Avaliação do efeito da Sinvastatina sobre a

INSTITUTO DE ENSINO E PESQUISA DA SANTA CASA DE BELO HORIZONTE
Núcleo de Pós Graduação e Pesquisa
Avaliação do efeito da sinvastatina sobre a homocisteína
plasmática em mulheres obesas: modulação por variáveis
clínicas e genética.
Maria Patrícia Costa Villela
Belo Horizonte
Fevereiro/2013
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MARIA PATRICIA COSTA VILLELA
Avaliação do efeito da sinvastatina sobre a homocisteína
plasmática em mulheres obesas: modulação por variáveis
clínicas e genética.
Dissertação apresentada ao Núcleo de Pesquisa e Pós-Graduação do
Instituto de Ensino e Pesquisa da Santa Casa de Belo Horizonte, como
requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências da
Saúde.
Orientadora: Profª Drª Valéria Cristina Sandrim.
Belo Horizonte
Hospital Santa Casa de Misericórdia
2013
2
FOLHA DE APROVAÇÃO
3
AGRADECIMENTOS
Agradeço a todos que, de alguma forma, participaram comigo na trajetoria desta pesquisa.
Antes de tudo, ao meu amado esposo Ricardo e à minha filha querida, Louise, pela compreensão,
paciência e estímulo constante a continuar adiante, apesar dos momentos de ausência, que não foram
poucos.
Aos colegas do labortório do IEP e do Mestrado, pelo carinho, ajuda e prestatividade sempre que
precisei de auxílio: Raquel, a quem chamo “Raquelzinha”, Catharina, querida Dedé, amiga que
partilhou comigo as frustrações naturais durante a pesquisa, ao Marcos, Lud e Hugo, pela ajuda na
estatística, Dna Nívea, sempre com um sorriso aberto e apta a ajudar.
À Vanessa, pela predisposição em compartilhar comigo as amostras para o projeto.
Em especial, à Carol, pelo acolhimento, paciência, predisposição em auxiliar sem segundas intenções,
pela imensa boa vontade em não somente me ajudar no alcance desta conquista profissional, mas pelo
interesse em estudar comigo todo o tema de pesquisa. Pelas “aulas” de estatística e sugestões na
escrita, obrigada. Carol, voce foi essencial, esteja certa!
Ao pessoal da Secretaria, Shirley e Zélia, pessoas educadas e gentis, sempre prontas a prestar
informações quando precisava.
À Karla Fernandes, que esteve presente a muitas das reuniões que eu tive com minha orientadora e
que, por isso, um dia me disse que “minha vida era acupuntura”, embora esta pesquisa não seja
referente à medicina chinesa. Karla, mesmo sem me conhecer direito, voce captou um pouco de minha
essência profissional.
Às professoras Josiannne e Iêda da Escola de Farmácia da UFMG por terem me recebido de braços
abertos para a realização das dosagens de Homocisteina. Pelos ensinamentos, paciência ao me
ensinar a técnica por HPLC, completamente nova para mim, pelo carinho e grande atenção que me
dedicaram no tempo que estive com elas.
À minha orientadora, Ms e Dra. Valéria Sandrim, obrigada por ter me acolhido quando ingressei no IEP
e por ter me direcionado no caminho rumo à evolução de mais uma conquista em minha trajetória
acadêmica.
Vocês todos foram muito importantes na concretização deste trabalho e marcaram presença, alguns de
forma mais intensa, outros menos, em minha vida profissional!
Sobretudo, a Deus e a “meus amigos” da espiritualidade, pois sem Eles, este trabalho não teria nem
começado!
4
“Aprenda a observar ao invés de ver. Se você observa, você questiona, se você questiona, você
busca respostas e para encontrar respostas, você tem que pesquisar”
Profa. Ms. Patrícia Sarsur Nasser Santiago
5
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Representação esquemática do Metabolismo da He, principais enzimas e vitaminas
envolvidas no ciclo.
Figura 2 – Padrões de distribuição de gordura corporal.
Figura 3 – Metabolismo simplificado da Homocisteína (He).
Figura 4 – Metabolismo de Remetilação da He.
Figura 5 – Metabolismo de transulfuração da He.
Figura 6 – Metabolismo da He.
Figura 7 – Formas em que a He circula no plasma.
Figura 8 – Níveis plasmáticos de He (M) basal e pós-tratamento dos grupos tratados com
Sinvastatina 20mg/dia e placebo.
Figura 9 – Níveis plasmáticos de He (μmol/L) basal e pós-tratamento dos genótipos CC e CT +TT
tratados com Sinvastatina 20mg/dia.
6
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Classificação de peso pelo IMC e risco de comorbidades
Tabela 2 - Circunferência abdominal e risco de complicações metabólicas associadas com obesidade
Tabela 3 - Combinação das medidas de circunferência abdominal e IMC para avaliar obesidade e risco
de doença cardiovascular
Tabela 4 - Fatores que podem desencadear Hiperhomocisteinemia.
Tabela 5 - Concentrações utilizadas para a curva de calibração do teste MDA
Tabela 6 - Valores de referência para dosagem de vitamina B12 e ácido fólico
Tabela 7 - Perfil dos grupos estudados
Tabela 8 - Parâmetros biológicos analisados e os níveis de He antes (basal) e após o tratamento com
sinvastatina.
7
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
L
microlitro
M
micromolar
mol/l
Micromol por litro
5,10 MTHF
5,10 metilenotetrahidrofolato
5-MTHF
5-metilenotetrahidrofolato
ABESO
Associação Brasileira para o Estudo da Obesidade e da Síndrome Metabólica
AVC
Acidente Vascular Cerebral
B12
Cobalamina
B6
Piridoxina
C6
Ácido mevalônico
CA
Circunferência Abdominal
CAMs
Moléculas de Adesão Celular
CLAE
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
cm
centímetro
CT
Colesterol Total
CβS
Cistationina β-Sintetase
DAC
Doença Arterial Coronariana
DM
Diabetes Mellitus
DNA
Ácido Desoxirribonucleico
EDTA
Ácido etilenodiaminotetracético
ELISA
Método de ensaio imunoenzimático
EO
Estresse oxidativo
FPP
Farnesilpirofosfato
GABA
Ácido gama-aminobutírico
GGPP
Geranylgeranylpyrophosphate
H2O2
Peróxido de Hidrogênio
HAS
Hipertensão Arterial Sistêmica
HDL
High Density Cholesterol (Lipoproteína de Alta Densidade)
He
Homocisteína
8
HHe
Hiperhomocisteinemia
HMG-CoA
HMG-CoA redutase (3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A)
HOCL
Ácido Hipocloroso
HPLC
High Performance Liquid Chromatography
HRM
High Resolution Melting
hs-CRP
High Sensitive C Reactive Protein (Proteina C Reativa de Alta Sensibilidade)
IBGE
Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
ICAM-1
Intercellular Adhesion Molecule-1 (Molécula de Adesão Intracelular-1)
IL-6
Interleucina 6
IMC
Índice de Massa Corporal
kg/m2
kilograma por metro ao quadrado
LDL
Low Density Lipoprotein (Lipoproteína de Baixa Densidade)
LO2
Peroxila
MDA, C3H4O2
Malondialdeído
mRNA
RNA mensageiro
MS
Ministério da Saúde
MS
Metionina Sintetase
MTHFR
Metilenotertahidrofolatoredutase
ng/ml
nanogramas por mililitro
mg/dl
miligrama por decilitro
O2
Radicais Superóxido
OH
Hidroxila
OMS
Organização Mundial de Saúde
PAD
Pressão arterial diastólica
PAS
Pressão arterial sistólica
PCR
Reação em Cadeia da Polimerase
pg/ml
picograma por mililitro
RCQ
Circunferência Abdominal/quadril
ROS
Espécies Reativas de Oxigênio
SBC
Sociedade Brasileira de Cardiologia
SBD-F
Sal de amônio 7-Fluorobenzo-2,1,3- oxadiazol-4-ácido sulfônico
SES
Secretaria Estadual de Saúde
9
TBAR
Ácido tiobarbitúrico
TBARS
Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
TCA
Ácido tricloroacético
TCEP
Tris-(2-carboxietil)-fosfina
Teste MDA-TBARS
Teste de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
TG
Triglicérides
TGO
Aminotransferase glutâmico-oxalacética
TGP
Aminotransferase glutâmico-pirúvica
tHcy
Homocisteína total
TMP
Solução Tetrametoxipropano
TNF-α
Fator de necrose tumoral alfa
UFMG
Universidade Federal de Minas Gerais
VCAM-1
Vascular Adhesion Molecule-1 (Molécula de Adesão Celular Vascular-1)
VLDL
Lipoproteína de densidade muito baixa
WHO
World Health Organization (Organização Mundial da Saúde)
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RESUMO
A obesidade é uma doença de caráter multifatorial que envolve fatores genéticos, ambientais e
nutricionais. No contexto da saúde pública, configura-se como doença prevalente e bastante
preocupante para as autoridades de saúde, tendo em vista que acarreta fatores de risco para o
desenvolvimento de complicações metabólicas e cardiovasculares (DCV). Diversos estudos evidenciam
a existência de um relacionamento entre obesidade e elevações plasmáticas de Homocisteína (He), um
aminoácido intermediário que ocupa posição central e regulatória no metabolismo da metionina, obtida
por meio da dieta e precursora da He. A He representa um fator de risco para as DCV, como
obesidade, quando ocorre uma condição conhecida como Hiper-homocisteinemia (HHe), resultante de
diversos fatores, dentre eles, deficiências nutricionais das vitaminas reguladoras do ciclo e
polimorfismos genéticos relacionados às enzimas envolvidas nas vias metabólicas, sendo o mais
citado, o MTHFR 677C>T. Os mecanismos que explicam o interrelacionamento entre HHe e DCV não
estão totalmente elucidados. Especula-se que a HHe exerça efeitos tóxicos nas células endoteliais ao
induzir estresse oxidativo no organismo, contribuindo para o agravamento das DCV. Pesquisas
empreendidas com vistas a investigar mecanismos preventivos para HHe apontam a implementação
nutricional de vitaminas do clico e estudos recentes fazem alusão à terapia com estatinas. O objetivo
principal deste estudo foi verificar se a terapia com sinvastatina 20 mg/dia altera os níveis plasmáticos
de He em mulheres obesas. A metodologia consistiu em um estudo populacional com um grupo tratado
com sinvastatina ou placebo, dosagem de Homocisteína total (tHcy) e variáveis relacionadas
(Malondialdeído (MDA), Vitamina B12, Ácido Fólico e Proteína C Reativa Ultra-sensível (hsPCR) e
análise polimórfica do MTHFR 677C>T). Nossos resultados mostraram que, antes do tratamento, não
foi observada nenhuma diferença significativa nos parâmetros analisados entre o grupo tratado e
placebo (p > 0,05). Após o tratamento, observamos decréscimo significativo (p<0,05) nos níveis de CT
17,88% (178,4 ± 36,6 vs 146,5 ± 47,7; p = 0,0008), LDL 27,43% (115,2 ± 35,2 vs 83,63 ± 44,3; p =
0,0015), TG 3,98% (120,4 ± 9,8 vs 115,6 ± 11,9; p = 0,0132) e um acréscimo não significativo de
6,45% nos níveis de HDL (44,9 ± 13,2 vs 47,8 ± 14,2; p > 0,05). Observamos ainda, diminuição de
37,5% nos valores de hsPCR (0,16 ± 0,03 vs 0,10 ± 0,06; p < 0,0001), redução significativa (p<0,05)
e decréscimo significativo nos valores da PAS (91,3 ± 29,4
vs 75,2 ± 28,7; p = 0,02). Com relação à He, verificamos redução significativa (p<0,05) entre os níveis
plasmáticos de He basal e pós-tratamento (8,4±2,5 vs 7,1±1,3 µM; p=0,026), o que não ocorreu no
grupo placebo (8,3±1,3 vs 8,2±1,9 µM; p > 0,05). Sugerimos, neste ponto, que os mecanismos
envolvidos nesse processo podem ter ocorrido indiretamente devido a uma correlação biológica
intrínseca entre o marcador de estresse oxidativo (MDA) ou via diminuição do LDL. Quanto ao
polimorfismo, antes do tratamento, verificamos que os níveis basais de He são maiores nos genótipos
CT+TT (9,4±0,87) comparado com o genótipo CC (7,5±0,55). No entanto, a diferença entre os grupos
não foi significativa, embora tenha uma tendência à significância (p=0,07). Depois do tratamento, houve
redução não significativa (p>0,05) de 10% nos níveis de He no grupo com genótipo CC (6,8±0,4). No
grupo com genótipos CT+TT houve redução também não significativa (p=0,07) de 21% da He após o
tratamento (7,53±0,3). Sugerimos, com este resultado, que o polimorfismo MTHFR 677C>T modula os
níveis de He e que genótipos com o alelo T respondem melhor à terapia com sinvastatina na redução
dos níves de He. Maiores estudos são necessários para elucidar os mecanismos estudados e
relacionados à redução encontrada nos níveis de He para subsidiar novas estratégias terapêuticas de
prevenção da Hiperhomocisteinemia.
Descritores: obesidade, obesity homocysteine, homocysteine cardiovascular disease, homocysteine oxidative
stress, homocisteína, simvastatin effects.
11
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.................................................................................................................... ......... 14
2. REVISÃO DE TEMAS RELEVANTES À DISSERTAÇÃO .....................................................
20
2.1 Obesidade e doenças cardiovasculares..................................................................................... 20
2.2 Diagnóstico e tratamento como prevenção do risco cardiovascular.......................................... 23
2.3 Homocisteína (He): conceito e metabolismo..............................................................................
26
2.4 Hiperhomocisteinemia (HHe): fatores vitamínicos e genéticos.................................................. 33
2.5 Sinvastatina ........................................................................................................................................... 37
2.6 Malondialdeído (MDA) ............................................................................................................... 41
2.7 Proteína C reativa (hsPCR) ........................................................................................................... 42
3. OBJETIVOS ........................................................................................................................................... 43
4. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................................................. 44
4.1 Casuística ..................................................................................................................................
44
4.2 Seleção das participantes do estudo ......................................................................................... 44
4.3 Critérios de inclusão .................................................................................................................. 45
4.4 Critérios de exclusão ................................................................................................................. 45
4.5 Amostras biológicas ................................................................................................................... 46
4.6 Delineamento experimental ....................................................................................................... 46
4.6.1 Parâmetros Bioquímicos .................................................................................................
46
4.6.2 Parâmetros Antropométricos.............................................................................................. 47
4.6.3 Parâmetros Lipídicos .........................................................................................................
47
4.6.4 Parâmetros Clínicos .................................................................................... ......................
47
12
4.7 Métodos .................................................................................................................................... 47
4.7.1 Fatores de risco ...................................................................................................................... 47
4.7.2 Parâmetros bioquímicos.....................................................................................................
48
4.7.2.1 Dosagem de Homocisteína total (tHcy): método utilizado na determinação dos
níveis plasmáticos da Homocisteína ........................................................................................................ 48
4.7.2.2 Dosagem de Malondialdeído (MDA): Determinação de substâncias reativas ao
ácido tiobarbitúrico (teste MDA-TBARS) ............................................................................... .......... 49
4.7.2.3 Dosagem de Vitamina B12 e Ácido Fólico ................................................................ 50
4.7.2.4 Análise polimórfica do MTHFR 677C>T por HRM PCR ................................................. 50
4.7.2.5 Dosagem de Proteína C reativa de Alta sensibilidade .................................................... 51
4.7.3 Parâmetros antropométricos ......................................................................................... ..... 52
4.7.3.1 Índice de Massa Corporal (IMC) ................................................................................. 52
4.7.3.2 Circunferência Abdominal (CA) .................................................................................. 53
4.7.3.3 Relação Cintura Quadril (RCQ) .................................................................................. 53
4.7.4 Parâmetros lipídicos .......................................................................................... ................... 54
4.7.5 Parâmetros Clínicos ............................................................................................................. 54
4.8 Análise estatística ...................................................................................................................... 55
5. RESULTADOS ................................................................................................................................ 56
5.1 Caracterização das participantes do estudo .............................................................................. 56
5.2 Sobre os efeitos da sinvastatina. Qual são os efeitos esperados e pleiotrópicos da
Sinvastatina? ................................................................................................................................... 58
5.3 Houve déficit de vitaminas na população estudada antes e após o tratamento com
sinvastatina? ......................................................................................... ............................................... 58
5.4 Houve diferença entre os níveis de He basal e pós-tratamento com sinvastatina? .................. 59
5.5 Há correlações entre os níveis de He, as variáveis estudadas MDA, HsPCR, LDL, HDL, CT,
idade e HAS e a terapia com sinvastatina? ...................................................................................... 59
13
5.6 O polimorfismo MTHFR 677C>T modula os níveis de He antes e após o tratamento com
sinvastatina? .................................................................................................................................... 61
6. DISCUSSÃO ............................................................................................................................... 62
7. LIMITAÇÕES ......................................................................................... ......................................... 66
8. CONCLUSÃO .............................................................................................................................. 67
9. REFERÊNCIAS .............................................................................................................................. 68
10. ANEXOS....................................................................................................................................... 72
10.1 Anexo 1 .................................................................................................................................... 72
10.2 Anexo 2 .................................................................................................................................... 74
14
1. INTRODUÇÃO
No panorama atual de saúde, um tema bastante preocupante em termos de saúde pública é a
obesidade, tendo em vista o aumento de sua prevalência e incidência nas populações, independente de
condições econômicas e sociais (1).
O grau elevado de gordura e sua distribuição corporal acarretam riscos para a saúde por guardar
relação com complicações metabólicas e cardiovasculares, sendo o excesso de gordura abdominal um
fator de risco maior para a saúde do que o excesso de gordura distribuída de forma generalizada no
corpo (2-3).
A obesidade pode ser definida pelo acúmulo excessivo de gordura corporal decorrente de um
desequilíbrio crônico nutricional entre a energia ingerida e a energia gasta, em associação ou não a
distúrbios genéticos, endócrinos ou metabólicos, como consumo abusivo de alimentos gordurosos,
redução da prática de atividade física e deficiência vitamínica (1-2, 4).
No contexto atual, estima-se que exista no mundo, cerca de 400 milhões de adultos obesos, com índice
de massa corporal acima de 30 Kg/m². Até 2015, aproximadamente 2,3 milhões de adultos estarão com
sobrepeso e mais de 700 milhões com obesidade (1). No Brasil, as proporções são consideradas
epidêmicas, sendo que há uma projeção de que, em 10 anos, se o ritmo continuar crescente, a
população brasileira estará com a mesma proporção de obesos dos Estados Unidos (5).
Segundo a Organização Mundial da Saúde (2011) (1), o aumento da prevalência da obesidade está
relacionado às doenças crônicas associadas à dieta, como diabetes mellitus, assim como a doenças
cardiovasculares, entre elas, doença arterial coronariana (DAC), acidente vascular cerebral (AVC) e
hipertensão arterial sistêmica (HAS), representando, portanto, um fator de risco importante para o
desenvolvimento destas doenças.
Estudos têm mostrado relacionamento entre obesidade, doenças cardiovasculares e elevações
plasmáticas de homocisteína (He), um aminoácido intermediário que ocupa posição central e
regulatória no metabolismo da metionina, aminoácido este obtido por meio da dieta e precursor da He
(6-7).
15
Reitman et al.. (7) expõem que o relacionamento existente entre aumento da He e obesidade não está
totalmente elucidado. Especula-se que o mecanismo envolvido possa ser decorrente de baixas
concentrações no plasma de vitaminas antioxidantes, a exemplo de carotenóides e vitamina E, tanto
quanto de vitaminas do complexo B, como o ácido fólico e a vitamina B12. A deficiência destas
vitaminas pode contribuir para o aumento excessivo dos níveis plasmáticos de homocisteína
encontrados em pacientes obesos.
A homocisteína representa um fator de risco para doenças cardiovasculares quando ocorre uma
condição conhecida como Hiper-homocisteinemia (HHe), condição esta que define a elevação
exagerada de seus níveis plasmáticos. Todavia, da mesma forma que os mecanismos que
correlacionam He a obesidade ainda não foram esclarecidos, os meios pelos quais a HHe relaciona-se
com as patologias cardiovasculares também não foram completamente descobertos. Vários estudos
referem efeitos tóxicos diretos da HHe nas células endoteliais através de processos oxidativos como
resultado de hiper-homocisteinemia, uma vez que esta condição poderia favorecer a criação de um
ambiente endógeno no organismo conhecido por estresse oxidativo (8-11).
O estresse oxidativo decorre de um estado de desequilíbrio do organismo entre a produção de
espécies reativas de oxigênio (ROS), também conhecidas como radicais livres, e a capacidade
antioxidante endógena (12). Em situações de equilíbrio, as ROS são neutralizadas por substâncias
antioxidantes, porém, em certas condições, pode haver um desequilíbrio entre a geração excessiva de
formas oxidativas em detrimento das defesas antioxidantes, cuja função é inibir ou reduzir a ação
deletéria dos radicais livres, levando ao estresse oxidativo celular (12-13).
Barbosa et al.., (12) explicam que a geração de ROS e a resposta do organismo com a produção de
antioxidantes constitui-se por um processo contínuo e fisiológico normal, com a finalidade de realizar
atividades biológicas relevantes no ambiente endógeno. Dentre as ROS geradas no organismo
mediante reações bioquímicas específicas catalisadas por enzimas, estão os radicais superóxido (O2),
hidroxila (OH), peroxila (LO2) e os não-radicais ácido hipocloroso (HOCL) e o peróxido de hidrogênio
(H2O2). Em contrapartida, são produzidas substâncias antioxidantes atuantes na defesa biológica
contra o excesso oxidativo, os inibidores vitamínicos A (β-caroteno), C (ácido ascórbico) e E (αtocoferol), outros carotenoides como licopeno, fitoquímicos como resveratrol, além de alguns minerais a
exemplo de cobre, zinco e selênio.
16
Quando a capacidade antioxidante é superada pela ação excessiva das ROS, ocorre oxidação das
biomoléculas por meio de reações bioquímicas, sendo os lipídeos as classes mais susceptíveis aos
danos. Como resultado da oxidação, são derivados metabólitos específicos, conhecidos como
marcadores de estresse oxidativo, os quais podem ser identificados e quantificados (12).
Os marcadores de estresse oxidativo no organismo são vários. Entre eles, o malondialdeído (MDA,
C3H4O2) e a Homocisteína (He) no estado oxidado. O MDA é um aldeído resultante, sobretudo, de
oxidação lipídica e a He parece estar relacionada à indução do ambiente oxidativo com subsequente
citotoxidade direta ao endotélio (8, 13-14).
Os efeitos tóxicos da HHe na patologia da aterogênese por lesão às células endoteliais têm sido
reportados por diversos investigadores. Especula-se que a HHe propicia a formação do ambiente
oxidativo ao sofrer autooxidação (8).
Segundo estudos, quando a HHe sofre oxidação, seus grupos sulfidrila reagem entre si e produzem
espécies reativas de oxigênio, como superóxido e peróxido de hidrogênio, as quais, por sua vez,
produzem diversos efeitos, tais como:
interação com o óxido nítrico vascular, inibindo sua
biodisponibilidade e, portanto, suas propriedades vasoativas; oxidação da fração LDL-colesterol,
condição importante que contribui para a gênese das placas ateromatosas nas artérias; alteração das
propriedades antitrombóticas pela redução dos fatores anticoagulantes e aumento dos fatores
agregantes plaquetários, eventos estes que propiciam a formação de trombos arteriais e venosos (11,
14-16).
Em decorrência dos efeitos aterogênicos e trombogênicos da HHe no sistema cardiovascular, a
toxidade da HHe nas células endoteliais têm sido apontada como fator de risco independente para
doenças cardiovasculares, embora o mecanismo exato pelo qual a He promova tais efeitos ainda não
esteja suficientemente claro pelos pesquisadores. Sabe-se que a condição que deflagra estes eventos
é a hiper-homocisteinemia correlacionada ao estresse oxidativo (14-15).
Diversas pesquisas têm sido instituídas com vistas a investigar fatores que induzam a hiperhomocisteinemia, buscar profilaxia, prevenção e elucidar mecanismos pelos quais a HHe interfere nas
doenças cardiovasculares. Autores defendem que o aumento do nível sérico de He pode ser atribuído a
várias razões, dentre as quais se destacam deficiências nutricionais das vitaminas reguladoras do ciclo,
17
polimorfismos genéticos relacionados às enzimas envolvidas nas vias metabólicas, idade, sexo,
algumas doenças como insuficiência renal e neoplasias malignas, podendo ocorrer ainda elevação
secundária ao uso de drogas antidiabéticas. (6, 8-9).
Pesquisadores relatam que o metabolismo da He engloba reações que requerem enzimas e co-fatores
vitamínicos para o processo ocorrer. As principais enzimas envolvidas são metionina sintetase (MS),
cistationina beta sintetase (CβS) e a metilenotetrahidrofolatoredutase (MTHFR), as quais são
dependentes das vitaminas B6, B12 e do ácido fólico (folato) para intermediar as reações (17). A figura
1 ilustra o ciclo metabólico da He e suas principais vias regulatórias.
TRANSULFURAÇÃO
REMETILAÇÃO
HIPERHOMOCISTEINEMIA – CIRCULAÇÃO SANGUÍNEA
Figura 1. Representação esquemática do Metabolismo da He, principais enzimas e vitaminas
envolvidas no ciclo (Modificado de Neves, et al.., (17). MTHFR = metileno-tetrahidrofolato
redutase; CβS = cistationina β-sintetase.
18
A literatura aponta o polimorfismo 677C>T da enzima MTHFR (metilenotetrahidrofolato redutase) como
o mais extensivamente estudado por se tratar de uma variação genética funcional que altera a função
da enzima ao reduzir sua atuação, resultando no aumento excessivo deste aminoácido no plasma (6,
18).
A comunidade científica tem instituído pesquisas com a finalidade de encontrar mecanismos
preventivos para a HHe. Pesquisas indicam a implementação nutricional de vitaminas essenciais ao
metabolismo da He como mais eficaz na normalização do ciclo e na prevenção da HHe do que os
fatores genéticos, sendo o mais citado o polimorfismo associado ao gene MTHFR 677C>T.(6). Outros
estudos referem efeitos pleiotrópicos das estatinas como um fator positivo na redução dos níveis
plasmáticos de He, embora estes estudos ainda sejam inconclusivos (19-21). Considerando os fatores
expostos na literatura que podem modular as concentrações plasmáticas de He, como fatores
nutricionais mais indicados, os genéticos e, mais recente, os estudos relativos à terapia com
sinvastatina, investigar se o mecanismo de ação desta droga interfere na modulação dos níveis de He
plasmática pode ser um método relevante de pesquisa, tendo em vista o benefício da população pela
indicação de mais um suporte preventivo da HHe, uma condição independente que favorece tanto a
gênese quanto do agravamento das DCV como obesidade e hipertensão arterial sistêmica.
O objetivo principal deste estudo foi verificar se a terapia com sinvastatina altera os níveis plasmáticos
de He em mulheres obesas. Para o alcance do objetivo, os níveis de He foram dosados antes e após o
tratamento com sinvastatina. Depois, buscou-se correlacionar os resultados com as variáveis
estudadas MDA, hsPCR, Vitamina B12, Ácido fólico, LDL, HDL, CT, Idade e HAS. Por último, objetivouse verificar a possibilidade do polimorfismo MTHFR 677C>T modular os níveis de He antes e após o
tratamento com sinvastatina.
Considerando que pacientes obesos estão predispostos a um maior risco para o desenvolvimento de
doenças cardiovasculares (DCV), que a HHe é um fator independente para a gênese destas patologias,
que sua modulação depende de suporte nutricional e de fatores genéticos, sendo o mais citado o
MTHFR e, finalmente, que sua regulação pode ser modulada pela terapia com sinvastatina, surgiram
questionamentos tais como: Há correlações entre os níveis de He, as variáveis clínicas estudadas
MDA, HsPCR, Vitamina B12, Ácido fólico, LDL, HDL, CT, idade e HAS e a terapia com sinvastatina? Já
que, segundo pesquisas, o suporte nutricional é mais preponderante na modulação da concentração
plasmática de He, os níveis sorológicos de Vitamina B12 e de Ácido fólico estavam normais antes do
19
tratamento com sinvastatina? Qual a correlação entre o polimorfismo MTHFR 677C>T e os níveis de
He antes e após o tratamento com sinvastatina? O efeito pleiotrópico das estatinas pode contribuir para
reduzir a HHe? A necessidade em se obter respostas a estes questionamentos reforçaram e motivaram
o empenho à realização desta pesquisa.
Este estudo foi realizado com dois grupos, um grupo tratado com sinvastatina e outro tratado com
placebo e dividido em duas etapas, antes e após o tratamento com sinvastatina ou placebo. Definimos
placebo como qualquer tratamento inócuo que se prescreve dizendo ser um procedimento ou
medicamento ativo. É inócuo por não estar vinculado à farmacologia medicamentosa e não exercer
ação específica nos sintomas ou doença do paciente, embora, de alguma forma, exerça efeito ou
resposta sobre a sintomatologia. Tais resultados são apenas de natureza psicológica, onde este efeito
denominado placebo é obtido quando, a partir da administração de um placebo, alcança-se um
resultado positivo (22). Na primeira etapa, antes do tratamento, foram coletadas as amostras de
sangue da população de pacientes obesas dos dois grupos, para análise das variáveis clínicas,
genéticas e das concentrações plasmáticas de He, quando foi administrado a droga ou o placebo. Na
segunda etapa, foram suspensas a droga e o placebo e coletadas novas amostras de toda a população
do estudo para realizar as correlações antes e depois do uso da droga em relação aos níveis de He.
20
2. REVISÃO DE TEMAS RELEVANTES À DISSERTAÇÃO.
2.1 Obesidade e doenças cardiovasculares
A obesidade é definida pela WHO como o acúmulo excessivo de tecido gorduroso no organismo que
representa riscos para a saúde (3). O grau elevado de gordura corporal resulta de um desequilíbrio
crônico nutricional entre a energia ingerida e a energia gasta, em associação ou não a distúrbios
genéticos, endócrinos ou metabólicos (2, 4).
A etiologia da obesidade é multifatorial e reflete a interação de fatores genéticos, endócrinos,
metabólicos e ambientais, onde questões relacionadas ao estilo de vida se envolvem com distúrbios da
dieta em associação à falta de atividade física (2).
De acordo com o Ministério da Saúde – MS (23), o determinante mais expressivo do acúmulo
excessivo de gordura da obesidade é o balanço energético positivo. Este balanço ocorre quando a
ingestão alimentar é superior à energia consumida nas funções fisiológicas e nas atividades diárias em
geral, gerando-se um balanço energético positivo em relação ao gasto energético, que leva à
obesidade.
Atualmente, a obesidade é considerada uma epidemia mundial, por estar presente e em ascensão
tanto em países desenvolvidos quanto em países em desenvolvimento. Estima-se que exista no
mundo, cerca de 400 milhões de adultos obesos, com índice de massa corporal acima de 30 Kg/m² e
que até 2015, aproximadamente 2,3 milhões de adultos estarão com sobrepeso e mais de 700 milhões
com obesidade (1). No Brasil, as proporções são consideradas epidêmicas, sendo que há uma
projeção de que, em 10 anos, se o ritmo continuar crescente, a população brasileira estará com a
mesma proporção de obesos dos Estados Unidos (5).
O rápido crescimento da obesidade nas populações é atribuído às mudanças ocorridas na sociedade
moderna, em decorrência de alterações econômicas, sociais e demográficas, com reflexos no estilo de
vida e no perfil nutricional dos indivíduos. (24).
As alterações nos hábitos alimentares voltadas para a redução no consumo de fibras e aumento de
alimentos gordurosos e açúcares, resultante da transição nutricional, em associação com as mudanças
nos padrões de vida geradas pela urbanização, globalização, consumismo e pelas comodidades que a
21
vida atual oferece, tem contribuído para a redução do esforço físico e do dispêndio energético e,
consequentemente, para o favorecimento da obesidade (23-24).
Pinheiro et al. (24), caracterizam a expressão transição nutricional como um processo de alterações
nos padrões nutricionais e de consumo, que se reflete na saúde das populações.
É importante ressaltar que a evolução nutricional na população brasileira nos últimos 20 anos, têm se
configurado com tendências à redução da desnutrição em crianças e adultos, paralelamente ao
aumento alarmante da obesidade (25). Observa-se ainda que a ascensão da obesidade no Brasil é
relevante e mais evidente nas famílias urbanas de baixa renda do que na área rural (24).
Neste cenário, Pinheiro et a, (24), justificaram que o consumo alimentar na zona rural difere daquele
consumido na zona urbana, o que gera uma diferença no padrão de obesidade no Brasil. Enquanto a
população urbana consome maior quantidade alimentos processados como carnes, gorduras, açúcares
e produtos derivados do leite, a ingestão de alimentos como raízes, tubérculos e cereais na área rural é
maior do que na urbana, o que contribui para o favorecimento do peso na primeira em relação à
segunda.
Segundo a Organização Mundial de Saúde (2011) (1), o aumento da prevalência da obesidade nas
populações representa um agravo para a saúde por se configurar como um fator de risco independente
que predispõe o organismo ao desenvolvimento de doenças crônicas, como síndrome metabólica e
distúrbios cardiovasculares.
A síndrome metabólica caracteriza-se por um transtorno complexo que engloba um grupo de fatores de
risco interrelacionados, de origem metabólica, os quais contribuem diretamente para o desenvolvimento
de diabetes tipo 2 e de doenças cardiovasculares, como doença arterial coronariana e infarto do
miocárdio (24, 26-27). Dentre os fatores de risco metabólicos característicos da síndrome metabólica,
encontram-se dislipidemia aterogênica (hipertrigliceridemia, níveis elevados de apolipoproteína B,
aumento do LDL-colesterol e redução do HDL-colesterol), hipertensão arterial, hiperglicemia e condição
pró-inflamatória. Neste contexto, a resistência à insulina e a obesidade abdominal parecem
desempenhar um papel essencial na gênese desta síndrome (28).
Sabe-se que a as complicações decorrentes de obesidade estão mais relacionadas à distribuição da
gordura corporal do que ao excesso de peso (3). A WHO refere que o modo pelo qual a gordura
corporal é armazenada no corpo contribui para o maior agravamento das DCV, sendo o excesso de
22
gordura abdominal um fator de risco maior para a saúde do que o excesso de gordura distribuída de
forma generalizada no corpo. Segundo a WHO, o excesso de gordura abdominal, definido como padrão
androide, visceral ou maçã acarreta mais riscos para os eventos cardiovasculares do que a distribuição
ginecoide (Figura 2) (3).
Figura 2- Padrões de distribuição de gordura corporal. Observa-se o padrão andróide à esquerda e o
padrão
ginecóide
à
direita.
Fonte:
Guia
da
dieta.
Site
de
internet:
http://www.guiadadieta.com.br/saude/obesidade-androide-x-ginecoide/
A ocorrência de distúrbios metabólicos como diabetes e cardiovasculares como hipertensão arterial na
obesidade estão mais relacionados à obesidade abdominal do que à obesidade localizada na região do
quadril, devido a questões ligadas a aumento da insulina (29).
No caso da pressão arterial, Jung (30) citado por Francischi et al. (29) refere que a cada 10% de
aumento da gordura corporal, ocorre elevação nos níveis pressóricos da pressão sistólica em,
aproximadamente, 6,0 mmHg e na diastólica em 4,0 mmHg. Francischi et al. (29) explica que o
acúmulo de gordura abdominal (andróide) nos pacientes obesos resulta no aumento da liberação de
ácidos graxos livres na veia porta, o que eleva a síntese hepática de triglicérides e aumento da
resistência à insulina. Em função da resistência à insulina e da hiperinsulinemia, há retenção de sódio
pelas células e interferência na atividade do sistema nervoso simpático e consequentemente, aumento
da pressão arterial sanguínea.
Dada a correlação significativa entre obesidade e a manifestação de doenças crônicas
cardiovasculares, torna-se importante a realização do diagnóstico e do tratamento adequado, o qual
23
deve ser associado a uma estratégia de manutenção do peso para a redução do aumento do risco
cardiovascular associado a estas doenças (26).
2.2 Diagnóstico e tratamento como prevenção do risco cardiovascular
O diagnóstico da obesidade é obtido por meio da utilização de alguns parâmetros, tais como: medidas
antropométricas, técnica que permite mensurar a massa corporal expressa pelo peso e as dimensões
físicas dadas pela estatura (peso x altura); índice de Massa Corporal (IMC) ou Índice de Quetelet;
Circunferência Abdominal (CA) e Relação Circunferência Abdominal/quadril (RCQ), entre outros (26).
O Índice de Massa Corporal (IMC) ou Índice de Quetelet é obtido através da divisão do peso em
quilogramas pelo quadrado da altura em metros (kg/m2). De acordo com a ABESO (26), valores de IMC
acima de 25,0 kg/m2 indicam sobrepeso, valores de 25,0 kg/m2 a 29,9 kg/m2 caracterizam um estágio
de pré-obesidade e valores a partir de 30,0 kg/m2 classificam como obesidade no grau I. O IMC entre
35 e 39,9 kg/m2 caracteriza obesidade de grau II e de grau III, o IMC igual ou superior a 40 kg/m2.
A tabela 1 mostra a classificação de sobrepeso e obesidade de acordo com o IMC, adaptada pela
Organização Mundial de Saúde, 2000.
Tabela 1 - Classificação de peso pelo IMC e risco de comorbidades
Classificação
IMC kg/m2
Risco de comorbidades
Baixo peso
< 18,5
Baixo
Peso normal
18,5 a 24,9
Médio
Sobrepeso
≥ 25
-
Pré-obeso
25,0 a 29,9
Moderado
Obeso I
30,0 a 34,9
Aumentado
Obeso II
35,0 a 39,9
Grave
Obeso III
≥ 40,0
Fonte: Organização Mundial da Saúde (2000).
Muito grave
Embora o IMC seja um bom indicador, possui algumas limitações por não estar totalmente
correlacionado com a composição corporal (31). Dentre suas limitações, cita-se a não distinção de
massa gordurosa de massa magra, não reflete a distribuição da gordura corporal (32-33).
24
O método do diagnóstico por meio da medida da Circunferência Abdominal (CA) permite avaliar a
obesidade do tipo central, também conhecida como visceral ou androgênica acumulada na região
mesentérica. Este tipo de gordura está relacionado a um maior risco de doença aterosclerótica (34). A
população do sexo masculino com CA ≥ 94 cm e mulheres com CA ≥ 80 cm possuem um risco
aumentado para desenvolver complicações metabólicas. Já o risco aumenta substancialmente quando
as medidas da CA atingem valores ≥ 102 cm para os homens e ≥ 88 cm para as mulheres (35). A
tabela 2 detalha o exposto.
Tabela 2- Circunferência abdominal e risco de complicações metabólicas associadas com
obesidade
Risco de complicações metabólicas
Homem
Mulher
Aumentado
≥ 94
≥ 80
Aumentado substancialmente
≥ 102
≥ 88
Fonte: I Diretriz Brasileira de Diagnóstico e Tratamento da Síndrome Metabólica (36).
De acordo com a ABESO (26), a combinação entre a CA o IMC são métodos melhores que permitem
avaliar os riscos e ajudar a diminuir as limitações de cada uma das avaliações quando empregadas de
forma isolada.
A Relação Circunferência Abdominal/quadril (RCQ) é considerada pela WHO como criteriosa para
caracterizar a síndrome metabólica, com valores de corte de 0,90 para homens e 0,85 para mulheres.
Obtêm-se a RCQ pela divisão dos perímetros da cintura (cm) e do quadril (cm) (3).
As medidas mensuradas pelo método RCQ e a Circunferência da Cintura (CA), embora sejam capazes
de estimar a quantidade de gordura abdominal, não fornecem avaliação exata da adiposidade visceral,
gordura esta que se relaciona à quantidade de tecido adiposo visceral (37-38).
Em síntese, indica-se como melhor opção para o diagnóstico de sobrepeso e obesidade, a associação
entre a avaliação da massa corporal e a distribuição de gordura, pela utilização dos métodos
combinados IMC e Circunferência Abdominal ou de Cintura (CA) (39-40).
25
A tabela 3, proposta pela WHO (41), serve como um indicador para uma combinação entre a medida
da CA e do IMC para avaliação do risco de complicações metabólicas e cardiovasculares decorrentes
de obesidade.
Tabela 3- Combinação das medidas de circunferência abdominal e IMC para avaliar obesidade e risco
de doença cardiovascular
Circunferência abdominal (cm)
Risco de complicações
metabólicas
IMC (kg/m2)
Baixo peso
Homem: 94-102
102 +
Mulher: 80-88
88 +
< 18,5
-
-
Peso saudável
18,5-24,9
-
Aumentado
Sobrepeso
25-29,9
Aumentado
Alto
Alto
Muito alto
Obesidade
≥ 30
Fonte: World Health Organization (WHO) (41).
O tratamento da obesidade envolve uma associação de fatores como dieta com restrição energética,
mudança comportamental, inserção da prática de atividade física e uso de medicações apropriadas de
forma singular (29).
A escolha da abordagem terapêutica mais adequada deve fundamentar-se na estratificação de risco
com base na distribuição de gordura corporal, levando em conta as complicações associadas e a
gravidade da doença (26, 42).
Rosa et al., (42) salientam que para se alcançar sucesso no tratamento, é necessário que haja redução
da massa gordurosa. Esse resultado é obtido a partir do balanço energético negativo, o qual ocorre
quando o gasto energético supera o consumo de energia.
Como a obesidade é uma doença crônica recorrente, para manter o peso ideal após o tratamento, o
auto-monitoramento deve ser incluído no programa de mudança comportamental, que engloba
educação sobre a etiologia da obesidade, reeducação alimentar, manutenção de atividade física
regular, além de apoio familiar, psicológico, social e acompanhamento de uma equipe multidisciplinar
de profissionais de saúde (29).
26
A ABESO (26) lembra que a manutenção do peso, embora difícil, por incorporar mudanças
relacionadas ao estilo de vida, é essencial na prevenção de patologias crônicas, tendo em vista a forte
relação existente entre obesidade, síndrome metabólica e DCV como a hipertensão arterial sistêmica.
2.3 Homocisteína (He): conceito e metabolismo
A Homocisteína (He) é um aminoácido não essencial identificado pelo pesquisador Vigneaud em 1932
(11). É formada a partir do metabolismo proteico do aminoácido essencial metionina, proveniente da
dieta, sendo, portanto um produto intermediário do metabolismo da metionina (6).
Segundo Neves e colaboradores, o metabolismo da He ocorre no fígado, onde a metionina obtida da
dieta é catabolizada para dar origem S-adenosilmetionina, S-adenosil-homocisteina e desta, à He. Uma
vez produzida, assume duas vias: pode ser regenerada a nova metionina ou ser catabolizada
(convertida) para formar o aminoácido cisteína (6). A função principal da He é atuar como reguladora
do ciclo da metionina para a síntese protéica (43). A figura 3 mostra simplificadamente as vias
metabólicas da homocisteína por remetilação (regeneração) ou transulfuração (conversão).
27
Figura 3 – Metabolismo simplificado da Homocisteína (He).
Para explicar de modo detalhado o metabolismo da He, é importante destacar que o processo via
remetilação ou transulfuração, engloba reações que requerem várias enzimas e co-fatores. As
principais enzimas envolvidas são metionina sintetase (MS), cistationina beta sintetase (CβS) e a
metilenotetrahidrofolatoredutase (MTHFR), as quais são dependentes das vitaminas B12 (cobalamina),
B6 (piridoxina) e do ácido fólico (folato) para intermediar as reações metabólicas, conforme exposto ao
final da figura 3 (17).
A via da remetilação ocorre geralmente no jejum ou em dietas aproteicas, com a finalidade de
regenerar a He remanescente em nova metionina num ciclo constante a partir da He. Esta via é
regulada pelas enzimas MTHFR, MS, já citadas, além da enzima homocisteínametiltransferase,
necessitando, respectivamente, do ácido fólico, da vitamina B12 ou da betaína para ocorrer (17). Por
28
requerer, principalmente, suprimento adequado de vitamina B12 e ácido fólico, esta via é conhecida
também como ciclo do folato (14).
Na remetilação, a He recebe um grupamento metil do 5-metilenotetrahidrofolato (5-MTHF, folato
circulante) ou da betaina para formar a metionina. O 5-MTHF, necessário à primeira alternativa desta
via, é gerado a partir do 5,10 metilenotetrahidrofolato (5,10 MTHF) em uma reação dependente da
enzima metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR). A reação com MTHF acontece em todos os tecidos
e depende da enzima metionina sintetase e de vitamina B12, além do folato adquirido da dieta. Já a
segunda alternativa, reação com betaína, é restrita às células hepáticas e renais, requer a ação da
enzima homocisteína metiltransferase e não depende de vitamina B12. Assim, uma vez regenerada a
metionina a partir do 5-MTHF ou da betaína, uma parte é utilizada na constituição de proteínas no
organismo e a outra, no fígado, é ativada por trifosfato de adenosina (ATP) para formar Sadenosilmetionina (11).
De acordo com Venâncio, este composto atua como doador universal de
grupos metil para diversos receptores de ácidos nucleicos, neurotransmissores, fosfolipídeos e
hormônios. Além disso, serve para formar S-adenosilhomocisteina, a qual se regenera a homocisteína,
propiciando o reinício de um novo ciclo de transferência do grupamento metil. (Figura 4).
29
Ciclo do Folato
TETRAHIDROFOLATO
METIONINA
ATP
5,10 MTHF
S-ADENOSILMETIONINA
MTHFR
5-MTHF
Metionina
Sintase +
Vit. B12
Doação de grupos metil
Hemetiltransferase +
Betaina
S- NOSILHOMOCISTEINA
HOMOCISTEINA
Figura 4: Metabolismo de Remetilação da He.
Quando há sobrecarga de metionina, a He entra no ciclo da transulfuração, tendo como objetivo
converter a metionina remanescente em cisteína para eliminação renal. A regulação desta via é
catalisada pela enzima cistationina beta sintetase (CβS), dependente da vitamina B6 como cofator (14).
Por intermédio desta via, a He é irreversivelmente condensada a serina que, sob ação da enzima CβS e
da vitamina B6, forma a cistationina. Subsequentemente, a cistationina é hidrolisada por uma segunda
enzima também dependente de vitamina B6, a ‫ץ‬-cistationase, para formar cisteina e α-cetobutirato. A
cisteína pode ser incorporada à glutationa, sendo, posteriormente, metabolizada a taurina e sulfatos
inorgânicos para, finalmente, ser excretada na urina (44) (Figura 5).
30
HOMOCISTEINA
Cistationina β-sintase
SERINA
Vit. B6
CISTATIONINA
 cistationase
Vit. B6
CISTEINA + α-cetobutirato
TAURINA + sulfatos
EXCREÇÃO RENAL
Figura 5. Metabolismo de transulfuração da He.
A imagem abaixo (Figura 6) ilustra as duas vias conjuntas do metabolismo da He.
31
Figura 6. Metabolismo da He. Extraído de PINTO et al., (14).
Estudiosos do metabolismo da He pontuam que, quando a He não é metabolizada a metionina ou a
cisteina por meio das vias expostas acima, sua porção excedente entra na circulação na forma de
frações plasmáticas. Uma pequena fração (2 a 5%) é encontrada na forma livre ou reduzida no plasma.
A fração maior, 70 a 80%, circula ligada a proteínas plasmáticas, especialmente albumina, e o restante
forma dissulfetos como homocistina (duas moléculas de He) e cisteína-homocisteína (11, 14, 17)
(Figura 7).
A figura 7 mostra as espécies moleculares de He no plasma e respectivas porcentagens.
32
Forma reduzida
HS – CH2 – CH2 – CH - COOH
CH2
Forma oxidada
CH2 – CH – COOH
S
NH2
CH2 – CH2 – CH – C00H
S
S
2-5%
Restante
NH2
CH2 – CH2 – CH – COOH
NH2
HE-CISTEINA
S
Proteína (albumina)
S
CH2 – CH – CH- C00H
HOMOCISTEÍNA(HE)
NH2
S – CH2 – CH2 – CH2 – C00H
NH2
HE
HE LIGADA A PROTEINAS
Restante
70 – 80%
Figura 7. Formas em que a He circula no plasma. Modificado de PINTO et al., (14).
As expressões He total (tHcy) e He plasmática referem-se à soma de todas as concentrações de He
nas modalidades livre, ligada a proteínas e na forma de dissulfetos (homocistina e cisteinahomocisteína), dando origem, segundo Santos e Andrade (2005), ao termo amplamente utilizado na
literatura denominado homocisteinemia ou pool total circulante de homocisteina no nível sérico (44).
Com relação às concentrações séricas consideradas normais para o pool de He circulante
(homocisteinemia), há divergências na literatura. Ueland et al. (45), consideram valores plasmáticos
normais em torno de 10 µmol/l, com uma variação entre 5 e 15 µmol/l para ambos os sexos. Já outros
defendem que estes valores variantes, embora referenciados como normais, devam oscilar entre 9 a 10
µmol/l. Vannuchi et al.. (46), registram valores diferenciados para homens e mulheres, sendo 8,0 a 14
normais para o sexo masculino e 6,0 a 12 para as mulheres, valores estes que permanecem dentro dos
limites normais variantes (5 e 15) citados por Ueland et al.. (45), independente do sexo. Concentrações
acima de 15 µmol/l, segundo Malinow et al. (47) caracterizam hiperhomocisteinemia, estado biológico
no qual há elevação exacerbada dos níveis séricos de He (8). Kang et al., (48) classificam a
hiperhomocisteinemia nas formas moderada entre 15 e 30 μmol/L, intermediária entre 31 e 100 μmol/L
e grave quando as concentrações forem maiores que 100 μmol/L .
Pesquisadores verificaram que a condição de hiperhomocisteinemia é determinada por várias questões
que interferem no metabolismo geral da He e alteram seus níveis plasmáticos. Tais questões, conforme
serão descritas no próximo item, incluem, especialmente, anormalidades genéticas que afetam as
funções das enzimas envolvidas no ciclo e fatores relacionados à nutrição, entre outros (6, 11, 17-18).
33
2.4 Hiperhomocisteinemia (HHe): fatores vitamínicos e genéticos
A etiologia da HHe é considerada multifatorial, sendo a mais comum, atribuída a distúrbios genéticos e
nutricionais (6, 11). Além destas causas, fatores fisiológicos, medicamentosos, condições clínicas e
aquelas relacionadas ao estilo de vida também contribuem para induzir hiperhomocisteinemia (6, 11,
17-18).
As alterações genéticas que podem comprometer as concentrações de He e desencadear HHe variam
de acordo com os distúrbios ocorridos nas vias do ciclo metabólico por remetilação ou transulfuração,
que afetam as funções das enzimas (17). Frequentemente, a hiperhomocisteinemia genética é
resultante de deficiência relacionada à atividade das enzimas CβS e MTHFR (11).
Na via da transulfuração, a deficiência homozigótica da CβS 844ins68 tem herança autossômica
recessiva, onde o cromossoma 21 (21q22.2) apresenta 33 mutações pontuais descritas e tipos
variados, de acordo com a população estudada (11, 14, 17). A incidência da deficiência dessa enzima
para indivíduos homozigotos é de, aproximadamente, 1:335 (11) e 1:200 (17) nascidos na população
em geral. Estes pesquisadores relatam que pacientes com mutação na atividade dessa enzima
desenvolvem homocisteinemia grave ou homocistinúria. Além disso, apresentam quadro clínico de
aterosclerose difusa, doença vascular arterial e venosa prematura, retardo mental, doença coronariana,
acidente vascular encefálico com prognóstico negativo, além de anormalidades esqueléticas. A
heterozigose para a CBS, conforme exposto por Venâncio et al. (11), Neves et al. (17)) e Pinto et al.,
(14), foi registrada em 30% a 40% da população com doença vascular precoce e , embora esteja
associada a HHe moderada, apresenta risco significativo aumentado para o desenvolvimento de
doenças cardiovasculares. Ambos registram que a frequência da mutação da CβS na população em
geral está estimada em 1%.
Polimorfismos na via da remetilação foram observados nos genes codificadores das enzimas do
metabolismo do folato, como a MS (metionina sintetase) 2756 A>G (Asp919Gly) e
metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR) 677C>T (Ala222Val) e 1298A>C (Glu 429Ala) (6, 18). Estes
pesquisadores apontam o polimorfismo 677C>T da MTHFR, localizado no cromossomo 1p36.3, como o
mais extensivamente estudado. Segundo eles, este polimorfismo funcional, causa termo-labilidade à
enzima por apresentar uma variante termolábil com atividade enzimática reduzida em mais de 60%,
causada por uma mutação pontual (677 C>T). Esta mutação foi identificada como missence C para T
no nucleotídeo 677 do genótipo, que gera uma substituição de uma valina por uma alanina no
34
aminoácido 222. Esse polimorfismo funcional em sua forma homozigota TT influencia,
significativamente, os níveis de He, levando à HHe (14, 17, 49).
Outra mutação pontual no gene da MTHFR foi descoberta por van der Put et al. (50). Esta é uma
mutação A para C no nucleotídeo 1298, que troca um glutamato por uma alanina, resultando também
em diminuição na atividade da enzima codificadora do gene (50).
A deficiência homozigótica da MTHFR 677 TT está associada a altos níveis de He, especialmente em
indivíduos com baixo status de folato (6). Neves et al., (17) referem que 8% da população geral é
homozigota para a variante termolábil desta enzima. Já Venâncio (11) assinala 5%. A homozigoze para
esta enzima pode resultar em HHe grave, caracterizada por doença arterial prematura e
tromboembolismo difuso, além de disfunção neurológica, retardo psicomotor e convulsões (11).
Neves et al. (17) evidenciam que a heterozigoze para a mutação da MTHFR não causa HHe. Esta
condição somente ocorre quando há deficiência de folato concomitante á deficiência da enzima.
Mutações relacionadas ao gene da MS 2756 A>G (Asp919Gly) podem cursar com HHe quando houver
deficiência de cobalamina (vitamina B12) ou na presença de defeito na formação de metil-cobalamina,
utilizada como co-fator da enzima (17). Os estudos de Kluijtimans et al. (6) indicaram que sujeitos com
deficiência homozigótica para a MS 2756 AA apresentam níveis de He mais altos se comparados aos
homozigotos 2756 GG e aos heterozigotos 2756 AG. Mutações do gene MS estão associados a
doença cardíaca isquêmica (17).
Outro fator relevante que se relaciona ao aumento da concentração plasmática de He tem como base
as alterações nutricionais, uma vez que a sobrecarga oral de metionina ou a ingestão inadequada de
vitaminas essenciais que funcionam como cofatores no metabolismo da metionina a homocisteína afeta
suas concentrações na circulação, já que ingestão inadequada destas vitaminas resulta na redução da
atividade enzimática nas vias, contribuindo para a HHe (8, 14). Vários pesquisadores concordam que o
estado nutricional deficiente parece ser o parâmetro mais importante na regulação endógena do nível
de He (6, 14, 18, 51). Kluijtimans et al. (6) enfatizam que os fatores nutricionais interferem mais no
controle dos níveis séricos de He total do que os fatores genéticos.
No âmbito nutricional, merecem destaque a vitamina B6 (piridoxina), a cianocobalamina (vitamina B12)
e ácido fólico (17). A piridoxina (vitamina B6) age como um cofator para a cistationina-b-sintetase
(CβS), enquanto que o ácido fólico e a cianocobalamina (vitamina B12) regulam as vias metabólicas
35
catalisadas pelas enzimas metilenotetraidrofolato redutase (MTHFR) e metionina sintetase,
respectivamente (8). A literatura mostra relação inversa entre os níveis plasmáticos destas vitaminas e
a concentração sanguínea de He e reporta que a suplementação medicamentosa ou nutricional pode
normalizar os níveis plasmáticos de He (17, 46) em adultos jovens (6, 52).
A vitamina B12 ou cianocobalamina é uma vitamina hidrossolúvel, componente da família das
cobalaminas, do complexo B, cuja síntese é realizada, exclusivamente, por microorganismos. Sua fonte
natural na dieta humana restringe-se a alimentos de origem animal como carne, leite e ovos. Exerce
várias funções no organismo, como ação essencial no metabolismo da He em reações bioquímicas,
sendo sua deficiência caracterizada por manifestações como distúrbios neurológicos, neuropatias
periféricas, anemia megaloblástica (anemia perniciosa), malformação fetal e HHe (53).
O Ácido fólico ou folato, termo genérico pelo qual é também conhecido, é a vitamina B9, uma vitamina
hidrossolúvel do complexo B. Na dieta, é obtido por meio de frutas, verduras e hortaliças de cor verdeescuras, particularmente, espinafre, couve e brócolis, incluindo outras fontes como leguminosas e
vísceras, sendo a principal, o fígado. Sua função no organismo relaciona-se à atividade da vitamina
B12, sendo ambos necessários para a síntese do ácido desoxirribonucleico (DNA), essencial nas
replicações celulares. Observa-se como resultado de sua deficiência, anemia megaloblástica, fadiga e
dor muscular difusa, distúrbios psiquiátricos, sendo o mais comumente observado depressão, além dos
sintomas causados por deficiências de vitamina B12 (54).
A vitamina B6 apresenta seis formas variantes, entre elas a piridoxina (54). Além de sua atuação no
metabolismo da He, esta vitamina é fundamental no metabolismo e síntese de muitas proteínas,
incluindo neurotransmissores cerebrais como dopamina, norepinefrina, serotonina, taurina, histamina e
ácido gama-aminobutírico (GABA) (14). Sua carência pode acarretar disfunções clássicas como
dermatite, seborréia, anemia microcítica, convulsões e depressão. A piridoxina é encontrada em
leguminosas, aves, soja e farelo de trigo (54).
Quanto aos fatores fisiológicos, os principais expostos na literatura que podem propiciar o aumento da
He são sexo, idade e as mudanças hormonais ocorridas na menopausa. Pesquisas demonstram que
os níveis de He, independente do sexo, aumentam com a idade, fato que pode ser explicado pela
diminuição da biodisponibilidade orgânica de vitaminas como folato, B6 e B12 que ocorre com a idade
e pela diminuição da produção ou na atividade enzimática fisiológica do metabolismo da homocisteína
(11, 17, 55-56). Especificamente com relação ao sexo masculino, sabe-se que a concentração sérica
36
de He encontrada nos homens saudáveis é 21% maior do que nas mulheres, o que mostra que os
homens parecem ter uma inclinação natural para maiores índices de He sérica do que o sexo feminino
(17). Nas mulheres após a menopausa, a concentração de He tende a aumentar em relação àquelas
pré-menopausa (55). Estudiosos atribuem a elevação da He no período pós-menopausa como
resultante à redução dos níveis de estrógeno que ocorre em mulheres durante e após esta mudança de
fase hormonal (55, 57).
Outro aspecto a ser considerado que se reflete na concentração de homocisteína na circulação é a
influência de fatores relacionados ao estilo de vida como o hábito do tabagismo, a falta de prática
regular de atividade física e o consumo excessivo de bebidas alcoólicas e café (11) .
Situações patológicas também podem cursar com aumento da He. Doenças como neoplasias
malignas, psoríase severa, hipotireoidismo, diabetes mellitus tipos I e II e insuficiência renal possuem
correlação com HHe (14). Dias et al. (8) ressaltam que pacientes com insuficiência renal crônica ou em
diálise apresentam He sérica duas a quatro vezes acima dos valores considerados como normais
segundo a literatura. Acrescenta ainda que, os valores elevados que esta população apresenta podem
ser resultantes de distúrbios no metabolismo da He e não de dificuldades na excreção renal decorrente
da doença. Ainda neste contexto de doenças que propiciam elevações da He circulatória, Venâncio et
al. (11) sustentam que fatores de risco classicamente conhecidos para doenças cardiovasculares em
adultos, como hipertensão arterial, colesterol total e LDL elevado, nível de HDL reduzido e obesidade,
também estão associados ao aumento da He.
O uso prolongado de medicamentos que afetam o metabolismo do folato ou das vitaminas B6 e B12
também podem aumentar as concentrações de He (8). Drogas anticonvulsivantes como fenitoína e
carbamazepina, o metotrexato (antagonista do folato), antagonistas da Vitamina B12 (óxido nítrico),
tiazídicos diuréticos (14), inibidores de vitamina B6 como azaribina (8) e fármacos antidiabéticos a
exemplo da metformina (9-10), entre outros são citados como favorecedores à condição de HHe.
A tabela 4 mostra, resumidamente, alguns dos fatores que podem desencadear HHe.
37
Tabela 4. Fatores causadores de Hiperhomocisteinemia
Genéticos
(mutações)
Cistationina
sintase (CβS)
Metionina
(MS)
Déficits
Nutricionais
β-
Fisiológicos
Vitamina B12
Idade
Vitamina B6
Sexo
masculino
sintase
Ácido Fólico
Metilenotetrahidrofolato
redutase (MTHFR)
Fatores
hormonais
como redução
do estrógeno
na menopausa
Aumento na ingestão
de metionina
Uso de drogas
(medicamentos)
Antidiabéticas
(metformina)
Condições
clínicas
Estilo de
vida
Insuficiência renal
crônica - IRC
Psoríase
Tabagismo
Lúpus eritematoso
Etilismo
Antagonistas da vit.
B12
Ciclosporina
Hipoteireoidismo
Uso abusivo
de café
Inibidores da vit. B6
Neoplasias
malignas
Transplantes
Sedentaris-mo
Anticonvulsivantes
(fenitoína
e
carbamazepina)
Antagonistas
do
folato (metotrexato)
Diabetes Mellitus
Agentes
hipocolesterolêmicos
Contraceptivos orais
Fonte: Modificado de PINTO et al., (14).
Da mesma forma que alguns fármacos podem induzir incremento da He plasmática, estudos mostram
que podem também contribuir para a redução dos seus níveis circulatórios. Pesquisas recentes têm
revelado relações entre menores concentrações de He e o uso de estatinas (58-60). Tais interações
seriam atribuídas ao efeito pleiotrópico das estatinas no organismo, a exemplo da sinvastatina (58, 61),
assunto abordado no tópico seguinte.
2.5 Sinvastatina
Descrição
A sinvastatina é um agente farmacológico que pertence à classe química das estatinas. Sua principal
indicação terapêutica é a redução do colesterol (62). Recomenda-se a administração oral de
sinvastatina, juntamente com a dieta para o tratamento das dislipidemias, efeito obtido pela redução
dos níveis sanguíneos de hipercolesterolemia e hiperlipidemia (63). Ferreira e Sato (62) assinalam
que, além de sua função primária como agente redutor do colesterol, há outros mecanismos por onde
as estatinas atuam no organismo, os quais estão sendo gradualmente elucidados por pesquisadores.
38
Composição química e propriedades farmacodinâmicas
Quanto à composição química, a sinvastatina é uma droga sintética, derivada de um produto de
fermentação do fungo Aspergillus terreus. Foi desenvolvida no início dos anos 50 no laboratório Merck,
quando o bioquímico Jesse Huff e os seus companheiros de pesquisa começaram a investigar a
biossíntese do colesterol. À época, mais especificamente, em 1959, a enzima HMG-CoA redutase (3hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A) foi descoberta como um dos principais fatores envolvidos na
produção do colesterol. Em face desta descoberta, vários cientistas foram estimulados a buscar um
meio eficaz para inibir a ação desta enzima no organismo. Assim, em 1979, Hoffman e seus colegas,
ao isolar os produtos da fermentação do Aspergillus terreus, descobriram o MK-733, um potente
inibidor da HMG-CoA redutase que, posteriormente, passou a ser conhecido como sinvastatina (64).
A HMG-CoA Redutase é uma enzima importante com função reguladora na produção do colesterol
intracelular no hepatócito, pois catalisa a conversão da HMG-CoA a partir do acetato em ácido
mevalônico (C6), processo que resulta na biossíntese do colesterol. Neste ponto, entra em cena a
sinvastatina com sua ação farmacodinâmica inibidora de forma específica, seletiva e competitiva a
atividade da HMG-CoA redutase. Após ingestão oral, a sinvastatina é hidrolisada ao seu
correspondente ß- hidroxiácido, principal metabólito e inibidor da HMG-CoA, impedindo assim a síntese
hepática do colesterol. Em resposta à redução de colesterol livre nos hepatócitos, a síntese de
receptores de LDL na superfície dos hepatócitos aumenta, levando à maior remoção de LDL
proveniente da corrente sanguínea que, por sua vez, induz uma maior redução de colesterol LDL
disponível no organismo. A droga mostra-se eficaz na redução das concentrações sanguíneas do
colesterol total, do colesterol ligado à lipoproteína de baixa densidade LDL-colesterol e do colesterol
ligado à lipoproteína de densidade muito baixa (VLDL), além dos lipídeos, da apolipoproteína B e dos
triglicérides plasmáticos, quando a resposta à dieta e a outras medidas não farmacológicas forem
insuficientes. A Sinvastatina também eleva o HDL-colesterol e, portanto, reduz a relação de
LDL10/HDL-colesterol e a relação colesterol total/HDL (63). A redução do colesterol se reflete na
diminuição do desenvolvimento de doenças cardiovasculares, o que consequentemente propicia a
queda na taxa de mortalidade.
Farmacocinética e dosagem terapêutica
Segundo Merck Sharp e Dohme (63), observou-se que a resposta do organismo à droga ocorre em um
intervalo de duas semanas e a resposta terapêutica máxima, em um período de 4 a 6 semanas. Os
39
efeitos hipolipemiantes resultantes do uso da sinvastatina são mantidos com a continuidade da terapia,
todavia com a interrupção do tratamento, os níveis de colesterol total retornam aos valores anteriores
ao início da terapia.
A dosagem terapêutica recomendada é de, geralmente, 20 ou 40mg por dia, em dose única, à noite,
dose esta que poderá ser ajustada para 80mg, de acordo com a prescrição médica (63).
Benefícios adicionais da sinvastatina
Uma análise no contexto da literatura revela que pesquisadores têm demonstrado grande interesse
pelos benefícios secundários da sinvastatina no organismo, benefícios estes conhecidos como efeitos
pleiotrópicos. Tais efeitos, reportados em diversos estudos realizados com estatinas, se caracterizam
por propriedades anti-inflamatórias e incluem ações imunomodulatória e antitrombogênica, melhora da
disfunção endotelial decorrente do aumento da liberação de óxido nítrico derivado do endotélio e,
ainda, por sua provável influência na melhora dos níveis circulatórios de homocisteína, relatam os
pesquisadores (21, 62, 65-66).
Ação pleiotrópica ou anti-inflamatória.
A ação anti-inflamatória das estatinas resulta, a princípio, na redução da concentração de lipoproteínas
ricas em colesterol no plasma (67). Os achados na literatura mostram que os efeitos anti-inflamatórios
da sinvastatina ocorrem por três mecanismos: a redução da disponibilidade celular dos radicais
isoprenóides, proteínas que servem como ligantes lipídicos para moléculas envolvidas em processos
de sinalização celular (66, 68); inibição da adesão de moléculas, tais como redução da expressão de
Moléculas de Adesão Celular (CAMs), as quais estão associadas ao recrutamento de células
inflamatórias; e redução da expressão de citocinas pró-inflamatórias como o fator de necrose tumoral
TNF-α e a interleucina IL-6, liberadas pelo tecido adiposo (68).
A inibição das proteínas isopreniladas ocorre através do efeito especifico inibidor das estatinas sobre a
HMG-CoA redutase, enzima que, conforme exposto anteriormente, cataliza a conversão do HMG-CoA
em mevalonato. Ao inibir a síntese de ácido mevalônico, o qual é precursor do colesterol, as estatinas
impedem a síntese de isoprenóides (ligantes lipídicos) derivados importantes e intermediários da via do
colesterol, tais como farnesilpirofosfato (FPP) e geranylgeranylpyrophosphate (GGPP) (69).
Estes intermediários protéicos atuam como ligantes lipídios anexos para a modificação pós-tradução de
uma variedade de proteínas, incluindo as proteínas da família GTPase, RAS, RHO e RAC. Com a
40
inibição da produção de FPP e GGPP acontecerá uma inativação das ações, por exemplo, de RAS e
RHO, respectivamente, já que a translocação do citoplasma para a membrana do RAS é dependente
da farnesilação e a translocação do RHO é dependente da geranilgeranilação (70).
O processo de ligação lipídica, traduzido como isoprenilação, é necessário para a associação dos
grupos de proteínas citados acima, à membrana plasmática, sendo essencial para suas atividades
biológicas (66). Cada membro da família das RAS possui funções específicas em termos de construção
do formato, motilidade, secreção e proliferação celular, enquanto a ativação do RHO é responsável
pela formação de complexos de adesão celular. Alterações no citoesqueleto de actina induzidas pelo
RHO podem afetar o transporte intracelular, transporte de membrana, a estabilidade de mRNA e
transcrição do genes. Estudos demonstram que a inibição da isoprenilação RHO causada pela ação
das estatinas geram efeitos nas paredes das células vasculares (71), nas paredes dos leucócitos (70) e
nos ossos (72).
O segundo efeito anti-inflamatório referenciado da sinvastatina é sua influência inibidora sobre a
expressão das CAMs. Entre elas, a Molécula de Adesão Intracelular-1 (ICAM-1) e a Molécula de
Adesão Celular Vascular-1 (VCAM-1) (73). As CAMs são moléculas de adesão com funções
específicas de ativação de quinases através do processo de fosforilação. Esse processo resulta na
indução da transcrição de citocinas, em aumento de expressão de células de proteína de membrana,
na produção de espécies reativas de oxigênio e no recrutamento de células inflamatórias (74).
Outro mecanismo endógeno no qual se observa a ação antiinflamatória da Sinvastatina é sua
interferência inibidora nas citocinas pró-inflamatórias. O fígado, em resposta a estas citocinas,
especialmente a interleucina-6 (IL-6), secreta um metabólito indicador de fase aguda às inflamações,
conhecido por Proteína C Reativa de Alta Sensibilidade (hs-PCR), que reflete um baixo grau de
inflamação sistêmica (75). Embora a hs-PCR seja um marcador de resposta inflamatória não
específica, estudos prospectivos mostram que a alta taxa de hs-PCR está relacionada como um fator
de risco independente para o aumento do risco de Doença Coronariana, Acidente Vascular Cerebral e
Infarto do Miocárdio (76).
Mecanismo de ação sobre níveis plasmáticos de Homocisteína
A terapia com estatinas têm demonstrado também uma ação benéfica sobre os níveis de plasmáticos
de homocisteína, reportam alguns pesquisadores (21, 65, 77). Especula-se que o mecanismo de ação
possa ser decorrente da ação farmacodinâmica e farmacocinética da droga sobre a redução das CAMs
41
que, ao serem reduzidas pelo uso de estatinas, contribuiriam, indiretamente, para diminuir a Hcy como
resultado do efeito antiinflamatório. Outros achados atribuem a modificação da He pela terapia com
estatinas como mediado por efeito biológico farmacogenético, devido a interações entre os
polimorfismos nos genes envolvidos no metabolismo da He (77). Estes pesquisadores descobriram,
entre outras evidências, que pacientes com variações genéticas no MTHFR 677C>T foram
beneficiados com a terapia com estatinas. Indivíduos com o genótipo CC mostraram algum efeito
protetor com estatinas, enquanto aqueles alocados nos grupos CT e TT,apresentaram efeito
significativamente protetor por estatinas (The GenHAT Study, 2008).
Todavia, há controvérsias e outras vertentes de pensamento salientam que não há evidências de que
as estatinas tenham efeito modificador sobre a He (20, 78), cujos resultados na literatura, embora
limitantes, parecem estar relacionados à dose dependente moderada a alta das drogas administradas.
Kitova et al. (59), mostraram em um estudo que, altas doses (80 mg) produziram uma diferença
significativa na diminuição da homocisteína total, já doses moderadas não mostraram efeito redutor da
He na pesquisa realizada.
Por isso, mais estudos são necessários para investigar os mecanismos moleculares de ação das
estatinas sobre os níveis de He, bem como sua relação dose-dependente para exercer efeitos
positivos.
2.6 Malondialdeído (MDA)
O Malondialdeído (MDA, C3H4O2) é um produto da peroxidação lipídica, tendo um relevante papel
como um biomarcador utilizado na indicação da ação dos radicais livres no organismo (13).
O processo de peroxidação lipídica celular inicia pelo ataque de espécies reativas de oxigênio (ROS) à
membrana, o que acarreta alterações em sua estrutura e permeabilidade, com consequente dano
celular pela oxidação sofrida. Um dos produtos gerados por esta peroxidação é o MDA (13).
A quantificação do MDA nos sistemas biológicos é um parâmetro importante que tem sido empregado
na avaliação do estresse oxidativo celular (13). O método utilizado para sua quantificação plasmática
consiste na reação do MDA com diferentes substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, denominadas
TBARS. Os valores de MDA são obtidos a partir de sua reação com duas moléculas do ácido
tiobarbitúrico (TBAR), em meio ácido e em alta temperatura. Esta reação é denominada de “teste de
substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico” – (teste MDA-TBARS).
42
Os valores de referência relatados na literatura para os níveis de MDA total no plasma apresentam
grande variabilidade, além de estar relacionados às condições experimentais empregadas nos ensaios
para quantificação (13). A literatura expõe valores de MDA plasmático para pessoas saudáveis em
torno de 0,138 ± 0,028µM, 2,16 ± 0,29µM, valores estes bastante diferentes dos obtidos por Sim et al.
(70) de 13,8 ± 1,32µM, Londero e Greco de 0,85 ± 0,25µM e Mao et al. de 0,426 ± 0,029µM (13, 70).
Diante da variação apresentada para os valores de referência, Antunes et al., (2008) (13) sugerem que
seja determinado um intervalo de referência individualizado para cada método desenvolvido na
determinação do MDA.
2.7 Proteína C reativa (hsPCR)
A proteína C reativa (PCR) é um marcador inflamatório de fase aguda sintetizada pelos hepatócitos, em
resposta ao estímulo das citocinas inflamatórias. Caracteriza-se por ser de fase aguda, uma vez que
apresenta meia vida plasmática curta, de aproximadamente, 19 hs (44).
Em 1930 foi descoberta e descrita por Tillet e Francis como uma substância presente no soro de
pacientes com doenças inflamatórias.
A determinação da concentração sérica da PCR vem sendo utilizada para detecção de estados
inflamatórios e infecções (35) sendo que baixas concentrações séricas, em torno de 0,072mg/dL, já
conferem risco aumentado do aparecimento de eventos cardiovasculares ao indivíduo (44).
Pesquisas recentes com adultos têm demonstrado uma associação entre PCR e altas concentrações
de triglicerídeos, LDL e insulina, baixas concentrações de HDL, hipertensão arterial (35), e obesidade
(44). A inflamação pode ser um fator inicial responsável pelas comorbidades associadas à obesidade
(35). Estes pesquisadores explicam que o tecido adiposo libera grandes quantidades de citocinas
inflamatórias, as quais estimulam a produção de PCR pelo Fígado, podendo associar-se ao
desenvolvimento de doenças cardiovasculares. As PCR’s reduzem o mecanismo de resposta à
insulina, promovem aumento da liberação de moléculas de adesão pelo endotélio, estimulam a
liberação hepática de fibrinogênio e ainda exercem aumento na expressão do fator tecidual nas
plaquetas (efeito pró-coagulante).
43
3. OBJETIVOS
Objetivo geral
Verificar se a terapia com sinvastatina 20 mg/dia por 45 dias altera os níveis plasmáticos de
Homocisteína em mulheres obesas.
Objetivos específicos
Correlacionar os níveis de He antes e após o tratamento com sinvastatina com as variáveis estudadas
(MDA, HsPCR, Vitamina B12, Ácido fólico, LDL, HDL, CT, idade e pressão arterial sistólica e
diastólica).
Verificar se o polimorfismo MTHFR 677C>T modula os níveis de He antes e após o tratamento com
sinvastatina.
44
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Casuística
Esta pesquisa é parte integrante de um projeto relativo ao tema Obesidade “Efeitos do tratamento com
sinvastatina sobre biomarcadores cardiovasculares, inflamatórios, angiogênicos e de obesidade em
mulheres obesas sem comorbidades”, devidamente aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP)
do Hospital Santa Casa de Misericórdia de Belo Horizonte (Anexo 1).
A população selecionada para participar do estudo foi esclarecida com relação aos propósitos da
pesquisa e aqueles que se mostraram de acordo, assinaram o Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido (TCLE) (Anexo 2).
4.2 Seleção das participantes do estudo
Trata-se de um estudo randomizado, mono cego realizado em duas etapas, no qual as participantes
selecionadas, atendidas no Centro de Especialidades Médicas da Santa Casa (CEM), foram
exclusivamente pacientes do sexo feminino, com idade entre 18 e 60 anos e obesas. A diferença de
idade observada entre os grupos (18 – 60 anos) ocorreu porque o propósito da pesquisa foi trabalhar
com mulheres sem hipertensão, diabetes e dislipidemia. Encontrar mulheres jovens sem comorbidades
foi fácil. Já mulheres com idade avançada sem nenhuma comorbidade associada, foi muito difícil
selecionar para participar do estudo. Por isso, a variação de idade foi grande. Todas as pacientes
recrutadas, após esclarecimento quanto aos objetivos da pesquisa, assinaram Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido, considerando riscos, benefícios e sigilo absoluto sobre os dados
informados.
A seguir, as voluntárias foram encaminhadas à primeira consulta para realização dos exames clínicos e
laboratoriais compostos por: Coleta de dados de história clínica, avaliação das condições de saúde,
pesagem (utilizando uma balança de bioimpedância que estima a porcentagem (%) de gordura total, a
% de água corporal, a massa muscular), coleta de dados antropométricos (altura, medida da
circunferência abdominal e do quadril, aferição da pressão arterial), primeira coleta de sangue para a
realização dos testes bioquímicos (glicemia jejum, insulinemia, colesterol total e frações, triglicérides,
45
proteína C Reativa (hsPCR), aminotransferase glutâmico-pirúvica (TGP), aminotransferase glutâmicooxalacética (TGO)) e prescrição de sinvastatina 20 mg/dia (ou placebo) para o tratamento, o qual teve
duração de seis semanas.
Após este período, foi realizada a segunda consulta, quando foram coletados novamente os dados
clínicos e antropométricos, retirada de material biológico para novos exames bioquímicos e suspensão
do uso da sinvastatina ou do placebo.
A amostra foi composta por 33 pacientes obesas (IMC ≥ 30 Kg/m2), divididas em 2 grupos: um grupo
formado por 25 pacientes que receberam o tratamento com sinvastatina (20mg/dia) e o segundo
grupo, composto por 8 pacientes tratadas com placebo.
Foram excluídas pacientes com hipertensão, Diabetes Mellitus e dislipidemias, gravidez, tabagistas,
que fizessem consumo crônico de álcool ou uso de medicamentos (anti-hipertensivos,
hipoglicemiantes, hipolipemiantes), que já tenham entrado na menopausa e sofrido cirurgia bariátrica.
4.3 Critérios de inclusão
Sexo feminino
Obesidade (IMC ≥ 30 kg/m2)
Faixa etária entre 18 e 60 anos
Concordância em participar do estudo e assinado o TCLE
4.4 Critérios de exclusão
Sexo masculino
Idade inferior a 18 anos e superior a 60
Existência de gravidez
46
Mulheres com IMC < 30 kg/m2
Terapia de reposição hormonal para ambos os grupos
Portadoras de neoplasias, hipertensão arterial sistêmica (HAS) e Diabetes Mellitus (DM) e
Dislipidemias.
Tabagistas, que apresentem consumo crônico de álcool ou façam uso de medicamentos (antihipertensivos, hipoglicemiantes, hipolipemiantes).
Não adesão ao tratamento de 6 semanas com sinvastatina 20mg/placebo 1 vez ao dia.
4.5 Amostras biológicas
As amostras de sangue venoso para obtenção do plasma foram coletadas em 4,5 mL com
anticoagulante ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), com o auxílio de tubos do sistema Vacuette®,
sendo rapidamente centrifugadas a 3.000 rotações por minuto (rpm) por 10 minutos para separação do
plasma. Em seguida, foram distribuídas em várias alíquotas, armazenadas em microtubos e
imediatamente estocadas à –80º C até o momento da realização das análises. As pacientes estavam
em jejum de 12 horas.
4.6 Delineamento experimental
Foi realizado com base em quatro parâmetros, a seguir:
4.6.1 Parâmetros Bioquímicos
Dosagem de Homocisteína total (tHcy).
Dosagem de Malondialdeído (MDA): Teste MDA-TBARS.
Dosagem de Vitamina B12 e Ácido Fólico
Análise polimórfica do MTHFR 677C>T por HRM PCR
47
Dosagem de Proteína C reativa ultra-sensível.
4.6.2 Parâmetros Antropométricos
Índice de massa corporal (IMC);
Circunferência abdominal (CA);
Relação circunferência quadril (RCQ).
4.6.3 Parâmetros Lipídicos
Lipoproteína de alta densidade (HDL);
Lipoproteína de baixa densidade (LDL);
Colesterol total (CT);
Triglicérides (TG);
Níveis de glicose sanguínea;
4.6.4 Parâmetros Clínicos
Idade
Pressão arterial sistólica (PAS)
Pressão arterial diastólica (PAD).
4.7 Métodos
4.7.1 Fatores de risco
48
Os critérios para os fatores de risco foram avaliados de acordo com as recomendações das III
Diretrizes Brasileiras sobre Dislipidemias e Prevenção de Aterosclerose definidos para hipertensos e
obesos (34, 79).
4.7.2 Parâmetros bioquímicos
4.7.2.1 Dosagem de Homocisteína total (tHcy): método utilizado na determinação dos níveis
plasmáticos da Homocisteína
A Homocisteína (He) é um produto intermediário produzido a partir do metabolismo proteico do
aminoácido essencial metionina, proveniente da dieta (6).
A dosagem de tHcy (homocisteína total) foi realizada pela técnica de Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência (CLAE) com detector fluorimétrico, técnica também conhecida por HPLC – High Performance
Liquid Chromatography. A técnica de CLAE é considerada uma técnica sensível e seletiva para análise
da homocisteína devido a sua alta especificidade na determinação deste aminoácido. Entretanto, outra
técnica como a quimioluminescência, foi descrita e pode também ser utilizada para quantificação da
homocisteína (43)
Utilizando a técnica de CLAE, os valores de referência para homocisteína estratificada por sexo é de
6,0 a 12,0 mol/L para mulheres, e de 8,0 a 14 mol/L para homens (46).
Ueland et al. (45) também utilizaram a técnica de CLAE para determinar os níveis de homocisteína em
indivíduos sadios e definiram os níveis entre 5 e 15,0 mol/L, podendo ser considerados ainda como
normais.
A hiperhomocisteinemia é classificada em moderada, intermediária e grave e correlacionam com os
intervalos de concentrações entre 15 a 30 μmol/L, 30 a 100 μmol/L e > 100 μmol/L, respectivamente.
O método utilizado foi descrito por PFEIFFER et al. (80). O preparo da amostra consistiu na redução de
grupamentos tiós da homocisteína plasmática pelo agente redutor tris-(2-carboxietil)-fosfina (TCEP),
com subsequente desproteinização com o ácido tricloroacético (TCA). Foi utilizado o agente
derivatizante sal de amônio 7-Fluorobenzo-2,1,3- oxadiazol-4-ácido sulfônico (SBD-F) para a
derivatização da homocisteína reduzida. E, como padrão interno utilizado na análise a cistamina.
Após a derivatização da homocisteína, 80 µl do sobrenadante foi injetado no equipamento de CLAE
para obtenção dos cromatogramas. O equipamento utilizado foi o da marca Agilent® série 1200 com
49
detector fluorimétrico, com comprimentos de onda de excitação e emissão de 385nm e 515 nm,
respectivamente. A fase móvel utilizada na análise foi composta por tampão acetato pH 5,5 com fluxo
de 1,1 mL/min. Uma coluna cromatográfica C18 Techesphere da Nova Analytica® foi utilizada. A
concentração da homocisteína foi determinada por meio de Curva de Calibração.
As análises de tHcy foram realizadas no Laboratório de Toxicologia da Faculdade de Farmácia da
Universidade Federal de Minas Gerais – UFMG, com a colaboração das professoras Iêda de Fátima O.
Silva e Josianne Nicácio Silveira.
4.7.2.2 Dosagem de Malondialdeído (MDA): Determinação de substâncias reativas ao ácido
tiobarbitúrico (teste MDA-TBARS)
O método utilizado para a quantificação plasmática dos valores de MDA consiste na reação do MDA
com duas moléculas do ácido tiobarbitúrico (TBAR), em meio ácido e em alta temperatura, que gera um
cromógeno róseo em função da reação. Esta reação é denominada de “teste de substâncias reativas
ao ácido tiobarbitúrico” – (teste MDA-TBARS), onde o cromógeno róseo é mensurado para a obtenção
dos valores de MDA plasmático .
Para a análise foram utilizados tubos de ensaio, plasma, reagentes e soluções específicas. Dessa
forma, em tubos de ensaio previamente identificados, foram pipetados 100μL plasma já
homogeneizado em vórtex, branco e padrão. Em seguida, foram adicionados a cada tubo de ensaio, 1
ml do reagente de cor TBA-TCA-HCl (TBA: 0,375%,TCA:15%, HCL: 0,25N).
Após, as amostras foram submetidas a banho-maria para aquecimento a 100º C de temperatura,
durante 30 minutos, sendo na sequência, resfriadas, em banho de gelo, por 5 minutos e centrifugadas
por 10 minutos a 3000rpm (1358,57g). Passados os 10 minutos, 200 μL da solução sobrenadante
foram pipetados para processamento das análises, as quais foram realizadas em placa de 96 poços e
detecção por leitura espectrofotométrica a 535nm.
Para a curva de calibração, foram pipetados em duplicata 200 μL dos padrões de solução
Tetrametoxipropano (TMP), de acordo com a tabela 2 e do branco.
Tabela 5: Concentrações utilizadas para a curva de calibração do teste MDA
Ponto da curva
P1
P2
Concentração (uM)
250,00
125,00
50
P3
P4
62,50
31,25
4.7.2.3 Dosagem de Vitamina B12 e Ácido Fólico
Para fins de investigação laboratorial dos níveis de He em relação às concentrações plasmáticas das
vitaminas essenciais ao metabolismo da He, neste estudo foram dosadas as vitaminas B12 e os níveis
de ácido fólico da população de estudo.
A tabela abaixo apresenta os níveis séricos laboratoriais considerados normais em adultos para
dosagem de vitaminas B12 e do Ácido fólico.
Tabela 6. Valores de referência para dosagem de vitamina B12 e ácido fólico.
Vitamina
Valor de Referência
Tipo de Amostra
Unidade Nacional
B12
(cianocobalamina)
200 - 835
Soro
pg/ml
Folato (ácido fólico)
3 - 20
Soro
ng/ml
Fonte: Protocolos clínicos dos exames laboratoriais - SES/UFMG/2009.
A literatura expressa que há limitações de sensibilidade e controvérsias para determinar os valores
relativos às concentrações de vitamina B12, haja vista que fatores como gravidez e carência de folato
podem determinar falsos valores, assim como falsos aumentos podem ser encontrados na presença de
doenças mieloproliferativas (53), ou devido ao uso de medicamentos, a exemplo da metformina, que
reduz a absorção da cobalamina no Intestino delgado (10).
A dosagem da vitamina B12 e do Ácido Fólico nos plasmas dos indivíduos em estudo foi realizada por
kits comerciais de acordo com as instruções do fabricante. O kit utilizado para a análise da vitamina
B12 foi “IMMULITE/ IMMULITE 1000 Vitamin B12 – Diagnostic Products Corporation”, e para a
análise do Ácido Fólico ““IMMULITE/ IMMULITE 1000 Folic Acid – Diagnostic Products Corporation”.
51
4.7.2.4 Análise polimórfica do MTHFR 677C>T por HRM PCR
O polimorfismo no gene methylenotetrahydrofolato redutase (MTHFR) 677C>T foi analisado por HRM
(High-resolution melting) pós-PCR pela visualização da curva de melting ou curva de dissociação do
ácido desoxirribonucleico – DNA através do kit “Type-it HRMTM PCR – Qiagen”. Esse método é
amplamente utilizado em biologia molecular para detecção de mutações e polimorfismos genéticos,
pois permite a identificação de variações em sequências de ácidos nucleicos (DNA/RNA).
A extração do DNA do sangue foi realizada pelo método Salting-out segundo Sambrook. Para a PCR foram
utilizados os seguintes iniciadores:
Foward: 5’TGAGGCTGACCTGAAGCACTTGAA3’
Reverse 5’ATGTCGGTGCATGCCTTCACAAAG3’.
Para a análise foi preparado um mix contendo 5µl da solução de Type It HRM PCR (Qiagen) fornecida
pela Illumina, 0,7µl de cada primer foward e reverse na concentração de 0,7µmol e 2,6µl de água
DNase free para cada analise a ser realizada. Após a preparação, 9µl do mix foram coloca dos em cada
poço da placa de análise juntamente com 1µl da amostra a ser analisada deixando um poço somente
com o mix servindo este como branco.
Após a preparação da placa de análise, esta foi colocada na Eco™ Real-Time PCR System para a
realização da PCR . A reação foi submetida aos seguintes ciclos de amplificação: um ciclo de 5 minutos a
95ºC, 40 ciclos de 10 segundos a 95ºC (desnaturação) / 30 segundos a 55ºC (anelamento) / 30 segundos a
72ºC (extensão).
Após a amplificação concluída, o amplicon foi submetido à variação de temperatura no ciclo de 95º C
por 15 segundos, 55ºC por 15 segundos e 95ºC por 15 segundos novamente para a separação das
hélices e liberação do amplicon. A determinação do genótipo foi realizada pela curva de dissociação. As curvas
obtidas foram analisadas pelo equipamento e comparadas com os padrões de genótipos previamente
selecionados e em comparação com os padrões, o genótipo das amostras foram classificadas. O
equipamento para o HRM utilizado foi o HRM Rotor-gene Q (Qiagen, Courtboeuf, France) e os
parâmetros para a análise foram estabelecidos conforme determinado pelo fabricante (Uniscience).
4.7.2.5 Dosagem de Proteína C reativa de Alta sensibilidade
Para a quantificação plasmática da hsPCR foi utilizado o método de ensaio imunoenzimático (ELISA)
utilizando-se o kit Hu CRP da Invitrogen® Corporation, seguindo as instruções do fabricante.
52
Inicialmente, os reagentes do kit foram devidamente preparados, de acordo com as instruções do
fornecedor. Em seguida, prepararam-se os padrões. Em um tubo de ensaio com 200µl de diluente, foi
adicionado 200µl da solução padrão a 50ng/ml fornecido pelo kit e homogeneizado para obter o padrão
de concentração de 25ng/ml. Dessa solução recém-preparada, foram retirados 200µl, volume este que
foi colocado em outro tubo com 200µl de diluente, seguido de homogeinização, a fim de se obter o
padrão de 12,5ng/ml. O mesmo processo se repetiu para os padrões de 12,5ng/ml, 6,25ng/ml,
3,12ng/ml, 1,56ng/ml e 0,78ng/ml .
Após o preparo de todas as soluções-padrão, foi adicionado em cada poço da placa de analise 100µl
da solução de diluição fornecido pelo kit e 50µl de cada padrão, amostras e controle, sendo a placa,
imediatamente, coberta com um adesivo e incubada em temperatura ambiente por 2 horas. Ao término
da incubação, a placa foi lavada com o tampão de lavagem também fornecido pelo kit por quatro vezes,
cuidadosamente, para se obter a total remoção do tampão de lavagem após o término do
procedimento.
Depois, acrescentou-se em cada poço 200µl de anticorpo policlonal anti-hsPCR conjugado com
peroxidase de rábano. A placa foi coberta novamente com adesivo e incubada em temperatura
ambiente por mais 2 horas. Após a incubação, repetiu-se novamente o processo de lavagem por quatro
vezes visando remover todo o tampão de lavagem depois do procedimento. Após a lavagem adicionouse em cada poço 200µl do mix de reagentes de cor fornecidos pelo kit e a placa foi incubada em
temperatura ambiente por 30 minutos protegida da luz. Decorridos os 30 minutos de incubação, foi
acrescentado 50µl da solução de parada fornecida pelo kit em cada poço e a densidade colorimétrica
de cada poço foi analisada em um leitor de microplacas a 540nm.
Com as leituras dos padrões, foi feita uma curva padrão e as concentrações das amostras foram
obtidas através da curva.
4.7.3 Parâmetros antropométricos
Os critérios para aferição dos parâmetros antropométricos seguiram as normas recomendadas pela
Associação Brasileira para o Estudo da Obesidade e da Síndrome Metabólica (ABESO, 2009) (26).
4.7.3.1 Índice de Massa Corporal (IMC)
53
Para a obtenção do IMC, foi necessário aferir o peso, medido por uma balança e a altura calculada por
um estadiômetro. Os valores obtidos foram aplicados na fórmula abaixo:
IMC= PESO (Kg)
(ALTURA)2 (m2)
A OMS classifica o IMC de acordo com os valores seguintes:
Abaixo do peso: < 18,5 kg/m2
Peso normal: 18,5 a 24,9 kg/m2
Sobrepeso: ≥ 25,0 kg/m2
Obesidade grau I: 30,0 a 34,9 kg/m2
Obesidade grau II: 35,0 a 39,9 kg/m2
Obesidade grau III: ≥ 40 kg/m2
4.7.3.2 Circunferência Abdominal (CA)
A circunferência abdominal foi medida com auxílio de uma fita métrica, tendo como localização padrão
para a mensuração o ponto entre a última costela e a crista ilíaca, conforme orientado pela OMS.
Segundo recomendações da OMS, as medidas estabelecidas como ponto de corte para o aumento do
risco cardiovascular em mulheres e homens estão descritas a seguir:
Mulheres: ≥ 80 cm
Homem: ≥ 94 cm
4.7.3.3 Relação Cintura Quadril (RCQ)
A RCQ foi calculada a partir da mensuração da circunferência abdominal dividida pela medida da
circunferência do quadril.
Após a obtenção dos dados, foi aplicada a seguinte fórmula:
54
RCQ= Circunferência abdominal
Circunferência do quadril
A OMS considera como ponto de corte os valores a seguir:
Mulheres: ≥ 0,85
Homem: ≥ 0,90
4.7.4 Parâmetros lipídicos
Os resultados dos parâmetros lipídicos colesterol total (CT) e suas frações Lipoproteína de alta
densidade (HDL) e Lipoproteína de baixa densidade (LDL), além de triglicérides foram obtidos por meio
de busca aos prontuários das participantes, cujas dosagens foram realizadas no Serviço de Patologia
Clínica que atende a Santa Casa de Belo Horizonte.
4.7.5 Parâmetros Clínicos
Idade
Pressão arterial sistólica (PAS) e Pressão arterial diastólica (PAD):
A medição da PA foi realizada segundo diretrizes da Sociedade Brasileira de Cardiologia, que
recomenda condutas adequadas para a correta medição da pressão arterial como preparo do paciente,
emprego da técnica padronizada e uso do equipamento próprio, o qual apresenta dimensões da bolsa
para diferentes circunferências de braço e que deve estar devidamente calibrado para o uso. Obesos
ou pacientes que possuem braços com circunferência maior que 50 cm, requerem manguitos mais
longos e largos, para que não haja superestimação da pressão arterial. Na inexistência de manguito
próprio, indica-se a realização da medida da PA no antebraço. O pulso recomendado para ausculta em
obesos é o radial, em detrimento do braquial (34). A PA do grupo de estudo foi aferida de acordo com
as determinações propostas.
55
4.8 Análise estatística
Foi utilizado o programa PRISM GraphPad Versão 3.0 para realizar as análises e confecção dos
gráficos. Os parâmetros clínicos, antropométricos, bem como os hemostáticos foram primeiramente
submetidos ao teste de normalidade. Quando a distribuição apresentava-se normal, os dados foram
analisados com estatística paramétrica realizando o teste t de Student pareado. Quando a distribuição
não era normal, os dados foram usados testes estatísticos não paramétricos de Mann-Whitney.
As correlações entre os diversos parâmetros foram avaliadas utilizando Spearman ou Pearson
dependendo do teste de normalidade. Foram consideradas como diferenças significativas valores de
p≤0,05.
56
5. RESULTADOS
Os resultados seguintes iniciam-se com a exposição das principais características das participantes do
estudo e estão todos representados por meio de tabelas e figuras. Com o propósito de facilitar o
entendimento e a forma pela qual foi realizada a dinâmica do processo, cada etapa analisada foi
representada por uma pergunta seguida da respectiva resposta e interpretação, tendo em vista atender
aos nossos objetivos.
5.1 Caracterização das participantes do estudo
As participantes do estudo foram reunidas em dois grupos: a) mulheres tratadas com sinvastatina
20mg/dia por seis semanas (n = 25) e b) mulheres tratadas com placebo por seis semanas (n = 8). O
material biológico foi coletado em dois momentos, antes e após o tratamento, tanto para o grupo com o
medicamento quanto para o grupo com o placebo.
Na Tabela 7 estão apresentadas as informações sobre o perfil clinico das participantes dos grupos
estudados, antes e depois do tratamento.
Não foi observada nenhuma diferença significativa nos parâmetros analisados entre os grupos tratados
com sinvastatina e com placebo antes do tratamento. Todos os parâmetros clínicos estavam
equilibrados (p > 0,05).
57
Tabela 7 – Perfil dos grupos estudados
Sinvastatina
Placebo
Parâmetros
Antes
Depois
Antes
Depois
25
25
8
8
IMC (Kg/m²)
34,4 ± 1,0
34,6 ± 1,0
34,6 ± 1,7
34,7± 1,7
CA (cm)
104,6 ± 8,2
102,8 ± 7,0
105,1 ± 7,9
103,1 ± 10,7
RCQ
0,88 ± 0,07
0,87 ± 0,08
0,89 ± 0,06
0,89 ± 0,07
CT (mg/dL)
178,4 ± 36,6 146,5 ± 47,7* 186,1 ± 35,0
188,2 ± 35,1
HDL C (mg/dL)
44,9 ± 13,2
LDL C (mg/dL)
115,2 ± 35,2 83,63 ± 44,3* 117,0 ± 32,2
122,7 ± 31,0
TRIGLICÉRIDES (mg/dL)
120,4 ± 9,8
115,6 ± 11,9*
122,5 ± 8,9
118,8 ± 11,3
PAD (mmHg)
69,2 ± 8,1
66,4 ± 6,4
71,2 ± 11,3
67,5 ± 7,1
PAS (mmHg)
91,3 ± 29,4
75,2 ± 28,7*
125,0 ± 43,8
112,6 ± 44,8
GLICOSE JEJUM (mg/dL)
92,8 ± 8,9
95,0 ± 9,0
91,8 ± 12,3
91,8 ± 9,7
VITAMINA B12 (pg/ml)
479 ± 172
430 ± 209
436 ± 120
436 ± 182
ÁCIDO FÓLICO (ng/ml)
14,0 ± 2,6
14,5 ± 2,6
14,7 ± 2,7
14,7 ± 2,5
MDA (M)
12,3  0,9
8,5  0,7*
13,9  3,1
13,2  2,9
hsPCR (mg/dl)
0,16 ± 0,03
0,10 ± 0,06*
0,16 ± 0,07
0,14 ± 0,07
N
47,8 ± 14,2
41,7 ± 8,4
41,5 ± 8,3
IMC (índice de massa corporal); CA (circunferência abdominal); RCQ (relação cintura-quadril); CT
(colesterol total); PAS (pressão arterial sistólica); PAD (pressão arterial diastólica); HDL (lipoproteína de
alta densidade); LDL (lipoproteína de baixa densidade); hsPCR (proteína C reativa de alta
sensibilidade); Valores expressos em média ± DP(desvio padrão). Análise estatística: teste t de
Student pareado. * p < 0,05 quando comparados ao grupo basal.
58
5.2 Sobre os efeitos da sinvastatina. Qual são os efeitos esperados e pleiotrópicos
da Sinvastatina?
Após o tratamento, conforme esperado, houve mudança significativa nos parâmetros lipídicos no grupo
tratado com 20mg/dia de sinvastatina. A tabela 7 mostra um decréscimo significativo (p<0,05) nos
níveis de Colesterol 17,88% (178,4 ± 36,6 vs 146,5 ± 47,7; p = 0,0008), LDL 27,43% (115,2 ± 35,2 vs
83,63 ± 44,3; p = 0,0015), Triglicérides 3,98% (120,4 ± 9,8 vs 115,6 ± 11,9; p = 0,0132) e um acréscimo,
embora não significativo, de 6,45% nos níveis de HDL (44,9 ± 13,2 vs 47,8 ± 14,2; p > 0,05), efeitos estes
esperados da terapia com sinvastatina, que é a redução nos níveis dos lipídeos. No grupo tratado com
placebo, não foram observadas nenhumas destas alterações (p > 0,05).
Com relação ao efeito pleiotrópico da sinvastatina, espera-se que, após o tratamento, a droga exerça
ação anti-inflamatória. Observa-se na tabela 7, diminuição de 37,5% nos valores de hsPCR (0,16 ±
0,03 vs 0,10 ± 0,06; p < 0,0001), marcador inflamatório high sensivity utilizado para dosagem neste
estudo, o que assinala o efeito pleiotrópico da sinvastatina. Observamos redução significativa (p<0,05)
nos níveis de MDA após o tratamento com sinvastatina (12,3  0,9 vs 8,5  0,7). Nota-se também que
houve decréscimo nos valores da pressão arterial sanguínea após o tratamento com a sinvastatina
20mg/dia, entretanto tal redução somente foi significativa no valor da PAS (91,3 ± 29,4 vs 75,2 ± 28,7;
p = 0,02). Com relação ao grupo tratado com placebo, não foi observada nenhuma diferença
significativa nestes parâmetros (p > 0,05).
5.3 Houve déficit de vitaminas na população estudada antes e após o tratamento
com sinvastatina?
Com o objetivo de verificar uma possível carência nutricional nestes pacientes que poderia influenciar
uma elevação nos níveis de He devido à deficiência de vitamina B12 (200-835 pl/dl) e de Ácido fólico
(3-20 pg/dl), foram quantificados os níveis sorológicos destas vitaminas nos grupos em estudo.
Entretanto, conforme demonstrado na tabela 7, nossos resultados mostraram que não houve diferença
significativa (p>0,05) entre o nível dessas vitaminas antes e depois do tratamento nos grupos em
estudo. Os valores expressos em média  EP foram: vit. B12 antes do tratamento 479±172 vs depois
do tratamento 430±209 e ácido fólico antes 14,0 ± 2,6 vs depois 14,5±2,6. Esses resultados mostram
59
que a população estudada não possui déficit destas vitaminas, já que os níveis plasmáticos
encontrados estavam dentro dos valores normais expressos na literatura.
5.4 Houve diferença entre os níveis de He basal e pós-tratamento com
sinvastatina?
Ao final do tratamento, foi observada diferença significativa (p<0,05) entre os níveis de He basal e póstratamento no grupo tratado com Sinvastatina 20mg/dia (8,4±2,5 vs 7,1±1,3 µM; p=0,026). Já no grupo
placebo, nenhuma diferença foi encontrada (8,3±1,3 vs 8,2±1,9 µM; p > 0,05) (Figura 8).
H o m o c iste ín a ( M )
1 0 .0
*
7 .5
5 .0
2 .5
0 .0
Basal
Placebo
Basal
Sinvastatina
Figura 08 - Níveis plasmáticos de He (M) basal e pós-tratamento dos grupos tratados com
Sinvastatina 20mg/dia e placebo. Valores expressos em média ± EP *p<0,05 comparado ao basal.
5.5 Há correlações entre os níveis de He, as variáveis estudadas MDA, HsPCR,
LDL, HDL, CT, idade e HAS e a terapia com sinvastatina?
Para analisar a possível interferência que o tratamento com a Sinvastatina poderia proporcionar na
relação entre a homocisteína e os parâmetros analisados, realizamos o teste de correlação de Pearson
com os valores obtidos antes e depois do tratamento com a sinvastatina. (Tabela 8).
Observamos correlação significativa (p=0,05) entre os níveis de He e CT após o tratamento. Esse
resultado demonstra que a diminuição nos níveis de He leva a redução dos níveis de CT após o
tratamento com sinvastatina. Verificamos ainda, correlação entre os níveis de He e LDL após o
tratamento, entretanto, essa correlação não foi significativa (p>0,05). Além disso, antes do tratamento,
60
houve correlação entre os níveis de He e MDA, mas essa correlação também não foi significativa
(p>0,05). Para as outras variáveis não houve correlação com os níveis de He. Abrimos um parêntesis
com relação ao critério idade, pois a literatura expressa que este fator pode influenciar o aumento dos
níveis de He. Todavia, apesar da diferença de idade entre os grupos (18 – 60 anos) ser grande, a
maioria dos pacientes estudados tem idade na média dos 30 anos. Conforme mostra a tabela 8, não
encontramos correlação quanto a este parâmetro clínico. Os valores de He basal e pós-tratamento se
mantiveram idênticos, independente da idade dos pacientes (0,08; 0,68 vs 0,08; 0,68; p > 0,05).
Tabela 8. Correlação entre os níveis de He e os parâmetros biológicos analisados antes (basal) e após
o tratamento com sinvastatina.
Parâmetros
Idade (anos)
IMC (Kg/m²)
PAS (mmHg)
PAD (mmHg)
Colesterol Total (mg/dL)
HDL (mg/dL)
LDL (mg/dL)
MDA (µM)
hsPCR (mg/dL)
He
Basal
r = 0,08
p = 0,68
r = 0,24
p = 0,25
r = -0,10
p = 0,61
r = -0,02
p = 0,92
r = -0,33
p = 0,11
r = 0,005
p = 0,97
r = -0,31
p = 0,12
r = -0,38
p = 0,06
r = -0,03
p = 0,86
He
Pós-tratamento
r = 0,08
p = 0,68
r = 0,10
p = 0,64
r = -0,12
p = 0,57
r = 0,14
p = 0,50
r = 0,40
p = 0,05
r = 0,14
p = 0,49
r = 0,38
p = 0,06
r = 0,33
p = 0,11
r = -0,01
p = 0,94
r= coeficiente de correlação de Pearson
p<0,05 estatisticamente significativo
He (Homocisteina); MDA (Malondialdeido); hsPCR (Proteina C Reativa high sensivity); IMC (Índice de Massa
Corporal); PAS e PAD (Pressão arterial sistólica e diastólica); HDL (lipoproteína de Alda densidade); LDL
(lipoproteina de baixa densidade); mg/dL(miligrama/decilitro).
61
5.6 O polimorfismo MTHFR 677C>T modula os níveis de He antes e após o
tratamento com sinvastatina?
Com o propósito de verificar se o polimorfismo no gene MTHFR 677C>T modula os níveis de He antes
e após o tratamento, dividimos nossa amostra de acordo com o genótipo, sendo 13 pacientes com o
genótipo CC e 12 pacientes com os genótipos CT+TT. (Figura 9). Verificamos que os níveis basais de
He foram maiores nos genótipos CT+TT (9,4±0,87) comparado com o genótipo CC (7,5±0,55). No
entanto, a diferença entre os grupos não foi significativa, embora tenha uma tendência à significância
(p=0,07). Após o tratamento com sinvastatina houve redução de 10% nos níveis de He no grupo com
genótipo CC (6,8±0,4), mas essa diminuição não foi significativa (p>0,05). No grupo com genótipos
CT+TT houve redução de 21% da He após o tratamento (7,53±0,3), todavia essa diferença também
não foi significativa (p=0,07). Esses resultados sugerem que a variante T leva ao aumento nos níveis
de He. Além disso, parece que na presença da variante T há melhor resposta à terapia com
sinvastatina (redução de 21%), sugerindo que a presença do polimorfismo influencie na resposta dessa
droga.
15
P
P ==00,07
,0
H cy ( M)
P
P ==00,10
,0 7
10
5
0
Basal
Sinvastatina
CC
Basal
Sinvastatina
CT +T T
Figura 9 - Níveis plasmáticos de He (μmol/L) basal e pós-tratamento dos genótipos CC e CT +TT
tratados com Sinvastatina 20mg/dia. Valores expressos em média ± EP.
n: CC = 13; CT+TT = 12
P=0,10
Basal CC vs CT+TT p=0,07 P= 0,07
62
6. DISCUSSÃO
Sabe-se que a homocisteína representa um fator de risco independente para as doenças
cardiovasculares, como obesidade, quando ocorre uma condição conhecida como Hiperhomocisteinemia (HHe), resultante da elevação exagerada de seus níveis plasmáticos.
Sabe-se ainda que os fatores envolvidos nesta condição são multifatoriais e que a busca pela
elucidação dos mecanismos endógenos pelos quais a HHe relaciona-se às patologias
cardiovasculares, bem como a identificação de abordagens preventivas tem sido alvo de pesquisas.
Neste contexto, novas vertentes de pensamento referem efeitos pleiotrópicos das estatinas como um
fator positivo na redução dos níveis plasmáticos de He, embora estes estudos ainda sejam
inconclusivos (19-21).
Os resultados obtidos neste estudo demonstraram que a sinvastatina reduziu os níveis de He da
população estudada. Todavia, este achado nos induz ao questionamento sobre os mecanismos
endógenos que levaram à redução da He, se foi por um efeito direto da sinvastatina ou por outros
mecanismos que se correlacionam, biologicamente, os quais podem estar ter influenciado
indiretamente a redução da He. Estes supostos mecanismos, discutiremos a seguir.
Com relação aos efeitos esperados da sinvastatina, sugerimos que a redução nos níveis de He possa
ter ocorrido indiretamente em decorrência do efeito da sinvastatina sobre os níveis de colesterol. A
literatura sustenta que as estatinas são drogas de escolha indicadas para o tratamento da
hipercolesterolemia e que o alvo da terapia são os pacientes com necessidade de redução da
lipoproteina de baixa densidde (LDL-colesterol). Assim, entre seus efeitos-alvo, espera-se que haja
redução do LDL colesterol (59, 81).
Conforme mostrado em nossos resultados, após o tratamento com sinvastatina, houve um decréscimo
significativo nos níveis de colesterol total (CT) e de Homocisteina (He), com uma correlação
significativa, pois ambos (CT e He) decresceram. Quanto ao LDL vs He, ambos também apresentaram
uma redução. Embora a correlação entre LDL e He tenha sido positiva, não chegou a ser significativa.
Acreditamos, com relação a este achado, que a pequena redução nos níveis de He concomitante à
diminuição do LDL pode não ter sido significativa em função do “n” amostral baixo (25 pacientes), fato
este que pode ter limitado nossos resultados.
Sugerimos, portanto, que a redução da He observada em nossos resultados tenha acontecido em
função de algum mecanismo biológico indireto e específico associado ao efeito primário da sinvastatina
63
em reduzir o colesterol (CT). Acreditamos, ainda, que os resultados poderiam ter sido melhores se a
amostra constitutiva do estudo tivesse sido maior.
A sinvastatina, além de sua função primária como agente redutor do colesterol, detém capacidades
anti-inflamatórias e antioxidantes, também conhecidas como pleiotrópicas. Essa ação pode melhorar a
resposta inflamatória de várias formas, podendo, por exemplo, ser benéfica na redução de indicadores
de respostas agudas à inflamação como as interleucinas e a Proteína C Reativa (20, 59, 65).
Pesquisadores referem que a Proteína C Reativa de Alta Sensibilidade (hs-PCR) é um marcador de
processo inflamatório subcrônico que reflete baixo grau de inflamação sistêmica. Por isso, é um
marcador importante utilizado para dosar resposta inflamatória crônica, como no caso da obesidade
(75).
A partir do exposto e com base nos resultados obtidos, refletimos se a redução da He poderia ter sido
influenciada pelos efeitos pleiotrópicos da sinvastatina sobre os níveis de Proteína C Reativa de Alta
Sensibilidade (hs-PCR), marcador inflamatório utilizado neste estudo. Tais efeitos, conjecturamos,
poderiam ter contribuído, indiretamente, para a redução da He. Este é o segundo mecanismo suposto
que poderia guardar relação com a diminuição da He, já que a literatura aponta interação intrínseca
entre elevação da He secundária ao aumento dos níveis de hsPCR, cujo mecanismo seria mediado
pela ação das estatinas.
Embora os dados na literatura forneçam evidências desta interação, não se observou no presente
estudo correlação específica entre hsPCR e He. De acordo com este achado, podemos sugerir que
possivelmente haja, além da hsPCR, outros mecanismos independentes antiinflamatórios que podem
atuar sobre a He e acarretar a redução de suas concentrações na circulação, tendo em vista que não
pudemos confirmar estas alegações encontradas na literatura. Dessa forma, descartamos a
possibilidade da redução da He observada em nossos resultados ter sido decorrente de interações com
a hsPCR.
Estudos demonstram que há relação intrínseca entre os níveis de MDA e as concentrações sanguíneas
de He, no sentido de que pacientes com altos índices de MDA tenham tendência a apresentar
elevações da He. O MDA é um parâmetro importante e amplamente indicado para avaliar o estresse
oxidativo celular no organismo (13). Nossos resultados demonstraram diminuição nos níveis de MDA
após o tratamento com sinvastatina, todavia não obtivemos resultados significativos na correlação entre
MDA e He. Com relação a este resultado, somos levados também a desconsiderar a hipótese de que a
redução da He detectada possa estar relacionada à diminuição do EO, analisado através do marcador
MDA.
64
Assim, expostas as hipóteses sobre os possíveis mecanismos biológicos que poderiam estar
envolvidos na redução dos níveis plasmáticos de He encontrados neste trabalho, acreditamos que a
diminuição da He que detectamos, pode ter ocorrido em razão de um mecanismo biológico relacionado
à diminuição do CT.
Com relação ao polimorfismo, não observamos relação entre os níveis de He com os genótipos CT+TT.
Contudo, verificamos que após o tratamento houve diminuição com tendência a significância nos níveis de He
nos pacientes com os genótipo CT+TT, o que nos leva à hipótese de que pacientes portadores do alelo “T”
sejam melhores respondedores à terapia com sinvastatina na redução dos níveis de He.
A literatura mostra que dentre os polimorfismos mais citados que induzem a elevações nos niveis de
He plasmática, o MTHFR 677C>T, em sua forma homozigota TT é o que mais influencia as
concentrações de He, as quais tendem à condicão de HHe (6, 18, 49). Segundo estes pesquisadores, a
substituição de C por T no nucleotideo 677 do gene MTHFR resulta na redução da atividade da enzima
MTHFR e na condição de HHe, especialmente, quando esta mutação estiver associada a baixo status
das principais vitaminas reguladoras do metabolismo. Isso explica porque pacientes com genótipo CC
apresenta índice menor de He em relação aos genótipos CT + TT, onde a presença do alelo T eleva,
geneticamente, as taxas da He.
Apesar dos resultados de nossos experimentos não terem alcançado um “p” significativo, nós
conseguimos perceber que, após o tratamento com sinvastatina, houve o que chamamos de “ tendência à
significância “ no grupo que carrega o alelo T. Esse fato nos induz a sugerir que a forma homozigota TT
do polimorfismo MTHFR 677C>T, responde melhor à terapia com sinvastina do que o genótipo CC, o
quail, em nível basal, tende a apresentar a He dentro da normalidade. Não obstante a literatura
apresente discordâncias para a concentração sérica de He, os valores expostos estão em torno de 10
µmol/l, com uma variação entre 5 e 15 µmol/l (45). Mais uma vez somos levados a acreditar que,
nossos resultados poderiam ter sido mais satisfatórios se nosso “n” (CC = 13; CT+TT = 12) tivesse sido
maior.
É relevante trazer a questão da influência dos fatores vitamínicos nos níveis séricos de He,
considerando-se que a literatura coloca a carência nutricional como mais promissor dos índices
aumentados de He do que as variações genéticas encontradas na população.
Kuijtmans et al. (6) referem que a contribuição genética para a condição de HHe está estimada em,
aproximadamente, 9% comparado a 35% de influência à elevação em decorrência dos déficits
nutricionais das vitaminas reguladoras do metabolismo proteico da He. Para investigar este fator, nós
então realizamos a dosagem destas vitaminas em nossa população de pacientes e constamos que a
65
população estudada não apresentava déficit nutricional. Essa constatação nos levou a descartar a
influência de vitaminas nas variações da He, uma vez que os níveis vitamínicos tanto antes quanto
depois do tratamento estavam dentro dos valores de referência indicados como normais (tabelas 6 e 7).
66
7. LIMITAÇÕES
Amostra: acreditamos que os resultados obtidos teriam sido mais expressivos se “n” amostral tivesse
sido maior. Tal fator pode ter limitado nossos resultados.
A amostra foi composta por 33 pacientes obesas, divididas em um grupo formado por 25 pacientes
(grupo tratado com sinvastatina) e um segundo grupo composto por 8 pacientes (grupo tratado com
placebo). Em função desse “n” baixo, a análise realizada com os genótipos (CC = 13; CT+TT = 12)
ocorreu como uma curiosidade de pesquisa em se investigar possível existência de modulação do
polimorfismo nos níveis de He em presença da droga.
67
8. CONCLUSÃO
Concluímos que a terapia com sinvastatina 20 mg/dia por 45 dias reduziu de modo significativo os níveis
plasmáticos de Homocisteína em mulheres obesas na faixa etária de 18 a 60 anos de idade sem
nenhuma comorbidade além da própria obesidade e que a redução observada pode ter ocorrido
indiretamente via redução do colesterol, efeito primário da sinvastatina. Apesar de termos encontrado
redução dos níveis séricos de LDL e do MDA após o tratamento, não encontramos correlação destes
parâmetros com a diminuição da Homocisteína. Além disso, verificamos que polimorfismo MTHFR
677C>T modula os níveis de He tanto antes quanto após o tratamento com sinvastatina. Maiores
estudos elucidativos destes mecanismos são necessários para a identificação de novas estratégias terapêuticas
de prevenção da hiperhomocisteinemia.
68
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72
10. ANEXOS
10.1 Anexo 1
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Efeitos do tratamento com sinvastatina sobre biomarcadores cardiovasculares, inflamatórios,
angiogênicos e de obesidade em mulheres obesas sem comorbidades.
Somos do Instituto de Ensino e Pesquisa da Santa Casa de Belo Horizonte e estamos desenvolvendo uma
pesquisa chamada “Efeitos do tratamento com sinvastatina sobre biomarcadores cardiovasculares,
inflamatórios, angiogênicos e de obesidade em mulheres obesas sem comorbidades” no Centro de
Especialidades Médicas - CEM. Estudaremos o efeito da sinvastatina em pacientes portadores de obesidade,
uma doença que é caracterizada pelo excesso de gordura corporal acumulada no tecido adiposo, com várias
implicações para a saúde.
Evidências indicam que o excesso de tecido adiposo visceral (presente em obesos e pessoas com sobrepeso)
está intimamente relacionado às várias disfunções metabólicas, incluindo resistência à insulina, dislipidemia,
aumento da pressão arterial, alterações da coagulação e do processo inflamatório o que leva ao
desenvolvimento do risco cardiovascular. Pesquisas apontam as estatinas como capazes de melhorar estas
disfunções metabólicas.
A sinvastatina, pertencente á classe das estatinas, além de ser importante na redução do colesterol LDL, age
sobre os níveis de vários biomarcadores relacionados a estas disfunções.
Estamos, então, realizando esse trabalho com o objetivo de determinar se a terapia com sinvastatina é capaz de
corrigir os níveis de marcadores encontrados no sangue de portadores de obesidade. Você está sendo
convidada a participar deste estudo por estar apresentando sintomas característicos da obesidade. Para
realização do mesmo, será necessário realizar uma coleta de sangue venoso (20 ml). Depois da coleta você irá
receber os comprimidos de sinvastatina (ou placebo) que deverão ser tomados diariamente durante 8 semanas.
Novas avaliações clínicas serão realizadas quando o tratamento for finalizado. O tratamento com sinvastatina é
amplamente utilizado e seus efeitos adversos graves são muito raros. Embora a finalidade medicamentosa seja
o tratamento, sabe-se que todo medicamento pode oferecer algum risco para a saúde.
Você pode se recusar a participar do estudo ou mesmo retirar o seu consentimento a qualquer momento, sem
que isto altere o seu tratamento no CEM.
Se você concordar em participar do estudo, isto não vai implicar em nenhuma vantagem pessoal ou financeira
para você, assim como, sua desistência, não implicará em nenhuma desvantagem ou mudança na realização do
seu tratamento. Garantimos ainda que a sua identidade não será revelada em nenhum momento do estudo ou
durante a publicação dos resultados em revistas científicas. Os resultados desse estudo somente serão
utilizados para aumentar os conhecimentos da medicina no estudo da Obesidade. Os resultados estarão
guardados com o pesquisador e lhe serão entregues se você desejar.
Eu,________________________________________entendi tudo que foi explicado sobre a pesquisa e concordo
em receber a sinvastatina (ou placebo) e realizar os exames laboratoriais para a pesquisa “Efeitos do
tratamento com sinvastatina sobre biomarcadorescardiovasculares, inflamatórios, angiogênicos e de
obesidade em mulheres obesas sem comorbidades”. Eu assinei e recebi uma cópia dessa autorização.
73
Data e local:__________________________________________________________
Assinatura do paciente:__________________________________________________
Assinatura do pesquisador:_______________________________________________
Núcleo de Pós-Graduação e Pesquisa
Instituto de Ensino e Pesquisa
Santa Casa de Belo Horizonte
Rua Domingos Vieira, 590. Pós-Graduação
Santa Efigênia. CEP: 30150-221
Belo Horizonte - MG
Fone/Fax: 31 3238-8838
74
10.2 Anexo 2