Esquemas Pr__ticas Biologia Microbiana

Biologia Microbiana
Preparação de meios de cultura
Pesar constituintes
Dissolver
(1 a 1 com agitação; aquecer se necessário)
Ajustar pH
(se necessário)
Adicionar agar
Distribuir em tubos ou frascos
Autoclavar
Cozer
Distribuir em tubos
Autoclavar
Plaquear
Solidificar em
posição inclinada
Meios sólidos
Filtração
∅ = 0.45 µm
Autoclavar
Solidificar em
posição vertical
Meios líquidos
Embora existam numerosos meios de cultura os seus ingredientes essenciais são relativamente pouco numerosos. Constituintes essenciais para uma bactéria heterotrófica (E. coli): sais inorgânicos,
fontes de carbono e azoto tipicamente glucose e (NH4)2SO4, tampão e um agente quelante como por exemplo o citrato ou EDTA .
Meios de cultura: (i) composição química definida;
(ii) complexos de composição química não definida baseados em hidrolizados proteicos; estes meios contêm uma mistura de produtos de degradação de proteínas como a caseína. Os principais métodos
de hidrólise são: (a) hidrólise ácida (HCl) - hidrólise completa de proteínas parcialmente purificadas, como a caseína e a gelatina; (b) hidrólise enzimática pela pepsina, pancreatina, tripsina ou papaína.
A digestão enzimática produz hidrolizados parciais (Peptona, Triptona) que geralmente são mais eficientes para o crescimento do que os hidrolizados totais ou a mistura de aminoácidos.
As culturas tendem a modificar o pH durante o crescimento, estas alterações podem ser minimizadas incluindo um tampão no meio.
Agente solidificante: Agar - polissacárido que forma um gel com a água (ponto de fusão 100ºC, solidifica a 40º - 45ºC), resiste à digestão pela maioria dos microrganismos. NOTA: o agar é hidrolizado
em solução ácida após autoclavagem.
Métodos de esterilização:
1 - Calor: (a) calor húmido: (i) autoclave; (ii) tindalização (aquecimento a 100ºC 10 min - morte das células vegetativas - incubação durante algumas horas a 30ºC para germinação dos esporos - o ciclo
repete-se 2 a 3x); (iii) fervura; (iv) pasteurização - aquecimento a temperaturas <100ºC; (b) calor seco -estufa.
2 - Desinfectantes químicos
3 - Filtração
4 - Irradiação
Biologia Microbiana
Diâmetro
Pigmentação
Colónias
Consistência
Morfologia
Opacidade
Textura
Forma
Elevação
Morfologia da colónia
Margem
Cocos
Bastonetes
Cocobacilos
Células
Morfologia
- microscopia -
Isolados
Cadeias
Pares
Morfologia celular
Tétradas
Endósporos
Cápsulas
Características microscópicas
Dimensão: variável; podem formar uma colónia de tamanho limitado, independentemente do período de incubação; outras espalham-se à superfície do agar.
Pigmentação: a coloração é variável.
Consistência: seca, pulverulenta, húmida, viscosa.
Opacidade: opaca, translúcida, iridiscente.
Textura: lisa, rugosa, granular, radiada, concentricamente zonada.
Forma: punctiforme, circular, elíptica, tripartida.
Elevação: plana, elevada, convexa, estratificada.
Margem: inteira, filamentosa, ciliada, lobada
Os endósporos bacterianos são estruturas de resistência - células vegetativas de paredes espessadas formadas durante a esporulação, que são resistentes à
radiação, agentes químicos, temperaturas extremamente elevadas, dessecação (Bacillus e Clostridium).
Cápsula: camada de polissacáridos(por vezes proteínas) protege a célula bacteriana, muitas vezes associada com bactérias patogénicas porque serve como uma
barreira contra a fagocitose.
Biologia Microbiana
Células - suspensões
Contagem de células totais
cfu por µl vol. =
1 mm
1 mm
cfu contadas
superfície contada (mm2)* x profundidade
da câmara (0,1 mm) x diluição
* = nº contados x 1/400
cfu/µl =
=
células contadas
nº contados x 1/400 x 0,1 x 10-D
cfu contadas
nº contados
x 4000 x 10D = N x 4 x 103 x 10D
cfu/ml = N x 4 x 106 x 10D
Vcamâra = 1 x 1 x 0,1 = 0,1 mm3
400 quadrados pequenos (25
x 16
)
Vcontagem = 0,1/400 mm3 = 1/4 x 106 mL
O número total de células é geralmente determinado com o auxílio de uma câmara de contagem calibrada que é observada ao microscópio. Uma
câmara típica tem uma depressão central, cuja superfície está dividida em quadrados de área conhecida.Uma gota da suspensão bacteriana é
colocada nesta superfície e coberta com uma lamela espessa.
9 quadrados - 1 quadrado = 1 mm2 - volume total = 0,9 mm3.
Biologia Microbiana
Células - suspensões
Células totais
Escala de McFarland
McFarland
Standard No.
0.5
1
2
3
4
1.0% Barium
chloride (ml)
0.05
0.1
0.2
0.3
0.4
1.0% Sulphuric acid
(ml)
9.95
9.9
9.8
9.7
9.6
Approx. cell density
(1X108ml)
1.5
3.0
6.0
9.0
12.0
% Transmittance*
74.3
55.6
35.6
26.4
21.5
Absorbance*
0.132
0.257
0.451
0.582
0.669
McFarland
Scale
No. Bacteria
(x106/ml)
1
300
2
600
3
900
4
1200
5
1500
6
1800
7
2100
8
2400
9
2700
10
3000
McFarland Standards
are tubes labelled 1
through 10 and filled
with suspensions of
Barium salts.
*Wavelength of 600 nm
Correlação com:
- peso fresco
- peso seco
- células/ml
- cfu/ml
McF 0.5
Ec 0.5
SF
Escala de McFarland - padrões de turbidez: BaCl2 1% e H2SO4 1% em diferentes proporções de modo a formar suspensões turvas de BaSO4.
O número de células de uma supensão bacteriana pode ser determinado em aproximação, por comparação com os padrões da escala de
McFarland.
Biologia Microbiana
1
1
7
6
2
3
5
4
Purificação por esgotamento do inóculo
Biologia Microbiana
PREPARAÇÃO DE UM ESFREGAÇO BACTERIANO
1
2
H2O + bactérias
Espalhar a mistura H2O-bactérias
4
3
Secar ao ar
Fixar pelo calor
Biologia Microbiana
G+ G1
Esfregaço
2
Violeta Cristal = 1 min
C
O
L
O
R
A
Ç
Ã
O
G+ G-
6
Álcool 95% até sair todo corante
7
Lavar
de
3
Lavar
G
R
A
M
4
Lugol = 1 min
8
Safranina = 1 min
9
Lavar
5
Lavar
10
Secar c/ papel
11
As células são fixadas pelo calor e coradas com um corante básico, O violeta cristal, que cora as células de azul; as preparações são depois tratadas com lugol
que permite que o iodo penetre nas células e forme um complexo insolúvel em água com o violeta cristal. Este complexo é posteriormente eliminado com uma
lavagem com alcool a 95% ou acetona, que solubilizam o complexo iodo-violeta cristal. Após o tratamento com o solvente apenas as bactérias gram +
permanecem coradas, possivelmente devido à sua espessa parede celular, que não é permeável ao solvente. As células são então tratadas com um contracorante
(safranina ou ácido fucsinico), para permitir a visualização das células gram - que se encontram descoradas. As células gram - aparecem coradas de vermelho e
as gram + de azul (violeta).
Biologia Microbiana
CARÁCTER GRAM (Teste de KOH 3%)
1
2
KOH 3% + bactérias
Misturar KOH 3% + bactérias
3
3
Gram negativa
teste KOH 3% (+)
Gram positiva
teste KOH 3% (-)
A parede das bactérias gram + é resistente à solução alcalina e por isso não ocorre lise celular.
A parede das bactérias gram - não é resistente à solução alcalina e por isso ocorre lise celular; o DNA reage com o KOH e há formação de um fio
viscoso
Biologia Microbiana
TESTE DA CATALASE
H2O2
palitos
1
2
Peróxido de hidrogénio + bactérias
3
3
catalase positiva (+)
2 H2O2
Misturar H2O2 + bactérias
catalase
2 H2O + O2
catalase negativa (-)
Biologia Microbiana
TESTE DA OXIDASE
palitos
TMPD
1
papel de filtro +
tetrametil parafenilenodiamina
dihidrocloreto + bactéria
2
Misturar bactérias + TMPD
contra papel de filtro
3
3
oxidase positiva (+)
oxidase negativa (-)
Células c/ coloração violeta (resultado imediato)
Oxidação do TMPD ► Redução do citrocromo c
1
Esfregaço
Bacillus sp.
2
Papel de filtro
+
Verde malaquite
3
5 min s/ ferver
4
Lavar
C
O
L
O
R
A
Ç
Ã
O
Biologia Microbiana
5
Safranina = 1 min
6
Lavar
de
E
N
D
Ó
S
P
O
R
O
S
7
Secar c/ papel
8
Cobre-se o esfregaço com papel de filtro (para evitar a evaporação do corante) saturado com verde malaquite (corante para endósporos - não
tem afinidade para as células vegetativas). Aquece-se à chama 5 min sem deixar secar o papel de filtro para auxiliar a penetração do corante nos
endósporos.