universidade federal de ouro preto

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO – UFOP
INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E BIOLÓGICAS – ICEB
DEPARTAMENTO BIODIVERSIDADE, EVOLUÇÃO E MEIO AMBIENTE – DEBIO
LUANA DA SILVA FREITAS
INFLORESCÊNCIAS
DA
HOLOPARASITA
DE
RAÍZES
LANGSDORFFIA
HYPOGAEA (BALANOPHORACEAE) COMO RECURSO CHAVE PARA UMA
FAUNA GENERALISTA NA ESTAÇÃO SECA
OURO PRETO – MINAS GERAIS
2012
F866i
Freitas, Luana da Silva.
Inflorescências da holoparasita de raízes Langsdorffia Hypogaea
(Balanophoraceae) como recurso chave para uma fauna generalista na
estação seca [manuscrito] / Luana da Silva Freitas - 2012.
68f.: il., color; grafs.; tabs.; mapas.
Orientador: Prof. Dr. Sérvio Pontes Ribeiro.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto.
Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Departamento de Biodiversidade,
Evolução e Meio Ambiente. Programa de Pós-Graduação em Ecologia de
Biomas Tropicais.
Área de concentração: Evolução e Funcionamento de Ecossistemas.
1. Ecossistemas montanos - Teses. 2. Estratégias reprodutivas - Teses.
3. Morfologia vegetal - Teses. 4. Predação (Biologia) - Teses. 5. Formiga Brachymyrmex sp - Teses. I. Universidade Federal de Ouro Preto.
II.
Título.
CDU: 574.4:581.4
Catalogação: [email protected]
LUANA DA SILVA FREITAS
INFLORESCÊNCIAS
DA
HOLOPARASITA
DE
RAÍZES
LANGSDORFFIA
HYPOGAEA (BALANOPHORACEAE) COMO RECURSO CHAVE PARA UMA
FAUNA GENERALISTA ASSOCIADA À ESTAÇÃO SECA.
Dissertação apresentada ao Colegiado do Programa de Pós Graduação em Ecologia
de Biomas Tropicais da Universidade Federal de Ouro Preto como parte dos
requisitos para obtenção do título de Mestre em Ecologia de Biomas Tropicais
Banca Examinadora:
Orientador: Prof. Dr. Sérvio Pontes Ribeiro
Departamento de Evolução e Biodiversidade, Instituto de Ciências Exatas e
Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto.
Profa. Dra. Ana Paula Fortuna Perez
Departamento de Evolução e Biodiversidade, Instituto de Ciências Exatas e
Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto.
Profa. Dra. Rosy Mary dos Santos Isaias
Universidade Federal de Minas Gerais,
Departamento de Botânica.
Instituto
de
Ciências
Biológicas,
AGRADECIMENTOS
Muitas pessoas foram importantes colaboradoras e incentivadoras desse trabalho,
agradeço a todas elas e especialmente:
Ao meu pai, José de Freitas por facilitar meus campos com suas “engenhocas
científicas” e minha mãe Lourdes por manter a comida sempre fresquinha e
quentinha e compreender minha ausência à mesa.
Aos meus irmãos e em especial minha irmã por me ensinar tanto com seu amplo
conhecimento.
Aos meus bichos, Nina e Barriga por me aliviarem a tensão.
Ao meu noivo e melhor amigo pela companhia na vida e no campo, sem se importar
com os hematófagos e as madrugadas “congelantes” de julho.
Ao meu orientador Prof. Dr. Sérvio Pontes Ribeiro pelos preciosos ensinamentos, na
ciência e na vida e por ter acreditado em mim. Obrigada pelos atendimentos aos
domingos de manhã e dia das mães (mesmo que relutante).
Ao meu co-orientador Prof. Dr. Hildeberto Caldas de Sousa pelo apoio, incentivo e
pela amizade. Minha eterna gratidão e respeito.
Ao colaborador Prof. Dr. Leandro Márcio Moreira por participar desse trabalho
mesmo que diante de tantas dificuldades. Obrigada por não desistir e pelos
valiosíssimos ensinamentos aos quais pretendo dar continuidade.
Ao Prof.Dr. Diego Demarco pela receptividade e conhecimentos imensuráveis.
Ao Eng. Florestal, amigo e mestre Alberto Vieira de Mello Matos (IEF/MG), por ser o
grande responsável por tudo isso e ter me mostrado “ o caminho das flores da terra”,
me acompanhando e incentivando desde o início.
Ao pesquisador Leandro Cardoso, pelos esclarecimentos sobre essa planta
fantástica e misteriosa.
Às minhas ajudantes de campo Érica Felestrino, Eliane Rangel, Thaís Rosada e à
Carolina Morais pelas “missões impossíveis”.
Aos professores e pesquisadores Dr. Leonardo Galetto (Universidad Nacional de
Córdoba), Dr. Gianfranco Curletti (Museo Civico di Storia Naturale, Italy), Dr. Paolo
Audísio (Sapienza Universitá di Roma, Italy), Dra. Renata Guerra (LBBM/UFOP), Dr.
Gregório Ceccantini, (USP), Dr. Udson Santos (UFOP), Dr. Rubem Ávila
(Unipampa), Msc. Leandro Scoss, Msc Flávio Siqueira, Ivan Fiorini, Msc. Roberth
Fagundes pela Identificação dos insetos, disponibilização de materiais e ricas
discussões.
A todos do Laboratório de Ecologia Evolutiva de Insetos de Dossel (onde fiz grandes
amizades) e Sucessão Natural e do Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular
pelo apoio e descontração, em especial Karina Barbosa, Roberta Versiani, Isabel
Braga, Cíntia Monteiro, Walmir Silva e Vítor Fernandes amei conviver com vocês.
Ao secretário Rubens, o melhor de todos, obrigada pela ajuda e compreensão.
Aos meus queridos amigos “bambas”, por me tornarem uma pessoa mais feliz.
À Fapemig pela concessão de bolsa de mestrado.
Ao Programa de Pós Graduação em Ecologia de Biomas Tropicais da Universidade
Federal de Ouro Preto.
LISTA DE FIGURAS
Fig.1. Mapa de distribuição da família Balanophoraceae no mundo ............................. 10
Fig.2. Morfologia externa de um indivíduo de Langsdorffia hypogaea
MART..........................................
20
Fig.3.Distribuição espacial dos agrupamentos de L. hypogaea em sua área de
ocorrência no Parque Estadual do Itacolomi ................................................................. 22
Fig.4. Aspecto de um agrupamento de inflorescências femininas de L.hypogaea....
23
Fig.5. Aspecto das estruturas reprodutivas de L.hypogaea ........................................... 28
Fig.6. Microscopia eletrônica de varredura das flores de L.hypogaea ........................... 29
Fig.7. Época de pluviosidade nos anos de estudo e sua correlação positiva com a
fenofase botão de L. hypogaea nos anos de 2010 e 2011. Época de ocorrência do
período reprodutivo da planta e da fenofase botão em 2010 e 2011 ...
30
Fig. 8. Número de indivíduos nas fenofases floração de L.hypogaea, frutos imaturos
e frutos maduros em 2010 e 2011, com seus respectivos picos de atividade e
época de duração .......................................................................................................... 32
Fig.9. Região vegetativa subterrânea de L.hypogaea, senescente no período de
pós-reprodução em 2010 .............................................................................................. 34
Fig. 10. Visitas às inflorescências de L.hypogaea nos períodos noturno e diurno
pelas principais ordens de artrópodes ocorrentes nas inflorescências da
planta...............................
39
Fig.11. Aspectos de predação às inflorescências de L. hypogaea ................................ 40
Fig.12. Corte longitudinal de um fruto múltiplo de L.hypogaea mostrando as regiões
utilizadas para a extração do DNA genômico ............................................................... 60
Fig.13. Aspecto do produto final de extração do DNA (pelete) de L. hypogaea
retirado de brácteas, escapo e eixo da inflorescência ................................................... 62
Fig. 14. Eletroforese em gel de agarose 1% corado com brometo de etídio
caracterizando a obtenção do DNA genômico extraído de 3g de tecido de
L.hypogaea retirado de amostras necrosadas com o uso de CTAB 7% e CTAB
2%.Produto final de PCR-RAPD realizado a partir de tecidos frescos com o
oligonucleotídeo S118..................
63
Fig. 15. Dendrograma de similaridade genética baseado no critério UPGMA ............... 67
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Animais visitantes das inflorescências de Langsdorffia hypogaea, número
de visitas por maior taxa, porcentagem de flores visitadas por menor taxa e
recursos consumidos ......................................................................................................37
Tabela 2. Identificação dos oligonucleotídeos RAPD testados para o estudo de L.
hypogaea, suas respectivas sequências de nucleotídeos e o polimorfismo expresso
por cada um deles...........................................................................................................66
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO GERAL .......................................................................................... 7
1.1. O HÁBITO PARASÍTICO ................................................................................. 7
1.2. FAMÍLIA BALANOPHORACEAE..................................................................... 9
1.3. FAUNA VISITANTE ....................................................................................... 11
2. CAPÍTULO 1: INFLORESCÊNCIAS DA HOLOPARASITA DE RAIZES
LANGSDORFFIA HYPOGAEA (BALANOPHORACEAE) COMO RECURSO CHAVE
PARA UMA FAUNA GENERALISTA ASSOCIADA À ESTAÇÃO SECA .................. 13
2.1. NTRODUÇÃO.............................................................................................. 18
2.2. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................ 19
2.2.1. ANISMO DO ESTUDO ............................................................................... 19
2.2.2. AL DO ESTUDO E DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ............................ 20
2.2.3. MORFOLOGIA FLORAL ............................................................................ 23
2.2.4. FENOLOGIA REPRODUTIVA .................................................................... 24
2.2.5. VISITANTES FLORAIS .............................................................................. 25
2.3. ESULTADOS ................................................................................................. 26
2.3.1. MORFOLOGIA FLORAL ............................................................................ 26
2.3.2. FENOLOGIA REPRODUTIVA .................................................................... 29
2.3.3.VISITANTES FLORAIS ................................................................................ 34
2.4. DISCUSSÃO ................................................................................................... 40
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 44
4. APÊNDICE ........................................................................................................... 51
7
1. INTRODUÇÃO GERAL
1.1. HÁBITO PARASÍTICO
A maioria das angiospermas conhecidas é autotrófica. No entanto, existe um
número significante de plantas parasitas que adotam o heterotrofismo total ou
parcial, buscando suas fontes de carbono, nutrientes e água em outros organismos
(Nickrent, 2002). Algumas plantas parasitas são adaptadas a viverem em ambientes
perturbados
por
atividades
antrópicas,
geralmente
são
habitat-específicas,
dependentes da comunidade ecológica onde suas hospedeiras estão inseridas
(Musselman & Mann, 1977; Nickrent, 2002; Watson et al, 2007). A interação plantaplanta pode ocorrer nas partes aéreas, como é o caso da família Loranthaceae ou
de forma subterrânea, através das raízes, como as Balanophoraceae.
De acordo com seus padrões nutricionais, essas plantas podem ser
classificadas em duas categorias, hemiparasitas e holoparasitas. As hemiparasitas
são clorofiladas e fotossintéticas durante parte de seu ciclo de vida, sendo o
fenômeno presente em Lorantaceae, Opiliaceae, Santalaceae e Scrophulariaceae.
As holoparasitas são totalmente aclorofiladas e, portanto, não fotossintéticas. Obtêm
água e nutrientes através do xilema e floema de plantas hospedeiras, algumas delas
parasitando raízes (Nickrent, 2002). O holoparasitismo ocorre em Balanophoraceae,
Cynomoriaceae,
Hydnoraceae,
Rafflesiaceae,
Cuscutaceae,
Lennoaceae
e
Orobanchaceae, sendo apenas Cynomoriaceae, Hydnoraceae, Lennoaceae e
Balanophoraceae, parasitas de raízes (Nickrent, 2002). Através de fixação via
haustório, as parasitas retiram nutrientes e água da hospedeira célula a célula,
conectado ao xilema por haustórios. (Nickrent, 2002). Os haustórios são uma
8
espécie de raíz modificada que promove o contato morfológico e fisiológico entre a
planta e seu hospedeiro (Kuijt, 1969).
Embora a maioria das plantas parasitas cresça na parte exterior da
hospedeira, existem algumas espécies que possuem o hábito endoparasítico, cujos
tecidos são praticamente incorporados aos da hospedeira (Kuijt, 1969), só
possuindo as estruturas reprodutivas livres, como é o caso do gênero Pilostyles
(Apodanthaceae).
Segundo Ejeta (2005), essa peculiaridade é determinada pela forma com a
qual essas plantas interagem com suas hospedeiras, fator que as tornam muitas
vezes importantes agentes patogênicos no setor agrícola de alguns países. O
parasitismo pode ter um efeito que leva desde o enfraquecimento do hospedeiro,
causando prejuízos no seu investimento em biomassa e estruturas reprodutivas, até
sua morte. Um conhecido exemplo é o gênero Striga (Orobanchaceae), uma erva
holoparasita de raízes que ataca plantações em muitas regiões da África, parte da
Ásia e Estados Unidos, tendo com principais hospedeiros, dentre outras culturas, o
milho (Zea mays L.), sorgo (Sorghum bicolor (L.) Moench) e o arroz (Oryza sativa L.)
(Dörr, 1997). Uma das maiores dificuldades em se combater essa planta está em
seu hábito hipógeo, que permite que sua identificação somente ocorra quando o
parasitismo já está intimamente estabelecido (Ejeta et al., 1991; Ejeta, 2005), ou
seja, na época reprodutiva, quando as flores podem ser visualizadas.
Estudos fisiológicos e bioquímicos têm sido realizados no intuito de melhorar
o entendimento sobre estas interações. Um caso bastante discutido é o strigol, um
composto químico liberado pelas plantas hospedeiras que induz a germinação das
sementes parasitas e a posterior formação dos haustórios, que por sua vez surgem
após receptarem um segundo sinal (Ejeta, 2005). Estudos realizados com
9
Scrophulariaceae (Estabrook e Yoder, 1998; Yoder, 1999; Yoder, 2001) mostraram
que esses sinais são flavonóides e outros compostos fenólicos, tais como gás
etileno, e que dentro de cerca de 24 horas após captar essa substância, já é
possível
visualizar
o
crescimento
do
tecido
haustorial
parasítico.
Esse
comportamento de germinação e formação de haustório após contato com a
rizosfera da hospedeira também foi observado por Govindappa e Shivamurthy
(1976) para Balanophora abbreviata Blume. Entretanto, a maioria dos mecanismos
de contato, crescimento e escolha de hospedeiro é completamente desconhecida.
De fato, para holoparasitas subterrâneas, devido à dificuldade de acesso, até
mesmo o entendimento básico sobre arquitetura e estrutura populacional é escasso
ou inexistente.
1.2. FAMÍLIA BALANOPHORACEAE
Balanophoraceae é uma família de angiospermas constituída por espécies
herbáceas, dióicas, raramente monóicas, aclorofiladas e holoparasitas de raízes. Os
indivíduos são formados basicamente por um rizoma subterrâneo dotado de
haustórios responsáveis pelo parasitismo e inflorescências carnosas, unissexuais ou
hermafroditas circundadas por folhas modificadas em brácteas (Falcão, 1975), de
aspecto coriáceo, que assim como o rizoma, são desprovidas de clorofila e
estômatos (Kuijt e Dong, 1990).
A família possui distribuição quase exclusivamente tropical (Fig. 1), com
casos raros nas regiões subtropicais e temperadas, e é representada por 18 gêneros
e 44 espécies (Hansen, 1980). No Brasil, são descritos seis gêneros: Helosis,
Scybalium, Lophophytum, Lathrophytum, Ombrophytum e Langsdorffia e as
11
seguintes espécies: Helosis cayennensis var. cayennensis (Swartz) Sprengel,
Helosis cayennensis var. mexicana (Liebm.) B. Hansen, Lophophytum
leandri
Eichl., Lophophytum mirabile subsp. Mirabile Schott & Endl. e Langsdorffia hypogaea
Mart. (Falcão 1975; Hansen, 1980), Scybalium fungiforme Schott & Endl. e
Langsdorffia heterotepala (para a região fluminense do Rio de Janeiro - Cardoso et
al. 2011). Existe uma grande carência de informação sobre a área de distribuição
destes taxa devida a pouca coleta e identificação incorreta de algumas coleções.
Figura 1 – Mapa de distribuição
www.parasiticplant.siu.edu
da família Balanophoraceae
no
mundo. Fonte:
Diferentemente dos gêneros Helosis (Hsiao et al 1993), Ombrophytum
(Mauseth et al,1992) e Dactylanthus (Moore 1940), o padrão haustorial de
Langsdorffia hypogaea é complexo, sendo essa interface parasita/hospedeira
constituída de dois tipos de organização (Hsiao et al, 1994): uma simples e limitada,
formada apenas pelos feixes de L. hypogaea e uma composta, formada por uma
íntima ligação entre os tecidos vasculares da planta hospedeira e da parasita,
aspecto denominado quimeral. Segundo Hsiao et al. (1994), essa característica
10
representa uma vantagem adaptativa em relação à estrutura simples, por aumentar
a habilidade da parasita na translocação de nutrientes para si. Outro aspecto
importante da espécie é o fato do parasitismo ocorrer através da penetração de
elementos traqueais da parasita, onde não há contato direto entre os vasos do
xilema de ambas (Hsiao et al. 1993; Mauseth et al. 1992).
1.3. FAUNA VISITANTE
A fauna edáfica associada a raízes de plantas parasitas, no geral formigas e
besouros, é considerável, mas estas interações são parcialmente estudadas, sendo
a maioria dos estudos descritivos e qualitativos. O coleoptera Hydnorobius hydnorae
(Belidae) tem sido registrado em plantas de Hydnoraceae (Marvaldi, 2005), já
Alloxycorynus
bruchi
Heller
foi
coletada
em
flores
de
Ombrophytum
(Balanophoraceae) e dois exemplares do gênero Oxycorynus (Belidae), foram
coletados em Lophophytum, pertencente à mesma família. Um novo gênero de
Curculionidae, nomeado como Balanophorobius, foi descrito por Anderson (2005)
como parasita de outra espécie de Balanophoraceae, que o autor sugere ser Helosis
cayennensis. A espécie holoparasita de raízes Cytinus hypocistis (Cytinacae), foi
documentada por de Vega et al. (2009) como sendo polinizada por dez diferentes
espécies de formigas, uma de Halictidae (Hymenoptera), uma de Halictidae e uma
de díptera. A espécie indiana Balanophora abbreviata Blume, reportada por
Govindappa e Shivamurthy (1975) foi observada sendo visitada por abelhas da
espécie Apis floreaI enquanto as espécies Balanophora kuroiwai Makino e B.
tobiracola Makino são visitadas por formigas, baratas, mariposas e moscas,
(Kawakita e Kato, 2002). Na Costa Rica, as inflorescências dos gêneros Helosis e
12
Corinae servem de atrativos para moscas (Gómez, 1983) e no Brasil, a espécie
amazônica Lophophytum mirabile, polinizada por pequenos coleópteras, dentre eles,
duas espécies da família Nitidulidae, e pilhada por abelhas, como documentado por
Borchsenius e Olesen (1990).
O único mamífero registrado até o momento visitando espécies de
Balanophoraceae, foi o lêmure de Madagascar Propithecus diadema, que Irwin et al.
(2007) observaram forrageando Langsdorffia sp. e Cytinus sp. (Cytinaceae). Os
mesmos autores ainda relatam que esse comportamento de forrageio no chão
utilizando o olfato para localizar o alimento, é pouco comum dentre os primatas.
Outro relato foi feito por Ecroyd (1996), que descreve vários aspectos da ecologia de
Dactylanthus taylorii Hook.f. e sua polinização por morcegos e ratos.
12
2. CAPÍTULO 1:
LANGSDORFFIA
INFLORESCÊNCIAS
HYPOGAEA
DA HOLOPARASITA DE
(BALANOPHORACEAE)
COMO
RAÍZES
RECURSO
CHAVE PARA UMA FAUNA GENERALISTA NA ESTAÇÃO SECA
LUANA DA S. FREITAS2; RUBEM S. ÁVILA3; DIEGO DEMARCO.4;
HILDEBERTO C SOUSA2 AND SÉRVIO P. RIBEIRO2
2
Departamento de Evolução e Biodiversidade, Instituto de Ciências Exatas e
Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Campus Morro do Cruzeiro s/n°
CEP 35400-000 Ouro Preto, Minas Gerais, Brasil.
3
Universidade Federal do Pampa, campus São Gabriel, Av. Antônio Trilha 1847.
CEP 97300-000. São Gabriel, RS.Brasil.
4.
Departamento de Botânica, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo,
Caixa Postal 11461, CEP. 05508-090, São Paulo, SP, Brasil.
O manuscrito foi submetido à Botanical Journal of the Linnean Society
14
RESUMO
Plantas que se reproduzem no período de baixa disponibilidade de recursos
são importantes para a manutenção temporal de polinizadores e herbívoros. Foi
testada a hipótese de que as inflorescências de Langsdorffia hypogaea são
recursos-chave para parte da fauna em florestas sazonais por surgirem na estação
seca e emitirem variados recursos em época de escassez. É esperada a existência
de mecanismos para minimizar a herbivoria e otimizar a polinização.
A reprodução da planta foi estudada em 2010 e 2011, em relação a sua
duração, padrão fenológico, sincronia populacional e correlação com a pluviosidade.
Baseado na morfologia floral e no comportamento dos animais visitantes procurouse averiguar a potencial síndrome de polinização e levantar indícios de possíveis
polinizadores e predadores. Após o término do período reprodutivo ocorrido em
2009 e 2010, os rizomas foram escavados para análise da estratégia reprodutiva
(monocarpia ou policarpia).
A floração é anual, de março a setembro, abrangendo todo o período de seca
e parte do chuvoso. Houve sincronia populacional na floração de 2011 e emissão de
botões em ambos os anos, sendo este correlacionado com a pluviosidade. A
mortalidade pós evento reprodutivo sugere monocarpia (N= 21). As inflorescências
são morfologicamente distintas, anteras com deiscência extrosa, estigma exposto
acima do perianto e ausência de síndromes de polinização. Foram observados 259
artrópodes visitantes, a maioria Hymenoptera/Formicidae (149 indivíduos, 17
espécies), oito espécies de Aranae e quatro de outros insetos. Uma espécie de
Coleoptera/Nitidulidae, o potencial polinizador, foi mais abundante (28% do total de
15
visitantes na fase adulta), representados por adultos e larvas e apenas 12,5% dos
agrupamentos de inflorescências chegaram à frutificação, em decorrência de
predações.
O alto investimento em reprodução atrai um grande número de herbívoros.
Em contrapartida, a planta intercala períodos de alta e baixa sincronia populacional e
oferta seus recursos reprodutivos no inverno, reduzindo a taxa de predação e
aumentando a efetividade da polinização. Adicionalmente, o recurso em pleno
período árido consiste de um recurso-chave ao atender as necessidades de uma
fauna variada, principalmente espécies generalistas e oportunistas.
PALAVRAS-CHAVE: Brachymyrmex
sp.; ecossistemas montanos; estratégias
reprodutivas; morfologia floral; predação em massa; interação multitrófica.
16
ABSTRACT
Premise of the study: Plants that reproduce during periods of low resource
abundance support the temporal fauna. We tested the hypothesis that
Langsdorffia hypogaea inflorescences are key resources for part of the fauna in
seasonal forests due to their emergence in the dry season and varied resources.
Mechanisms to minimize herbivory and optimize pollination are expected.
Methods: We investigated the following reproductive traits in 2010 and 2011:
duration of reproductive events, phenological pattern, population synchrony and
correlation with rainfall. Based on floral morphology and analysis of flower visitors
we gathered evidence of some potential pollinator and predator species. Plants
were excavated for analysis of reproductive strategy (monocarpy or polycarpy).
Key results: Flowering is annual, from March to September, during dry and wet
seasons. Population synchrony present in the 2011 flowering event and bud
emergence in both years, the latter correlated with rainfall. Post-reproductive
death (N = 21) suggested monocarpy. The inflorescences are morphologically
different, anthers with extrorse dehiscence, stigma exposed above the perianth,
and absence of pollination syndromes. In total, 259 arthropods visited the plants,
mostly Hymenoptera/Formicidae (149 individuals, 17 species), eight species of
Aranae and four species of other insects. A species of Coleoptera/Nitidulidae, and
potential pollinator, was the most abundant (28% of total visitors), represented by
adults and larvae. In both years, only 12.5% of all patches fructified due to
predation.
Conclusions: The plant alternates periods of high and low population synchrony
and allocates its reproductive resources in winter to escape from predators
17
attracted by the large investment in reproduction that results in high resource
supply, while ensuring pollination and acting as a key resource in the system by
supporting a varied fauna. The beetle of the family Nitidulidae is a potential
pollinator of L. hypogaea.
Keywords: Brachymyrmex sp., phenology, floral morphology, high montane
seasonal forests, trophic guilds, mass predation.
18
2.1. INTRODUÇÃO
Estruturas florais elaboradas podem representar uma demanda evolutiva
conflituosa entre custos e benefícios para a planta, pois enquanto aumentam a
eficiência da polinização, atraem animais herbívoros (Shaanker & Ganeshaiah,
1988). Algumas plantas conseguem driblar esse efeito antagônico através do saciar
do predador, primeiro descrito por Janzen (1976) para o bambu Phyllostachys
bambusoides Siebold & Zucc. A produção massiva e sincronizada de sementes
dentro da população sacia os herbívoros predadores, fazendo com que parte desse
banco de sementes seja poupada para a perpetuação da população
(Crawley,
1997).
Durante a estação seca, momento em que há baixa atividade fotossintética
média em florestas estacionais alto montanas, a holoparasita Langsdorffia hypogaea
Mart. (Balanophoraceae) se reproduz, lançando uma quantidade significativa de
recursos próximos ao solo, podendo representar um recurso-chave para alguns
representantes da fauna. Além disso, quando a fenologia de uma planta é ajustada
de forma que o recurso seja previsível no tempo, especialmente em momentos de
escassez, a importância do produtor para a fauna daquele ambiente é ainda maior
(Develey & Peres, 2000; Barea & Watson, 2007). Entretanto, esta é exatamente uma
situação em que o benefício da polinização contrapõe aos custos da predação. No
caso, quando o recurso de maior interesse não é semente, mas frutos e flores, a
possibilidade de escapar de toda uma guilda de predadores é mais difícil no tempo,
podendo resultar no espaço.
O entendimento desta relação evolutiva com a paisagem biótica carece do
entendimento básico sobre a biologia reprodutiva desta espécie. Assim, este
19
trabalho tem como objetivo apresentar a fenologia, morfologia floral e fauna
associada à L. hypogaea. Como a floração é sincronizada e ocorre na estação seca,
é relativamente fácil de ser encontrada por polinizadores. Por outro lado, espera-se
que exista alguma estratégia de variação espacial no surgimento das flores de um
ano para o outro, de forma a minimizar a previsibilidade das mesmas para seus
predadores. Foi testada a hipótese de que a planta representa um recurso-chave
para a fauna associada e é polinizada por formigas e besouros de solo, por ser uma
planta herbácea, hipógea e de flores diminutas.
2.2. MATERIAL E MÉTODOS
2.2.1. ANISMO DO ESTUDO
A planta Langsdorffia hypogaea é uma das 44 espécies descritas de
Balanophoraceae, constituída por ervas dioicas, suculentas, aclorofiladas e
holoparasitas de raízes, geralmente de árvores. Para o Brasil, existem atualmente
seis espécies registradas (Falcão, 1975; Cardoso et al. 2011). Morfologicamente, L.
hypogaea se divide em duas regiões: um corpo vegetativo irregularmente cilíndrico,
alongado e hipógeo, de aspecto tomentoso e carnoso, denominado rizoma ou
tubérculo, a partir do qual surgem os tecidos responsáveis pelo parasitismo,
chamados haustórios (Hansen, 1980) e unidades reprodutivas, representadas por
inflorescências de eixo suculento e unissexuais, que irrompem dos escapos,
circundadas na base pela bainha de brácteas, sendo os frutos aquênios e diminutos
(Fig. 2). A morfologia floral de Balanophoraceae não é muito clara (Souza e Lorenzi,
2008, Eberwein et al., 2009). A espécie está restrita às regiões tropicas, em florestas
21
montanas e campos cerrados, com altitudes que variam de 400 a 3100m, onde foi
encontrada parasitando Geonoma sp., Iriartea sp., Mimosa sp., Byrsonima sp.,
Trichilia
sp.,
Ficus
sp.
(Hansen,
1980),
pertencentes
a
quatro
famílias
filogeneticamente não relacionadas entre si.
2 cm
Figura 2 – Morfologia externa de um indivíduo de Langsdorffia hypogaea mostrando as
estruturas reprodutivas (setas pretas), o rizoma (setas cinzas) e raízes hospedeiras (setas
brancas).
2.2.2. LOCAL DO ESTUDO E DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
O Parque Estadual do Itacolomi se situa entre os municípios de Ouro Preto e
Mariana – MG e ocupa uma área de aproximadamente 7.500 ha. A altitude média do
Parque é de 1.350 metros e o clima é do tipo Cwb, de acordo com a classificação de
20
Koppen, com duas estações bem definidas, uma seca e uma chuvosa, verões
suaves concentrando cerca de 90% da precipitação anual que varia de 1.100mm a
1.800mm e temperatura média anual de 17,4°C a 19,8°C (Gomes, 1998). A
composição florística nestas áreas possui variações, principalmente quanto à
altitude, disponibilidade de água e nível de interferência antrópica (Pedreira e Sousa,
2011).
A área amostral está localizada na microbacia do córrego do Manso e possui
uma vegetação secundária, caracterizada como Floresta Estacional Alto-Montana,
dotada de um solo frequentemente raso (Pedreira e Sousa, 2011) (Fig. 3). A
ocorrência da população de L. hypogaea foi registrada em duas áreas distantes 370
m uma da outra e localizadas a 1347m de altitude. A primeira área é em encosta
rasa e aberta com monodominância de Eremanthus erythroppapus (DC.) McLeish
(Asteraceae) (20°26' S e 43°30' W), distante 5 m de uma trilha. A segunda área é em
floresta mista secundária, mais abaixo na encosta, a quatro metros de uma estrada
(20°25' S e 43°30' W).
Por não ser possível distinguir visualmente os indivíduos de L.hypogaea pelo
fato da mesma ser hipógea, a nomenclatura utilizada para este estudo foi
agrupamento de inflorescências. Para individualizar os agrupamentos ou pseudoindivíduos, estabeleceu-se uma distância mínima de 20 cm entre a inflorescência da
borda e sua vizinha mais próxima (Fig. 3 e 4).
A fim de determinar o número de agrupamentos e a densidade destes, em
cada área foi feita uma minuciosa varredura ao longo de dois transectos de 1000x5
m, ambos paralelos e marginais aos acessos (estrada e trilha, respectivamente), já
que esta espécie ocorre frequentemente próxima aos acessos humanos. Nesta
varredura de 20.000 m², as florações surgiram nos mesmos locais nos anos de 2009
22
(observação prévia), 2010 e 2011. Para analisar o tipo de estratégia reprodutiva da
planta, 21 agrupamentos foram escavados e desenraizados, sendo que sete deles
se reproduziram em 2009 e o restante em 2010. Medidas de comprimento e número
de ramificações de cada rizoma foram coletadas.
D≥20 cm
Figura 3 – Distribuição espacial dos agrupamentos de L. hypogaea em sua área de
ocorrência no Parque Estadual do Itacolomi. Cada círculo preto representa um agrupamento
de inflorescências, e as mesmas são representadas pelos círculos vermelhos. As distâncias
entre os agrupamentos são maiores ou iguais a 20 cm.
23
4 cm
Figura 4 – Agrupamento de inflorescências femininas de L.hypogaea.
2.2.3. MORFOLOGIA FLORAL
A morfologia das flores foi realizada em material fixado em FAA 50 (Johansen,
1940) com o auxílio de microscópio estereoscópico e de microscópio eletrônico de
varredura. Para esta última análise, flores masculinas e femininas foram isoladas,
desidratadas em série etílica, secas pelo método de ponto crítico, montadas e
metalizadas com ouro. As observações e o registro de imagens foram efetuados em
microscópio eletrônico de varredura Zeiss DSM 940 a 10 kV com câmera digital
acoplada.
24
2.2.4. FENOLOGIA REPRODUTIVA
As observações fenológicas foram realizadas semanalmente, durante os anos
de 2010 e 2011, nas quais foram
marcados 22 e 10 agrupamentos de
inflorescências respectivamente, num total de 109 inflorescências. Para averiguar a
ocorrência de apomixia (produção de sementes na ausência de fecundação) na
população, uma amostra de três agrupamentos femininos, num total de oito
inflorescências foi isolada de visitações, com sacos de nylon fino, desde o período
de botão até o final do estudo.
A duração de cada fenofase na população foi investigada e a classificação do
padrão fenológico encontrado seguiu a proposta de Newstron et al. (1994). Foram
analisadas: emissão de botões, floração, frutos imaturos e frutos maduros. O Índice
de atividade foi utilizado para estimar a sincronia, indicando a proporção de
indivíduos que manifestaram determinado evento fenológico ao mesmo tempo.
Assim, para valores inferiores a 20%, a população foi classificada como
assincrônica, 20 a 60% pouco sincrônica e para valores maiores que 60%, assumese que a população possua uma alta sincronia fenológica (Bencke and Morellato,
2002). Foram elaborados fenogramas englobando os meses reprodutivos, baseado
na porcentagem de indivíduos em cada fenofase por mês e ano. Os dados de
botões não visualizados foram estimados como dados perdidos a partir do cálculo da
mediana dos dias em que houve frutificação, acrescida da diferença entre número
de inflorescências e botões. Para verificar se houve correlação entre a fenologia e a
pluviosidade, foi feita uma correlação de Spearman (Zar, 1996), considerando como
25
variáveis a frequência de indivíduos manifestando determinada fenofase mensal e a
pluviosidade em ambos os anos do estudo.
2.2.5. VISITANTES FLORAIS
Os dados foram coletados durante quatro noites por dois observadores entre
19h00min e 07h00min e sete dias por um observador entre 07h00min e 19h00min
totalizando 180 horas de campo e 45 inflorescências analisadas, pertencentes a 15
agrupamentos populacionais. Foi utilizada uma lanterna com luz vermelha para
minimizar os impactos do efeito de iluminação nos visitantes noturnos, como
sugerido por Peitsch et al. (1992). Os animais que não puderam ser identificados no
campo foram coletados e encaminhados ao Laboratório de Ecologia Evolutiva de
Herbívoros de Dossel e Sucessão Natural da Universidade Federal de Ouro Preto,
no caso das formigas e Coleoptera, e para o Laboratório de Aracnologia do
Departamento de Zoologia da Universidade Federal de Minas Gerais, no caso das
aranhas. Após a identificação em nível de família, Coleoptera da família Nitidulidae e
larvas foram encaminhados para identificação na Sapienza Universitá di Roma,
Roma Italy. Para visualizar os Hemiptera, foi necessária a retirada da serapilheira
em torno do escapo. A condição para ser classificado como potencial polinizador foi
que a mesma morfoespécie visitasse ambos os sexos de flores, tocando as anteras
e estigmas sem destruir essas estruturas. Animais de maior ocorrência também
foram categorizados dessa forma através do percentual de ocorrência do evento de
visitação em relação ao total de visitantes e em relação ao percentual de flores
visitadas.
26
Para avaliar se houve diferença na quantidade de visitas em relação ao
período noturno e diurno foi utilizado o Teste U de Mann Whitney. Para analisar se
os principais grupos de visitantes responderam igualmente ao recurso, foi aplicado o
teste Qui-quadrado (Zar, 1996), utilizando a contagem de visitas destes animais. O
tipo de estrutura explorada pelos visitantes também foi registrado e quando possível,
os animais foram classificados em guildas tróficas. Para diferenciar predação por
mamíferos e insetos herbívoros, cinco inflorescências (três masculinas e duas
femininas) foram
protegidas por grades
de arame, por onde o acesso à
inflorescência foi limitado aos mamíferos.
2.3. ESULTADOS
2.3.1. MORFOLOGIA FLORAL
As inflorescências masculinas e femininas de L. hypogaea divergem em
vários aspectos. A inflorescência masculina é um racemo circundado por um anel de
brácteas presentes de forma uniforme em sua base (Fig. 5C) e espalhadas ao longo
de todo o escapo. As flores são pediceladas (Figs. 5C,6A,B), monoclamídeas,
dialitépalas, trímeras (eventualmente com duas ou quatro tépalas), com androceu
isostêmone, monadelfo (Figs. 5C, 6A –C). As anteras possuem deiscência extrorsa
(Fig.6C). As flores exalam um aroma adocicado e gotas de néctar foram observadas
na superfície de toda a inflorescência.
A inflorescência feminina se assemelha a uma espádice com um anel de
brácteas em sua base (Fig. 5B), no ápice de um escapo. Ambas as inflorescências
são congestas e possuem um eixo suculento, mas as flores femininas são sésseis,
27
monoclamídeas, gamotépalas, tubulares (Figs.6D,E), irregulares lobadas, com
gineceu sincárpico. Observa-se um único estilete e estigma filiforme (Fig. 6F) que se
projeta acima do tubo do perianto (Fig.6D). Essas flores também exalam um aroma
adocicado, mas o néctar foi observado apenas na base da inflorescência, sobre as
brácteas (Fig. 5F).
O fruto múltiplo imaturo possui uma morfologia externa semelhante à
inflorescência. Os aquênios, de coloração avermelhada, ficam fixos ao eixo (Fig.5D),
até o completo amadurecimento (Fig. 5E).
28
1 cm
1 cm
1 cm
1 cm
1 cm
Figura 5 - Aspecto das estruturas reprodutivas de L.hypogaea A - F. A. Botão da inflorescência
com brácteas coriáceas e tricomas nas bordas. B. Inflorescências femininas. C. Inflorescência
masculina. D. Fruto múltiplo imaturo. (Fotos: L. Freitas, 2010). E. Aquênio. (Foto: L. Cardoso).
F. Néctar (setas pretas) produzido pela inflorescência feminina (Foto: L. Freitas, 2010).
29
Figura 6 - Microscopia eletrônica de varredura das flores de L.hypogaea. A-C. Flores masculinas
dialitépalas pediceladas. A. Flor trímera. B. Flor com duas tépalas. C. Detalhe das três anteras
livres entre si abertas. D-F. Flores femininas gamotépalas tubulares. E. Detalhe da base das flores
sésseis .F. Detalhe do estigma (Fotos: D.Demarco, 2011).
2.3.2. FENOLOGIA REPRODUTIVA
A razão sexual encontrada nos agrupamentos de inflorescências foi de 15
inflorescências femininas para sete masculinas (2:1) em 2010 e cinco inflorescências
femininas para cinco masculinas (1:1) em 2011. O padrão de floração da planta foi
do tipo anual, com duração de sete meses. A época reprodutiva coincidiu com o fim
da época chuvosa, se estendeu por toda a seca e finalizou com o início das chuvas,
compreendendo o final do mês de março até o final de setembro, em um total de 210
dias. Não houve registros de apomixia. No ano de 2010, a fenofase botão (Fig.5A)
31
teve duração de 38 dias, iniciando em março e finalizando em maio com um total de
73 botões (N=22 agrupamentos, média de 4,3 botões por agrupamento, DP = 4,2)
com pico de atividade em abril e alta sincronia em 2010 (63,6%) e em 2011(60%) na
população. O coeficiente de Spearman mostrou que a fenofase botão apresentou
correlação positiva e significativa com a pluviosidade (rs=0,77; P=0,044) em 2010 e
2011 (rs=0,76; P=0.046)(Fig.7).
250.0
80
70
60
50
150.0
40
100.0
30
Botões (%)
Pluviosidade (mm)
200.0
Botões
Pluviosidade
20
50.0
Sep-11
0
Aug-11
Jul-11
Jun-11
May-11
Apr-11
Mar-11
Feb-11
Jan-11
Dec-10
Nov-10
Oct-10
Sep-10
Aug-10
Jul-10
Jun-10
May-10
Mar-10
0.0
Apr-10
10
Figura 7 - Época de pluviosidade nos anos de estudo e sua correlação positiva com a
fenofase botão de L. hypogaea nos anos de 2010 (rs=0,77; P=0,044) e 2011 (rs=0,76;
P=0.046) (Correlação de Spearman). Época de ocorrência do período reprodutivo da planta
e da fenofase botão (N=22) em 2010 e (N=10) em 2011.
No mês de março de 2010, quando 25% dos indivíduos observados
apresentavam 30 botões florais (N=4 agrupamentos, média de 7,5 botões por
agrupamento, DP=6,5), foi registrada a primeira floração, sendo que em 35 dias,
58% dos agrupamentos estavam no momento de pico da fenofase (N=11 plantas) e
no final de maio, todos (N=73 inflorescências)
já haviam florido (N=19
agrupamentos, média por agrupamento=3,8, DP=3,0) (Fig.8). Em 2011, os botões
florais (N=19) ocorreram nos meses de março e abril (N=7 agrupamentos, média de
30
4,7 botões por agrupamento, DP=4,1) e seu pico de atividade registrado neste último
mês (N=6 agrupamentos, média de 4,3 botões por agrupamento, DP=4,9) em 13
botões (Fig. 7).
O surgimento das primeiras 14 inflorescências em 2011 ocorreu no mês de
abril, mesma época em que sua máxima atividade foi registrada. (N=6
agrupamentos, média de 2,3 inflorescências por agrupamento, DP=1,9) e após 29
dias, em maio, essa fenofase terminou, totalizando 19 inflorescências (N=7
agrupamentos, média de 2,7 inflorescências por agrupamento, DP=2,0) (Fig.8). A
fenofase de inflorescência não apresentou correlação com a pluviosidade
(correlação de Spearman rs=0,65; P=0,114) para o ano de 2010 ou 2011 (r s=0.49;
P=0,259), com baixa sincronia populacional (57,9%) em 2010 e alta sincronia
(85,8%) no ano seguinte.
No ano de 2010, no mês de maio, enquanto ainda ocorria floração, as
primeiras frutificações foram registradas em sete agrupamentos e 60 dias depois,
estavam maduros. A frutificação imatura teve seu pico de atividade em junho,
quando foram observados ao todo 54 frutos múltiplos (N= 16 agrupamentos, média
de 3,3 frutos múltiplos por agrupamento, DP = 2,0) ao longo então de 36 dias (Fig.8).
Nesse primeiro ano do estudo, a população mostrou baixa sincronia (56,2%) e não
apresentou correlação significativa com a pluviosidade (correlação de Spearman r s=
0.17; P=0,072), sendo que no pico de frutificação, 26% dos agrupamentos já haviam
tido seus frutos totalmente dispersos ou predados e sete dias após o registro do
mesmo, seis agrupamentos com 17 frutos múltiplos, ou seja, 89% desapareceram,
causando um brusco decréscimo na população.
32
No ano seguinte não foi possível avaliar sincronização desta fenofase, pois
das 19 inflorescências geradas apenas uma frutificou, sendo que demais foram
predadas.
A ocorrência de frutos imaturos (Fig. 5D) perdurou 36 dias, até final de junho,
com o surgimento de frutos maduros no mês seguinte (Fig. 8). Em 2011, o
amadurecimento foi registrado em setembro. Esta fenofase não pôde ser
correlacionada de forma robusta com pluviosidade, devido ao número extremamente
pequeno de indivíduos que chegaram a produzir frutos maduro (Fig. 5E).
Nominalmente, para 2010 tivemos três indivíduos nos meses de julho (n=1) e
setembro (n=2), e apenas um em 2011, em setembro. No entanto, devido ao período
de floração sempre começando no início da seca e ao tempo de desenvolvimento da
fase reprodutiva, invariavelmente os frutos maduros surgiram ainda em meses
secos.
12
Número de agrupamentos
10
8
6
Inflorescências
Frutos múltiplos imaturos
4
Frutos múltiplos maduros
2
mar
apr
may
jun
jul
aug
sep
mar
apr
may
jun
jul
aug
sep
0
2010
2011
Figura 8 - Número de indivíduos nas fenofases floração de L.hypogaea em 2010 (N= 19) e
2011 (N=7), frutos imaturos em 2010 (N=16) e 2011 (N=1) e frutos maduros em 2010 (N=3)
e em 2011 (N=1), com seus respectivos picos de atividade e época de duração.
33
Em média, após o amadurecimento, os frutos compostos levaram 22 dias
para serem dispersos ou predados. Após o primeiro fruto amadurecer em um
agrupamento, leva em média 26 dias até que todos tivessem se dispersado, quando
caem ao solo, agregados uns aos outros, por gravidade ou atividade de insetos
atraídos pelo eixo suculento, e 228 dias desde a primeira inflorescência surgir. Este
valor foi estimado para 2010 que teve um número substancial de frutos. Um
fenômeno importante segue-se ao desaparecimento do fruto, que é
a aparente
morte do próprio indivíduo, o que nos faz sugerir pela primeira vez que esta espécie
seja monocárpica.
Os rizomas dos 21 agrupamentos escavados apresentaram uma média de
11,8 cm de comprimento e cinco ramificações e todos estavam em estado de
decomposição, que era mais ou menos avançado de acordo com a época em que
ocorreu a reprodução. A epiderme desta região apresentava-se levemente
acinzentada e nas plantas que se reproduziram em 2009, foram observados pontos
de necrose. Em relação à morfologia, em todas as plantas, tanto a epiderme quanto
os pêlos que a reveste estavam intactos. As ramificações das plantas que se
reproduziram em 2009 estavam quebradiças, fator que dificultou a escavação, no
entanto, naquelas cuja reprodução foi mais recente, 2010, a arquitetura foi mantida
na maioria das coletas.
A região interna dos rizomas encontrava-se escurecida, em estágio de
apodrecimento. Não foram encontrados vestígios de ataques por parasitas nestes
tecidos. Além da região vegetativa, em boa parte dos casos, o escapo com as
brácteas das inflorescências permaneceram anexados aos rizomas, fator que
facilitou a localização exata dos indivíduos no campo. Em 11 indivíduos que se
34
reproduziram em 2010 foram encontradas raízes de hospedeiras em estágio de
decomposição e soltas da planta de origem, acopladas à L. hypogaea (Fig. 9).
Figura 9 - Região vegetativa subterrânea de L.hypogaea, senescente no período de pósreprodução em 2010, mostrando a epiderme intacta, brácteas e escapos vestigiais (setas
brancas) e raízes mortas das hospedeiras (setas pretas).
2.3.3. VISITANTES FLORAIS
As inflorescências de L. hypogaea foram visitadas por 259 artrópodes ao
todo, representantes das ordens Hymenoptera, Hemiptera, Dermaptera, Blattodea,
Araneae e Coleoptera. Além disto, indícios encontrados nas plantas (marcas de
dentes e demais aspectos do forrageio) sugerem visitação por pequenos mamíferos.
Foram identificadas 17 espécies de formigas pertencentes às subfamílias
35
Myrmicinae, Formicinae, Dolichoderinae e Ponerinae. Além destes, também foi
observada uma espécie da ordem Blattodea e uma espécie da ordem Hemiptera,
uma espécie da ordem Dermaptera e uma morfoespécie do gênero Stelidota,
(Nitidulidae), o qual foi o invertebrado mais dominante no sistema (veja abaixo).
Afora insetos, oito espécies da ordem Araneae pertencentes às famílias Salticidae,
Theridiidae, Lycosidae, Gnaphosidae, Thomisidae e Linyphiidae (Tabela 1).
O grupo taxonômico mais frequente foi Formicidae, com 149 indivíduos
observados (57% do total de indivíduos observados; três formigas por inflorescência
monitorada). A quantidade de ocorrências de formigas nas inflorescências não foi
significativamente diferente em relação aos turnos diurno e noturno (Mann Whitney Z
= 1,88; P = 0,058) (Fig. 10A). As espécies de formigas foram observadas utilizando
fontes de açúcar (exsudato de hemíptera e néctar), cortando tecidos e eixo floral ou
predando outras formigas (Tabela 1). Apesar de estes insetos terem visitado uma
grande quantidade de flores de ambos os sexos, estes não foram visualizados
tocando o estigma, e assim desconsideramos a possibilidade de atuação como
agentes polinizadores da planta.
O gênero de Nitidulidae, Stelidota sp. (Coleoptera) observada foi a mais
abundante (73 indivíduos –28% do total de visitantes), com maior ocorrência à noite
(Mann Whitney Z = -2.07; P = 0,037. Estes insetos foram observados forrageando o
néctar e em 13,7% das ocorrências foi registrado o comportamento de cópula,
seguido pela perfuração das flores até atingir o eixo da inflorescência, onde ocorria a
ovoposição. Em uma coleta complementar de 13 inflorescências, foram encontradas
68 larvas se alimentando do escapo e eixo dessa estrutura. Além de terem feito
visitas nos períodos diurno e noturno (Fig.10B), sendo este último na época de
produção de néctar, aroma e antese masculina (in prepp.), tocavam as partes
36
reprodutivas das flores masculinas, carregando grãos de pólen durante a coleta de
néctar, e das flores femininas durante a cópula, além de terem visitado 55% das
inflorescências amostradas (N= 25).
As aranhas observadas utilizavam as inflorescências de L. hypogaea como
sítios de forrageamento para captura de presas. Para esses animais também não foi
observada diferença significativa nas visitas em relação aos períodos noturnos e
diurnos (Mann Whitney Z=1,79; P=0,072) (Fig. 10C). Foram registrados dois
indivíduos da ordem Dermaptera, que também utilizavam as inflorescências para
forragear presas durante o dia. As cochonilhas foram encontradas em 4% dos
eventos e duas morfoespécies de baratas não identificadas foram observadas
coletando néctar durante o dia. A análise de Qui-quadrado mostrou uma coocorrência entre os grupos de maior visitação, Nitidulidae e Formicidae no período
noturno (X²=3,345; df=3; P>0,05) ou diurno (X²=4,033; df=6;P>0,05).
37
Tabela 1 - Visitantes das inflorescências de 15 plantas de duas populações de Langsdorffia
hypogaea, nos meses de março a setembro de 2010 e 2011. O número de visitações por maior
taxa é apresentado bem como a porcentagem de flores visitadas por menor taxa e os recursos
consumidos.
Classe
Espécies/menor taxa
Ordem
Nº de animais
Nº de flores
Recurso
/taxa
visitadas /menor
consumido
taxa
Família
Insecta
Hymenoptera
Formicidae
149
Acromyrmex sp.
11
Escapo flora, eixo
da
inflorescência,
flores
Acromyrmex cf. subterraneus
1
Forel, 1893
Escapo
da
flora, eixo
inflorescência,
flores
Brachymyrmex heeri
4
Néctar
Brachymyrmex sp.1
17
Néctar
Brachymyrmex sp.2
2
Néctar
Camponotus melanoticus
4
Néctar
Crematogaster sp.
16
Hemiptera
Hypoponera sp.
2
Presas
Linepithema cf. pulex Wild,
1
Néctar, Hemiptera
Linepithema sp.1
15
Néctar, Hemiptera
Pheidole cf. flavens Roger,
4
Néctar
Pheidole sp.1
2
Néctar
Pheidole sp.2
3
Néctar
Pheidole sp.3
4
Néctar
Pheidole sp.4
2
Néctar
Solenopsis sp.
2
Néctar
Wasmannia sp.
1
Hemiptera
55
Escapo flora, eixo
Emery, 1894
2007
1863
Coleoptera
Stelidota sp.(adultos)
73
da
inflorescência,
38
flores
Stelidota sp. (larvae)
68
13*
Escapo flora, eixo
da inflorescência
Dermaptera
4
Dermaptera sp.
4,5
Formigas
4,5
Néctar
18
Seiva
Salticidae sp.
1
Presas
Theridiidae sp.
1
Presas
Lycosidae sp.
3
Presas
Camillina sp.
1
Presas
Eilica aff.modesta Keyserling,
2
Presas
Thomisidae sp.
3
Presas
Sphecozone castanea
2
Presas
Linyphiidae sp.
3
Presas
72**
Escapo
Blattodea
4
Blattodea sp.
Hemiptera
11
Hemiptera sp.
Araneae
Arachnidae
17
Salticidae
Theridiidae
Lycosidae
Gnaphosidae
1891
Thomisidae
Linyphiidae
Mammalia
11
da
flora, eixo
inflorescência,
flores e rizoma
Notes: * Coleta complementar de inflorescências
** A visitação por mamíferos está relacionada ao número total de plantas (n=32) do estudo.
39
Figura 10 – Visitações às inflorescências de L.hypogaea nos períodos noturno e diurno. A-C
Principais ordens ocorrentes nas inflorescências da planta. A. Formicidae. B. Nitidulidae. C.
Aranae. Mediana e percentis: 25% e 75%.
Em ambos os anos do trabalho, somente 12,5% dos 32 agrupamentos de L.
hypogaea observados completaram seu ciclo de vida em decorrência principalmente
de predação das inflorescências e dos frutos múltiplos imaturos. Indícios deixados
nas estruturas parcialmente predadas e no local, tais como marcas de dentes
(Fig.11B), apontaram para pequenos roedores ou marsupiais (L. Scoss; Pontífica
Universidade Católica, comunicação pessoal). Foram encontrados casos em que
animais se alimentaram somente do escapo, eixo da inflorescência e flores,
poupando brácteas e parte aérea do rizoma (Fig. 11B), enquanto em outros casos,
além dessas estruturas, o animal escavou o solo superficial e se alimentou também
de parte do rizoma (Fig. 11C). Todas as cinco inflorescências engaioladas
apresentaram o padrão de forrageamento feito por formigas do gênero Acromyrmex
(Fig. 11A), que cortavam os pedicelos das flores masculinas e em seguida, o eixo da
inflorescência.
41
B
A
C
Figura 11 - Aspectos de predação às inflorescências de L. hypogaea. A – C. A. Flores e
parte do eixo da inflorescência masculina cortados por formigas do gênero Acromyrmex. B.
Inflorescência feminina possivelmente predada por um roedor, fato evidenciado pela marca
de dentes (setas pretas). C. Predação de flores, escapo, eixo da inflorescência e parte do
rizoma.
2.4. ISCUSSÃO
A reprodução das plantas é geralmente sincronizada para o melhor
aproveitamento da disponibilidade sazonal de polinizadores e dispersores e
influenciada por fatores climáticos (Janzen,1976; Howe & Westley,1997; Lambert et
al.,2010). O teste de correlação de Spearman mostrou que, com exceção à emissão
de botões, as fenofases perduraram por toda a seca, tornando o recurso flores
suculentas e frutos, disponível para atrair esses animais. Somente a emissão de
botões em ambos os anos e a floração em 2011 apresentaram alta sincronia
populacional, sugerindo que a vantagem adaptativa da sincronia parece ser
superada pela necessidade de minimizar a previsibilidade deste recurso para
predadores. Mais que sincronizada, a fenofase botão apresentou correlação positiva
40
com a pluviosidade, época em que o mesmo se desenvolve recoberto por brácteas
coriáceas de borda margeada por tricomas (Fig.5A), até que aconteça a floração no
início da seca. Isso pode representar uma demanda evolutiva conflitiva, já que a
planta parece necessitar de água para iniciar sua reprodução e na época das chuvas
a presença de predadores generalistas é maior. Ou seja, é possível que tenha
havido uma forte pressão seletiva na direção de brácteas coriáceas dotadas de
tricomas marginais, e um retardamento na época de abertura das mesmas, para que
este desenvolvimento precoce seja feito integralmente de forma protegida, com a
abertura dos botões ocorrendo apenas após o início da seca. Embora vários animais
ativos nesse período venham a usar a inflorescência, este dano é potencialmente
menor do que poderia ser caso ocorresse na época chuvosa.
Plantas que se reproduzem fora do pico reprodutivo da comunidade em que
estão inseridas são importantes para manutenção da fauna por desempenharem o
papel de recursos-chave (ou espécie-chave, sensu Terborgh, 1986a; Barea &
Watson, 2007). Esse trabalho mostrou que L. hypogaea assume um importante
papel ao sustentar uma cadeia trófica que se conecta em função de suas estruturas
reprodutivas, através da ocorrência concentrada de inflorescências de cor atrativa
em um mesmo espaço e tempo, com numerosas flores suculentas ricas em néctar e
produtoras de odores, seguidas da disponibilidade de frutos. Para muitos animais na
época de seca, estes recursos surgem em um momento em que a oferta de
nutrientes é pequena, e são suficientemente perenes para sustentar populações de
invertebrados pelo período mais seco e frio destas regiões montanas. A reprodução
da holoparasita se estendeu por todo o inverno, com picos de frutificação em junho e
julho, épocas mais extremas da estação. Durante sete meses por ano, as estruturas
florais foram exploradas no período noturno e diurno, por uma variada fauna da qual
42
29 espécies foram ao todo coletadas, enquanto buscavam nutrientes da planta,
sítios reprodutivos, local de nidificação e presas.
Entretanto, por serem recursos para uma fauna relativamente diversa e
abundante, as estruturas reprodutivas destas plantas estão inevitavelmente sob
risco. Uma estratégia evolutiva capaz de minimizar a ação de predação é a
síndrome do saciar do predador (Janzen, 1976). Esta estratégia pode explicar a
variação na sincronização da floração entre anos, e passa pelo escape de longo
prazo via alternância de fornecimento de recursos abundantes e previsíveis em um
ano, e dispersos e escassos no ano seguinte.
Em um ano, a grande quantidade de recursos disponibilizada ao mesmo
tempo pode saciar os herbívoros sem prejudicar a transferência efetiva do pólen ao
estigma (ou por mera probabilidade, garantir o escape de algumas sementes da
predação). No ano seguinte, a inesperada redução da quantidade de recurso
disponibilizado resultaria na súbita redução da capacidade de suporte para as
populações dos predadores e seu eventual colapso.
Embora não seja esperado que flores masculinas e femininas de uma mesma
espécie difiram em relação à fusão de tépalas e presença de pedicelo, esse é um
fato comum em Langsdorffia e diversas variações quanto ao perianto são
encontradas nos diferentes gêneros de Balanophoraceae (Eberwein, et al., 2009).
Por outro lado, a morfologia distinta dessas flores associada à grande proximidade
entre elas, gera uma superfície da inflorescência onde grãos de pólen e estigma são
encontrados em abundância. As flores masculinas dialitépalas mantêm as anteras
totalmente expostas com gotas de néctar em diversos locais, sugerindo um
polinizador generalista que forrageie a inflorescência como um todo. As flores
femininas são gamopétalas, mas apresentam o estigma exserto que, por ser
43
reduzido e as flores estarem muito próximas umas das outras, aumenta a área
receptiva da inflorescência como um todo, também sugerindo um polinizador
generalista. A
presença de perfume noturno também
indica a atração de
polinizadores que respondem a esse tipo de estímulo nesse período, tais como os
representantes das ordens Hymenoptera, Coleoptera e Blattodea aqui relacionados.
44
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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50
4. APÊNDICE A
EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE DNA GENÔMICO DA ESPÉCIE
LANGSDORFFIA HYPOGAEA MART. (BALANOPHORACEAE)
Freitas, L.S.¹; Ribeiro, S.P.¹; Moreira, L.M.²
1 – Programa de Pós-graduação em Ecologia de Biomas Tropicias, Departamento
de Biodiversidade, Evolução e Meio Ambiente, Instituto de Ciências Exatas e
Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto.
2 – Departamento de Ciências Biológicas, Instituto de Ciências Exatas e Biológicas,
Universidade Federal de Ouro Preto.
O protocolo será submetido à American Journal of Botany
52
RESUMO
Uma população da holoparasita Langsdorffia hypogaea Mart. foi
analisada quanto a seus parâmetros genéticos. Para tal, o protocolo de
extração do DNA genômico foi otimizado às peculiaridades da planta, que não
possui folhas verdadeiras ou meristemas disponíveis, além de apresentar
uma grande quantidade de mucilagem e compostos secundários. Após esse
procedimento, o DNA extraído do escapo, brácteas e eixo floral de 26
inflorescências pertencentes a 17 agrupamentos ou (pseudoindivíduos) foi
avaliado a partir do uso de 12 oligonucleotídeos (primers) mediante técnica de
RAPD. Destes, sete foram testados pela primeira vez nesta família botânica,
ao passo que o restante foi previamente descrito como eficientes para outras
espécies da família Balanophoraceae. Dos oligonucleotídeos
testados,
apenas cinco apresentaram bandas polimórficas passíveis de serem
analisadas, sendo que o S118 foi o mais eficiente para esta análise. De
acordo com os resultados encontrados, este oligonucleotídeo apresentou um
considerável potencial para a caracterização de diversidade desta espécie.
Com base nos polimorfismos gerados, foi construído um dendrograma
seguindo o critério UPGMA, que revelou uma maior diversidade genética
entre inflorescências do mesmo agrupamento do que entre inflorescências de
agrupamentos diferentes. Apesar de este padrão ser próprio de plantas com
reprodução cruzada, o que é o caso de L hypogaea, a escassez de
oligonucleotídeos, limitação no número de bandas obtidas e de amostras
pode ter induzido tal resultado.
53
INTRODUÇÃO
Existem atualmente diversas técnicas na área da biologia molecular que
possibilitam a detecção de variabilidade genética entre organismos ao nível de DNA
(Ferreira e Gratapaglia, 1996). Através do uso de marcadores de DNA é possível
analisar um elevado número de genótipos em um curto prazo e por um custo
relativamente baixo, com o benefício de não serem influenciados pelas condições
ambientais e podendo amostrar um alto grau de polimorfismo caso exista (Williams
et al.,1990)
Para a manipulação do DNA de qualquer organismo é necessário submetê-lo
a uma série de reações, afim de que o material genético extraído apresente
qualidade e quantidade satisfatórias para investigações moleculares. Entretanto,
algumas espécies de plantas apresentam características que podem dificultar o
procedimento de extração e amplificação, como a presença de mucilagens e
polifenóis, ou quando os tecidos disponíveis para o estudo se restringem aos de
proteção e sustentação, por serem geralmente rígidos e compactos, compostos por
células mortas, portanto, sem DNA.
Metabólitos secundários como os flavonóides, terpenóides e alcalóides, por
exemplo, são investimentos de proteção das plantas contra herbivoria, patógenos
(Herms & Mattson 1992, Meijden 1996) e radiação solar (Markhan et al.,1998). A
contaminação por esses compostos polifenólicos tornam o DNA escurecido
(Romano & Brasileiro,1999), alterando sua migração no gel bem como a interação
com proteínas, fundamental à realização de técnicas moleculares. Isso pode ser
facilmente detectado na amostra extraída, tornando necessário o uso de
54
procedimentos que isolem ou reduzam as concentrações dessas substâncias,
típicas das plantas nativas do cerrado e caatinga.
A técnica molecular chamada PCR (Polymerase Chain Reaction), ou reação
em cadeia da polimerase, é bastante robusta para este tipo de manejo e dentre suas
variações mais usadas estão o RAPD, VNTR e RFLP. A técnica de RAPD
(Randomly Amplified Polymorphic DNA), ou polimorfismo de DNA amplificado ao
acaso, possibilita amplificar regiões casuais do genoma do organismo, utilizando
oligonucleotídeos aleatórios e curtos que se anelam no DNA genômico em
diferentes regiões (Fungaro, 2001). A técnica utiliza apenas um oligonucleotídeo de
sequência aleatória, com 10 nucleotídeos, em contraste à clássica reação de PCR
que faz uso de um par de oligonucleotídeos.
Apesar de apresentar a desvantagem de ser pouco reprodutível e consistente,
a técnica de RAPD é recomendada para organismos dos quais não se possui
conhecimentos genéticos prévios (Lacerda et al., 2002), pois consegue mapear todo
o genoma, já que faz uso de oligonucleotídeos aleatórios. Além disso, possui um
custo relativamente reduzido, menor tempo de execução, menor número de etapas e
é menos complexa de se implementar (Schuster, 1965). A técnica de microssatélites
tem sido mais amplamente utilizada para estes fins em contraposição ao RAPD em
alguns aspectos, pois é altamente reprodutível, já que utiliza oligonucleotídeos
específicos. No entanto, para a obtenção dos mesmos, é necessário ter um
conhecimento prévio do genoma em questão que permita identificar as regiões com
sequências repetitivas (Schuster, 1965), o que não é concebível para a espécie em
estudo, já que esta é a primeira tentativa de estudos deste tipo para este modelo
vegetal.
55
Parte dos problemas de entendimento sobre as espécies de plantas da família
Balanophoraceae está na falta de dados sobre o tamanho populacional. De fato, há
pouca informação sobre a estrutura genética das manchas populacionais de
indivíduos normalmente encontradas em campo. Embora existam ferramentas mais
robustas para estudos de diversidade genética e outras pesquisas do gênero, até o
momento, nenhuma técnica molecular foi empregada para análise de diversidade de
L. hypogaea, não havendo, portanto, banco de dados moleculares disponíveis para
esta espécie. O banco de genes do NCBI (National Center of Biotechnology
Information) por exemplo, possui apenas duas sequências depositadas para a
espécie, uma sequência parcial do gene que codifica para o RNAr 18S (GenBank:
L25683.1) e uma sequência parcial para um gene que codifica para a subunidade
menor do RNAr mitocondrial (GenBank: U82654.1). Com base nesta falta de
conhecimento molecular em associação ao fato de que L. hypogaea é uma planta
cujo modelo de interação a seu hospedeiro é negligenciado por estudos, essa
investigação científica torna-se pertinente.
MATERIAL E MÉTODOS
AMOSTRAGEM
Para essa análise, foram coletadas 26 inflorescências pertencentes a 17
agrupamentos (Fig. 4). Quando possível, dado o pequeno número de inflorescências
disponíveis, coletou-se mais de uma amostra do mesmo agrupamento. Pelo fato de
ser hipógea e não possuir folhas verdadeiras ou meristemas acessíveis, os tecidos
utilizados foram o eixo da inflorescência, escapo e brácteas (Fig. 12). Sendo estes
56
dois últimos tecidos constituídos em grande parte por tecido morto e rígido, tornando
necessária a utilização de uma massa relativamente alta para que o isolamento de
DNA pudesse ser satisfatório.
Após testes preliminares utilizando massas distintas de amostras congeladas,
conservadas em álcool 70%, frescas e até mesmo em fase avançado de
decomposição (na carência de material fresco), estabeleceu-se o uso de
aproximadamente dois gramas de tecido fresco retirado do escapo, eixo floral (isento
de flores) e brácteas. O fator que nos levou a estes testes preliminares tem relação
direta com a fenologia da floração desta espécie bem como o número disponível de
indivíduos na região.
Vale ressaltar que os rizomas não foram coletados para minimizar a injúria à
planta e evitar pegar fragmentos da hospedeira bem como resíduos de rizosfera. Os
tecidos foram transportados em caixas de isopor até o laboratório e acondicionados
em temperatura de 4°C por até 24 horas antes do tratamento.
EXTRAÇÃO DO DNA GENÔMICO
O material genético foi isolado utilizando um protocolo de extração baseado
em Doyle e Doyle (1990), ajustado para as condições morfoestruturais encontradas
em L. hypogaea. Ao que parece, além da grande quantidade de mucilagem
(observação pessoal), a planta é rica em polifenóis que dificultaram o isolamento do
DNA, além de ter conferido a coloração que varia do amarelo claro ao marrom
escuro ao produto final (pelete) (Fig.13A - C).
Para eliminar possíveis ectoparasitas, o material foi imerso em hipoclorito de
sódio durante cinco minutos, lavado em água destilada e seco com guardanapo de
57
papel. Para facilitar e otimizar o processo de rompimento das paredes celulares, os
tecidos foram fragmentados com o auxílio de um bisturi esterilizado e então
macerados na presença de nitrogênio liquido em almofariz de cobre até a obtenção
de um pó fino e homogêneo.
Para rompimento das membranas celulares e acesso ao DNA, foi empregada
uma solução extratora de 20 ml de CTAB 2% (5,6 mL de Nacl 5M, 2 mL de Tris-Hcl
0,1M, 0,4g de CTAB 2% (p/v),0,8 mL de EDTA 0,5M, 100µl de beta-mercaptoetanol,
0,4 g de PVP-40, 625 µl de proteinase K 20 mg/ml) e água destilada até completar o
volume de 20 mL. O macerado foi mantido em banho-maria a 55°C por três horas,
agitando ocasionalmente o tubo para manter o extrato ressuspendido. Para
purificação do DNA e eliminação de proteínas e polifenóis, acrescentou-se duas
lavagens com solução de clorofórmio: álcool isoamílico (24:1 v/v) intercaladas com
três centrifugações a 5.000g. Posteriormente, ao sobrenadante desta solução foi
adicionado 2,5 volumes de etanol absoluto gelado a 4°C e novamente o extrato foi
centrifugado, dessa vez por 20 minutos sob a mesma velocidade. O produto de DNA
gerado (pelete) foi lavado com dois mL de etanol 70% (v/v) e seco por inversão em
papel-toalha por aproximadamente um minuto. Na sequência, as amostras foram
ressuspendidas em 150 µL de tampão TE, com determinação de sua concentração
aproximada definida por espectrofotometria e armazenadas a 4°C para uso
posterior.
Para que o isolamento genômico das amostras não-frescas ou oriundas de
tecidos duros fosse possível, foi necessário acrescentar uma fase adicional ao
processo descrito acima, imediatamente após a remoção da fase aquosa, repetindose a incubação do sobrenadante em outro tampão CTAB, desta vez a 7%, sem
adição de BSA 1%, incubando a solução a 55°C por 1 hora. O DNA precipitado foi
58
recuperado e lavado com etanol 70% (v/v) por duas vezes. Esse processo foi
necessário em função de, no início do trabalho, não haver plantas frescas, cuja
floração e consequente localização da população, aconteceram sete meses depois.
ELETROFORESE
A integridade do DNA genômico isolado foi revelada por eletroforese em gel
de agarose 1% que foi preparado fundindo-se 0.5 g de agarose no volume de 50 ml
de tampão TBE (Tris/Borato/EDTA) 1x em forno de microondas. Após a solidificação,
as amostras contendo 10 µl do material (DNA), 3 µl de tampão de amostra 5x ( azul
de bromofenol, 0,125% xilenocianol, 0,125% e glicerol 50%) e 2µl de brometo de
etídeo (10mg/ml) foram aplicadas nos poços do gel e submetidas a uma voltagem de
100V em tampão de corrida TBE 1x por 40 minutos para então serem visualizadas e
fotografadas sob luz UV. A quantidade de material genético foi estimada por
espectrofotometria 260/280nm.
SELEÇÃO DE OLIGONUCLEOTÍDEOS E AMPLIFICAÇÃO DO DNA POR RAPD
As amostras de DNA de cada material genético foram diluídas em fatores de
1:650 a 1:1000 de acordo com os perfis de rendimento observados no gel de
agarose e quantificados por espectrofotometria para que fossem amplificadas via
PCR. Foram testados 12 oligonucleotídeos, sete da linhagem S, depositados no
Genemark
(http://www.genemark.com.tw/106-primers.htm),
além
de
cinco
oligonucleotídeos previamente descritos por Holzapfel et al.(2002) em trabalho
realizado com outras espécies de plantas da família Balanophoraceae (Tab. 1).
59
Foram realizados ensaios para a padronização da técnica através de variações nas
quantidades
de
alguns
reagentes,
na
temperatura
de
anelamento
dos
oligonucleotídeos e nos tempos nos ciclos de amplificação do termociclador. Ao
término dos ensaios-piloto, as reações de amplificação foram padronizadas em um
volume total de 50 µL contendo 3µL de DNA diluído (ver fatores de diluição acima),
3µL de MgCl2 25mM, 10 µL de tampão PCR 10x, 1 µL de dNTP 10 µM, 16 µL do
oligonucleotídeo RAPD ,1 µL da enzima Taq polimerase (1 U.μL-1) e 16 µL, QSP de
água destilada.
As amplificações foram efetuadas no termociclador Biocycler, versão 3.2,
programado para 35 ciclos, cada uma constituído pela seguinte sequência: três
minutos a 94°C, um minuto a 46°C e dois minutos a 72°C. Na sequência
foi
realizada uma etapa de extensão de 10 minutos a 72°C e redução para 4°C. Aos
produtos das reações foram adicionados 5 µL de azul de bromofenol e submetidos a
eletroforese em gel de agarose 0,8% corado com brometo de etídio na presença de
tampão TBE 1x . A separação eletroforética foi de 6 horas a 70 volts. Por fim, os géis
foram fotografados sob luz ultravioleta. Os fragmentos de DNA amplificados foram
computados como ausência ou presença de bandas.
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Figura 12 – Corte longitudinal de um fruto múltiplo de L.hypogaea mostrando as regiões
utilizadas para a extração do DNA genômico. (Seta preta – escapo, seta branca – eixo do
fruto, setas cinzas – brácteas) (Foto: Freitas L, 2010).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
EXTRAÇÃO DO DNA GENÔMICO
A extração de DNA do material não fresco foi possível após a adição da etapa
de lavagem com CTAB 7% ao protocolo e utilizando uma massa igual ou superior a
3g. No entanto, o produto final apresentou-se degradado, como era esperado (Fig
14A). Conservando-se a mesma massa, porém de tecidos recém coletados, a etapa
do CTAB 7% foi retirado do processo e o rendimento do material genético foi
mantido. Apesar do produto final do material fresco também ter ficado ligeiramente
60
corado ainda assim foi possível utilizá-lo. A coloração do mesmo dependeu do tipo
de tecido utilizado. No caso das brácteas, por ficarem escuras após a floração,
quando utilizadas geraram um pelete escurecido (Fig 13A). Foi evitado o uso desse
tecido quando possível. O escapo, apesar de ser uma região de coloração mais
clara que as brácteas, é rico em mucilagem e pêlos e constituído por um tecido duro
e fibroso que dificultou a maceração e produziu um produto final um pouco mais
claro que o anterior (Fig. 13B). A região de melhor manipulação e produto final foi o
eixo da inflorescência que além de não possuir pigmentação escura, é um tecido
mole de fácil maceração e que também gerou um produto final de cor clara (Fig.
13C). No entanto, sua disponibilidade na planta foi ínfima, sendo necessária a
utilização de outras partes em todas as realizações do procedimento.
A quantificação do DNA por espectrofotometria mostrou um rendimento médio
de 15,0 µg a partir de uma massa média de 3,0 gramas e valor médio de
A260nm/A280nm=1,846, indicando baixa contaminação com polifenóis, proteínas e
carboidratos. A pureza do DNA obtido foi satisfatória, visível no gel de agarose (Fig.
14B) e mostrando-se amplificável à técnica de PCR (Fig 14C).
Reduzindo a quantidade de material sob este novo protocolo, a integridade do
DNA genômico de L. hypogaea se mostrou tão satisfatória quanto em massas
maiores, tornando-o ideal para este modelo de planta de tecidos duros e reduzidos.
Além disso, houve uma otimização de tempo na execução da metodologia e uma
economia considerável de reagentes utilizados no preparo do CTAB 7%. Todas as
amostras obtidas com o novo protocolo se mostraram íntegras, o que é fundamental
para a nitidez e reprodutibilidade de produtos de PCR.
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Figura 13 – Aspecto do produto final de extração do DNA (pelete) de L. hypogaea de três
tecidos diferentes da planta, brácteas (a), escapo (b) e eixo da inflorescência (c) (Foto: L.
Freitas, 2010).
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Figura 14 - Eletroforese em gel de agarose 1% corado com EtBr caracterizando a obtenção
do DNA genômico extraído de 3g de tecido de L.hypogaea retirado de amostras necrosadas
com o uso de CTAB 7% (a) 2g de tecido retirado de plantas frescas (15µg) com o uso de
CTAB 2% (b) e produto final de PCR-RAPD realizado a partir de tecidos frescos (c). O
oligonucleotídeo utilizado na PCR foi o S118, utilizado pela primeira vez e com êxito na
família Balanophoraceae (Foto: L. Freitas, 2012).
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SELEÇÃO DE OLIGONUCLEOTÍDEOS E AMPLIFICAÇÃO DO DNA POR RAPD
Dos 12 oligonucleotídeos testados, foram selecionados apenas cinco (S118,
OP-P02, OP-P10, OP-20, OP-A20) por apresentarem padrões de bandas
polimórficas mais consistentes (Tab. 1). Um total de 28 fragmentos polimórficos foi
selecionado fazendo uso deste conjunto de oligos. O oligonucleotídeo S118
apresentou-se como o mais eficiente (dez bandas) (Fig. 14C), sendo que o registro
deste para a família Balanophoraceae é inédito e fundamental para que uma
biblioteca de oligos família específica seja consolidada.
A partir da leitura dos géis, gerou-se uma matriz binária em que os indivíduos
foram genotipados quanto à presença (1) ou ausência (0) de fragmentos RAPD com
a qual se estimou o coeficiente de similaridade de Jaccard. Os dados foram
analisados e uma matriz de similaridade genética utilizada para construir um
dendrograma (Fig. 15) pelo critério UPGMA utilizando o software TREECON W (Van
de Peer & De Wachter, 1994) e considerando 1000 rodadas de bootstraps.
O dendrograma gerado presumiu a existência de maior variabilidade genética
dentro dos agrupamentos de inflorescências que entre agrupamentos distintos,
sendo que esse perfil é normalmente esperado para populações de plantas que
possuem fecundação cruzada em decorrência da alta movimentação de genes
(Brown, 1979; Reis, 1996) e também foi observado por Holzapfel, et al. (2002) para
Dactylanthus tayloori, pertencente à Balanophoraceae. Ao contrário do resultado
encontrado por esse autor, a linhagem de oligonucleotídeos OP gerou pouco
polimorfismo para L. hypogaea.
No entanto, um novo oligonucleotídeo foi caracterizado como interessante
para amplificação desta espécie (S118) já que foi capaz de amplificar o maior
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número de bandas polimórficas em relação aos demais. Apesar do perfil sugestivo
apresentado pelo dendrograma, a baixa quantidade de oligonucleotídeos utilizada, a
limitação no número de indivíduos, em detrimento de seu reduzido número na área
de ocorrência bem como a ausência de um grupo externo pode ter induzido um
resultado os resultados encontrados, necessitando, portanto de aprofundamento de
análises dessa natureza.
Apesar de grande parte das inflorescências serem predadas, os poucos frutos
que permanecem no ambiente conseguem amadurecer e dispersar centenas de
sementes, que por sua vez devem ser provenientes de polinização cruzada. De fato,
o amplo investimento da planta em atrativos para a reprodução, somado à
morfologia das flores masculinas e femininas e à variedade de animais visitantes,
levanta fortes indícios de que a mesma possua polinizadores generalistas que
mantêm seu sucesso reprodutivo através da eficiente transferência de pólen.
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Tabela 2 - Identificação dos oligonucleotídeos RAPD testados para o estudo de L. hypogaea,
suas respectivas sequências de nucleotídeos e o polimorfismo expresso por cada um deles.
Oligonucleotídeo
Sequência
Referência
Bandas
polimórficas
Bandas polimórficas de
de
Dactylanthus tayloori
L.hypogaea
S2
5’ – TGATCCCTGG – 3’
Este trabalho
Não amplificou
Não avaliado
S97
5’ – ACGACCGACA – 3’
Este trabalho
Não amplificou
Não avaliado
S118
5’ – GAATCGGCCA – 3’
Este trabalho
Dez
Não avaliado
S201
5’ – GGGCCACTCA – 3’
Este trabalho
Não amplificou
Não avaliado
S346
5’ – TCGTTCCGCA – 3’
Este trabalho
Não amplificou
Não avaliado
*LL
5’ – TAATTAGGATGCA – 3’
Este trabalho
Não amplificou
Não avaliado
*LM
5’ - AAGTGGAGTAAT – 3
Este trabalho
Não amplificou
Não avaliado
OP-P02
5’- TCGGCACGCA – 3’
Holzapfel et
Seis
20
Cinco
14
Não amplificou
14
Cinco
15
Dois
21
al.(2002)
OP-P10
5 ’- TCCCGCCTAC – 3’
Holzapfel et
al.(2002)
OP-P11
5’ – AACGCGTCGG – 3’
Holzapfel et
al.(2002)
OP-P16
5’ – CCAAGCTGCC – 3’
Holzapfel et
al.(2002)
OP-P20
5’ – GTTGCDISSEGATCC –
Holzapfel et
3’
al.(2002)
* Os oligonucleotídeos LL e LM foram acrescentados de nucleotídeos na tentativa de aumentar a
especificidade.
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Figura 15 – Dendrograma de similaridade genética baseado no critério UPGMA para as 27
inflorescências de L. hypogaea mostrando uma maior variação genética dentro dos
agrupamentos que entre agrupamentos de inflorescências. A letra A significa agrupamento e
a letra i significa inflorescência.