentia: Hystricognathi) é conhecida como os porcos-espinhos do Novo Mundo, encontra-se
distribuída nas Américas, e é formada por 15 espécies agrupadas em cinco gêneros. Sphiggurus e Coendou são dois desses
gêneros que ocorrem nas florestas neotropicais, cujo status genérico é motivo de controvérsia na literatura. Quando
estudos citogenéticos e moleculares do DNA mitocondrial são analisados, sugerem que Sphiggurus e Coendou sejam
tratados como gêneros plenos. Por outro lado, esses táxons são tratados como sinonímias quando submetidos a estudos
de morfologia de crânio e pêlo. Nesse sentido, o presente estudo visou verificar se Sphiggurus mantém a estruturação
em um clado monofilético distinto de Coendou; e ainda qual o nível de diversidade genética intrapopulacional de S.
villosus do Parque Estadual Paulo César Vinha (PEPCV-ES). Para tanto, foram analisados 800pb do gene mitocondrial
citocromo b (citb) de 22 exemplares de S. villosus de quatro localidades do Espírito Santo: PEPCV, Setiba (n=18);
Reserva Biológica de Duas Bocas, Cariacica (n=2); Estação Ecológica de Santa Lúcia, Santa Teresa (n=1) e um fragmento
de Mata Atlântica ao redor do Convento da Penha, Vila Velha (n=1). Seqüências de S. villosus (Rio de Janeiro), S.
melanura (Roraima), C. prehensilis (Mato Grosso) e C. bicolor (Acre) disponíveis no Genbank foram adicionadas em
nossas análises. O DNA das amostras foi extraído, o gene citb foi amplificado com os primers MVZ05/MVZ16, e as
seqüências alinhadas pelo programa CLUSTAL_X e confirmadas a olho no programa MEGA4. As árvores de Máxima
Parcimônia (MP) e Neighbor Joining (NJ) foram criadas pelo programa MEGA4 com os valores de bootstrap estimados
em 1000 replicações. Na análise de máxima verossimilhança (MV) a árvore foi construída utilizando o PhyML com
o modelo evolutivo Kimura 2-parâmetros e os valores de bootstrap estimados em 500 replicações. A distância genética
entre os táxons foi estimada com o método Kimura 2-parâmetros com taxa de 1:1 de transição para transversão pelo
programa MEGA4. As análises dos parâmetrros genéticos intrapopulacionais foram feitas para a população de PEPCVES, usando o programa ARLEQUIN v3.11. As análises filogenéticas revelaram dois clados reciprocamente monofiléticos,
respectivos a Sphiggurus e Coendou, com suporte superior a 76% nas análises de MP, MV e NJ. Considerando os
haplótipos já descritos para as duas espécimes do Rio de Janeiro, somamos 15 haplótipos distintos para S. villosus, dos
quais dez (67%) são exclusivos de Setiba-ES. No PEPCV-Setiba-ES, os 12 haplótipos variaram de freqüência de 6 a 17%,
observou-se alta diversidade haplotípica (h=1,0000±0,0185) e baixa diversidade nucleotídica (dn=0,012476±0,00694).
Nossos dados confirmam a distinção de Sphiggurus e Coendou, como previamente proposto por dados moleculares.
Ainda, verificamos que a população do PEPCV-ES apresentou grande diversidade genética, sendo considerada uma
importante área para a preservação do patrimônio genético de Sphiggurus.
Apoio financeiro: FACITEC/ES, FAPES/ES, CEPF/CONSERVATION INTERNATIONAL, CNPq e UFES.
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Um cariótipo novo para Blarinomys breviceps
(Winge, 1887): um caso de erro de
identificação ou uma nova espécie no gênero?
Fagundes, V1; Costa, LP2
Laboratório de Genética Animal
Laboratório de Mastozoologia e Biogeografia, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Espírito Santo
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Blarinomys, cariótipo, nova espécie, Rodentia, Muridae
Blarinomys Thomas, 1896 é um gênero de roedor pertencente à subfamília Sigmodontinae, família Cricetidae, tribo
Akodontini. É monotípico e B. breviceps (Winge, 1887) é seu representante único. Essa espécie tem como distribuição
o leste do Brasil, da Bahia a São Paulo e Nordeste da Argentina, com localidade tipo em Lagoa Santa, Minas Gerais.
Dentre os Akodontini, é uma das poucas espécies pouco conhecidas devido ao registro raro em coleções científicas. Dados
morfológicos e ecológicos são pouco conhecidos e essa espécie é indicada com extinta em sua localidade tipo, ocorrendo
somente em regiões de Cerrado e na zona mais mésica da Mata Atlântica. No presente estudo, descrevemos o cariótipo
de um exemplar macho dessa espécie, coletado na Reserva Biológica de Duas Bocas, em Cariacica, Espírito Santo. Os
cromossomos foram obtidos de preparação direta de medula óssea, após injeção de colchicina 0,1% in vivo; e corados
pela técnica de bandamento GTG e coloração das regiões organizadoras dos nucléolos pela prata (Ag-RONs). O cariótipo
apresentou 2n=45, NF=51, com 4 pares de meta/submetacêntricos grandes (pares 1 a 4), 16 pares de acrocêntricos
médios com variação gradativa de tamanho (pares 6 a 22) e um arranjo heteromórfico formado por um cromossomo
acrocêntrico médio (cromossomo 5), um acrocêntrico pequeno (cromossomo 23) e um acrocêntrico grande, distinto
de todos os demais do cariótipo. O padrão de banda GTG permite sugerir que o cromossomo acrocêntrico grande é
resultante de uma fusão em tandem de um homólogo do par 5 com um homólogo do par 23 (5+23). O cromossomo
X é um acrocêntrico médio e o Y um acrocêntrico pequeno. As Ag-RONs se localizaram nos telômeros proximais
de dois pares acrocêntricos, um médio e um pequeno. Dados do cariótipo de um exemplar de B. breviceps do Rio de
Janeiro, corado somente em coloração comum, já foi relato na literatura com 2n=28, NF=48, 11 pares metacêntricos,
dois pares acrocêntricos, X metacêntrico médio e Y acrocêntrico médio. Estudos adicionais com hibridação in situ
fluorescente (FISH) com sonda telomérica permitirão verificar se há resquícios teloméricos intersticiais decorrentes do
evento da fusão em tandem. A diferença cariotípica entre os dois exemplares relatados é muito grande, e provavelmente
esses exemplares não pertencem a uma mesma espécie.
Financiadores: FAPES/ES, FACITEC/ES, CNPq/Programa Taxonomia.
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Estudo da variabilidade genética de quinze
populações de Oligoryzomys nigripes Olfers,
1818 (Rodentia, Cricetidae)
Coutinho, LC1,2; Fagundes, V1
Laboratório de Genética Animal, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Espírito Santo, Vitória, ES
2
Programa Institucional de Iniciação Científica (PIBIC/CNPq-UFES)
[email protected]
1
Palavras-chave: Rodentia, Cricetidae, Oligoryzomys nigripes, DNA mitocondrial, D-loop
Oligoryzomys nigripes Olfers, 1818 (Rodentia, Cricetidae) pertence à tribo Oryzomyini, apresenta ampla distribuição
geográfica, ocupando o sul, sudeste, centro-oeste e nordeste do Brasil, sob o domínio da Mata Atlântica e Cerrado.
Um estudo recente analisou o cariótipo de 41 exemplares de sete populações e revelou grande diversidade de cariótipos
com 30 formas distintas, cuja distribuição não é aleatória, e sugeriu que O. nigripes apresenta um dos maiores índices
de polimorfismos cromossômicos dentre os roedores do novo mundo. Diante do alto polimorfismo cariotípico, o
presente estudo visou mapear geograficamente a diversidade molecular de O. nigripes, utilizando a seqüência de 1130
pb de DNA mitocondrial: 842 pb da região controladora, 66 pb do RNA transportador da Tirosina, 66 pb do RNA
transportador da Prolina e 156 pb do gene citocromo b. Foram calculados número, freqüência de haplótipos e diversidade
haplotípica total. Análises intrapopulacionais (diversidade nucleotídica, haplotípica e número médio de diferenças para-par) e interpopulacionais (análise de variância molecular e Φst) foram realizadas. Também foi construída uma rede
de haplótipos para evidenciar os passos mutacionais que caracterizam a transição entre os haplótipos. Analisamos 91
exemplares de quinze populações: Bahia (Una, n=10), Espírito Santo (Cariacica, n=3; Caparaó, n=10; Santa Teresa, n=14),
Rio de Janeiro (Teresópolis, n=6), Minas Gerais (Caxambu, n=5; Simão Pereira, n=3), São Paulo (Pilar do Sul, n=4;
Piedade, n=4; Sete Barras, n=6), Paraná (Venceslau-Brás, n=3; Pinhalão, n=4; Ortigueira, n=5) e Rio Grande do Sul
(Maquiné, n=10; Esmeralda, n=4). Foram obtidos 76 haplótipos, revelando alta diversidade haplotípica (h=0,9946),
sendo que 31,5% estão distribuídos no Espírito Santo; 17% no Rio Grande do Sul; 15,5% no Paraná; 13% em São
Paulo; 9,0 % na Bahia; 7,8% em Minas Gerais e 6,5% no Rio de Janeiro. Dos 1130 pb, 241 sítios foram variáveis
e utilizados para análise. A diversidade nucleotídica (dn) foi baixa, o que indica que poucos sítios variaram entre os
haplótipos, variando desde dn=0,003355 (Una, BA) a dn=0,063953 (Ortigueira, PR). A média de diferenças par-apar foi alta, variando de π=3,757772 (Una, BA) a π=72,138769 (Ortigueira, PR). Duas populações revelaram alta
divergência genética (Φst) quando comparadas com as demais: Una, BA (0,71494≤Φst≤0,97418) e Esmeralda, RS
(0,66290≤Φst≤0,97418), o que foi corroborado pela rede de haplótipos que as posicionou bastante divergentes das 13
outras populações. As únicas populações que possuem haplótipos compartilhados entre si foram Santa Teresa (ES) e
Cariacica (ES); todas as demais apresentaram apenas haplótipos exclusivos. Nossos dados indicam uma alta diversidade
genética no Espírito Santo, São Paulo, Paraná e Rio Grande do Sul, sugerindo que essas regiões são importantes centros
de diversificação genética de O. nigripes, revelando-se com grande importância para a conservação da biodiversidade
da Mata Atlântica.
Apoio financeiro: FACITEC/ES, FAPES/ES, CEPF/Conservation International e CNPq/PIBIC.
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Primeira descrição do cariótipo de Oecomys
paricola (Thomas, 1904) (Rodentia: Cricetidae)
Rosa, CC3; Amaral, PJS4; Rossi, RV5; Pieczarka, JC1,2; Nagamachi, CY1,2
Lab. de Citogenética, ICB, UFPA
2
Pesquisador do CNPq
3
Bolsista PIBIC-CNPq
4
Bolsista FAPESPA de doutorado em Genética e Biologia Molecular
5
Museu Paraense Emilio Goeldi
[email protected]
1
Palavras-chave: Citogenética, Oecomys, Rodentia, Cariótipo
A família Cricetidae apresenta 112 gêneros e cerca de 580 espécies, sendo a segunda maior família entre os mamíferos.
O gênero Oecomys pertence à subfamília Sigmodontinae, uma das cinco incluídas nessa família. De acordo com a
literatura, o gênero Oecomys apresenta uma grande diversidade cariotípica, com o número diplóide variando entre
60 e 86, sugerindo um alto grau de rearranjo cromossômico. A fim de conhecer e compreender essa grande diversidade
cariotípica, além de identificar os possíveis mecanismos cromossômicos envolvidos na diversificação dos cariótipos, foram
estudados citogeneticamente dois exemplares machos de Oecomys, coletados no Parque Ambiental de Belém, Belém,
PA. Após processados, os espécimes foram depositados na coleção de mamíferos do Museu Paraense Emílio Goeldi.
Ambos os exemplares foram identificados como Oecomys paricola, sendo esta uma das onze espécies encontradas no
Brasil. Estudos citogenéticos nesta espécie estão sendo realizados pela primeira vez. Preparações cromossômicas mitóticas
foram obtidas a partir da técnica de extração direta de medula óssea e foram empregadas as técnicas de coloração
convencional (bandeamentos G e C) para verificar possiveis diferenças cromossômicas. Os resultados mostram que
os dois espécimes apresentam cariótipos diferentes, com 2n=68/NF=72 e 2n=70/NF=76. No espécime com 2n=68
foram encontrados trinta pares de cromossomos acrocêntricos e três pares de cromossomos de dois braços (M/SM). No
espécime com 2n=70 foram encontrados trinta pares de cromossomos acrocêntricos e quatro pares de cromossomos de
dois braços. Nos dois citótipos o cromossomo X possui dois braços de tamanho médio e o cromossomo Y constitui um
submetacêntrico pequeno. A heterocromatina constitutiva ocorre em pequena quantidade nas regiões centroméricas
de todos os cromossomos, sendo que o espécime com 2n=68 apresentou um par de cromossomos com marcação
pericentromérica mais evidente. A diferença no 2n e na morfologia cromossômica entre os dois cariótipos pode ser
explicada por um rearranjo do tipo fissão ou fusão, seguido de possíveis inversões pericêntricas. Estudos citogenéticos
em maior número de exemplares são necessários para tentar esclarecer se estes citótipos constituem um polimorfismo
ou são indícios de espécies crípticas.
Apoio Financeiro: CNPq, CAPES, UFPA, MPEG.
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Diferenças cromossômicas entre dois
espécimes de Hylaeamys megacephalus
(Cricetidae, Sigmodontinae) da região
centro-oeste do Brasil
Melo, DRM3; Amaral, PJS4; Rossi, RV5; Oliveira, ACM6; Rissino, JD1; Pieczarka, JC1,2; Nagamachi, CY1,2
Lab. de Citogenética, ICB, UFPA
2
Pesquisador do CNPq
3
Bolsista PIBIC-CNPq
4
Bolsista FAPESPA de doutorado em Genética e Biologia Molecular
5
Museu Paraense Emilio Goeldi; 6Lab. Zoologia de Vertebrados, ICB, UFPA
1
Palavras-chave: Hylaeamys, Cricetidae, Citogenética, FISH, citótipos
Os roedores do gênero Oryzomys (Cricetidae, Sigmodontinae) representam um táxon complexo e primitivo, amplamente
distribuído pela região Neotropical. Ao longo do tempo, diferentes autores agruparam o gênero em distintos arranjos sistemáticos.
Oryzomys representa aproximadamente 40% das espécies descritas para a tribo Oryzomyini, porém a falta de acordo entre os
taxonomistas tem gerado grandes controvérsias sobre a composição especifica do gênero, variando de 36 a mais de 100 espécies.
Oryzomys é considerado um gênero polifilético do ponto de vista citogenético. Os estudos já realizados mostram uma grande
variabilidade cromossômica, com 2n e NF variando de 34 a 80, e 50 a 112, respectivamente, indicando uma elevada taxa
de evolução cromossômica. Foram detectadas mais de 40 variantes cariotípicas entre as 25 espécies já cariotipadas, revelando
que o número total de táxons morfológicos de Oryzomys está subestimado. Estudos prévios mostram que a analise cariológica
pode ser uma ferramenta muito útil na elucidação da real diversidade deste grupo. O gênero Hylaeamys corresponde a um
dos 10 novos gêneros propostos para grupos de espécies dentro de Oryzomys, visando produzir uma classificação condizente
com o parafiletismo deste último gênero. Hylaeamys corresponde ao “grupo megacephalus”, sendo constituído por sete espécies
distribuídas na Venezuela, Trinidad, Guianas, Paraguai e no Brasil, através da floresta tropical amazônica, mata atlântica
e cerrado. Neste trabalho foram estudados, por citogenética clássica (Convencional, Bandeamentos –G, -C) e molecular
(FISH telomérico), os cariótipos de um casal de H. megacephalus coletados na Fazenda Tanguro (12º 54’ S e 52º 22’ W)
aproximadamente 35 km ao Sul do município de Querência (12º 35’ 49” S e 52º 11’ 59” W), Mato Grosso. Estes espécimes
estão depositados na coleção de mamíferos do Museu Paraense Emílio Goeldi. As preparações cromossômicas foram obtidas
da medula do fêmur e de cultura de fibroblastos de biopsia de tecido. Os resultados mostram diferença no 2n: a fêmea possui
2n=54, NF=62, com cinco pequenos pares de cromossomos de dois braços, 21 pares de acrocêntricos, e cromossomo X
acrocêntrico de tamanho médio. O macho possui 2n=52, NF 62, diferindo por apresentar um par metacêntrico pequeno a mais
e dois pares acrocêntricos a menos. O cromossomo X é semelhante ao da fêmea e o Y é acrocêntrico pequeno. O bandeamento
G permitiu a identificação de todos os pares cromossômicos, tendo sido observado heteromorfismo de tamanho em alguns
pares. A diferença no 2n, considerando-se a proporção de cromossomos de dois braços e de acrocêntricos no cariótipo dos
espécimes analisados, provavelmente é conseqüência de um rearranjo do tipo fusão/fissão cêntrica. O Bandeamento C mostra
que a heterocromatina constitutiva ocorre em pequena quantidade nas regiões centroméricas dos cromossomos. A FISH com
sonda telomérica não mostrou marcação intersticial (ITS), apenas nas regiões distais dos cromossomos.
Apoio Financeiro: CNPq, CNPq-PPG7, UFPa, MPEG.
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Cariótipo de Oryzomys subflavus
e Necromys lasiurus (Rodentia:
Sigmodontinae) do nordeste brasileiro
Silva, SJ1, Sousa, MAN2
Curso de Ciências Biológicas, Centro de Ciências Biológicas e Sociais Aplicadas, Universidade Estadual da Paraíba
2
Centro de Ciências Biológicas e Sociais Aplicadas, Universidade Estadual da Paraíba
1
Bolsista PIBIC/CNPq/UEPB
[email protected]
1
Palavras-chave: Cromossomos, Rodentia, Nordeste, Oryzomys subflavus, Necromys lasiurus
Sigmodontinae é a segunda maior família de roedores murídeos, com 377 espécies e 74 gêneros divididos em 8 tribos.
Este grupo apresenta alta variabilidade citogenética tanto inter como intraespecífica e, em vários casos, alta freqüência
de polimorfismos cromossômicos. Grande parte da informação citogenética, obtida ao longo de anos de estudos,
encontra-se armazenada no Banco de Células e Tecidos do Laboratório de Citogenética do Departamento de Sistemática
e Ecologia - DSE da Universidade Federal da Paraíba – UFPB, na forma de 2942 lâminas preparadas. O resgate destas
informações pode contribuir para o aumento da informação sobre a biodiversidade brasileira, incluindo a região Nordeste.
Foram analisadas lâminas preparadas de duas espécies da subfamília Sigmodontinae, do Nordeste brasileiro, do banco
de células do DSE. O número modal foi estabelecido examinando-se 20 metáfases de cada exemplar. As metáfases mais
elucidativas foram fotografadas em fotomicroscópio digital Olympus. As imagens foram ampliadas em papel fotográfico
em laboratório comercial para montagem dos cariótipos levando-se em consideração o número diplóide (2n) e o número
de braços autossômicos (NA). Um macho da espécie Oryzomys subflavus de Macarapana, PB apresentou 2n=50 e NA=58,
com 2 pares de cromossomos metacêntricos médios, 3 pares de cromossomos submetacêntricos grandes e 19 pares de
cromossomos acrocêntricos em ordem decrescente de tamanho. O X é o maior acrocêntrico e o Y um acrocêntrico
pequeno. Dois machos de Necromys lasiurus, um de Salgado de São Félix, PB e outro de Mamanguape, PB e uma fêmea
de Macaparana, PE mostraram 2n=34 e NA=34; com 15 pares de acrocêntricos em ordem descrescente de tamanho
(1-15) e um par metacêntrico pequeno (16). Entretanto, o exemplar de Mamanguape apresentou uma metáfase com
2n=34 e NA=35 devido a presença de um cromossomo ímpar metacêntrico de tamanho grande. O. subflavus na região
de PE e PB apresenta variação de 2n=46, 48,49 e 50 e NA=56 e no Espírito Santo 2n=54 e NA=64. N. lasiurus apresenta
2n=34 e NA=34 nos estados de Bahia, Goiás, Pernambuco, Piauí e Tocantis. Observa-se que a subfamília Sigmodontinae
possui uma alta variabilidade específica e há uma notável diversidade citogenética que pode levar à especiação. Nesse
trabalho, de acordo com a literatura, o 2n não variou em nenhum espécime. Entretanto, observamos variação no NA
em O. subflavus em relação a literatura e destacamos que as informações apresentadas neste trabalho ainda não foram
descritas para as localidades apresentadas.
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“Análise populacional de Oligoryzomys
nigripes (Rodentia: Sigmodontinae)
para avaliação de seu papel como
reservatório de Hantavírus”
Agrellos, R1; D’Andrea, PS1; Bonvicino, CR1,2
Depto. de Medicina Tropical, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ
2
Divisão de Genética, INCA
[email protected]
1
Palavras-chave: genética de populações, filogeografia, Oligoryzomys nigripes, reservatórios silvestres, Hantavírus
Os roedores sigmodontíneos desempenham um papel fundamental na manutenção de ciclos parasitários e na dispersão
e transmissão de doenças de origem zoonótica, como a hantavirose, na qual apresentam uma relação espécie-específica
com os vírus causadores da Síndrome Cardio-Pulmonar por Hantavírus. Oligoryzomys nigripes é uma espécie associada
ao Hantavírus Juquitiba-like na costa leste brasileira, do Rio de Janeiro ao Rio Grande do Sul, e habita florestas primárias
e secundárias da Mata Atlântica e da Floresta de Araucária. Estudos populacionais e filogeográficos de espécies de
mamíferos reservatórios de parasitas ajudam a entender a distribuição e a dinâmica dos ciclos de transmissão das doenças
associadas a elas. Para este trabalho, foram obtidas amostras de O. nigripes de 19 indivíduos sorologicamente positivos
para Hantavírus de três localidades, nos estados do Espírito Santo (n=8), Rio de Janeiro (n=3) e Santa Catarina (n=8).
As análises foram realizadas com cerca de 800 pares de base, utilizando como marcador molecular o gene mitocondrial
Citocromo b. A análise de rede de median-joining não mostrou estruturação geográfica entre as populações do sudeste,
porém houve uma pequena separação entre os haplótipos do sudeste e os do sul. A análise molecular de variância
mostrou que 78,6% (p<0,05) da variação são diferenças dentro das populações (considerando separadamente ES, RJ e
SC). Apesar da AMOVA mostrar pouca estruturação, o fluxo gênico entre as populações do sudeste e do sul é pequeno
(Fst=0,2; p<0,01). Na análise da distribuição da diferença de substituições entre pares de haplótipos (mismatch distribution)
foram consideradas como populações o total dos indivíduos e os indivíduos do sudeste e do sul separados. A análise
mostrou expansão demográfica, ou seja, a curva simulando uma expansão demográfica não foi significativamente
diferente do observado em todos os casos analisados (p>0,2). O teste de neutralidade de Fu corrobora esse resultado
(Fs=-9,87; p<0,001). Esses resultados sugerem que as populações de O. nigripes analisadas sofreram uma expansão
demográfica recente a partir de poucos indivíduos. Após essa expansão, o baixo fluxo gênico entre locais mais distantes
iniciou uma diferenciação entre essas populações. Existiria então uma limitação regional de dispersão de Hantavírus a
partir de O. nigripes. Como essa espécie é extremamente oportunista em relação às atividades agrícolas humanas, essa
expansão recente pode estar associada à expansão das áreas de cultivo.
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Estruturação geográfica em Oxymycterus
nasutus (Rodentia: Sigmodontinae) no Rio
Grande do Sul: uma abordagem filogeográfica
Pereira, JQ1; Jung, DMH1,2,3; Christoff, AU2; Valiati, VH1,3
Laboratório de Biologia Molecular, Universidade do Vale do Rio dos Sinos
2
Museu de Ciências Naturais, Universidade Luterana do Brasil
3
PPG em Biologia, Universidade do Vale do Rio dos Sinos
[email protected]
1
Palavras-chave: Oxymycterus nasutus, Citocromo B, Filogeografia, Sigmodontinae, Estrutura geográfica
Sigmodontinae (Rodentia: Cricetidae), segunda maior subfamília de mamíferos, compreende várias formas de roedores,
organizados em aproximadamente 84 gêneros atuais, distribuídos predominantemente na América do Sul. A subfamília
tem sido arranjada tradicionalmente em grupos de gêneros, dos quais alguns foram reconhecidos como tribos. Na tribo
Akodontini, o gênero Oxymycterus destaca-se como um elemento comum das comunidades de mamíferos nas latitudes
médias do continente sul-americano, estando representado no Estado do Rio Grande do Sul por O. judex e O. nasutus.
Até o presente momento, nenhum trabalho de cunho sistemático, filogenético ou filogeográfico havia tido como foco
amostras provenientes do estado, de forma que o conhecimento sobre estas espécies fundamenta-se em extrapolações
a partir de estudos de taxonomia alfa, apanhados gerais e dados não publicados. Os objetivos deste estudo foram
avaliar a existência de padrões filogeográficos entre populações de O. nasutus ao longo de sua distribuição geográfica
no Rio Grande do Sul, através do gene mitocondrial da CytB entre 22 indivíduos provenientes de 11 populações do
RS e Uruguai. O fragmento alvo foi amplificado pela PCR, sendo os primeiros 650pb seqüenciados. Destes, 579pb
foram conservados e 25 polimórficos, dos quais 16 corresponderam a mutações únicas e nove foram informativos para
parcimônia. Doze haplótipos foram encontrados entre os indivíduos seqüenciados. O teste de Tajima não rejeitou a
hipótese de neutralidade (D= -0,11426± 0,2553; p= 0,86255). As análises filogeográficas deram-se através da inferência
Bayesiana, Neighbor-joining, Máxima Parcimônia e rede haplotípica. Foi realizada uma AMOVA, sendo os níveis
definidos entre os clados recuperados nas análises cladísticas. Todas as topologias recuperadas descreveram um padrão
similar, dois clados principais (Sul e Norte), com suporte > 50%. O FST obtido, considerando os clados Sul, Norte e
Uruguai, indicou estruturação entre os grupos (FST= 0,59952, p= 0,00196± 0,00136), sendo 59,95% da divergência
genética total explicada pela variação entre os grupos, 14,36% entre populações e 25,69% dentro das populações.
As análises filogeográficas revelaram a existência de dois grandes grupos de haplótipos no Estado do Rio Grande do
Sul, com estruturação geográfica, correspondendo ao clados Norte e Sul. Ainda, foi possível identificar um padrão de
dispersão Sul-Norte, já que os haplótipos considerados os mais ancestrais da população são aqueles pertencentes à região
de Sentinela do Sul, na região sudeste do Estado, enquanto os mais derivados foram os encontrados no Clado Norte, na
região Nordeste do Rio Grande do Sul. Considerando que O. nasutus está restrito a áreas de estepe gramíneo-lenhosa,
e que a região fitogeográfica intermediária entre os seus dois limites de ocorrência é composta originalmente por áreas
de Floresta Estacional Decidual e Floresta Ombrófila Mista, é possível sugerir que tais áreas funcionem, pelo menos
atualmente, como um limitador do fluxo gênico entre os dois clados.
Apoio Financeiro: UNISINOS, FAPERGS, CAPES.
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Alta diversidade cariotípica em Akodon
cursor (Rodentia, Cricetidae) no Espírito
Santo revela um novo citótipo para a espécie
Colombi, VH1,2; Fagundes, V1
Laboratório de Genética Animal, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Espírito Santo
2
Programa Institucional de Iniciação Científica (PIBIC/CNPq-UFES)
[email protected], [email protected]
1
Palavras-chave: Akodon cursor, Espírito Santo, citogenética, polimorfismo, cariótipo
O gênero Akodon (Meyen, 1833), com 45 espécies reconhecidas, distribui-se pela América do Sul da região Andina
do Chile até a Venezuela e nas porções temperadas, subtropicais e tropicais do Brasil, Bolívia, Argentina, Paraguai e
Uruguai. Dentre as espécies, A. cursor ocorre na encosta atlântica da Paraíba ao Paraná e apresenta alto polimorfismo
cariotípico intra e interpopulacional. Em 1998, a análise de 311 espécimes do Paraná, São Paulo, Rio de Janeiro e
Bahia revelou 28 citótipos com variação do número diplóide (2n=14, 15 e 16) e do número de braços autossômicos
(NA=18-26), com rearranjos do tipo inversão pericêntrica e fusão cêntrica nos pares 1 e 3; inversão pericêntrica nos
pares 2, 4 e 6; trissomia do cromossomo 7; e monossomia do cromossomo X. No intuito de identificar o número e a
freqüência de citótipos no ES, analisamos o 2n e o NA de 98 espécimes de 10 localidades: Águia Branca (n=7), Cariacica
(n=5), Castelo (n=6), Domingos Martins (n= 9), Governador Lindenberg (n=3), Ibitirama (n=11), Irupi (n=12),
Muqui (n=1), Santa Teresa (n=7) e Viana (n=37). Todos os exemplares apresentaram 2n=14, com um par metacêntrico
grande (1+3M), oriundo da fusão dos pares submetacêntricos 1 e 3 (da forma 2n=16). Os pares 2 e 4 apresentaram-se
homomórficos acrocêntricos (2A/4A); heteromórficos (2H/4H), compostos por um cromossomo acrocêntrico e outro
submetacêntrico; ou homomórficos submetacêntrico (2S) ou metacêntrico (4M). O par 5 é metacêntrico (5M); o par 6
é acrocêntrico (6A); o par 7 é metacêntrico minúsculo (7M); o cromossomo X é acrocêntrico médio e o Y acrocêntrico
pequeno. Encontramos nove citótipos, sendo um novo para a espécie: 1) 2n=14, NA=18, 1+3M,2A,4A,5M,6A,7M
em 19,6% dos exemplares (Cariacica, Domingos Martins, Governador Lindenberg, Ibitirama, Irupi, Santa Teresa e
Viana); 2) 2n=14, NA=19, 1+3M,2A,4H,5M,6A,7M em 23,7% dos espécimes (Águia Branca, Cariacica, Castelo,
Domingos Martins, Ibitirama, Irupi e Viana); 3) 2n=14, NA=20, 1+3M,2A,4M,5M,6A,7M em 7,2% dos exemplares
(Domingos Martins, Governador Lindenberg, Irupi e Viana); 4) 2n=14, NA=19, 1+3M,2H,4A,5M,6A,7M em 15,5%
dos espécimes (Águia Branca, Cariacica, Domingos Martins, Governador Lindenberg, Ibitirama, Irupi, Muqui, Santa
Teresa e Viana); 5) 2n=14, NA=20, 1+3M,2H,4H,5M,6A,7M em 20,6% dos exemplares (Águia Branca, Cariacica,
Castelo, Domingos Martins, Ibitirama, Irupi, Santa Teresa e Viana); 6) 2n=14, NA=21, 1+3M,2H,4M,5M,6A,7M
em 9,3% dos espécimes (Castelo, Domingos Martins, Irupi e Viana); 7) 2n=14, NA=20, 1+3M,2S,4A,5M,6A,7M
em 2,1% dos exemplares (Domingos Martins e Viana); 8) 2n=14, NA=21, 1+3M,2S,4H,5M,6A,7M em 1% dos
espécimes (Viana); e 9) 2n=14, NA=22, 1+3M,2S,4M,5M,6A,7M em 1% dos exemplares (Viana), sendo esse citótipo
novo para a espécie. Dessa maneira, aumentamos em 24% a amostra total analisada e só observamos um novo citótipo,
resultando em 29 citótipos em 408 exemplares. Observamos, assim, que 31% de toda a variação cariotípica da espécie
ocorre no Espírito Santo.
Apoio Financeiro: FAPES/ES, FACITEC/ES e CNPq.
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Análise cariotípico de Akodon
(Cricetidae, Rodentia) de Minas Gerais
Godinho, RM; Lopes, MOG; Carvalho, AH; Svartman, M
Universidade Federal de Minas Gerais, Biodiversity Salvation, Universidade federal de Minas Gerais, Universidade Federal de Minas Gerais
[email protected]
Palavras-Chave: Akodon, Cromossomos, Polimorfismos, Simpatria, Bandas
Resumo: Os roedores constituem a mais numerosa ordem de mamíferos, com cerca de 40% das espécies desta classe.
Sigmodontinae é a maior subfamília de roedores da América do Sul e cerca de um terço de seus representantes pertencem
à tribo Akodontini, que se destaca pela alta variabilidade citogenética em contraste com a baixa variação morfológica. A
subfamília Sigmodontinae é composta por nove gêneros e 81 espécies, 41 das quais pertencentes ao gênero Akodon, que
se distribui por toda a América do Sul. Dez espécies de Akodon já foram registradas no Brasil: A. cursor, A. montensis, A.
azarae, A. lindberghi, A. toba, A. paranaensis, A mystax, A. reigi, A. serrensis e Akodon sp, uma espécie recém-descrita e ainda
sem classificação formal. Akodon. cursor (2n=14, 15 e 16; NF=18 a 26) e A. montensis (2n=24, 25 e 26; NF=42, 44 e 46)
ocorrem em simpatria em algumas regiões dos estados de Minas Gerais, Rio de Janeiro e São Paulo. A citogenética é
de fundamental importância para a identificação taxonômica diferencial entre estas duas espécies que, com base na
morfologia, são crípticas.Neste trabalho, analisamos citogeneticamente 24 espécimes de Akodon coletados em Minas
Gerais. A análise incluiu os padrões de bandeamento G, C e a coloração das regiões organizadoras de nucléolos (RON).
Os exemplares estudados eram provenientes de diferentes áreas geográficas de Minas Gerais, englobando diversos
biomas: mata, campo rupestre, campo inundado e cerrado. A ocorrência de Akodon ainda não havia sido descrita para
a maior parte da área geográfica amostrada. Nossa amostra continha seis exemplares de Akodon cursor (2n=14; NF=18,
19, 20), com variação cariotípica devida a inversões pericêntricas nos pares 2 e 3; dezesseis exemplares de A. montensis
(2n=24, NF=42; 2n=25, NF=44; 2n=26, NF=46), com um polimorfismo decorrente da presença de um ou dois
cromossomos Bs; e dois exemplares de A. lindberghi (2n=42, NF=42). Akodon cursor e A. montensis ocorriam em simpatria
em algumas regiões e em áreas próximas a locais de ocorrência conhecidos para A. lindberghi e A. serrensis, o que estende
as zonas de simpatria conhecidas para essas espécies. Os dois espécimes de Akodon lindberghi foram coletados numa
área de transição entre o cerrado e mata atlântica, o que reforça a idéia de que esse animal típico de cerrado e outras
áreas centrais do Brasil, é simpátrico com as espécies da mata atlântica de Minas Gerais.
Apoio financeiro: FAPEMIG, CAPES, NAPq e PRPq/UFMG.
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Técnica de GISH em quatro espécies de
roedores da Tribo Akodontini (Rodentia,
Cricetidae), a partir de suspensão celular
em fixador ácido-alcoólico
Hass, I1, 2; Müller, S2; Sbalqueiro, IJ1
Departamento de Genética, Universidade Federal do Paraná, Curitiba, Brasil
Department Biology II, Human Genetics, Ludwig-Maximilians University, Munich, Germany
[email protected]
1
2
Palavras-chave: GISH, citogenética, Akdontini, Rodentia, hibridação
A técnica GISH é amplamemte empregada em citogenética vegetal, onde o DNA genômico total de uma espécie
é marcado e usado para identificar os cromossomos desta espécie em uma outra, reconhecendo os cromossomos
ou segmentos homeólogos. Porém, nós utilizamos o GISH para verificar a qualidade de hibridação das células das
espécies de roedores - Akodon montensis, Akodon paranaensis, Thaptomys nigrita e Brucepattersonius griserufescens - que
seriam posteriormente submetidas a estudos com ZOO-FISH. O ojetivo deste estudo, foi o de comparar a técnica de
amplificação de uma pequena quantidade de DNA genômico pela DOP-PCR, descrita por TELENIUS et al. (1992) e
SPEICHER et al. (1993), com a nossa adaptação que utiliza material celular em suspensão em fixador ácido-alcoólico. Em
ambas as metodologias foram utilizados os mesmos indivíduos das espécies em estudo, bem como os mesmos reagentes
para a mistura de reação e iniciador para a amplificação o 6MW. Após a reação da 1ª. DOP-PCR em termociclador
a verificação dos fragmentos produzidos foi realizada em gel de agarose 1% em TAE 1X, corrida a 130W/150mA por
20 min, e visualização em brometo de etídio. Foi utilizado o marcador Hind III para observar a obtenção de bandas
entre 550 a 2300 pb, consideradas de tamanho ótimo para a realização das hibridações GISH. O mesmo procedimento
foi utilizado posteriormente para a verificação de fragmentos produzidos pela 2a. amplificação e pela DOP-PCR de
marcação. As sondas de DNA genômico foram marcadas com biotina e contra coradas com ActinomicinaD/DAPI.
Para a análise das hibridações utilizou-se o microscópio Zeiss-Axiophot com sistema de fluorescência com lâmpada
de mercúrio HBO 100. Os resultados observados mostram que a quantidade e qualidade das DOP-PCR e PCR de
marcação foram mais intensas a partir da técnica por nós adaptada, porém os resultados das hibridações em ambas as
metodologias apresentaram-se similares. Assim, a metodologia adaptada por nós pode ser amplamente utilizada, o que
garante um melhor aproveitamento do material celular disponível para estudo, bem como uma maior quantidade e
qualidade do DNA genômico a ser empregado nas hibridações.
Apoio financeiro: UFPR, LMU, CNPq, DAAD.
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Filogeografia e tempo de divergência de
três espécies de roedores akodontinos de
ocorrência na Mata Atlântica: Akodon cursor,
A. montensis e Oxymycterus dasytrichus
Montes, MA1,2; Barros, MC3; Oliveira, LFB4; Langguth, A3; Mattevi, MS1,5*
Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Caixa Postal 15053, 91501-970,
Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil
2
Laboratório de Biologia Genômica e Molecular, Facultade de Biociências, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul
3
Departamento de Sistemática e Ecologia, Universidade Federal da Paraíba, Caixa Postal 5010, 58059-900, João Pessoa, Brazil
4
Setor de Mastozoologia, Museu Nacional, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 20940-040, Rio de Janeiro, Brazil
5
Curso de Pós-Graduação em Genética e Toxicologia Aplicada, Universidade Luterana do Brasil, 92420-280, Canoas, Rio Grande do Sul, Brazil
[email protected]; [email protected]; [email protected]; [email protected]
1
A Mata Pluvial Atlântica é um dos ambientes terrestres mais ricos em espécies e um dos cinco mais ameaçados do
planeta. Os roedores e os marsupiais são os mamíferos mais diversificados da Mata Atlântica, tendo um importante papel
ecológico neste bioma. No presente estudo investigamos seqüências do gene mitocondrial citocromo b em roedores
sigmodontinos da tribo Akodontini habitantes da Mata Atlântica da América do Sul a fim de analisar os níveis e os
padrões da variação genética destes roedores neste habitat fragilizado. Objetivamos abordar quatro áreas conceptuais: 1)
estudar a estrutura filogeográfica em Akodon cursor, A. montensis, Akodon 2n=44 e Oxymycterus dasytrichus, buscando
delinear possíveis áreas regionais onde seriam encontrados clados monofiléticos dentro da Mata Atlântica; 2) determinar
a idade das linhagens, 3) avaliar os processos de diversificação das espécies aqui estudadas em relação às mudanças
geológicas e paleoambientais ocorridas na Mata Atlântica e 4) revelar a estrutura populacional das espécies e aplicar este
conhecimento para a definição das prioridades de manejo e conservação de alguns taxa deste bioma. Foram estudadas
amostras de 12 localidades de A. cursor (n=24), 13 localidades de A. montensis (n=24), sete localidades de Akodon 2n=44
(n=18) e 10 localidades de O. dasytrichus (n=15). Cada uma das espécies estudadas apresentou um padrão filogeográfico
característico: A. montensis apresentou quatro grupos, dos quais três foram bem definidos geograficamente, O. dasytrichus
não apresentou uma estruturação em grupos bem definida e A. cursor apresentou dois grupos monofiléticos, a princípio
claramente correlacionados com a geografia. O tempo de divergência para O. dasytrichus coincidiu com a transição
Mioceno-plioceno. A divergência entre os grupos de A. cursor e A. montensis ocorreu recentemente, há menos de dois
milhões de anos, numa época onde o registro dos glaciais revela a presença de quatro grandes aumentos no volume
das massas de gelo. Os intervalos de clima frio poderiam ter isolado populações e gerado a estrutura que encontramos
atualmente em A. montensis.
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Mecanismos envolvidos na heterose do
comportamento de construção de ninho em
camundongos
Sauce, B; Anceti, KF; Peripato, AC
Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos
[email protected]
Palavras-chave: Camundongo, Heterose, Comportamento Materno, Construção de Ninho
O comportamento é uma característica complexa cuja variação é influenciada pelo ambiente e, geralmente, por fatores
herdáveis geneticamente (aditivos ou por interações) e/ou de forma não-genética. Nosso grupo tem investigado os
comportamentos associados ao cuidado materno em camundongos do cruzamento de duas linhagens endogâmicas
(SM/J e LG/J). Dentre tais comportamentos, a construção de ninho parece sofrer influências de fatores genéticos
por interações devido ao maior valor do híbrido (heterose em F1) observado em relação aos parentais. Além disso,
em resultados anteriores, encontramos em nossas linhagens o gene PEG 3 (paternally expressed gene 3) afetando parte
da variação fenotípica do cuidado materno em geral. Tal gene tem, em outros animais, conhecida influência no
comportamento de construção de ninho e sua expressão (apenas paterna) sofre efeito epigenético – que, teoricamente,
também pode levar à heterose. Neste trabalho, testamos a hipótese que, em nossas linhagens, a heterose observada
no comportamento materno de construção de ninho está associada com herança por fatores genéticos de interações
(dominantes e epistáticos) ou por fatores epigenéticos. Usamos fêmeas das linhagens endogâmicas SM/J (n=29), LG/J
(n=24), e dos intercruzamentos F1 (n=23) e F2 (n=89) dessas linhagens. Avaliamos, então, a qualidade dos ninhos
pré-parto construídos classificando quanto à utilização de algodão e abertura (pontuação de 0 a 3). Para o teste de
fatores genéticos com interações, usamos as análises para o modelo de heterose assumindo dominância. Para o teste dos
fatores epigenéticos, fizemos uma correlação da construção de ninho das fêmeas F2 com a diferença no cruzamento dos
avós: fêmea LG/J com macho SM/J, ou fêmea SM/J com macho LG/J. Em nossos resultados, detectamos a média de
1,979 de qualidade de ninho na população F1. Como esperado, esses valores são estatisticamente maiores que a média
de 1,462 nas populações parentais (P<0,002). Na população F2, o valor esperado pelo modelo de dominância seria
metade da média de F1, mas encontramos um valor de 1,727. Como essa média é significativamente maior que o
modelo prevê (t140=18,1; P<10-7), isso indica que a heterose existente é devida não apenas a efeitos de dominância, mas
também a fatores epistáticos. As avaliações do ninho em F2 tiveram uma correlação próxima de zero com o cruzamento
dos avós (qualidade com r=-0,07; altura com r=-0,08). Isso é uma indicação de que não detectamos efeito herdável
epigenético dos avós associados à variação existente. Enfim, apesar do resultado negativo sobre o efeito de herança
epigenética também esperado em nossa hipótese, a heterose e a variação do comportamento de construção de ninho
parecem sofrer um efeito de interações genéticas. Em estudos futuros, genotiparemos diversos marcadores no genoma
desses animais cruzados buscando elucidar os genes e a arquitetura genética do comportamento de construção de ninho
por meio do método de QTL.
Apoio financeiro: FAPESP.
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Variação no tamanho de ninhada
em camundongos LG/J x SM/J
Gallo, TCG; Anceti, KF; Sauce, B; Peripato, AC
Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos
[email protected]
Palavras-chave: Tamanho de ninhada, Camundongos
O tamanho de ninhada (TN) é uma característica diretamente relacionada ao fitness e sua variação pode apresentar grandes
conseqüências em mamíferos. Devido ao custo fisiológico da lactação em fêmeas, TN elevado pode ser desvantajoso,
pois precisará estar associado a um maior desempenho materno no que tange a amamentação, proteção contra intrusos,
entre outros fatores. A variação no número de filhotes nascidos pode receber influências ambientais e genéticas. O
objetivo deste trabalho foi o de investigar a variação de TN em camundongos das linhagens endogâmicas LG/J, SM/J
e seus intercruzamentos F1 e F2. Registramos o número de filhotes por fêmea logo após o parto e monitoramos por sete
dias, período em que ocorre a maior perda significativa de filhotes devido a desvios de comportamento materno ou
inviabilidade da prole. Durante este período verificamos a perda em média de quatro filhotes por ninhada de fêmeas
da linhagem LG/J, um filhote para a linhagem SM/J e F1 e dois filhotes em média para geração F2. As primíparas
da linhagem LG/J, em geral, apresentam a ejeção de leite apenas no segundo dia pós-parto, fato pelo qual podemos
observar a menor sobrevivência de filhotes. O TN médio de 24 fêmeas da linhagem LG/J é de 6,59 ± 0,54 enquanto que
20 fêmeas SM/J apresentaram média de 4,05 ± 0,38 filhotes nascidos. As gerações F1 (n=21) e F2 (n=88) apresentaram,
respectivamente, os valores médios de ninhada de 10,84 ± 0,39 e 9,11 ± 0,23. Esta característica difere significativamente
entre as gerações parentais (P= 0,0004) e entre as demais gerações, inclusive entre F1 e F2 (P=0,0006). Nós também
investigamos heterose na geração F1 e com a detecção da mesma, verificamos se havia alterações no TN médio na
geração F2 baseada no modelo de dominância. Se o modelo a ser explicado fosse devido a dominância, teríamos um
decréscimo de metade do TN da geração F1 para a geração F2. O tamanho médio de ninhada encontrado para fêmeas
F1 é significativamente maior do que da linhagem parental (t63=7,13; P<1,0x10-7) indicando heterose para TN nesse
cruzamento. Nós esperaríamos o TN de 8,08 na geração F2, no modelo de dominância de heterose. No entanto,
encontramos o tamanho médio de 9,11 que desvia significativamente do valor esperado (t130=16,43; P<1,0x10-7). Desta
forma, podemos indicar também interações epistáticas afetando heterose nesse cruzamento. Encontramos resultados
semelhantes no estudo de TN utilizando o mesmo intercruzamento, porém em outra população (Peripato et al. 2004).
A primeira etapa desenvolvida foi a investigação da variação de TN neste intercruzamento. Nosso próximo passo deverá
ser o aumento do tamanho amostral em F2 e a investigação da arquitetura genética de tamanho de ninhada através da
análise de QTL em fêmeas F2 do intercruzamento da linhagem LG/J e SM/J.
Apoio Financeiro: FAPESP.
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Uso de haplótipos de mtDNA na conservação
das raças caprinas (Capra hircus) moxotó e
canindé no nordeste do Brasil
Paiva, SR1; Barreto, GB1; Faria, DA1; da Silva, FLR2; Facó, O2; McManus, C.3; Mariante, AS1; Araújo, AM4
Laboratório de Genética Animal, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, DF
2
Embrapa Caprinos, CE
3
FAV, Universidade de Brasília, DF
4
Embrapa Meio Norte, PI
[email protected]
1
Palavras-chave: Conservação Recursos Genéticos animais, D-loop, manejo genético
A região Nordeste é detentora do maior rebanho caprino do País e possui raças naturalizadas adaptadas às condições
adversas do semi-árido. Estas raças sofreram um processo de cruzamento indiscriminado com diversas raças comerciais,
pondo em risco o tamanho dos seus efetivos populacionais e, conseqüentemente, seu potencial genético. Adicionalmente,
estas raças apresentam poucos estudos que visem agregar conhecimento as suas origens, potenciais produtivos e diversidade
genética. Resultados recentes com marcadores microssatélites indicaram que as raças Moxotó e Canindé são estatisticamente
diferentes das raças européias e que o Núcleo de conservação da raça Moxotó da Embrapa Caprinos se encontra com
endogamia elevada. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avançar nos estudos sobre a variabilidade genética dos
Núcleos de Conservação das raças Canindé e Moxotó existentes na Embrapa Caprinos por meio do sequenciamento do
DNA mitocondrial (mtDNA). Foram seqüenciados 391 pares de bases da primeira metade da região controle (D-loop)
de 41 animais Moxotó, 30 animais Canindé e 11 animais pertencentes a raças comerciais recentemente introduzidas no
Brasil (Saanen, Parda Alpina e Anglo Nubiana). Foram observados um total de 39 haplótipos de forma, que 16 foram
específicos da raça Canindé, 11 da raça Moxotó e sete das raças comerciais. Três haplótipos foram específicos das duas
raças naturalizadas e dois haplótipos comuns entre todas as raças analisadas. Trinta dos 39 haplótipos foram observados
apenas uma vez na amostra estudada. Tais resultados confirmam o alto número de haplótipos existente dentro da espécie
caprina, padrão este já relatado por outros autores e significativamente diferente do observado, por exemplo, em ovinos
e suínos. Por outro lado, apesar da alta diversidade de haplótipos, a análise de variância molecular demonstrou que
apenas 4,39% (p=0,03519) de toda a variabilidade observada foram em razão de diferenças entre as raças. Isso é uma
evidência adicional da influência das raças comerciais nos estoques localmente adaptados bem como demonstra que
estes marcadores podem ser úteis para monitorar eventos de introgressão. Em relação à diversidade nucleotídica foram
observados valores de 0,024615 ± 0,012793 para raça Moxotó, 0,021642 ± 0,011461 para a raça Canindé e 0,015903
± 0,009233 para as raças comerciais. As raças naturalizadas apresentaram uma diversidade genética significativamente
maior do que as raças comerciais, sugerindo que apesar de estarem ameaçadas de extinção, possuem um conjunto gênico
apto ao restabelecimento de seus antigos efetivos populacionais. Estes resultados auxiliarão o manejo genético destes
dois rebanhos bem como serão usados, juntamente com outras amostras, em estudos filogenéticos para determinar as
principais raças que deram origem às raças localmente adaptadas brasileiras.
Apoio Financeiro: Embrapa.
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Citogenética de raças locais de ovinos (Ovis
aries) e caprino (Capra hircus)
do estado da Bahia
Santos, JR; Medrado, AS; Malhado, CHM; Affonso, PRAM; Carneiro, PLS; Paiva, SR
Laboratório de Citogenética, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia – UESB
[email protected]
Palavras-chave: Cariótipo, Ovino, Morada Nova, Rabo Largo e Repartida
O Brasil possui diversas raças de animais domésticos que se desenvolveram a partir de raças trazidas pelos colonizadores
portugueses, franceses e holandeses logo após o descobrimento. Todas as raças de ovinos e caprinos presentes no território
brasileiro foram formadas pelo processo de adaptação e seleção natural de raças européias. Geralmente, são animais
de pequeno porte, contudo, eficientes em termos de adaptação e sobrevivência nas mais diversas regiões brasileiras de
naturalização. Na região nordeste estes animais ganharam notoriedade por terem se adaptado às condições edafo-climáticas
predominantes na região, desenvolvendo mecanismos biológicos apropriados, resultando em vários grupos e/ou raças
localmente adaptadas ou locais. Esta adaptação ao sistema de produção promoveu uma redução da capacidade produtiva
dos rebanhos em termos de carne, leite e tamanho corporal. Apesar de a seleção natural ter ocorrido no sentido negativo
da produção, o nordeste possui hoje, para suas condições de semi-árido, material genético de excelente qualidade para
produção de pele, carne de baixo teor de gordura e uma adequada produção de leite. As técnicas citogenéticas são
consideradas ferramentas poderosas para os programas de conservação, tanto por identificarem os padrões e processos
responsáveis pela situação atual dos rebanhos como por auxiliarem no desenvolvimento de estratégias de manejo e
unidades de conservação. Tal atitude é válida, visto que esses animais representam principalmente na região Nordeste,
uma fonte de recursos importantes dos pontos de vista social, econômico, cultural e histórico. Com o objetivo de
caracterizar e avaliar os rebanhos das raças de ovinos e caprinos criados na Bahia, análises citogenéticas convencionais
foram realizadas em animais das raças Morada Nova e Rabo Largo (ovinos), e Repartida (caprino) para uma abordagem
comparativa em relação ao padrão citogenético descrito para rebanhos europeus. A análise microscópica convencional,
pela coloração com Giemsa, revelou o mesmo número cromossômico nas duas raças de ovinos estudadas (2n = 54) e o
mesmo na raça de caprino, Repartida (2n = 60). A fórmula cariotípica dos ovinos composta por 06 metacêntricos grandes
e 48 telocêntricos, incluindo o par sexual, com diferenças sutis de tamanho entre os pares cromossômicos (NF=60) e
no caprino, 60 telocêntricos (NF=60). Com relação aos cromossomos sexuais, apresentados ao lado direito do primeiro
grupo na seqüência do cariótipo, o cromossomo X é o maior dos telocêntricos, enquanto o cromossomo Y é o menor
elemento do cariótipo para ambas as espécies. Estudos subseqüentes utilizando outros marcadores cromossômicos
estão sendo realizados para uma caracterização citogenética mais detalhada dessas raças, a fim de identificar eventuais
peculiaridades na estrutura dos cromossomos desses rebanhos, auxiliando no manejo reprodutivo dos mesmos.
Apoio financeiro: FAPESB, CNPq, Banco do Nordeste e UESB.
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Uso de marcadores moleculares para
seleção de doadores de germoplasma em
um programa de conservação: caso da raça
ovina (Ovis aries) morada nova
Barretto, GB1,3; Facó, O2; Mariante, AS3; Paiva, SR3
Estudante de Medicina Veterinária, União Pioneira de Integração Social, DF
2
Embrapa Caprinos, CE
3
Laboratório de Genética Animal, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, DF
[email protected]
1
Palavra-Chave: Recursos Genéticos Animais, microssatélites, manejo genético
A origem da raça ovina Morada Nova no Brasil é desconhecida, contudo, acredita-se que por meio de uma forte seleção
natural pelo clima da região, os animais trazidos pelos portugueses na época do povoamento do sertão passaram por um
processo de adaptação favorecendo-se assim a sua multiplicação. Como não há relatos da origem exata destes animais o
nome da raça Morada Nova surgiu devido aos primeiros relatos da presença destes animais serem na cidade de Morada
Nova, CE. Hoje esta raça é reconhecida pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento como uma raça
localmente adaptada e está inserida no Programa Nacional de Conservação coordenado pela Embrapa e parceiros. Uma
das várias estratégias de conservação é a coleta e criopreservação de germoplasma (sêmen e embriões) dos animais mais
representativos da raça. Os critérios tradicionais usados para escolha destes animais são baseados, principalmente, em
caracteres reprodutivos, sanitários e morfológicos. A utilização de marcadores moleculares, principalmente os baseados
na genotipagem de locos microssatélites, tem se mostrado uma ótima ferramenta para verificação da diversidade
genética de rebanhos, obtendo informações valiosas para a conservação. Desta forma o objetivo deste trabalho foi testar
a utilização destes marcadores para a seleção de animais para doadoras de germoplasma dentro de um programa de
conservação. Foram utilizados 15 marcadores microssatélites (maioria dentro da lista proposta pela FAO e ISAG) em
32 animais da raça Morada Nova que participaram da Primeira Prova de Desempenho de ovinos da raça Morada Nova
realizado entre fevereiro e maio de 2008 no município de Morada Nova, CE. Os microssatélites foram amplificados por
PCR em sistemas multiplex e a eletroforese capilar foi realizada no sistema ABI3700 e a leitura dos alelos foi realizada
a partir da detecção das fluorescências específicas contidas nos oligonucleotídeos usados. Em termos de diversidade
total do rebanho, foi observada uma média de 5.13 alelos, heterozigosidade esperada de 0,6162, heterozigosidade
observada de 0,5680 e coeficiente de concestralidade molecular médio 0,3935. Para a escolha dos melhores animais a
serem conservados, os mesmos foram classificados, em ordem crescente, a partir dos valores médios de concestralidade
molecular. Desta forma os 15 animais com menor valor deste índice foram pré-selecionados como candidatos a coleta
de germoplasma. Com a utilização de um gráfico de componentes principais (três primeiros componentes explicaram
aproximadamente 60% de toda a variação) pode-se confirmar os resultados obtidos de forma que foi observado um
distanciamento excessivo dos animais com as maiores médias de coeficiente de concestralidade. A utilização dos locos
de microssatélites confirmaram ser uma ferramenta de ótima funcionalidade para auxiliar a escolha dos animais a serem
conservados, maximizando assim a variabilidade genética representativa desta raça.
Apoio Financeiro: Embrapa, Banco do Nordeste.
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Associação entre microssatélite localizado
no cromossomo OAR3 e peso ao abate de
ovinos pertencentes a três grupos genéticos
Gouveia, JJS1; Santiago, AC2; Ibelli, AMG3; Tizioto, PC1; Esteves, SN4; Barioni Júnior, W4; Regitano, LCA4
Mestrado em Genética e Evolução, Univ. Federal de São Carlos
2
Graduanda em Ciências Biológicas, UNICEP
3
Doutorado em Genética e Evolução, Univ. Federal de São Carlos
4
Pesquisador da Embrapa Pecuária Sudeste
[email protected]
1
A ovinocultura tem uma enorme importância em várias regiões do mundo e isso pode ser demonstrado pelo volume
de produção e de dinheiro gerado por esta atividade. Apesar de o Brasil apresentar excelentes condições ambientais
e mercado bastante favorável, a produção nacional ainda é desprezível no contexto mundial. A baixa produtividade
brasileira na ovinocultura se deve, ao menos em parte, ao baixo potencial genético do rebanho nacional. Algumas
características importantes que poderiam ser usadas nos programas de melhoramento genético apresentam baixa
herdabilidade, difícil mensuração ou correlações negativas com outras características. Nesse contexto, a genética
molecular, através da identificação das regiões cromossômicas responsáveis pelo controle das mesmas e incorporação
destas informações moleculares em programas de melhoramento genético, pode ser bastante útil. Portanto, o objetivo
do presente trabalho foi investigar uma região do braço Q do cromossomo OAR3 como região candidata a conter genes
importantes para a característica peso ao abate em ovinos. Para isso foram utilizados 139 cordeiros de três grupos genéticos
(48 Santa Inês x Santa Inês, 51 Dorper x Santa Inês e 40 Suffolk x Santa Inês). Os animais foram genotipados para os
marcadores microssatélites BP1, BL4 e BMS1617, localizados no braço Q do cromossomo OAR3, a 163.1, 195.5 e
202.2 cM. A análise de associação entre os marcadores e a característica de peso ao abate foi realizada através de um
modelo de substituição gênica no qual o alelo de maior freqüência é fixado e o efeito dos demais alelos é estimado
como desvio deste. O marcador BL4 apresentou um alelo (BL4_159) com efeito significativo (P= 0,0415) no grupo
genético Santa Inês x Santa Inês. O efeito de substituição do alelo BL4_159 representou um aumento de 1,018 Kg no
peso ao abate dos animais. Não foi observado efeito significativo para nenhum alelo do marcador BL4 para os outros
grupos genéticos assim como para os marcadores BMS1617 e BP1 em todos os três grupos genéticos. Nossos resultados
corroboram outros estudos em ovinos e bovinos que sugerem que o braço Q do cromossomo OAR3 contém um ou
mais genes que influenciam características de crescimento.
Apoio financeiro: CAPES,CNPq e EMBRAPA.
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DIversidade genética de ovinos (Ovis aries)
no centro-oeste do Brasil: alta variabilidade
do grupo genético pantaneiro
Vilarinho, KR1; Martins, CF2; Vargas Jr., FM2; McManus, C3; Paiva, SR1
Laboratório de Genética Animal, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, DF
2
Universidade para o Desenvolvimento do Estado e da Região do Pantanal, MS
3
FAV, Universidade de Brasília, DF
[email protected]
1
Palavras-chave: Conservação Recursos Genéticos animais, microssatélites, manejo genético
A atividade de criação de ovinos na região Centro Oeste tem se destacado, nos últimos anos, como uma alternativa
economicamente viável para os produtores. Existe um mercado com grande potencial, principalmente para carne,
de forma que o sucesso dessa atividade esta intimamente relacionada aos grupos genéticos a serem usados bem como
o nível de tecnificação e conhecimento aplicado. Dentre as possíveis raças a serem usadas em sistemas de produção
observa-se que há pouco conhecimento acerca de um grupamento genético adaptado às condições da região do estado
de Mato Grosso do Sul e do Pantanal denominado localmente de ovelha crioula ou Pantaneira. Estudos recentes da
presente equipe demonstraram, por meio de haplótipos de mtDNA, que esses animais podem ser considerados um
grupo geneticamente mais semelhante as raças localmente adaptadas de ovinos brasileiros do que de raças comerciais
recentemente introduzidas no país. Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a diversidade genética
de um rebanho deste grupo genético no Estado do Mato Grosso do Sul de modo que os resultados irão subsidiar o
manejo genético deste rebanho. Foram usados sete locos de microssatélites (MAF65, ILSTS05, BM827, ILSTS11,
INRA35, INRA63 e OarHH35) em 118 animais (12 reprodutores e 106 matrizes) do rebanho pertencente à UNIDERP,
Campo Grande-MS. Foi observado um número médio de alelos de 8,71 ± 2,06; a heterozigosidade observada foi de
0,7790 ± 0,0145 e a heterozigosidade esperada foi de 0,7935 ± 0,0123. Tais valores foram altos quando comparados
com os obtidos para outras raças de ovinos para o mesmo painel de marcadores. A coancestralidade molecular média
foi de 0,2119 e o índice de endogamia (FIS) do rebanho foi de apenas 0,0066. Novamente, estes coeficientes indicam
uma alta diversidade genética dentro deste grupo, que por sua vez, sugere a existência de uma vasta variabilidade para ser
trabalhada tanto em programas de melhoramento como de conservação de recursos genéticos animais. Estes resultados
serão usados para auxiliar o manejo genético deste rebanho (por exemplo, controle pedigree e indicação de cruzamentos)
bem como serão um subsídio para a seleção de doadores de germoplasma para o programa nacional de conservação
de recursos genéticos animais coordenado pela Embrapa e que conta com a participação de várias Universidades e
Instituições de pesquisa do Brasil.
Apoio Financeiro: CNPq, Embrapa e UNIDERP.
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Validação Preliminar de bibliotecas SAGE
em mÚsculo esquelético de gado nelore
(Bos indicus) e búfalos d’água
(Bubalus bubalis) por PCR em tempo real
Reis, SP; Lima, NO, Gonçalves, EC; Silva, A; Schneider, MPC
Laboratório de Polimorfismo de DNA, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará
[email protected]
Palavras-chave: PCR em tempo real, SAGE, expressão gênica, Bos indicus, Bubalus bubalis
Os zebuínos (Bos indicus) e os búfalos d’água (Bubalus bubalis) são amplamente utilizados como produtores de carne,
sendo de elevada importância para o agronegócio nacional. Estudos envolvendo análise da expressão de genes que
atuam na formação da musculatura esquelética são de extrema relevância para o avanço nas pesquisas que visam o
melhoramento genético animal. A análise seriada da expressão gênica (SAGE), apesar de eficiente para quantificar a
expressão gênica, pode ocasionalmente identificar genes erroneamente e, portanto, precisa ser validada por outra técnica
quantitativa que permita identificar precisamente os níveis de expressão gênica. A mais adequada delas é a PCR em
tempo real, por permitir o monitoramento da fase exponencial da reação. Assim, o objetivo deste trabalho foi validar
a acurácia das análises de bioinformática nas bibliotecas SAGE construídas por nosso grupo para Nelore e Murrah,
utilizando PCR em tempo real. O RNA foi obtido de amostras do músculo semitendinosus de zebuínos da raça nelore
e de búfalos da raça Murrah para síntese de cDNA. As reações de PCR em tempo real foram realizadas utilizando
o ABI PRISM 7500 Real Time PCR System para os genes da miozenina e do canal aniônico voltagem-dependente 3
(VDAC3), usando a molécula fluorescente SYBR Green como sistema de detecção e gerando uma curva de dissociação
para detecção de amplificações inespecíficas. Foi empregado o método de quantificação relativa (2-ΔΔCt) utilizando-se o
gene da microglobulina como controle endógeno e a amostra bovina como calibradora. Para comparação da expressão
destes genes nas duas técnicas foi realizado o teste estatístico ANOVA com auxílio do aplicativo Bioestat 5.0. Os
iniciadores foram padronizados a 400nM para a miozenina e microglobulina e a 300nM para VDAC3. As eficiências
de amplificação dos genes mostraram-se similares. Os valores médios de Ct para VDAC3, miozenina e microglobulina
para zebuínos foram 32,36, 33,28 e 32,55 e para búfalo 37,58, 37,98 e 36,10 respectivamente. Já os valores médios
de ΔCt (Ctalvo – Ctcontrole endógeno) foram de -0,19 (VDAC3) e 0,72 (miozenina) para zebuínos e 1,48 (VDAC3) e 1,88
(miozenina) para búfalos, com ΔΔCt (ΔCtalvo - ΔCtcalibrador) de 1,67 para VDAC3 e 1,15 para miozenina. Ambos os
genes mostraram-se hipoexpressos nas amostras de búfalo em relação às de nelore (VDAC3: -31%; miozenina: -45%),
semelhante às razões de tags da SAGE (VDAC3: -5,95 vezes; miozenina: -3,27 vezes). O valor de p no teste ANOVA
foi de 0,011, considerado significante ao nível alfa de 0,05. Assim, estes dados indicam diferenças na expressão gênica
destes dois genes entre estas espécies e embora haja a necessidade de ampliar a análise para um maior número de genes,
de forma preliminar validam a biblioteca SAGE que os indicou como de expressão diferencial, abrindo perspectivas
para outros estudos envolvendo a expressão gênica nestas espécies.
Financiamento: PRONEX, FUNTEC/SECTAM, CNPq.
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Avaliação de marcadores do complexo MHC
do genoma bovino para o mapeamento da
região MHC do búfalo de rio
Rodrigues filho, EA1; Stafuzza, NB1, Amaral, MEJ1
Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas (IBILCE), Departamento de Biologia, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho – UNESP
[email protected]
1
Palavras-chave: búfalo de rio, mapeamento, região MHC
Devido suas vantagens produtivas e reprodutivas em relação ao bovino, o búfalo de rio vem despertando o interesse
dos produtores nos últimos anos como uma excelente alternativa para a produção de carne, leite e derivados. Porém,
estudos envolvendo a caracterização do seu genoma encontram-se em fase inicial quando comparados aos genomas de
outras espécies de interesse econômico. Uma vez que as informações sobre o genoma bubalino estão no inicio, os mapas
genômicos de bovino podem potencialmente ser utilizados, por meio de tecnologias envolvendo a genômica comparativa.
Estudos de hibridização in situ, evidenciaram que cromossomo 2 bubalino é o resultado de fusão cêntrica entre os
cromossomos bovino 2 e 23, sendo este último o portador da região do complexo MHC bovino. Uma característica
marcante do búfalo é uma maior resistência à doenças quando comparado com bovinos. O complexo MHC corresponde
à região mais densa no número de genes, contendo a maioria daqueles relacionados à apresentação de antígenos às
células do sistema inume. O presente trabalho teve por objetivo avaliar pares de primers para PCR de genes de classe II
do complexo MHC, mapeados previamente no genoma bovino, para o mapeamento da região MHC do genoma de
búfalo. Pares de primers para 35 marcadores foram avaliados, sendo que 31 produziram produtos de PCR adequado
ao mapeamento da região MHC de búfalo, mostrando aproveitamento de 89% dos marcadores. Os dados obtidos são
inéditos e contribuem para a criação do primeiro mapa genômico do complexo MHC bubalino, cujas informações irão
auxiliar no conhecimento sobre a arquitetura genômica dessa região entre as espécies de bovídeos.
Bolsa: FAPESP.
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Conservação de sintenia entre os
cromossomos 1 e 6 de búfalo de rio com
seus correspondentes nos genomas bovino
e humano
Stafuzza, NB; Miziara, MN; Amaral, MEJ
Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas (IBILCE), Departamento de Biologia, Universidade Estadual Paulista Julio de Mesquita Filho (UNESP)
[email protected]
Palavras-chave: búfalo de rio, conservação de sintenia
A comparação entre genomas de espécies de mamíferos vem auxiliando na busca pelos fatores genéticos que distinguem
organismos evolutivamente relacionados por meio da identificação dos rearranjos cromossômicos que resultaram na
evolução cariotípica e na diferenciação das espécies. Uma das estratégias utilizadas na comparação de genomas é o
mapeamento comparativo que se baseia na conservação existente entre os genomas de mamíferos. A construção de
mapas comparativos vem permitindo uma análise estrutural detalhada dos genomas de diferentes espécies, mostrando
que organismos que se divergiram recentemente apresentam segmentos de DNA homólogos contendo genes em posições
relativamente idênticas. Desse modo, o objetivo do presente estudo foi comparar mapas genômicos construídos para
os cromossomos 1 e 6 de búfalo de rio com os mapas correspondentes no genoma bovino e humano, evidenciando as
porções de conservação de sintenia entre esses cromossomos. As comparações entre os marcadores do cromossomo 1
de búfalo e a seqüência do genoma humano foi realizada a partir de 40 genes, os quais geraram oito blocos homólogos
de sintenia, revelando segmentos correspondentes nos cromossomos humanos 3, 4, 8 e 21. Destes oito blocos, cinco
apresentaram rearranjos na ordem dos genes e na orientação, dois revelaram conservação da ordem dos genes com
orientação do bloco invertida, e um bloco apresentou ordem e orientação conservadas. A comparação entre o mapa do
cromossomo 6 bubalino com a seqüência do genoma humano foi realizada a partir de 18 genes, revelando um bloco
homólogo de sintenia correspondente ao cromossomo humano 1 com rearranjos na ordem dos genes. As comparações
dos mapas de búfalo com a seqüência do genoma bovino revelou inversões dos marcadores ao longo dos cromossomos
homólogos 1, 27 e 3. Pela primeira vez foi possível comparar a ordem de genes dos cromossomos 1 e 6 do genoma
bubalino, corroborando a conservação de sintenia entre os cromossomos correspondentes no genoma bovino e humano,
porém com ordem diferente dos genes.
Bolsas: CAPES e CNPq.
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Análise da expressão gênica da miostatina
em músculo esquelético de gado nelore
(Bos indicus) e búfalos d’água
(Bubalus bubalis) por PCR em tempo real
Lima, NO; Reis, SP; Silva, A; Schneider, MPC; Gonçalves, EC
Laboratório de Polimorfismo de DNA, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará
[email protected]
Palavras-chave: PCR em tempo real, expressão gênica, Bos indicus, Bubalus bubalis
Tanto rebanhos bovinos (Bos indicus) quanto bubalinos (Bubalus bubalis) são amplamente utilizados como produtores
de carne, sendo de elevada importância para a pecuária nacional. Entretanto, há grande variação na qualidade da carne,
tanto entre indivíduos como entre espécies. Apesar do grande número de pesquisas buscando compreender a influência
das características dos músculos nas propriedades da carne, principalmente maciez e sabor, esta variabilidade ainda não
é totalmente compreendida. Considerando o componente genético, estudos envolvendo a análise da expressão de genes
que atuam na formação da musculatura esquelética são de extrema relevância para o avanço nas pesquisas que visam o
melhoramento genético animal e o controle de qualidade, em atendimento aos requerimentos do mercado consumidor.
Neste sentido, o objetivo desta pesquisa foi comparar a expressão do gene da miostatina, um importante regulador
negativo muscular, na musculatura esquelética de uma raça de bovino e uma de bubalino. Para isso, foram utilizadas
duas amostras de músculo semitendinosus de bovinos da raça nelore e de búfalos da raça Murrah para extração de RNA
total e síntese de cDNA. As reações de PCR em tempo real foram realizadas utilizando o ABI PRISM 7500 Real Time
PCR System, usando a molécula fluorescente SYBR Green como sistema de detecção e gerando uma curva de dissociação
para detecção de amplificações inespecíficas e dímeros de iniciadores. Foi empregado o método de quantificação relativa
(2-ΔΔCt) utilizando-se o gene da microglobulina como controle endógeno e a amostra bovina como calibradora. Os
iniciadores foram padronizados a 400 nM e as eficiências de amplificação dos genes mostraram-se similares. Não foi
observada amplificação de produtos inespecíficos. Os valores de Ct da miostatina e microglobulina para bovinos foram
28,4 e 30,46 e para búfalos 31,1 e 38,8 respectivamente. Já os valores de ΔCt (Ct alvo – Ct controle endógeno) foram de -2,046
para bovinos e -7,616 para búfalos, com o ΔΔCt (ΔCt alvo – ΔCt calibrador) igual a -5,63. Assim, o gene da miostatina
mostrou-se 49,52 vezes mais expresso nas amostras de búfalos do que nas de bovinos (Log 49,5 = 1,69). Embora haja a
necessidade de análises de uma maior número de genes, estes dados permitiram traçar um perfil preliminar da expressão
da miostatina nas espécies estudadas, fornecendo subsídios para o entendimento das bases moleculares das diferenças
fenotípicas encontradas entre as espécies.
Fonte financiadora: PRONEX, FUNTEC/SECTAM, CNPq.
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Mapeamento físico e comparativo do
cromossomo 14 bubalino (Bubalus bubalis)
com painel de células híbridas irradiadas
Galvão, SR1; Mariani, P2; Williams, JL2; Womack, JE3; Amaral, MEJ3,4; Caetano, AR1
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia Parque Estação Biológica, Final Av. W/5 Norte, Brasília - DF
2
Parque Tecnológico Padano, Via Einstein, Polo Universitario, Lodi 26900, Itália
3
Departamento de Patobiologia Veterinária, Texas A&M University, College Station, TX 77843, EUA
4
Dept. Biologia, IBILCE, UNESP – Universidade Estadual de São Paulo, São Jose Rio Preto, SP
[email protected]
1
Palavras-chave: Búfalo, Mapa RH, Mapa Físico
O desenvolvimento de ferramentas genômicas e a geração de informações moleculares para o búfalo (Bubalus bubalis)
ainda estão em uma fase inicial em relação a outras espécies de interesse zootécnico. Esse trabalho será de grande
importância para a condução de estudos para identificação das bases genéticas e mecanismos moleculares que resultam
em diferenças significativas entre bubalinos e bovinos, tanto na fisiologia quanto na qualidade e composição da carne
e leite. Possibilitará também a geração de soluções inovadoras para aumentar a produtividade e saúde dos rebanhos, e
também da qualidade e segurança de produtos derivados. A ferramenta genômica de última geração para construção
de mapas físicos é o painel de células somáticas híbridas irradiadas (Painel RH), pois não requer a geração de famílias
segregantes e permite o mapeamento de marcadores de baixo polimorfismo intraespecífico/intraracial, permitindo
assim a utilização de marcadores derivados de seqüências gênicas conservadas entre espécies e úteis para mapeamento
comparativo. Em uma colaboração entre o Centro de Biotecnologia Animal e Genômica da Universidade Texas A&M
e o Laboratório de Genômica Comparativa do IBILCE-UNESP, foi produzido um Painel RH de Búfalo, composto de
90 linhagens celulares. Recentemente, um consócio internacional foi então estabelecido para a construção de um mapa
RH bubalino de primeira geração. No presente estudo, foram testadas condições de amplificação para 79 marcadores
derivados de genes do cromossomo bovino BTA13, o qual possui alto grau de sintenia com o cromossomo bubalino
BBU14, conforme demonstrado em estudos citogenéticos previamente publicados. Condições ideais de amplificação
foram obtidas para um total de 37 marcadores, os quais foram testados no mínimo duas vezes em todas as linhagens
do Painel para minimizar a ocorrência de resultados falsos positivos ou negativos. O software Carthagene foi utilizado
para analisar os dados e gerar o mapa. Marcadores com LOD dois pontos < 3 foram excluídos da análise final. O mapa
produzido contém um total de 26 marcadores, com taxa de retenção média de 5,9%. O mapa RH gerado foi ancorado
ao mapa citogenético bubalino e a localização dos genes mapeados em 2 mapas bovinos (RH 2ª geração e Sequência
Genômica v3.1) foi utilizada para construção do mapa comparativo. O resultado obtido mostrou uma alta conservação
sintênica entre os cromossomos BTA13 e BBU14, como esperado. Mais marcadores estão sendo adicionados ao mapa,
o que permitirá uma melhor cobertura do cromossomo e uma análise mais robusta.
Apoio financeiro: CNPq e Embrapa.
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Interação genótipo-ambiente em características
de crescimento de bovinos da raça nelore
criados nos estados de Goiás e São Paulo
Guidolin, DGF1,5; Buzanskas, ME1,6, Paz, CCP2; Lôbo, RB3, Bezerra, LAF4.; Oliveira, JA1; Munari, DP1
UNESP, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Departamento de Ciências Exatas, Jaboticabal, SP
2
APTA/SAA, Ribeirão Preto, SP
3
Associação Nacional de Criadores e Pesquisadores (ANCP), Ribeirão Preto, SP
4
Departamento de Genética, FMRP/USP, Ribeirão Preto, SP
[email protected]
1
Palavra-chave: Interação genótipo-ambiente; desempenho; bovino de corte; Nelore; crescimento
Em programas de avaliação genética é comum a inclusão de rebanhos oriundos de extensas áreas geográficas, onde os
fatores climáticos, nutricionais e de manejo são distintos. Nessas condições, é necessário o estudo da interação genótipoambiente para avaliar as diferenças entre animais de um ambiente de produção para outro. Assim, o objetivo deste
trabalho foi estudar o efeito da interação genótipo-ambiente sobre a classificação de touros da raça Nelore, nos estados
de Goiás e São Paulo. Foram utilizados dados de animais participantes do Programa de Melhoramento Genético da
Raça Nelore (PMGRN-Nelore Brasil), mantido pela ANCP. Utilizou-se 7588 e 6928 dados de pesos corporais aos 365
(P365) e aos 450 (P450) dias de idade, respectivamente, de animais nascidos entre os anos de 1986 a 2006. Análises
preliminares, utilizando o método dos quadrados mínimos, auxiliaram na definição dos efeitos ambientais considerados
no modelo de análise. Em cada estado, os animais foram distribuídos em grupos de contemporâneos (GC) que incluíram
ano e estação de nascimento do animal, sexo, fazenda e lote de manejo. As estimativas de parâmetros genéticos foram
realizadas pelo método da máxima verossimilhança restrita, utilizando um modelo animal uni-característica por estado,
que incluiu o efeito fixo de GC e os efeitos aleatórios de animal e residual. Os touros com pelo menos oito filhos foram
classificados com base nos seus valores genéticos por estado. Estimativas de correlações de Spearman entre as classificações
dos touros pelo valor genético foram utilizadas para avaliar o efeito da interação genótipo-ambiente. Para esta análise
foram utilizados 25 e 21 touros, presentes em ambos os estados, para P365 e P450, respectivamente. As estimativas de
herdabilidade para P365 e P450 foram, respectivamente, 0,62±0,052 e 0,50±0,058 para os dados de Goiás e 0,20±0,072
e 0,14±0,07 em São Paulo. As correlações entre a classificação dos touros foram não significativas (P>0,05), indicando
que houve interação genótipo-ambiente para ambas as características, o que sugere haver possibilidade de que animais
selecionados pelo mérito genético superior para um estado não o serem para outro.
Apoio Financeiro: Capes5 e CNPq6 (Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento Animal, FCAV/UNESP)
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Associação entre SNPs e maciez de carne
na raça nelore
Pinto LFB1; Ferraz JBS1; Balieiro JCC1; Eler JP1; Meirelles FV1; Silva SL1; Rezende FM1; Bonin MN1; Tarouco JU1; Oliveira ECM1
Departamento de Ciências Básicas – FZEA/USP
[email protected]
1
Palavras-chave: Bovinos, Calpaína, Calpastatina, Desequilíbrio de ligação, Qualidade de Carne
Para avaliar maciez de carne é necessário abater os animais, logo, trata-se de uma característica de difícil avaliação. Este
aspecto tem implicado em incessante busca de marcadores moleculares que estejam associados a esta característica para
facilitar o processo de seleção. Portanto, o presente estudo teve por objetivo testar associações entre três marcadores
SNPs (CAPN4751, UOGCAST1 e WSUCALP) e maciez de carne em animais da raça Nelore. Foram utilizados dados
de 468 machos não castrados, criados em pastagem até cerca de 18 meses de idade e então confinados até o abate entre
22 e 26 meses. Foram colet adas amostras do músculo Longissimus dorsi entre a 12ª e 13ª costela, as quais foram
avaliadas após 7, 14 e 21 dias de maturação a 2°C. Para determinar a maciez utilizou-se o método de mensurar a
força de cisalhamento com aparelho Warner Braztler Shear Force. Foi utilizado o teste razão de verossimilhança entre o
modelo reduzido ij i ij Y = m + GC + e, onde ij Y é o valor fenotípico, m é a média geral, i GC é o efeito fixo de grupo de
contemporâneo, e ij e é o resíduo aleatório. Para testar efeito aditivo utilizou-se o modelo completo ij i ij ij Y = m + GC +
b (A) + e onde A é o efeito aditivo associado ao coeficiente ij b, enquanto para testar o efeito de dominância utilizou-se
o modelo ij i j ij ij Y = m +GC + T + l (D) + e, onde D é o desvio de dominância associado ao coeficiente ij l. O marcador
CAPN4751 está presente no gene da calpaína e aqui foi associado à maciez de carne nos três tempos de maturação
avaliados. O genótipo C/C exigiu sempre menor força para rompimento das fibras musculares que o genótipo T/T.
A freqüência do alelo C foi igual a 33,8 %, porém apenas 17 animais apresentaram o genótipo C/C. O marcador
UOGCAST1 está presente no gene da calpastatina e foi associado à maciez de carne maturada com 14 e 21 dias. O
genótipo C/C (observado em 189 animais) foi sempre mais favorável que o G/G para maciez e a freqüência do alelo
C foi igual a 64,7%. O marcador WSUCALP também está localizado no gene da calpastatina e aqui foi associado à
maciez de carne apenas na mensuração feita 14 dias post mortem. Neste caso o genótipo T/T (observado em 187 animais)
foi mais favorável que o C/C e a freqüência do alelo T foi igual a 64,2 %. Apenas o CAPN4751 apresentou efeito de
dominância significativo e os percentuais de variância residual explicados foram geralmente reduzidos, variando de
0,92 % até 2,40 %. Todos as associações aqui encontradas podem ser utilizadas como fonte de informação na seleção,
porém ainda é necessário testar possíveis interações entre esses marcadores, para concluir sobre o verdadeiro potencial
de utilização na raça Nelore.
Apoio Financeiro: MERIAL e FAPESP.
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Análises de seqüências STR na
determinação do vínculo genético em
animais da raça nelore
Reis, RL1; Pedrosa, ER3; Souto, R4; da Cruz, AD5, Carvalhêdo, AS6; Borges, FR2
Departamento de Biologia, Núcleo de Pesquisas Replicon- Universidade Católica de Goiás- UCGárea IV Bloco L Av. Universitária, 1069, Goiânia-GO CPE: 74605-010
2
Biólogo, Doutorando - UNB, Departamento de Biologia-UCG, Lagene- SES-GO
3
Biomédico, Núcleo de Pesquisas Replicon- UCG
4
Biomédico, Lab. Genectis Center, Lagene- SES-GO
5
Doutor, Departamento de Biologia- UCG, Núcleo de Pesquisas Replicon, Lagene- SES-GO
6
Veterinário, Embriotec, Universidade Paulista- UNIP
[email protected]
1
Palavras-Chave: Genetic link, STR, Tipagem Sanguínea, Nelore, PCR- multiplex
O presente estudo teve como objetivo principal a análise de seqüências STR para a identificação do vínculo genético
em animais da raça nelore. Realizando um comparativo entre a técnica de tipagem sanguínea e o teste através de DNA
utilizando PRC-multiplex. O estudo envolveu a análise de 16 trios (Touro, Matriz, Prole) devidamente certificados pelo
sistema de tipagem. A análise das seqüências foram feitas utilizando 12 marcadores dos quais 10 são os recomendados
pela ISAG. (TGLA 57; TGLA 122; TGLA126; TGLA 227; BM1818; BM 2113; BM 1824; INRA 23; SPS 115;
ETH 10; ETH225. Dos 16 trios analisados, 3 trios tiveram a exclusão de 6 alelos do Touro e 1 trio excluiu em 8 alelos
o Touro e o outro trio em 7 alelos o Touro. A amplificação dos marcadores foram eficientes em 100% dos animais
analisados. Podemos concluir que o sistema STR desenvolvido pela Empresa BIOCOD-LINHAGEN (BH), mostrouse altamente eficiente para a resolução de casos de erro na paternidade onde os métodos tradicionais como tipagem
sanguínea não foi possível.
Apoio financiero: PROPE/UCG.
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Construção de uma biblioteca genômica
tipo BAC de nelore (Bos taurus indicus)
de Campos, TA1; Merighe, GKF2; Amaral, MEJ3; Meirelles, FV2; Caetano, AR1
Embrapa – Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF
Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, USP, Pirassununga, SP
3
Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, UNESP, S. J. Rio Preto, SP
1
2
Palavras-chave: Biblioteca Genômica, BAC, Nelore, Bos taurus indicus, Cromossomo artificial de bactéria
Nos últimos anos, grandes avanços foram realizados em pesquisas genômicas de bovinos, principalmente de raças
européias (grupo Bos taurus taurus). Apesar destas informações constituírem ferramentas úteis para o estudos
genéticos, e do genoma bovino em geral, o desenvolvimento de ferramentas específicas para o estudo de raças zebuínas
(Bos taurus indicus) é de grande importância,pois este grupo constitui grande parte da base genética do rebanho brasileiro.
Com a finalidade de desenvolver uma ferramenta para estudos do genoma zebuíno, iniciamos a construção de uma
biblioteca genômica tipo BAC (Bacterial Artificial Chromosome) de um touro Nelore. Na etapa atual de trabalho,
foram estabelecidos parâmetros necessários para a obtenção de alta eficiência de clonagem de grandes insertos (100Kb
– 200Kb) em vetor BAC. Para esta finalidade, o DNA de um touro Nelore POI (Puro de Origem por Importação) foi
extraído a partir de plugs de agarose contendo 108 fibroblastos obtidos a partir de uma cultura celular. Após a extração,
o DNA foi submetido à eletroforese de campo pulsado em gel de 1% de agarose por 20 horas em um aparelho CHEFF
DR II (Biorad) para retirada do DNA mitocondrial e de outras substâncias inibidoras do processo de clonagem. Os
plugs foram removidos do gel e submetidos à digestão parcial com EcoRI para a obtenção de insertos de 150-200Kb.
Após a digestão, o DNA foi fracionado através de eletroforese em campo pulsado de 3 etapas: i) 2V/cm, 15s de pulso,
15 horas, 14ºC, com a corrente elétrica levando o DNA para o topo do gel; ii) mesmas condições anteriores com inversão
da corrente elétrica e iii) 40 horas; 3V/cm; 0,1 – 40 segundos de pulso; 14ºC. Esta eletroforese de 3 etapas retirou
pequenos fragmentos de DNA que poderiam co-migrar com fragmentos de alto peso molecular e, assim, interferir
negativamente na obtenção de clones portadores de grandes insertos. A região do gel contendo 150- 200Kb foi excisada
do gel, e os fragmentos foram extraídos do gel. Após a obtenção dos insertos, foram realizadas a ligação ao vetor PCC1
BAC e a transformação em Escherichia coli EPI 300 (Epicentre). Diferentes concentrações de inserto e vetor na reação
de ligação, além de diferentes condições de eletroporação foram testadas para obtenção da maior eficiência de clonagem.
A maior eficiência de clonagem obtida foi de 1000 clones/2µL de reação de ligação, com condições que serão utilizadas
para a finalização da biblioteca genômica tipo BAC de B. taurus indicus com cobertura de 5X do genoma do animal
(aproximadamente 100mil clones).
Fontes de financiamento: CNPq, Embrapa.
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Parâmetros genéticos e fenotípicos de
produtividade acumulada e intervalo entre
partos em bovinos da raça nelore
Grossi, DA1; Berton, MP2; Venturini, GC3; Paz, CCP4; Bezerra, LAF5; Lôbo, RB6; Munari, DP7
Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento Animal, Curso de Doutorado, FCAV/UNESP, Bolsista FAPESP
2
Acadêmica do Curso de Zootecnia, FCAV/UNESP, Bolsista FAPESP
3
Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento Animal, Curso de Mestrado, FCAV/UNESP, Bolsista CNPq
4
APTA/SAA – Ribeirão Preto/SP
5
Departamento de Genética, FMRP/USP
6
ANCP- Ribeirão Preto/SP
7
Departamento de Ciências Exatas, FCAV/UNESP
[email protected]
1
Palavras-Chave: bovinos de corte, características reprodutivas, herdabilidade, intervalo de partos
Foram analisados dados de 5724 fêmeas da raça Nelore nascidas de 1973 a 2002, pertencentes a 22 fazendas do estado de
São Paulo, participantes do Programa de Melhoramento Genético da Raça Nelore (PMGRN/Nelore Brasil). O objetivo
foi avaliar a associação genética entre produtividade acumulada (PAC) e primeiro e segundo intervalo entre partos
(IEP1 e IEP2, respectivamente), visando propor subsídios para seleção de bovinos de corte. Todas as fêmeas consideradas
continham dados de PAC e IEP1. Na estruturação dos dados, foram excluídas fêmeas que não possuíam pai e mãe
conhecidos, número de fazenda atual ou data de nascimento e observações de qualquer dos intervalos entre partos que
estivessem abaixo de 330 e acima de 750 dias. Análises pelo método dos quadrados mínimos auxiliaram na definição dos
efeitos ambientais considerados nas análises dos componentes de variância. Assim, o grupo de contemporâneos (GC)
de PAC foi formado por animais da mesma fazenda, nascidos no mesmo ano e estação e os GC de IEP1 e IEP2 foram
compostos por animais da mesma fazenda atual e nascidos no mesmo ano. Foram excluídos dos arquivos os GC com
menos de quatro observações por característica e pais com menos de três filhos em cada variável. O arquivo final resultou
em 2641, 2642 e 1437 animais com observações de PAC, IEP1 e IEP2, com médias de 146,0±28,1 kg, 474,6±113,5
dias e 449,9±110,6 dias, respectivamente. Utilizou-se o método de máxima verossimilhança restrita (REML) sob modelo
animal para estimar parâmetros genéticos, fenotípicos e ambientais em análises bi-característica de PAC com IEP1 e IEP2.
Os modelos incluíram efeitos aleatórios aditivo direto e residual. No modelo para PAC, foram considerados os efeitos
fixos de GC e o peso do animal à desmama como co-variável linear de primeiro grau e no modelo de IEP1 e IEP2, o
efeito fixo de GC e de estação de nascimento do parto anterior e do parto atual. As estimativas de herdabilidade para
PAC, IEP1 e IEP2 foram de 0,12 (média), 0,02 e 0,02, respectivamente. Essas estimativas indicaram que a PAC possui
variabilidade genética aditiva suficiente para incluí-la nos programas de avaliação genética e que o IEP1 e IEP2 não
respondem a seleção. As correlações genéticas de PAC com IEP1, IEP2 foram -0,17 e -0,30 respectivamente. Portanto,
a seleção para PAC poderá ocasionar mudanças favoráveis em IEP1 e IEP2.
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Parâmetros genéticos de características
corporais associadas ao rendimento de
cortes comerciais na raça nelore
Tarouco, JU1; Silva, SL1; Pinto, LFB1; Ferraz, JBS1; Balieiro, JCC1; Eler, JP1; Oliveira, ECM1; Leme, PR1
Departamento de Ciências Básicas – FZEA/USP
[email protected]
1
Palavras-chave: Bovinos, Carne, Correlação, Gordura, Porção Comestível
A determinação do rendimento da porção comestível (PERPC) da carcaça de bovinos de corte é de grande importância
para produtores, industria e retalhistas. Essa característica pode ser estimada utilizando equações de predição, onde a
área de olho de lombo (AOLU), espessura de gordura subcutânea (EGSU) e espessura de gordura na picanha (EGPU),
avaliadas no animal vivo utilizando aparelho de ultra-som, aliadas ao peso vivo (PV550) são utilizados como fonte
de informação. Entretanto, pouco se sabe sobre as correlações genéticas entre as diferentes características, bem como
os coeficientes de herdabilidade, o que dificulta sua utilização em programas de melhoramento no Brasil. Portanto, o
objetivo do presente estudo foi estimar os coeficientes de herdabilidade e as correlações genéticas para AOLU, EGSU,
EGPU, PV550 e PERPC. Foram utilizados dados de 2620 tourinhos Nelore com média de idade de 547,0 ± 47,5 dias
e peso médio de 404,5 ± 50,7 kg. A PERPC foi estimada com a equação PERPC = Ø ,057 - (0,006 ) + 0,072AOLU
- (0,076EGSU - 0,192EGPU). O grupo de contemporâneo (GC) foi composto considerando-se a fazenda, ano de
nascimento e grupo de manejo ao sobreano, avaliado por mesmo técnico e equipamento. Grupos com progênies de
apenas um touro, menos que cinco registros por touro ou com nenhuma variabilidade foram excluídos do banco de
dados. Para determinação dos efeitos (variâncias) genéticos e ambientais foram realizadas análises bi-variadas utilizando
o peso aos 550 dias como característica âncora. A convergência foi assumida quando a variância do simplex atingiu
1 x 10-9 para cada análise e sem alteração nos seis primeiros decimais da função de verossimilhança, em duas fases
seguidas do processo iterativo. Os componentes de variância e os parâmetros genéticos foram estimados pelo método da
Máxima Verosimilhança Restrita livre de derivadas (DFREML), com o software MTDFREML, utilizando um modelo
que incluiu os efeitos fixos de grupo de contemporâneos (classe) e idade como (covariável) e os efeitos aleatórios de
animal e de resíduo. PV550, AOLU, EGSU, EFPU, PERPC apresentaram herdabilidades iguais a 0,41, 0,43, 0,38,
0,40, 0,36 e 0,47, respectivamente. Estes resultados indicam que há um substancial efeito genético aditivo e que o
progresso genético dessas características pode ser obtido através da seleção. O fato desses coeficientes de herdabilidade
serem superiores aos normalmente observados na literatura pode ser explicado pelo fato de não ter havido pressão de
seleção direta para essas características nos animais avaliados neste trabalho. A PERPC apresentou correlação genética
baixa e negativa com PV550 (-0,10), porém de alta magnitude com AOLU (0,70), EGSU (-0,71) e EGPU (-0,75),
logo, a seleção para aumento do percentual de porção comestível implicará, principalmente, na redução de gordura na
carcaça. Este fato merece atenção, pois na raça Nelore os percentuais de gordura já são reduzidos.
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Perfil da expressão do gene forebrain
embryonic zinc finger-like em células do
leite de vacas da raça Gir Leiteiro hígidas e
com mastite
Antunes, GR1*; Vasconcellos, RS2; Fonseca, I3; Carvalho, GC2; Guimarães, MFM3; Guimarães, SEF4
Universidade Federal de Juiz de Fora
Universidade Presidente Antônio Carlos - Juiz de Fora
3
Embrapa Gado de Leite
4
Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
1
2
Palavras-chave: expressão diferencial, FEZL, resposta imune, PCR em tempo real, melhoramento animal
A raça Gir Leiteiro (Bos indicus) é considerada uma das raças mais recomendadas para a produção de leite em áreas
tropicais principalmente pela capacidade de adaptação ao clima e por apresentar maior rusticidade que as raças de
clima temperado. Desta forma, as raças zebuínas e seus cruzamentos assumiram posição de destaque na composição
do rebanho bovino efetivo nacional, representando cerca de 80% deste (Ferreira et al., 2007). A mastite bovina é a
doença que mais se destaca dentre as doenças infecto-contagiosas na produção animal, sendo de grande importância
econômica por conta da diminuição da qualidade e quantidade de leite, descarte da produção, custos com tratamento
e até mesmo morte do animal. A doença é caracterizada pela resposta inflamatória da glândula mamária causada por
mudanças metabólicas e fisiológicas, traumas, ou, mais freqüentemente, por patógenos contagiosos ou ambientais
(Baizabal et al, 2006). A resposta de resistência à mastite é complexa e os genes envolvidos na resposta imune têm
sido apontados como fortes candidatos à resistência (Alluwaimi et al., 2003). A partir de dados de correlação genética,
mapeamento fino, seqüenciamento e expressão gênica, identificou-se o gene FEZL (forebrain embryonic zinc-finger-like)
como candidato ao fenótipo de resistência/susceptibilidade, sendo a expressão deste maior em vacas com mastite do
que em vacas hígidas (Sugimoto et al., 2006). Com isto, o objetivo deste trabalho foi avaliar o perfil de expressão do
gene FEZL em células do leite de vacas da raça Gir Leiteiro por meio da técnica de PCR quantitativo em tempo real
(qPCR). Foram coletadas amostras de leite de seis animais, sendo três com mastite e três sem mastite. O RNA total
extraído a partir de células presentes no leite de cada animal foi utilizado na confecção da primeira fita de cDNA e
as reações de qPCR foram realizadas usando-se o gene rRNA 18S como controle endógeno. Os dados gerados foram
analisados pelo software REST© (Pfaffl et al, 2002). A expressão do gene FEZL foi 18,65 vezes maior nas vacas com
mastite em comparação às vacas hígidas (p<0,001), corroborando os resultados obtidos por Sugimoto et al. (2006). Este
resultado sugere que este gene tem um papel importante nos mecanismos de resistência à mastite bovina, podendo ser
um candidato para estudos que tenham como objetivo o isolamento de genes de resistência à mastite, para ser usado
em programas de melhoramento animal assistido por marcadores.
Apoio Financeiro: Fapemig.
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Identificação de novos alelos
microssatélites na raça Gir
Azevedo, ALS1,2; Gomez, AL1,2; Gasparini, K1; Campos, AL1; Domingues, R1; Vieira TR1; Mendonça, PRF1; Guimarães, SEF 2;
Peixoto, MGCD1; Verneque, RS1; Regitano, LCA3; Machado, MA1
1
Embrapa Gado de Leite, Juiz de Fora, MG
Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG. 3Embrapa Pecuária Sudeste, São Carlos, São Paulo
[email protected]
2
Palavras-chave: marcadores moleculares; SSR, bovino; Bos indicus
Estudos arqueológicos e de miDNA comprovam que os bovinos taurinos e zebuínos foram domesticados em duas
regiões distintas e divergiram há mais de 610.000 anos. É possível verificar, como conseqüência desse processo, grandes
diferenças entre estas subespécies, tanto para características fenotípicas como adaptação ao ambiente tropical e também
a nível genômico. O grande avanço das técnicas moleculares nos últimos anos possibilitou identificar e catalogar essa
grande diversidade genômica existente entre taurinos e zebuínos, por meio da formação de bancos de dados com
informação de diversos tipos de marcadores e sequências de DNA. O USDA (United States Department of Agriculture)
disponibiliza um mapa de ligação bovino altamente saturado com informações sobre os marcadores (número de alelos,
tamanho dos alelos e heterozigosidade). Esse mapa baseia-se em trabalhos que utilizaram diferentes raças de bovinos,
na grande maioria taurinas (Gelbvieh, Simmental, Piedmontese, Longhorn, Hereford, Angus) sendo que apenas duas
raças zebuínas foram utilizadas (Brahman, Nellore). Dada a grande diferença existente entre essas duas subespécies,
espera-se encontrar características distintas para esses marcadores em rebanhos zebuínos, já que poucos animais foram
avaliados para a formação do mapa de referência do USDA. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi identificar, na
raça Gir, novos alelos para marcadores moleculares localizados em toda extensão do genoma bovino. Para isso, foram
utilizadas 27 fêmeas Gir que foram genotipadas com 142 marcadores microssatélites. As amostras foram amplificadas
pela técnica de PCR, e os produtos foram detectados por eletroforese capilar no equipamento MegaBACE 1000. Foi
calculado, para cada um dos marcadores, a heterozigosidade esperada (HE) e conteúdo de informação polimórfica (PIC).
Os valores médios de HE (0,69), de PIC (0,63) e do número de alelos (6) podem ser considerados altos, demonstrando
que esses marcadores são altamente informativos mesmos dentro de pequenas populações. O marcador IOBT959 foi o
que apresentou os maiores valores para HE (0,87), PIC (0,90) e número de alelos (14). Apenas 28 marcadores (20%),
apresentaram PIC inferior a 0,5, indicando que a maioria dos marcadores são altamente polimórficos. Foi possível identificar
40 novos alelos que apresentavam tamanho em pares de base fora da faixa indicada no mapa de referência do USDA. Foram
encontrados alelos bem distantes do tamanho máximo pré-determinado para os marcadores DIK553 (60 pb) e MNB88
(42pb). Os demais alelos identificados estavam, em média, a 8 pares de bases do tamanho esperado. A identificação de
novos alelos dentro de uma população de animais zebuínos reforça a necessidade de um maior conhecimento molecular
para essas raças, uma vez que o rebanho bovino brasileiro é constituído, na sua maioria, por raças zebuínas. A escassez
de conhecimento a respeito dessa diversidade genômica pode comprometer, ou reduzir a confiabilidade, na utilização de
marcadores para seleção assistida por marcadores e também na realização de testes de paternidade.
Apoio financeiro: FAPEMIG/CNPq/Embrapa Gado de Leite.
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Análise das freqüências alélicas e
genotípicas do polimorfismo LEP/Kpn2I em
bovinos de corte
Moura, WC1; Siqueira, F2; Torres Junior, RAA2; Regitano, LCA3; Alencar, MM4;
Silva, LOC2;Feijó,GLD2; Carvalho, TD2; Machado, COF5
Ciências Biológicas, Universidade para o Desenvolvimento do Estado e da Região do Pantanal, Campo Grande/MS
2
Melhoramento Genético Animal, Embrapa Gado de Corte, Campo Grande/MS
3
Genética Molecular Animal, Embrapa Pecuária Sudeste, São Carlos/SP
4
Melhoramento Genético Animal, Embrapa Pecuária Sudeste, São Carlos/SP
5
Ciências Biológicas, Universidade Federal do Mato Grosso do Sul, Campo Grande/MS
[email protected]
1
Palavras-chave: bovinos, melhoramento genético, seleção assistida por marcadores, leptina, freqüências alélicas
Embora seja o maior exportador de carne bovina no mundo, o Brasil não detém o maior faturamento, já que não
exporta para os mercados de maior valor agregado, pois, além das questões sanitárias a carne brasileira não é considerada
de boa qualidade. A maciez da carne, o grau de marmoreio, a cobertura de gordura da carcaça e a área do músculo
Longissimus dorsi são fatores relevantes na procura por qualidade e padronização. Em razão das várias raças disponíveis,
diversas estratégias podem ser usadas no sentido de adequar tipo de animal e ambiente para aumentar a produtividade e
melhorar a qualidade da carne. Uma delas é a utilização de cruzamentos Bos taurus e Bos indicus, resultando em animais
produtores de carne de boa qualidade em ambientes tropicais, como conseqüência da heterose, da complementaridade e
do efeito aditivo das raças. Com o rápido avanço dos estudos de fisiologia e de genômica, alguns dos fatores moleculares
envolvidos na fisiologia dessas características se tornaram conhecidos e, a partir disso, marcadores moleculares puderam
ser identificados. Até o momento, vários genes foram identificados como possíveis responsáveis pela qualidade de
carcaça e de carne em bovinos, como os genes: DGAT1, FABP3, GH1, LEP, TG, CAST e CAPN. A proteína leptina,
codificada pelo gene LEP, está associada com diversas características de interesse econômico, como capacidade de ingestão
alimentar, produção de leite e deposição de gordura na carcaça. Dados da literatura mostram que uma transição C/T
(arginina/cisteína) localizada no éxon 2 está estreitamente relacionada com deposição de gordura na carcaça. Neste
trabalho, foram avaliadas as diferenças de freqüências alélicas e genotípicas do polimorfismo LEP/Kpn2I entre raças
taurinas adaptadas (Bonsmara, Caracu e Senepol) e delas com a raça Nelore (zebuína) e Angus (taurina não adaptada)
em 124 touros escolhidos em centrais de inseminação e com o menor grau de parentesco possível. A genotipagem foi
realizada por PCR-RFLP e as freqüências alélicas e genotípicas foram comparadas utilizando o teste de Qui-quadrado.
O alelo favorável para deposição de gordura foi designado de T e o alelo desfavorável de C. As freqüências alélicas
variaram entre as raças, sendo que dos 26 touros Nelore avaliados apenas dois apresentaram o alelo T (3,9%). Esse alelo
também está presente nas raças taurinas adaptadas (Bonsmara 58,0%, Caracu 62,0%, Senepol 43,5%), assim como na
raça Angus (62,0%). Dessa forma, esse marcador poderá ser viável na seleção de animais taurinos, adaptados ou não,
já que a freqüência de média a alta observada na população em estudo permite que esse teste seja aplicado, desde que
confirmada a associação desse alelo com a característica. Essas informações poderão contribuir para o melhoramento
genético de bovinos de corte e para a seleção de animais com potencial para produção de carne de maior qualidade.
Apoio Financeiro: EMBRAPA e FUNDECT.
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Associação dos polimorfismos nos loci
da κ-caseína e da β-lactoglobulina com
parâmetros da produção leiteira na raça
Guzerá melhorada para leite
Carvalho, MRS1; Steinberg, RS1; Machado, MA2; Verneque, RS2; Teodoro, RL2; Sandes, SHC1; Peixoto, MGCD2
Departamento de Biologia Geral, Instituto de Ciências Biológicas - UFMG
2
Embrapa Gado de Leite - Juiz de Fora
[email protected]
1
Palavras–chave: seleção assistida por marcadores, κ-caseína, β-lactoglobulina, Zebu, núcleo MOET
Polimorfismos nos genes da κ-caseína e β-lactoglobulina foram descritos influenciando a variação em parâmetros de
produção de leite. O alelo B da κ-caseína é associado a aumentos na quantidade e na concentração de proteína no
leite, e no rendimento da produção de queijo. O alelo A da β-lactoglobulina está associado a aumentos na produção
de leite, no teor de proteína e redução na concentração de caseína enquanto o alelo B está associado a aumentos na
quantidade de caseínas e no rendimento da produção de queijo. Neste trabalho foram genotipados animais pertencentes
ao núcleo MOET Guzerá de seleção para leite com o intuito de validar a associação desses polimorfismos com traços
de produção leiteira. Em 169 animais genotipados, foi encontrado o alelo B na freqüência de 0,15, para a κ-caseína, e
0,80, para a β-lactoglobulina. A análise de variância utilizou dados de famílias de irmãos completos e meio-irmãos dos
reprodutores do núcleo MOET, sob modelo de substituição gênica. Os resultados sugerem a associação do polimorfismo
da κ-caseína com os valores genéticos para produção de leite, gordura e proteína, com efeito superior do genótipo AA
sobre o AB (p<0,0001). Não foi detectada associação do polimorfismo da β-lactoglobulina com os valores genéticos
para as características estudadas.
Orgão financiador: FAPEMIG, CNPQ, PRODETAB, PRONEX.
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Identificação de SNPs no gene DDEF1 bovino
Veneroni, GB1; Meirelles, SL2; Gouveia, JJS1; Santiago, AC3; Oliveira, HN4; Alencar, MM5; Regitano, LCA5
Programa de pós graduação em Genética e Evolução – UFSCAR
Departamento de Genética e Melhoramento Animal - UNESP Jaboticabal/SP
3
Graduanda em Ciências Biológicas, UNICEP
4
Departamento de Melhoramento e Nutrição Animal - UNESP Botucatu/SP
5
Embrapa Pecuária Sudeste - São Carlos/SP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: SNP, gene DDEF1, raça Canchim, espessura de gordura, marcador molecular
A raça Canchim foi criada objetivando a produção de carne de melhor qualidade nas condições brasileiras e, tem sido
muito utilizada em cruzamentos. Padrões específicos de algumas características da carcaça como, por exemplo, de espessura
de gordura, contribuem para a manutenção da qualidade da carne. A raça Canchim produz carcaças com espessura de
gordura inferior ao desejável pelo mercado, necessitando assim de estudos que visem auxiliar o melhoramento dessa
característica. Os marcadores moleculares surgem nesse contexto como uma possibilidade de auxiliar o melhoramento
tradicional. O BTA14 possui relatos de QTLs para espessura de gordura, motivando o estudo de genes candidatos
a influenciar a deposição de gordura nessa região do genoma dos bovinos. Um dos genes encontrados nessa região e
que foi relacionado à adipogênese é o DDEF1. Este trabalho teve por objetivos a identificação de polimorfismos em
parte do domínio P H centaurina do gene DDEF1. Foram calculados os valorers genéticos de 113 touros, pais de uma
população de meio-irmãos constituída de 1193 animais. Procedeu-se a escolhida de 6 touros com maior valor genético
e maior acurácia e 6 touros com menor valor genético e maior acurácia. O DNA desses 12 touros foi utilizado em
reações de sequenciamento do domínio P H centaurina do gene DDEF1, que foi dividido em 5 amplicons devido ao
grande distanciamento dos exons codificadores desse domínio. No entanto, até o momento apenas as análises de 3
desses amplicons foram finalizadas. Os sequenciamentos foram realizados em um seqüenciador ABI Prism 3100 Avant
(Applied Biosystems). Os eletroferogramas gerados pelo seqüenciador foram submetidos ao programa de base calling
Phred. Em seguida tais seqüências foram submetidas ao programa de montagem Phrap. A visualização das seqüências
geradas foi realizada através do programa Consed, onde foi possível a observação dos SNPs. Esta metodologia permitiu
identificação de polimorfismos somente em indivíduos heterozigotos para o SNP. Para identificação de polimorfismos
entre indivíduos homozigotos submeteu-se as seqüências consenso ao programa CLUSTAL W. Foram identificados
10 polimorfismos no amplicon RP1, 8 no RP2 e 9 no RP3. As seqüências consenso obtidas foram comparadas as
depositadas no banco de SNPs do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_blastByOrg.cgi). Tendo-se verificado
que os polimorfismos identificados nesse trabalho não estão depositados naquele banco de dados.
Apoio financeiro: Embrapa, CNPq, FAPESP.
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Varredura dos cromossomos 24 e 29 em uma
população F2 de bovinos (Gir x Holandês)
no mapeamento de QTL para resistência a
parasitas e características de crescimento
Cervini, M1; Machado, MA3; Verneque, RS3; Teodoro, RL3; Campos, AL3; Regitano, LCA2
Universidade Federal de São Carlos
Embrapa Pecuária Sudeste, São Carlos, SP, Brasil
3
Embrapa Gado de Leite, Juiz de Fora, MG, Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: QTL, carrapato, mapeamento, bovino, melhoramento
A utilização de metodologias moleculares no melhoramento animal apresenta grande potencial para incrementar o
ganho na seleção de várias características de valor comercial no rebanho mundial. Esse conhecimento pode ser aplicado,
tanto no manejo adequado de cruzamentos de animais quanto na seleção. A identificação de regiões do DNA que
controlam uma parte da variação de características quantitativas (QTL, Quantitative Trait Loci) que possuam interesse
econômico é uma etapa importante para o desenvolvimento de estratégias de seleção assistida por marcadores. Dentre
esses fenótipos de variação quantitativa, podemos apontar: características de crescimento, medidas por meio do peso
corporal, e a resistência à parasitas, como o carrapato (Rhipicephalus (Boophilus) microplus), o qual é responsável, direta
ou indiretamente, por perdas anuais que giram em torno de 1 bilhão de dólares só no Brasil. A identificação de QTLs
para características de crescimento e resistência ao carrapato poderá auxiliar em estudos posteriores de identificação de
marcadores moleculares em gene(s) específico(s), os quais poderão ser informativos na identificação de animais com maior
valor genético para essas características. Dessa forma, esse trabalho tem como objetivo mapear QTLs para características
de crescimento e resistência a carrapatos nos cromossomos 24 e 29, utilizando marcadores do tipo microssatélites em
uma população F2 Gir x Holandês. Os valores fenotípicos de contagem de carrapato e medidas de peso ao nascimento,
peso a desmama, peso aos 180 dias e peso aos 365 dias foram coletados em 370 animais F2. Os genótipos para 12
marcadores, cobrindo os cromossomos 24 e 29, foram determinados para as três gerações. O mapeamento de possíveis
QTLs está sendo realizado por análise de intervalos com o auxílio dos softwares CRI-MAP e QTL Express.
Apoio financeiro: Prodetab Embrapa.
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Análise de transcritos relacionados ao
processo de cavitação em embriões bovinos
da raça Gir produzidos in vivo e in vitro
Wohlres-Viana, S1; Boité, MC2; Viana, JHM3; Machado, MA1,3; Camargo, LSA3
Universidade Federal de Juiz de Fora, Juiz de Fora, MG
2
Universidade Federal Fluminense, Niterói, RJ
3
Embrapa Gado de Leite, Juiz de Fora, MG
[email protected]
1
Palavras-chave: Blastocisto, Criopreservação, RT-PCR, Expressão gênica, Blastocele
A maioria do gado brasileiro é de origem zebuína e apresenta um melhor desempenho reprodutivo do que gado taurino
em ambiente tropical, provavelmente pela adaptação evolutiva desta subespécie. Biotecnologias reprodutivas, como
a transferência de embriões (TE) e produção in vitro (PIV) de embriões, têm sido utilizadas nestas raças visando a
multiplicação dos animais de elevado valor comercial. Apesar da ampla adoção destas biotecnologias, existem diferenças
entre embriões produzidos in vitro (PIV) e in vivo (TE) que envolvem aspectos morfológicos e genéticos. Diversos
transcritos de RNAm podem estar envolvidos no desenvolvimento pré-implantação, com influência na qualidade
embrionária. O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão dos transcritos para AQP3 (aquaporina 3) e ATPase-α1
(Na/K-ATPase alfa 1) em blastocistos produzidos in vivo e in vitro a partir de animais zebuínos da raça Gir. Uma vez que
estes genes têm sido relacionados com o processo de cavitação e formação da blastocele, podem implicar em diferenças
na viabilidade pós-criopreservação observada entre embriões de TE e PIV. Foram utilizados 15 blastocistos, divididos
em três pools para extração do RNA, para cada grupo (in vivo e in vitro). Após a extração, foi realizada a amplificação
do RNA e a transcrição reversa. O cDNA obtido foi submetido a PCR em Tempo-Real (RT-PCR), utilizando o gene
H2a como controle endógeno, para a subsequente análise da expressão pelo software REST®. A quantificação relativa dos
genes AQP3 (0,81 ± 0,31) e ATPase-α1 (1,20 ± 0,65) nos grupos in vitro em relação aos grupos in vivo não apresentou
diferença significativa (P>0,05). Com base nestes resultados podemos concluir que estes genes não apresentam variações
em sua expressão cuja magnitude seja suficiente para explicar as diferenças encontradas nas taxas sobrevivência póscriopreservação, sendo necessária a análise de outros transcritos para identificar as possíveis fontes de variação.
Apoio financeiro: CNPq, Fapemig.
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Clonagem e expressão dos hormônios
ovarianos GDF-9 e BMP-15 de bovino
em E. coli para produção de anticorpos
policlonais em coelhos
Dias, LO¹,²; Franco, MM¹; Melo, EO¹
¹Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
²UnB – Universidade de Brasília
[email protected]
Palavras-chave: GDF-9, BMP-15
O desenvolvimento folicular e a taxa de ovulação são determinados por uma complexa troca de sinais endócrinos,
parácrinos e autócrinos envolvendo o ovócito e as células somáticas adjacentes. Dentre os fatores secretados pelo
ovócito, com efeito parácrino sobre as células somáticas do folículo, podemos destacar os hormônios GDF-9
(“Growth Differentiantion Factor-9”) e BMP-15 (“Bone Morphogenetic Protein-15”). Nesse trabalho foram gerados
anticorpos policlonais contra regiões específicas das proteínas GDF-9 e BMP-15 que serão usados como ferramentas
para estudar a expressão e as funções desses hormônios em várias fases do desenvolvimento folicular. Foi escolhida
uma região não conservada entre os pré-peptídeos dos genes do GDF-9 e BMP-15 a fim de se evitar a possibilidade de
reação cruzada dos anticorpos contra os peptídeos maduros e a não expressão da pré-pro-proteína devido à questões de
códon-usage. Para a clonagem das seqüências dos genes de bovino, ovócitos de ovários obtidos em abatedouros foram
submetidos à extração de RNA total com o reagente Trizol (Invitrogen). A partir do RNA total foram sintetizados os
cDNAs por meio da enzima transcriptase reversa (Superscript II – Invitrogen). Os cDNAs foram usados como molde
para amplificação, por PCR, das seqüências específicas. Os fragmentos amplificados foram clonados no vetor pGEMTeasy (Promega) e posteriormente no vetor pET21 (Novagen) para expressão em bactérias E. coli da cepa BL21. Todas
as construções foram confirmadas quanto a sua integridade, e fase de leitura por sequenciamento. A expressão das
proteínas foi induzida em culturas em fase de crescimento com 0,5mM de IPTG (Sigma) por 1, 2, 3 e 4 horas a 300C, sob
agitação vigorosa, e analisadas por eletroforese em géis de poliacrilamida 12%. As culturas com bons índices de indução
foram usadas para produzir extratos utilizados na purificação das proteínas de interesse por meio de cromatografia de
afinidade, usando colunas de Níquel (Amersham). As proteínas purificadas foram usadas para imunização de coelhos
com inoculação subcutânea utilizando de 100 a 150µg de amostra, em três doses com intervalo de 3 semanas entre as
doses. As inoculações foram feitas com adjuvante de Freund completo (primeira dose) e incompleto (segunda e terceira
doses). Após as imunizações, 10 ml de sangue foram coletados para se isolar o soro e medir a titulação em ensaios de
Westhern-blot usando as proteínas como antígenos nas imunizações.
Orgão financiador: CNPq.
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Análise da expressão do gene SEMA5A em
gado holandês com mastite
Vasconcellos, RS1; Antunes, GR2; Fonseca, I3; Silva, PV4; Guimarães, MFM3*; Guimarães, SEF4
Univesidade Presidente Antônio Carlos - Juiz de Fora
2
Universidade Federal de Juiz de Fora
3
Embrapa Gado de Leite
4
Universidade Federal de Viçosa
*[email protected]
1
Palavras-chave: PCR em Tempo Real, expressão gênica, resposta imune
A mastite é a principal doença em gado de leite, caracteriza-se pela resposta inflamatória da glândula mamária a agentes
infecciosos, alterando sua fisiologia e metabolismo. Esta doença promove grandes perdas na produção leiteira devido
a alterações na composição do leite e prejuízos na saúde do animal, aumentando assim os custos de produção. Com o
objetivo de compreender melhor os mecanismos de resposta imune envolvidos no fenótipo de resistência/susceptibilidade
à mastite, foi realizada a quantificação da expressão relativa do gene SEMA5A (Semaphorin 5A) em animais com e sem
mastite da raça Holandesa preta e branca (PB). A proteína SEMA5A pertence à família das semaforinas que exercem
funções no desenvolvimento neuronal. Estudos mostram que o gene SEMA5A está relacionado com a resposta imune
do hospedeiro por induzir a expressão de TNF-α e IL-8, dentre outras citocinas (Sugimoto et al, 2006). Para esta
investigação foi utilizada a técnica de PCR quantitativo em tempo real. Seis animais da raça Holandesa PB, puros de
origem, provenientes de uma fazenda localizada no município de Coimbra (MG) foram analisados, sendo três sem
mastite clínica (controle) e três com mastite clínica. As amostras de leite das vacas com mastite clínica foram coletadas
imediatamente após o aparecimento dos sinais clínicos, portanto não houve infecção artificial. O RNA total foi extraído
a partir de células somáticas presentes nas amostras de leite e utilizado como molde para a síntese da primeira fita de
cDNA. Os animais com mastite foram comparados com o grupo controle e as análises estatísticas foram realizadas pelo
programa REST© (Pfaffl et al, 2002). Utilizou-se como controle endógeno o rRNA18S sendo a eficiência de amplificação
do gene alvo e do controle endógeno próximas (1,86 e 1,80, respectivamente). A taxa de expressão do gene SEMA5A foi
11,22 vezes menor nos animais com mastite em comparação ao grupo controle (p<0,001). Espera-se que a expressão do
SEMA5A seja maior em animais com mastite por ativar a expressão de genes da resposta imune, fato que não foi observado
neste trabalho. Sugimoto et al (2006), demonstraram que um SNP no gene FEZL (forebrain embrionic zinc finger-like)
pode ser responsável pela suscetibilidade e resistência à mastite. Constataram também que a proteína FEZL liga-se à
região promotora do gene SEMA5A, ativando a sua expressão, sendo a intensidade desta ativação dependente deste
SNP. Desta forma é interessante realizar uma análise de SNP do gene FEZL nestes animais para verificar se a baixa taxa
de expressão do SEMA5A nos animais com mastite foi devido ao SNP deste gene.
Apoio financeiro: FAPEMIG.
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Análise da proporção sexual de embriões
bovinos desenvolvidos in vitro: influência
do touro
Elias, FP1; Vila, RA1; Galerani, MAV1; Lôbo, RB1
Departamento de Genética - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP
[email protected]
1
Palavras–chave: embrião, sexagem
Embriões produzidos in vitro, na maioria das espécies, dividem – se já nos primeiros dias de desenvolvimento em dois
grupos definidos: clivagem rápida e clivagem lenta, dos quais há predominância de machos e fêmeas, respectivamente.
Assim, o desvio sexual é um fator de estreita ligação com a cinética de desenvolvimento. Uma vez já comprovado o
efeito do touro na cinética e taxa de desenvolvimento de blastocistos, é suposto que o sêmen de diferentes touros pode
interferir no desvio da proporção sexual dos embriões in vitro. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a proporção
macho:fêmea de blastocistos produzidos de 18 touros do Programa de Melhoramento Genético Nelore Brasil. Para a
realização do protocolo de Fertilização in vitro (FIV), os oócitos selecionados foram coletados de ovários provenientes de
matadouro e permaneceram em meio de maturação por 24 h a 38,5 oC e 5% CO2 em atmosfera. Os espermatozóides
viáveis foram obtidos por centrifugação do sêmen dos touros em Gradiente de Percoll e utilizados para a fecundação
in vitro com concentração de 2 x 106 células/ml em meio de fecundação. Após 12 horas, os supostos zigotos foram
transferidos para meio de cultivo em co-cultivo com células do cumulus. Após 168h da fecundação in vitro foi feita a
classificação dos embriões viáveis em estágio de blastocisto. A sexagem dos blastocistos foi realizada por meio de Reação
em Cadeia de Polimerase (PCR) com a utilização de uma sequência Y-específica e de uma sequência autossômica bovina
e a visualização dos fragmentos feita em gel de agarose. A análise estatística por meio do teste de Qui-Quadrado dos
resultados obtidos mostrou que a proporção macho:fêmea variou conforme o touro utilizado (p<0,05), de modo que
cinco touros apresentaram desenvolvimento superior de blastocistos fêmeas (entre 52,7% e 62,2%) em relação aos
machos, enquanto que em 12 touros o desenvolvimento de blastocistos machos foi superior (entre 52,9% e 61,9%)
ao de fêmeas e apenas 1 touro apresentou igual proporção de desenvolvimento entre blastocistos fêmeas e machos.
Os resultados apresentados são de grande interesse, pois permitem por meio da sexagem de embriões no estágio de
blastocisto obter conhecimento a respeito da cinética de desenvolvimento dos touros. Além disso, verificou-se que a
proporção sexual de embriões desenvolvidos in vitro pode ser maior para machos ou fêmeas de acordo com o touro
utilizado para a produção in vitro de embriões.
Agradecimentos: FAEPA, CNPq e ANCP.
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Polimorfismo no Exon 2 do gene leptina
pela técnica de PCR/RFLP em bovinos
Lara, MAC1; Fiorini, LC1; Resende, FD2; Siqueira, GR2; Faria, MH2; Signoretti, RD2; Machado, JPM3
1
Instituto de Zootecnia, APTA, Nova Odessa, SP
Pólo Regional da Alta Mogiana, APTA, Colina, SP
3
Universidade Federal de Pelotas, RS
[email protected]
2
Palavras-Chave: Marcador molecular, Qualidade de carne, Bos taurus taurus, Bos taurus indicus,Marmorização
A crescente demanda do mercado consumidor por carne de qualidade, principalmente em relação à maciez e à
palatibilidade, tem incentivado o desenvolvimento de marcadores genéticos que permitam identificar e selecionar
animais de genótipos superiores para essas características. A leptina por controlar a deposição de gordura subcutânea
e intramuscular (marmorização), que afeta a terminação do animal para o peso de abate e a palatabilidade da carne
tem sido muito estudada. Alguns SNPs foram identificados no exon 2 (LEP2), dentre eles: o SNP252, que provoca a
substituição do nucleotídeo A por T, levando a mudança do aminoácido tirosina para fenilalanina, associado à alteração
no consumo de alimento e na gordura subcutânea e intermuscular (Lagoniro et al., 2003); o SNP305, com transição de
C para T, modificando arginina por cisteína, relacionado ao conteúdo de gordura na carcaça (Buchanan et al., 2002).
Sabe-se que a marmorização aumenta a maciez perceptível da carne, ao substituir proteína por lipídeo, aumentando a
suculência, por estimular as glândulas salivares. Em geral, animais de origem Bos taurus taurus, principalmente as raças
Britânicas, produzem carne com maior marmorização em relação às raças de origem Bos taurus indicus. O presente
estudo teve como objetivo investigar a variabilidade genética do SNP252 e SNP305 e compará-la entre bovinos
de raças européias e zebuínas. Um total de 437 bovinos das seguintes raças: Aberdeen Angus (76), Hereford (48),
Shorthorn (62), Simental (29) Caracu (84), Gir (50), Guzerá (41) e Nelore (47) foram investigados pela técnica de
PCR/RFLP. Os locos LEP2-252 e LEP2-305 foram investigados com o emprego das enzimas de restrição ClaI e Kpn2I,
respectivamente, em gel de poliacrilamida 8%, corado com prata. O loco LEP2-252 apresentou os alelos T (467pb) e
A (252 e 215pb). O alelo A foi o mais freqüente em todas as raças investigadas. As estimativas de freqüência do alelo
T variaram de 0,0125 (Aberdeen Angus) a 0,2467 (Nelore). O teste exato de Fisher revelou diferenças significativas
(P<0,05) entre raças quanto à ocorrência dos alelos A e T. O loco LEP2-305 apresentou os alelos T (94pb) e C (75 e
19pb) em freqüências distintas (P<0,05) entre raças européias e zebuínas. O alelo T ocorreu em freqüências superiores
nas raças européias, que produzem carnes com maior marmorização, e na naturalizada (Caracu) em relação às zebuínas,
variando de 0,0937 (Guzerá) a 0,5610 (Aberdeen Angus). Esses resultados corroboram com os achados da literatura
que sugerem uma relação significativa entre o alelo T e carcaças com excelente marmorização. A confirmação desses
resultados será de grande aplicação para os programas de melhoramento com vistas à seleção assistida por marcadores
moleculares e certificação de qualidade, agregando valores econômicos ao produto animal.
Orgão financiador: FAPESP.
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Expressão do gene NK-LYSIN em resposta à
infecção por Eimeria Tenella em Gallus gallus
Amazonas, EA1; Bayer, DV1; Costa, CAF2; Brentano, L2; Trevisol, IM2; Figueiredo, EAP2; Zingali, RB3; Gil, LHVG3; Bertani, GR1
Departamento de Bioquímica - LIKA/UFPE, Recife, PE
2
Embrapa Suínos e Aves – CNPSA, Concórdia,SC
3
Instituto de Ciências Biomédicas, UFRJ
4
Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães – CPqAM/FIOCRUZ, Recife, PE
[email protected]
1
Palavras-chave: expressão gênica, qRT-PCR, resistência a coccidiose, baço, aves
A cadeia produtiva de frangos contribui de modo expressivo para o agronegócio brasileiro. No entanto, quase a totalidade
do plantel avícola do país é acometida pela coccidiose – uma das principais causas de perda de produtividade – e causada
por parasitas do gênero Eimeria. O controle da coccidiose é, em geral, realizado através do uso de anticoccidiostáticos
fornecidos na ração ao longo da vida da ave. Essa prática vem sendo combatida cada vez mais amplamente pelos
consumidores que clamam por soluções alternativas ao uso de medicamentos na produção de animais destinados ao
consumo humano. Nesse sentido, esforços em elucidar os mecanismos de resistência inata têm conquistado importância
crescente. O ciclo de infecção de E. tenella envolve a invasão e destruição de células intestinais, podendo ocasionar a
morte da ave. Nesse sentido, células de defesa como linfócitos são cruciais no mecanismo de resistência à doença. Dentre
os peptídeos secretados por linfócitos, o NK-lysin tem sido relatado como importante mediador da resposta imune a
infecções parasitárias. O presente estudo visou avaliar o perfil de expressão de NK-lysin antes e após inoculação com
oocistos de Eimeria tenella em três linhagens que apresntam diferentes taxas de mortalidade quando infectadas com
esta coccidio. Para tanto, as três linhagens com características fenotípicas divergentes (TT, de corte; CC, de postura e
CON, controle de CC, sem seleção genética) desenvolvidas pela Embrapa Suínos e Aves foram inoculadas com 30.000
oocistos de E. tenella aos 7 dias de idade sendo coletado o baço de 4 aves por linhagem para estudos de expressão
gênica antes da inoculação (dpi0) e aos dois dias pós infecção (dpi2). A expressão de mRNA de NK-lysin foi avaliada
por qRT-PCR em Rotor Gene (Corbett Life Sciences). A quantificação relativa foi realizada segundo o método 2-∆∆CT
(Livak & Schmittgen, 2001) normalizada com GAPDH como gene constitutivo de referência. Antes da infecção
observou-se maior expressão de NK-lysin nas aves CC, sendo 6,8 vezes maior do que nas aves da linhagem CON
(P=0,08). Após a infecção, houve um aumento na expressão de NK-lysin na ordem de 6,29 vezes na linhagem CON
(P=0,09) e de 17,8 vezes nos animais da linhagem TT (P=0,01), enquanto na linhagem CC não observou-se alteração
pós-infecção. Em estudos anteriores, nosso grupo evidenciou maior taxa de mortalidade das aves da linhagem de corte
TT em relação às aves da linhagem de postura CC (Bertani, 2005). Linhagens com maiores níveis de NK-lysin préinfecção podem ser mais resistentes a infecção por Eimeria tenella, conforme observamos nas aves CC. Os resultados
sugerem que a seleção para produção de ovos baseada na teoria da genética quantitativa possa estar favorecendo maior
expressão de NK-lysin.
Apoio Financeiro: CAPES, FACEPE, Embrapa.
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Estudo de modelos de regressão aleatória
para avaliação genética da curva de
produção de ovos em aves de postura
Venturini, GC1,2; Grossi, DA1,3; Buzanskas, ME1,2; El Faro, L4; Schmidt, GS5; Ledur, MC5; Munari, DP6
Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento Animal, FCAV/UNESP
2
Bolsista CNPq
3
Bolsista FAPESP
4
APTA/SAA, Ribeirão Preto, SP
5
EMBRAPA Suínos e Aves. Concórdia, SC
6
Departamento de Ciências Exatas. FCAV/UNESP
[email protected]
1
Palavras-Chave: avicultura; poedeiras; polinômios ortogonais, herdabilidade, característica reprodutiva
Objetivou-se aplicar modelos de regressão aleatória (MRA) para a estimação de parâmetros genéticos para a curva de
produção de ovos em aves de postura. Foram utilizadas 1494 fêmeas provenientes de uma geração de uma linhagem
de postura desenvolvida pelo Programa de Melhoramento Genético de Aves da EMBRAPA Suínos e Aves, Concórdia,
SC. As fêmeas eram filhas de 43 galos acasalados com 232 galinhas em esquema hierárquico sob inseminação artificial,
nascidas a partir de três incubações, com intervalos de 15 dias e identificadas por anelamento. A produção individual
foi avaliada por meio do número de ovos produzidos a cada três semanas, a partir da 17ª até 70ª semana de idade,
totalizando 18 períodos de produção. As fêmeas com produções totais inferiores a 63 ovos ou que morreram foram
excluídas dos arquivos. O arquivo de dados conteve 25509 observações de períodos de produção e a matriz dos coeficientes
de parentesco foi constituída por 12006 animais. As funções de covariâncias foram estimadas por meio de MRA pelo
método de máxima verossimilhança restrita, utilizando-se a opção DXMRR do programa estatístico DFREML. O
modelo incluiu o efeito fixo de incubação e a trajetória média de produção (fixa), e os efeitos aleatórios genético-aditivos
(ka), de ambiente permanente direto (kc), além dos resíduos. Para modelar as trajetórias aleatórias foram utilizados
os polinômios ortogonais de Legendre, variando as ordens de ka e kc de 3 até 6 coeficientes, totalizando 10 diferentes
modelos. A estrutura de variâncias residuais foi fixada em cinco classes, após agrupar aquelas com comportamento
semelhante, usando um modelo com ka e kc=3, e 18 diferentes variâncias. De acordo com os critérios de informação
de Akaike e Bayesiano de Schwar, o melhor modelo para avaliar geneticamente a curva de produção de ovos conteve
47 parâmetros, com ordem para ka e para kc de seis coeficientes. As estimativas de herdabilidade variaram de 0,05 a
0,38, sendo que as maiores estimativas foram observadas no primeiro, terceiro, quarto e quinto período, (0,29; 0,32;
0,38 e 0,31, respectivamente). A partir do sexto período, as estimativas decresceram, variando de 0,08 a 0,21. Assim,
a produção de ovos nos períodos iniciais (terceiro a quinto) apresentou variabilidade genética suficiente para obter
ganho genético com a seleção.
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Expressão diferencial dos micrornas MIR133 e MIR-206 entre linhagens de corte
e postura de Gallus gallus
Andreote, APD1; Jorge, EC2; Ledur, MC3; Silva, NA2; Coutinho, LL2
CENA-USP, Av. Centenário, 303, Piracicaba – SP, 13400-970, Brasil
ESALQ-USP, Av. Pádua Dias,11, Piracicaba - SP, 13418-900, Brasil
3
Embrapa Suínos e Aves, CP. 21, 89700-000, Concórdia, SC, Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: microRNAs, miogênese, expressão gênica, RT-PCR quantitativo
MicroRNAs são uma família de pequenos RNAs não codantes, com cerca de 20 bases, que regulam negativamente
a expressão gênica num nível pós-transcricional. A ação dessas moléculas na repressão da expressão gênica vem
sendo descrita em diversos processos biológicos, como: morfogênese do cérebro, secreção de insulina, proliferação e
diferenciação celular, tumorgênese, defesa viral, desenvolvimento muscular, etc. O desenvolvimento da musculatura
esquelética envolve a ação de inúmeros genes, expressos em locais e momentos específicos durante as diversas fases
do processo. Esta especificidade sugere a existência de um mecanismo dinâmico de indução e inativação da expressão
desses genes, no qual os microRNAs têm ganhando posição de destaque. Os microRNAs músculo-específicos miR133 e miR-206 vêm sendo amplamente estudados e sua ação na miogênese é conhecida. miR-133 está associado ao
aumento da proliferação celular, através da repressão do gene que codifica a proteína SRF (Serum response factor). Já
o miR-206 foi descrito em associação com a diferenciação dos mioblastos, e sugerido como possível regulador da
folistatina, molécula cuja ação antagoniza a miostatina (regulador negativo do crescimento muscular). Este trabalho
teve por objetivo analisar a expressão destes dois microRNAs em frangos com capacidades divergentes para deposição
muscular. Embriões de frango no estádio E43 (H&H), provenientes de duas linhagens (corte e postura), foram dissecados
para a coleta de tecido da musculatura peitoral. O tecido removido foi imediatamente congelado e o RNA total foi
extraído utilizando Trizol (Invitrogen). A síntese de cDNA foi realizada a partir de 10 ng do RNA total utilizando o
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Os níveis de expressão foram mensurados em sistema
de detecção LightCycler utilizando o TaqMan microRNA probes kit (Applied Biosystems). A normalização dos dados
de expressão foi feita utilizando-se o gene referência MRPS27. Para a quantificação da expressão relativa utilizamos
o software REST 2005 (19.12). Os resultados indicaram que ambos os microRNAs, miR-133 e miR-206, são mais
expressos na linhagem de corte em relação à de postura (P<0,04 e P<0,005, respectivamente). Estes resultados sugerem
que a regulação da expressão de genes importantes na miogênese pode ser diferente em cada uma das linhagens. Ainda,
esses resultados nos permitiram adicionar novos membros à via molecular que determina as diferenças no potencial de
deposição muscular entre as linhagens.
Apoio financeiro: FAPESP, CNPq e Embrapa Suínos e Aves.
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Análise de meio-irmãos para o mapeamento
fino de uma região associada a QTLs no
cromossomo 1 da galinha
Boschiero, C1; Nones, K3; Rosário, MF3; Ledur, MC2; Coutinho, LL3; Moura, ASAMT1
Departamento de Produção Animal, FMVZ, UNESP, Botucatu
2
Embrapa Suínos e Aves, Concórdia
3
Laboratório de Biotecnologia Animal, ESALQ, USP, Piracicaba
[email protected]
1
Palavras-chave: mapeamento fino, QTL
Após a identificação de QTLs (locos de características quantitativas), o mapeamento fino é o passo seguinte na busca
por genes associados a características de importância econômica. Esta abordagem permite identificar QTLs com maior
precisão, pois satura com marcadores moleculares regiões previamente identificadas. Nos últimos anos foram identificados
cerca de 700 QTLs em galinhas. O objetivo deste trabalho foi conduzir análise com modelo genético de meio-irmãos
para refinar o mapeamento de QTLs de uma região do cromossomo 1 da galinha previamente identificada por nosso
grupo. Os genótipos de 653 aves pertencentes a três famílias de meio-irmãos foram obtidos a partir da população
desenvolvida pela Embrapa Suínos e Aves. A região-alvo foi definida a partir dos resultados de Nones et al. (2006),
que mapearam QTLs para pesos vivos e de órgãos numa região de 82,3 cM utilizando dez marcadores. Seis novos
marcadores microssatélites foram genotipados nesta região, e o mapa de ligação parcial foi construído com 16 marcadores,
resultando numa região de 110,8 cM. O espaçamento médio entre os marcadores foi de aproximadamente 7,4 cM,
em comparação com 9,1 cM obtido por Nones et al. (2006), na mesma região. As aves foram abatidas aos 42 dias e as
características avaliadas foram: peso vivo aos 35 (P35), 41 (P41) e aos 42 dias (P42), peso do coração (Pcor) e pulmões
(Ppul). Foram calculados os rendimentos do coração (Rcor) e dos pulmões (Rpul). A análise de mapeamento de QTLs
foi conduzida em duas etapas: primeiro para o conjunto de três famílias (1, 2 e 3) de meio-irmãos paternos (análise
conjunta = C) e, a seguir, dentro de cada família (individual = I). O modelo estatístico incluiu os efeitos fixos de sexo,
família e incubação. Na análise C foram mapeados QTLs para: P35, P41, Pcor e Ppul, e na análise I para: P35, P41,
Pcor, Ppul e Rpul (família 1) e para Pcor e Rcor (família 2). Nenhum QTL foi mapeado na família 3. Os intervalos de
confiança variaram de 47 a 95 cM (C) e de 40 a 93 cM (I). A proporção da variância fenotípica total atribuída a cada
QTL variou de 2,6 a 4,3% (C) e de 4,1 a 14,7% (I), com destaque para os QTLs mapeados na família 1, para P35 e P41,
que explicaram cerca de 14% da variância fenotípica total. O mapeamento fino permitiu mapear diversos QTLs,
confirmando os já mapeados, porém alguns foram posicionados em diferentes intervalos. Além disso, as análises dentro
de famílias indicaram que os principais QTLs estão segregando em apenas uma das famílias de meio-irmãos.
Apoio financeiro: CNPq e FAPESP.
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Evidências do aumento da sensibilidade ao
hormônio do crescimento (GH) e produção
do fator de crescimento tipo insulina I (IGF-I)
após estresse hiperosmótico no linguado
brasileiro Paralichthys orbignyanus
Meier, KM1; Figueiredo, MA1; Kamimura, MT1; Laurino, J3; Maggioni, R4; Pinto, LS5;
Dellagostin, OA5; Tesser, MB2; Sampaio, LA2; Marins, LF1
Departamento de Ciências Fisiológicas, Universidade Federal do Rio Grande
2
Departamento de Oceanografia, Universidade Federal do Rio Grande
3
Centro de Biologia Genômica e Molecular, Faculdade de Biociências, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul
4
Faculdade de Educação, Ciências e Letras do Sertão Central, Universidade Estadual do Ceará
5
Centro de Biotecnologia, Universidade Federal de Pelotas
[email protected]
1
Palavras-chave: Estresse hiperosmótico, crescimento, osmorregulação, RT-PCR semi-quantitativa, Paralichthys orbignyanus.
A ação do hormônio do crescimento (GH) é o resultado de uma cascata intracelular iniciada logo após a sua interação com
o receptor do GH (GHR), localizado na superfície das células alvo. Esta cascata culmina com a transcrição de genes alvo,
como os fatores de crescimento tipo insulina (IGFs), os quais são responsáveis pela maioria dos efeitos biológicos do GH.
Além de sua função central sobre o crescimento, o GH de peixes também está envolvido com o controle osmorregulatório.
Neste contexto, o objetivo do presente trabalho foi isolar os cDNAs do GH, GHR e IGF-I do linguado brasileiro Paralichthys
orbignyanus e avaliar se a expressão desses genes é induzida pelo estresse hiperosmótico. Os peixes utilizados neste estudo
(18 a 26 cm) foram oriundos de desovas artificiais realizadas na Estação Marinha de Aquacultura (EMA-FURG, Brasil). Os
indivíduos foram aclimatados por uma semana à salinidade 11 (ponto isosmótico da espécie). Após a aclimatação, um grupo
de peixes foi transferido para um tanque com água do mar a salinidade 30, enquanto outro grupo foi colocado a salinidade
11. Os tecidos foram amostrados em quatro ocasiões: três horas, 24 h, 72 h e sete dias após a transferência. Foi extraído o
RNA total e sintetizado o cDNA de hipófises, brânquias e fígados de três indivíduos de cada salinidade, em cada tempo de
exposição. Foram isolados e seqüenciados os cDNAs do GH, GHR, IGI-I e β-actina, sendo as seqüências de nucleotídeos e
de aminoácidos comparadas com as seqüências de peixes disponíveis no GenBank. Todas as seqüências obtidas mostraram alta
similaridade com seqüências de outras espécies de linguados. A expressão foi analisada através do método de RT-PCR semiquantitativa, utilizando o gene da β-actina como normalizador. Os resultados obtidos indicaram que o mRNA do GH tem
um pico de expressão significativo somente 24 h após o estresse hiperosmótico. Nas brânquias, a expressão do GHR apresentou
um aumento significativo após sete dias. No fígado, tanto GHR quanto IGF-I aumentaram significativamente em 72 h, e
ambos atingiram os maiores níveis de expressão após sete dias. Estes resultados indicam que o estresse hiperosmótico pode
aumentar a sensibilidade ao GH nas brânquias e no fígado de P. orbignyanus e, conseqüentemente, incrementar a produção
de IGF-I. O manejo deste parâmetro pode ser útil para atingir melhor desempenho de crescimento para esta e outras espécies
comercialmente importantes, nas quais o GH tenha uma relação direta com o mecanismo osmorregulatório.
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Impacto da variação de taxas evolutivas nas
estimativas de tempo de divergência
Soares, AER1; Schrago CG1
Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio de Janeiro
[email protected]
1
Palavras-chave: Relógio molecular, tempo de divergência, relógio molecular relaxado, Bayes MCMC, simulação
Desde que foi proposto o relógio molecular, no início dos anos 60, ele tem sido utilizado para elucidar diversas questões
sobre o tempo de origem de linhagens e suas relações com eventos da história do planeta. Entretanto, o método clássico
impõe a constância de taxas evolutivas em todas as espécies analisadas, o que limita consideravelmente a aplicação do
mesmo. Além disso, testes foram desenvolvidos para detectar linhagens que desviam do relógio molecular. Isso motivou
o desenvolvimento de metodologias que modelam a evolução das taxas de evolução decompondo o tamanho de ramo
em taxa e tempo independentemente. A idéia da necessidade de um ponto de calibração foi flexibilizada pela adoção
de intervalos máximos e mínimos dos tempos de divergência das linhagens e até mesmo com a adoção de distribuições
probabilísticas nas calibrações. Modelagens complexas requerem algoritmos eficientes para vasculhar o espaço paramétrico
num tempo computacionalmente viável. Nesse sentido, aqueles algoritmos influenciados pela inferência bayesiana
filogenética foram aplicados ao problema da estimativa de tempos de divergência, como por exemplo os trabalhos de
Thorne et al, 1998 e Drummond, 2006. Embora esses métodos tenham ganhado grande aceitação, ainda não se sabe
o comportamento do acúmulo de erros quando a variação das taxa evolutivas é elevada. Para entender a relação entre
a taxa de erro e as taxas evolutivas simulamos uma série crescente de variação de taxas evolutivas numa árvore simples
com 4 táxons, nos métodos clássico e bayesiano auto-correlacionado e independente. As simulações foram feitas nos
modelos evolutivos Jukes-Cantor e Kimura 2-P. Conforme previsto, o acúmulo de erros do relógio clássico é linear
em relação à variação da taxa, porém a estatística Z é bastante sensível à variação das taxas e impede que estimativas
errôneas sejam adotadas. Em contrapartida, o método bayesiano auto-correlacionado não apresenta acúmulo linear
de erros e atinge um erro máximo, diferente do método bayesiano independente que surpreendentemente também
apresenta uma taxa de acúmulo de erros aproximadamente linear.
Apoio financeiro: CNPq e FAPERJ.
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Estimação de normas de reação adaptativas
ao longo do desenvolvimento usando
modelo de regressão aleatória múltipla
Pegolo, NT1; de Oliveira, HN1,2; Albuquerque, LG3; Lôbo, RB4; Bezerra, LAF1
1
Departamento de Genética - FMRP, Universidade de São Paulo (USP)
Departamento de Nutrição e Melhoramento Animal – FMVZ, Universidade Estadual Paulista (UNESP)
3
Departamento de Zootecnia – FCAV, Universidade Estadual Paulista (UNESP)
4
Associação Nacional de Criadores e Pesquisadores (ANCP)
[email protected]
2
Palavras-chave: normas de reação, regressão aleatória, desenvolvimento, peso, bovinos
O conceito para norma de reação ao longo do desenvolvimento (NRD) é dado por Schlichting and Pigliucci (1998)
como sendo o conjunto completo de trajetórias ontogênicas multivariadas que podem ser produzidos por um único
genótipo exposto a todos os ambientes biologicamente relevantes. Os mesmos autores consideram a NRD um modelo
ideal para expressar e entender as interconexões entre as várias abordagens da evolução fenotípica, elucidando os
caminhos envolvidos na transição epigenética do genótipo para o fenótipo. Neste trabalho, agregamos uma visão da
Genética Quantitativa ao isolar o componente genético aditivo da característica analisada, tornando a NRD adaptativa
(NRAD). Usando 408.416 dados de peso das progênies de touros Nelore do Programa Nelore Brasil da ANCP,
realizamos a estimação da função de covariância (FC) e a predição das NRADs, por meio de um modelo de regressão
aleatória com variáveis de controle múltiplas, citada por Meyer e Kirkpatrick (2005), usando programa BLUPF90
de Mizstal (1999) e suas atualizações, com a estimação dos parâmetros genéticos por inferência bayesiana. O modelo
considerou polinômios de Legendre lineares ao longo do gradiente ambiental (gerado pela média de peso de grupos
contemporâneos) e cúbicos ao longo do gradiente temporal (definido pelos dias após nascimento, com os pesos ajustados
aos 120, 210, 365 e 450 dias), com 20 classes residuais, evitando heteroscedasticidade. Separamos os dados de progênies
machos (PM) e fêmeas (PF) em duas análises diferentes, pois análises anteriores indicaram ser a melhor abordagem. A
aplicação do modelo resultou em duas matrizes simétricas de ordem cinco, com os coeficientes da FC a partir de PM e
PF, evitando a superparametrização comum às análises multivariadas. O modelo permitiu a estimação das herdabilidades
(h2), bem como a predição do valor genético de animais, em qualquer ponto dos eixos ambiental e temporal, gerando
gráficos de superfície. As correlações entre os coeficientes da CF indicaram importantes conexões entre atributos das
NRADs, como entre plasticidade ambiental e inclinação da curva de crescimento em machos. A superfície de h2 para
PM apresentou valores menores (entre 0,11 e 0,39), havendo uma depressão em ambientes desfavoráveis. Com PF, a
h2 foi maior (entre 0,19 e 0,59), com a depressão bastante delimitada e deslocada para ambientes menos desfavoráveis
e para menores idades, confirmando uma interação genótipo-ambiente-idade-sexo. A metodologia permitiu predizer
o efeito da seleção fenotípica para peso nos coeficientes da FC, e assim, a resposta correlacionada ao longo de todo o
gradiente ambiental e de desenvolvimento, em ambos os sexos.
Apoio financeiro: CAPES.
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O homem, a baleia e o ornitorrinco
compartilham um idêntico domínio paired
do gene PAX9
Paixão-Côrtes, VR1; Heinzelmann, L1,4; Santos, F2; Redondo, R2; Pissinatti, A3; Salzano, FM1; Bortolini, MC
PPGBM, Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Federal do.Rio Grande do Sul
2
Departamento de Biologia Geral, ICB, Universidade Federal de Minas Gerais
3
Centro de Primatologia do Rio de Janeiro – CPRJ – FEEMA
4
Grupo de Estudos de Mamíferos Aquáticos do Rio Grande do Sul - GEMARS
[email protected]
1
Palavras-chave: PAX9, domínio paired, seleção purificadora, dN/dS, mamíferos
O PAX9 é um gene de desenvolvimento composto por quatro exons, sendo que o exon 2 codifica o chamado domínio
paired que confere à proteína, um fator de transcrição, a capacidade de se ligar ao DNA. Estudos de mutações que
provocam agenesia de dentes em humanos e experimentos com modelos animais fornecem sólidas evidências de que o
exon 2 do PAX9 teria papel chave na rota genética da odontogênese. Em mamíferos, a diversificação e especialização dos
dentes possibilitaram um incremento na geração de energia que representou uma inovação chave para a sobrevivência deste
grupo. Sendo assim, é possível supor que alterações no exon 2 do PAX9 poderiam estar relacionadas ao estabelecimento
das diferentes fórmulas dentais que surgiram ao longo da história evolutiva dos mamíferos. Foram analisadas seqüências
do exon 2 (~690bp) de 45 espécies de mamíferos, sendo 18 destas obtidas para esse estudo. As demais foram compiladas
do Genbank/NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank) e do Ensembl (http://www.ensembl.org/index.html).
Um fato marcante que surge das análises é a grande diferença entre a porcentagem de mutações não-sinônimas e
sinônimas no exon 2, pois somente 2% de todas as mutações detectadas, resultam em troca do aminoácido. Para testar
se a variação encontrada poderia ser explicada pelo equilíbrio entre mutação e deriva (neutralidade) foram realizados
testes usando os programas YN00 e CODEML, parte do pacote PAML 3.15, que estimam as taxas de substituições
sinônimas e não-sinônimas (dN/dS), também conhecidas como ω. Valores das taxas de substituição ω < 1 e ω > 1
indicam respectivamente seleção purificadora (ou negativa), ou positiva (Darwiniana). Já valores de ω = 1 estariam
indicando que a hipótese de neutralidade não poderia ser descartada. Quando os modelos de substituição são comparados
(M0 - M3, M1a - M2a e M7 e M8), o que melhor se adapta aos dados é o M3 (p < 0,001), que admite variação nas
classes de ω. A taxa de substituições sinônimas e não-sinônimas (dN/dS= ω = 0,00759) é um valor significativamente
menor que zero, sinalizando que a principal força agindo no exon 2 de mamíferos é seleção purificadora. Além disso,
como o modelo M3 permite ramos com valores diferentes, encontramos que 92% dos sítios dentro do exon 2 estão
sujeitos a uma taxa substituições sinônimas e não-sinônimas muito baixa (menor que 0,00125). Isso significa que uma
esmagadora constrição funcional mantém a seqüência de aminoácidos inalterada por todas as linhagens dos mamíferos
estudados até aqui. Uma onipresente seleção purificadora domina completamente o panorama evolutivo do domínio
paired do exon 2, pois não há nenhuma alteração não-sinônima nos 384 nucleotídeos que o compõe. Ou seja, são os
mesmos 128 aminoácidos para todos os 45 mamíferos analisados, entre eles o homem, a baleia e o ornitorrinco.
Apoio: CNPq, CAPES e FAPERGS.
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A sinalização por ácido retinóico é
determinante para a padronização das câmaras
cardíacas em peixe zebra (Danio rerio)
Castro, RA 1,2 & Xavier-Neto, J1,2
Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento, Instituto de Ciências Biomédicas/USP
2
HC-Incor- FM, São Paulo/SP
[email protected]
1
Palavras-chave: Padronização antero-posterior do coração, Ácido retinóico, Peixe zebra e Biologia do desenvolvimento
O ácido retinóico (AR) é sintetizado no organismo a partir de oxidações sucessivas de seu precursor, o álcool retinol, para
AR. A última etapa de oxidação é catalisada pela ação das enzimas RALDHs. Na cardiogênese, o AR é importante para
a geração dos átrios e o crescimento do miocárdio ventricular. Uma das decisões mais precoces durante a formação do
coração é o estabelecimento de sua polaridade antero-posterior (AP). Seu estabelecimento é crítico para a demarcação das
regiões de efluxo (ventrículos) e de influxo (átrios), respectivamente. Segundo, a proposta levantada pelo nosso grupo,
uma onda caudo-rostral (CR) de expressão da RALDH2 é o mecanismo ancestral responsável pela de padronização AP
do coração dos vertebrados. Estudos em embriões de galinha e camundongo mostraram que a onda caudo-rostral de
RALDH2 é responsável pela especificação das identidades atriais e ventriculares nestes organismos. Embora a presença
dessa onda tenha sido observada no peixe zebra (Danio rerio), não havia sido encontrado, ainda, em peixes nenhum
indício efetivo de correlação entre a presença da onda com sua ação de padronização AP no tubo cardíaco dos peixes.
Para testar o papel da sinalização pelo AR nesta padronização AP, manipulamos a via de AR do peixe zebra com um
pulso do inibidor das enzimas RALDHs, DEAB e com AR exógeno. Os resultados obtidos, durante o período da onda
CR de expressão de RALDH2, sugerem que os tratamentos com DEAB produzem átrios significativamente reduzidos
(p<0,001), em média 12% menores que o grupo controle, enquanto que os animais tratados com AR exógeno apresentam
o domínio atrial significativamente expandido(p<0,05), com um aumento médio de 9% em relação ao grupo controle.
Animais tratados com DEAB e AR em um estágio no qual a manipulação de AR não mais perturba a especificação das
câmaras cardíacas, não mostraram diferença significativa quando comparados com o controle, (p>0,05). Estes dados
suportam a hipótese de que, semelhante aos demais amniotos, o padrão AP do coração em vertebrados é determinado
pela presença ou ausência de AR e que a onda de expressão da RALDH2 é um mecanismo ancestral de padronização
dos vertebrados.
Apoio financeiro: FAPESP.
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Nkd1 é necessária para o posicionamento
dos órgão internos em relação ao eixo
esquerdo-direito
Schneider, I; Houston, D; Rebagliati, M; Slusarski, D
Department of Biological Sciences, University of Iowa, Iowa City, IA 52242
[email protected]
Palavras-chave: zebrafish, cálcio, β-catenina, embrião, naked cuticle
Vertebrados em geral possuem perfeita simetria bilateral externa, porém quando examinamos seus órgãos internos,
podemos constatar que coração, pulmões, intestino etc., são posicionados de forma assimétrica com relação ao eixo
esquerdo-direito. Apesar de algumas vias de sinalização já terem sido associadas com a determinação do eixo esquerdodireito, o mecanismo que determina a assimetria dos órgãos internos ainda não foi elucidado.Através do estudo da
sinalização de íons cálcio (Ca2+) in vivo, tanto embriões de peixe (peixe-zebra, Danio rerio) e sapo (Xenopus laevis),
demonstramos que a manipulação da sinalização de Ca2+ em um grupo especial de células (células dorsais precursoras,
CDP), causa alteração no posicionamento dos órgãos internos e na expressão de genes importantes para a determinação
do eixo esquerdo-direito. Também observamos que a perda da sinalização de Ca2+ nas CDP causa estabilização e ativação
da proteína β-catenina. Como a β-catenina parece ser o principal alvo da sinalização de Ca2+, procuramos identificar
reguladores de sua atividade que fossem expressos no mesmo grupo de células, as CDP. O gene Naked Cuticle, ou nkd,
identificado inicialmente em estudos em Drosophila, codifica uma proteína produzida nas CDP, capaz de se ligar em
Ca2+, e que inibe a ação da proteína β-catenina. O peixe-zebra possui duas cópias do gene nkd, nkd1 e nkd2, ambos
expressos nas CDP e capazes de antagonizar β-catenina. Através da utilização de um tipo especial de oligonucleotideos
denominados morpholinos, nós bloqueamos a expressão de ambas as cópias do gene nkd nas CDP em peixe-zebra. Apenas
o bloqueio da expressão de nkd1 resultou em alteração do posicionamento de órgãos internos e afetou a expressão de
genes necessários para formação do eixo esquerdo-direito. Por fim, concluímos que tanto o bloqueio da expressão da
proteína Nkd1 quanto a inibição da sinalização de Ca2+ causam inibição da atividade da proteína β-catenina, afetam
expressão de genes importantes para lateralidade e alteram o posicionamento dos órgãos internos em relação ao eixo
esquerdo-direito. Nossos dados identificam Nkd1 como possível mediador entre fluxos de Ca2+ nas CDP e a determinação
do eixo esquerdo-direito.
Apoio financeiro: American Heart Association.
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Efeito do hormônio do crescimento (GH)
sobre a regulação de genes relacionados ao
eixo somatotrófico e ao estresse oxidativo
em um modelo de peixe transgênico
Petry, RG1; Figueiredo, MA1; Lanes, CFC1; Almeida, DV1; Marins, LF1
Departamento de Ciências Fisiológicas, Universidade Federal do Rio Grande (FURG)
[email protected]
1
Palavras-chave: Hormônio do Crescimento, Peixe Transgênico, Estresse Oxidativo, Síntese Protéica, Expressão de Genes
O hormônio do crescimento (GH) é o principal responsável pelo crescimento somático em vertebrados. Este processo
é regulado pelo eixo somatotrófico, onde o GH liberado no sangue pela hipófise liga-se a receptores específicos
(GHR) na superfície das células-alvo, induzindo a síntese dos fatores de crescimento tipo insulina (IGFs). O IGF-I é
o principal mediador do efeito anabólico do GH sobre o metabolismo protéico. Entretanto, tem sido observado que
o excesso de GH pode promover um aumento da produção de espécies reativas de oxigênio. Dessa forma, o objetivo
do presente trabalho foi avaliar os efeitos de diferentes níveis de GH sobre a regulação de genes relacionados ao eixo
somatotrófico e ao estresse oxidativo em um modelo de peixe transgênico. Paulistinhas (Danio rerio) transgênicos foram
produzidos através da co-injeção de duas construções genéticas lineares ambas contendo o promotor da β-actina de carpa
(Cyprinus carpio), porém uma direcionando a expressão da proteína verde-fluorescente (GFP) utilizado como gene
marcador (cβA/GFP), e a outra o cDNA do GH do peixe-rei marinho, Odontesthes argentinensis, (cβA/msGH). O
transgene cβA/msGH foi microinjetado em ovos recém-fertilizados em duas concentrações: 100.000 cópias/célula
(Grupo T1) e 500.000 cópias/célula (Grupo T5). Além disso, ambos os grupos receberam 100.000 cópias/célula do
transgene cβA/GFP. A análise da expressão dos genes msGH, GHR, IGF-I, eIF2β, hsp70 e gclc foi realizada através
de RT-PCR semiquantitativa. Os resultados mostraram que o grupo com a menor concentração do transgene cβA/
msGH (T1) apresentou um aumento significativo na expressão do gene GHR (P<0,05) em relação aos demais grupos
(T5 e controle), enquanto que o grupo T5 não mostrou diferença em relação ao controle. A expressão do gene IGF-I
corroborou com os resultados do receptor, onde a maior expressão foi observada para o grupo T1 (P<0,05). O resultado
observado para o gene eIF2β foi similar ao IGF-I, onde o grupo T1 também apresentou uma expressão elevada em
relação aos demais grupos (P<0,05). A expressão do gene hsp70 indicou que os dois grupos transgênicos apresentaram
uma maior expressão do que o grupo controle (P<0,05). Entretanto, para o gene gclc apenas o grupo T5 apresentou uma
maior expressão em relação ao controle (P<0,05). Portanto, no presente estudo é possível inferir que o excesso de GH
pode gerar estresse oxidativo, afetando o crescimento devido a uma diminuição nos receptores de GH e conseqüente
queda na produção de fatores de crescimento. Além disso, foi demonstrada, em peixes, a existência de um nível ótimo
de GH associado a um aumento de síntese protéica.
Apoio: CNPq e FURG.
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Expression pattern of the Dapper genes
during development of limbs in chicken
(Gallus gallus)
Peterlini, DJ1; Sobreira, RD1; Xavier-Neto2, J; Dietrich, S3; Alvares, LE1
Department of Histology and Embryology, State University of Campinas - UNICAMP
Laboratory of Genetics and Molecular Cardiology, Heart Institute - Incor – HC, FMUSP
3
Department of Craniofacial Development, King’s College London
[email protected]
1
2
Keywords: chicken, Dapper, development, expression patterning, limb
Limbs represent an important evolutionary acquisition of tetrapoda that has allowed the expansion of this group
throughout biosphere. The molecular basis of limbs development has been subject of intense investigations, and the
role of several genes and signaling molecules has begun to be understood in the context of axial patterning as well as
in regard to the differentiation of specific tissues and/or structures of the limbs. The family of the Dapper genes (Dpr)
has been related to several aspects of vertebrate’s development, as morphogenetic movements, specification of the
neural tissue, cardiogenesis and eye development. These multiple roles are mediated by the interaction of the Dapper
proteins with different molecular partners in particular Dishevelled, a key molecule of the Wnt signaling and the Alk4/5
receptors of the Nodal signaling pathway. Considering that the Dapper genes are able to modulate signals of the Wnt
and Nodal pathways, we decided to investigate the expression of these genes during limbs development using chicken
as the experimental model. At embryonic day 3 (E3) the expression of Dapper 1 occurs along the whole extension of
the limbs, but it is stronger on zeugopod and autopod. Between E4 and E5, the expression in the zeugopod region
becomes diffused while it is still strong in a narrow region of the autopod. At E6, the expression of Dapper 1 becomes
strong in whole autopod, keeping diffused in the zeugopod. Dapper 2 expression at E3 is observed in the whole limb
in a pattern similar to that observed to Dapper 1. Between E4/E5 Dapper 2 transcripts are localized in the anterior
region of the forelimb and hindlimb as well as in the digits, being absent in interdigital regions. At E6, the expression
of Dapper 2 becomes related to the joints of shoulder/hip on stilopod, elbow/knee on zeugopod, and wrist/ankle and
fingers on autopod. Our preliminary results of in situ hybridization revealed that both Dapper 1 and Dapper 2 are
expressed in the limbs in a dynamic pattern, suggesting that they may play an important role in the ontogeny of these
structures. At the moment we are characterizing the expression of the Dapper 1 and Dapper 2 in the earlier phases of
limb development.
Financial support: FAPESP and FAEPEX.
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Expressão dos genes Wpkci e PKCI na
região gonadal em diferentes estadios do
desenvolvimento de Aves
Caetano, LC1; Araújo, A1; Bobrovnitchaia, IG1; Gennaro, FGO1; Vila, RA1; Galerani, MAV1; Ramos, ES1,2
Laboratório de Epigenética e Reprodução do Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP
2
Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP
[email protected]
1
Palavras-chave: expressão, gônada, gene Wpkci, gene PKCI, embrião de galinha
Os mecanismos que levam a determinação e diferenciação sexuais em Aves não estão completamente elucidados. O
gene Wpkci tem expressão fêmea-específica no desenvolvimento gonadal, localiza-se no cromossomo W e apresenta um
homólogo em Z, o gene PKCI. Devido à localização destes genes e a estrutura de suas proteínas, foi proposto que devam
atuar de forma antagônica no processo de diferenciação do ovário. O objetivo deste trabalho foi verificar a expressão
desses dois genes em diversos estádios do desenvolvimento de Gallus gallus. A região gonadal embrionária dos estadios
de desenvolvimento anteriores à diferenciação histológica (estadio 20HH - 3 dias de incubação e estadio 25HH 4 ½ dias de incubação), e os primórdios gonadais pós-diferenciação histológica (estadio 38HH - 12 dias de incubação)
foram isolados de ovos galados, bem como ovário e testículos de animais adultos. Foram utilizados quatro embriões
de cada estadio, sendo dois de cada sexo, e um animal adulto de cada sexo. A sexagem prévia à análise de expressão foi
realizada utilizando-se PCR (Polimerase Chain Reaction) para detecção de seqüências do gene CHD e também pelo
MHM assay, ensaio desenvolvido em nosso laboratório. Foram realizadas a extração de RNA e a transcrição reversaPCR para seqüências dos genes PKCI, Wpkci e da β-actina (controle). O transcrito de Wpkci só pôde ser observado em
embriões fêmeas. A expressão de PKCI foi observada nos machos e fêmeas no período anterior ao início da diferenciação
histológica da gônada, bem como no estadio pós-diferenciação (38HH) nos machos e no testículo adulto. No ovário de
fêmea adulta e nos primórdios gonadais pós-diferenciação das fêmeas não foi visualizada a expressão deste gene. Com esses
resultados pode-se concluir que a expressão do gene PKCI limitou-se ao período pré-diferenciação da gônada feminina,
enquanto no macho, manteve-se até o adulto, enquanto o Wpkci apresentou transcritos em todos os estadios analisados,
mas exclusivamente nas fêmeas. As pesquisas com expressão de genes envolvidos com a determinação sexual das Aves
poderão levar a futuros estudos de interferência por RNA visando a um maior entendimento desse complexo sistema.
Apoio: CNPq, FAPESP, FAEPA, ANCP, CAPES.
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A família RGM em Gallus gallus: estrutura
gênica e transcrição alternativa presumível
Jorge, EC1; Coutinho, LL1
Departamento de Zootecnia, Escola Superior de Agricultura ‘Luiz de Queiroz’ (ESALQ/USP)
[email protected]
1
Palavras-chave: orientadores de axônio, estrutura gênica, Gallus gallus, expressão diferencial
Moléculas orientadoras por repulsão (Repulsive Guidance Molecules, RGM) são uma família de orientadores de axônios
com várias funções durante a embriogênese, incluindo processos regenerativos após injúria no sistema nervoso; apoptosis;
adesão e diferenciação celular. Vertebrados possuem três homólogos de RGM: RGM-A, RGM-B e RGM-C. Os membros
da família dividem 50-60% de identidade de aminoácidos e apresentam características estruturais similares, incluindo
uma seqüência sinal na porção N-terminal e um domínio parcial ´von Willebrand do tipo D´. RGM-A e RGM-C
possuem ainda um domínio RGD, potencialmente envolvido no processo de interação célula-célula. Todos os membros
da família RGM possuem o domínio transmembrana do tipo âncora de GPI na porção C-terminal da proteína. RGM-A
e RGM-B dividem funções no sistema nervoso, enquanto RGM-C tem sido caracterizado como específico de tecido
muscular (esquelético e cardíaco), com funções descritas no metabolismo de ferro. Ortólogos para os três membros da
família RGM foram encontrados nos genomas de Homo sapiens, Pan troglodytes, Rattus novergicus, Mus musculus, Xenopus
tropicalis e Danio rerio. Entretanto, em frangos (Gallus gallus), apenas RGM-A e RGM-B foram mapeados no genoma,
sendo RGM-A localizado no cromossomo 10 e RGM-B no cromossomo Z. Transcritos para RGM-A de frango, contendo
dois éxons e totalizando 1.355pb, foram ainda encontrados no tecido muscular esquelético embrionário, onde era
esperado encontrar RGM-C. A hipótese é que em frangos RGM-A poderia estar exercendo no tecido muscular o papel
de RGM-C, ausente no genoma desta espécie. Análises computacionais corroboraram essa hipótese, pois as seqüências
de proteínas e nucleotídeos de RGM-C dos ortólogos de frango foram cerca de 46% similares apenas às seqüências
de RGM-A e RGM-B do genoma do frango e nenhuma outra região. Essas análises indicaram ainda a presença de 19
EST agrupadas em quatro unigenes clusters (Gga.117; Gga.28485; Gga.38535; Gga.18951), imediatamente upstream ao
loci de RGM-A no cromossomo 10, com sobreposição ao segundo éxon do gene. A origem dessas EST sugeriu ainda a
transcrição alternativa de RGM-A, com padrão de expressão tecido-específica. Iniciadores específicos para os dois éxons
conhecidos e os quatro unigenes permitiram amplificar um fragmento único, de aproximadamente 3.900 pb. RT-PCRs
realizadas em diversos tecidos revelou a expressão de transcritos alternativos para RGM-A em estádios específicos do
desenvolvimento muscular. Estes resultados contribuíram para (1) sugerir que a estrutura de RGM-A de frango esteja
incompleta no banco de dados; e (2) revelar transcritos alternativos inéditos para RGM-A, expressos diferencialmente
durante o desenvolvimento muscular, ambas corroborando para a hipótese de que uma das formas alternativas expressas
de RGM-A tenha assumido o papel de RGM-C nesse tecido, justificando sua ausência no genoma.
Apoio financeiro: FAPESP e CNPq.
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The retrovirallike cENS gene family specifically
expressed in early chicken embryos
Lerat, E1; Birot, A2; Samarut, J2; Mey, A2
1
Université Claude Bernard Lyon, Laboratoire de Biométrie et Biologie Evolutive, UMR CNRS 5558, Villeurbanne, France
Ecole Normale Supérieure de Lyon, Laboratoire de Biologie Moléculaire de la Cellule, UMR5161 CNRSINRA UMR1237, Lyon, France
2
Embryonic stem (ES) cells are important developmental cells that appear very early during development and subsequently
give rise to all the cell lineages of the future adult organism. In these cells a limited subset of transcription factors is
expressed that are well conserved among species and essential for the stem cell fate. The transcriptome analysis of ES
cells from chicken has revealed a gene family, cENS, that is specifically expressed in ES cells and in early embryos, and
is repressed during the differentiation process. This family is characterized by displaying retroviral structures and sharing
no homology with other species genes. These characteristics are probably not restricted to the chicken genome, and
raise the question of whether similar genes are present and have been maintained in other species. We have examined
the different copies of this gene in the sequenced chicken genome in order to investigate its dynamics and its evolution.
We have distinguished two groups of cENS related copies. The first group, resulting from recent transposition events,
contains the transcribed ENS1 and ENS3 plus copies subjected to negative selection pressures. The second group
contains degenerate copies that were integrated into the genome earlier. Comparison with copies previously isolated
from three Galliformes showed that they are also subjected to selection pressures. We also detected numerous soloLTR
containing the ENS1 promoter that may control the expression of host genes. Taken together, these findings suggest
a function sustained by a neogene of retroviral origin during the early stages of chicken development.
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Expressão dos genes TSPX e SRY em
embriões bovinos pré-implantação
Takeuchi, PL1; Rios, AFL1; Araújo, A1; Galerani, MAV1; Lôbo, RB1; Vila, RA1; Elias, FP1; Ramos, ES1,2
1
Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP
Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP
[email protected]
2
Introdução: TSPX e SRY são genes específicos dos cromossomos X e Y, respectivamente, que estão envolvidos nos processos
de transcrição e regulação do ciclo celular, e podem estar relacionados à diferença na velocidade de desenvolvimento
entre embriões machos e fêmeas de mamíferos no período pré-implantacional. Objetivos: Verificar a expressão dos
genes TSPX e SRY em embriões bovinos pré-implantação produzidos por fertilização in vitro e comparar a expressão de
TSPX entre embriões machos e fêmeas por reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real. Material e Métodos:
Como amostra controle foi utilizado tecido testicular bovino. Foram analisado pools de 20 embriões produzidos por
fertilização in vitro para cada fase do desenvolvimento embrionário pré-implantação (1-2; 2-4; 4-8; 8-16; 16-32 células,
mórula e blastocisto) para a análise qualitativa de expressão dos genes TSPX e SRY por PCR com transcrição reversa
(RT-PCR). A seqüência obtida após a amplificação para o gene TSPX foi seqüenciada para confirmação da origem do
segmento estudado. Para a análise quantitativa por PCR em tempo real foram obtidos seis embriões individualizados
submetidos à extração concomitante de DNA (para a sexagem utilizando o gene TSPY) e RNA. O gene da β-actina foi
utilizado como controle. Resultados: Foram encontrados transcritos dos genes TSPX e SRY no tecido testicular e em
todas as fases analisadas do desenvolvimento embrionário bovino, exceto no estágio de 1-2 células. Com o DNA extraído
foi possível realizar a sexagem dos embriões antes da análise quantitativa, a qual revelou a presença de transcritos de
TSPX apenas nos blastocistos femininos e no tecido testicular. Conclusão: A expressão dos genes estudados mostrou-se
muito precoce, sendo verificada em todos os estágios, exceto no de 1-2 células. Foi detectado um padrão de expressão
diferencial de TSPX entre machos e fêmeas no estágio de blastocisto que, associado à expressão de SRY nos embriões
masculinos, poderia contribuir para a diferença na velocidade de desenvolvimento entre os embriões machos e fêmeas
relatada por vários autores nesse período do desenvolvimento embrionário.
Apoio Financeiro: FAPESP/CNPq/FAEPA/PRONEX/ANCP.
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Teoria cromossômica do câncer e expressão
da telomerase em uma linhagem tumoral
de camundongo
Oliveira-Júnior, RJ1; Vieira, CU1; Reis, CF 1; Goulart, LR; Morelli, S1
Instituto de Genética e Bioquímica, Universidade Federal de Uberlândia
[email protected]
1
Palavras-chave: Sarcoma 180, citogenética, telomerase, evolução cromossômica, micro-seleção natural
O câncer é uma doença resultante da instabilidade genética. Existem duas linhas teóricas que tentam explicar a origem da
patologia, a teoria da mutação pontual convencional e a teoria cromossômica do câncer. Diversas características das células
neoplásicas que não podem ser explicadas através das mutações convencionais são explicadas pela teoria cromossômica.
A telomerase desempenha um papel importante no surgimento e desenvolvimento do câncer, permitindo que as células
tumorais se proliferem sem as barreiras impostas pela erosão telomérica. É observado, frequentemente, que o câncer
possui células específicas que são responsáveis pela progressão tumoral. O objetivo do presente trabalho foi realizar a
caracterização genética e citogenética da linhagem celular, bem como utilizar a mesma para entender alguns aspectos
da biologia tumoral, como expressão da telomerase, resposta cariotípica frente a diferentes tipos de manutenção da
linhagem, presença de células-tronco tumorais e o papel da aneuploidia na progressão da neoplasia. A linhagem celular
sarcoma 180 possui uma população heterogênea de células, com número modal de 68 cromossomos (tetraplóide) e
número cromossômico variando de 16 a 232. A linhagem celular não apresentou diferenças cariotípicas referentes aos
diferentes tipos de manutenção celular ou diferentes tempos de progressão tumoral. Em todas as metáfases analisadas
foram encontrados cromossomos marcadores, sendo eles três cromossomos metacêntricos e quatro microcromossomos. A
heterocromatina constitutiva é rica nas bases A-T e sua localização é conservada nas regiões pericentroméricas. As NORs
encontram-se ativadas, em pelo menos um cromossomo do par, em todos os cromossomos que possuem a seqüência de
DNAr, sendo eles os cromossomos 2, 4, 8, 10, 11, 12, 15, 16, 17, 18 e 19. Dentro da população encontram-se algumas
células que possuem as combinações cromossômicas ideais para a perpetuação do tumor, que foram denominadas
células-tronco tumorais. A linhagem possui elevada expressão da telomerase em comparação com células do sangue,
lavado peritoneal, mesentério e testículos, o que permite com que a linhagem se prolifere indefinidamente. A tetraploidia
observada em sarcoma 180 foi originada via endoreduplicação e durante a evolução cariotípica da linhagem, foram
selecionadas alterações cromossômicas específicas que conferem vantagens adaptativas às células tumorais.
Apoio financeiro: FAPEMIG, CNPq, CAPES, UFU.
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Domínios estruturais conservados e
fosforilação preditiva em proteínas de
músculo gastrocnêmio de rato
Ribeiro Junior, HL²; Salles, KFF²; Ferraz, ASM²; Machado, AAN²; Barros, PM²; Moraes, SMD¹; Ceccatto, VM¹; Lima, TS²
¹Mestrado Acadêmico em Ciências Fisiológicas
²Instituto Superior de Ciências Biomédicas – Universidade Estadual do Ceará
[email protected]
Palavras-chave: Proteínas, Bioinformática, Músculo Esquelético, Evolução Molecular, Fosforilação
Dados experimentais obtidos a partir de perfil bidimensional de proteínas de músculo gastrocnêmio de ratos Wistar
foram utilizados como entrada para o estudo teórico de seus domínios protéicos estruturais conservados e predição
de potenciais sítios de fosforilação. Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e dissecado o músculo
gastrocnêmio. Após a extração, foi realizada a eletroforese bidimensional (2D-PAGE, pI 4-7, 7cm), coloração com
Coomassie Blue, digitalização e análise no software ImageMaster 2D Platinum. A identificação dos spots foi efetuada
contra o banco de dados Uni ProtKB/Swiss-Prot, utilizando a ferramenta online Tagident. Suas seqüências de aminoácidos
foram usadas como entrada de dados para programas preditivos online: sítios de fosforilação (ProMoST – www.promost.
com) e domínios conservados (SMART – http://smart.embl-heidelberg.de). No ProMoST, foram plotados os dados
experimentais obtidos em gel bidimensional, caracterizando cerca de vinte isoformas da proteína MYBPH (proteína
ligante de miosina – H, MYBP_RAT, O88599). Na simulação, foram incluídas as espécies protéicas: camundongo
(MYBPH_MOUSE, P70402) e humana (MYBPH_HUMAN, Q13203). Os resultados mostraram um perfil gráfico,
onde se reconhece diferentes spots com pequenas diferenças de pI (variando de 5 a 6,8), ocorrendo fosforilação pelas
enzimas fosforilases ST e Y, com cerca de 20 isoformas cada (incluindo a proteína não-modificada). Os resultados
preditivos obtidos através do ProMoST e dos dados utilizados, mostraram correlação com os dados experimentais.
Sugere-se que o uso desta ferramenta na análise de géis 2D pode facilitar a identificação de fosfo-isoformas. O programa
SMART caracterizou domínios conservados. As proteínas estudadas (miosinas, actinas, tropomiosinas, proteínas
ligantes de miosina, tipo C e H entre outras) mostraram dezenas de sítios de conservação. Desta forma, montou-se um
quadro analítico que considera a proteômica de músculo que envolve a homologia dos sítios estruturais conservados e
suas relações estruturais e fisiológicas. Em MYBPH, usada aqui como modelo analítico, encontrou-se dois domínios
IGcam e um FN3. O primeiro é um domínio imunoglobulínico de adesão molecular, constituindo uma subfamília
molecular. O domínio FN3 é um dos três tipos de repetições internas encontradas no plasma da proteína fibronectina.
Aproximadamente 2% de todas as proteínas animais contém o motivo FN3, incluindo proteínas intra e extra-celulares.
Análises preditivas utilizando ferramentas preditivas podem auxiliar na busca de biomarcadores para alterações musculares,
como o exercício físico e o diabetes mellitus.
Apoio Financeiro: Funcap, CNPq, FINEP.
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Estudos cromossômicos em células tumorais
obtidas a partir de expansão clonal indicam
a presença de células-tronco tumorais
Oliveira-Júnior, RJ1; Oliveira, DM1; Vieira, NR1; Morelli, S1
Instituto de Genética e Bioquímica, Universidade Federal de Uberlândia
[email protected]
1
Palavras-chave: Sarcoma 180, expansão clonal, citogenética, poliploidia, células-tronco tumorais
As células cancerosas em geral apresentam muitas alterações no material genético, uma vez que acumulam uma série de
mutações e anomalias cromossômicas. Em algumas células tumorais são observadas profundas mudanças cariotípicas, o que
possibilita a análise citogenética destas aberrações. O presente estudo teve como objetivo acompanhar o desenvolvimento
de uma linhagem celular a partir de uma única célula tumoral (expansão clonal) e fazer a análise citogenética da população
celular resultante. As células cancerosas foram retiradas do animal e células individuais foram isoladas por meio de
diluição seriada em uma placa de ELISA com 96 poços. Os cromossomos das células tumorais foram obtidos por meio
da técnica de suspensão celular e as metáfases foram analisadas por meio de microscopia óptica. As células normais de
camundongos possuem 2n=40 cromossomos, sendo que todos eles são acrocêntricos. O sarcoma 180 possui número
cromossômico anormal variando de 68 a 71 cromossomos (tetraplóide), com a presença de cromossomos metacêntricos
e micro-cromossomos que são marcadores desta linhagem. Foram individualizadas células em pelo menos 50 poços
diferentes, no entanto somente uma célula foi capaz de se proliferar e originar uma nova população celular. Este dado
sugere que somente algumas células que possuem características específicas são responsáveis pela progressão tumoral,
sendo elas frequentemente denominadas células-tronco tumorais. Analisando a população obtida por meio de expansão
clonal foi observado que as células mantiveram os cromossomos marcadores da linhagem, no entanto observou-se um
aumento no número de cromossomos metacêntricos. Também foi observado um aumento no número cromossômico
geral em relação às células tumorais originais, sendo que mais que 50% das metáfases apresentaram o dobro do
número cromossômico original (>120 cromossomos). O aumento do número cromossômico se deve provavelmente
à poliploidização de uma célula via endoreduplicação. Apesar de algumas células possuírem número cromossômico
extremamente alterado, a cultura celular se manteve viável e as células foram capazes de originar tumores em animais
(in vivo). As células inoculadas nos animais foram recuperadas depois do desenvolvimento tumoral e re-analisadas.
Observou-se que a população celular retornou ao estado tetraplóide original, caracterizando mais uma vez a presença
de células-tronco tumorais. Desta forma acredita-se que o tumor é composto por uma população heterogênea de
células e somente as células tetraplóides possuíam as características adaptativas necessárias para se desenvolverem no
animal. A presença de variabilidade genotípica dentro da população tumoral pode ser interessante para a manutenção
do tumor. Ao ocorrer algum tipo de pressão seletiva, como o tratamento com quimioterápicos, a população celular
possuirá material genético diversificado, podendo algumas células apresentar características que as permitam sobreviver
às adversidades encontradas. Desta forma, a progressão tumoral seguiria todas as leis evolutivas propostas por Darwin,
ocorrendo assim uma “micro-seleção natural”.
Apoio financeiro: FAPEMIG, CNPq, CAPES, UFU.
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Identificação do gene candidato para
mutação careca induzida por ENU em
camundongos
Lopes, GC1; Massironi S2; Melo, LCFP1; Reis, BLFS1; Guénet, JL3; Godard, ALB1
Laboratório de Genética Animal e Humana, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais/MG
2
Biotério de Experimentação do Departamento de Imunologia, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo/SP
3
Unité de Génétique des Mammifères, Institut Pasteur, França
[email protected]
1
Palavras-chave: Mutação induzida, ENU, clonagem gênica, Fgfr2
Através do projeto “Camundongo como organismo modelo: Indução de novas mutações” de colaboração entre o LGAH
do ICB/UFMG e o Biotério de Experimentação do Depto. de Imunologia do ICB/USP buscou-se induzir mutações
em camundongos com a utilização de ENU (Etil-Nitroso-Uréia), que gera mutações pontuais em região aleatória no
genoma.O projeto ENU gerou 11 mutantes com fenótipos característicos e marcantes dentre eles o careca (carc). Essa
mutação isolada em linhagem isogênica BALB/c se caracteriza por ser recessiva, A partir de observações histológicas
dos animais observou-se nos rim aumento da celularidade nos glomérulos, o baço apresenta hiperplasia de tecido
linfóide e o fígado apresenta aumento de celularidade nas regiões periarteriolares. O linfonodo dos animais mutantes
mostrou-se maior em relação aos animais normais, apesar de apresentar uma distribuição normal de células T, B e
macrófagos. Os níveis de T3, T4 e TSH estão sendo medidos com a finalidade de explicitar um possível envolvimento
hormonal no fenótipo mutante. Com base nas observações histológicas, é possível que o mutante careca sofra de algum
problema metabólico hormonal ou mesmo de algum distúrbio imunológico envolvido com formação da pelagem.
Esse trabalho tem como objetivo de mapear e Identificar o gene causador do fenótipo carc, identificar e caracterizar
a mutação a nível molecular e avaliar o valor do mutante como um modelo animal viável para estudos subseqüentes.
O mapeamento genético à média resolução proveniente da genotipagem por meio de microssatélites de 783 animais
com 15 marcadores polimórficos, pôde posicionar o locus careca no cromossomo 7 num intervalo genômico de 5,56
megabases compreendido entre os marcadores D7Mit105 e D7Mit304. Os resultados do mapeamento posicionaram o
locus carc na porção distal do cromossomo 7 em uma região homóloga aos cromossomos humanos 10q25-q26, 11p15.5
e 11q13.3. Dentre os genes conhecidos neste trecho, o gene Fgfr2 (fibroblast growth factor receptor 2) foi considerado
o candidato mais imediato, já que participa ativamente da diferenciação epidérmica no embrião. Além disso, animais
knockouts para Fgfr2 mostram intensa correspondência fenotípica com o mutante carc. Existe também dentro da região
mapeada 5 genes com função ainda não descrita experimentalmente e 3 genes homeobox. O seqüenciamento do gene
descartou qualquer mutação exônica capaz de indicar a possibilidade do gene Fgfr2 ser o responsável pelo fenótipo carc.
A busca pela identificação gene causador do fenótipo carc continua tendo como foco principal no estudo dos genes sem
função descrita em concomitância com mapeamento posicional do loci carc com o uso de marcadores SNPs.
Instituições financiadoras/parceiras: FAPEMIG, CAPES/FAPESP, USP e Instituto Pasteur – Paris.
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Evolution of the gene regulatory network
controlling trunk segmentation in insects
Marques-Souza, H1; Aranda, M2; Tautz, D3
Department of Integrative Biology, University of California, Berkeley, USA
2
Institute for Genetics, University of Cologne, Cologne, Germany
3
Department of Evolutionary Genetics, Max-Planck-Institute, Ploen, Germany
[email protected]
1
Keywords: Gene, regulatory network, evolution, development, insect, segmentation gene, RNAi, gene silencing
The study of pattern formation in insects is the main source of our current understanding of the genetic processes
underlying the development of an organism. In the model organism Drosophila melanogaster, a set of transcription factors
and signaling molecules pattern the embryo through a segmentation gene cascade. Maternal gradients define broad
expression domains of the transcription factors called gap genes, which are involved in a cross-regulatory network along
the anteroposterior axis of the fly embryo. This cross-regulatory network regulate the expression of downstream genes like
pair rule, segment polarity and Hox genes, resulting in the patterning all body synchronously (long germ development).
Although orthologs of most of the Drosophila segmentation genes can be found in all arthropods, functional study in
insects displaying more ancestral mode of development (short germ development) reveals significant differences in the
role of these genes during insect development. In order to shed light into the evolution of insect body patterning, we
analyzed the role of the gene regulatory network controlling trunk segmentation in the short germ beetle Tribolium
castaneum. To this aim, we performed a simultaneous analysis of an extensive number of segmentation genes using
techniques such as in situ hybridization and gene silencing to characterize the expression pattern, function and genetic
interaction among these genes during embryonic developing. Our data reveals that, although most of the segmentation
genes are expressed in comparable patterns between Tribolium and Drosophila, their interactions as well as their role
in regulating target genes has changed significantly since both species have diverged from their last common ancestor.
In contrast to Drosophila, it seems that the gap genes have only a minor role in regulating pair rule genes in Tribolium.
This evolutionary difference might reflect the different mode of development between both species. Intriguingly, we
find that the expression of the gap genes along the AP axis in Tribolium form a set of repression borders essential for
the regulation of the trunk Hox genes in their collinear anteroposterior order of expression. By altering the limits
of the gap gene expression domains via RNAi, it is possible to generate Tribolium larva that are completely lacking
limbs, with additional pairs of legs or with additional mouthparts along the body. More importantly, based on our
interpretation of the Hox gene regulation in Tribolium, we are able to interpret all morphological changes observed in
the gap gene knockdown embryos and to propose a model for the evolution of the gene regulatory network controlling
trunk segmentation in insects.
Funding: International Graduate School in Genetics and Functional Genomics.
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Segmentação: velhos genes, novas funções
Andrioli LP
Escola de Artes Ciências e Humanidades, USP/SP
[email protected]
Tailless (tll) e huckebein (hkb) são genes expressos nas porções mais terminais do embrião, diretamente sujeitos a
regulação do receptor tirosina-quinase Torso, desencadeador do sinal responsável pela formação das extremidades não
segmentadas do corpo da larva. Nas regiões mais centrais do embrião, uma cascata de fatores de transcrição organizada
em níveis hierárquicos (gap, pair-rule e segment-polarity) gera informação posicional necessária para a especificação
dos segmentos do corpo. Nesse estudo investigo a possibilidade de que hkb e tll também participem da regulação do
padrão estriado pair-rule na região anterior do embrião. De acordo com modelo que proponho, faixas pair-rule não
são formadas nas regiões mais terminais do embrião devido à atividade combinatória de repressores locais. Para testar
esse modelo, o padrão de faixas de expressão pair-rule foi analisado em embriões duplo-mutantes nulos formados pela
combinação de um repressor comum de faixas anteriores (sloppy-paired, slp) com hkb ou tll. Dessa forma detectamos
efeitos específicos de desrepressão de faixas anteriores em embriões slp-hkb- e slp-tll-, maiores do que em embriões
mutantes simples para esses genes, evidenciando a atuação de tll e hkb como repressores. A expressão ectópica de tll
e hkb diretamente sobre as faixas confirmou o papel repressor desses genes para faixas específicas, compatível com os
resultados verificados com os mutantes. Fato interessante, nos experimentos com a expressão ectópica, foi verificada a
atuação de tll como repressor dos genes Kr, kni e gt, sinalizando um possível mecanismo de gradiente de concentração
de Tll. No momento estamos gerando e analisando duplo-mutantes e triplo-mutantes para verificar se essa atividade
não detectada no mutante simples tll- também reflete um papel fisiológico segundo um mecanismo combinatório na
regulação de genes gap da região mediana do corpo. A atuação combinatória e/ou redundante de reguladores é um
indício da robustez dos mecanismos de regulação necessários para a geração dos segmentos do corpo, assegurando a
correta expressão espacial dos genes envolvidos.
Apoio financeiro: FAPESP.
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Bahia Othon Palace Hotel • Salvador • BA • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
Positive selection in a conserved gene
Sobrinho Jr., IS1; de Brito, RA2
Laboratório de Genética de Populações e Evolução, Departamento de Genética e Evolução, UFSCar
[email protected]; [email protected]
Keywords: positive selection, doublesex, Anastrepha, sex differentiation genes
Doublesex (dsx) is a key gene in the sex differentiation cascade in insects and acts by regulating genes that are responsible
for males or females traits. Because of functional and structural conservation of its DNA-binding domain and the central
role dsx plays in sexual differentiation, this gene is expected be reasonably conserved. In this work we study population
genetics data for many specimens of the Anastrepha fraterculus species group, notably A. fraterculus, A. sororcula and A.
obliqua, to investigate patterns of molecular adaptation in the common region of dsx and test the hypothesis that this
gene is evolutionary conserved and evolves under purifying selection. Flies were collected from 39 localities in Brazil.
DNA was extracted and a 543 bp fragment, which represents the common region of dsx between both gender and
contains de DNA-binding domain, was PCR amplified, purified, and cloned. At least two to five recombinant colonies
were sequenced per individual. These sequences were aligned and the haplotype network was inferred by statistical
parsimony. Our results show that haplotype diversity of dsx was very high and its evolutionary rate, based on dN/dS
estimates, was approximately eightfold higher than mitochondrial COI data from these same populations. Although
the relatively high proportion of nonsynonymous substitutions found in dsx, Tajima’s and Fu and Li’s neutrality tests,
Templeton’s contingency test and the analysis of dN/dS ratio in PAML revealed an overall signature of purifying
selection. However, when using the test of McClellan et al. (2005), which considers shifts in amino acid properties
of nonsynonymous substitutions and determines if the change is conservative or radical, we found five amino acid
properties that were under positive-destabilizing selection. The majority of them were detected in the 3’ end of the
common exon, but none was detected in the DNA-binding domain. Interestingly, two of the affected properties were
involved in structural changes in α-helixes at the 3' extremity, showing that structural changes in α-helix had been
favored by selection at this region. Such results indicate that dsx evolves under a complex pattern of diversification
with some regions being affected by positive selection in a background of mild purifying selection. Sequencing of the
whole gene in these individuals might help elucidate these questions.
Financial support: CAPES, CNPq, FAPESP.
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Conservação do fator de transcrição Doublesex
em insetos e seu papel na regulação das
proteínas de estocagem em Apis mellifera
Freitas, FCP1; Cristino, AS2; Simões, ZLP1,3
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
2
Instituto de Física de São Carlos, Universidade de São Paulo
3
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
[email protected]
1
Palavras-chave: Doublesex, regulação gênica, Apis mellifera
O gene doublesex (dsx) está entre os genes mais conservados que participam da determinação do sexo em insetos e
ocupa a base da hierarquia reguladora dos genes envolvidos na diferenciação sexual somática. O dsx codifica um fator
de transcrição (DSX) que regula a transcrição sexo-específica de vários genes. Recentemente, foram identificadas
quatro isoformas alternativas de mRNA do gene dsx em Apis mellifera, sendo duas específicas de fêmea, uma específica
de macho e uma presentes em ambos os sexos. A função melhor caracterizada do DSX é a regulação da expressão de
proteínas de estocagem tais como a proteína do ovo (yp1) em Drosophila melanogaster, a vitelogenina (vg) em Bombyx
mori e a hexamerina 1.2 (hex1.2) em Ochlerotatus atropalpus. Este estudo teve dois objetivos: caracterizar do perfil de
expressão de cinco genes (dsx, ix, vg, hex70A e hex110) em rainhas e zangões nos estágios larvais 4 (L4), 5 (sudivisões
L5F2 e L5S3) e pupal (pupa de olho branco, Pw) e realizar uma análise filogenética da evolução do dsx em insetos.
O fato de dsx apresentar-se conservado em metazoários indica que as vias regulatórias e os genes-alvo controlados por
este fator pleiotrópico possam também estar conservados. Análises filogenéticas e da região promotora dos genes vg e
hex110 em insetos (apresentados em trabalhos anterioes) indicam ser estes os candidatos a terem expressão diferencial
nos sexos de A. mellifera. Contudo, foi observado que não parece haver um perfil de expressão específico de sexo para
os genes ix, vg, hex70A e hex110, mas sim uma expressão diferencial (em níveis de transcritos) entre os sexos.
Apoio Financeiro: FAPESP.
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Níveis de esterase do hormônio juvenil (HJ) e
epóxido hidrolase do HJ no desenvolvimento
pós-embrionário de Melipona scutellaris
Bonetti, AM1; Mackert, A2; Vieira, CU1; Bitondi, MMG3; Paulino-Simões, ZL3
Universidade Federal de Uberlândia, Instituto de Genética e Bioquímica, Laboratório de Genética
2
Depto. de Genética, FMRP, Universidade de São Paulo
3
Depto. de Biologia, FFCLRP, Universidade de São Paulo
1
A ação do Hormônio Juvenil (HJ) na diferenciação de casta e polietismo etário em abelhas depende de genes que estão
relacionados com o controle de sua síntese e degradação. A Esterase do HJ (JHE) produzida no corpo gorduroso e
secretada na hemolinfa e a Epóxido Hidrolase do HJ (JHEH) enzima citosólica, participam da degradação do HJ.
Em A. mellifera essas proteínas foram estudadas e apresentaram perfis compatíveis com os títulos de HJ durante o
desenvolvimento pós-embrionário. Em Melipona scutellaris essas proteínas foram estudadas utilizando-se anticorpos
específicos para A. mellifera durante o desenvolvimento pós-embrionário de operárias. As análises foram feitas por
western blot após separação de extrato protéico total por SDS-PAGE. Foram localizadas proteínas de peso molecular
compatíveis com A. mellifera. Ambas foram encontradas na hemolinfa (JHE) e corpo gorduroso (JHEH) durante todo
o desenvolvimento, no entanto, o perfil destas proteínas foi diferente do obtido para A. mellifera. Os maiores níveis de
JHE foram encontrados nas fases de larva defecante e pupa de olho branco, que correspondem ao final do instar larval
e início do estágio pupal. Em relação à JHEH altos níveis de proteínas foram encontrados durante todos os estágios
larvais e pupais analisados. Em abelhas adultas, ocorre queda dos níveis de JHEH. Apesar da alta similaridade entre as
seqüências de A. mellifera e M. scutellaris, evidenciada pelo fato da localização das proteínas utilizando anticorpo nãoespecífico, o perfil das proteínas durante o desenvolvimento é diferente. Esse fato sugere que a regulação dessas duas
proteínas seja diferente entre essas espécies de abelhas.
Apoio Financeiro: FAPESP, FAPEMIG e CNPq.
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Gene codificador de uma proteína cuticular
rica em glicina em Apis mellifera: expressão
modulada por ecdisteróides durante o
desenvolvimento
Soares, MPM; Bitondi, MMG
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto – USP Departamento: Biologia
Avenida Bandeirantes, 3900, 14040-901, Ribeirão Preto, Brasil
[email protected]
Palavra-chaves: gene codificador de proteína cuticular, Apis mellifera, tegumento, ecdisteróides
Resumo: Os insetos são recobertos por uma estrutura extracelular, a cutícula. Dentre seus principais componentes
destacam-se as proteínas cuticulares, as quais são sintetizadas pela epiderme e secretadas em momentos precisos dos
ciclos de muda. O presente trabalho se desenvolve dentro de uma abordagem ampla que visa obter informações sobre
estrutura, função e regulação hormonal de genes codificadores de proteínas integrantes das diferentes cutículas que
recobrem a abelha Apis mellifera em seus estágios larval, pupal e adulto. Neste contexto, foi investigada a expressão de um
gene codificador da proteína cuticular, AmelGrp. O RNA foi extraído do tegumento (epiderme e cutícula) dos diferentes
estágios e utilizado em experimentos de RT-PCR semiquantitativa para síntese de cDNA, amplificação, clonagem e
seqüenciamento. A proteína predita apresentou regiões ricas em glicina, evidenciando uma provável classe de proteínas
cuticulares inédita em abelhas. A expressão de AmelGrp se restringe a períodos específicos do desenvolvimento e não
está sujeita a regulação espacial. O aumento dos transcritos AmelGrp, tanto no tórax quanto no abdômen, coincide
com o declínio do título de ecdisteróides na hemolinfa. Experimentos in vitro confirmaram que AmelGrp é regulado
por estes hormônios. Western blots mostraram que os níveis da proteína AmelGrp se relacionam positivamente com
os níveis do respectivo transcrito nas diferentes fases do desenvolvimento. No presente momento estamos utilizando o
RNA de interferência como ferramenta para investigar a função do gene AmelGrp.
Apoio Financeiro: Fapesp, CnpQ, Capes-Proap, Pro-Reitoria de Pós-graduação.
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CO2 inibe a ativação de ovários e expressão
de genes ligados à reprodução em operárias
Apis mellifera
Macedo, LMF1; Guidugli-Lazzarini, KR1; Laure, MAFB2; Simões, ZLP1
Departamento de Biologia, FFCLRP- USP
Departamento de Genética, FRMRP - USP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: abelha, vitelogenina, perfil protéico, expressão gênica, status reprodutivo
Em Apis mellifera a rainha é a única fêmea na colônia com capacidade de acasalar e botar ovos fecundados. As operárias,
facultativamente estéreis, arcam com as tarefas não-reprodutivas. Ambas sintetizam vitelogenina (Vg), principal proteína
do ovo, porém, a modulação da expressão do gene codificador dessa proteína, a função exercida por ela, diferem nas
castas. Inúmeros agentes podem estimular ou reprimir a síntese da Vg. Sabe-se que a exposição ao dióxido de carbono
(CO2) afeta o processo reprodutivo em ambas as castas. O tratamento das rainhas com CO2 eleva os títulos de Vg na
hemolinfa e acelera o desenvolvimento ovariano. Nas operárias o efeito é antagônico. Dentro deste cenário, os nossos
objetivos foram: analisar os títulos de proteínas na hemolinfa de abelhas operárias (órfãs) controles e tratadas com CO2 e
verificar diferenças na expressão de genes relacionados à reprodução. O tratamento foi realizado no quarto e quinto dia
após a emergência. No décimo dia, foram extraídos corpo gorduroso e ovário (para análises moleculares) e hemolinfa
(para análise protéica por meio da técnica SDS-PAGE). Os genes selecionados para a análise de expressão, por RTPCR semi-quantitativa, foram os codificadores de: Vg, Lipoforina (Lp) e seus receptores, Transferrina, Hexamerina
70a e Buffy. O tratamento inibiu o desenvolvimento ovariano e também modificou o padrão protéico, causando uma
diminuição nos títulos de Vg e hexamerinas 70a, 70b e 70c presentes na hemolinfa de operárias com dez dias de idade.
Também observamos um harmônico aumento tanto da expressão da Lp (ligante) quanto do seu receptor. Nos demais
genes, a expressão foi maior no grupo controle, cujos ovários apresentavam-se predominantemente ativados. Acreditase que a hexamerina 70a tenha função associada ao desenvolvimento dos ovários e reprodução. A principal função da
transferrina nos ovários é o fornecimento essencial de íons de ferro necessários para o desenvolvimento dos ovócitos e
embriões. O buffy é inibidor de morte celular programada e a maior expressão deste gene é esperada nos tecidos que
não entraram em processo de morte celular. Sugerimos que os genes estudados possam fazer parte da rede que regula
a esterilidade funcional em operárias. O aumento observado na expressão de Lp pode compensar a diminuição de Vg,
já que, estas duas proteínas compartilham funções como transporte de lipídios e de estocagem. A análise conjunta dos
nossos resultados mostra que o tratamento com CO2 afeta genes importantes em processos reprodutivos e através deste
tratamento podemos ampliar os conhecimentos nesta área de estudo.
Apoio Financeiro: FAPESP, CAPES.
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Identificação e expressão de um gene
Toll-Like receptor em Melipona scutellaris
(Hymenoptera, Apidae, Meliponina)
Amaral, IMR1; Vieira, CU1; Bonetti, AM1
Instituto de Genética e Bioquímica, Laboratório de Genética, Universidade Federal de Uberlândia/MG
[email protected]
1
Palavras-chave: Melipona scutellaris, receptor toll, Drosophila melanogaster, resposta imune, proteína transmembrânica
Em Drosophila melanogaster, as moléculas toll foram inicialmente descritas como receptores transmembrânicos do tipo
I com um papel importante no desenvolvimento dorso-ventral do embrião. Moscas geneticamente deficientes em
moléculas toll apresentam uma capacidade reduzida de defesa contra fungos e bactérias gram-positivas. Posteriormente,
pelo menos 11 tipos de moléculas toll análogas às de Drosophila foram identificadas em mamíferos e denominadas “tolllike” receptors (TLRs). Os TLRs são proteínas transmembranas caracterizadas por seqüências extracelulares repetidas
ricas em leucina capazes de reconhecer um amplo grupo de padrões moleculares associados à patógenos (PAMPs) de
diferentes espécies de microrganismos e fundamentais para a ativação da resposta imune inata. Não existem trabalhos
sobre o sistema imune de abelhas sem ferrão. Devido ao potencial econômico dos meliponíneos, principalmente no norte
e nordeste do Brasil, é de vital importância conhecer os seus mecanismos de defesa contra patógenos. Nesse trabalho foi
feito a identificação de um gene Toll em Melipona scutellaris e análise de expressão durante o desenvolvimento larval.
Análises de bioinformática no genoma de Apis mellifera revelaram um gene codificante para receptor Toll. Em seguida,
foi desenhado um par de primer específicos para esse gene para estudos de expressão. Os RNA totais de larvas L1,
L2, L31 e L32 de M. scutellaris foram extraídos utilizando Trizol. Em seguida foi feita a reação de transcrição reversa e
análise da expressão por PCR semi-quantitativa. O fragmento gênico foi clonado e seqüenciado para caracterização do
gene em M. scutellaris. Alinhamento com clustal W mostrou a homologia desse gene com o de Apis mellifera. Análise
de expressão gênica mostrou que o gene MsToll é expresso em todas as fases analisadas. Nos meliponíneos, o alvéolo
de cria é preenchido com alimento (pólen, mel e secreção glandular), a rainha ovoposita em cima desse alimento, sem
seguida o alvéolo é lacrado. Esse alimento larval é rico em bactérias. A expressão desse gene durante a fase larval pode
ser explicado pela grande interação entre as larvas e as bactérias do alimento. A proteína toll é essencial para sinalizar a
invasão do organismo por bactérias, disparando uma cascata de eventos para tentar bloquear essa invasão.
Apoio: CNPq, FAPEMIG, CAPES, UFU.
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Can a storage protein plays a nuclear activity?
Martins, JR; Araújo, LA; Nunes, FMF; Bitondi, MMG
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Departamento de Genética, Universidade de São Paulo
[email protected]
Keywords: Apis mellifera, hexamerin, ovaries, immunofluorescence
In preparing for metamorphosis, insect larvae store a huge amount of proteins in hemolymph, mainly hexamerins. Out
of four hexamerins synthesized in the fat body of the honey bee larvae, HEX 70a exhibited a peculiar developmental
pattern, especially it is present in adults. The fat body is not the only site for hex 70a gene expression. Both transcripts and
protein subunits are detected in developing gonads from workers and queens, suggesting a role in ovary differentiation.
Here we used a monoclonal antibody against HEX 70a in immunofluorescence assays and confocal microscopy to
localize this hexamerin in the ovaries of newly emerged queens. At this life cycle stage, the queen ovary consists around
200 ovarioles, each one formed by a terminal filament (containing somatic cells) and a germarium (with oogonia and
somatic cells). A vitellarium containing the oocyte and nurse cells is not yet distinguished in ovarioles of newly emerged
queens. Our analyses revealed that HEX 70a is present mainly in the nuclei of all germarium cells types. In termites,
a hemolymph-soluble hexamerin is able to covalently binding JH to modulate JH-dependent gene expression. The
presence of hexamerins in the germarium nuclei is an amazing novelty and strongly suggest that HEX 70a protein can
be a hormone carrier to the cell nucleus, acting as a transcription factor.
Supported by: FAPESP, FAEPA.
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Cellular basis of selection response
and phenotypic plasticity in Drosophila
melenogaster
Torquato, LMS; Bitner-Mathé, BC
Instituto de Biologia, Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio de Janeiro
[email protected]
Palavras-chave: Cell size, developmental temperature, Drosophila, selection, wing shape
Artificial selections on wing shape have been separately performed at two temperatures: 39 generations at 16.5oC and 64
generations at 22oC. This selection program resulted in lines of Drosophila melanogaster with ring-shaped or elongated
wings. We tested whether the changes in the mean values of the artificially selected character has led to changes in
the phenotypic plasticity of this character in terms of cell size and cell number. For each direction and temperature of
selection, flies were raised in two generations at 16.5oC or 25oC. For up to 40 females by group, the numbers of tricomes
were counted in standard squares on 5 intervein areas of the dorsal surface of the wing. These data were also used for
estimating the cell size throughout the wing blade. We observed that cell size varies across intervein areas, increasing
towards the anterior region of the wing. This pattern of variation can be better explained by the fitting of a quadratic
distribution than by a linear one. There is also a significant effect of developmental temperature: the cell size is greater
at the lowest temperature. But the most interesting was that we observed a significant effect of the interaction between
the direction of selection and the temperature where the selection was performed. These preliminary results suggest
that variation in cell size is related to wing shape variation. Moreover, populations may respond to similar selection
regime through different genetic mechanisms, depending on the environment where the selection was performed, and
this response may be partially independent from that related to the character plasticity.
Apoio financeiro: CNPq e FAPERJ.
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Candidate genes expression and wing shape
divergence in Drosophila melenogaster
Matta, BP; Bitner-Mathé, BC
Instituto de Biologia, Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio de Janeiro
[email protected]
Palavras-chave: morphological evolution, wing development, artificial selection, real-time quantitative RT-PCR, Drosophila
The outline shape of Drosophila wing can be estimated by the ratio between wing width and wing length, so that the
higher this ratio, the rounder the wing, and vice-versa. Through a program of bidirectional artificial selection in a single
natural population of Drosophila melanogaster, lines with a highly significant divergence in wing outline shape were
previously established. Since these lines have the same genetic background, and no correlated response of wing size to
the shape selection program was observed, they were used here to evaluate if genes functionally associated to the wing
development also account for the quantitative size-free wing shape variation between these lines. We have analyzed
the expression of three candidate genes involved in different processes during the development of wing imaginal disc:
rotund (rn), nubbin (nub) and Epidermal growth factor receptor (EGFR). Third instar wandering larvae were sexed
and dissected in cold PBS for the collection of 100 imaginal discs from at least 50 males of each selection line: rounder
outline shape (R line) or longer outline shape (L line). Two technical replicates of real-time quantitative RT-PCR (qRTPCR) were performed for each candidate gene in triplicates of each line sample. A reference gene (Rp49/RpL32) was
included to normalize the relative expression of candidate genes. RNA integrity and dissociation curves were analyzed
and did not show strong degradation or the presence of unspecific products. For all three tested genes, the normalized
relative expression (NRE) corrected by the efficiency of each gene was significantly greater than the expected at random
(REST, 5000 permutations: NRErn = 1,784; NREnub = 1,561; NREEGFR = 1,497; all P < 0,003). Moreover, all NRE
were higher in the R sample than in L the sample. That is, rn, nub and EGFR have transcription levels significantly
higher in males with rounder wings than in males with longer ones, showing the possibility that these genes might have
contributed to generate the phenotypic divergence between these lines. This preliminary result is now being validated
in biological replicates and in samples of a control line with no selection applied. A better normalization will be done as
well, with the inclusion of at least one more reference gene. Other candidate genes will be tested, so we hope to better
understand if morphological divergence can be rapidly generated through the selection of variation in non-coding
regions of genes functionally involved in developmental processes.
Apoio Financeiro: CNPq e FAPERJ.
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Plasticidade fenotípica da pigmentação em
Drosophila mediopunctata: forma da norma
de reação e valor fenotípico médio
Rocha, F; Medeiros, HF; Klaczko, LB
Departamento de Genética e Evolução, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas
[email protected]
Palavras-chave: plasticidade fenotípica, policromatismo, pleiotropia
Atualmente, parece haver um consenso sobre a idéia de que a plasticidade fenotípica e o valor médio de uma determinada
característica são geneticamente independentes. Neste trabalho, nós usamos a norma de reação da pigmentação
abdominal de Drosophila mediopunctata em resposta à temperatura para testar essa idéia. Em D. mediopunctata os
indivíduos podem ter de zero a três pintas escuras mediais no abdômen. Já se demonstrou que: esta característica sofre
forte influência da temperatura; tem determinação genética, com pronunciada influência do segundo cromossomo; há
uma associação não-aleatória entre as inversões PA0 e PC0 do segundo cromossomo e o número médio de pintas, na
qual a primeira inversão está associada a fenótipos claros (menor número de pintas) e a segunda associada a fenótipos
escuros (maior número de pintas). Para testar diferentes cenários envolvendo o valor fenotípico médio, as inversões
PA0 e PC0 e as normas de reação desse traço à temperatura, oito estirpes (quatro homocariotípicas para PA0 e quatro
para PC0) com valor fenotípico médio variável (de 1,01 a 3,00 pintas por indivíduo) foram criadas em 11 temperaturas
diferentes num gradiente térmico entre 14° e 24°C. Seguindo uma amostra estratificada, as oito estirpes formaram dois
grupos fenotípicos, independentemente do cariótipo: um grupo claro (valor médio abaixo de 2 pintas por indivíduo)
e um grupo escuro (valor médio acima de 2). Todas as estirpes apresentaram o mesmo padrão de resposta à variação de
temperatura, em que temperaturas mais baixas produziram animais com mais pintas que temperaturas mais altas. Os
dados (número de pintas de 1134 animais) foram analisados por duas ANCOVAs, testando separadamente os fatores
cariótipo e grupo fenotípico. Nenhum efeito significativo foi detectado para o cariótipo ou qualquer interação entre o
cariótipo e outras variáveis. Em contraste, houve um forte efeito do grupo fenotípico (F=26,804; g.l.= 1, 1118; P<0,001),
bem como da interação entre esse fator, a temperatura e o sexo (F=13,677; g.l.=1, 1118; P<0,001), indicando que
estirpes do grupo claro tiveram normas de reação diferentes de estirpes do grupo escuro. As normas de reação das oito
estirpes foram descritas por equações quadráticas (NP = a + bT + cT2), e apresentaram grande variação de forma, em
parte explicada pelo parâmetro c, que determina a curvatura da parábola descrita por essa equação. Foi detectada uma
correlação negativa significativa entre o valor médio de cada estirpe e a curvatura (valor de c) das normas de reação (r
= -0,93; P< 0,001), evidenciando uma alta dependência entre a forma da norma de reação e o valor fenotípico médio.
Esses resultados rejeitam diretamente a idéia de independência genética entre o valor médio e a plasticidade fenotípica
e podem indicar um padrão de correlação geral cuja importância pode ter sido subestimada.
Orgão financiador: FAPESP, CNPQ, CAPES.
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Variation in wing shape of artificially
selected lineages of Drosophila
melanogaster and its effects on correlated
traits and phenotypic plasticity
Corrêa, DM1; Bitner-Mathe, BC2
Instituto de Biologia, Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio de Janeiro
[email protected]; [email protected]
Palavra-chave: Drosophila melanogaster, phenotypic plasticity
Divergent lineages have been produced by artificial selection on the shape (SH) of the Drosophila melanogaster wing,
generating both elongated and rounded shaped wings. The selection program has been performed independently in
two temperatures (16.5°C and 22°C). In generation 39 at 16.5 oC and 64 at 22oC, some replications were transferred
to the opposite temperature while some were maintained at the original temperature. We tested the influence of the
environment where the lineages were selected over the artificially selected character and over other correlated traits. The
influence of the artificial selection over the phenotypic plasticity of the traits was also analyzed. We found significant
differences between the experimental conditions (direction of selection and temperature) where the direction of selection
was responsible for the largest amount of variation of SH. The temperature at which the selection process occurred
showed to be significant and appointed as the second principal effect causing variation in SH. Final temperature was
also significant but responsible for a minor variation. No interaction effect was detected. A preliminary study of the
correlation patterns of the wing traits, by Principal Components Analysis, indicates a similar pattern, also found in
preview studies, with a slight variation among the direction of selection and temperatures. The differences found are yet
to be confirmed. Transferring some replications to a different temperature allowed us to test the phenotypic plasticity
of the traits in each direction of selection. Traits responded differently when raised at a different temperature but all
directions of selection (elongated, control and rounded) responded very similarly. This suggests that although the
selection program was strong enough to change the genotypic structure that produces variation in the traits it didn’t
influence the mechanisms that control the phenotypic plasticity itself, allowing very divergent lineages to respond in a
very similar pattern. Wing size was highly affected by the temperature the lineages were raised in the final generation
comparing with the temperature at which the selection program occurred. Assessing the effects that influence the
variation of SH and its correlated traits is important to understand the mechanisms that underlie the variation of
complex traits as the wing of a fly.
Orgão finanaciador: CAPES.
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A forma das asas e o sucesso dos machos
em Drosophila melanogaster
Menezes, BF1; Vigoder, F2; Peixoto, A2; Bitner-Mathé, BC1
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Laboratório de Genética de Populações de Drosophila, Instituto de Biologia
2
Instituto Oswaldo Cruz, Laboratório de Biologia Molecular de Insetos
1
Palavras-chave: Drosophila, seleção sexual, variação morfológica
Em Drosophila, a corte é fundamental para o acasalamento, sendo constituída por uma série de processos. Entre estes
processos, o batimento das asas gera uma vibração que é característica de cada espécie e essencial no reconhecimento
intra-específico. Variações na forma das asas de Drosophila foram descritas entre populações e entre espécies, mas se estas
variações influenciam, direta ou indiretamente, o processo de corte é uma questão em aberto. Em nosso laboratório,
a partir de uma população natural de Drosophila melanogaster, foram obtidas por seleção artificial, linhagens com
formas de asas muito divergentes - quatro linhagens apresentam forma das asas alongadas e outras quatro apresentam
forma das asas arredondadas. Nesse trabalho, nós utilizamos essas linhagens para testar a influência da forma das asas
dos machos para o seu sucesso no acasalamento. Em cruzamentos onde machos de asas alongadas competiam com
machos de asas arredondadas, observamos um número significativamente maior de acasalamentos dos machos de
asas alongadas independente da fêmea disputada ser proveniente de linhagens com asas alongadas ou arredondadas.
O mesmo não ocorreu quando machos de asas alongadas competiam com machos de linhagens controle. Nesse caso,
o sucesso dos machos de asas alongadas foi significativamente maior apenas na disputa por fêmeas provenientes do
mesmo tipo de linhagens. Três testes complementares foram realizados. O primeiro permitiu descartar a hipótese de
que, nos experimentos que realizamos, o tamanho dos machos tenha sido o fator determinante para o seu sucesso.
O segundo mostrou que ao cortarmos as asas dos machos não foi mais possível detectar diferença no sucesso entre
machos provenientes de diferentes linhagens. O terceiro detectou diferenças significativas no padrão de som emitido
por machos provenientes de linhagens com asas alongadas e arredondadas. Esse conjunto de dados sugere que a forma
das asas tem influência no processo de corte e, embora não esteja clara a relação direta dessa influência, é possível que
ela esteja relacionada com o padrão de som emitido durante a corte.
Apoio: Bolsa IC CEPEG/UFRJ, FAPERJ, CNPq.
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Prevalência de agentes androcidas em
espécies de Drosophila
Martins, AB¹; Ventura, IM¹; Andrade, CAC¹; Araripe, LO¹; Klaczko, LB¹
Departamento de Genética e Evolução, Universidade Estadual de Campinas
[email protected]
1
Palavras-chave: “sex-ratio”, elementos genéticos egoístas, Wolbachia, Spiroplasma, D. paraguayensis
Agentes androcidas são elementos citoplasmáticos egoístas que causam desvios nas proporções sexuais. Para estes elementos
a morte precoce da prole masculina de uma fêmea infectada favorece sua disseminação, já que é transmitido verticalmente.
A prevalência de agentes androcidas, estimada por modelos matemáticos, depende da taxa de transmissão de uma
fêmea infectada para suas filhas e dos efeitos diretos e indiretos do agente causador no valor adaptativo do hospedeiro.
Até o momento não foi detectada influência da presença desses elementos no valor adaptativo de Drosophila, por isso
espera-se que a prevalência dos mesmos seja baixa neste grupo. Em populações naturais de Drosophila a prevalência
desses agentes varia entre 1-10%, atingindo um máximo de 13,4%. Neste trabalho iniciamos estimativas da prevalência
de agentes androcidas em populações de D. melanogaster e D. paraguayensis. A detecção inicial da presença do agente
androcida é feita pela contagem da F1. Proles com mais de 75% de fêmeas são consideradas positivas. Posteriormente,
será confirmada a presença e identificação do agente pela amplificação com primers específicos para os agentes androcidas
encontrados em Drosophila (Wolbachia e Spiroplasma). Em 2008, foram realizadas coletas no Parque Nacional do Itatiaia
(Itatiaia, Rio de Janeiro) e nas cidades de Salvador e Rio de Janeiro. Para D. paraguayensis a prevalência de agentes
androcidas estimada foi igual a 7,7% (IC: 4,1% - 13,8%; n = 130). No caso de D. melanogaster, a prevalência de agentes
androcidas estimada foi igual a 1,7% (IC: 0% - 9,9%; n = 60) no Rio de Janeiro, RJ. A coleta de D. melanogaster em
Salvador, BA foi realizada em duas localidades. Em Patamares a prevalência de agentes androcidas estimada foi igual
a 16,5% (IC: 12,0% - 22,3%; n = 200), enquanto em Peri-peri, foi igual a 23,8% (IC: 10,2% - 45,5%; n = 21).
Montenegro e colaboradores (2005) estimaram uma prevalência de 2,3% (IC: 0,6% - 5,8%; n = 173) para esta espécie
em Recife, PE. Estes resultados mostram que a prevalência de agentes androcidas em diferentes espécies pode ser bem
maior do que a prevista pelos modelos disponíveis, o que indica que novos estudos envolvendo taxa de transmissão e
influência no valor adaptativo do hospedeiro são necessários. Além disso, a descoberta de populações de uma mesma
espécie apresentando grande variação nas prevalências desses elementos – como relatadas aqui – podem ser bastante
informativas e úteis para esses estudos.
Apoio financeiro: FAPESP; CNPq.
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Variación natural en el tamaño corporal
asociada al segundo cromosoma de
Drosophila melanogaster
Carreira, VP; Mensch, J; Hasson, E; Fanara JJ
Laboratorio de Evolución. Departamento de Ecología, Genética y Evolución
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
[email protected]
Palabras clave: tamaño corporal, variación genética, clina, Drosophila melanogaster, segundo cromosoma
El análisis genético-evolutivo de caracteres adaptativos es complejo debido a los múltiples factores, genéticos y
ambientales, implicados en su expresión. Sin embargo, el conocimiento de las bases genéticas de estos caracteres es
indispensable para comprender su arquitectura genética y cuantificar la variación genética natural intrapoblacional y
la divergencia interpoblacional en loci asociados. El tamaño del cuerpo es un carácter adaptativo cuya variación tiene
base genética, depende de factores ambientales y muestra una multiplicidad de interacciones con otros componentes del
fitness. El objetivo de este trabajo es estudiar la variación natural en el tamaño corporal asociada al segundo cromosoma
de Drosophila melanogaster. Se midieron varios caracteres morfológicos (tamaño del ala, largo del tórax, ancho de
cabeza y distancia interocular) en individuos de ambos sexos de 66 líneas isogénicas para el cromosoma 2 derivadas
de 9 poblaciones naturales dispuestas a lo largo de un gradiente latitudinal en Argentina. Las correlaciones entre los
caracteres fueron generalmente positivas y significativas en ambos sexos pero el porcentaje de la varianza explicado por la
correlación nunca alcanzó el 50%. Esto implicaría cierta proporcionalidad entre las tasas de proliferación y crecimiento
celular de distintos discos imaginales durante el crecimiento larval y, a la vez, diferencias en la arquitectura genética
de los caracteres. Asimismo, la correlación entre mediciones de un mismo carácter en machos y hembras fue siempre
positiva y significativa y el porcentaje de la varianza explicado por esta asociación varió entre el 38% y el 58%. Esto
último sugiere un cierto grado de dimorfismo sexual en la arquitectura genética de los caracteres de tamaño corporal.
Los ANOVAs para cada carácter mostraron que las hembras son más grandes que los machos y que existen diferencias
entre las poblaciones en todos los casos. Además, el factor línea fue siempre significativo explicando entre un 9% y un
19% de la varianza fenotípica total indicando la existencia de una base genética de la variación para todos los caracteres.
Los análisis de regresión múltiple revelaron asociaciones positivas y significativas entre la distancia intraocular en las
hembras y el ancho de cabeza en ambos sexos con la latitud, mientras que el largo del tórax de los machos mostró
una relación negativa con la altitud. Estos resultados apoyan parcialmente la hipótesis de adaptación térmica de estos
caracteres aunque se debe considerar que las regresiones explicaron solamente hasta un 10% de la varianza fenotípica
total. A partir de estos resultados se proyectan estudios tendientes a determinar qué genes son los responsables de la
variación fenotípica observada en las poblaciones naturales para los caracteres vinculados al tamaño corporal.
Financiamiento: ANPCYT, CONICET y UBA.
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Variação fenotípica da espécie Drosophila
buzzatii (Díptera, Drosophilidae) detectada
por morfometria geométrica da asa
Santos,CG; Silva-Bernardi, ECC; Franco, FF; Manfrin, MH
[email protected]
Palavras-chave: variação geográfica, Drosophila buzzatii, morfometria geométrica
Drosphila buzzatii é uma espécie cactofílica pertencente ao “cluster” D. buzzatii (grupo repleta). Essa espécie tem uma
distribuição semi-cosmopolita, sendo encontrada na Europa e Austrália, onde foi introduzida há aproximadamente 200
anos, e na América do Sul, local de sua ocorrência natural. Geralmente, D. buzzatii está associada à cactus do gênero
Opuntia, mas ela também pode estar associada a outros gêneros como Cereus, Trichocereus e Pilosocereus. Embora D.
buzzatii tenha sido extensivamente estudada por meio de marcadores citogenéticos e moleculares, não há informação
sobre a diversidade morfológica de suas populações naturais. Neste contexto, o objetivo do presente trabalho foi
investigar a diferenciação fenotípica, através da morfologia da asa, de 37 populações de D. buzzatii, localizadas no Chaco
argentino (9) e nas regiões sul (7), sudeste (10), nordeste (10), e centro-oeste (1) do Brasil. Essa amostragem abrange
a maior parte da distribuição geográfica dessa espécie na América do Sul. Dez indivíduos machos de cada população
foram analisados através de técnicas de morfometria geométrica (relative warps), totalizando 320 exemplares, nos quais
foram digitalizados dez marcos anatômicos na asa direita de cada um. Através da análise discriminante foi possível
detectar diferenciação morfológica entre as populações (Wilk`s 0,0103183; p < 0,001). Entretanto, apenas 47,5% dos
indivíduos foram re-classificados corretamente, indicando que a variação intra-populacional é maior que a variação
interpopulacional de D. buzzatii. O tamanho (centroide size) foi a variável com maior peso na discriminação dos grupos,
sugerindo que a diferenciação morfológica observada pode ser explicada por variações ambientais, como a temperatura
que reconhecidamente afeta o tamanho corporal dos insetos e também o tipo de sítio de desenvolvimento larval
utilizado pela população, pois estudos mostram que a espécie de planta hospedeira pode gerar variações morfológicas em
populações de uma mesma espécie. Este resultado corrobora outros estudos realizados com marcadores cromossômicos
e moleculares, os quais sugerem que esta espécie apresenta fluxo gênico, o que explica a baixa diferenciação morfológica
interpopulacional observada, apesar da grande amplitude de distribuição geográfica.
Apoio Financeiro: CNPq, CAPES, FAPESP, USP.
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Composition Correlations for the
D. melanogaster Genome. Role of Exonic
3-periodic Component
Guerra, JCO1*; Barbosa, PLM2
Departamento de Física, ICEx, UFMG, Belo Horizonte, MG, Brazil
Departamento de Física, ICEx, UFMG, Belo Horizonte, MG, Brazil
*[email protected]
1
2
Keywords: Irreducible correlation functions, Nucleotide correlations, 3-periodic composition, Exon distribution, D. melanogaster genome
Correlation functions of DNA have been widely studied in order to understand the complex organization of genomes.
Many correlation measures, such as composition correlation functions, power spectra, random-walk variances, or
the mutual information function, have been employed. Many authors have recently rather considered dinucleotide
frequency distributions, in special purine-purine and pyrimidine-pyrimidine dinucleotides. In our work, we focus on
composition correlation functions and how to decompose and analyze its features. Surprisingly, features found from
dinucleotide frequency analysis are already fully obtained from our approach. In this work, we adopt the irreducible
representation of the four-nucleotide set, given as four tetrahedron directors in 3-D. This approach was developed in
the context of describing general properties of DNA sequences in the most compact or irreducible form. In the context
of double strand properties, any of the 10 given nucleotide correlations (AA, AT, AC, AG, TA, CA, GA, CC, CG, GC)
can be deduced from a smaller set of 6 irreducible correlation functions (xx, yy, zz, xy, xz and yz). We observe that the
z component, reflecting the contrast between strong-weak base pairing, contains the most relevant genomic structure
and therefore we focus our analysis in the zz-correlations alone. We examine composition correlations for both the D.
melanogaster whole genome and its protein coding segments alone. In particular, the 3-periodic correlation component
could be correctly isolated and shown to reflect essentially a phase-uncorrelated exon distribution along the genome.
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Análise do padrão de esterases ao longo
de cinco gerações de linhagem da espécie
Drosophila mercatorum pararepleta (Diptera;
Drosophilidae) resistente a metal pesado
Gustani, EC; Santos, K; Machado, LPB; Mateus, RP
Departamento de Ciências Biológicas, Laboratório de Genética e Evolução, UNICENTRO, Guarapuava-PR
[email protected]
Palavras-chave: Esterase, Drosophila mercatorum pararepleta, metal pesado, cádmio, resistência
As populações de Drosophila mercatorum pararepleta (Diptera; Drosophilidae) estão distribuídas preferencialmente em
ambientes naturais de vegetação aberta da América do Sul, geralmente não é encontrada em áreas urbanas, sendo, portanto,
uma espécie sensível a alterações ambientais de origem antrópica. O cádmio é um metal pesado tóxico encontrado em
sedimentos de esgotos industriais e domésticos, podendo contaminar água e solo e assim ser absorvido pelos organismos.
As esterases são enzimas que catalisam a hidrólise de éster e são responsáveis por funções diversificadas nos insetos.
O objetivo do presente trabalho foi analisar o perfil das esterases ao longo de cinco gerações da linhagem D33 de D.
m. pararepleta selecionada para resistência a metal pesado. A seleção da resistência foi realizada em experimentos com
diferentes concentrações de cádmio no meio de cultura. A mortalidade das moscas desenvolvidas em meio contaminado
com 0,07 mM de cádmio foi de 80%, desta forma, os indivíduos sobreviventes foram cultivados por cinco gerações
nesta condição. A cada geração, 10 indivíduos foram congelados a - 20o C, para posterior análise enzimática, e os demais
repicados para meio de cultura contaminado. Após cinco dias do repique, as moscas parentais foram descartadas para
não haver sobreposição de gerações. A análise das enzimas em indivíduos controle e da linhagem resistente ao longo das
5 gerações foi realizada em PAGE 10%, sendo as esterases detectadas na presença dos substratos α e β-naftil acetatos
e do corante Fast Blue RR. Dos oito loci esterásicos observados nos indivíduos controle, apenas 4 foram detectados
com maior freqüência nos indivíduos cultivados em meio contaminado. Os loci dos indivíduos controle apresentaram
maior afinidade pelo substrato α-naftil acetato, sendo apenas um locus (EST-7) observado como β-esterase, e dois como
α/β-esterase (EST-1 e 6). Já nos indivíduos das 5 gerações da linhagem resistente apenas um locus (EST-8) foi detectado
como α-esterase, os demais foram observados ou como β-esterase (EST-7), ou como α/β-esterase (EST-1 e EST-3).
Desse modo, pode ser inferido que o cádmio não apenas atuou na inibição da expressão de alguns loci, como também
na afinidade destas enzimas pelos substratos α/β-esterase, aumentando a atividade β-esterásica das mesmas.
Apoio financeiro: Fundação Araucária.
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Ação de metal pesado na atividade
esterásica de duas linhagens de Drosophila
mercatorum pararepleta cultivadas em
meio de cultura contaminado com cádmio
Santos, K; Gustani, EC; Mateus, RP; Machado, LPB
Departamento de Ciências Biológicas, Laboratório de Genética e Evolução, UNICENTRO, Guarapuava-PR
[email protected]
Palavras-chave: metal pesado, cádmio, esterase, Drosophila mercatorum, isoenzima
O cádmio é um metal pesado com potencial mutagênico e genotóxico, de efeito cumulativo e distribuído ao longo
dos organismos por proteínas plasmáticas. As esterases constituem um sistema isoenzimático multilocus capaz de
desempenhar diferentes funções fisiológicas celulares catalisando a hidrólise de ésteres. O objetivo deste trabalho foi
analisar o efeito do cádmio na atividade das esterases de indivíduos provenientes de duas linhagens de Drosophila
mercatorum pararepleta (Diptera; Drosophilidae), D33 (Cristalina/GO) e Rio do Poço (Guarapuava/PR). Larvas de 1o
estadio inicial destas linhagens foram transferidas para desenvolvimento em meio de cultura contaminado com 0,01 mM
de cádmio. Indivíduos adultos controle e sobreviventes da exposição ao cádmio foram submetidos à eletroforese em gel
de poliacrilamida 10%, e as esterases foram reveladas no gel em solução de coloração contendo os substratos α e β-naftil
acetatos e Fast Blue RR (corante). Na comparação com os indivíduos controle, alguns loci de esterases foram inibidos
nos indivíduos que se desenvolveram em meio contaminado. Um locus, EST-11, foi observado, em baixa freqüência,
nos indivíduos expostos ao cádmio, e a expressão do locus β-esterase, EST-7, foi maior (bandas mais fortemente coradas)
também nessas amostras, quando comparadas ao controle. Em experimentos semelhantes realizados anteriormente
com indivíduos desenvolvidos em meio contaminado com 0,05 mM de cádmio, outros loci foram expressos, os quais
não foram detectados neste estudo. Desta forma, pode ser concluído que a expressão dos loci de esterases parece ser
bastante sensível à concentração de cádmio a qual os indivíduos são expostos durante o desenvolvimento. E, ainda,
que este metal pode atuar aumentando a atividade β-esterásica do locus EST-7.
Apoio financeiro: UNICENTRO.
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Elementos transponíveis mariner em
espécies neotropicais de drosophila
Wallau, GL1; Capy, P2; Loreto ELS1,3
PPG Biodiversidade Animal – Universidade Federal de Santa Maria LEG, CNRS, Gif Sur Yvette, França
Dep de Biologia- CCNE, Univ. Fed. de Santa Maria, Santa Maria, RS
Palavras–chave: Transposons, Evolução, análise filogenética
Os elementos transponíveis da família mariner apresentam uma ampla distribuição, estando presentes nos genomas de
diversos filos animais, como artrópodes, vertebrados, celenterados, assim como também nos genomas de protozoários,
fungos e plantas. Esta ampla distribuição é marcada por uma significativa diversidade de seqüências de elementos
relacionados à mariner (mariner-like elements - MELs), que são classificados em 6 subfamílias de acordo com o grau de
similaridade de aminoácidos do sítio catalítico. Apesar deste elemento transponível já ser descrito em vários organismos,
em drosophilídeos existem poucos estudos com seqüências relacionadas à mariner. Neste trabalho propomos uma busca
mais abrangente de seqüências relacionadas à mariner em 48 espécies neotropicais de Drosophila. Para a análise molecular,
foi utilizadas buscas por PCR no DNA genômico de com primers degenerados de regiões de aminoácidos conservadas
da ORF (WVPHEL-YSPDALP) que na presença desses elementos produzem um fragmento de 491pb. As seqüências
obtidas a partir dos clones serão jogadas contra o banco de dados do GENBANK BLAST P para confirmação de
seqüência relacionada à mariner. Posteriormente a secuencia da provável proteína é determinada pelo programa Genedoc,
alinhadas no Clustal X e analisadas filogeneticamente com o programa MEGA 4 (bootstrap 1000) em conjunto com
seqüências já descritas para a identificação das subfamílias de mariner. Para a análise filogenética foi utilizado como grupo
externo duas famílias distintas da ordem TIR Bari e TC1. As buscas com os primers degenerados já foram realizadas
em 11 espécies, sendo que 9 apresentaram o fragmento esperado. Destas 9 espécies 6 (D. ornatifrons, D. mediostriata,
D. neocardini,D. pallidpenis, D. mediopunctata e D. paramediostriata) apresentaram clones com seqüências relacionadas
a mariner. Com esses dados podemos visualizar que a subfamília mellífera é a mais amplamente distribuída estando
presente em 5 das 6 espécies que possuem clones de mariner. Já a subfamília mauritiana está presente em 3 destas
espécies e a subfamília irritans em 1 espécie. Destas 6 espécies que têm clones de mariner D. ornatifrons, D. mediostriata,
D. neocardini, e D. pallidipenis possuem seqüências degeneradas com stop códons, deleções ou substituições. Já D.
mediopunctata e D. paramediostriata apresentaram 2 clones cada, que provavelmente são provenientes de elementos
ativos, pois não são degenerados. A analise filogenética dos MELs demonstra algumas incongruências comparadas com
a filogenia das espécies.
Orgão financiador: CAPES-COFECUB.
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Novos elementos transponíveis hAT de
Drosophila possivelmente envolvidos em
Transferência Horizontal
Mota, NR1; Valente, VLS1; Loreto, ÉLS1,2
Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
2
Departamento de Biologia, Universidade Federal de Santa Maria
[email protected]
1
A superfamília hAT pertence à Classe II de elementos transponíveis e seus membros estão amplamente distribuídos nos
genomas de plantas, animais e fungos. Esta superfamília foi assim designada em razão dos seus três membros fundadores:
hobo de Drosophila melanogaster, Activator de Zea mays e Tam3 de Antirrhinum majus. Os elementos da superfamília
hAT são caracterizados por possuírem normalmente menos de 4Kb de comprimento, duplicações de sítio-alvo (TSDsTarget Site Duplications) de 8pb e repetições terminais invertidas (TIRs- Terminal Inverted Repeats) relativamente curtas
de 5 a 27pb, além de apresentarem certa similaridade de seqüência em motivos restritos da transposase. Um estudo
anterior do nosso grupo de pesquisa (Ortiz e Loreto, 2008) identificou novos elementos hAT através de buscas in silico
nos 12 genomas disponíveis de Drosophila. Dentre estes novos elementos, estão Homo3 e Howilli3, da família homo,
os quais compartilham 96% de similaridade e Homo1 e Howilli2, da família hobo, que possuem 88% de similaridade.
Estes elementos tornam-se especialmente interessantes devido aos seus altos valores de similaridade de seqüência,
uma vez que estão inseridos em genomas de espécies Drosophila de subgêneros distintos: Homo3 e Homo1 em D.
mojavensis (subgênero Drosophila) e Howilli3 e Howilli2 em D. willistoni (subgênero Sophophora). Este trabalho tem
como objetivo rastrear seqüências homólogas a estes elementos em espécies Neotropicais e cosmopolitas do gênero
Drosophila, assim como tentar esclarecer o cenário evolutivo destas duas famílias de transposons. Até o momento,
através de abordagem por PCR, com o uso de primers desenhados a partir dos elementos identificados in silico, um total
de 55 espécies foram analisadas (32 do subgênero Drosophila e 23 do subgênero Sophophora). Seqüências de Homo3/
Howilli3 parecem ter uma distribuição descontínua ao longo do gênero Drosophila, o que pode sugerir a ocorrência de
eventos de transferência horizontal. Uma hipótese alternativa a esta é a de que essas seqüências estavam presentes no
ancestral do gênero Drosophila. No entanto, esta situação é pouco provável pois implicaria na ocorrência de múltiplos
eventos de perda estocástica. Por outro lado, seqüências homólogas a Homo1/Howilli2 parecem ser restritas ao grupo
willistoni, sugerindo ao menos um evento de transferência horizontal para o genoma de D. mojavensis. No momento,
estes amplicons estão sendo clonados e seqüenciados e serão em breve utilizados para as análises filogenéticas. Além disso,
através de buscas adicionais com a ferramenta Blast no banco de dados do NCBI, uma seqüência de Ceratitis capitata
com 92% de similaridade à transposase de Howilli2. Os gêneros Ceratitis e Drosophila são ambos conhecidos como
“moscas das frutas” e podem facilmente serem encontrados compartilhando o mesmo ambiente. Estes dados podem
fortemente indicar a ocorrência de transferência horizontal entre gêneros, provavelmente facilitada por sobreposição
espacial, ecológica e temporal das espécies envolvidas.
Orgão financiador: CNPq.
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Analise isoenzimática em espécies
de Drosophila do grupo tripunctata
(Diptera, Drosophilidae)
Mateus, RP; Cavasini, R; Gustani, EC; Machado, LPB
Laboratório de Genética e Evolução, Departamento de Ciências Biológicas, UNICENTRO, Guarapuava-PR
[email protected]
Palavras-chave: Isoenzima, Alozimas, Drosophila, Grupo tripunctata, Floresta Ombrófila Mista
O grupo tripunctata (gênero Drosophila) é endêmico da Região Neotropical, e, com 64 espécies descritas, é o segundo
maior grupo de drosofilídios nesta região e o maior grupo do gênero que ocorre nas florestas Neotropicais. No
presente trabalho, indivíduos de 11 espécies do grupo tripunctata, coletados em dois fragmentos florestais formados
por Floresta Ombrófila Mista (Mata de Araucária), no município de Guarapuava – Paraná, foram avaliados para 4
sistemas isoenzimáticos (IDH, MDH, ME e 1-GPDH) em géis de amido a 14%. As coletas foram realizadas durante
o ano de 2006, e foram detectadas as seguintes espécies: Drosophila angustibucca, D. bandeirantorum, D. bifilum, D.
medioimpressa, D. mediopicta, D. mediopunctata, D. mediosignata, D. mediostriata, D, platitarsus, D. prosimilis e D.
pruinifacies. Os resultados das análises eletroforéticas identificaram um total de 5 loci e 20 alelos (6 para Idh, 5 para
Mdh-1, 3 para Mdh-2, 3 para Me e 3 para 1-Gpdh). Para o locus Idh, a banda mais catódica foi encontrada apenas em
D. mediopicta. Já para os loci Mdh-1 e 1-Gpdh, as bandas mais lentas foram encontradas apenas em indivíduos de D.
pruinifacies. Todos os loci apresentaram mais de um alelo. Drosophila bandeirantorum apresentou polimorfismo em todos
os loci analisados. Drosophila mediosignata e D. mediostriata apresentaram mais de um alelo para 3 loci (Idh, Mdh-1 e
Me; Idh, Mdh-2 e Me, respectivamente). Drosophila medioimpressa, D. mediopicta, D. mediopunctata e D. pruinifacies
foram polimórficos para 2 loci (Mdh-1 e 1-Gpdh; Idh e Mdh-1; Idh e Mdh-2; Mdh-1 e Mdh-2, respectivamente). Nossos
resultados indicaram que os loci Idh e Mdh-1 apresentaram um número maior de alelos (6 e 5, respectivamente) quando
comparados com os outros loci, que apresentaram 3 diferentes alelos cada. Entre as espécies analisadas, D. pruinifacies
apresentou maior divergência com relação à composição alélica dos loci analisados quando comparada com as outras
espécies. Estes dados revelam aspectos importantes sobre a variabilidade genética destas espécies de Drosophila do grupo
tripunctata, que poderão ser utilizados em trabalhos posteriores sobre aspectos populacionais e evolutivos das espécies
deste grupo.
Apoio Financeiro: CNPq, FAU e UNICENTRO.
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Relação entre tamanho de regiões
intergênicas e inserções de elementos
transponíveis em espécies de Drosophila:
análise dos genes das classes Delta e
Epsilon das Glutationas S-Transferases
Dias, ES1; Lopes, FR1; Vieira, C2; Carareto, CMA1
Departamento de Biologia, UNESP – Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
2
Universidade de Lyon, França
[email protected]
1
Palavras-chaves: Elementos transponíveis, análise in silico, genomas de Drosophila, Glutationa S-Transferases, resistência a inseticida
A inserção de elementos tranponíveis (TEs) em regiões regulatórias de genes CYP tem sido associada a evolução da
resistência a inseticidas. Como as Glutationas S-transferases (GSTs) estão relacionadas a metabolização de xenobióticos,
o objetivo deste estudo foi verificar a ocorrência de inserções de TEs em regiões próximas dos genes das classes Delta
e Epsilon dessa família. Em D. melanogaster, essas classes contém 10 genes cada. A localização dos genes de ambas as
classes foi realizada a partir de comparações entre as seqüências de D. melanogaster e os onze genomas seqüenciados de
Drosophila. Na região genômica entre os dois genes vizinhos dos clusters das GSTs foi realizado um BLASTN contra o
banco de genes preditos de modo a identificar os genes GSTs e suas regiões intergênicas. Nessas seqüências foi avaliada
a ocorrência de fragmentos de TEs, utilizando a biblioteca de TEs de Drosophila por meio do RepeatMasker. Os genes
das classes Delta e Epsilon encontram-se seqüencialmente arranjados, formando clusters, exceto em D. ananassae na classe
Delta e em D. yakuba e D. willistoni na Epsilon, nas quais os clusters são interrompidos por genes que não codificam
GSTs. O número de genes variou de 6 (D. mojavensis) a 12 (D. willistoni), na classe Delta, e de 6 (D. grimshawi) a
16 (D. ananassae) na classe Epsilon. As regiões intergênicas da classe Delta (126) apresentaram tamanho médio de
1.044pb, e da Epsilon (138), 775pb. Foram encontrados TEs em todas as espécies, exceto em D. sechellia e D. mojavensis,
exclusivamente nas regiões intergênicas. Nos genes Delta, foram encontradas 52 inserções (0,41 TE/região intergênica);
nos Epsilon, 36 inserções (0,26 TE/região intergênica). Os TEs mais freqüentes foram os transposons, exceto em D.
willistoni, na qual foi encontrado também um retrotransposon, e em D. simulans e D. ananassae, que apresentaram
apenas LINEs. Na classe Delta, as inserções corresponderam a cerca de 8% dos tamanhos dos elementos consenso,
e na Epsilon a 5%, indicando que os fragmentos de TEs na proximidade das GSTs são muito pequenos, indicando
serem resquícios de inserções antigas. Em todas as espécies, em ambas as classes, não foram encontradas inserções em
regiões intergênicas com até 500pb, e, exceto no grupo melanogaster, em ambas as classes, e em D. willistoni e D. virilis,
para Delta, essa ausência também foi observada em regiões com até 1.000pb. A correlação positiva significante entre
tamanho médio das regiões intergênicas e número de TEs sugere atuação de seleção purificadora eliminando inserções
nas proximidades de genes (< 1 Kb), onde freqüentemente são encontradas as seqüências regulatórias. Como as GSTs
são enzimas de detoxificação e fragmentos de TEs são fontes de variabilidade genética, pode-se sugerir que eles propiciem
plasticidade genômica importante para adaptação a ambientes em constante mudança.
Apoio finaceiro: CNPq.
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Estudo do elemento Mar, um MITE,
no gênero Drosophila
Ludwig, A1; Deprá, M1; Loreto, ELS1,2; Valente, VLS1,3
PPGBM – UFRGS
Departamento de Biologia – UFSM
3
Departamento de Genética – UFRGS
[email protected]
2
Palavras-chave: MITEs, Mar, Drosophila, superfamília hAT, transposon
MITEs (Miniature inverted repeat transposable elements) são elementos de transposição curtos, não-autônomos e
freqüentemente presentes em alto número de cópias nos genomas. Vários trabalhos têm sugerido que esses elementos
originam-se a partir de transposons autônomos que sofrem deleções internas, mas mantém as repetições terminais
invertidas (TIRs) conservadas, possibilitando mobilização in trans. O elemento Mar de Drosophila willistoni possui
610 pb, sítio alvo de duplicação (TSDs) de 8 pb, TIRs perfeitas de 11 pb e não apresenta capacidade codificadora.
Esse elemento foi classificado como um MITE da superfamília hAT com base na similaridade das TIRs e TSDs, e
foi encontrado em apenas uma linhagem de D. willistoni, analisada em um trabalho anterior de outros autores. Na
tentativa de caracterizar a representatividade deste elemento e suas implicações evolutivas nos genomas de Drosophila,
iniciamos um trabalho de análise da distribuição do elemento Mar em um grande número de espécies. Um total de
58 espécies de Drosophila de diferentes grupos dos dois principais subgêneros, Sophophora e Drosophila, juntamente
com Zaprionus indianus, Z. sepsoides, Scaptodrosophila latifasciaeormis e S. lebanonensis foram testadas por PCR para
a presença do elemento Mar. Fragmentos de tamanho esperado (400 pb) foram encontrados em todas as linhagens
do subgrupo willistoni investigadas (exceto em D. tropicalis onde encontramos um fragmento maior): 3 linhagens
de D. willistoni, 3 semiespécies de D. paulistorum, D. equinoxialis e D. insularis. Além disso, a amplificação de um
fragmento maior também foi detectada em D. saltans e D. prosaltans. Os amplicons de cada espécie foram clonados e
serão seqüenciados para a realização de análise evolutiva do elemento. Adicionalmente às análises por PCR, realizamos
buscas in silico por seqüências homólogas ao Mar, nos 12 genomas de Drosophila atualmente disponíveis. Através
da ferramenta BLAST, inúmeras cópias deste elemento (mais de 30) foram encontradas no genoma de D. willistoni.
Nenhuma seqüência foi encontrada nas outras espécies. A maioria das cópias encontradas em D. willistoni possui TIRs
e TSDs conservadas indicando recente amplificação dessas seqüências neste genoma. Dessa forma, podemos sugerir a
existência de seqüências ativas de elementos da superfamília hAT no genoma de D. willistoni capazes de mobilizar esses
MITEs. A análise das seqüências dos clones das diferentes espécies deverá contribuir para o entendimento da evolução
do elemento Mar no gênero Drosophila.
Apoio financeiro: CNPq.
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Análise da posição do gene de rDNA
em espécies da radiação tripunctata de
Drosophila
Brianti, MT; Ananina, G; Klaczko, LB
Departamento de Genética e Evolução, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP, CP 6109, Campinas 13083-970 SP
[email protected]
Palavras-chaves: Drosophila, NOR, Hidridação, FISH, heterocromatina
Nos eucariotos, o DNA ribossômico (rDNA) é uma família multigênica composta de um ou mais aglomerados de
unidades de repetição (RU). Cada unidade consiste de seqüências altamente conservadas que codificam os rRNAs
18S, 5.8S e 28S, separadas por espaçadores internos de transcrição (internal transcribed spacers - ITS) e espaçadores
intergênicos (intergenic spacer – IGS). Citogeneticamente são visíveis como regiões organizadoras do nucléolo (NORs)
quando estão transcricionalmente ativos. O rDNA tem sido utilizado como marcador molecular para sistemática e
reconstrução filogenética, tanto pela análise de seqüências nucleotídicas quanto pela localização; e também como modelo
de evolução para famílias multigênicas. Investigamos através de hibridação in situ por fluorescência (FISH) 19 espécies, a
maioria da radiação tripunctata do subgênero Drosophila, quanto à posição do rDNA em cromossomos mitóticos. Todas
as espécies apresentaram marcações exclusivamente nos cromossomos sexuais. Nos cromossomos X apenas uma região
de rDNA foi detectada para cada cromossomo, porém com variação de localização nas marcações entre espécies; nos
cromossomos Y, além de alterações das posições, observamos, também, alteração do número de marcações. Anteriormente
a este trabalho aproximadamente 40 espécies já tinham sido estudadas sob este aspecto e avaliando nossos dados em
conjunto com os anteriormente publicados notamos que no sub-genêro Drosophila, com poucas exceções, a posição do
rDNA se restringe aos cromossomos sexuais. Deste modo podemos sugerir que a condição de uma região organizadora
do nucléolo (NOR) em cada cromossomo sexual é um caráter ancestral no subgênero Drosophila e provavelmente é
um caráter ancestral comum aos subgêneros Drosophila e Sophophora do gênero Drosophila.
Apoio Financeiro: CAPES, FAPESP e CNPq.
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Epigenomic variability of TEs control in
natural populations of Drosophila
Rebollo, R1; Horard, B2; Vieira, C1
Université de Lyon; Université Lyon 1; CNRS; UMR 5558, Laboratoire de Biométrie et Biologie Evolutive,Villeurbanne F-69622, France
Université Lyon ; CNRS; ENS Lyon; HCL; UMR 5239, Laboratoire de Biologie Moléculaire de la Cellule, Pierre Bénite, F-69495, France
1
2
Transposable elements (TE) are ubiquitarious, abundant and major players in genome evolution. They may constitute
a living library of DNA information for the host genome but TEs insertion are also mutagenic events. Host genome
needs therefore to control TEs dynamics. Epigenetics regulation pathways of parasitic DNA is being more and more
observed in different species. Chromatin modifications allow malleable isolation of DNA sequences in putative on/
off regions that can be dependent of the environment. Indeed, host genome can suppress negative effects of TEs –
transcription and mobilisation – but keep the library intact – TEs DNA sequences. Curiously, biological importance
of epigenetic variation in natural populations is still unknown; probably due to the paradox between epigenetics and
heritable characteristics. A few examples of epigenetics spreading to more than one individual can already be observed
today and population epigenomics is therefore justified. In Drosophila simulans, where 5% of the genome is made of
TEs, we can observe an important variation of TE copy number between natural populations. We propose to make
a population epigenomic survey in D. simulans natural populations in order to understand variations in TEs copy
number. Preliminary results illustrate a significant difference in histone modifications regarding specific TEs in given
natural populations of D. simulans. TEs transcription analysis allowed us to correlate chromatin localisation with TEs
putative activity.
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A inserção de elemento P na linhagem
KG00562 de Drosophila melanogaster
causa um splicing aberrante
Pereira, GB; Paçó-Larson, ML
Departamento de Biologia Celular e Molecular e Bioagentes Patogênicos, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP
[email protected]
Palavras-chave: Splicing, Drosophila melanogaster, KG00562, Lipina B
A linhagem KG00562 é uma entre as milhares de linhagens de Drosophila melanogaster geradas por mutagênese de
inserção e que têm sido utilizadas para análises da função de novos genes. Nesta linhagem mutante o sítio de inserção
de 11.467Kb, mediada pelo elemento P, foi mapeado à 3’ do locus de Kermit e à 5’ do CG8709, que codifica proteínas
de uma nova família de fosfatases de ácido fosfatídico dependente de Mg+2. Dados de nosso laboratório mostraram
que o locus CG8709 expressa diferentes transcritos com padrões teciduais distintos. A isoforma neural, nomeada
DmLpin B, tem seu primeiro éxon compartilhado com o locus vizinho que codifica Kermit. Na linhagem KG00562
a inserção do elemento P ocorre no primeiro intron da isoforma B. Nesta linhagem, o transcrito de DmLpinB não é
detectado e é observada a presença de um mRNA anômalo, de aproximadamente 2,5Kb, em northern blot hibridado
com sonda derivada do primeiro exon de DmLpin B. Neste trabalho, através de Rapid Amplification of cDNA Ends 3’
(RACE-3’), clonamos e caracterizamos a estrutura primária do RNA adicional de 2,5 kb expresso na linhagem KG00562.
Este mRNA tem 2.292 nucleotídeos e é resultado de um splicing aberrante entre o primeiro éxon não traduzido de
DmLpin B e o segundo éxon do gene White, presente na construção KG e utilizado como marcador da inserção. A
maior fase de leitura deste mRNA tem 613 aminoácidos e consiste na proteína White com a porção amino-terminal
truncada em 74 resíduos de aminoácidos. Estes resultados indicam que a expressão dessa proteína White truncada,
possivelmente seguindo o padrão de expressão de DmLpin B, é a causa do ganho de função observado na linhagem
KG00562, caracterizado por um alto índice de letalidade. Mesmo em background selvagem, cerca de 73% das moscas
carregando a inserção KG00562 não completam o desenvolvimento.
Órgãos Financiadores: FAPESP, CNPq, FAEPA.
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Seqüências relacionadas ao elemento But2
no gênero Drosophila
Rossato, DO1; Ludwig, A2; Loreto, ELS2,3; Valente-Gaiesky, VLS2,4
Curso de Ciências Biológicas – UFRGS
2
PPGBM – UFRGS
3
Departamento de Biologia da UFSM
4
Departamento de Genética da UFRGS
[email protected]
1
Palavras-chave: Drosophila, elemento de transposição, But2, MITEs
Os elementos de transposição são segmentos de DNA que têm a capacidade de mover-se e replicar-se dentro do genoma.
O elemento But2 pertence a superfamília hAT da ordem TIR (terminal inverted repeat) de transposons da classe II.
Elementos dessa ordem usualmente possuem repetições terminais invertidas curtas e codificam uma transposase que
catalisa a sua excisão do sítio original e promove sua reinserção em um novo lugar no genoma, gerando duplicações no
sítio alvo (TSDs). But2 foi descoberto em locais de pontos de quebra cromossômica em D. buzzatii, possui 2775 pb,
TIRs de 12 pb e gera TSDs de 8 pb. Com a disponibilidade de seqüências genômicas de 12 espécies de Drosophila, nós
realizamos uma busca in silico, por seqüências homólogas ao But2 utilizando a ferramenta BLAST. Como esperado, esse
elemento está presente em D. mojavensis a qual, juntamente com D. buzzatti, pertence ao grupo repleta do subgênero
Drosophila. Inesperadamente, uma seqüência com alto grau de similaridade (93%) ao But2 foi encontrada em D.
willistoni, uma espécie pertencente a outro subgênero, Sophophora. Nas outras espécies nenhuma seqüência foi encontrada.
Esses resultados nos instigaram a realizar uma análise mais abrangente da distribuição e evolução do elemento But2 no
gênero Drosophila. Testamos, então, a presença do elemento But2 através de PCR em diversas espécies de Drosophila,
utilizando primers degenerados desenhados a partir das TIRs para amplificar o elemento completo. Até o momento, 25
espécies foram investigadas e observamos amplificação de fragmentos de tamanhos distintos e menores que o esperado
nas espécies do grupo willistoni e grupo saltans de Drosophila e em D. buzzatii. A presença de seqüências menores
(400-800 pb) relacionadas ao But2 foi confirmada através de PCR in silico no genoma de D. willistoni. Encontramos
um grande número dessas seqüências (mais de 20 cópias) com similaridade em média de 85% com o elemento But2
completo encontrado em D. willistoni. Os fragmentos amplificados de todas as espécies serão clonados e seqüenciados
para confirmar a identidade dessas seqüências e fazer análises evolutivas. Vários trabalhos têm mostrado que elementos
curtos, chamados MITEs (Miniature inverted repeat transposable elements) podem ser originados a partir da degeneração
de elementos autônomos. Nossos dados preliminares sugerem que seqüências curtas relacionadas ao But2 estão presentes
nas espécies do grupo willistoni e saltans possivelmente por degeneração. A grande similaridade encontrada entre os
elementos completos de D. willistoni e D. buzzatii pode ser devido a ocorrência de transferência horizontal entre essas
espécies. A análise filogenética das diferentes variantes dessas seqüências nas diferentes espécies deve permitir o melhor
entendimento da evolução do elemento But2 nos genomas de Drosophila.
Apoio financeiro: CNPq e PROPESQ/UFRGS.
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Componentes do valor adaptativo em
linhagens de Drosophila melanogaster
e Drosophila simulans (Diptera,
Drosophilidae) com diferentes níveis de
suscetibilidade ao inseticida DDT
Gomes, MO1; Madi-Ravazzi, L2
Universidade Estadual Paulista – UNESP/IBILCE, Departamento de Biologia
[email protected]; [email protected]
1,2
Palavras-chave: Resistência a inseticidas, grupo melanogaster, valor adaptativo, Drosophila, DDT
A resistência a inseticidas tem sido estudada em muitos insetos vetores e também na espécie Drosophila melanogaster,
que é considerada um organismo modelo para este tipo de estudo. Um dos problemas em debate na literatura é que
o fenótipo para a resistência ao DDT nessa espécie parece não trazer custo adaptativo, pois há indicativos que o gene
(DDT-R) responsável pela resistência está se aproximando de uma fixação global. O objetivo do presente trabalho foi
avaliar os parâmetros do valor adaptativo como a fertilidade, viabilidade, fecundidade e tempo de desenvolvimento de
linhagens geográficas recém coletadas de D. melanogaster (BG,SE, LE, RP) e D. simulans (BG, SE, LE, RP) com diferentes
níveis de suscetibilidade ao DDT. A linhagem suscetível de D. melanogaster, Canton-S, foi usada como referência.
Foram efetuados 20 cruzamentos por casal de 3 dias de idade, em tubos de excursão contendo meio de cultura padrão
(banana-fermento). Os casais permaneceram nesses tubos por 5 dias para a oviposição, com repiques diários, e logo
após foram submetidos ao bioensaio com o DDT (efetuados em tubos de cintilação contendo as concentrações CL50)
previamente estabelecidas para as linhagens em estudo. A linhagem do casal que sobreviveu ao bioensaio foi considerada
resistente ao DDT e a linhagem do casal que não sobreviveu, suscetível. Foram computados, o número de ovos, pupas
e adultos dessas linhagens para avaliação do valor adaptativo. Em D. melanogaster foram analisadas a F1 de 08 casais
resistentes e 09 casais suscetíveis e em D. simulans foram analisadas a F1 de uma linhagem resistente e 12 suscetíveis.
A viabilidade ovo-pupa, pupa-adulto e ovo-adulto foram relativamente altas (70 a 90%) para as linhagens resistentes e
suscetíveis de D. melanogaster e para D. simulans, com exceção para essa última espécie da viabilidade ovo-adulto que
foi relativamente menor (55 a 71%) do que em D. melanogaster. A produtividade das linhagens de D. melanogaster
também foi consideravelmente maior (876) do que D. simulans (91). O tempo de desenvolvimento ovo-adulto para as
linhagens variou de 9 a 10 dias. Os ovos da linhagem de SE de D. melanogaster que sobreviveu à exposição ao DDT,
não prosseguiram seu desenvolvimento. Essa linhagem pode não conter o alelo que confere a resistência ao inseticida,
e o que observamos pode ser um efeito de outros mecanismos de resistência atuando nessa espécie. Isso é sugestivo que
esse alelo pode não estar amplamente difundido nas populações de D. melanogaster. Na observação dos parâmetros
avaliados entre as linhagens resistentes e suscetíveis das duas espécies não foi possível identificar diferenças que permitam
responder a questão do custo da resistência do fenótipo resistente, para isso deveremos ampliar o número de amostras
de linhagens resistentes para uma avaliação mais robusta.
PROAP-CAPES.
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Simpatria entre duas espécies de
Drosophila: o que esperar?
Santos, CKB1; Mazucato, M2; Sene, FM2; Manfrin, MH1
Programa de Pós-Graduação em Biologia Comparada, Departamento de Biologia, FFCLRP, USP
2
Departamento de Genética, FMRP, USP
[email protected]
1
Palavras-chave: Drosophila cactofílica, zona de contato secundário, introgressão assimétrica, morfometria geométrica, DNA mitocondrial
As espécies crípticas Drosophila serido e D. antonietae, cactofílicas e pertencentes ao “cluster” buzzatii, são alopátricas
na maior parte de suas áreas de ocorrência. Entretanto, análises populacionais prévias descreveram a localidade de
Florianópolis-SC como área de contato secundário, com populações de D. serido e D. antonietae em simpatria, sem
formação de híbridos. Com a finalidade de testar esta hipótese, foram analisados 160 indivíduos: 100 da referida área
de contato; 20 da localidade tipo de cada espécie e 20 indivíduos híbridos, oriundos de cruzamentos em laboratório.
Cada indivíduo foi caracterizado através da variação morfológica da asa e do edeago, DNA mitocondrial e por análise
eletroforética da proteína isocitrato desidrogenase (IDH), que apresenta alelos característicos para cada espécie. Foi
observado o alelo 1,05, característico de D.serido, em 94% da amostra e não foi observada a presença de híbridos para
este marcador, que constituiu um marcador taxonômico eficiente para a identificação destas espécies. Através da técnica
de morfometria geométrica, foi feita uma análise discriminante dos edeagos, com 87% de eficiência na classificação
dos grupos, que apresentaram diferenças significativas (Wilk’s = 0.08737; P < 0.00001); A análise discriminante das
asas classificou os grupos com 89,2% de eficiência, com diferenças significativas (Wilk’s = 0.06564; P < 0.00001). As
análises morfométricas evidenciaram uma menor variação morfológica na população de D. serido de Florianópolis,
com relação à população da localidade-tipo (Milagres-BA), sugerindo uma colonização e efeito do fundador ou
seleção natural. Através da análise do DNA mitocondrial, foram geradas duas redes de haplótipos não enraizadas,
indicando a existência de duas linhagens evolutivas distintas. Verificou-se a existência de um haplótipo característico
da linhagem de D. antonietae em indivíduos que possuíam morfologia e alelos característicos de D. serido, sugerindo
uma introgressão assimétrica. Porém, novas análises são necessárias para descartar a possibilidade de existência de um
polimorfismo ancestral deste haplótipo. Nesta amostra, a maior freqüência observada de D. serido, diferentemente de
dados anteriores, sugere influência da sazonalidade na dinâmica desta área de contato, que pode estar relacionada à
preferência e disponibilidade de cactos hospedeiros. As análises de cada indivíduo, através de diferentes marcadores, não
foram totalmente congruentes, podendo sugerir eventos de introgressão atuais ou passados. Por outro lado, os caracteres
morfológicos possuem herança genética complexa, e podem apresentar plasticidade fenotípica, além de dominância,
recessividade, epistasia e estar sob ação de seleção natural. Portanto, estudos adicionais são necessários para verificar
hipóteses de eventos de hibridização e introgressão para caracterizar a dinâmica populacional envolvida na presente
área de contato e definir eventos históricos e ecológicos para esta área.
Apoio financeiro: FAPESP, CAPES, CNPq, FINEP, USP.
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Estrutura de populações de Drosophila
melanogaster
Ananina, G1; Nolte, V2; Orozco-terWengel, P2; Medeiros, HF3; Andrade, CAC4; Schlötterer, C2; Klaczko, LB1
1
Instituto de Biologia, Departamento de Genética e Evolução, Unicamp
Institut für Populationsgenetik, Veterinärmedizinische Universität Wien, Wien, Austria
3
Coordenação de Zoologia, Museu Paraense Emílio Goeldi, Belém, PA, Brazil
4
Departamento de Biologia Marinha, Universidade Federal Fluminense, Niterói, RJ, Brazil
[email protected]
2
Palavras-chave: inversões cromossômicas, microssatélites, filogeografia, biodiversidade genética, espécie invasora
Drosophila melanogaster originou-se na região sub-sahariana da África e recentemente colonizou o resto do mundo. De
acordo com as estimativas, a colonização do continente Eurásia deu-se 10,000 – 15,000 anos atrás, enquanto a dispersão
para América do Norte e Austrália ocorreu há apenas algumas centenas de anos. Os estudos recentes de comparação das
populações ancestrais africanas com as não africanas foram concentrados nas populações europeus, asiáticas, norte americanas
e australianas de D. melanogaster. Populações da América do Sul praticamente não foram investigadas. Examinamos
nove populações brasileiras de D. melanogaster usando dois tipos de marcadores genéticos: inversões cromossômicas e
microssatélites. Com ambos os tipos de marcadores encontramos baixa estruturação nas populações brasileiras. Apenas
uma população, Recife (PE), formou um cluster distinto. Contudo, para as freqüências das quatro inversões cosmopolitas
detectamos correlações significativas com a latitude para: In(2R)NS, In(3L)P, e In(3R)P. Microssatélites mostraram um
padrão complexo da variabilidade. Detectamos estrutura genética somente nas regiões correspondentes às inversões In(3L)P
e In(3R)P, enquanto outros locos não revelaram nenhum agrupamento entre as populações. As amostras brasileiras foram
comparadas com as populações africanas, européias e norte americanas de D. melanogaster. As comparações foram feitas
baseando-se na variação genética em 11 locos de microssatélites. Nossa análise indicou que as populações brasileiras são
muito semelhantes às populações cosmopolitas (africanas, européias e norte americanas), no entanto formam um grupo
distinto mostrando maior presença de alelos africanos. Os dados citogenéticos foram consistentes com os dados moleculares,
pois nas amostras brasileiras, encontramos uma inversão no cromossomo X [In(1)16D;18D], idêntica à inversão africana
In(1)Be, que até então só foi encontrada no continente africano.
Apoio financeiro: FAPESP, CNPq, CAPES, FAEP e FWF (Fonds zur Förderung des wissenschaftlichen Forschung).
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Testando o uso de barcoding na
identificação de espécies crípticas de
drosophilideos do “cluster” Drosophila
buzzatii (Insecta: Drosophilidae)
Santos, MH1; Franco, FF1; Manfrin, MH1
Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
[email protected]
1
Palavras-chave: barcoding, Drosophila, buzzatii, identificação de espécies, COI
O DNA “barcoding” baseia-se na premissa de que é possível distinguir indivíduos de espécies distintas a partir de
pequenas porções do DNA. A região do genoma mais utilizada para esse tipo de análise é a primeira porção do gene
Citocromo Oxidase I (COI), presente no DNA mitocondrial da grande maioria dos organismos eucariontes. Apesar das
críticas que vem recebendo, o DNA “barcoding” pode ser uma ferramenta útil na identificação de espécies em situações
particulares, como a identificação de espécies crípticas, imaturos e fêmeas de insetos.O “cluster” Drosophila buzzatii é
formado por sete espécies cactófilas e crípticas, distribuídas em regiões de vegetação seca dos domínios morfoclimáticos
da Caatinga, Cerrado e Chaco Argentino. A identificação das espécies é comumente efetuada pelo estudo morfológico
do aparelho reprodutor masculino (edeago), o que limita o processo de identificação. Para a identificação das fêmeas,
por exemplo, é necessário obter machos através de isolinhagens de fêmeas que previamente copularam na natureza.
Utilizando as técnicas convencionais, a identificação de formas larvais é também dificultada. Devido a essas limitações,
seria possível, através de “barcoding”, identificar de forma rápida e segura, espécies do “cluster” D. buzzatii, incluindo
fêmeas e imaturos?Foram utilizadas seqüências de 576 pb da primeira porção da COI de 48 indivíduos das espécies
Drosophila martensis (1) e D. ricardsoni (1), como grupo externo; D. koepferae (1), D. antonietae (7), D. borborema (10),
D. buzzatii (10), D. gouveae (6), D. serido (8) e D. seriema (4). O alinhamento das seqüências foi realizado através do
programa Bioedit v. 7.0.9.0. e a relação entre os haplótipos foram verificadas pela construção de uma rede de haplótipos,
gerada pelo programa TCS v. 1.21. Foi construída uma árvore de relações haplotípicas através do método de máxima
parcimônia (bootstrap, 500 replicações) (PAUP v. 4.0b10). Com base nos cladogramas, foi calculado o Fst e a AMOVA
entre os grupos (ARLEQUIN v. 3.11) a fim de testar o grau de isolamento entre os agrupamentos.A rede de haplótipos
gerou três grandes clados isolados e três haplótipos isolados. O clado 1 continha apenas D. buzzatii, já o clado 2, todos
os indivíduos da espécie D. antonietae e o clado 3 D. gouveae, de uma região onde há suspeita de introgressão entre as
espécies. O clado 3 continha todas as outras espécies do “cluster”, com exceção de D. buzzatii (clado 1) e D. koepferae,
que não apareceu agrupada, assim como as espécies do grupo externo. O teste de Máxima Parcimônia confirmou os
agrupamentos dos clados 1 e 2 (Bootstrap de 100 e 86), entretanto o clado 3 não formou agrupamento de uma mesma
espécie. Os valores de Fst indicaram grande separação entre esses agrupamentos e a AMOVA indicou que 81,6% da
variação é encontrada entre os clados e 16% dentro deles. Neste trabalho preliminar, pode-se concluir que “barcoding”
pode ser usado na identificação de algumas espécies como D. buzzatii, considerada basal dentro do “cluster”, mas deve
ser usado com cautela na identificação de espécies com histórias evolutivas complexas.
Apoio: CAPES, CNPq, Fapesp, USP.
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Desarrollo y caracterización de
microsatélites para poblaciones del
noroeste argentino de Drosophila buzzatii
Lipko, P; Corio, C; Villaruel, C; Hasson, E
Laboratorio de Evolución. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Argentina
[email protected]
Palabras clave: Drosophila buzzatii, microsatélites, estructura poblacional, genética evolutiva, variabilidad
Drosophila buzzatii (Ruiz & Wasserman 1993) es una especie cactófila originaria de Sudamérica que se reproduce
en los tejidos necróticos de varias especies de cactáceas de los géneros Opuntia, Cereus y Trichocereus. Esta especie
forma parte del cluster buzzatii del complejo D. buzzatii (subgrupo D. mulleri, grupo D. repleta). El conocimiento
de la ecología y la genética hacen de D. buzzatii un modelo ideal para estudiar los procesos genéticos que moldean la
variabilidad intra e interpoblacional. A su vez, los loci de microsatélites proveen herramientas potentes para el estudio
de la diversidad genética y la estructura poblacional. En este trabajo se presentan 15 nuevos microsatélites aislados del
genoma de D. buzzatii, los cuales se utilizaron para la caracterización genética de 2 poblaciones argentinas, una del
Noreste (Montecarlo, Provincia de Misiones) y otra del Noroeste (Valle Fértil, Provincia de San Juan), con el fin de
avanzar en el estudio de la estructura poblacional de esta especie cactófila autóctona de la argentina. En este estudio
mostramos que si bien la heterocigosidad observada fue baja, todos los loci analizados fueron polimórficos en ambas
poblaciones. Estos marcadores serán una herramienta fundamental para la estimación de variación genética y para
investigar los procesos que han determinado la estructura genética de las poblaciones de esta especie.
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Filogeografia de Drosophila meridionalis
(Diptera, Drosophilidae): um novo grupo de
espécies no subgrupo mulleri
Silva-Bernardi, ECC1; Mazucato, M1; Sene, FM1; Manfrin, MH2
1
Departamento de Genética, FMRP, Universidade de São Paulo
Departamento de Biologia, FFCLRP, Universidade de São Paulo
[email protected]
2
Palavras-chave: grupo repleta, filogeografia, DNA mitocondrial, COI, estrutura populacional
Drosophila meridionalis (grupo repleta, subgrupo mulleri) é uma espécie cactofílica, amplamente distribuída na América
do Sul, cujas populações, geralmente, encontram-se geograficamente isoladas. Estudos citogenéticos anteriores revelaram
a existência de variação cariotípica entre populações dessa espécie. Foram descritos cinco cariótipos distintos, mostrando
que D. meridionalis é politípica em relação a esse marcador. Embora potencialmente adequada, D. meridionalis, até o
momento, não foi utilizada como modelo em pesquisas sobre os processos de diferenciação populacional e especiação.
Neste trabalho, seqüências de 640 pb do gene mitocondrial COI foram analisadas, objetivando descrever a estrutura
populacional de D. meridionalis e inferir eventos históricos e/ou recorrentes, que expliquem a distribuição geográfica
atual da espécie e, eventualmente, estejam envolvidos na diversificação das populações. Os haplótipos mitocondriais
foram obtidos a partir de indivíduos machos provenientes de 15 populações: Mucugê-BA, Mucuri-BA, Itaúnas-ES,
Macaé-RJ, Arraial do Cabo-RJ, São Sebastião-SP, Bertioga-SP, Itirapina-SP, São Francisco do Sul-SC, Camboriú-SC,
Governador Celso Ramos-SC, Florianópolis-SC, Arroio Teixeira-RS, Cornélios-RS e Viamão-RS. A rede de parcimônia
estatística dos haplótipos foi construída pelo programa TCS 1.21. A Nested Clade Analysis (NCA) foi feita utilizando o
programa GeoDis 2.5 e a análise de variância molecular (AMOVA) utilizando o programa Arlequin 3.11. A AMOVA,
considerando todas as populações um grupo único, mostrou que 61,59% da variação genética é inter-populacional e
38,40% intrapopulacional (ΦST=0,6159; p<0,000001). Três redes de haplótipos foram geradas pelo programa TCS,
sendo a rede A separada por nove passos da rede B e 28 passos da rede C. A rede A continha haplótipos das populações
do Rio Grande do Sul, um haplótipo de Governador Celso Ramos-SC e um haplótipo de Florianópolis-SC. A NCA
indicou amostragem inadequada para discriminar entre “isolamento por distância” e “dispersão a longa distância”
das populações de Santa Catarina em relação às populações do Rio Grande do Sul. A AMOVA sugeriu estruturação
populacional significativa (ΦCT=0,3817; p<0,000001) quando as populações de Santa Catarina e do Rio Grande do
Sul foram tratadas como dois grupos distintos. A NCA da rede B sugeriu “fluxo gênico restrito com isolamento por
distância” entre as populações de Mucugê-BA, Mucuri-BA e Itaúnas-ES e as populações do litoral de Santa Catarina.
A AMOVA indicou estrutura populacional altamente significativa (ΦCT=0,8042; p<0,000001) quando as populações
do litoral de São Paulo e Rio de Janeiro foram reunidas em um grupo separado das demais, sugerindo fragmentação
alopátrica entre tais grupos, resultado não obtido na NCA porque a amostragem foi considerada inadequada. Somente
um haplótipo de Itirapina-SP e um haplótipo de São Sebastião-SP formaram a rede C. Os resultados obtidos a partir
dos dados moleculares mostraram que indivíduos identificados taxonomicamente como representantes da espécie D.
meridionalis podem compor, no mínimo, três grupos distintos. A associação de estudos morfológicos e moleculares
permitirá determinar o status taxonômico desses grupos.
Apoio Financeiro: CAPES, CNPq e USP.
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Polimorfismo intraespecífico de inserção
de elementos transponíveis em regiões
reguladoras dos genes da família Cyp em
Drosophila melanogaster e D. simulans
Ricci, J1, Lopes, FR1, Vieira, C2; Carareto, CMA1
Laboratório de Evolução Molecular. Departamento de Biologia, IBILCE, UNESP-São José do Rio Preto
Laboratório de Biométrie et Biologie Evolutive,Université Claude Bernard Lyon 1, Villeurbanne, França
[email protected]
1
2
Palavras-chave: elementos transponíveis, genes Cyps, regulação da expressão gênica, resistência a inseticidas, DNAREP1_DM
A família citocromo P450 monooxigenases (CYP) possui genes envolvidos no metabolismo de xenobióticos, dentre
eles, os inseticidas. Alguns Cyps de Drosophila melanogaster tiveram sua função bem estabelecida, oito associados à
resistência a inseticidas e cinco ao desenvolvimento. Sabe-se que a inserção de fragmentos de elementos transponíveis
(TEs) em regiões regulatórias ou codificadoras dos Cyps aumenta sua expressão e pode induzir a resistência a inseticidas.
Neste estudo foram analisados os genomas seqüenciados de D. melanogaster e D. simulans com o objetivo de avaliar a
ocorrência de inserções de TEs nas regiões intergênicas 5’ e 3’, bem como nas regiões gênicas de 35 Cyps e do primeiro
gene vizinho upstream e downstream de cada Cyp. Foram extraídas as regiões de similaridade de cada gene e analisada
a ocorrência de TEs nessas seqüências pela ferramenta RepeatMasker (RM) utilizando a biblioteca de TEs do gênero
Drosophila oriunda do RepBase. Essa análise identificou alta freqüência de TEs nas regiões intergênicas 5’ e 3’em Cyps
associados à resistência e ao metabolismo de xenobióticos em geral, e da mesma forma nos genes flanqueadores, associados
a variadas funções. Porém, aqueles associados ao desenvolvimento mostraram quase completa ausência de inserções. Esses
resultados corroboram os achados de Chen e Li (2007) de que inserções nos Cyps relacionados à resistência a xenobióticos
podem ser adaptativas e são mantidas nas populações, enquanto aquelas em genes relacionados ao desenvolvimento,
sob forte seleção negativa. A maioria dessas inserções está localizada entre 500 e 2.000pb do gene alvo. De modo geral,
houve maior número de inserções na região intergênica 5’ que na 3’. Entretanto, quando consideradas as inserções
5´ e 3´ para diferentes Cyps (resistência, detoxificação em geral e desenvolvimento), essa diferença foi significante
apenas para os relacionados à resistência em D. simulans. Dentre os TEs detectados, destaca-se o DNAREP1_DM,
um transposon não-autônomo ancestral descrito em D. melanogaster. Os resultados mostram que os DNAREP1 com
diferentes tamanhos presentes nos Cyps de D. simulans correspondem preferencialmente à extremidade 3’ do elemento
consenso, enquanto o mesmo não ocorre em D. melanogaster. De modo inédito, utilizando a ferramenta Alibaba2,
foram identificados seqüências homólogas a sítios de ligação de fatores de transcrição (Oct-1, HSTF, Hb, Sp1, TBP e
NF-1) em cópias do DNAREP1_DM localizadas nos genes Cyp6w1, Cyp6a2 e Cyp12d1 de D. simulans, e apenas no
primeiro de D. melanogaster, todos associados à resistência Esses achados sugerem que tais fragmentos de TEs possam ser
seletivamente mantidos por fornecerem motivos de ligação de fatores de transcrição que, de alguma maneira, afetariam
a expressão gênica em situação de estresse ambiental.
Apoio Financeiro: FAPESP e CNPq.
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Padrões contrastantes entre morfologia do
edeago e asa em espécies de Drosophila
cactofílicas
Franco, FF1; Sene, FM1; Manfrin, MH2
1
Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP
Departamento de Biologia, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, USP
[email protected]
2
Palavras-chave: morfometria, morfometria geométrica, edeago, asa, taxonomia, Drosophila
Espécies do gênero Drosophila são organismos modelo para estudos de genética. Por esse motivo, a taxonomia destas
espécies é de grande interesse para os geneticistas. Um dos maiores agrupamentos de espécies dentro do gênero Drosophila
é o grupo repleta, que é composto por mais de 90 espécies, naturalmente endêmicas da região Neotropical. O principal
marcador taxonômico para as espécies do grupo repleta é a morfologia do edeago, que ao contrário da morfologia externa
do corpo, é bastante variável entre as espécies do grupo. Com o advento da morfometria geométrica, entretanto, a qual
é uma metodologia sensível a pequenas alterações na morfologia, outros caracteres morfológicos têm sido utilizados
para diferenciar as espécies do grupo repleta, bem como de outros grupos dentro do gênero Drosophila. Dentre esses
caracteres, destaca-se a asa, que é um órgão plano e com várias intersecções entre as veias alares, que permitem a definição
de marcos anatômicos (landmarks), que são utilizados nas análises morfométricas. Com o objetivo de investigar se a
morfologia da asa é um bom marcador taxonômico para espécies do “cluster” buzzatii (grupo repleta), que é um grupo
composto por espécies cactofílicas e crípticas, foram analisadas a morfologia do edeago e da asa de aproximadamente
340 indivíduos, pertencentes às espécies D. serido, D. gouveai, D. seriema e D. borborema. As imagens dos edeagos
foram contornadas e analisadas de acordo com os Descritores Elípticos de Fourier. As asas foram analisadas por Relative
Warps, com a utilização de 10 marcos anatômicos. A quantificação da divergência morfológica entre as espécies foi
realizada através de análises discriminantes. Tanto o edeago (Wilks’ Lambda = 0,0054; p<0,00001) quanto a asa (Wilks’
Lambda = 0,1787; p<0,00001) apresentaram diferenciação entre as quatro espécies analisadas, mas enquanto através da
morfologia do edeago os indivíduos foram reclassificados corretamente com uma porcentagem de 98%, com os dados de
morfologia da asa os indivíduos foram reclassificados corretamente em 79% das vezes, sendo que para a espécie D. gouveai
a porcentagem de reclassificação correta foi de apenas 54,5%. Esses resultados confirmam o edeago como um excelente
marcador taxonômico para as espécies do “cluster” D. buzzatii e sugerem que, embora haja pronunciada diferenciação
morfológica na asa das espécies analisadas, a variabilidade intra-específica é maior do que a variação interespecífica, não
sendo, portanto, um marcador consistente para identificação das espécies do “cluster” D. buzzatii.
Apoio Financeiro: FAPESP, FAEPA, CAPES, CNPq, FINEP, USP.
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Desvendando a diversidade críptica do
grupo bromeliae de Drosophila
Schmitz, HJ1; Valente, VLS1
Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS)
[email protected]
1
Palavras-chave: Drosophila, grupo bromeliae, espécies crípticas, morfometria, diversidade
O grupo bromeliae de Drosophila compreende espécies de ecologia restrita a flores como recurso de ovoposição, ao
contrário da maior parte das espécies do gênero, que utilizam frutos. Segundo dados presentes na literatura, a única
espécie do grupo conhecida para o sul do Brasil é Drosophila bromelioides, mas nossas coletas recentes, realizadas em
Porto Alegre, RS, revelaram três novas espécies crípticas, que chamamos aqui de tipos III, IV e V. A mais generalista das
espécies é D. bromelioides, seguida pelo tipo III, enquanto os tipos IV e V foram encontrados apenas em flores do gênero
Solanum. O objetivo deste trabalho é comparar estas espécies através de diferentes marcadores, a fim de se estudar a
evolução deste grupo críptico. Foram usadas para a análise D. bromeliae, que tem distribuição na América Central, e as
quatro espécies presentes em nossas coletas, anteriormente mencionadas. Embora crípticas quanto à morfologia geral,
as cinco espécies podem ser reconhecidas pela análise da genitália masculina, mais precisamente pela morfologia do
edeago. Além disso, apresentamos aqui os resultados da análise de espermateca, ovopositores, arista e de um conjunto
de 29 caracteres morfométricos. A espermateca de D. bromeliae apresenta um tamanho marcadamente reduzido, com
comprimento e largura de cerca de 40µm e invaginação do duto alcançando ¾ da cápsula. As espermatecas das demais
espécies apresentam tamanho aproximado de 80µm de comprimento e 60µm de largura, porém, a invaginação do
duto alcança 2/3 da cápsula no tipo III e apenas 1/3 em D. bromelioides e nos tipos IV e V. Quanto aos ovopositores,
os tipos IV e V apresentam valvas fortes e pontudas, com comprimento aproximado de 550µm, enquanto nas demais
espécies as valvas são arredondadas e menores, com comprimento de 375µm. Entre essas três últimas espécies, há
diferença estatisticamente significativa entre o número de espinhos em cada valva do ovopositor (ANOVA, com n=30
para cada espécie), tanto discais (p<0,0001; D. bromelioides > tipo III > D. bromeliae), quanto marginais (p<0,0001;
tipo III > D. bromelioides > D. bromeliae) e totais (p<0,0001; tipo III > D. bromelioides > D. bromeliae). O número de
ramos dorsais na arista mostrou-se diferente no tipo V. Este número variou entre três e cinco, tendo como regra geral,
quatro (88,7% dos indivíduos em D. bromeliae, n=53; 95,8% em D. bromelioides, n=119; 93,4% no tipo III, n=136;
100% no tipo IV, n=11). Entretanto, o tipo V apresenta-se como exceção, já que 91,1% dos indivíduos têm apenas
três ramos (n=45). Finalmente, a utilização de uma análise discriminante com os 29 caracteres morfométricos obteve
sucesso de 98% na classificação dos machos, e de 96% na análise das fêmeas.
Apoio financeiro: CNPq.
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Filogeografia de espécies de Drosophila
cactofílicas e endêmicas da América do
Sul inferida pelos genes mitocondrial COI e
nuclear period
Franco, FF1; Sene, FM1; Mazucato, M1; Manfrin, MH2
Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP
Departamento de Biologia, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, USP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Filogeografia, COI, period, genealogia, Drosophila
As espécies cactofílicas Drosophila serido, D. gouveai, D. seriema e D. borborema pertencem ao “cluster” Drosophila
buzzatii (grupo repleta), um grupo monofilético e endêmico da América do Sul. Para investigar a história filogeográfica
dessas espécies foram analisados 630pb do gene mitocondrial COI e 360pb do gene nuclear period, provenientes de
102 indivíduos de diferentes populações. Os dados foram analisados através de Nested Clade Analysis (NCA), testes de
neutralidade e AMOVA. Na genealogia baseada no gene period, as seqüências formaram haplogrupos espécie específicos.
Através da NCA foi detectada fragmentação alopátrica entre os clados 3-5 (D. serido) e 3-4 (D. gouveai) e entre os clados
4-2 (D. serido + D. gouveai) e 4-1 (D. seriema + D. borborema). Além disso, foi detectado fluxo gênico restrito e eventos
de dispersão a longa distância para D. seriema, em congruência com a distribuição fragmentada dessa espécie ao longo
da Cadeia do Espinhaço. Ao contrário do gene period, existe compartilhamento de vários haplótipos do gene COI entre
as espécies analisadas, sendo que não foram observados agrupamentos espécie específicos, embora exista pronunciada
diferenciação entre as espécies em relação a este marcador (Фst = 0,434; p < 0,000001). Os principais resultados da
NCPA foram: 1. Fluxo gênico restrito com isolamento por distância para as espécies D. seriema e D. borborema, 2.
Expansão populacional contígua de populações de D. serido de Cabo Frio, RJ em direção ao litoral Sul do estado
de São Paulo, 3. Eventos de expansão populacional contígua envolvendo populações de D. borborema, D. seriema e
D. gouveai. Tais resultados podem estar relacionados aos eventos de expansão das populações de cactos durante o período
Quaternário. O tempo de divergência estimado para as espécies analisadas nesse trabalho é de cerca de três milhões de
anos, que é tempo suficiente para aquisição de monofilia recíproca de acordo com a teoria da genética de populações.
Dessa forma, o compartilhamento entre haplótipos do gene COI entre as espécies analisadas parece estar relacionado a
eventos de introgressão de DNA mitocondrial entre as diferentes linhagens evolutivas dentro do “cluster” buzzatii. Além
disso, os genes analisados no presente trabalho possuem Ne diferentes, uma vez que os genes mitocondriais possuem Ne
menor do que genes ligados ao X, que é o caso do period. Neste contexto, seria esperado encontrar menor número de
polimorfismos compartilhados na genealogia do gene mitocondrial em comparação com a genealogia do gene period,
exceto se o último estivesse sob ação de seleção direcional. No entanto, os testes de neutralidade sugerem que o period
está evoluindo sob seleção purificadora. Esses resultados corroboram a hipótese de que houve diversificação com fluxo
gênico entre as linhagens que compõem o “cluster” buzzatii, com introgressão de DNA mitocondrial.
Apoio Financeiro: FAPESP, FAEPA, CAPES, CNPq, FINEP, USP.
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Polimorfismo cromossômico de populações
de Drosophila willistoni da região nordeste
do Brasil
Nascimento, GAF; Lima, CDS; Oliveira, RDL; Valente, VLS; Rohde, C
Laboratório de Genética, Centro Acadêmico de Vitória, Universidade Federal de Pernambuco
Palavras-chave: Drosophila, citogenética
A espécie Drosophila willistoni pertence ao grupo críptico willistoni e ao subgênero Sophophora (Diptera, Drosophilidae).
Apesar de esta espécie ter sido bastante estudada nos últimos 20 anos, as populações do Nordeste são praticamente
desconhecidas quanto à genética e aos padrões dos cromossomos politênicos. Este projeto de iniciação científica está
estudando as características genéticas das populações naturais de D. willistoni do Nordeste, em especial do Estado de
Pernambuco. O objetivo é comparar os padrões dos cromossomos politênicos, tanto os fixados quanto os segregantes
(inversões), com os resultados obtidos para outras populações estudadas por nosso grupo e originárias de outras regiões
geográficas. Coletas de drosofilídeos são realizadas nas regiões úmidas de Pernambuco, como a Zona da Mata e o Litoral,
desde 2007, quando se iniciaram as atividades práticas do Laboratório de Genética, no Centro Acadêmico de Vitória/
UFPE. As formas adultas são capturadas com o uso de rede entomológica sobre frutos caídos ou através de armadilhas
contendo banana. Já as formas imaturas (ovos e larvas) são obtidas através da coleta dos frutos fermentados que são
trazidos ao laboratório e mantidos em vidros apropriados até a emergência dos adultos. Todos os nascidos são separados
por espécie, contados e sexados. A análise do polimorfismo cromossômico é feita a partir dos preparados dos cromossomos
politênicos presentes nas células da glândula salivar de larvas em terceiro estágio. O reconhecimento do padrão dos
cromossomos politênicos das diferentes isolinhagens é feito com auxílio do fotomapa da espécie, elaborado por Rohde
e Valente. Já o reconhecimento das diferentes inversões paracêntricas é feito com auxílio das imagens disponíveis em
laboratório tanto para inversões homo quanto heterozigotas. Os resultados indicam que as populações são abundantes
em Pernambuco e várias isolinhagens foram obtidas nos municípios de Pombos e Bonito, principalmente sobre frutos
de jaca, espalhados nas bordas da mata. As análises citogenéticas dos descendentes indicam que as populações são
polimórficas quanto à presença de inversões.
Apoio Financeiro: FACEPE e CNPq.
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Evidência da ação de seleção natural
em populações naturais de Drosophila
mediopunctata de fragmentos florestais
Batista, MRD¹; Ananina, G¹; Klaczko, LB¹
¹Instituto de Biologia, Departamento de Genética e Evolução, Unicamp
[email protected]
Desde 1986, estamos estudando o polimorfismo de inversões cromossômicas em Drosophila mediopunctata. O
cromossomo II é o que apresenta maior número de inversões, oito na região distal e 9 na proximal, 17 no total. Foi
demonstrado que há um cline altitudinal nas freqüências dos arranjos da população do Parque Nacional do Itatiaia e que
há diferenciação no padrão das freqüências em distintas populações. Na população da Mata Santa Genebra (Campinas, SP)
encontramos anteriormente as seguintes freqüências de inversões para a região distal do cromossomo II: f(DA) = 0,221;
f(DI) = 0,047; f(DS) = 0,369; f(DV) = 0,048; f(DP) = 0,246 (N = 634 cromossomos). Esse resultado foi inesperado,
quando comparado às freqüências em Jundiaí: f(DA) = 0,562; f(DI) = 0,092; f(DS) = 0,147; f(DV) = 0,076;
f(DP) = 0,095 (N = 368 cromossomos); e no Itatiaia: f(DA) = 0,512; f(DI) = 0,224; f(DS) = 0,126; f(DV) ~ 0; f(DP)
= 0,071 (N = 3860 cromossomos). A distribuição das freqüências de inversões da Mata Santa Genebra é mais diferente
daquelas de Jundiaí, cuja distância é de 50 km, do que esta última da população do Itatiaia (distante 150 km). Para
melhor compreendermos este resultado, realizamos outras coletas em diferentes fragmentos de mata da região de
Campinas e observamos o seguinte padrão de distribuição de freqüências: Mata do Ribeirão Cachoeira - f(DA) = 0,407;
f(DS) = 0,214; f(DV) = 0,107; f(DI) = 0,1; f(DP) = 0,107 (N = 140 cromossomos); Parque Ecológico de Campinas
- f(DA) = 0,395; f(DI) = 0,1320; f(DS) = 0,105; f(DV) = 0,237; f(DP) = 0,105 (N = 38 cromossomos); e a Mata do
Costa e Silva f(DA) = 0,268; f(DI) = 0,109; f(DS) = 0,342; f(DV) = 0,073; f(DP) = 0,195 (N = 82 cromossomos).
Notamos que o padrão das freqüências da Mata do Ribeirão Cachoeira e do Parque Ecológico são semelhantes entre si
e àquelas do Itatiaia e Serra do Japi. Enquanto que o padrão da Mata do Costa e Silva e Mata Santa Genebra são entre
si. Estes resultados sugerem que as freqüências de inversão cromossômica dividem as matas em dois grupos distintos,
aquelas cuja freqüência da inversão DA é maior (Mata do Ribeirão Cachoeira e Parque Ecológico) e aquelas com a
freqüência de DS maior (Mata Santa Genebra e Mata do Costa e Silva). Tais fragmentos também estão divididos em
relação ao seu domínio florístico. A Mata do Ribeirão Cachoeira e Parque Ecológico pertencem ao domínio Floresta
Ombrófila Densa, enquanto as matas de Santa Genebra e do Costa e Silva ao domínio Floresta Estacional Semidecídua.
Sendo assim, a diferenciação geográfica das freqüências de inversão cromossômica pode estar refletindo adaptações às
variações florísticas ou climáticas locais, fruto da ação da Seleção Natural.
Apoio financeiro: FAPESP, CNPq, CAPES, FAEP.
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Polimorfismo cromossômico em Drosophila
nebulosa: uma releitura
Garcia, CF1; Garcia, ACL2; Schmitz, HJ1; Valente, VLS1
Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
2
Centro Acadêmico de Vitória, Universidade Federal de Pernambuco
[email protected]
1
Palavras-chave: Drosophila nebulosa, Polimorfismo cromossômico, Inversões paracêntricas, Cromossomos politênicos, Fotomapa
Drosophila nebulosa é um drosofilídeo pertencente ao grupo willistoni, típico de regiões abertas e xéricas. Apresenta ampla
distribuição neotropical desde os U.S.A., até o Chile, Argentina e Uruguai. Do ponto de vista cromossômico, ela é
polimórfica para inversões paracêntricas, localizadas principalmente no cromossomo III. Esta espécie teve o seu primeiro
fotomapa dos cromossomos politênicos construído e análises de polimorfismos cromossômicos de populações das regiões
de Porto Alegre e do Uruguay, realizadas por nosso grupo, baseado nos estudos prévios de Pavan (1946). O presente
trabalho se insere em um amplo projeto que pretende estabelecer relações entre polimorfismo cromossômico e elementos
transponíveis. Assim, apresentamos aqui o fotomapa aprimorado, com uso de recursos computacionais modernos, para
a D. nebulosa, incluindo além das seções já estabelecidas, também subseções e outros detalhes estruturais; bem como
a análise do polimorfismo para o terceiro cromossomo de indivíduos oriundos de diferentes locais da América Latina
(Santa Maria, RS; San José, Costa Rica e Tingo María, Peru). Para tal, fez-se a análise dos cromossomos politênicos de
células das glândulas salivares de larvas em terceiro estágio de desenvolvimento. Estas glândulas foram dissecadas em
solução fisiológica e os cromossomos fixados em ácido acético 45%, corados com orceína aceto-lática, e analisados ao
microscópio, sob contraste de fase. Os melhores núcleos de cada indivíduo foram fotografados e analisados quanto à
presença de diferentes rearranjos. Das 13 inversões paracêntricas já descritas para o terceiro cromossomo de D. nebulosa
(inversões A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L e M), foram encontradas as inversões A, C e H até o momento, com a
inversão H sendo a mais freqüente.
Apoio Financeiro: PIBIC/CNPq, CNPq.
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Novas contribuições sobre o polimorfismo
cromossômico de Drosophila paulistorum
Garcia, ACL1; Garcia CF2; Rohde C1; Tidon R3; Valente, VLS2
Laboratório de Genética, Centro Acadêmico de Vitória, Universidade Federal de Pernambuco
Laboratório de Drosophila, Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
3
Departamento de Genética e Morfologia, Universidade de Brasília
1
2
Palavras-chave: Drosophila paulistorum
Drosophila paulistorum (Diptera, Drosophilidae) é uma superespécie constituída por seis semi-espécies morfologicamente
similares: Andino-Brasileira, Centro-Americana, Orinocana, Transicional, Interior e Amazônica. A distribuição
geográfica deste grupo é essencialmente neotropical, e a semi-espécie Andino-Brasileira é a de mais ampla distribuição,
ocorrendo desde a Guatemala até o sul do Brasil. Quando intercruzadas em laboratório, estas semi-espécies apresentam
um isolamento reprodutivo parcial: as fêmeas descendentes são férteis e os machos estéreis. A identificação de cada
semi-espécie pode ser feita através de poucos marcadores genéticos, como o cruzamento direcionado com linhagens
conhecidas ou a análise do padrão de bandas dos cromossomos politênicos e comparação com fotomapas de referência.
Neste estudo, apresentamos novas contribuições sobre o polimorfismo cromossômico da semi-espécie Andino-Brasileira
proveniente do bioma Cerrado, os resultados deste estudo são comparados com dados prévios de populações de
outras regiões do Brasil estabelecidos por nosso grupo. As coletas do presente estudo foram realizadas em Brasília, na
Reserva Ecológica do IBGE (15°56′S, 47°53′W) e no Parque Nacional de Brasília (15°40′S, 47°54′W). A análise dos
cromossomos politênicos incluiu a caracterização dos diferentes arranjos fixados e arranjos segregantes, resultantes da
ocorrência de inversões paracêntricas no passado evolutivo da espécie. Os cromossomos politênicos estão presentes
em células das glândulas salivares de larvas em terceiro estágio de desenvolvimento. Estas glândulas são dissecadas em
solução fisiológica e os cromossomos fixados em ácido acético 45%, corados com orceína aceto-lática, e analisados ao
microscópio, sob contraste de fase. Os melhores núcleos de cada isolinhagem são fotografados e analisados quanto à
presença de diferentes rearranjos com o auxílio do fotomapa da semi-espécie Andino-Brasileira produzido por nosso grupo.
Foram identificadas 7 diferentes inversões paracêntricas nas 20 isolinhagens do Cerrado investigadas. O cromossomo
III (acrocêntrico) apresentou 4 inversões, o cromossomo X (metacêntrico) 2 inversões no braço XL e 1 inversão no
braço XR e o cromossomo II (metacêntrico) não apresentou inversões segregantes ou fixadas. O cromossomo III
também tem sido caracterizado como o mais polimórfico entre as outras populações previamente analisadas, incluindo
representantes do bioma da Mata Atlântica da região sul e sudeste do Brasil. O polimorfismo cromossômico de
D. paulistorum vem sendo tradicionalmente estudado por nosso grupo, dentro de uma proposta maior que visa estudar
populações desta superespécie habitantes de diferentes biomas brasileiros, a fim de comparar as variantes cromossômicas
que se estabeleceram ao longo da evolução da superespécie nestes ambientes.
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Estudo de duas populações naturais de
Drosophila mediopunctata por meio de
marcadores microssatélites
Laborda, PR1; Mori, GM1; Klaczko, LB2; Souza, AP1
1
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética, UNICAMP
Departamento de Genética e Evolução, Instituto de Biologia, UNICAMP
[email protected]
2
Palavras-chave: Drosophila, microssatélites
O entendimento da biologia das espécies e da forma como elas evoluem pode ser muitas vezes obtido pelo estudo da
dinâmica de suas populações. Devido a isso, a conformação genética de diversas espécies, selvagens e domesticadas,
é constantemente alvo da investigação científica. E uma das ferramentas mais eficazes para esse tipo de análise são
os marcadores microssatélites, que permitem o acesso a vários sítios do genoma e, dessa forma, podem reconstituir
a história genética das populações. A nossa espécie de interesse é Drosophila mediopunctata, mosca com distribuição
neotropical que é estudada por nosso grupo sob diversos aspectos. Este trabalho objetivou a obtenção de estimativas
populacionais para a espécie por meio da análise de duas populações naturais com o auxílio de marcadores moleculares
microssatélites. Quarenta e oito indivíduos, provenientes de duas coletas, realizadas em Campinas e Jundiaí, foram
genotipados com 25 marcadores desenvolvidos para a espécie. Foram obtidas as heterozigosidades observada e esperada,
identificados os locos que desviaram das proporções esperadas no Equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) e aqueles
em desequilíbrio de ligação, e calculados o valor de FST e o número de migrantes por geração. Quatro programas
foram usados para a obtenção das estimativas: TFPGA, FSTAT, GENEPOP e ARLEQUIN. Os valores médios de
número alelos e heterozigosidades observada e esperada foram n = 8,5, HO = 0,5 e HE = 0,7, respectivamente. Não
foram identificados alelos privativos de uma ou outra população, e os cálculos realizados com as populações separadas
mostraram os mesmos resultados. Na população de Campinas, doze locos desviaram das proporções do EHW, e na
população de Jundiaí, treze. Na análise conjunta, dezesseis dos 25 locos desviaram do EHW. Todos os locos fora do
EHW apresentaram deficiência de heterozigotos. Com relação aos pares de locos em desequilíbrio de ligação, houve
algumas discrepâncias entre os resultados gerados por alguns programas. O GENEPOP identificou nove, doze e sete
pares de locos em desequilíbrio para Campinas, Jundiaí, e as duas populações juntas, respectivamente. O ARLEQUIN
identificou sete, nove e quatro pares para Campinas, Jundiaí, e as duas em conjunto, respectivamente. Entretanto, de
maneira geral, o mesmo grupo de locos estava envolvido nos grupos de ligação formados. O valor de FST obtido entre
as duas populações foi de -0,0013 (P>0,05), e o número de migrantes calculado foi de aproximadamente três por
geração. Os resultados sugerem, portanto, que as localidades de Campinas e Jundiaí constituem uma única população
para D. mediopunctata, uma vez que há compartilhamento dos mesmos alelos, não foi detectada estruturação e ocorre
fluxo gênico considerável.
Apoio financeiro: FAPESP.
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Herança mendeliana dos cromossomos
supranumerários do curimbatá
(Prochilodus lineatus) do rio Mogi-Guaçu
Voltolin, TA1; Senhorini, JA2; Oliveira, C.3; Foresti, F3; Bortolozzi, J1; Porto-Foresti, F1
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual Paulista
Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade, Centro Nacional de Pesquisa e Conservação de Peixes Continentais, CEPTA
3
Departamento de Morfologia, Universidade Estadual Paulista
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Cromossomos supranumerários, Herança mendeliana, Prochilodus lineatus, Cruzamento dirigido, Neutralização
Prochilodus lineatus, popularmente conhecido como curimbatá, ocorre freqüentemente na bacia superior do rio Paraná,
envolvendo, sobretudo, os rios Grande, Pardo e Mogi-Guaçu. Além disso, é uma espécie bastante utilizada em projetos
de piscicultura principalmente no sul do Brasil. Sob o ponto de vista citogenético, apresenta um cariótipo básico
composto por 2n=54 cromossomos, além da presença de até 7 cromossomos B. Cromossomos B, também conhecidos
como supranumerários ou cromossomos acessórios, são elementos adicionais dispensáveis presentes em alguns indivíduos
de algumas populações em algumas espécies, o qual provavelmente surgiu do cromossomo A, mas seguiu seu próprio
caminho evolutivo. A estrutura, função e comportamento destes cromossomos são completamente particulares nos
diferentes grupos portadores, tornando-se difícil alcançar uma conclusão geral sobre sua origem e importância para as
espécies. A presença destes elementos cromossômicos em peixes Teleostei de água continental é um evento comum,
presente em 41 espécies dentre as já analisadas na região Neotropical. Estes cromossomos extras são de pequeno
tamanho, freqüentemente heterocromáticos e geralmente não apresentam homologia com o complemento padrão
A, podendo variar tanto no número quanto na morfologia. Intensos estudos têm sido realizados no intuito de buscar
informações sobre sua função, origem e herança nos organismos portadores. Diante disso, este trabalho objetivou o
estudo da herança dos cromossomos B resultantes de cruzamentos dirigidos na espécie P. lineatus proveniente do rio
Mogi-Guaçu, Pirassununga, SP. Estes cruzamentos foram realizados no CEPTA/ICMbio, Pirassununga, SP. O padrão
de transmissão destes elementos supranumerários foi obtido utilizando o teste Z. Os dados sobre padrão de transmissão
destes microcromossomos mostraram-se consistentes (KB= 0,48), com a expectativa do comportamento meiótico regular
seguindo um modelo de transmissão mendeliano (KB= 0,5). Observou-se, portanto, um processo de não acumulação
destes cromossomos B manifestado nas gerações filiais desta referida espécie. Estes resultados parecem indicar que os
cromossomos supranumerários presentes na espécie P. lineatus de ocorrência no rio Mogi-Guaçu estão em uma fase de
neutralização, seguindo um padrão de herança mendeliana.
Apoio financeiro: CAPES, CEPTA/ICMbio e FAPESP.
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Resultado das coletas e da atividade diária
de machos e fêmeas de Drosophilidae
capturados na Universidade Estadual de
Goiás – Morrinhos, GO
Pires, DJ1; Isaac, VLR1; Rocha, LHO1; Ribeiro, AI1; Ávila, LR1
Departamento de Biologia, Universidade Estadual de Goiás – Unidade Universitária de Morrinhos
1
Palavras-chave: Drosophilidae, Comportamento Diurno, Zaprionus indianus, Drosophila simulans e Temperatura
O conhecimento das espécies de drosofilideos que colonizam um determinado ambiente é de extrema importância,
porque são consideradas indicadoras de biodiversidade por responderem rapidamente às alterações ambientais. Os
drosofilídeos são moscas sensíveis as mudanças no ambiente, principalmente da temperatura e umidade relativa do ar.
Neste sentido, este trabalho foi verificado o número de espécies da família Drosophilidae e o comportamento diurno de
machos e fêmeas capturados na Unidade Universitária de Morrinhos, GO. As coletas foram realizadas com o auxílio de
um puçá e uma caixa isca com bananas maduras foi deixada no local, um dia antes da coleta. No total foram realizadas
14 coletas durante dois dias em horários diferentes (6:00hs, 8:00hs, 10:00hs, 12:00hs, 14:00hs, 16:00hs e 18:00hs.
Os valores de temperatura e umidade relativa do ar foram anotados em cada horário. No total foram coletados 2.773
drosofilídeos de 11 espécies, sendo 1.361 no dia 24/10/07 e 1.412 no dia 26/10/07. As espécies com maior número
de exemplares capturados foram: Drosophila simulans e Zaprionus indianus. As coletas do dia 24/10/07 mostraram
que os picos das atividades dos drosofilídeos foram pela manhã (8 e 10horas). O mesmo aconteceu no dia 26/10/07,
onde os horários dos maiores picos de atividades foram às 6 e 10horas. O teste do X2 mostrou que houve diferença
significativa no número de machos capturados no dia 24/07/07, no período da manhã (6, 8 e 10horas) e no fim da
tarde (18horas). O número de fêmeas coletado foi significativamente maior às 14horas. No dia 26/10/07 o número de
machos foi significativamente maior nos três primeiros horários de coletas e a partir das 12 horas não houve diferença
significativa entre os membros de cada sexo. Em ambos os dias de coletas dos drosofilídeos, foi observado uma preferência
para realização das suas atividades no período da manhã, onde a temperatura é mais baixa e a umidade relativa do ar é
maior. O número de machos foi significativamente maior neste mesmo período, sugerindo que os machos e as fêmeas
possuem estratégias diferentes para explorar o mesmo recurso e assim evitar a competição.
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Comportamento sexual de Zaprionus
indianus: análise do som de corte do macho
Müller, MJ1,2; Mendonça, MP2; Oliveira, IR2; de Oliveira, LPL3; Valiati, VH2; Valente, VLS1
Laboratório de Drosophila, Departamento de Genética Universidade Federal do Rio Grande do Sul - UFRGS, Porto Alegre/RS
2
Laboratório de Biologia Molecular, Universidade do Vale do Rio dos Sinos - UNISINOS, São Leopoldo/RS
3
Ciências Exatas e Tecnológicas, Universidade do Vale do Rio dos Sinos - UNISINOS, São Leopoldo/RS
[email protected]
1
Palavras-chave: Zaprionus indianus, som de corte, intervalo interpulso
Drosofilídeos apresentam uma corte sexual complexa, formada por vários componentes comportamentais, acústicos e
químicos. Alguns destes podem estar envolvidos na manutenção do isolamento sexual entre espécies. O som produzido
pela vibração das asas do macho é um destes e apresenta diversos componentes acústicos, incluindo uma série de
pulsos com intervalo interpulso (IPI), o qual é espécie-específico, funcionando como sinal de reconhecimento entre
indivíduos da mesma espécie. Além disso, pode compor o “display” sexual e, conseqüentemente, influenciar na escolha
dos parceiros. Em algumas espécies as fêmeas produzem sons em resposta ao som de corte do macho, podendo ser de
rejeição. No gênero Zaprionus, as fêmeas exibem sons de resposta ao som de corte dos machos, porém não produzidos
pela batida das asas, mas sim pela vibração do corpo num movimento chamado de “rocking”. Em Z. indianus, não há
conhecimento do padrão sonoro de corte dos machos, nem se as fêmeas produzem sons de resposta. O objetivo deste
trabalho é caracterizar o som de corte sexual de machos e a possível ocorrência de sons produzidos pela fêmea desta
espécie em resposta a corte do macho. Os indivíduos utilizados eram sexualmente maduros e depois de separados por
sexo, eram mantidos em meio de cultura por três dias em fotoperíodo (12h claro/12h escuro) a temperatura de 24ºC
± 1. Foram gravados os sons de 11 casais, captados com um microfone de lapela, amplificados 70 vezes e armazenados
com o programa Audacity. A análise do oscilograma foi executada nos programas Sigview e MatLab. Para este trabalho,
avaliou-se apenas a última seqüência de pulsos antes da cópula. Os parâmetros estimados foram o IPI e a freqüência
fundamental, via análise de Fourier. Os resultados demonstraram que o som de corte de Z. indianus é monocíclico com
um IPI médio de 0,2472 msec ± 0,0514 e freqüência fundamental de aproximadamente 300 Hz. Não há diferenças
significativas entre as médias de IPI para os pulsos produzidos pelos machos antes da cópula (F4,25=1,78; P=0,1650).
Nesta seqüência de pulsos pré-copula foram detectados dois diferentes intervalos de tempo (IPI), denominados IPI
longo (0,2743 msec ± 0,0345) e IPI curto (0,1842 msec ± 0,0141 (F1,28=56.23; P<0,00000). Somente um casal não
copulou, observando-se uma grande quantidade de pulsos emitidos pelo macho. Contudo, o som que a fêmea emitiu
difere na quantidade de vibrações das fêmeas que copularam. De maneira geral, todas as vezes que a fêmea aceitou os
machos e emitiu algum som, o número de vibrações foi muito menor. Mesmo preliminares, os resultados apontam
para a possibilidade de dois tipos de som de resposta da fêmea a corte do macho. Uma seqüência de vibrações curta
como sinal de receptividade a cópula e uma longa, como um sinal de rejeição ao macho.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq, UFRGS, UNISINOS.
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Ecologia e genética da espécie invasora
Zaprionus indianus
na região nordeste do Brasil
Lima Filho, MGC1; Monteiro, AGF1; Anjos, MDA1; Garcia, ACL1, Valente VLS2; Rohde, C1
1
Laboratório de Genética, Centro Acadêmico de Vitória, Universidade Federal de Pernambuco
Laboratório de Drosophila, Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
2
Palavras-chave: Zaprionus, citogenética
A espécie Zaprionus indianus pertence à família Drosophilidae é originária da África tropical. É conhecida por sua
capacidade invasora e por ser transportada pelo homem em frutos comerciais. Desde sua primeira descrição no Brasil,
em Santa Isabel, São Paulo, em março de 1999, esta espécie tem se espalhado rapidamente ao longo das latitudes do
Brasil, tendo sido reconhecida em freqüências superiores a 45% no Sul do Brasil e, recentemente, já chegou aos Estados
Unidos. Este trabalho visa dar continuidade aos estudos iniciados em 2005 sobre o polimorfismo cromossômico e
sobre a dispersão da espécie Zaprionus indianus, dando enfoque às populações do Nordeste Brasileiro. Coletas e análises
citogenéticas estão feitas desde agosto de 2007, quando se iniciaram as atividades práticas do Laboratório de Genética,
no Centro Acadêmico de Vitória/UFPE. As coletas dos adultos machos e fêmeas são feitas com rede entomológica sobre
frutos caídos ou através de armadilhas contendo banana. Já as coletas das formas imaturas (ovos e larvas) são feitas pela
coleta dos frutos fermentados que são trazidos ao laboratório e mantidos em vidros apropriados até a emergência dos
adultos. Todos os nascidos são separados por espécie, contados e sexados. Aqueles identificados como Z. indianus têm
seus cromossomos politênicos extraídos da glândula salivar e processados de acordo com protocolo padrão do laboratório.
Foram obtidas diversas isolinhagens nas coletas realizadas nos municípios de Paulista, Camaragibe, Vitória de Santo
Antão e Gravatá, no interior de Pernambuco. As análises citogenéticas comparativas entre populações do Nordeste e
de outras regiões do Brasil e da Argentina, são discutidas neste trabalho.
Apoio Financeiro: FACEPE e CNPq.
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Variabilidade genética tipo RAPD em
linhagens geográficas de Zaprionus
indianus (Gupta, 1970)
Bélo, M; Braganholi, DF; Bertoni, BV; Beleboni, RO; Zingaretti, SM
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Universidade Estadual Paulista (UNESP) e Universidade de Ribeirão Preto (UNAERP)
[email protected]
Palavras-chave: distância genética, índice de Jaccard, localidades, similaridade
Exemplares de Z. indianus foram capturados em cinco regiões, distribuídas segundo uma linha imaginária norte sul,
pelos estados de Goiás (Morrinhos), Minas Gerais (Carneirinho) e São Paulo (Olímpia, Jaboticabal e Santa Cruz da
Esperança). As linhagens foram mantidas separadas no laboratório, em frascos de ¼ de litro com meio de cultura à
base de farinha de trigo e fubá, permanecendo em câmara com condições controladas de temperatura (25 ± 1ºC),
umidade relativa do ar (70-85%) e fotoperíodos de 12 horas. O DNA genômico foi extraído das larvas de terceiro
instar e utilizado para análise da variabilidade genética das linhagens, pelo método RAPD. Foram usados 15 tipos de
primers, que apresentaram 96 bandas de tamanhos diferentes que variaram de 300 a 4950 pares de bases. Os dados foram
agrupados usando-se o método UPGMA e o índice de Jaccard, utilizados para construção de um dendograma. O valor
mais alto para similaridade genética foi apresentado entre as linhagens provenientes de Jaboticabal e Olímpia, seguindo,
respectivamente, a graduação dos valores, vieram as combinações entre as linhagens provenientes de Carneirinho e
Olímpia e, a outra, entre Santa Cruz da Esperança e Jaboticabal. De acordo com os resultados, o dendograma mostra
a formação de dois grupos maiores; um formado pelas linhagens de Jaboticabal, Olímpia e Carneirinho (este grupo é
dividido em dois sub-grupos, um constituído pelas linhagens de Olímpia e Jaboticabal e outro subgrupo é constituído
unicamente pela linhagem de Carneirinho); o outro grupo é constituído pelas linhagens provenientes de Morrinhos e
Santa Cruz da Esperança. Apesar de a invasão de Z. indianus ser recente na América do Sul, estes resultados indicam
a possibilidade de estar ocorrendo uma diferenciação genética entre as linhagens para a formação de clina, em relação
à latitude, especialmente entre as linhagens de Caneirinho, Olímpia e Jaboticabal. Por outro lado, não foi encontrada
uma explicação adequada para a similaridade apresentada pelas linhagens localizadas nos extremos da distribuição norte
sul, ou seja, entre Morrinhos e Santa Cruz da Esperança, respectivamente.
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Análise da espermatogênese nas espécies
Zaprionus indianus, Z. megalorchis e
Z. sepsoides (Drosophilidae, Diptera)
Madi-Ravazzi L; Penariol, L; Bardella, VB; Azeredo-Oliveira, MTV
Departamento de Biologia, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas (IBILCE), Universidade Estadual Paulista (UNESP)
[email protected]
1
Palavras-chave: Zaprionus, espermatogênese, testículo, meiose, prófase I
Zaprionus indianus é um drosofilídeo nativo da região Afrotropical que recentemente colonizou o continente Sul Americano
espalhando-se rapidamente por várias regiões. Vários estudos têm sido realizados com o objetivo de entender a dinâmica
dessa espécie invasora e o sucesso de sua colonização. Entretanto, existem poucos estudos sobre a biologia reprodutiva
desse gênero na literatura. O objetivo desse trabalho foi avaliar a espermatogênese de três espécies do gênero Zaprionus:
Z. indianus e Z. megalorchis e Z.sepsoides. A espécie Z. indianus apresenta uma ampla distribuição geográfica enquanto
as outras duas são restritas a algumas regiões africanas. Para as análises citogenéticas foram utilizados 10 machos de
cada espécie, com diferentes idades (de um a oito dias). Testículos não fixados foram dissecados em solução fisiológica
(Demerec), recobertos com lamínula, esmagados suavemente e analisados ao microscópio de contraste de fase. Outros
testículos foram corados com orceína lacto-acética, esmagados e analisados ao microscópio Olympus BX40, com o
sistema analisador de imagem Image Pró-Plus Media Cybernetics, Versão 4.5 para Windows. A análise morfológica dos
testículos, realizada em contraste de fase, das três espécies revelou que esses apresentam estrutura em espiral e diferem
quanto ao tamanho e quanto à espessura dos túbulos seminíferos: testículos de espessura mediana e com tamanho médio
(Z. indianus); testículos finos e longos (Z. megalorchis) e testículos com maior diâmetro e pequenos (Z. sepsoides). A
análise dos espermatócitos (prófase I) revelou que essas células possuem um grande núcleo com um evidente nucléolo.
Nessa fase, as três espécies apresentaram características diferentes em relação à distribuição e morfologia dos corpúsculos
heteropicnóticos. Na espécie Z. indianus foi verificada a presença de um corpúsculo heteropicnótico central em formato
de estrela com quatro prolongamentos cromatínicos. Em Z. megalorchis, nessa mesma fase, pode ser observado três
corpúsculos heteropicnóticos ligados por prolongamento cromatínicos. Na espécie Z. sepsoides os núcleos dessas células
apresentaram um corpúsculo heteropicnótico maior associado a um menor em formato de bastonete. A distribuição
do material cromatínico nesse estágio pode estar associada com a organização dos cromossomos bivalentes ao longo da
prófase I, especialmente nas fases tardias (paquíteno até a diacinese). Essas células, nas três espécies, exibiram evidente
marcação de proteínas citoplasmáticas, indicando alta atividade sintética, o que corrobora a presença proeminente do
nucléolo. As análises citogenéticas das espécies do gênero Zaprionus indicaram que todos os estágios da espermatogênese
estão presentes e organizados de forma regular e progressiva ao longo do comprimento do testículo, semelhantemente
ao que ocorre em Drosophila. As diferenças morfológicas e citogenéticas, observadas nas fases da meiose, das três
espécies, refletem uma diferenciação genética acentuada nesse grupo, que poderão auxiliar no entendimento da biologia
reprodutiva do gênero Zaprionus, além de contribuir com o entendimento do sucesso da colonização de Z. indianus
em outros continentes.
Apoio Financeiro: CAPES.
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Análise da expressão circadiana da proteína
PERIOD no relógio biológico de insetos vetores
Campos, CA1; Gentile, C2; Peixoto, AA1; Bauzer, LGSR1
1
Laboratório de Biologia Molecular de Insetos, Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz
School of Biological and Chemical Sciences, Queen Mary University of London
[email protected]
2
Palavras-chave: Insetos vetores, Relógio circadiano, Period, Aedes aegypti, Drosophila melanogaste
A compreensão de aspectos comportamentais de insetos vetores é essencial para o controle de doenças transmitidas
por eles. A partir do modelo Drosophila melanogaster, genes que controlam o comportamento foram caracterizados,
principalmente aqueles envolvidos no funcionamento do relógio circadiano. O modelo atual de controle molecular de
ritmos circadianos é baseado em mecanismos de auto-regulação negativa envolvendo diversos genes sendo os principais
period, timeless, Clock e cycle. Estes genes formam a primeira alça de regulação do relógio onde os fatores de transcrição
CLOCK e CYCLE ativam a expressão de period e timeless. Em seguida, os produtos destes genes, PERIOD e TIMELESS,
formam heterodímeros que migram para o núcleo reprimindo a ação de CLOCK e CYCLE, desativando assim sua
própria expressão. Este mecanismo de auto-regulação negativa é responsável pela regulação cíclica dos genes period
e timeless. Através de experimentos de Western Blot, ritmos de expressão da proteína PERIOD do relógio de Aedes
aegypti, vetor da dengue e febre amarela, foram comparados com dados existentes no modelo Drosophila. A utilização
do anticorpo anti-PERIOD em Aedes aegypti revelou bandas com peso molecular acima de 200 kD, um valor maior
do que o peso de 160 kD previsto a partir da anotação de seqüências de cDNA do gene period desta mesma espécie
sugerindo que, assim como observado em Drosophila, alterações pós-traducionais da proteína PERIOD de Aedes
aegypti, possivelmente fosforilação, aumentam seu tamanho molecular. Quantificação das bandas observadas indica
que, diferentemente do descrito em Drosophila melanogaster, a expressão da proteína PERIOD não sofre uma alteração
substancial na comparação entre as amostras coletadas na fotofase e aquelas coletadas na escotofase.
Apoio financeiro: HHMI, CNPq, Faperj e Fiocruz.
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Análise molecular do gene vrille
em insetos vetores
Rivas, GBS1; Gentile, C2; Peixoto, AA1
Laboratório de Biologia Molecular de Insetos, IOC, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro
2
Queen Mary College, Universidade de Londres, Reino Unido
[email protected]
1
Palavras-chave: vrille, ritmos circadianos, regulação gênica, insetos vetores, relógio biológico
A grande maioria dos seres vivos apresenta oscilações diárias em sua fisiologia e comportamento, que são controladas por
um mecanismo endógeno chamado relógio biológico. Em insetos, suas bases genéticas têm sido elucidadas no modelo
Drosophila melanogaster. Diversos loci foram identificados e o mecanismo molecular regulando este sistema consiste de
alças regulatórias interligadas que causam o aumento e queda da expressão de muitos genes ao longo das 24 horas do
dia. O gene vrille apresenta uma expressão circadiana e codifica um repressor que tem um papel importante no controle
do relógio de Drosophila. Os ritmos de atividade e alimentação de insetos vetores são importantes para a dinâmica
de transmissão de várias doenças. Contudo, apesar da sua importância epidemiológica, pouco se sabe sobre os genes
que controlam o ciclo circadiano desses insetos. Neste trabalho, estudamos a genética molecular do gene vrille em três
espécies de insetos vetores: Lutzomyia longipalpis, o principal vetor de leishmaniose visceral nas Américas, Aedes aegypti,
transmissor do vírus da dengue e febre amarela, e Culex quinquefasciatus, vetor da filariose. Uma análise comparativa
entre essas espécies é interessante, pois suas atividades locomotoras ocorrem em períodos diferentes, sendo Aedes aegypti,
uma espécie diurna, Culex quinquefasciatus, noturna e Lutzomyia longipalpis de hábitos crepusculares e noturnos. A
seqüência do gene vrille de Lutzomyia longipalpis foi obtida a partir do seqüenciamento de fragmentos amplificados
utilizando-se as técnicas de PCR, com oligos degenerados e específicos, e RACE. As seqüências de vrille de Aedes aegypti
e Culex quinquefasciatus, foram obtidas pela caracterização in silico de seqüências disponíveis nos bancos de dados dos
genomas destas espécies. A comparação entre as proteínas codificadas por vrille destes três vetores mostra que apesar
de bastante divergentes em algumas regiões, existe uma grande conservação no domínio bZIP, importante para ligação
ao DNA e para o seu papel como repressor transcricional. Além disso, através da análise da expressão circadiana de
vrille por PCR em tempo real, observamos um padrão rítmico com níveis máximos de mRNA no período da transição
de luz para escuro (“crepúsculo”), em todas as espécies estudadas. Essa ritmicidade e sua fase de expressão se mantêm
mesmo em condições de escuro constante. Sendo assim, observamos um forte indicativo de que apesar das diferenças nos
padrões de atividade locomotora entre Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus, e Lutzomyia longipalpis, alguns componentes
importantes no funcionamento do relógio biológico como vrille, apresentam-se conservados evolutivamente.
Apoio: IOC, CNPq, FAPERJ e HHMI.
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Genética populacional de Culex
quinquefasciatus (Diptera: Culicidae)
Morais, SA; Marrelli, MT
Faculdade de Saúde Pública, Departamento de Epidemiologia, Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: Culex quinquefasciatus, variação geográfica, COI, ND4
O mosquito Culex (Culex) pipiens quinquefasciatus Say, 1823 faz parte de um complexo de espécies com distribuição
mundial, conhecido como complexo Culex pipiens. Os outros membros incluem Cx. p. pipiens, com distribuição restrita
aos países de clima temperado, Cx. australicus, na Austrália e Cx. p. pallens que possui registros em zonas de hibridação.
São relatadas ainda as espécies crípticas Cx. torrentium e Cx. pervigilans que possuem distribuição fechada em países da
Europa e Nova Zelândia, respectivamente. No Brasil ainda não foi relatada a presença de outro membro do complexo
pipiens, com exceção do Cx. quinquefasciatus que tem distribuição expansiva na faixa tropical, incluindo todo o território
brasileiro. Entretanto, existem evidências da presença de híbridos entre Cx. quinquefasciatus e Cx. pipiens no extremo
sul do Brasil, uma vez que este último ocupa regiões localizadas ao sul da Argentina, mais precisamente na extensão
da bacia do Prata. O mosquito Cx. quinquefasciatus tem importância pela sua potencialidade em transmitir doenças,
pelo incômodo que causa às comunidades e pelas características de infestação da população. O estudo genético em
populações naturais de Cx. quinquefasciatus por marcadores moleculares está sendo realizado com o intuito de entender
a distribuição e a dinâmica populacional desta espécie no Brasil, assim como as implicações nas possíveis medidas de
controle genético de populações provenientes de várias regiões brasileiras. Para isso foram efetuadas coletas da espécie
Cx. quinquefasciatus nas cidades de São Paulo SP, Pariquera-Açú SP, Recife PE, Rio Branco AC, Teresina PI, Chapecó
SC, Pelotas RS e Chuí RS. Os mosquitos foram previamente identificados por observação dos caracteres externos,
confecção de lâminas da genitália masculina e consulta às chaves taxonômicas. Para os testes foram utilizados em média
30 mosquitos de cada localidade e analisada a região do gene codificador da subunidade IV da NADH desidrogenase
(ND4) e subunidade I do citocromo c oxidase (COI), ambos do DNA mitocondrial. As análises das freqüências de
nucleotídeos da região do gene ND4 e COI mostram similaridade genética entre populações de diferentes regiões
geográficas, podendo ser resultante do fluxo gênico pelos movimentos migratórios constantes, no caso de dispersão
passiva, somado ao estabelecimento desta população de mosquitos no território brasileiro. As análises da morfologia da
genitália masculina de exemplares capturados no extremo sul do Brasil mostram a presença de possíveis híbridos. Em
vista disso, serão efetivados testes com regiões mais variáveis que possibilitem diferenciar geneticamente esses eventos
na população, como o segundo espaçador intergênico, do DNA ribossômico (ITS2) ou a região nuclear polimórfica,
não codificante, do segundo intron do lócus da acetilcolinesterase (ACE2).
Apoio financeiro: FAPESP.
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Análise da diferenciação genética entre
populações brasileiras de Anopheles
(Kerteszia) Cruzii (Diptera: Culicidae):
evidências de um complexo de espécies
Rona, LDP1; Carvalho-Pinto, CJ2; Gentile, C1; Grisard, EC2; Peixoto, AA1
Instituto Oswaldo Cruz, Laboratório de Biologia Molecular de Insetos, Rio de Janeiro, RJ – Brasil
2
Universidade Federal de Santa Catarina, MIP, Florianópolis, SC – Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: Anopheles cruzii, malária, complexo de espécies, genética de populações, análise multilocus
Anopheles (Kerteszia) cruzii (Diptera: Culicidae) foi o principal vetor da malária endêmica no sul do Brasil, entre os
anos de 1930 e 1960. Atualmente este mosquito é responsável por vários casos de malária, geralmente oligossitomática,
no sul e sudeste do Brasil. Apesar da importância epidemiológica de An. cruzii, são escassos os estudos relacionados á
genética dessa espécie, sendo ainda discutível seu status taxonômico. Estudos de inversões cromossômicas e do padrão
de bandeamento do cromossomo X em populações do sul e sudeste do Brasil revelaram que An. cruzii é uma espécie
polimórfica e sugeriam que o táxon seria, na verdade, um complexo de três espécies crípticas. Outro estudo baseado na
análise de isoenzimas sugeriu a ocorrência de apenas dois grupos geneticamente isolados, um formado pela população
da Bahia e o outro pelas populações do sul e sudeste do Brasil (RJ, SP e SC). No presente estudo, diferentes genes
relacionados ao relógio circadiano (timeless, Clock e cycle) e genes constitutivos que codificam proteínas ribossomais
(rp49, rpS29 e rpS2) foram utilizados como marcadores moleculares na análise da diferenciação genética entre populações
brasileiras de An. cruzii. Os genes que controlam os ritmos biológicos são importantes do ponto de vista evolutivo, pois
estão envolvidos no controle dos ritmos de atividade sexual, potencialmente importantes no isolamento reprodutivo entre
espécies próximas e os genes constitutivos foram escolhidos para verificar se os resultados obtidos não eram específicos
dos genes do relógio biológico. Utilizando a técnica de PCR com iniciadores degenerados, isolamos e seqüenciamos
fragmentos destes genes em An. cruzii e utilizamos estes genes no estudo de diversas populações brasileiras. O fragmento
do gene timeless foi utilizado para analisar a diferenciação genética entre as populações de Florianópolis (SC), Cananéia
e Juquitiba (SP), Itatiaia (RJ), Santa Teresa (ES) e Ilha de Itaparica (BA) e os outros cinco genes foram utilizados para a
análise exclusiva das populações de Santa Catarina e da Bahia. Nossos resultados mostram claramente que os mosquitos
do Estado da Bahia formam um grupo geneticamente distinto das populações do sul/sudeste do Brasil. Considerando a
variabilidade genética detectada neste estudo e a diferença fenotípica já verificada em estudos anteriores de populações de
An. cruzii coletadas nas mesmas localidades, nós propomos que An. cruzii é um complexo de no mínimo duas espécies
crípticas, uma encontrada na Bahia e a outra formada pelas populações do sul/sudeste do Brasil.
Apoio financeiro: HHMI, FIOCRUZ e CNPq.
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Banco de genes expressos de Anopheles
darlingi adulto (Diptera; Culicidae),
Coari, Amazonas
Rafael, MS1; Nunes-Silva, CG2; Junior, GMA4; Guimarães4, GM; Bridi, LC1; Assunção, EN2; Neves, RO3; Astolfi-Filho, S2; Tadei, WP1
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), Laboratório de Vetores de Malária e Dengue,
Coordenação de Pesquisas em Ciências da Saúde, Manaus, AM
2
Universidade Federal do Amazonas, Instituto de Ciências Biológicas, Centro de Apoio Multidisciplinar, Campus Universitário, Manaus, AM
3
Bolsista CAPES, Programa de Pós-Graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva/INPA
4
Bolsistas DTI-CNPq
[email protected]
1
Palavras-chave: Biblioteca de cDNA, genes de resistência a inseticidas, ESTs, malária
Anopheles darlingi é um mosquito de grande importância epidemiológica, pois transmite a malária humana, especialmente
na Amazônia. Medidas rotineiras adotadas nos programas de controle de A. darlingi têm diminuído a ocorrência dessa
enfermidade, mas não eliminam a doença. O aumento do número dessa parasitose ocorre, especialmente, devido à
resistência a inseticidas sintéticos deste mosquito e de outros anofelinos vetores da malária. Montou-se o banco de
Seqüências Expressas Curtas (Expressed Sequences Tags - ESTs) de A. darlingi adultos, para determinar as seqüências de
genes expressos, especialmente daquelas desconhecidas e de outras envolvidas com a resistência a inseticidas químicos e
no desenvolvimento de espécies de plasmódios. Um micrograma de RNA mensageiro de A. darlingi adulto foi isolado,
utilizando-se o kit “Micro-FastTrack 2.0 (Invitrogen Life Technologies) e o oligo-(dT)”, com um sítio para a enzima Not
I, para a síntese da primeira fita de cDNA. Após a síntese da segunda fita, esse cDNA foi ligado ao adaptador Sal I. O
cDNA foi digerido com enzima de restrição Not I, segundo o kit “SuperScriptTM Plasmid System with Gateway Technology
for cDNA Synthesis and Cloning (Invitrogen Life Technologies)”. Fragmentos de 500 e 1000 pb foram selecionados
em gel de agarose. As bandas do gel foram recortadas e eluídas, pelo kit GFX da GE Healthcare. Cerca de 10ng/µl
de cDNA foram ligados ao plasmídeo pCMVSPORT6™. Os plasmídeos recombinantes foram inseridos em bactérias
Escherichia coli TOPO10 INVITROGEN, pelo processo de eletroporação. Os cDNAs amplificados apresentaram entre
200 e 900 pb. A análise da qualidade das seqüências obtidas e a exclusão das seqüências contaminantes foram realizadas
pelos programas Phred, Cross-match e SeqClean, respectivamente. Os Contigs e Singlets obtidos foram analisados por
programas BLAST X e BLAST N junto ao Laboratório Nacional de Computação Científica (LNCC). Até o momento
obteve-se cerca de 7.000 reads. Muitas dessas seqüências expressas apresentaram homologia com Anopheles gambiae,
Anopheles quadrimaculatus, Anopheles stephensis e outros insetos de importância epidemiológica depositados em bancos
de dados públicos. As ESTs descritas pela primeira vez neste trabalho representam importante estratégia para nortear e
embasar estudos específicos, voltados para o controle de A. darlingi, importante vetor da malária humana no Brasil.
Apoio Financeiro: CNPq,processo no. 506431/2004-5, Projeto PIATAM-FINEP/Petrobrás.
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Diferenciação genética em populações de
Aedes aegypti nos estados do Maranhão
e Amazonas com base no marcador
mitocondrial ND4
Sousa, AA1; Sampaio, I2; Fraga, E1; Barros, MC1
Laboratório de Genética e Biologia Molecular – CESC/UEMA
2
Instituto de Estudos Costeiros/UFPA Bragança PA
[email protected]
1
Palavras–chave: Aedes aegypti, diferenciação genética, Maranhão, Amazonas, ND4
O Aedes aegypti é um vetor de grande importância epidemiológica, sendo responsável pela transmissão da febre amarela
e dos quatro sorotipos de dengue, causando impactos em termos de morbidez o que exige esforços e investimentos
cada vez mais intensos dos serviços de saúde pública. Objetivou – se obter a variabilidade haplotípica para diferentes
populações de Ae. aegypti no estado do Maranhão e no estado do Amazonas com base no marcador mitocondrial ND4
a fim de detectar a diferenciação genética entre as populações e subsidiar estratégias de controle. As amostras foram
obtidas em doze municípios do estado do Maranhão e em Manaus/AM através de armadilhas para ovos (APO). No
Laboratório de Genética e Biologia Molecular do CESC/UEMA (GENBIMOL) as larvas foram alimentadas, quando
adultos transferidos para gaiolas entomológicas onde foram proporcionadas as condições de cruzamentos e obtenção
da F1. A partir da F1 foram aplicados os procedimentos moleculares: extração de DNA, amplificação do gene por PCR
e reação de sequenciamento. Foram inseridas algumas seqüências do Genbank ao banco de dados onde foram editadas
e alinhadas através do programa Bioedit. Os sítios polimórficos, as diversidades haplotípica (h) e nucleotídica (π) para
cada população e a análise de variância molecular (AMOVA) foram realizados nos programas DNAsp e Arlequin.
Obteve – se um fragmento de 335 pares de bases em 129 espécimes de Ae. aegypti para o gene ND4. Quando todos os
municípios foram considerados como uma única população foi observado 15 sítios polimórficos, 16 haplótipos sendo
que o haplótipo um foi o mais freqüente ocorrendo em todas as populações do Maranhão, seguido pelos haplótipos
dois, quatro e oito. A diversidade haplotípica (Hd) encontrada foi de 0, 715 e nucleotídica (π) foi de 0, 01843. Quando
cada município foi considerado como única uma população o número de sítios polimórficos variaram de 1 a 12 e
o de haplótipo de 2 a 7, os valores de diversidade haplotípica foram de 0, 167 a 0, 864 e nucleotídica de 0,00050
a 0,01824. Os resultados da AMOVA mostraram que a maior parte da variação encontra-se dentro das populações
(um único grupo 63,60%, dois grupos distintos 60,94%). O índice de diferenciação genética entre as populações
(ΦST) apresentou um valor de 0,36404 para um único grupo e de 0,39058 para dois grupos com P significativo. A
magnitude das diversidades haplotípica e nucleotídica das populações nos estados do Maranhão e Amazonas indicam
diferenças significativas entre as populações analisadas e os resultados da AMOVA para os diferentes níveis de hierarquia
testada apontam para uma estruturação populacional. Esta diferenciação genética nas populações pode ser reflexo das
campanhas sistemáticas de controle com aplicação de inseticidas pelo qual o vetor vem sendo submetido em razão da
sua importância epidemiológica.
Apoio financeiro: CNPq, UFPA e UEMA.
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Padrão de esterases em populações
do mosquito Aedes aegypti (Diptera,
Culicidae), resistentes e suscetíveis a
inseticidas utilizados no controle
Guirado, MM1; Bicudo, HEMC2
Programa de Pós Graduação em Genética
Departamento de Biologia, UNESP, São José do Rio Preto, SP
[email protected], [email protected]
1
2
Palavras-chave: Aedes aegypti, polimorfismo, esterases, resistência a inseticidas
Aedes aegypti é considerado um mosquito cosmopolita, com ocorrência nas regiões tropicais e subtropicais. No Brasil,
está restrito às vilas e cidades, sempre com características domiciliares e peridomicíliares e, raramente, é encontrado
em ambientes onde a densidade populacional é baixa. Este mosquito é o único vetor do arbovírus da dengue e da
febre amarela urbana em todo território nacional, e é considerado um dos vetores mais importantes na veiculação de
patógenos a humanos. Este trabalho tem o objetivo de analisar o polimorfismo de esterases em populações geográficas
de A. aegypti suscetíveis e resistentes a inseticidas. É bem conhecido na literatura o envolvimento de esterases no
processo de resistência em muitos organismos. A classificação quanto á resistência ou suscetibilidade é realizada pelo
Laboratório de Referência da SUCEN localizado no município de Marília – SP. A técnica utilizada é a eletroforese
em géis de poliacrilamida, aplicando-se amostras de larvas L4 maceradas individualmente. Os resultados preliminares
correspondentes à análise de cinco populações e trinta larvas de cada mostraram a presença de sete bandas α-esterásicas,
provisoriamente denominadas EST-1 a EST-7. Essas populações mostraram dois padrões com relação às bandas que
apresentaram maior freqüência: um composto pelas bandas EST-1 e EST-4 e outro pelas bandas EST-3 e EST-4.
As populações portadoras do primeiro padrão são consideradas resistentes (São José do Rio Preto-SP, Santos-SP e
Salvador-BA) enquanto as portadoras do segundo padrão são consideradas suscetíveis (Rockefeller – padrão e MaríliaSP). A confirmação de que esses padrões realmente diferenciam populações resistentes e suscetíveis deverá ser obtida
pela ampliação do número de populações analisadas, na continuação do trabalho.
Apoio Financeiro: FAPESP.
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Efeitos do butóxido de piperonil na toxicidade
do organofosforado temefós e o envolvimento
de esterases na resistência de Aedes aegypti
(Diptera: Culicidae) ao temefós
Pereira, BB; Guilherme, LC; De Campos Júnior, EO; Luiz, DP; Faria, RCB; Moreira Neto, JF; Amaral, IMR; Bonetti, AM; Kerr, WE
Instituto de Genética e Bioquímica, Laboratório de Genética, Universidade Federal de Uberlândia
[email protected]
Palavras-chave: Temefós, Resistência, Sinergismo, Esterases, Aedes aegypti
A dengue, uma das principais doenças transmitidas por vírus, é um problema gravíssimo especialmente em países tropicais
como o Brasil, onde o clima e os hábitos urbanos oferecem condições ótimas para o desenvolvimento e proliferação
de seu principal vetor, o mosquito Aedes aegypti descrito por Linnaeus em 1762 (Forattini, 1999). A resistência aos
inseticidas continua sendo um grande problema para o efetivo controle de Aedes aegypti, que é comumente um dos
mais amplamente distribuídos vetores de doenças no mundo. O inseticida organofosforado temefós (TE) tem sido
usado para controlar populações de A. aegypti resistentes a piretróides. O butóxido de piperonil é utilizado como um
sinergista de inseticidas para controlar insetos resistentes. Este estudo foi conduzido para avaliar os efeitos de PBO na
toxicidade de temefós utilizando alguns bioensaios (Carvalho et al., 2004). Estes bioensaios, realizados nas linhagens
resistentes e suscetíveis de larvas no estágio L4 de A. aegypti ao TE revelaram que na concentração de 1%, o PBO teve
significante (p< 0,05) efeito sinergista na toxicidade de TE. Nós demonstramos que elevadas atividades esterásicas
estiveram associadas com a sobrevivência das larvas L4 de A. aegypti expostas somente ao TE. Resultados de ensaios
bioquímicos sugerem que o PBO teve significante (p< 0,05) efeito inibidor na atividade esterásica total das larvas de
A. aegypti. O alto efeito sinergista observado com concentração de 1% de PBO na toxicidade de temefós às larvas pode
ser explicado pela redução da atividade esterásica devido a inibição por PBO.
Apoio financeiro: Capes, FAPEMIG, CNPq e UFU.
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Presença de duas linhagens genética
do vetor da dengue Aedes aegypti
(Diptera: Culicidae) no Brasil
Scarpassa, VM1; Cardoza, TB1; Cardoso-Júnior, CP2
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), Manaus, AM, Brasil
2
SUCEN, São José do Rio Preto, SP, Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: Aedes aegypti, DNA mitocondrial, Genética de populações, Linhagens mitocôndrias
Aedes (Stegomyia) aegypti (Linnaeus, 1762) é o principal transmissor da dengue e da febre amarela em áreas urbanizadas.
Esse mosquito foi introduzido no Brasil provavelmente pelo intenso tráfico fluvial entre a África e as Américas, ao
longo dos séculos XV a XIX. No Brasil, após intensas campanhas de combate, Ae. aegypti foi considerada erradicada
na década de 50, sendo re-introduzido na década de 70, por falhas na vigilância epidemiológica e pelas mudanças
ambientais antrópicas favorecidas pela urbanização acelerada. Desde 1998 está espécie encontra-se presente em todos
os estados brasileiros e, apesar dos programas de combate ao vetor, freqüentes epidemias de dengue têm sido registradas
em diferentes centros urbanos do Brasil, com um aumento alarmante de casos de febre hemorrágica do dengue. O
objetivo deste estudo foi analisar a estrutura genética e inferir as taxas de dispersão, via fluxo gênico, de 14 amostras
de Ae. aegypti procedentes de quatro regiões do Brasil: Norte, Nordeste, Sudeste e Centro-Oeste. Cento sessenta e três
espécimes foram seqüenciados para o gene COI do DNAmt, que geraram fragmentos de tamanho de 852 pb. Dez
haplótipos foram observados. A diferenciação genética com base em valores de FST foi muito elevada entre as populações.
Considerando as quatro regiões do Brasil analisadas conjuntamente, a correlação entre distancias geográfica e genética
foi positiva e significante (r2 = 0,332; P = 0,038), suportando o modelo de isolamento por distância. No entanto, não
houve correlação dentro de cada região. Estes resultados são consistentes com a dispersão passiva desse vetor, via migrações
humanas e atividades comerciais, dentro das regiões. O dendrograma de haplótipos apresentou claramente dois grupos.
O grupo I mostrou semelhança genética com as populações de Ae. aegypti do leste da África, enquanto o grupo II com
as populações de Ae. aegypti do oeste da África. As distâncias genéticas, estimativas de fluxo gênico (valores de FST e
Nm, respectivamente), AMOVA e análises de dendrograma indicaram uma expressiva e significante estrutura genética
para as populações analisadas. Estes resultados são provavelmente decorrentes de vários fatores: múltiplas introduções
associadas às linhagens distintas, diferenciação geográfica (IBD), padrões de dispersão passiva, atividades de controle
do vetor, seguidas por eventos de extinção e re-colonização, e deriva genética.
Apoio Financeiro: FAPEAM e MCT/INPA.
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Níveis reduzidos de variação genética
compatíveis com o efeito do fundador
observados em populações de Aedes
albopictus (Diptera: Culicidae)
de Manaus, Amazonas, Brasil
Maia, RT; Maciel, LH; Scarpassa, VM; Tadei, WP
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), Manaus, Amazonas, Brasil
[email protected] e [email protected]
Palavras-chave: gene ND5, DNA mitocondrial, estrutura genética, dengue
O Aedes albopictus, conhecido como “tigre asiático”, é uma das espécies da família Culicidae que representa preocupação na
saúde pública. No Brasil, a presença deste mosquito foi registrada pela primeira vez em 1986 no Estado do Rio de Janeiro.
Atualmente, essa espécie foi registrada em pelo menos 19 Estados do território nacional, ocorrendo predominantemente
nas periferias urbanas e localidades semi-rurais. Em condições experimentais, o Ae. albopictus é capaz de transmitir 22
arboviroses, entre elas, o dengue e a febre amarela. No Brasil, estudos de genética de populações com Ae. albopictus
foram realizados nos Estados do Rio de Janeiro, Minas Gerais, Rio Grande do Sul, Maranhão, Espírito Santo, Santa
Catarina, Bahia, Paraná e Pernambuco. Nas demais localidades ainda existe uma grande necessidade de se elucidar a
estrutura genética das populações deste mosquito. Neste trabalho foram estudadas a variabilidade e estrutura genética
de populações de Ae. albopictus, com base no polimorfismo do gene ND5 do DNA mitocondrial. Foram estudadas
populações provenientes de cinco bairros de Manaus (AM): Coroado, Cidade de Deus, Cidade Nova, Compensa e
Mauazinho. Dos 68 indivíduos seqüenciados, observou-se 2 haplótipos. Esses haplótipos estão separados por apenas
uma mutação (C↔T). Os valores de diversidade genética foram baixos para todas as populações, sendo a população de
Mauazinho a que apresentou os maiores índices (h = 0,385 ± 0,0201; π = 0,00089 ± 0,00031). Os testes de neutralidade,
D de Tajima e Fs de Fu, não foram significativos para todas as amostras, indicando que as populações de Ae. albopictus
de Manaus estão em equilíbrio genético. O teste Fs de Fu sugeriu, também, que as populações não se encontram em
expansão. A AMOVA revelou que a maior parte da variação ocorreu dentro das populações (99,08%). Os valores de FST
foram baixos, assim como os valores de Nm foram elevados, para todas as comparações, com exceção da comparação
entre Compensa e Mauazinho sugerindo pouca estrutura genética para Ae. albopictus da cidade de Manaus. A correlação
entre distâncias genética e geográfica (r = 0,598; P = 0,039) foi positiva e significante, sugerindo que a distância genética
depende da distância geográfica. Em conclusão, a baixa estrutura genética detectada neste estudo pode ser conseqüência
da recente introdução dessa espécie em Manaus, via efeito do fundador, seguida de expansão subseqüente através dos
bairros da cidade. A semelhança genética pode ser, portanto, decorrente do tempo insuficiente para haver o acúmulo
de diferenças genéticas entre as populações e, não ao extensivo fluxo gênico ocorrendo no presente entre elas.
Apoio Financeiro: FAPEAM, CNPq, CAPES.
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Evaluation of the genetic markers
cacophony and period in the development
of topologies applied to phylogeography of
Lutzomyia longipalpis
Costa Júnior, CRL1; Figueiredo Júnior, CAS1; Lima, TLD1; Oliveira, APA1; Tenório, KER1;
Coutinho Abreu, IV2; Ramalho Ortigão, M2; Balbino, VQ1
Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco
Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, USA
[email protected]
1
2
Lutzomyia longipalpis is the principal vector of Leishmania infantum chagasi in the Americas. This vector is found throughout
the Neotropical Region, primarily in semi-arid and dried tropical forests. However, its distribution is discontinuous due
to geographical and climatic barriers. In addition, its limited flying ability can restrict gene flow between populations
leading to the appearance of cryptic species. An increasing number of reports, dealing with genetic characterization
of L. longipalpis populations have fostered intense discussion regarding the taxonomic state o this species. Currently,
no definition exists as to the number of cryptic species and their areas of occurrence in Brazil, due in part to the small
number of genetic markers available. Here we evaluated the polymorphisms of two such markers (cacophony e period)
being used in studies of population genetics of L. longipalpis. DNA sequences for both markers were obtained from the
NCBI database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) and applied to a test of phylogeny signal using Tree Puzzle (http://www.
tree-puzzle.de). Total number of sequences analyzed for each marker was 111 for cacophony and 94 for period. The results
indicated that both markers displayed greater than 60% of the quartets in the vertices of likelihood maps obtained. In
addition, Modeltest 3.7 (http://darwin.uvigo.es/software/modeltest.html) was used to assess the model that best represents
nucleotide evolution, and in this case our results indicate that the General Time Reversible (GTR) fit that description. Using
this model, new topologies were created using maximum parsimony, corrected distances for each respective model, and
maximum likelihood. The topologies obtained for the three models used did not reveal any groups representative of the
populations of Lapinha, Jacobina, Natal and Sobral. Additionally, it was not possible to establish a separation between
sympatric, morphologically distinct specimens collected in Sobral. The data suggest an elevated degree of retention of
ancestral polymorphism, possibly indicating that these markers are not recommended for topologies in phylogeographic
studies of L. longipalpis. Thus, we believe that for the clarification of the taxonomic status of L. longipalpis, period and
cacophony are unable to provide strong topologies to identify incipient speciation process.
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Análise microgeográfica de Lutzomyia
longipalpis s.l. (Diptera: Psychodidae:
Phlebotominae) no município de Pancas,
Espírito Santo
Ferreira, GEM1; Araki, AS1; Santos, CB2; Grimaldi Jr, G3; Falqueto, A2; Peixoto, AA1
Laboratório de Biologia Molecular de Insetos – Instituto Oswaldo Cruz
Unidade de Medicina Tropical – Universidade Federal do Espírito Santo
3
Laboratório de Pesquisas em Leishmaniose – Instituto Oswaldo Cruz
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Lutzomyia longipalpis s.l., complexo de espécies, period, análise microgeográfica, barreiras geográficas
Lutzomyia longipalpis s.l. (Lutz & Neiva, 1912) é a principal espécie transmissora da Leishmaniose Visceral Americana
(LVA) e apresenta ampla distribuição geográfica que se estende do México ao Norte da Argentina. Esse vetor é na
verdade um complexo de espécies crípticas que, no Brasil, diferem nos sinais acústicos e feromônios produzidos pelos
machos. Contudo, não se sabe ainda quantas são e nem como se distribuem essas espécies. L. longipalpis s.l. não apresenta
variação morfológica significativa entre as populações brasileiras, exceto pelo número de pintas abdominais que, apenas
em alguns casos de simpatria, pode ser utilizado para separar espécies do complexo. O município de Pancas (ES) é
caracterizado pela presença de afloramentos rochosos cortados por córregos definindo microrregiões que em sua maioria
são endêmicas para LVA. Algumas delas apresentam um alto número de registros da LVA, com prevalência de infecção
críptica de 40% em humanos mas variando de 45% a 85% em cães. Uma das hipóteses para explicar a variação na
prevalência relativa entre cães e humanos seria a existência de diferenças na preferência alimentar de L. longipalpis s.l.
entre as microrregiões, indicando uma diferenciação genética entre elas. A divergência molecular entre as populações
de duas microrregiões desse município, chamadas de Córregos São Luiz e Ubá, foi analisada utilizando seqüências
de period, um gene que controla ritmos circadianos e som de corte em Drosophila. As análises das 57 seqüências (30
no Córrego São Luiz e 27 no Ubá) mostraram medidas de polimorfismo com valores semelhantes. A estimativa de
FST mostrou um valor baixo, mas significativo, indicando haver estruturação entre as duas populações. Além disso, a
divergência genética encontrada entre as microrregiões de Pancas é maior que as observadas entre algumas populações
separadas por mais de 500 km de distância e que parecem pertencer a uma mesma espécie do complexo L. longipalpis.
Entretanto, essa divergência é ainda muito menor que a observada entre diferentes espécies desse complexo sugerindo
que a baixa estruturação em period entre os Córregos São Luiz e Ubá seja conseqüência de um isolamento geográfico
recente ou incompleto. Seria interessante estudar essas populações utilizando técnicas mais sensíveis como, por exemplo,
microssatélites, além de estender as análises a outras microrregiões.
Apoio financeiro: HHMI, FIOCRUZ, CAPES e CNPq.
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Lutzomyia longipalpis s.l. in Brazil and the
impact of the Sao Francisco River in the
speciation of this sand fly vector
Oliveira, APA3; Coutinho-Abreu, IV1; Sonoda, IV2; Tenório, KER3; Figueiredo-Junior, CAS3; Balbino, VQ3; Ramalho-Ortigão, M1
Department of Biological Sciences, University of Notre Dame
2
Centro de Pesquisas René Rachou, Fundação Oswaldo Cruz
3
Laboratório de Genética Molecular Humana, Universidade Federal de Pernambuco
[email protected]
1
Keywords: Lutzomyia longipalpis s.l.; geographic isolation; speciation; Sao Francisco River, Brazil
Lutzomyia longipalpis s.l. (Diptera: Psychodidae) is the principal vector of Leishmania infantum chagasi in the
Americas, and constitutes a complex of species. Various studies have suggested an incipient speciation process based
on behavioral isolation driven by the chemotype of male sexual pheromones. It is well known that natural barriers,
such as mountains and rivers can directly influence population divergence in several organisms, including insects. In
this work we investigated the potential role played by the Sao Francisco River in eastern Brazil in defining the current
distribution of Lu. longipalpis s.l. Our studies were based on analyses of polymorphisms of the cytochrome b gene
(cyt b) sequences from Lu. longipalpis s.l. available in public databases, and from additional field-caught individuals.
Altogether, 9 distinct populations and 89 haplotypes were represented in the analyses. Lu. longipalpis s.l. populations
were grouped according to their distribution in regards to the 10ºS parallel: north of 10ºS (<10ºS); and south of 10ºS
(>10ºS). Our results suggest that although no polymorphisms were fixed, moderate genetic divergences were observed
between the groups analyzed (i.e., FST= 0.184; and Nm= 2.22), and were mostly driven by genetic drift. The population
divergence time estimated between the sand fly groups was about 0.45 million years (MY), coinciding with the time of
the change in the course of the Sao Francisco River, during the Mindel glaciation. Overall, the polymorphisms on the
cyt b haplotypes and the current speciation process detected in Lu. longipalpis s.l. with regards to the distribution of
male sexual pheromones suggest a role of the Sao Francisco River as a significant geographical barrier in this process.
Apoio: FACEPE & CNPq.
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Diferenciação genética entre populações
brasileiras do complexo Lutzomyia
longipalpis (Diptera: Psychodidae)
Araki, AS1; Vigoder, FM1; Bauzer, LGRS1; Ferreira, GEM1; Souza, NA2; Brazil, RP3; Peixoto, AA1
Laboratório de Biologia Molecular de Insetos, Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brasil
Laboratório de Transmissores de Leishmanioses, Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brasil
3
Laboratório de Bioquímica e Fisiologia de Insetos, Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Lutzomyia longipalpis, complexo de espécies, period, som de cópula, leishmanioses
Lutzomyia longipalpis s.l. é o principal vetor da leishmaniose visceral americana e um complexo de espécies no Brasil.
Entretanto, a distribuição e o número de espécies que compõem este complexo ainda permanecem por ser elucidados.
Um fragmento do gene period (per), que controla aspectos dos ritmos circadianos e do som de corte em Drosophila,
foi utilizado na análise do polimorfismo molecular e da divergência entre amostras de L. longipalpis s.l. de diferentes
regiões do Brasil. Os dados gerados neste trabalho foram comparados com os previamente publicados que envolvem o
mesmo marcador molecular. Os resultados sugerem a existência de duas espécies simpátricas, distinguidas pelo número
de pintas abdominais, nas localidades de Estrela (AL) e Jaíba (BA), semelhante ao observado previamente em Sobral
(CE). Machos com duas pintas (2P) abdominais destas localidades e aqueles provenientes de Marajó (PA), Natal (RN) e
Pancas (ES) são geneticamente similares. Interessantemente estas seis populações produzem som do tipo “Burst”. Estas
populações pertencem a uma das espécies do complexo Longipalpis, mostram certo grau de isolamento por distancia
e se encontram distribuídas na faixa costeira brasileira desde a região norte até o sudeste, em Pancas. Por outro lado,
machos das populações de Jaíba uma pinta (1P), Teresina (PI), Lapinha (MG), Sobral 1P, Estrela 1P e Jacobina (BA)
produzem cinco subtipos diferentes de som Pulsado, sendo um subtipo compartilhado entre Sobral 1P e Teresina. Este
segundo grupo de populações é geneticamente mais heterogêneo, representando um número de espécies incipientes.
Apoio Financeiro: HHMI, Capes e FIOCRUZ.
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Divergência genética entre duas espécies
simpátricas do complexo Lutzomyia
longipalpis utilizando o gene paralytic,
um locus associado com resistência a
inseticidas e produção de som de corte
Lins, RMMA1; Souza, NA2; Peixoto, AA1
1
Laboratório de Biologia Molecular de Insetos, IOC, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro
Laboratório de Transmissores de Leishmanioses, IOC, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro
[email protected]
2
Palavras-chave: Lutzomyia longipalpis, Drosophila, para, resistência a inseticidas, flebotomíneos, espécies simpátricas
Flebotomíneos são insetos vetores das leishmanioses e Lutzomyia longipalpis s.l. é o principal vetor da Leishmaniose
Visceral Americana (LVA). L. longipalpis s.l. forma um complexo de espécies, entretanto, até recentemente, a existência
de um complexo de espécies cripticas entre as populações brasileiras era controversa. Um fragmento do gene paralytic
(para), que codifica um canal de sódio dependente de voltagem associado com a resistência a inseticidas da classe dos
piretróides e também à produção de som de corte em Drosophila melanogaster, foi isolado e utilizado como marcador
para estudar a divergência entre duas espécies do complexo L. longipalpis da localidade de Sobral (CE), onde os machos
podem ser diferenciados pela presença de uma ou duas pintas em seus tergitos abdominais, sendo chamados de Sobral
1S (uma pinta) e Sobral 2S (duas pintas). Nessa localidade, estudos anteriores envolvendo cruzamentos, análise de
feromônios e som de cópula indicam a existência de duas espécies do complexo vivendo em simpatria. Os resultados
revelaram o gene para como sendo o primeiro marcador molecular a apresentar diferenças fixas entre essas duas espécies.
Além disso, foram observadas duas mudanças de aminoácidos em baixa freqüência em uma região bastante conservada
do canal, levantando a possibilidade de que estas possam estar associadas a um processo incipiente de resistência a
inseticidas nesse vetor da leishmaniose visceral.
Financiamento: HHMI, CNPq, FIOCRUZ e CAPES.
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Caracterização de quatro espécies do grupo
Simulium perflavum (Diptera: Simuliidae)
da Amazônia brasileira pelo método
de Barcode
Soares, FR1,2; Cunegondes, A1; Hamada, N1; Kaminski, AC1
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Coordenação de Pesquisas em Entomologia, Av. André Araújo, 2936, Aleixo, Manaus, AM
2
Bolsista PIBIC/INPA
[email protected]
1
Simulium grupo perflavum (Insecta: Simuliidae) constituí um conjunto de espécies que compreende quatro, cinco ou
sete espécies, dependendo do autor, devido à alta similaridade morfológica de algumas espécies. Espécies amazônicas
têm sua identificação controversa, sendo que duas delas, S. rorotaense e S. maroniense são consideradas sinônimas. O
método de “DNA barcoding”, sistema de identificação por meio da análise de um pequeno segmento do genoma,
representa um método extremamente promissor para o diagnóstico da diversidade biológica e apresenta diversas
vantagens, como: capacitar a identificação de espécies em qualquer estágio de vida ou fragmento; facilitar a delimitação
de espécies crípticas; auxliar áreas diversas do conhecimento relacionadas. A análise de regiões curtas e padronizadas
de um gene pode descriminar espécies animais reconhecidas. O objetivo desse trabalho foi realizar o seqüenciamento
de um fragmento do gene citocromo oxidase subunidade I (COI), para servir como um “barcode” de algumas espécies
amazônicas do gênero Simulium grupo perflavum da Amazônia brasileira. Foram estudados indivíduos das seguintes
espécies do grupo perflavum: S. perflavum, S. rorotaense, S. maroniense e S. trombetense. Os espécimes foram preservados
em álcool 100%. O DNA total foi isolado pelo kit “DNeasy Blood and Tissue” da Qiagen. As seqüências do gene COI
foram amplificadas por “Polymerase Chain Reaction” (PCR). Os produtos de PCR foram separados por eletroforese
em gel de agarose 1%, corado com brometo de etídeo. As bandas de DNA foram visualizadas em um transiluminador
de luz ultravioleta (UV) e fotografadas. Os fragmentos foram recortados e extraídos do gel, com o “QIAquick PCR
Purification Kit” da Qiagen. O seqüenciamento foi feito em seqüenciador MegaBace 1000. As seqüências obtidas foram
comparadas quanto à distância entre espécies com o modelo Kimura-2-Parâmetros (K2P). Com os dados disponíveis,
realizamos uma análise com base em estimativas no tamanho dos fragmentos encontrados. As análises foram realizadas
utilizando o programa UVP. S. maroniense possui 50% dos fragmentos analisados com cerca de 700 pares de bases (bp).
S. trombetense possui 38% dos fragmentos analisados com cerca de 723bp. S. perflavum possui a maioria dos fragmentos
analisados (36%) com cerca de 800bp. S. rorotaense possui 46% dos fragmentos analisados com cerca de 723bp. Esses
resultados sugerem que S. perflavum é uma espécie bastante diferente geneticamente das demais, por possuir um maior
número de pares de bases nos fragmentos. S. trombetense e S. rorotaense apresentaram em sua maioria fragmentos de
tamanho semelhante. Já S. maroniense apresentou maior porcentagem de fragmentos com 700bp.
Fontes financiadoras: INPA/FAPEAM.
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Análise de genes pertencentes ao ciclo
circadiano em Anastrepha fraterculus
Gonçalves, VR; de Brito, RA
Laboratório de Genética de Populações e Evolução, Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos
[email protected]
Palavras-chave: Anastrepha, Ciclo circadiano
Na família Tephritidae (Trypetinae, Toxotrypanini) encontra-se o gênero Anastrepha que é o maior dentro desta família.
Algumas espécies deste grupo, dentre elas A. fraterculus, possuem grande importância econômica, embora os estudos
nestas espécies sejam ainda escassos. Além disso, estas espécies têm sido utilizadas em estudos evolutivos, particularmente
buscando o entendimento do processo de diferenciação entre espécies deste grupo, muitas das quais proximamente
relacionadas. Dessa forma é de extrema importância o conhecimento de genes que possam estar diretamente ligados
ao processo de especiação destas espécies. Como algumas das espécies deste grupo apresentam diferenças no período
preferencialmente utilizado para cópula, no presente trabalho foram estudados os genes aristaless (al), hand e cycle (cyc),
pertencentes ao ritmo circadiano, que estão ligados a este processo em Drosophila. Este ciclo possui genes envolvidos
em diversos processos biológicos, dentre eles ritmos e horários de processos celulares incluindo aprendizagem, visão,
olfato, locomoção, desintoxicação e áreas de metabolismo, afetando assim, o comportamento de todos os organismos
desde unicelulares até humanos. O objetivo deste trabalho foi identificar regiões internas nos genes al, hand e cyc
na espécie A. fraterculus que permitam a utilização destas regiões para estudos comparativos entre espécies do grupo
fraterculus. Os primers para amplificação destes genes foram desenvolvidos a partir de seqüências de nucleotídeos
de espécies filogeneticamente próximas ao gênero Anastrepha. A amplificação dos genes foi feita a partir de pools de
cDNAs e DNAs da espécie estudada. Estas regiões gênicas foram purificadas através de precipitação com PEG8000 e
clonadas usando o kit de clonagem InsTAclone (Fermentas). Os clones foram sequenciados utilizando o sequenciador
automático MegaBACE 4800 e Kits de sequenciamento Dyenamic ET Terminator (GE). As seqüências internas dos
genes al, hand e cyc na espécie A. fraterculus revelaram regiões razoavelmente conservadas quando comparadas com as
espécies de gêneros próximos filogeneticamente, as mesmas usadas para a construção dos primers, mas com regiões
potecialmente promissoras para comparações intra- e inter- específicas. O resultado destas análises sugerem regiões para
a construção de primers específicos que permitirão a amplificação destes genes em espécies distintas do grupo fraterculus
e em outras espécies do gênero Anastrepha, o que pode nos permitir entender um pouco mais sobre o processo de
especiação neste gênero e do papel que estes genes podem desempenhar nesta diferenciação.
Apoio financeiro: CAPES.
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Expressed gene tags from reproductive
tissues of Anastrepha fraterculus
Kaminski, ACF; Paula, FPP; Henrique-Silva, F; de Brito, RA
Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos
[email protected]
We are celebrating 150 years of Darwin’s evolutionary theory, and the speciation process has continued to be one of
the central questions in evolutionary biology. One question of paramount importance relates to which genes would be
involved in this process. Albeit a great deal of knowledge has accrued in recent years due to more robust quantitative
analytical methods, faster computers and a plethora of methods to identify and screen new genetic markers, we still
know surprisingly little of which evolutionary changes lead to species differentiation. It has been suggested that most
speciation processes occur as a by-product of the independent evolution in allopatric populations. Because it is difficult
to distinguish between traits that directed the speciation process and others that differentiated after the split, the
identification of such genes has been pretty elusive. Many comparative studies have indicated that sex-related molecular
and morphological traits evolve faster than others, in part due to sexual selection. Studies on such genes have shown
that many are subject to positive selection that has driven the large differences observed, but most of these studies have
focused on male-expressed proteins. In this study we created a cDNA library of adult female reproductive tissues seeking
genes that are preferentially expressed in females and may be also subject to selection and the counter-response to male
proteins. We extracted total RNA from the reproductive tissue of a pool of 50 sexually mature females of Anastrepha
fraterculus. After quantification, mRNA was isolated using the PolyATract mRNA Isolation System and cloned using
the CloneMiner cDNA Library Construction kit. This library has been screened by colony PCR and over 500 clones
sequenced to identify expressed genes in the female reproductive trait. Sequences were edited for quality and blasted.
Sequences that find no similarities on GenBank are investigated for open reading frames which are then blasted. This
procedure has enabled a higher rate of gene identification because many genes here identified have shown low levels of
similarity to sequences available on GenBank. We have identified many standard house-keeping genes such as Tubulin,
Actin, ATP synthase 6, mitochondrial Cytochrome Oxidase and at least 10 different ribosomal proteins. It is not
surprising that ribosomal proteins account for almost 40 % of the clones sequenced so far, considering the amount of
protein expression that takes place in the ovary. More importantly, we have also identified many tissue specific genes,
such as chorion, some tripsin-like proteases and some genes involved in immune response as well as about 10% of
sequences that show no similarity to any sequences in GenBank which we hope that, with a more thorough screening,
should help us identify many important genes that affect species differentiation in this important group of flies.
Financiamento: CNPq, CAPES, FAPESP.
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Análise da Variação genética em genes
Nucleares de Moscas-das-Frutas
do grupo fraterculus
Fernandes, F; Sobrinho, ISJr; de Brito, RA
Laboratório de Genética de Populações e Evolução, Departamento de Genética de Populações e Evolução, Universidade Federal de São Carlos
[email protected]
Palavras-chave: Anastrepha, marcadores nucleares, Rhagoletis
A família Tephritidae, possui grande importância econômica por causar grandes prejuízos na produção de frutos, nesta
família encontram-se as moscas-das-frutas do gênero Anastrepha. As espécies deste gênero são de difícil identificação,
provavelmente devido recente divergência do grupo e possível existência de híbridos na natureza. O isolamento de
marcadores genéticos para estas espécies podem ajudar a caracterizá-las melhor e auxiliar o estudo de sua biologia.
Neste trabalho, buscamos a amplificação de um conjunto de 18 marcadores nucleares isolados de moscas-das-frutas
do gênero Rhagoletis, um grupo filogeneticamente próximo ao gênero Anastrepha. Primers para estes marcadores foram
desenvolvidos a partir de seqüências isoladas de uma biblioteca de cDNA de Rhagoletis por Roethele et al. (Ann.Ent.
Soc.Am. 94:936-947. 2001). A amplificação destas regiões foi testada em diferentes condições em pools de DNA com
cinco indivíduos de cada espécie, A. obliqua, A.sororcula e A.fraterculus, de localidades distintas no Brasil. O DNA deste
pool foi extraído utilizando o protocolo de precipitação diferenciada em Tiocianato de Guanidina. Dos 18 marcadores,
oito forneceram bons produtos de amplificação para estes pools sendo que dois destes marcadores, P70 (correspondente
ao gene RpL27A) e o P661, uma região expressa ainda não identificada, geraram sequências que indicam regiões em
Anastrepha homólogas às de Rhagoletis. Os produtos de PCR destas regiões foram purificados através de precipitação
com PEG8000 e clonados usando o kit de clonagem InsTAclone (Fermentas). Os clones derivados de cada amplificação
representam cópias distintas para cada uma das regiões amplificadas permitindo uma investigação cursorial do nível
geral de polimorfismo inter e intraespecífico para estas regiões. Entre cinco e dez clones foram seqüenciados por
espécies. A maioria das alterações encontradas nas seqüências obtidas das regiões clonadas estava ou em um íntron,
ou em uma região que não sabemos determinar se seria ou não codificadora, mas provavelmente também intrônica
(P661). A comparação dos índices de diversidade nucleotídica (π) revelaram que as espécies estudadas apresentam níveis
razoáveis de polimorfismo para a região P70 (p = 0, 0156) e valores bastante altos para a região P661 (0,02257), quando
comparados com outras espécies estudadas. Os testes de neutralidade F e D de Fu & Li e D de Tajima, não foram
significantes (p>0,10). As redes de haplótipos para a região RpL27A não separaram bem A. fraterculus de A. obliqua,
mas diferenciaram A. sororcula das outras 2 espécies. A ausência de polimorfimos específicos de espécie é facilmente
visualizada nas árvores de haplótipos. Os polimorfismos ora detectados podem ser já utilizados para o estabelecimento
de marcadores SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms), o que pode ser de grande utilidade no estabelecimento de
mapas genéticos para estas espécies e em estudos de segregação destes marcadores e sua associação com uma variação
quantitativa para a identificação de QTLs (loci de caracteres quantitativos).
Apoio Financeiro: CNPq.
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Estruturas cromossômicas terminais em
dípteros da família Sciaridae: Inesperada
diversificação revelada com sondas obtidas
por microdissecção
Fernandes, T; Madalena, CRG; Gorab, E
Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: Sciaridae, microdissecção, heterocromatina terminal, Trichosia pubescens
A maioria dos eucariontes possui telômeros compostos por seqüências curtas (4 a 8 pb) e replicados pela ação da telomerase.
Contudo, em dípteros esse padrão geral é substituído por famílias ou de retroelementos (Drosophila) ou de DNAs
satélites (Chironomus e Anopheles). Embora os dípteros sejam um excelente objeto de estudo de diversificação telomérica,
estudos têm se concentrado basicamente em dois gêneros: Drosophila e Chironomus, muito distantes filogeneticamente.
A indicação de que seqüências curtas possam compor a região cromossômica terminal de Rhynchosciara escapa ao que
tem sido observado em outros dípteros, chamando a atenção para a necessidade de um estudo comparativo dentro
de Sciaridae. Apesar de ser um sciarídeo empregado há tempo em pesquisa, estudos voltados para a organização da
heterocromatina terminal de Trichosia pubescens nunca foram realizados. Quanto à estrutura cromossômica terminal,
T. pubescens, diferentemente de espécies de Rhynchosciara, não possui cromossomos telocêntricos e não apresenta
enriquecimento de DNA homopolimérico A/T ou proteínas relacionadas à transcriptase reversa, sugerindo a existência de
estruturas terminais divergentes entre essas espécies. Com o objetivo de compreender a organização da heterocromatina
terminal de T. pubescens, microdissecções cromossômicas foram realizadas e o pull de DNA microdissecado marcado com
biotina e posteriormente usado como sonda para hibridação in situ (HIS). Estudos de microdissecção cromossômica
em Rhynchosciara americana e R. hollaenderi anteriormente realizados em nosso laboratório mostraram que DNAs
microdissecados de uma única extremidade geravam um padrão de hibridação em que todas as extremidades, exceto
as telocêntricas, eram marcadas. No presente trabalho, o produto de dissecção oriundo de uma única extremidade do
cromossomo X foi avaliado por HIS. Para nossa surpresa, o padrão abrangente observado em espécies de Rhynchosciara
não foi repetido em T. pubescens. Um padrão de marcação preferencial na extremidade utilizada para a microdissecção foi
observada por HIS, embora algumas extremidades aparecessem fracamente marcadas. Esses dados preliminares apontam
para uma possível singularidade quanto à organização das regiões terminais em T. pubescens quando comparadas às
observadas em outro gênero da mesma família. Estes resultados inesperados sugerem uma organização cromossômica
terminal mais complexa do que prevíamos anteriormente, sugerida pela distribuição da heterocromatina desta espécie
se comparada a de Rhynchosciara. As informações obtidas até o momento serão futuramente importantes para os
experimentos de caracterização do DNA telomérico de T. pubescens e reforçam a premissa de que estudos comparativos
podem fornecer dados importantes na elucidação das estruturas teloméricas excepcionais observadas nos dípteros.
Apoio Financeiro: FAPESP.
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Análise do genoma mitocondrial
de duas espécies de flebotomíneos
epidemiologicamente importantes
(Diptera: Psychodidae)
Tenório, KER; Oliveira, APA; Figueiredo Júnior, CAS; Batista, MVA; Lima,TLD; Balbino, VQ
Laboratório de Genética Molecular Humana, Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco
[email protected]
Palavras-chave: Flebotomíneos, primers degenerados, Diptera, DNA mitocondrial, genômica comparativa
Os flebotomíneos são pequenos insetos, hematófagos, responsáveis pela transmissão de algumas doenças aos humanos
e animais e apresentam distribuição pantropical, com algumas espécies sendo também encontradas nas regiões
temperadas. Das enfermidades transmitidas pelos flebotomíneos, as de maior importância, pela distribuição geográfica
e pelo número de casos, são as leishmanioses. Lutzomyia longipalpis, encontrada no Novo Mundo, é o principal vetor
da leishmaniose visceral, a forma mais grave da doença. Phlebotomus papatasi, espécie encontrada no Velho Mundo,
é vetor da leishmaniose cutânea. Apesar da importância epidemiológica destes insetos, as informações acerca dos
seus genomas mitocondriais ainda são escassas. O DNA mitocondrial (mtDNA) tem sido alvo de vários estudos
evolutivos e filogenéticos, sendo ainda utilizado na identificação de populações, subespécies e espécies. O mtDNA dos
metazoários é pequeno e circular (15 a 20 Kb de extensão) e possui conteúdo gênico conservado (moda de 37 genes,
sendo duas subunidades ribossômicas, 22 tRNA e 13 genes codificadores de proteínas), com uma estrutura gênica
simples (ausência de DNA repetitivo, transposons, íntrons ou pseudogenes). Neste estudo, definimos a base para a
obtenção dos genomas mitocondriais de Lu. longipalpis e Ph. papatasi a partir do uso de primers degenerados. Utilizamos
como referência as seqüências de 25 espécies de Diptera depositadas no National Center for Biotechnology Information
(http://www.ncbi.nlm.mih.gov), além de 293 ESTs de Lu. longipalpis e Ph. papatasi depositadas em bancos de dados
públicos. A partir destas seqüências, foi criado um banco de dados local contendo informações sobre a estrutura e
função dos genes mitocondriais. A utilização diferencial de códons sinônimos foi avaliada pelo programa Codon Usage
(http://www.bioinformatics.org/sms2/codon_usage.html). Estes dados foram analisados com programas de alinhamento
múltiplo, visando identificar as similaridades que favorecessem a identificação de regiões conservadas. A partir
das seqüências das ESTs, foi possível definir as seqüências de nove dos trezes genes mitocondriais codificadores de
proteínas do genoma mitocondrial. A identidade dos produtos obtidos foi estabelecida pelo programa BLAST X
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast), utilizado na busca de homologias dos contigs gerados contra o banco de dados
do NCBI. A partir destas informações, estabelecemos um total de 23 conjuntos de primers degenerados que nos
propiciarão a obtenção das seqüências dos genomas mitocondriais de Lu. longipalpis e Ph. papatasi. A relevância da
expansão das informacões concernentes aos genomas mitocondriais destas espécies é discutida em relação a possibilidade
do desenvolvimento métodos mais robustos para estudos de genética de populações e de filogeografia destas espécies.
Orgão financiador: FACEPE.
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Filogenia Molecular dos Meliponini
(Hymenoptera: Apidae) Neotropicais
Guedes, CES1; Melo, GA2; Costa, MA3
Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz, Fundação Oswaldo Cruz
Departamento de Zoologia, Universidade Federal do Paraná
3
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Santa Cruz
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Meliponini, Filogenia Molecular
A tribo Meliponini (Hymenoptera: Apidae) reúne as abelhas indígenas sem ferrão. Estas abelhas são eussociais e
apresentam-se distribuídas em todas as regiões tropicais do planeta. Cerca de 500 espécies são conhecidas para este
grupo, que apresenta 57 gêneros, com maior diversidade na região Neotropical, onde são importantes polinizadores de
espécies nativas e cultivadas. A classificação do grupo é incerta, em parte pela dificuldade no levantamento de caracteres
morfológicos bem definidos. As hipóteses filogenéticas morfológicas propostas para Meliponini mostraram-se discordantes
e foram baseadas em poucos caracteres. Propostas filogenéticas anteriores baseadas em dados moleculares foram limitadas
na resolução das relações entre os gêneros neotropicais. O objetivo do presente trabalho foi desenvolver uma análise
filogenética ampliada da tribo Meliponini com a avaliação de novas regiões gênicas informativas e aumento do número
de táxons. Para isso foram selecionadas duas regiões do genoma mitocondrial, o DNAr 16S e o Citocromo b e amostras
de 40 espécies pertencentes a 25 gêneros de Meliponini. As seqüências foram obtidas através de seqüenciamento direto
de produtos de PCR. Uma matriz resultante do alinhamento combinado das seqüências das duas regiões genômicas
apresentou 478 sítios variáveis, dos quais 96 foram autapomórficos. Duas espécies de Bombus, uma de Apis, uma
de Euglossa e uma de Eufriesea foram utilizadas como grupo externo. As análises filogenéticas foram desenvolvidas
pelos métodos de máxima parcimônia e análise Bayesiana. A análise de máxima parcimônia realizada no programa
Winclada 1.00.08 resultou em uma única árvore mais parcimoniosa com comprimento de 1896 passos, com índice de
consistência 0,34 e índice de retenção de 0,43. Nesta análise os gêneros de Meliponini formam um grupo monofilético,
apresentando três clados principais: o clado I apresenta Austroplebeia como o grupo irmão dos demais Meliponini, no
clado II Heterotrigona itama e Tetragonula carbonaria surgem como grupo irmão dos Meliponini neotropicais, agrupados
no clado III. A análise Bayesiana apresentou resultado similar ao encontrado na análise de parcimônia. Os resultados
obtidos no presente trabalho mantêm os Meliponini neotropicais como um grupo monofilético, corroborando os
resultados de análises anteriores baseados em dados moleculares e contrariando as propostas morfológicas que mostram,
entre outras diferenças, disjunções intercontinentais envolvendo gêneros neotropicais. A principal destas disjunções
tem sido proposta dentro do gênero Trigona sensu Michener, que não foi verificada em nenhuma das análises realizadas
no presente trabalho. Schwarziana e Mourella surgem como um clado monofilético, bem como Leurotrigona muelleri,
Trigonisca sp. e Celetrigona longicornis. Outro agrupamento com forte suporte morfológico recuperado no presente
trabalho é formado pelos gêneros Meliwillea e Scaptotrigona. Estes resultados mostraram que a análise combinada
das duas regiões gênicas selecionadas foi eficiente na resolução das relações entre gêneros e espécies de Meliponini
proximamente relacionados.
Apoio Financeiro: CNPq.
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Isolamento de locos microssatélites em
cinco espécies de abelhas sem ferrão
Gonçalves, PHP1; Domingues, AMT1; Francisco, FO1; Brito, RM1; Pioker, FC2; Mateus, S3; Arias, MC1
Departamento de Genética e Biologia Evolutiva,Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo
2
Departamento de Ecologia, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo
3
Departamento de Biologia, Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
[email protected]
1
Palavras-chave: Meliponini, biblioteca genômica, microssatélites
As abelhas sem ferrão (Apidae, Meliponini) têm papel ecológico fundamental, sendo responsáveis pela polinização
de espécies vegetais nativas ou cultivadas e até mesmo pela dispersão de sementes. Ainda, os meliponíneos também
apresentam importância econômica, pois muitas espécies podem ser manejadas para fins de produção de mel e subprodutos.
Essas abelhas encontram-se amplamente distribuídas pelas regiões tropicais e subtropicais do planeta, sendo a maior
diversidade encontrada na região Neotropical. As abelhas sem ferrão nidificam frequentemente em ocos de árvores e
por isso a degradação dos biomas brasileiros ameaça de extinção muitas espécies. O desmatamento da Mata Atlântica
para a criação de áreas cultiváveis chegou a reduzir o número de espécies em 95% no Estado de São Paulo, o que torna
fundamental o conhecimento e estudo das espécies restantes. A caracterização da variabilidade genética de populações
é essencial para o conhecimento da biodiversidade de um determinado ecossistema, e os microssatélites são uma das
ferramentas moleculares mais utilizadas para esse tipo de estudo. Com o intuito de se conhecer mais sobre o status
genético das populações de abelhas sem ferrão, o objetivo deste trabalho foi isolar locos microssatélites das seguintes
espécies: Frieseomelitta varia, Plebeia remota, Scaura latitarsis, Tetragonisca angustula, e Trigona spinipes. Através do
enriquecimento da biblioteca genômica destes organismos, conseguimos isolar marcadores com repetições de di (TC,
GA, CA), tri (GAA, TTC) tetranucleotídeos (TAGG, ATAG, TCAC) para cada uma das espécies. Estes resultados serão
extremamente úteis no estudo genético dos meliponíneos, visto que até a realização deste trabalho, apenas três espécies
(Melipona bicolor, Scaptotrigona postica e Trigona carbonaria) tiveram locos de microssatélites isolados e caracterizados
por grupos de pesquisa no exterior.
Apoio financeiro: FAPESP, CNPq e CAPES.
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Filogeografia de Melipona quadrifasciata
(Hymenoptera, Meliponini): vicariância
pleistocênica e diversificação recente na
região neotropical
Batalha-Filho, H1; Waldschmidt, AM2; Campos, LAO 1; Fernandes-Salomão, TM1
Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Meliponini, filogeografia, mtDNA, vicariância, Pleistoceno
Estudos filogeográficos têm proporcionado inúmeras possibilidades para o entendimento dos padrões evolutivos e da
história demográfica da diversificação das linhagens de espécies. A abelha Melipona quadrifasciata, conhecida popularmente
como mandaçaia, apresenta duas subespécies distintas: M. quadrifasciata anthidioides e M. quadrifasciata quadrifasciata.
A principal diferença entre as subespécies são as bandas tergais amarelas, que são contínuas em M. q. quadrifasciata e
descontínuas em M. q. anthidioides. A existência de colônias com padrão de faixas abdominais contínuas, semelhantes a
M. q. quadrifasciata, em regiões fora da área de ocorrência da subespécie do sul do Brasil tem sido relatadas no Sergipe
e na região de Januária, no norte do Estado de Minas Gerais, em regiões com clima semi-árido. O objetivo deste estudo
foi elucidar o padrão filogeográfico das populações de M. quadrifasciata ao longo de sua área de distribuição. Para
análise filogeográfica foram utilizados 852 pb referentes a parte do gene COI do mtDNA de 145 indivíduos de M.
quadrifasciata provenientes de 56 localidades dos estados RS, SC, PR, SP, RJ, MG, ES, BA e SE. As seqüências foram
alinhadas pelo método ClustalW. Foram construídas uma árvore filogenética por meio da inferência Bayesiana e uma rede
de haplótipos por meio de median-joining network. Também foram implementados SAMOVA e mismatch distribution.
A estimativa da coalescência foi realizada pelo programa MDIV. Dos 852 pb obtidos 55 (6,45%) foram variáveis.
Foram identificados 50 haplótipos, com uma diversidade nucleotídica (π) de 0,0055 e uma diversidade haplotípica
(Hd) de 0,957. Foi evidenciado, na inferência filogenética e na rede de haplótipos, a presença de dois clados: o clado
sul compreendendo à subespécie M. q. quadrifasciata, e o clado norte formado pela subespécie M. q. anthidioides e as
populações de faixa tergal contínua do norte de Minas Gerais e do Sergipe e nordeste da Bahia. A SAMOVA mostrou um
percentual de variação entre os clados de 65,56%, um ΦST de 0.905 e a barreira de fluxo gênico estimada foi localizada
próxima ao Vale do Ribeira do Iguape no sul do estado de São Paulo, concordando também com a separação dos clados.
A mismatch distribution evidenciou gargalos populacionais em ambos clados por meio de distribuição unimodal. O
tempo de divergência estimado pela análise de coalescência foi entre 490.000 e 390.000 anos A.P., no Pleistoceno
médio, provavelmente durante intensos ciclos de glaciações. Padrões filogeográficos com vicariância semelhante foram
reportados para pássaros (Xiphorhynchus fuscus) e serpentes (Bothrops jararaca). Outras espécies de abelhas, M. bicolor
e M. marginata, exibem diferenciação morfológica que recebe o status de subespécies, apresentando zona de separação
entre as subespécies concordante com M. quadrifasciata. Mais estudos se fazem necessários para confirmar se o efeito
vicariante aqui observado se repete em outras espécies de abelhas ou outros grupos animais.
Apoio: CNPq, PROBIO e FAPEMIG.
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Análise molecular de Melipona
quadrifasciata utilizando marcadores PCRRFLP (Hymenoptera: Apidae, Meliponina)
Dutra-Valente, D; Fernandes-Salomão, TM; Waldschmidt, AM; Tavares, MG; Campos, LAO
Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Departamento de Biologia Geral, Setor Biologia Celular e Biofísica, Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
Palavras-chave: Citocromo oxidase I, DNA mitocondrial, Hymenoptera, M. quadrifasciata, PCR-RFLP
Melipona quadrifasciata é uma espécie de abelha sem ferrão endêmica e amplamente distribuída em uma área que
abrange desde o sul ao nordeste do país. Duas formas de M. quadrifasciata são encontradas no estado de Minas Gerais:
Melipona quadrifasciata anthidioides, com faixas tergais descontínuas e Melipona quadrifasciata de faixas tergais contínuas.
O objetivo do presente trabalho foi caracterizar o gene citocromo oxidase I (COI) no DNA mitocondrial de Melipona
quadrifasciata utilizando marcadores RFLP. Foram analisadas 40 colônias coletadas em quatro localidades no estado de
Minas Gerais sendo 10 colônias por localidade. Melipona quadrifasciata anthidioides foram coletadas em Rio Vermelho
e Caeté e Melipona quadrifasciata de faixas contínuas foram coletadas em Januária e Urucuia. A extração do DNA
total foi conforme o protocolo de Fernandes-Salomão et al., (2005) e um indivíduo por colônia foi analisado. Foi feita
uma amplificação parcial por PCR do gene COI utilizando primers específicos. Os produtos da amplificação foram
digeridos com cinco endonucleases de restrição (DraI, XbaI, SspI, ScaI e HinfI) conforme recomendação dos fabricantes
e o produto da digestão foi separado por eletroforese em gel de agarose 2% (p/v). Os resultados mostraram ausência
de sítios XbaI e ScaI nas seqüências analisadas. Sítios SspI, DraI e HinfI foram observados na seqüência COI analisada,
no entanto, foram monomórficas em todos os indivíduos. Os resultados mostraram que, as diferenças morfológicas
entre Melipona quadrifasciata anthidioides e Melipona quadrifasciata de faixas contínuas, não refletem diferenças na
seqüência da região do DNA mitocondrial avaliada. Estudos posteriores utilizando outros genes mitocondriais e/
ou outros marcadores moleculares devem ser utilizados para averiguar se existe correlação entre variações genéticas e
diferenças morfológicas nessas abelhas.
Apoio financeiro: FAPEMIG, CNPq.
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Uso de primers microssatélite
heteroespecíficos e diversidade genética
entre espécies de abelhas sem ferrão
(Hymenoptera: Apidae)
Silva, FO1; Borges, AA1; Tavares, MG1, Fernandes-Salomão, TM1; Campos, LAO1
Departamento de Biologia Geral, Setor de Biofísica e Biologia Celular, Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
1
Palavras-chave: Abelhas sem ferrão, microssatélites, diversidade genética, Hymenoptera, Melipona
Melipona rufiventris e M. mondury, duas espécies de abelha sem ferrão, foram estudadas com o objetivo de acessar a
diversidade genética, determinando o número de alelos e a heterozigosidade média observada, com base na análise
de nove locos microssatélites desenvolvidos especificamente para M. bicolor. Foram analisadas 54 operárias de 11
colônias de M. mondury coletadas nos estados de Minas Gerais e Bahia e 177 operárias de 36 colônias de M. rufiventris
provenientes de três estados brasileiros (Goiás, Maranhão, Minas Gerais), além do Distrito Federal. O DNA genômico
das operárias foi extraído conforme Waldschmidt et al. (1997) e amplificado segundo Peters et al. (1998). Os dados
foram analisados utilizando o programa Popgene (Yeh et al. 1999). Os resultados obtidos foram comparados com
aqueles disponíveis na literatura para oito espécies de meliponíneos: M. bicolor, M. quadrifasciata, Tetragona clavipes,
Scaptotrigona postica (Peters et al., 1998); Partamona helleri, P. mulata, Plebeia remota (Francisco et al., 2006) e M. scutellaris
(Carvalho-Zilze & Kerr, 2006), as quais também foram analisadas com “primers” microssatélites desenvolvidos para
M. bicolor. Todos os nove pares de “primers” utilizados geraram fragmentos de tamanho esperado. O número médio de
alelos (A) e a heterozigosidade média observada (Ho) em M. rufiventris (A: 2,78 alelos/loco; Ho: 0,11) e em M. mondury
(A: 3 alelos/loco; Ho: 0,24) foram menores do que os valores verificados em M. bicolor (A: 4,1 alelos/loco; Ho: 0,61),
mas semelhantes aos encontrados nas outras espécies. A comparação mostrou que o elevado valor de heterozigosidade
(Ho) detectado em M. bicolor, para a qual os “primers” foram desenvolvidos, não foi, em geral, observado nas demais
espécies. Entre os fatores que poderiam explicar as diferenças encontradas, pode-se citar a redução populacional que
algumas espécies têm sofrido, devido à degradação ambiental; o tamanho amostral; a presença de mais de uma rainha
fisogástrica em colônias de M. bicolor; a presença de alelos nulos ou características intrínsecas da própria evolução
dos microssatélites, como o fato da taxa de mutação diferir entre locos e alelos, e consequentemente, entre espécies.
É importante ressaltar que, embora “primers” heteroespecíficos possam ser utilizados, com sucesso, em estudos com
espécies filogeneticamente próximas, os resultados devem ser analisados com cuidado, já que o número de alelos e os
valores de heterozigosidade observadas em cada caso podem variar devido à influência de diferentes fatores.
Apoio financeiro: FAPEMIG, CNPq, UFV.
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Caracterização de locos microssatélite para
Melipona mondury (Hymenoptera: Apidae)
Lopes, DM; Oliveira, FS; Salomão, TMF; Campos, LAO; Tavares, MG
Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
Palavras-chave: Melipona, Hymenoptera, Microssatélite, ISSR
Microssatélites são marcadores moleculares muito úteis em estudos populacionais devido ao seu alto grau de polimorfismo,
codominância e multialelismo. A etapa limitante no uso desses marcadores é o desenvolvimento dos primers utilizados
para amplificar a região microssatélite. Devido a essa dificuldade, existem poucos primers microssatélites desenvolvidos
para abelhas sem ferrão, e considerando-se a diversidade de espécies desse grupo de abelhas e a importância das mesmas
como agentes polinizadores em ambientes naturais e cultivados, torna-se urgente o desenho de outros primers espécieespecíficos para meliponíneos. Assim, este trabalho teve como objetivo desenhar primers microssatélites para Melipona
mondury, uma espécie de abelha sem ferrão que se distribui ao longo da mata Atlântica. Para o desenvolvimento dos
primers, o DNA extraído de um indivíduo de M. mondury foi amplificado utilizando-se 14 primers ISSR (Inter-simple
sequence repeats), de acordo com a metodologia proposta por Nest et al. (2000). Os fragmentos ISSR foram purificados,
clonados e seqüenciados, permitindo o desenho de 11 pares de primers específicos para M. mondury. Estes primers foram
testados amplificando-se o DNA de 20 indivíduos de M. mondury e 20 indivíduos de M. quadrifasciata, M. bicolor, M.
rufiventris e Partamona helleri. Dentre os 11 locos testados nove (81,8%) foram polimórficos em M. mondury, com um
número de alelos variando de 2 a 6. Os valores de diversidade genética variaram de 0,0 a 0,78 (média: 0,38). Apenas o
loco Mmo15 não apresentou desvio do equilíbrio de HW ao nível de 5% e nenhum loco apresentou desequilíbrio de
ligação. Vários primers também foram polimórficos em M. quadrifasciata, M. bicolor, M. rufiventris e Partamona helleri,
demonstrando que os mesmos poderão ser utilizados em estudos genéticos com outras espécies de meliponíneos.
Apoio Financeiro: FAPEMIG, CNPq, CAPES, UFV.
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Comparação entre algumas populações de
abelhas do complexo Rufiventris com base
em seqüências do DNA mitocondrial
Pires, CV; Fernandes-Salomão, TM; Tavares, MG; Campos, LAO
Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa, MG
[email protected]
Palavras-chaves: Rufiventris; DNA mitocondrial
As abelhas são objetos de estudo de grande interesse na área científica pela sua importância ecológica e econômica,
isto por serem polinizadoras e produtoras de mel. Os meliponíneos são excelentes polinizadores, no entanto, as
populações destes polinizadores vêm diminuindo (Didham et al., 1996), principalmente em conseqüência da ação
indiscriminada de meleiros, do uso de inseticidas, de queimadas (Kerr et al., 1994, 2001; Martins, 2002) e de práticas
como desmatamentos. O gênero Melipona, é difícil separação de espécies por análise dos caracteres morfológicos
(Michener, 2000). Por isso, estudos morfológicos e moleculares com M. rufiventris foram e continuam sendo realizados
visando obtenção de dados que possam ampliar os conhecimentos relativos à taxonomia e à variabilidade genética desta
espécie. Estudos empregando diferentes técnicas moleculares, demonstraram que a maioria dos indivíduos oriundos da
região de Dom Bosco e Brasilândia de Minas não incluem em nenhum dos padrões moleculares já descritos para M.
rufiventris e M. mondury sugerindo que possam pertencer a uma outra espécie. Considerando a grande importância
deste tipo de estudo em Melipona e espécies relacionadas, o prese