Instrumentação e técnicas básicas de assepsia II

Aula 3
Instrumentação e técnicas básicas de assepsia
Profa. Dra. Ilana Camargo
Instrumentos
Câmara de biossegurança
/ fluxo laminar
Autoclave
Esterilização pelo calor úmido (vapor sob pressão)
Em geral: 15 a 20 minutos a 121ºC
Esterilização
Bico de Bunsen
Autoclave
Filtro esterilizante
Câmara de Biossegurança
Equipamentos
Equipamentos
Estufa
Materiais
Fechar com tampão de algodão e
cobrir com papel alumínio e
papel pardo
Rotina do laboratório
Tubos cônico
(tipo falcon)
Microtubos (“tubo
Eppendorf”)
Balão volumétrico
Proveta
Erlenmeyer
Frasco com
tampa de rosca
Béquer
Rotina do laboratório
Balança de precisão
Centrífuga
pHmetro
Rotina do laboratório
Agitador magnético
com aquecimento
Barras magnéticas
(“pulgas” ou “peixinhos”)
Banho-maria
Agitador de tubos (vórtex)
NUNCA PIPETE COM A BOCA!!!
Instrumentos
Pipetas e pipetadores
Instrumentos
Pipetas automáticas
Pipeta Pastuer
Ponteiras
Instrumentos
Como cultivar os microrganismos??
Onde isolar?
Meios de cultura: Material nutriente preparado no laboratório para o
crescimento de microrganismos.
Fazer a partir de pós desidratados;
Comprar meios preparados (prontos para o uso)
Onde colocar?
Como escolher o meio para o isolamento?
A) origem do material a ser analisado;
Placas de Petri;
B) A espécie que se imagina estar presente;
Tubos de ensaio.
C) Necessidades nutricionais dos organismos.
Meios Líquidos, semi-sólidos e sólidos
Agar foi descoberto no Japão (Kanten) a partir de algas marinhas e é utilizado em
comidas. Holandeses passaram a usar agar em alimentos;
Fannie Hess, esposa do pesquisador Walter Hess utilizava agar em geléias. Walter
testou em meios de cultura e escreveu para Robert Koch
Até cerca de 1880, as culturas eram todas líquidas. Koch havia tentado usar gelatina,
mas esta derretia a 37C. Ao ver a utilidade do agar, Robert Koch passou a utilizá-lo em
meios de cultura para o cultivo de bacilos da tuberculose.
AGAR
Sem cor
Sem gosto
Sem odor
Gelatinoso
Bactérias não o degradam!
Diferentes concentrações de ágar 
diferentes estados físicos
Sólidos contém agentes solidificantes, principalmente ágar (cerca de 1 a 2,0 %);
Semi-sólidos a quantidade de ágar é de 0,075 a 0,5 %, dando uma consistência
intermediária, de modo a permitir o crescimento de microrganismos em tensões variadas
de oxigênio ou a verificação da motilidade e também para conservação de culturas;
Líquidos sem agentes solidificantes, apresentando-se como um caldo, utilizados para
ativação das culturas, repiques de microrganismos, provas bioquímicas, dentre outros.
H2O
H2O H2O
H2O
Autoclavar
121°C por 20 minutos
Distribuir em placas
estéreis
Meio autoclavado = Calor!!
Materiais
Tubos de ensaio
Placas de Petri
http://www.abvector.com/Cultivating.htm
Placas de Richard Petri
Placas de Petri - 1887
Meios de cultura
Profa. Dra. Ilana Camargo
Microrganismos em meio de cultura
26
Meios de Cultura
• Soluções nutrientes utilizadas para promover o crescimento de microrganismos
em laboratório.
• Inóculo: microrganismos que são colocados em um meio de cultura para iniciar o
crescimento.
• Cultura: microrganismos que crescem e se multiplicam nos meios de cultura.
Quimicamente definidos:
Quantidades precisas de compostos
químicos inorgânicos ou orgânicos
altamente purificados, adicionados a água
destilada.
Meios
Complexos (ou indefinidos):
Não se conhece a composição precisa de
alguns componentes. Empregam produtos
de digestão da caseína (proteína do leite),
de carne, de soja, de leveduras, extratos de
plantas, entre outros.
27
Microrganismos em meio de cultura complexo
Composição:
Peptona (Fonte de nitrogênio)
Triptose (reações de fermentações)
Extrato de carne (carboidratos, constituintes minerais, vitaminas)
Extrato de leveduras (Fonte de vitaminas)
Água (destilada / deionizada)
Sangue (Fator de crescimento, rico em nitrogênio, carboidratos e vitaminas)
28
Ágar: polissacarídeo complexo solidificante obtido de algas marinhas.
Poucos microrganismos degradam o ágar.
Temperatura de fusão inferior à temperatura da água.
Permanece líquido até 40ºC.
Na técnica de Pour plate o ágar é mantido a 50ºC e é adicionado sobre o inóculo sem
afetar, ou causar danos a bactéria.
Dependendo de sua concentração os meios podem ser classificados quanto a
consistência:
- Líquido – menos de 1g de ágar por litro de água
- Semi-sólido – 4 g/L
- Sólido – 15 a 18 g/L
29
Classificação quanto à função dos meios:
-Seletivo
-Diferencial
-Enriquecedor
-Rico
-Transporte
30
Meios Seletivos
Favorece o crescimento da bactéria de interesse impedindo o crescimento de
outras bactérias.
Inibidores: substâncias capazes de inibir algumas bactérias que não são de interesse.
1) Corantes: verde brilhante, eosina, cristal violeta...
2) Metais pesados: Bismuto;
3) Substâncias químicas: azida, citrato, desoxicolato, selenito e álcool feniletílico...
4) Agentes antimicrobianos: vancomicina, cloranfenicol
5) Meio hipertônico: alta concentração de sal (7,5%)
31
Meio Diferencial
Utilizado para fácil detecção da colônia da bactéria de interesse quando existem outras
bactérias crescendo na mesma placa do meio
Substâncias utilizadas como indicadores de atividade enzimáticas que auxiliam na
identificação
-Indicadores de pH: fucsina, azul de metileno, vermelho neutro, vermelho de fenol e
púrpura de bromocresol. Medem as variações de pH que resultam do metabolismo
bacteriano de certos substratos.
- Indicadores diversos: detectam produtos bacterianos específicos. Ex.: íons ferro e ferroso
para a detecção de sulfato de hidrogênio
32
Indicadores de pH comumente usados em microbiologia
Indicador
pH ácido
pH básico
Andrade
róseo
amarelo
Púrpura de
bromocresol
amarelo
púrpura
Azul de bromotimol
amarelo
azul
Vermelho de
ortocresol
amarelo
vermelho
Vermelho de metila
vermelho
amarelo
Vermelho neutro
vermelho
amarelo
Vermelho de fenol
amarelo
vermelho
33
C.L.E.D. – Cistina – Lactose – Eletrólitos - Deficiente
Peptona ..........................................................7
Nitrogênio e
carbono
Extrato de levedura........................................2
Extrato de carne.............................................2
Cistina......................................................0,128
Lactose..........................................................10
Azul de Bromotimol..................................0,03
Açúcar
Indicador de pH
Ágar...............................................................12
34
CLED
(Cistina Lactose- Eletrólitos-Deficientes)
Com indicador azul de bromotimol
Lactose +
(Amarelo)
Meio diferencial
35
CLED
(Cistina Lactose- Eletrólitos-Deficientes)
Com indicador de Andrade!!
Lactose +
(Rosa)
Meio diferencial
36
Ágar MacConkey
Peptona de carne...................................................3
Peptona de caseína..............................................17
Nitrogênio e
carbono
NaCl.........................................................................5
Lactose..................................................................10
Sais biliares.........................................................1,5
Vermelho neutro................................................0,03
Cristal violeta...................................................0,001
Açúcar
Inibidor de
Gram+
Indicador de pH
Inibidor de
Gram+
Ágar....................................................................13,5
37
Meio Seletivo e Diferencial
Muito utilizado na rotina laboratorial
Ágar MacConkey – Seletivo e Diferencial
Seletivo: Cristal violeta e sais biliares – inibem bactérias Gram-positivo;
Diferencial: Este meio possui indicador de pH, por exemplo vermelho neutro:
quando o meio fica ácido a cor fica rosa.
Possui lactose que a bactéria pode degradar (fermentar) produzindo ácido
que diminui o pH do meio.
38
Lactose Lactose +
MacConkey
Cultura mista!!!!!!
Seletivo para enterobactérias
(Gram-negativo) a partir de
fezes, urina, alimentos,
água...
39
MacConkey
Cultura mista!!!!!!
1. Lactose –
2. Lactose +
Sais biliares e cristal violeta
inibem Gram-positivas
Meio seletivo e diferencial
40
Ágar Manitol Hipertônico
Peptona...............................................................10
Nitrogênio e
carbono
Extrato de carne..................................................1
Inibidor de algumas
NaCl.....................................................................75 Gram+
e das Gram -
Manitol................................................................10
Vermelho de fenol .......................................0,025
carboidrato
Indicador de pH
Ágar....................................................................12
Meio Seletivo e Diferencial
41
Ágar Manitol Hipertônico
Indicador Vermelho de fenol!!!
Manitol -
Manitol +
A degradação do manitol está relacionada com a patogenicidade, indicativo da presença
de Staphylococcus aureus.
Crescem apenas bactérias que suportam grande concentração de sal!
42
E.M.B.
(Eosina Azul de metileno)
Para isolamento de
Enterobactérias
(Gram–negativo)
Corantes inibem
Gram-positivo
Brilho verde metálico
Escherichia coli???
Bactérias produtoras de ácidos fortes formam
brilho verde metálico causado pela precipitação do
corante nas colônias: SUGESTIVO de E. coli!!!
Meio seletivo e diferencial
43
E.M.B.
(Eosina Azul de metileno)
Para isolamento de
Enterobactérias
(Gram–negativo)
Corantes inibem
Gram-positivo
Colônias pardo rósea
Produtora de ácido fraco
Ex: Enterobacter sp
Meio seletivo e diferencial
44
Meios de Cultura
Seletivo:
Favorece o crescimento do microrganismo de
interesse e impede o crescimento de outros.
Ex.: Ágar sulfeto de bismuto para isolamento de
Salmonella typhi a partir das fezes.
Meios
Diferencial:
Permite a fácil identificação da colônia da
bactéria de interesse, dentre as colônias de
outras bactérias crescidas no meio.
Ex.: Meio ágar sangue para detectar a presença
de Streptococcus pyogenes (forma-se um halo
claro em torno da colônia pela lise das
hemáceas)
45
Meio de enriquecimento
Incrementa o crescimento de certas espécies bacterianas ao mesmo tempo que inibe o
desenvolvimento de microrganismos que não sejam de interesse.
46
Caldo selenito e Caldo GN
Partem do princípio de que a E. coli e outros Gram-negativos da microbiota normal
são mantidos em fase de latência (Lag) prolongada pelas substâncias químicas
inibidoras.
As espécies de Salmonella e Shigella são menos inibidas, entram em uma fase de
crescimento exponencial (Log) e são isoladas com mais facilidade de amostras
fecais.
47
Caldo GN
Triptose..............................................................20
Glicose.................................................................1
Manitol.................................................................2
Hidrogenofosfato potássico..............................4
Base
nutritiva!!
carboidrato
carboidrato
Tampão
NaCl......................................................................5
Citrato de sódio..................................................5
Desoxicolato de sódio....................................0,5
Inibidores de
Gram+
48
Caldo selenito e Caldo GN
Incubação de no máximo 8 horas
Meio seletivo
X.L.D. ou Hektoen ou SS
49
Ágar SS (Salmonella/Shigella)
Peptonas.........................................................10
Lactose...........................................................10
Nitrogênio e
carbono
carboidrato
Bile de boi dessecada................................. 8,5 Inibidores de Gram+ e
algumas Gram -
Citrato de sódio.............................................10
Tiossulfato de sódio.....................................8,5
Indicador de H2S
Citrato de amônio e ferro III............................1
Verde brilhante........................................0,0003
Vermelho neutro.......................................0,025
Indicador de pH
Ágar.................................................................12
50
Ágar SS
(Salmonella/Shigella)
Salmonella sp
Lactose (Transparente)
Produção de H2S
(Com centro negro)
Meio Seletivo e diferencial: verde brilhante, bile e alta
concentração de tiossulfato e citrato inibem a microbiota
acompanhante de fezes, alimentos e outros materiais.
51
Lactose + E. coli - cor rosa
Rico X Enriquecimento
Rico:
é o meio que é suplementado com sangue, soro, suplementos
vitamínicos e extrato de levedura para isolar microrganismos exigentes.
Ex: ágar Mueller Hinton suplementado com 5% de sangue de carneiro e
ágar chocolate
Meio de enriquecimento:
Incrementa o crescimento de certas
espécies bacterianas ao mesmo tempo que inibe o desenvolvimento de
microrganismos que não sejam de interesse.
Ex.: Caldo GN e Caldo selenito.
52
Ágar Mueller Hinton
suplementado com sangue de
carneiro a 5%.
Meio rico
Permite o crescimento da
maioria das bactérias
Colônia
Hemólise
53
Meios de Cultura
Seletivo:
Favorece o crescimento do microrganismo de
interesse e impede o crescimento de outros.
Ex.: Ágar sulfeto de bismuto para isolamento de
Salmonella typhi a partir das fezes.
Diferencial:
Meios
Permite a fácil identificação da colônia da bactéria de
interesse, dentre as colônias de outras bactérias
crescidas no meio.
Ex.: Meio ágar sangue para detectar a presença de
Streptococcus pyogenes (forma-se um halo claro em
torno da colônia pela lise das hemáceas)
de Enriquecimento:
Semelhante ao seletivo, mas suplementado por
nutrientes especiais, com a característica de
aumentar o número da bactéria de interesse
tornando-a detectável.
54
Meio de transporte
Stuart
Mantem
o
microrganismo
viável,
mas
impede
o
crescimento e multiplicação até o subcultivo em meio
adequado.
Glicerol fosfato de sódio .......................................10
Tioglicolato de sódio................................................1
Cloreto de cálcio....................................................0,1
Azul de metileno................................................0,002
Ágar............................................................................8
55
Microrganismos em meio de cultura
56
Meio Mueller Hinton
Pseudomonas aeruginosa
Pigmento verde natural
Escherichia coli
Brilho verde metálico
somente no meio EMB!
Meio EMB
Serratia marcescens
Pigmento vermelho natural!!
57
Método de esgotamento em placa
Por estriamento
58