TRIAGEM FITOQUÍMICA E ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DO

UNIVERSIDADE FEDERAL DOS VALES DO JEQUITINHONHA E MUCURI
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
MICHAELLE GERALDA DOS SANTOS
TRIAGEM FITOQUÍMICA E ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DO
EXTRATO DICLOROMETANO-ETANÓLICO DE RAÍZES DE Eriosema
crinitum (Kunth) G. Don (Leguminosae)
Diamantina
2014
MICHAELLE GERALDA DOS SANTOS
TRIAGEM FITOQUÍMICA E ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DO
EXTRATO DICLOROMETANO-ETANÓLICO DE RAÍZES DE Eriosema
crinitum (Kunth) G. Don (Leguminosae)
Dissertação apresentada ao curso de Mestrado do
Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas da Universidade Federal dos Vales
do Jequitinhonha e Mucuri, como requisito
parcial à obtenção do título de Mestre em
Ciências Farmacêuticas.
Área de concentração: Farmacologia de produtos
naturais e plantas medicinais.
Orientador: Dr. Gustavo Eustáquio Brito Alvim
de Melo
Diamantina
2014
Ficha Catalográfica - Sistema de Bibliotecas/UFVJM
Bibliotecária: Jullyele Hubner Costa CRB-6/2972
S237t
2014
Santos, Michaelle Geralda dos.
Triagem fitoquímica e atividade antiproliferativa do extrato
diclorometano-etanólico de raízes de Eriosema crinitum (Kunth) G.
Don (Leguminosae) / Michaelle Geralda dos Santos. – Diamantina:
UFVJM, 2014.
99 p.: il.
Orientador: Prof. Dr. Gustavo Eustáquio Brito Alvim de Melo
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal dos Vales do
Jequitinhonha e Mucuri. Faculdade de Ciências Biológicas.
Mestrado - Programa de Pós Graduação em Ciências
Farmacêuticas, 2014.
1. Eriosema crinitum. 2. Inflamação. 3. Proliferação celular. I.
Melo, Gustavo Eustáquio Brito Alvim de. II. Título.
CDD 615.321
Elaborada com os dados fornecidos pelo(a) autor(a).
Triagem fitoquímica e atividade antiproliferativa do extrato diclorometano-etanólico de
Eriosema crinitum (Kunth) G. Don (Leguminosae)
Michaelle Geralda dos Santos
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação
em
Ciências
Farmacêuticas, nível de Mestrado, como
parte dos requisitos para obtenção do
título de Mestre.
APROVADA EM 21 / 02 / 2014
Prof.ª Edel Fi gueiredo Barbosa Stancioli – UFMG
Membro
Prof.ª Patrícia Machado de Oliveira – UFVJM
Membro
Prof. Gustavo Eustáquio Brito Al vim de Melo – UFVJM
Presidente
DIAMANTINA
2014
AGRADECIMENTOS
Ao maravilhoso Deus e à sua bondosa Mãe Nossa Senhora, por terem me concedido saúde,
sabedoria e perseverança em todos os momentos e pela graça da concretização desse sonho.
À minha querida mãe Douraci, pelo seu amor incondicional, pelo seu exemplo dual de mãe e
pai. Com sua fé inabalável, sempre participou de todas as minhas caminhadas. Você é a razão
de tudo!
Aos meus irmãos Michelle, Júnior e Roberto pela amizade, incentivo, carinho e pelo amor que
nos une.
À minha avó Judite, minha segunda mãe, sempre presente em minha vida, pelo amor, carinho
e pelas suas orações,
A todos os meus familiares que estiveram presentes durante esta jornada, em especial, à tia
Lourdes por me acolher em sua casa desde a época da graduação;
Ao meu tio Serafim Luciano Costa (Finfin) pelo auxílio na coleta da “Pustemeira”;
Ao meu namorado, Willian, pela sua presença constante, por todo amor, carinho, dedicação e
paciência;
Ao meu orientador, Prof. Dr. Gustavo Eustáquio Brito Alvim de Melo, grande exemplo de
competência; pelos ensinamentos, confiança, amizade, apoio, respeito e incentivo em todos os
momentos da realização desse trabalho. Por me ajudar em meu crescimento científico,
profissional e pessoal. Agradeço a oportunidade que me foi dada.
Ao pessoal do Herbário Dendrológico Jeanine Felfili, na pessoa do Prof. Dr. Evandro L. M.
Machado pela identificação taxonômica da planta que foi objeto desse estudo;
Ao Prof. Dr. Luiz Elídio Gregório pela colaboração, por toda atenção, dedicação e por sua
participação na análise química do extrato vegetal;
À Profa. Dra. Cristiane F.F. Grael pela colaboração e pelo auxílio na confecção do extrato
vegetal;
À Profa. Dra. Etel Rocha Vieira pela colaboração, atenção e disposição em ajudar;
Aos colegas e professores da Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas pela amizade, apoio
e bons momentos de convívio. Nós somos os pioneiros!
À toda equipe do Bioex, especialmente Rosa, Vinícius e Mariana pela amizade, parceria,
dedicação e atenção em todos os momentos;
À toda equipe do Labimuno, por terem me acolhido com carinho, pela atenção, dedicação,
pela transmissão de conhecimentos e, principalmente pela amizade. Em especial, agradeço à
Bethânia e Valéria: presentes de Deus em minha vida. Adoro vocês!
Às colegas Bárbhara e Débora, pelo auxílio na realização das reações cromogênicas e da
CCDC;
Enfim, a todas as pessoas que contribuíram direta ou indiretamente para a conclusão desse
trabalho: alunos, professores e funcionários. Meus sinceros agradecimentos!
“Change
your
opinions,
keep
to
your
principles; change your leaves, keep intact
your roots.”
Victor Hugo
RESUMO
A Eriosema crinitum (Kunth) G. Don é utilizada no Vale do Jequitinhonha como planta antiinflamatória na forma de decocção de suas raízes. Tendo em vista a complexidade do
processo inflamatório, o qual envolve a ativação de células do sistema imune e produção de
diversos mediadores, o objetivo desse estudo foi realizar uma triagem fitoquímica e avaliar a
possível atividade anti-inflamatória, in vitro, do extrato diclorometano-etanólico de raízes de
E. crinitum, através da avaliação do efeito do mesmo sobre a proliferação de linfócitos, a
produção de citocinas e da ciclooxigenase 2 (COX-2). A triagem fitoquímica do extrato foi
realizada por meio de reações cromogênicas, fluorogênicas e de precipitação, seguidas da
análise em cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detector de arranjo de diodos
(CLAE-DAD). A citotoxicidade do extrato sobre hemácias, após 4 horas de cultura, e sobre
leucócitos do sangue periférico humano, após 24 horas ou 5 dias de cultura, foi avaliada por
meio do teste de atividade hemolítica e pelo método de exclusão com azul de Tripan,
respectivamente. Na avaliação do efeito do extrato sobre a proliferação de linfócitos, por
citometria de fluxo, células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC) foram
incubadas, por 5 dias, em meio de cultura contendo o mitógeno Fitohemaglutinina (PHA), na
presença ou ausência do extrato nas concentrações de 25 μg/mL, 12,5 μg/mL e 6,25 μg/mL.
Essas mesmas culturas foram realizadas no tempo de 36 horas para análise da citocina IL-2,
por ELISA. Para análise da produção das citocinas TNF-α e IFN-γ, culturas de sangue total
foram estimuladas com Miristato Acetato de Forbol (PMA) e tratadas com o extrato nas
concentrações de 50 μg/mL, 25 μg/mL e 12,5 μg/mL. Essas concentrações foram utilizadas
em culturas de sangue total estimuladas com lipopolissacarídeo (LPS) para investigação do
efeito do extrato sobre a expressão de COX-2. A produção de citocinas e de COX-2 foi
analisada por citometria de fluxo. Os resultados evidenciaram a presença de terpenos e das
subclasses dos flavonoides: flavonas e flavonóis no extrato. O extrato, nas concentrações
iguais ou inferiores a 50 μg/mL, não foi tóxico para culturas celulares de 24 horas e, para
culturas de 5 dias, as concentrações não tóxicas foram iguais ou inferiores a 25 μg/mL.
Quanto à ação anti-inflamatória, o extrato não inibiu a produção das citocinas TNF-α e IFN-γ
e também não foi capaz de reduzir a expressão de COX-2. No entanto, o extrato inibiu a
proliferação de linfócitos e suas subpopulações T CD4 e TCD8, tendo uma eficácia em
relação à Dexametasona de 71,65%, 53,14% e 167,94% para linfócitos totais, T CD4 e T
CD8, respectivamente. O extrato também reduziu os níveis de IL-2 nas culturas estimuladas
com PHA. Esses achados sugerem que o extrato apresenta um efeito inibidor, principalmente
sobre a proliferação de células T CD8, associado à inibição na produção de IL-2. Diante dos
resultados apresentados, os princípios ativos presentes na planta parecem exercer suas funções
anti-inflamatórias regulando a proliferação de linfócitos T, principalmente os linfócitos T
CD8. Essa função poderia ser explorada em desordens de natureza inflamatórialinfoproliferativa, bem como prevenção da rejeição de transplantes de órgãos. Para tal, ensaios
adicionais são necessários para investigar e identificar os constituintes ativos e os mecanismos
moleculares envolvidos na ação inibitória apresentada pelo extrato.
Palavras-chave: Eriosema crinitum, inflamação, proliferação celular, IL-2.
ABSTRACT
The Eriosema crinitum (Kunth) G. Don is used in Jequitinhonha Valley as anti-inflammatory
plant in the form of decoction of its roots. Given the complexity of the inflammatory process,
which involves the activation of immune cells and production of several mediators, the aim of
this study was to perform a phytochemical screening and evaluate the potential antiinflammatory activity, in vitro, the dichloromethane-ethanol extract of the roots of E. crinitum
by assessing the effect of the same on lymphocyte proliferation, production of cytokines and
cyclooxygenase-2 (COX-2). The phytochemical screening of the extract was performed using
chromogenic reactions, fluorogenic and precipitation followed by analysis in high efficiency
liquid chromatography coupled with a diode array detector (HPLC-DAD). The cytotoxicity of
the extract after 24 hours or 5 days of culture on erythrocytes and leukocytes in human
peripheral blood was evaluated by the test of hemolytic activity and the method of exclusion
with Trypan blue, respectively. In evaluating of the effect of the extract on the proliferation of
lymphocytes by flow cytometry, mononuclear cells from human peripheral blood (PBMC)
have been incubated for 5 days in a culture medium containing the mitogen
Phytohemagglutinin (PHA) in the presence or absence of extract at concentrations of 25
μg/mL, 12.5 μg/mL and 6.25 μg/mL. These cultures too were performed in the time of 36
hours for analysis of IL -2 by ELISA. To analyze the production of cytokines TNF-α and
IFN-γ, whole blood cultures were stimulated with Phorbol Myristate acetate (PMA) and
treated with the extract at concentrations of 50 μg/mL, 25 μg/mL and 12.5 μg/mL. These
concentrations were used in whole blood cultures stimulated with lipopolysaccharide (LPS) to
investigate the effect of the extract on the expression of COX-2. Cytokine production and
COX-2 was analyzed by flow cytometry. The results showed the presence of terpenes and
subclasses of flavonoids: flavones and flavonols in extract. The extract, in concentration equal
or greater than 50 μg/mL was not toxic to cell cultures after 24 hours and in culture after 5
days, non- toxic concentrations were equal to or greater than 25 μg/mL. In relation to the antiinflammatory action, the extract did not inhibit the production of TNF-α and IFN-γ and also
was not able to reduce the expression of COX-2. Moreover, the extract inhibited the
proliferation of lymphocytes and their subpopulations CD4 and CD8, and its efficacy
compared to dexamethasone was 71.65%, 167.94% and 53.14% for total lymphocytes, CD4
and CD8, respectively. The extract also reduced the levels of IL-2 in cultures stimulated with
PHA. These findings suggest that the extract has an inhibitory effect, especially on the
proliferation of CD8 T cells associated with the inhibition of IL-2. Considering the presented
results, the active molecules present in the plant seem to play their anti-inflammatory
functions by regulating the T lymphocytes proliferation, mainly T CD8 lymphocytes. This
function could be exploited in inflammatory lymphoproliferative disorders, as well as in the
prevention of transplant rejection. Further trials are needed to investigate the active
constituents and the molecular mechanisms involved in the inhibitory action displayed by the
extract.
Keywords: Eriosema crinitum, inflammation, cellular proliferation, IL-2.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Eriosema crinitum. Estrutura total da planta (A e B), fruto legume (C) e flor
(D)........................................................................................................................................
29
Figura 2. Extrato diclorometano-etanólico (1:1) de raízes de E. crinitum........................... 39
Figura 3. Sequência de procedimentos utilizados para as análises de proliferação celular
pela diluição do VPD450.....................................................................................................
52
Figura 4. Sequência de procedimentos utilizados para a análise do percentual de
linfócitos positivos para as citocinas avaliadas....................................................................
57
Figura 5. Sequência de procedimentos utilizados para as análises de expressão de COX2............................................................................................................................................ 59
Figura 6. Pesquisa de taninos em raízes de Eriosema crinitum...........................................
61
Figura 7. Pesquisa de alcaloides em raízes de Eriosema crinitum....................................... 62
Figura 8. Pesquisa de flavonoides em raízes de Eriosema crinitum pelas reações de Pew
e de Shinoda.........................................................................................................................
63
Figura 9. Pesquisa de flavonoides em raízes de Eriosema crinitum pela reação com
Cloreto de Alumínio............................................................................................................. 63
Figura 10. Pesquisa de antraquinonas em raízes de Eriosema crinitum..............................
64
Figura 11. Pesquisa de saponinas em raízes de Eriosema crinitum.....................................
64
Figura 12. Pesquisa de esteroides e terpenos em raízes de Eriosema crinitum...................
65
Figura 13. Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC) para pesquisa de
terpenos em raízes de E. crinitum........................................................................................
66
Figura 14. Cromatograma da análise do extrato diclorometano-etanólico de raízes de
Eriosema crinitum por CLAE-DAD, modo Spectrum Max Plot.........................................
67
Figura 15. Cromatograma da análise do extrato em diclorometano-etanólico de raízes de
Eriosema crinitum no comprimento de onda de 288nm por CLAE-DAD..........................
68
Figura 16. Estrutura básica dos flavonoides e as principais subclasses...............................
69
Figura 17. Espectros em UV/Vis (190 – 600 nm) dos picos indicativos da presença de
flavonóis
no
extrato
diclorometano-etanólico
de
raízes
de
Eriosema
crinitum................................................................................................................................
70
Figura 18. Espectros em UV/Vis (190 – 600 nm) dos picos indicativos da presença de
flavonas
no
extrato
diclorometano-etanólico
de
raízes
de
Eriosema
crinitum................................................................................................................................
71
Figura 19. Percentual de hemólise em culturas tratadas com diferentes concentrações do
extrato diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum e com o controle do solvente
DMSO 2% (n = 8) após 4 h de cultura................................................................................. 73
Figura 20. Efeito do extrato diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum sobre a
viabilidade celular, após 24 horas de cultura.......................................................................
74
Figura 21. Efeito do extrato diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum sobre a
viabilidade celular, após 5 dias de cultura ........................................................................... 75
Figura 22. Efeito do extrato diclorometano-etanólico de E. crinitum (DE) sobre a
proliferação de linfócitos...................................................................................................... 77
Figura 23. Efeito do extrato diclorometano-etanólico de E. crinitum (DE) sobre a
produção de IL-2..................................................................................................................
79
Figura 24. Efeito do extrato diclorometano-etanólico de E. crinitum (DE) sobre o
percentual de linfócitos TNF-α+ (A) e de linfócitos IFN-γ+ (B)......................................... 80
Figura 25. Análise da intensidade média de fluorescência (IMF) de monócitos COX2+.......................................................................................................................................... 81
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Posição sistemática da espécie Eriosema crinitum................................................. 29
Tabela 2. Mediadores inflamatórios e respostas celulares desencadeadas.............................
31
Tabela 3. Reativos Gerais de Alcaloides (RGA) utilizados na pesquisa da presença de
alcaloides nas raízes de Eriosema crinitum............................................................................
41
Tabela 4. Composição do gradiente de fase móvel utilizado na análise em CLAE-DAD do
extrato diclorometano-etanólico de Eriosema crinitum.........................................................
46
Tabela 5. Anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos utilizados para análise de
populações linfocitárias, marcação de citocinas e análise da enzima ciclooxigenase............ 53
Tabela 6. Pesquisa de classes de metabólitos secundários em raízes de E.
crinitum................................................................................................................................... 66
Tabela 7. Faixa de absorção e intensidade das bandas I e II para identificação das
subclasses de flavonoides.......................................................................................................
69
Tabela 8. Caracterização dos voluntários...............................................................................
72
Tabela 9. Índice de proliferação para linfócitos e suas subpopulações em culturas não
estimuladas com PHA............................................................................................................
78
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BSA
Bovine serum albumin
CFSE
Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester
CIPq-Saúde
Centro Integrado de Pós-Graduação e Pesquisa em Saúde
CLAE-DAD
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detector de Arranjo de
Diodos
COX
Ciclooxigenase
DE
Extrato Diclorometano-etanólico de Eriosema crinitum
dL
Decilitro
DEXA
Dexametasona
DMSO
Dimetilsulfóxido
ELISA
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
EUA
Estados Unidos
FITC
Isotiocianato de Fluoresceína
fL
Fentolitro
FR
Fator de Retenção
FSC-A
Forward side scatter – área
FSC-H
Forward side scatter – altura
G
Grama
HRP
Horseradish Peroxidase
ICAM-1
Molécula Intercelular de Adesão 1
IE
Índice de Espuma
IFN-γ
Interferon gamma
iNOS
Óxido Nítrico Sintase induzível
IL-1
Interleucina 1
IL-1Ra
Antagonista do Receptor de IL-1
IL-2
Interleucina 2
IL-4
Interleucina 4
IL-5
Interleucina 5
IL-6
Interleucina 6
IL-9
Interleucina 9
IL-10
Interleucina 10
IL-12
Interleucina 12
IL-13
Interleucina 13
IL-17
Interleucina 17
IL-18
Interleucina 18
IL-21
Interleucina 21
IL-22
Interleucina 22
IP
Índice de Proliferação
LPS
Lipopolissacarídeo
Μg
microgramas
Μm
micrômetro
μM
Micromolar
mAU
mili unidades de absorbância
MG
Minas Gerais
mL
mililitros
Nm
Nanômetro
MS
Ministério da Saúde
NK
Natural killer
OMS
Organização Mundial da Saúde
PAF
Fator Ativador de Plaquetas
PBMC
Células Mononucleares do Sangue Periférico
PBS
Tampão Fosfato Salina
PBS-W
Tampão Fosfato Salina – Wash
PBS-P
Tampão Fosfato Salina de Permeabilização
PE
Ficoeritrina
PerCP-Cy5.5
Proteína Clorofila Peridinina combinada a Cianina
Pg
Picograma
PHA
Fitohemaglutinina
PMA
Miristato Acetato de Forbol
PNPIC
Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares
RENAME
Relação Nacional de Medicamentos Essenciais
RGA
Reativos Gerais de Alcaloides
PRR
Receptores de Reconhecimento de Padrões
SP
São Paulo
SSC-A
Side light scatter - área
SSC-H
Side light scatter - altura
SUS
Sistema Único de Saúde
TFA
Trifluoroacético
TGF-β
Fator de Crescimento Transformante beta
TLR
Receptores do tipo “Toll” (do inglês: Toll-like Receptors)
TMB
3,3’, 5,5’ tetrametilbenzidina
TNF-α
Fator de Necrose Tumoral alpha
UFVJM
Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri
VCAM-1
Molécula de adesão vascular celular 1
UV/Vis
Ultravioleta/Visível
VPD450
Violet Proliferation Dye 450
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.....................................................................................................................
22
2 REVISÃO DE LITERATURA.............................................................................................. 23
2.1 Plantas medicinais.........................................................................................................
23
2.2 A família Leguminosae (Fabaceae) e o gênero Eriosema............................................. 25
2.3 Composição química e investigação de atividades biológicas de espécies do gênero
Eriosema ............................................................................................................................. 26
2.4 Eriosema crinitum.........................................................................................................
28
2.5 Resposta inflamatória....................................................................................................
30
3 JUSTIFICATIVA..................................................................................................................
36
4 OBJETIVOS..........................................................................................................................
38
4.1 Objetivo Geral...............................................................................................................
38
4.2 Objetivos Específicos....................................................................................................
38
5 METODOLOGIA..................................................................................................................
39
5.1 Material vegetal............................................................................................................. 39
5.1.1 Coleta e identificação taxonômica.............................................................................
39
5.1.2 Preparo do extrato bruto.............................................................................................
39
5.2 Triagem fitoquímica das principais classes de metabólitos secundários presentes nas
raízes de E. crinitum............................................................................................................ 40
5.2.1 Pesquisa de taninos..................................................................................................... 40
5.2.2 Pesquisa de alcaloides................................................................................................
41
5.2.3 Pesquisa de flavonoides.............................................................................................
42
5.2.4 Pesquisa de antraquinonas.......................................................................................... 43
5.2.5 Pesquisa de saponinas e índice de espuma................................................................. 43
5.2.6 Pesquisa de esteroides e terpenos............................................................................... 44
5.3 Análise do extrato diclorometano-etanólico de E. crinitum por Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência acoplada a Detector de Arranjo de Diodos (CLAEDAD)...................................................................................................................................
45
5.4 Critérios de inclusão e sujeitos da pesquisa..................................................................
46
5.5 Amostra biológica.........................................................................................................
47
5.6 Parâmetros hematológicos............................................................................................. 47
5.7 Obtenção das Células Mononucleares do Sangue Periférico (PBMC) humano...........
47
5.8 Avaliação da citotoxicidade do extrato diclorometano-etanólico de raízes de E.
crinitum, in vitro.................................................................................................................. 48
5.8.1 Avaliação da atividade hemolítica do extrato diclorometano-etanólico de raízes de
E. crinitum...........................................................................................................................
48
5.8.2 Efeito do extrato diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum sobre a
viabilidade de PBMC humanas...........................................................................................
49
5.9 Análise do efeito do extrato diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum sobre
a proliferação de linfócitos humanos..................................................................................
50
5.10 Anticorpos utilizados................................................................................................... 53
5.11 Avaliação do efeito do extrato diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum
sobre produção de citocinas por linfócitos humanos, in vitro............................................. 54
5.11.1 Avaliação do efeito extrato diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum
sobre a produção de IL-2..................................................................................................... 54
5.11.2 Avaliação do efeito do extrato diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum
sobre a produção de IFN-γ e TNF-α...................................................................................
56
5.12 Avaliação do efeito do extrato diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum
sobre a expressão de COX-2...............................................................................................
58
6 ANÁLISE ESTATÍSTICA....................................................................................................
60
7 RESULTADOS ..................................................................................................................... 61
7.1 Triagem fitoquímica das principais classes de metabólitos secundários presentes nas
raízes de E. crinitum............................................................................................................ 61
7.2 Análise do extrato em diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum por
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a Detector de Arranjo de Diodos
(CLAE-DAD)...................................................................................................................... 67
7.3 Análise de hemogramas dos sujeitos da pesquisa.........................................................
72
7.4 Citotoxicidade do extrato diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum...............
72
7.5 Efeito do extrato diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum sobre a
proliferação de linfócitos humanos.....................................................................................
75
7.6 Efeito do extrato diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum sobre a produção
de IL-2 por linfócitos humanos...........................................................................................
78
7.7 Efeito do extrato diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum sobre a produção
de TNF-α e IFN-γ por linfócitos humanos..........................................................................
7.8 Efeito do extrato diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum sobre a expressão
79
de COX-2............................................................................................................................
81
8 DISCUSSÃO DOS RESULTADOS.....................................................................................
82
9 CONCLUSÃO.......................................................................................................................
86
REFERÊNCIAS........................................................................................................................ 87
ANEXO A................................................................................................................................. 97
22
1 INTRODUÇÃO
As plantas medicinais têm sido utilizadas desde a antiguidade para a cura de diversas
doenças. Muitos compostos bioativos foram descobertos a partir de fontes naturais e são hoje
utilizados no tratamento de diversas doenças.
O Brasil possui uma das maiores biodiversidades do mundo e o Cerrado contribui
relevantemente para essa posição. Porém, estudos acerca das atividades biológicas da grande
maioria das espécies vegetais ainda são escassos. Assim, pesquisas que envolvam espécies
presentes nesse bioma são de grande relevância para contribuir com a obtenção de respaldo
científico na utilização de plantas medicinais pela população, para a valorização da riqueza
vegetal e para a possibilidade de descoberta de substâncias bioativas com potencial para o
desenvolvimento de novos fármacos.
A família Leguminosae (Fabaceae) é uma das famílias mais expressivas em termos de
número de espécies no Cerrado. Dentre essas espécies se encontra a Eriosema crinitum
(Kunth) G. Don, uma planta que tem sido utilizada há tempos por raizeiros de Diamantina e
região para fins anti-inflamatórios. Porém, não existem relatos na literatura sobre a avaliação
da composição química ou da bioatividade de extratos dessa planta.
Diante disso, iniciamos o presente estudo com o intuito de investigar, primeiramente, a
toxicidade do extrato diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum sobre hemácias e
leucócitos do sangue periférico humano, in vitro. Em seguida, realizamos uma caracterização
química preliminar do extrato vegetal de forma paralela à avaliação de seu efeito inibitório
sobre a produção de citocinas pró-inflamatórias e sobre a expressão da enzima ciclooxigenase
2 (COX-2), bem como sobre a proliferação de linfócitos do sangue periférico humano, in
vitro.
23
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Plantas medicinais
A utilização de plantas com fins medicinais para tratamento, cura e prevenção de
doenças é uma das mais antigas formas de prática medicinal da humanidade (RATES, 2001).
A Organização Mundial da Saúde (OMS), considerando as plantas medicinais como
importantes instrumentos da assistência farmacêutica, tem expressado, por meio de vários
comunicados e resoluções, sua posição a respeito da necessidade de valorizar a sua utilização
no âmbito sanitário ao observar que 70% a 90% da população nos países em vias de
desenvolvimento dependem delas no que se refere à Atenção Primária à Saúde (WHO, 1993;
WHO, 2011).
Apesar da grande evolução da medicina alopática, a partir da segunda metade do
século XX, têm existido obstáculos básicos na sua utilização pelas populações carentes, que
vão desde o acesso aos centros de atendimento hospitalares à obtenção de exames e
medicamentos. Estes motivos, associados à fácil obtenção e à grande tradição do uso de
plantas medicinais, contribuem para sua utilização pelas populações dos países em
desenvolvimento (VEIGA JÚNIOR, PINTO e MACIEL, 2005).
Segundo Calixto (2000a), entre as várias razões que têm proporcionado o interesse da
população pelos medicamentos fitoterápicos, pode-se mencionar a preferência por terapias
naturais; os efeitos colaterais observados com os medicamentos sintéticos e a crença errônea
de que os medicamentos fitoterápicos não possuem efeitos colaterais; a tendência da
população em acreditar que os medicamentos fitoterápicos podem ser efetivos nos tratamentos
de doenças quando os medicamentos sintéticos falham; a automedicação; a existência de
estudos científicos para alguns produtos fitoterápicos e o alto custo dos medicamentos
sintéticos.
A utilização de componentes químicos derivados de produtos naturais é
reconhecidamente importante na produção e desenvolvimento de fármacos (CALIXTO et al.,
2000b). Estima-se que cerca de 40% dos medicamentos disponíveis foram desenvolvidos a
partir de fontes naturais, sendo que dentre essa porcentagem, aproximadamente 25% são
derivados direta ou indiretamente de constituintes químicos vegetais (CALIXTO et al.,
2000b; RATES, 2001).
24
Assim, as plantas com finalidades terapêuticas, além de seu uso na medicina popular,
têm contribuído, ao longo dos anos, para a obtenção, de forma direta ou indireta, de vários
fármacos, até hoje amplamente utilizados na clínica, como a morfina (Papaver somniferum
L.), os glicosídeos cardiotônicos digitoxina (Digitalis purpurea L.) e a digoxina (Digitalis
lanata Ehr.), os antimaláricos quinina (Cinchona spp) e artemisina (Artemisia annua), bem
como vários medicamentos utilizados no tratamento do câncer, como vimblastina e vincristina
(Catharanthus roseus), o taxol (Taxus brevifolia), dentre vários outros com funções
terapêuticas diversas (CALIXTO, 2001).
A pesquisa por novos produtos bioativos de origem vegetal pode ser feita de forma
randômica, por observação ecológica ou etnobotânica (BASSO et al., 2005). A pesquisa
randômica é extremamente laboriosa e fornece uma taxa muito baixa de sucesso. A
observação ecológica consiste em buscar bioatividade a partir de plantas de áreas que indicam
a presença de compostos ativos como aquelas em que há ausência de herbívoros, indicando
ocorrência de substâncias tóxicas ou através da zoofarmacognosia, em que o alvo são as
plantas ingeridas por animais, principalmente primatas, para alívio de sintomas (BERRY et
al., 1995). A pesquisa etnobotânica utiliza o conhecimento popular para selecionar as plantas
que serão estudadas e, ao contrário da pesquisa randômica, a etnobotânica apresenta uma alta
probabilidade de obtenção de compostos com alguma atividade biológica (BASSO et al.,
2005).
Nos últimos anos, as pesquisas etnobotânicas vêm crescendo, particularmente em
países como o Brasil. O enfoque dos trabalhos varia conforme a região, mas o tema
predominantemente contemplado aborda o âmbito das plantas medicinais (OLIVEIRA et al,
2009).
Tendo em vista que o Brasil se configura como um dos países com a maior
biodiversidade do mundo, o país encontra-se em uma posição estratégica para desenvolver
uma exploração racional e sustentada de novas substâncias de valor terapêutico (MYERS, et
al., 2000; BASSO et al., 2005). Grande parte das plantas nativas brasileiras ainda não tem
estudos e muitas espécies são utilizadas sem respaldo cientifico quanto à eficácia e segurança,
o que demonstra a existência de uma enorme lacuna entre a oferta de plantas e as poucas
pesquisas. Desta forma, considera-se este um fator de grande incentivo ao estudo com plantas,
visando sua utilização como fonte de recursos terapêuticos, pois o reino vegetal representa,
em virtude da pouca quantidade de espécies estudadas, um vasto celeiro de moléculas a serem
descobertas (FOGLIO et al., 2006).
25
A biodiversidade brasileira está distribuída em seis biomas, sendo o Cerrado brasileiro
a segunda maior área de plantas nativas do país, sendo considerado um hotspot mundial; uma
área que concentra grande biodiversidade e é prioritária para conservação (MYERS et al.,
2000; BASSO et al., 2005; JOLY et al., 2011). As plantas encontradas no Cerrado despertam
o interesse da indústria de medicamentos, pois estas constituem fontes de compostos bioativos
(CARAMORI et al., 2004). Embora haja relatos de atividades biológicas de espécies
presentes no Cerrado, sendo muitas plantas utilizadas pela população residente como agentes
antimicrobianos, anti-inflamatórios e antifúngicos, dentre outras atividades (BOONCLARM
et al., 2006; REBECC et al., 2010; SILVA et al., 2009), existem poucos estudos sobre os
efeitos terapêuticos dos extratos brutos, ou compostos isolados, provenientes de plantas deste
bioma (NAPOLITANO et al., 2005).
2.2 A família Leguminosae (Fabaceae) e o gênero Eriosema
Leguminosae (ou Fabaceae) representa uma das maiores famílias dentre as
Angiospermas. É de distribuição cosmopolita e ocorre em diferentes latitudes e altitudes, nos
mais variados ambientes (JOLY, 1975). No Brasil ocorrem aproximadamente 200 gêneros e
1.500 espécies (SOUZA e LORENZI, 2005), dos 630 gêneros e 18.000 espécies existentes na
família (JUDD et al., 2002).
As espécies representantes dessa família destacam-se principalmente por sua
importância econômica, pois são amplamente utilizadas na alimentação humana, com
espécies como Phaseolus vulgaris L. (feijão) e Arachis hypogaea L. (amendoim), fornecem
matéria-prima para medicamentos, fragrâncias, madeiras nobres e óleos, bem como para fins
paisagísticos (POLHILL et al., 1981; HEYWOOD, 1993, ALVES, 2008).
Em termos taxonômicos, reconhece-se Leguminosae como uma família monofilética
dividida em três subfamílias: Caesalpinioideae, Mimosoideae e Papilionoideae (LEWIS et al.,
2005, ALVES, 2008). Papilionoideae é considerada a maior subfamília dentre as
Leguminosae, abrangendo dois terços dos gêneros e espécies (LEWIS et al., 2005).
O gênero Eriosema pertence à subfamília Papilionoideae e foi descrito em 1825 por
Auguste Pyramo De Candolle, que tratou o gênero como uma seção do gênero Rhynchosia,
com oito espécies, com a ressalva de que poderia ser elevado à categoria genérica (GREAR,
1970). Após revisão por Desvaux, em 1826, foi elevado a gênero com o nome de Euriosma
Decand. Porém, devido a dúvidas sobre a ortografia e a autoria do gênero ter gerado confusão,
26
somente no ano 2000 o termo Eriosema foi definido, e finalmente atribuído a Desvaux que
publicou a alteração ortográfica (FORTUNATO et al., 2002).
Eriosema (DC.) Desv. é um gênero pantropical e inclui cerca de 150 espécies com o
centro de diversidade na África. No continente americano está representado por 38 espécies,
das quais 30 encontram-se na América do Sul (LEWIS et al., 2005). Grear (1970), no entanto,
registrou a ocorrência de 32 espécies somente no Brasil.
O gênero Eriosema inclui ervas eretas, ou subarbustos, são, geralmente, perenes,
contêm xilopódio ou raízes napiformes ou fusiformes, flores amarelas e fruto legume reto,
geralmente pubescente. Podem ser encontradas em campos graminosos até arbustivos,
campos rupestres, áreas úmidas, pastagens e áreas degradadas (ROGALSKI e MIOTTO,
2011).
2.3 Composição química e investigação de atividades biológicas de espécies do gênero
Eriosema
O primeiro estudo fitoquímico com espécies do gênero Eriosema foi realizado por Ma et
al. (1995), onde foram isoladas e identificadas nove substâncias no extrato diclorometânico de
raízes da espécie E. tuberosum, uma espécie encontrada na Província Yunnan, na China. As
substâncias são pertencentes às classes das flavanonas, isoflavanonas, chalconas e cromonas.
Cinco das nove substâncias isoladas mostraram atividade antifúngica contra Cladosporium
cucumerinum e Candida albicans.
Em 1996, Ma et al. isolaram e identificaram seis cromonas (iso-eriosematin, eriosematin
A, B, C, D e E)
também a partir do extrato diclorometânico de raízes da espécie E.
tuberosum. As cromonas eriosematin A, D e E inibiram o crescimento de Cladosporium
cucumerinum e de Candida albicans.
A partir de repetidas purificações cromatográficas da fração solúvel em butanol do
extrato metanólico de E. tuberosum, foram identificadas sete substâncias: cinco
isoflavonoides glicosídicos e duas isoflavononas (MA et al., 1998), além de três novos
fenólicos glicosídicos e quatro constituintes fenólicos não glicosídicos já conhecidos. Os
compostos fenólicos foram tóxicos para o fungo Cladosporium herbarum (MA et al., 1999).
Outra espécie do gênero Eriosema, a E. kraussianum, é utilizada na África do Sul para
tratamento de impotência sexual em homens. Em um estudo do extrato de raízes dessa planta
em mistura de diclorometano e etanol na proporção de 1:1, foram isoladas e identificadas
27
cinco novas pirano-isoflavonas, denominadas Kraussianona 1, 2, 3, 4 e 5. As Kraussianonas 1
e 2 demonstraram atividade de relaxamento do músculo liso comparável àquela encontrada
para o citrato de sildenafil (Viagra®) no teste de disfunção erétil em músculo liso de pênis de
coelho, no qual esse medicamento foi utilizado como referência para comparação (DREWES
et al., 2002). Em 2004, Drewes et al. isolaram outras 2 pirano-isoflavonas (Kraussianona 6 e
7) e demonstraram que as Kraussianonas 3 e 5, isoladas anteriormente e presentes em menor
quantidade no extrato de raízes de E. kraussianum, tiveram efeito contrário ao do Viagra®
quando realizaram o teste de disfunção erétil como no estudo anterior. Ainda em estudos com
E. kraussianum, Ojewole, Drewes e Khan (2006), demonstraram que as Kraussianonas 1 e 2,
presentes em extrato hidro-etanólico das raízes dessa planta reduziram os níveis glicêmicos
em um modelo experimental com ratos.
Em um estudo utilizando um modelo experimental de pré-eclâmpsia com ratas, foram
verificados vários efeitos da Kraussianona 2, isolada de extrato diclorometânico das raízes de
E. kraussianum, quando essa substância foi administrada a ratas, dentre os quais foram
observados: redução da mortalidade fetal, decréscimo da pressão sanguínea e da concentração
de dois fatores antiangiogênicos solúveis no plasma, tirosina kinase 1 semelhante a fms (sFlt1) e endoglina (sEng) (RAMESAR et al., 2012).
Outra espécie encontrada na África do Sul é a E. glomerata, da qual foram isoladas, a
partir do extrato diclorometano-metanólico (1:1), duas novas diidrochalconas, denominadas
Erioschalconas A e B. Essas substâncias inibiram o crescimento de quatro microrganismos:
Bacillus megaterium, Escherichia coli, Chlorella fusca e Microbotryum violaceum
(AWOUAFACK et al., 2008).
O extrato etanólico de partes aéreas de E. robustum, espécie encontrada no Leste e área
Central da África, apresentou atividade anti-fúngica e antimicrobiana, inibindo o crescimento
dos microrganismos Aspergillus fumigatus, Cryptoccocus neoformans, Staphylococcus
aureus, Enterococcus faecalis e Escherichia coli (AWOUAFACK et al., 2013). Awouafack,
Tane e Eloff (2013) isolaram duas novas flavonas a partir do extrato etanólico de partes aéreas
dessa espécie, denominadas robusflavona A e B, as quais exibiram significante atividade
antioxidante, sendo que nos estudos de Awouafack et al. (2013) essas substâncias
apresentaram moderada atividade anti-fúngica e antimicrobiana.
Em um estudo utilizando extratos hexânico e diclorometânico de raízes de E. chinense,
uma espécie encontrada na Tailândia, foram isolados oito novos flavonoides prenilados,
denominados khonklonginols A-H, dentre os quais alguns demonstraram citotoxicidade sobre
28
linhagens de células humanas de carcinoma de células pequenas do pulmão (NCI-H187) e
carcinoma epidermal oral (KB), bem como exibiram atividade contra Mycobacterium
tuberculosis H37Ra (SUTTHIVAIYAKIT et al., 2009).
Prasad et al. (2013) avaliaram o extrato etanólico das raízes da espécie E. chinense,
encontrada no nordeste da Índia, e validaram o potencial antidiarréico dessa planta, o qual foi
atribuído pelos efeitos do tipo antimotilidade e antissecretório gastrintestinais associados com
atividade antibacteriana contra cepas de bactérias implicadas na diarreia. Nesse estudo, o
extrato e sua fração em clorofórmio mostraram-se ricos em flavonoides, fenóis, alcalóides e
taninos, sendo que o constituinte isolado que também apresentou atividade antidiarreica é uma
flavanona prenilada denominada lupinifolina.
Thongnest et al. (2013), também estudaram a espécie E. chinense e, através de métodos
espectroscópicos, elucidaram estruturas de seis flavonoides prenilados, uma isoflavona, além
de outros 12 substâncias conhecidas a partir dos extratos em hexano, diclorometano e etanol
de raízes dessa planta. Alguns dos flavonoides isolados apresentaram atividade antioxidante e
antimicrobiana.
A espécie E. laurentii, encontrada na África, é utilizada em Camarões para tratamento
de infertilidade e outras doenças ginecológicas, bem como para os sintomas relacionados á
menopausa. Recentemente, um estudo demonstrou que o extrato metanólico de partes aéreas
dessa espécie teve propriedades semelhantes ao estrógeno, pois preveniu a secura e atrofia
vaginal e a perda de massa óssea em ratas ovariectomizadas, além de melhorar o perfil
lipídico dos animais. Os autores também encontraram que os constituintes majoritários do
extrato, sendo provavelmente os responsáveis pela atividade do mesmo, foram os
isoflavonoides genistina e genisteína (ATEBA et al., 2013).
2.4 Eriosema crinitum
Dentre as espécies do gênero Eriosema, encontra-se a Eriosema crinitum (Kunth) G.
Don, uma planta nativa do Brasil, encontrada nos estados de Goiás, Mato Grosso, Minas
Gerais, Paraná, Rio de Janeiro e São Paulo (GREAR 1970; FORTUNATO, 1999). Seu habitat
consiste de campos secos, arbustivos e campos cerrados, caracterizada por ser uma planta de
pequeno porte, ervas eretas com 14 a 17,5 cm de altura, com flores amarelas e raízes
fusiformes, de difícil visualização em campo (Figura 1). A posição sistemática da E. crinitum
está indicada na Tabela 1.
29
A
B
C
D
Figura 1. Eriosema crinitum. Estrutura total da planta (A e B), fruto legume (C) e flor (D).
Tabela 1. Posição sistemática da espécie Eriosema crinitum
Categoria
Reino
Divisão
Classe
Ordem
Família
Subfamília
Tribo
Gênero
Espécie
Nome científico
Plantae
Tracheophyta
Magnoliopsida
Fabales
Fabaceae/Leguminosae
Papilionoideae
Phaseoleae
Eriosema
Eriosema crinitum
Popularmente conhecida como “Pustemeira”, E. crinitum é utilizada por raizeiros em
Diamantina e região para o tratamento de processos inflamatórios na forma de decocção de
suas raízes. No entanto, em levantamento bibliográfico recente, não foram encontrados
estudos que tenham avaliado os mecanismos envolvidos na atividade anti-inflamatória
atribuída à espécie ou que tenham investigado a composição química das raízes da planta.
30
2.5 Resposta inflamatória
A reação inflamatória é um evento complexo que envolve o reconhecimento do
agente/estímulo lesivo, para sua posterior destruição ou neutralização, seguido da tentativa de
reconstruir o tecido danificado. A presença desse agente lesivo desencadeia a ativação e a
amplificação do sistema imune resultando na ativação de células e na liberação de diversos
mediadores responsáveis pela resposta inflamatória. No entanto, se a destruição do agente
agressor e o processo de reparo não ocorrem de maneira eficiente e sincronizada, a resposta
inflamatória pode levar a uma lesão tecidual persistente induzida pelo acúmulo de leucócitos,
colágeno e outras substâncias que podem ser prejudiciais ao organismo (NATHAN, 2002).
Macroscopicamente a resposta inflamatória é caracterizada pelos sinais da
inflamação, descritos por Cornelius Celsus no século I dC, a saber: calor, rubor, tumor e dor.
No século XVIII, Rudolf Virchow acrescentou a perda de função aos sinais descritos por
Celsus (MEDZHITOV, 2010).
Esses sinais refletem, na verdade, as mudanças hemodinâmicas (ou vasculares) e
celulares que ocorrem durante a inflamação. As mudanças hemodinâmicas são caracterizadas
pela vasodilatação arteriolar e um aumento localizado da permeabilidade microvascular.
Todas as etapas que constituem o processo inflamatório, como vasodilatação, aumento da
permeabilidade vascular e migração celular, são reguladas pela ação de vários mediadores
liberados durante uma lesão tecidual ou na presença de microrganismos patogênicos,
alérgenos, compostos tóxicos, corpos estranhos e irritantes. Esses mediadores que orquestram
o processo inflamatório são derivados de proteínas presentes no plasma ou produzidos e
liberados por células endoteliais, leucócitos infiltrados no sítio inflamatório ou por células
residentes. Além disso, podem ser classificados de acordo com suas propriedades bioquímicas
em sete grupos (MEDZHITOV, 2008; GILROY et al., 2004), conforme representado na
Tabela 2.
31
Tabela 2. Mediadores inflamatórios e respostas celulares desencadeadas
Grupo
Mediador
Resposta
1
Aminas vasoativas (histamina e
serotonina).
Aumento da permeabilidade vascular, vasodilatação
ou vasoconstrição.
2
Peptídeos vasoativos (substância P,
cininas, fibrinopeptídeos A e B e
produtos da degradação da fibrina).
Degranulação de mastócitos
Vasodilatação e aumento
vascular.
3
Fragmentos do complemento (C3a,
C4a e C5a).
Recrutamento de granulócitos e monócitos e
induzem a degranulação de mastócitos.
4
Mediadores lipídicos (leucotrienos,
tromboxanos, prostaglandinas e fator
ativador de plaquetas).
Vasodilatação (ou vasoconstrição), recrutamento de
leucócitos, aumento da permeabilidade vascular e
ativação de plaquetas.
5
Enzimas proteolíticas (elastina,
catepsina e metaloproteinases da
matriz).
Defesa do hospedeiro, remodelagem tecidual e
migração leucocitária.
6
Quimiocinas.
Extravasamento e quimiotaxia de leucócitos.
7
Citocinas
da
permeabilidade
Efeitos locais: indução da expressão de moléculas
de adesão e de quimiocinas, facilitando a migração
de leucócitos.
Efeitos sistêmicos: indução de proteínas de fase
aguda levando à febre.
Durante o processo inflamatório as células endoteliais que revestem os vasos são
ativadas por diversos mediadores inflamatórios (histamina, trombina, fator ativador de
plaquetas (PAF) e citocinas) e expressam moléculas de adesão que se ligam a moléculas
complementares expressas na membrana celular dos leucócitos promovendo a rolagem e a
firme adesão dos leucócitos às células do endotélio e, posteriormente, sua transmigração para
o sítio inflamatório. Esses eventos celulares (rolagem, adesão e migração) são propiciados por
proteínas expressas na membrana celular endotelial e também nos leucócitos, conhecidas
como moléculas de adesão ou adressinas. A expressão dessas moléculas de adesão é regulada
pelos vários mediadores inflamatórios (POBER e SESSA, 2007; LANGER e CHAVAKIS,
2009).
No tecido, a distinção da infecção/lesão é feita por células do sistema imune inato
através de receptores expressos em suas membranas que reconhecem estruturas moleculares
do agente agressor, conhecidos como Receptores de Reconhecimento de Padrões. Um
exemplo desse reconhecimento é a identificação de patógenos pelos receptores do tipo “Toll”
32
(TLR) expressos nas membranas de macrófagos, células dendríticas e mastócitos residentes
no tecido, levando à produção de uma ampla gama de mediadores inflamatórios tais como
moléculas quimiotáticas (quimiocinas) e as citocinas Fator de Necrose Tumoral alpha (TNFα), Interleucina (IL)-1 e IL-6 que, por sua vez, agem induzindo a expressão de moléculas de
adesão e o aumento da permeabilidade do endotélio de forma a provocar o extravasamento de
proteínas plasmáticas e leucócitos (principalmente neutrófilos), que são normalmente restritos
aos vasos sanguíneos, para o espaço extravascular onde se encontra o sítio de infecção/lesão
(ZENZ et al., 2008; APOSTOLAKI et al., 2010; MEDZHITOV, 2010).
Os leucócitos mono e polimorfonucleares do sistema fagocítico efetuam a fagocitose e
a eliminação de agentes invasores/agressores e restos celulares durante a inflamação.
Portanto, a migração dos leucócitos, antes restritos ao lúmen dos vasos, para o espaço
extravascular e subsequentemente para o foco inflamatório é um evento fundamental para
uma resposta inflamatória. Essas células são responsáveis por conter e destruir
microrganismos patogênicos através da fagocitose e da liberação de espécies reativas de
oxigênio, de nitrogênio e enzimas proteolíticas presentes em seus grânulos (YONEKAWA e
HARLAN, 2005; MEDZHITOV, 2010). No entanto, essas substâncias não são específicas a
ponto de destruir somente o agente agressor e também promovem danos teciduais. Embora os
leucócitos sejam críticos para a defesa do hospedeiro, sendo os efetores primários da
inflamação e respostas imunes, durante o processo de transmigração da corrente sanguínea
para o espaço extravascular, essas células podem lesionar a parede dos vasos, provocando
trombose ou promovendo edema. Os leucócitos emigrados podem ainda iniciar e sustentar o
dano tecidual através da liberação de diversos mediadores, como oxidantes, proteases, lipídios
bioativos e citocinas (YONEKAWA e HARLAN, 2005).
Quando a ação do agente inflamatório cessa, um processo de resolução da resposta
inflamatória é ativado, no qual há redução da liberação de mediadores, recuperação do estado
hemodinâmico original da microcirculação, reparo tecidual e eliminação das células
inflamatórias por recirculação sistêmica, drenagem linfática ou por morte celular (GILROY et
al., 2004; SERHAN et al., 2011). Entretanto, o processo inflamatório pode seguir outro curso
que não a resolução e resultar em fibrose (substituição por tecido conectivo) ou progredir para
um processo inflamatório crônico como resultado da persistência do agente agressor
(infecções persistentes por certos microrganismos; exposição prolongada a agentes
potencialmente tóxicos ou reações autoimunes) ou falhas nos processos de resolução.
33
Assim, os eventos promovidos pelas células do sistema imune inato (neutrófilos,
células dendríticas, células natural killer – NK, macrófagos e mastócitos) são importantes
para iniciar a cascata inflamatória, porém, é necessário mencionar que a ativação da
imunidade adaptativa, que consiste na expansão de um pequeno número de linfócitos
antígeno-específicos que participam dos processos tardios da inflamação (BARTON, 2008;
CRUVINEL et al., 2010) é crucial para a resolutividade do processo inflamatório. Os
linfócitos são os principais componentes celulares da resposta adaptativa, sendo divididos em
linfócitos B, responsáveis pela produção de anticorpos e linfócitos T, que amplificam a
resposta antígeno-específica e contribui para a resposta imune humoral, para a resposta imune
mediada por células e para a resposta reguladora (SHERWOOD e TOLIVER-KINSKY,
2004). Quando ativados, diante da exposição ao antígeno, apresentado por células
especializadas do sistema imune inato, os linfócitos T reconhecem especificamente o antígeno
e secretam a citocina IL-2, a qual atua como um fator de crescimento autócrino nessas células,
promovendo expansão clonal e proliferação. Esse evento precede as respostas efetoras dos
linfócitos T, as quais são importantemente orquestradas por citocinas, assim como na resposta
imune inata (GANGULY; BADHEKA e SAINIS, 2001).
As citocinas são polipeptídeos que medeiam e regulam as reações imunes e
inflamatórias, podendo atuar de forma autócrina (nas células produtoras), parácrina (nas
células próximas) ou endócrina (ação à distância). São sintetizadas pelas células do sistema
imune como linfócitos, monócitos/macrófagos, mastócitos, células dendríticas, além de outros
tipos de celulares, como as endoteliais e algumas células teciduais e células do sistema
nervoso (GONCHAROVA et al., 2007; OLIVEIRA et al., 2011). As citocinas são secretadas
por um curto período e em quantidade limitada e são consideradas redundantes quanto às suas
fontes e seus efeitos, pois uma citocina pode ser produzida por células diferentes e citocinas
distintas podem produzir o mesmo efeito. Já outras citocinas possuem efeito pleiotrópico, ou
seja, efeitos múltiplos em diversos tipos celulares (ZHANG e AN, 2007).
Frequentemente as citocinas são produzidas em cascata, ou seja, uma citocina estimula
suas células-alvo a produzir mais citocinas. Essas substâncias se ligam a receptores
específicos, ativando mensageiros intracelulares que regulam a transcrição gênica (ZHANG e
AN, 2007). Assim, as citocinas influenciam a resposta, a diferenciação, a proliferação e a
sobrevida das células do sistema imune, bem como regulam a secreção e a atividade de outras
citocinas (OLIVEIRA et al., 2011), podendo atuar como pró-inflamatórias (aumentam os
mediadores inflamatórios) tais como IL-1α, IL-1β, TNF-α, IL-12 e IL-18; e citocinas anti-
34
inflamatórias (atuam diminuindo a expressão de genes inflamatórios) como por exemplo IL10, IL-13, Fator de Crescimento Transformante beta (TGF-β), IL-22, IL-1Ra, Interferon alpha
e beta (IFN-α/β) (DINARELLO, 2007).
É importante ressaltar que as citocinas exercem um papel importante na regulação da
resposta inflamatória e no controle tanto da imunidade inata quanto da adaptativa. Os
linfócitos T helper (Th), principais células atuantes na imunidade adaptativa, são classificados
de acordo com o padrão de citocinas que secretam, resultando em uma resposta mediada por
célula (Th1) associada à secreção de IL-2, IL-12 e IFN-γ, sendo importantes contra patógenos
intracelulares, ou uma resposta imune humoral (Th2), associada à secreção de IL-4, IL-5, IL10 e IL-13, sendo efetiva na proteção contra helmintos, principalmente. Além disso, a
produção de citocinas caracteriza outras subpopulações de linfócitos T, tais como as células T
reguladoras produtoras de TGF-β e IL-10, que suprimem ou modulam a resposta imune. As
células T reguladoras são classificadas em naturais (Treg), envolvidas na proteção contra
autoantígenos, e adaptativas (Tr1 e Th3), que são requeridas para a imunotolerância. As
células Th17 produzem IL-17, IL-21 e IL-22 e fornecem proteção contra patógenos
extracelulares, sendo envolvidas em outros processos inflamatórios como artrite reumatóide.
Recentemente têm sido apontadas também as células Th9, que produzem IL-9, e são
relacionadas à indução de hipersecreção de muco em asmáticos, porém com papel
patofisiológico ainda não estabelecido. Por fim, as células Th22, caracterizadas pela produção
de IL-22, parecem estar envolvidas na homeostase e patologia da pele (ANNUNZIATO e
ROMAGNANI, 2009; JÄGER e KUCHROO, 2010; ARUN, TALWAR e KUMAR, 2011).
As citocinas contribuem fortemente para a indução da expressão de moléculas
envolvidas com os processos de adesão e migração celular, tais como E-selectina, ICAM-1,
VCAM-1, de receptores celulares (como o receptor de IL-2) e pela expressão e ativação de
enzimas, como óxido nítrico sintase induzível (iNOS) e ciclooxigenase (COX)-2 (HADDAD,
2002).
A enzima COX se apresenta como duas isoformas ativas: COX-1 e COX-2, as quais
promovem a síntese de prostaglandinas (PG), importantes mediadores do processo
inflamatório. COX-1 é expressa constitutivamente em muitos tecidos e é responsável pela
síntese de PG em níveis basais requeridos para a homeostase. COX-2 é uma enzima não
detectada na maioria dos tecidos em condições fisiológicas, mas é induzida por fatores próinflamatórios no sítio da inflamação e expressa principalmente por macrófagos. A produção
excessiva de prostaglandinas resulta em uma resposta inflamatória exacerbada e produção de
35
dor. Assim, a inibição da expressão e produção desses poderosos mediadores constitui um
alvo interessante para substâncias que atuam como anti-inflamatórios (RUITENBERG e
WATERS, 2003; ZHOU et al, 2009).
Estudos têm demonstrado a ação de extratos de plantas medicinais na redução dos
níveis de citocinas pró-inflamatórias, como IL-2, TNF-α e IFN-γ, bem como da expressão
e/ou atividade de COX-2 (GANGULY; BADHEKA e SAINIS, 2001; ZHOU et al., 2009;
AVELAR et al., 2011; ALMEIDA, 2012; LEE, LEE, KO, 2012; AVELAR-FREITAS et al.,
2013; HELLINGER et al., 2013), revelando que a investigação de atividades biológicas a
partir de extratos vegetais consiste em uma importante estratégia para a identificação de
substâncias que podem fornecer novos fármacos anti-inflamatórios.
36
3 JUSTIFICATIVA
O uso de plantas medicinais tem se tornado significativo nos últimos anos, sendo
incentivado pela OMS (WHO, 1993; WHO, 2011). No Brasil, país detentor de uma das
maiores biodiversidades do planeta, englobando 15 a 25% de todas as espécies vegetais
(JOLY et al., 2011), a fitoterapia tem sido o foco de ampla discussão. Vale ressaltar que, em
2006, duas políticas foram publicadas para o setor de plantas medicinais e fitoterápicos. A
primeira foi a “Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares” (PNPIC)
(Portaria MS nº 971, de 03/05/2006) implantada no Sistema Único de Saúde (SUS) que
contempla diretrizes, ações e responsabilidades do governo federal, estadual e municipal para
a oferta de serviços do SUS, incluindo a fitoterapia. A segunda, formulada pelo Ministério da
Saúde, foi a “Política Nacional de Medicamentos Fitoterápicos” (Decreto Presidencial nº
5.813, de 22/06/2006), com diretrizes que vão além das esferas do setor de Saúde, englobando
toda a cadeia produtiva de plantas medicinais e produtos fitoterápicos.
Além disso, em 2008, foi publicada a Portaria Interministerial nº 2.960, de 09/12/2008
aprovando o Programa Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos e criando o Comitê
Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos. Em 2010, a Portaria MS nº 886, de
20/04/2010 instituiu a “Farmácia Viva” no SUS, que, no contexto da Política Nacional de
Assistência Farmacêutica, visa atender à população com a fitoterapia, promovendo o resgate e
a valorização da cultura popular no que se refere à utilização de plantas medicinais, com a
introdução de conhecimentos científicos. Recentemente, a Portaria MS/GM nº 533, de 28 de
março de 2012, na qual é estabelecido o elenco de medicamentos e insumos da Relação
Nacional de Medicamentos Essenciais - RENAME acrescentou quatro medicamentos
fitoterápicos aos oito já disponíveis.
A E. crinitum é uma planta nativa brasileira utilizada em Diamantina e região como
uma planta com propriedade anti-inflamatória. Não existem estudos que tenham avaliado as
atividades biológicas dessa planta e, como estudos de outras espécies do gênero identificaram
constituintes químicos inéditos e apresentaram as mais diversas atividades biológicas, há
necessidade de estudos que busquem investigar e demonstrar os mecanismos pelos quais a E.
crinitum atue como um anti-inflamatório e que identifiquem os possíveis constituintes
químicos responsáveis por essa atividade.
Nesse estudo, determinou-se, primeiramente, as concentrações do extrato da planta
que são tóxicas às células do sangue periférico, já que a avaliação da toxicidade é de
37
fundamental importância para dar continuidade ou não aos estudos com a planta. Em seguida,
avaliou-se os efeitos do extrato de raízes de E. crinitum sobre a proliferação e produção de
citocinas por linfócitos do sangue periférico humano, bem como sobre a expressão de COX-2,
in vitro.
Além disso, realizou-se uma triagem fitoquímica das principais classes de metabólitos
secundários presentes no extrato através de reações cromogênicas, fluorogênicas e de
precipitação para direcionar a identificação de substâncias através de cromatografia líquida de
alta eficiência.
Acreditamos que o estudo químico preliminar da planta e o efeito de seu extrato sobre
parâmetros imunológicos, possam contribuir para a indicação de uma possível atividade
biológica atribuída à E. crinitum na medicina popular e para o conhecimento da tão
diversificada e ainda pouco conhecida flora medicinal brasileira.
38
4 OBJETIVOS
4.1 Objetivo Geral
Realizar uma triagem fitoquímica e avaliar a possível atividade anti-inflamatória, in
vitro, do extrato diclorometano-etanólico de raízes de Eriosema crinitum.
4.2 Objetivos Específicos
Caracterizar as principais classes de metabólitos secundários presentes no extrato
diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum.
Determinar as concentrações não tóxicas, in vitro, do extrato diclorometano-etanólico
de raízes de E. crinitum sobre hemácias e leucócitos do sangue periférico humano.
Avaliar o efeito do extrato diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum sobre a
proliferação de linfócitos do sangue periférico humano.
Investigar o efeito do extrato diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum sobre a
produção de citocinas pró-inflamatórias IL-2, TNF-α e IFN-γ em linfócitos do sangue
periférico humano.
Avaliar o efeito do extrato diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum sobre a
expressão de COX-2 em monócitos do sangue periférico humano.
39
5 METODOLOGIA
5.1 Material vegetal
5.1.1 Coleta e identificação taxonômica
Os exemplares de E. crinitum foram coletados no município de Datas-MG (S
18º27.318´ W 43º39.764´, altitude 1223 m) no período matutino, em que a temperatura é mais
baixa e há menor insolação, no dia 10 de setembro de 2012 . Para a identificação botânica,
exemplares contendo flores foram utilizados para confecção das exsicatas, as quais foram
arquivadas sob os números de registro 881 e 882, no Herbário Dendrológico Jeanine Felfili do
Departamento de Engenharia Florestal da Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e
Mucuri (UFVJM), sob supervisão do Prof. Dr. Evandro Luiz Mendonça Machado.
5.1.2 Preparo do extrato bruto
Após a coleta, raízes de E. crinitum foram incubadas em estufa para secagem a
temperatura de 35°C até atingirem peso constante. Em seguida, as raízes foram pulverizadas
em moinho de facas (Marconi®) fornecendo uma massa de 450 g. O extrato foi preparado
através de maceração de raízes pulverizadas em frascos de vidro âmbar utilizando como
solvente uma mistura de diclorometano e etanol na proporção de 1:1. Ao término de 72 horas
de maceração, o extrato diclorometano-etanólico foi filtrado em papel filtro, concentrado em
evaporador rotativo Fisatom® (40-42o C, sob pressão reduzida) e armazenado em frascos de
vidro revestidos com papel alumínio. Após completa evaporação do solvente foi obtida uma
massa de 12,1 g de extrato de cor castanha (Figura 2).
Figura 2. Extrato diclorometano-etanólico (1:1) de raízes de E. crinitum.
40
Para a condução dos experimentos, o extrato diclorometano-etanólico de raízes de E.
crinitum foi dissolvido em Dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma, St. Louis, MO, EUA) a uma
concentração de 5 mg/mL.
5.2 Triagem fitoquímica das principais classes de metabólitos secundários presentes nas
raízes de E. crinitum
A triagem fitoquímica preliminar nas raízes de E. crinitum foi realizada por meio de reações
cromogênicas, fluorogênicas e de precipitação conforme Jigna e Sumitra (2007), Silva et al.
(2010), Bustamante et al. (2010) e Sociedade Brasileira de Farmacognosia (2013).
5.2.1 Pesquisa de taninos
Três testes gerais de identificação de taninos foram realizados, utilizando-se como
controle positivo folhas de Hamamelis virginiana (hamamelis). Para confirmar a presença de
taninos na amostra, pelo menos duas das três reações realizadas precisam apresentar resultado
positivo.
Assim, 2,5 g de raízes pulverizadas de E. crinitum e de H. virginiana foram
submetidos à decocção por 15 minutos com 50 mL de água destilada. Após esse período, a
solução foi filtrada, mantida à temperatura ambiente e chamada de solução extrativa A. Essa
solução foi distribuída em 4 tubos de ensaio identificados, sendo que em cada tubo foi
realizada uma reação de identificação: tubo 1 - reação com gelatina, tubo 2 – reação com
cloreto férrico, tubo 3 – reação com acetato de chumbo e o tubo 4 representou o branco da
reação contendo somente o decocto.
Na primeira reação, foram adicionadas a 2 mL da solução extrativa A, 2 gotas de ácido
clorídrico (HCl) e solução de gelatina a 2,5% p/v gota a gota. A formação de precipitado
indica a reação positiva para taninos.
Na segunda reação, foram adicionados a 2 mL da solução extrativa A, 10 mL de água
destilada e 3 gotas de solução de cloreto férrico (FeCl 3) a 1% em metanol. A formação de cor
azul é indicativa da presença de taninos hidrolisáveis ou gálicos e a cor verde é indicativa da
presença de taninos condensados ou catéquicos.
41
Na terceira reação, foram adicionados a 5 mL da solução extrativa A, 10 mL da
solução de ácido acético a 10% e 5 mL de uma solução de acetato de chumbo a 10%. A
formação de um precipitado esbranquiçado indica a presença de taninos hidrolisáveis.
5.2.2 Pesquisa de alcaloides
Para a pesquisa de alcaloides, 2 g das raízes de E. crinitum pulverizadas foram
adicionados a 20 mL de ácido sulfúrico (H2SO4) a 1% . Essa solução foi fervida por 2 minutos
e filtrada em algodão. Após filtração a solução foi dividida em duas porções denominadas A e
B, para a pesquisa direta e confirmatória de alcaloides na amostra vegetal, respectivamente.
A porção A foi distribuída em 5 tubos para a realização da pesquisa direta de
alcaloides encontrados na forma combinada. O primeiro tubo consistiu o branco da reação
contendo 2 mL da porção A. Nos demais tubos foram adicionadas 2 gotas de um dos Reativos
Gerais de Alcaloides (RGA). A Tabela 3 apresenta os RGA, com o nome, composição e a cor
do precipitado formado quando estes reagem com alcaloides. A turvação e/ou formação de
precipitado é um indicativo da presença de alcaloides na amostra.
Tabela 3. Reativos Gerais de Alcaloides (RGA) utilizados na pesquisa da presença de
alcaloides nas raízes de Eriosema crinitum.
RGA
Preparo
Composição
Cor do
precipitado
Dragendorff
Carbonato de bismuto 5 g
Iodeto de potássio 25 g
Iodo bismutato de
Alaranjado
potássio
Ácido clorídrico concentrado 12 mL
Água destilada 100 mL
Mayer
Cloreto de mercúrio 1,35 g
Iodeto de potássio 5 g
Iodo mercurato de
Branco
potássio
Água destilada 100 mL
Bouchardat/
Wagner
Iodo 1 g
Iodeto de potássio 2 g
Iodo-Iodeto de
Marrom
potássio
Água destilada 100 mL
Hager
Solução de Ácido pícrico a 1%
Ácido pícrico
Amarelo
42
Com a porção B foi feita a pesquisa confirmatória da presença de alcaloides na forma
livre na amostra. Assim, foi adicionada solução de hidróxido de amônio (NH4OH) a 10% a
essa porção para tornar o pH básico e, em seguida foram adicionados 7 mL de clorofórmio
(CHCl3). Após 10 minutos de extração, a camada clorofórmica foi retirada e mantida em
banho-maria até a completa evaporação do solvente. O resíduo foi dissolvido em 5 mL de
H2SO4 a 1% e essa solução foi dividida em 5 tubos de ensaio, aos quais foram adicionadas 2
gotas de um dos RGA citados anteriormente. O resultado é considerado positivo quando
ocorre turvação ou formação de precipitado.
As reações direta e confirmatória também foram realizadas para as folhas de Peumus
boldus (boldo do Chile) como controle positivo para a presença de alcaloides. Para que a
amostra seja considerada positiva para alcaloides, no mínimo 3 reações confirmatórias da
porção B devem apresentar resultado positivo.
5.2.3 Pesquisa de flavonoides
Para realizar a pesquisa de flavonoides, 1 g de raiz pulverizada de E. crinitum foi fervida
com 10 mL de etanol a 70% por dois minutos. A mistura foi filtrada em algodão, obtendo-se
um extrato etanólico. A identificação genérica de flavonoides foi feita por três reações, como
descritas a seguir.
Na primeira, denominada reação de Shinoda, foram adicionados a 2 mL do extrato
etanólico seis fragmentos de magnésio (Mg) e 1 mL de HCl concentrado. O aparecimento de
uma coloração rósea a vermelha indica a presença de flavonoides na amostra.
A segunda reação foi realizada com cloreto de alumínio. Para isso, um papel filtro foi
umedecido em duas áreas diferentes com o extrato etanólico de raízes de E. crinitum e sobre
uma das regiões umedecidas foi adicionada uma gota de cloreto de alumínio (AlCl3) a 5%. A
reação é considerada positiva se houver aparecimento de fluorescência com mudança de cor
para amarelo a amarelo esverdeado.
Por fim, fez-se a reação de Pew, em que 3 mL do extrato etanólico foram colocados em
uma cápsula de porcelana e levados à fervura em banho de água até que o solvente
evaporasse. Ao resíduo foram adicionados 3 mL de metanol, e o conteúdo da cápsula foi
transferido para um tubo de ensaio. Neste tubo foram adicionados zinco metálico e 3 gotas de
HCl concentrado. A reação é positiva quando há formação de coloração vermelha.
43
A amostra de raízes de E. crinitum seria considerada positiva para flavonoides se, no
mínimo, duas das reações descritas apresentassem resultado positivo. Paralelamente, realizouse as reações para flavonoides utilizando folhas de Baccharis trimera (Less) DC (carqueja)
como controle positivo.
5.2.4 Pesquisa de antraquinonas
Para pesquisa direta de antraquinonas livres adicionou-se 5 mL de NH4OH a 10% em
0,20 g do pó de raízes de E. crinitum. O desenvolvimento de coloração rósea a vermelha
indica resultado positivo.
Além da pesquisa direta fez-se a reação conhecida como reação de Bornträger com
prévia hidrólise ácida, para a análise de glicosídeos antraquinônicos e dímeros. Neste teste,
foram adicionados 8 mL de etanol a 25% a 1 g do pó de raízes de E. crinitum. A mistura foi
fervida e filtrada em algodão. Em seguida, adicionou-se H2SO4 a 5% à solução e aqueceu-se a
mesma levemente. Após o resfriamento, foram adicionados 5 mL de clorofórmio e, após 3
minutos de extração, a fase orgânica foi decantada e retirada. Adicionou-se 5 mL de NH4OH a
10% e a solução foi agitada fortemente e, em seguida, mantida em repouso. O
desenvolvimento de coloração rósea ou vermelha na fase aquosa sugere a presença de
antraquinonas.
A presença de antraquinonas na amostra só é considerada positiva se a reação de
Bornträger com hidrólise apresentar resultado positivo; se esta última reação for negativa, o
resultado é considerado negativo mesmo se a reação direta for positiva. Para ambas as reações
foram utilizadas folhas de Cassia senna L. (sene) como controle positivo para antraquinonas.
5.2.5 Pesquisa de saponinas e índice de espuma
Para a pesquisa de saponinas, transferiu-se 1 g de raiz pulverizada de E. crinitum foi
transferido para um erlenmeyer contendo 100 mL de água destilada. A mistura foi fervida por
5 minutos e, em seguida foram adicionadas gotas de carbonato de sódio 0,20 M até atingir pH
7. A solução resfriada foi filtrada e transferida para um balão volumétrico, onde o volume foi
completado com água destilada para 100 mL. A solução foi diluída com água destilada nas
proporções de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 e 100% em tubos de ensaio (16 x 160 mm).
As soluções diluídas foram agitadas vigorosamente no sentido vertical por 15 segundos e, em
44
seguida, o tubo foi mantido em repouso por 15 minutos. Como controle positivo para a
presença de saponinas foram utilizadas folhas de Baccharis trimera (Less) DC (carqueja).
A amostra é positiva para saponina quando há formação de anel de espuma com altura
igual ou superior a 1 cm. O índice de espuma (IE) é calculado para a maior diluição na qual a
amostra é positiva para saponinas e é utilizado para comparação entre as espécies ou gêneros
vegetais .
O índice foi calculado conforme a fórmula abaixo:
IE = p x 1000
------------PxV
Em que p = peso da amostra vegetal (1 g); P = percentual da amostra utilizada no
preparo do extrato ou teor da planta no extrato em g; V = volume do extrato no tubo de ensaio
com formação de espuma de 1cm de altura (sem a diluição, ou seja, volume original em mL).
5.2.6 Pesquisa de esteroides e terpenos
Para a realização da pesquisa de esteroides e terpenos, 1 g de raiz de E. crinitum
pulverizada foi macerado por 30 minutos em 5 mL de clorofórmio. Em seguida, a mistura foi
filtrada e transferida para tubo de ensaio, no qual foi adicionado 1 mL de anidrido acético. A
mistura foi agitada suavemente e acrescentou-se, cuidadosamente, algumas gotas de H2SO4
concentrado na parede do tubo. A formação de anel de cor avermelhada entre as camadas
clorofórmica e ácida indica a presença de terpenos e anel de coloração azul esverdeada indica
que a reação foi positiva para esteroides. Paralelamente, foi realizada a reação para folhas de
Ginkgo biloba, que consistiu o controle positivo para terpenos.
Além disso, como análise complementar para presença de terpenos, foi realizada uma
Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC) utilizando-se uma placa
cromatográfica contendo uma camada de 250 μm de sílica gel como fase estacionária
(Whatman®, UV 254 nm).
Primeiramente, 1 g de raiz de E. crinitum pulverizada foi macerado em 10 mL de
diclorometano por 15 minutos em banho-maria a 40°C. Em seguida, filtrou-se a mistura e o
filtrado foi levado à secura em banho-maria a 40°C. Adicionou-se 1 mL de clorofórmio ao
resíduo e aplicou-se uma gota da amostra com auxílio de um capilar de vidro na
cromatoplaca. Foi também aplicada na cromatoplaca, uma gota do extrato diclorometano-
45
etanólico de raiz de E. crinitum e do padrão alfa-bisabolol, ambos dissolvidos em
clorofórmio. A cromatoplaca foi colocada em uma cuba contendo a fase móvel constituída de
tolueno e de acetato de etila 93:7 (v/v). Ao fim da corrida, observou-se a cromatoplaca em
câmara escura sob luz ultravioleta nos comprimentos de onda de 254 nm e 386 nm. A
revelação das bandas foi feita após imersão da cromatoplaca em solução de vanilina sulfúrica
(1 g de vanilina, 1 mL de ácido sulfúrico e metanol em quantidade suficiente para 100 mL) e
secagem da mesma em estufa a 100°C por 10 minutos. Para comparação da amostra com o
padrão sesquiterpeno alfa-bisabolol, foi calculado o fator de retenção pela razão entre as
distâncias percorridas pelas manchas de coloração violeta e a distância percorrida pela fase
móvel.
5.3 Análise do extrato diclorometano-etanólico de E. crinitum por Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência acoplada a Detector de Arranjo de Diodos (CLAE-DAD)
Uma alíquota de 100 mg do extrato em diclorometano-etanólico de E. crinitum,
previamente seco em evaporador rotativo, foi ressuspendida em 10 mL de metanol
(JTBaker®, México), com auxílio de sonicador, por 5 minutos à temperatura ambiente. O
extrato ressuspendido foi filtrado em filtro de 13 mm de diâmetro com poro de 0,20 μm, com
auxílio de seringa de 10 mL. O filtrado obtido foi eluído através de uma coluna contendo 0,50
g de C-18, pré-condicionada com metanol, com o intuito de retirar substâncias que
apresentem adsorção irreversível em C-18. O material coletado foi diluído em igual volume
de metanol e uma injeção de 20 μL foi realizada no cromatógrafo líquido.
Para a análise em CLAE-DAD, foi utilizado um cromatógrafo líquido de alta eficiência
(Thermo Scientific®), equipado com uma bomba de quatro canais modelo Accela 600,
contendo injetor automatizado Accela, degaseificador on line e detector por arranjo de diodos
(DAD) modelo Accela PDA Detector 80 Hz. Os dados foram registrados e analisados
utilizando o software ChromQuest 5.0.
As condições empregadas foram: fase móvel aplicada em gradiente, conforme descrito na
Tabela 4, fluxo de 1 mL/minuto e coluna de fase reversa (Octadecilsílica C-18, Phenomenex
Luna C18(2)®) com diâmetro interno de 150 mm x 4,60 mm, diâmetro de partícula de 3 μm e
poro de 100 Å, protegida por pré-coluna do mesmo adsorvente e fabricante. A detecção foi
realizada na faixa do ultravioleta ao visível (UV/visível) nos comprimentos de onda (λ) entre
190 e 600 nm.
46
Tabela 4. Composição do gradiente de fase móvel utilizado na análise em CLAE-DAD do
extrato diclorometano-etanólico de Eriosema crinitum.
Tempo (minutos)
0
5
45
50
52*
60*
% Fase móvel A
90
90
0
0
90
90
% Fase móvel B
10
10
100
100
10
10
A – água ultrapura contendo 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA, Synth® - Brasil)
B – acetonitrila (Tedia® – EUA) contendo 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA, Synth® - Brasil)
*Reequilíbrio da coluna cromatográfica
5.4 Critérios de inclusão e Sujeitos da pesquisa
Foram utilizados como critérios de inclusão no estudo: indivíduos com idade entre 18
e 39 anos, que não reportassem doença infecciosa, autoimune, crônico degenerativa ou de
hipersensibilidade e que não estavam em uso de anti-inflamatórios esteroidais e/ou não
esteroidais, bem como mulheres que, além de preencherem os critérios citados, não fossem
gestantes.
O recrutamento desses voluntários foi realizado através da abordagem de estudantes
da UFVJM nas dependências da universidade. Após serem esclarecidos dos objetivos da
pesquisa, aqueles que concordaram e que estavam aptos a participar do estudo, deram seu
consentimento livre e esclarecido (Anexo I). O projeto foi avaliado e aprovado pelo Comitê
de Ética e Pesquisa (CEP) da Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri
(UFVJM), protocolado sob o registro n° 002/09.
No total, 36 voluntários participaram do estudo, sendo 13 homens e 23 mulheres, com
idade média de 26 ± 4 anos.
Os procedimentos experimentais descritos a seguir foram realizados no Laboratório de
Imunologia do Centro Integrado de Pós-Graduação e Pesquisa em Saúde (CIPq-Saúde) da
UFVJM.
5.5 Amostra biológica
A amostra biológica consistiu de 15 mL de sangue venoso, coletados de forma
asséptica por punção da veia antecubital mediana, na fossa antecubital, utilizando tubos a
vácuo heparinizados. Os procedimentos de coleta foram conduzidos por pessoal treinado e
47
capacitado para tal e obedeceram as Recomendações da Sociedade Brasileira de Patologia
Clínica e Medicina Laboratorial para coleta de sangue venoso (2010). Após a utilização da
amostra biológica nas análises descritas a seguir, todo o material remanescente foi descartado
adequadamente.
5.6 Parâmetros hematológicos
Para obtenção dos valores de leucócitos totais e da série vermelha (hemácias,
hemoglobina e hematócrito), foi utilizado o contador automático de células CELM CC-550®
(CELM, Baruerí, SP, Brasil). A contagem diferencial de leucócitos foi realizada pela
observação em microscópio óptico do esfregaço sanguíneo corado com Giemsa e MayGrunwald, conforme descrito em Carvalho e Silva (1988).
5.7 Obtenção das Células Mononucleares do Sangue Periférico (PBMC) Humano
Para a avaliação das concentrações tóxicas do extrato diclorometano-etanólico de
raízes de E. crinitum, bem como nas análises do efeito desse extrato sobre a proliferação
celular, utilizou-se as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) a partir do sangue
coletado de voluntários hígidos.
Assim, 15 mL de sangue periférico venoso, coletados em tubos a vácuo contendo
heparina (Vacutainer; Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA), foram diluídos na proporção
1:1 em Tampão Fosfato de Salina (PBS) (NaCl 1,50 M; Na2HPO4 0,08M; NaH2PO4 0,02M,
pH 7,20-7,40) e as PBMC foram obtidas por meio de gradiente de densidade durante
centrifugação (400 g, 21°C, 30 min) com Ficoll-Histopaque 1077 (Sigma, St. Louis, MO,
EUA), conforme descrito por Bicalho et al. (1981). O anel de PBMC, formado após a
centrifugação, foi recolhido e lavado 2 vezes em PBS (250 g, 4ºC, 15 min). Em seguida, as
células foram ressuspensas em 1 mL de PBS ou RPMI (Gibco, Invitrogen Corporation, Grand
Island, NY, EUA). Após ajuste da concentração celular, as células foram novamente
centrifugadas e ressuspensas em PBS ou RPMI suplementado com L-glutamina (Sigma, St.
Louis, MO, EUA) (2 mM), e coquetel antibiótico/antimicótico (penicilina G 100 UI/mL,
estreptomicina 100 µg/mL e anfotericina B 250 ng/mL - Sigma, St. Louis, MO, EUA), em
uma concentração de 1x107 células/mL.
48
5.8 Avaliação da citotoxicidade do extrato diclorometano-etanólico de raízes de E.
crinitum, in vitro
Com a finalidade de identificar as concentrações não tóxicas do extrato
diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum que seriam utilizadas nos demais ensaios,
foram conduzidos ensaios de citotoxicidade sobre as hemácias e leucócitos do sangue
periférico humano.
5.8.1 Avaliação da atividade hemolítica do extrato diclorometano-etanólico de raízes de
E. crinitum
Para avaliar se o extrato diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum seria capaz
de causar lise em hemácias humanas, realizou-se o teste de hemólise in vitro, conforme
Montagner (2007) e modificado como a seguir. Preparou-se uma suspensão de hemácias
diluídas 1:20, a partir do sangue coletado de 8 indivíduos hígidos, adicionando-se 500 µL de
sangue total a 10 mL PBS em um béquer. A suspensão foi mantida sob leve agitação em um
agitador magnético durante toda a execução do teste. Em seguida, o extrato da planta, nas
concentrações finais de 100 μg/mL, 50 μg/mL, 25 μg/mL e 12,5 μg/mL, foi incubado em PBS
na presença de 100 μL da suspensão de hemácias. Culturas contendo 100 μl de suspensão de
hemácias na concentração 1:20 e o extrato da planta em suas respectivas concentrações finais,
foram submetidas à adição de água ultra pura para fornecer o controle positivo que
representasse 100% de hemólise. Para eliminar a interferência da absorbância do extrato na
densidade óptica de cada análise, foram confeccionados os respectivos controles (brancos),
nos quais o extrato, nas concentrações testadas ou o DMSO foram adicionados ao PBS ou à
água. Foram confeccionadas também culturas de hemólise espontânea (controle negativo) que
consistiram de PBS e 100 μL de suspensão de hemácias com seu respectivo branco (somente
PBS), além de culturas controle do solvente, com adição de DMSO, em substituição ao
extrato, acrescidas de 100 μL da suspensão de hemácias. As culturas foram confeccionadas
em tubos de poliestireno (Falcon 2059, Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA) e foram
incubadas por 4h em estufa úmida a 37°C e 5% de CO2. Após esse período, os tubos foram
centrifugados (7 min, a 500 g e 18ºC) e 200 μL do sobrenadante foram transferidos para uma
placa de 96 poços de fundo chato. Na sequência, foi realizada a leitura da absorbância em 540
nm, no leitor de placas. Dos valores de absorbância dos testes e controles foram subtraídos os
49
valores de absorbância de seus respectivos brancos e o resultado do teste de hemólise foi
obtido como percentual de hemólise de acordo com a equação:
Hemólise (%) = Absorbância (extrato) - Absorbância (controle negativo) x 100
Absorbância (controle positivo) - Absorbância (controle negativo)
5.8.2 Efeito do extrato diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum sobre a
viabilidade de PBMC humanas
Com o intuito de verificar se o extrato diclorometano-etanólico de raízes de E.
crinitum seria tóxico às PBMC humanas, realizou-se o ensaio de viabilidade celular pelo
método de exclusão com azul de Tripan.
Assim, isolou-se as PBMC a partir do sangue periférico de 8 voluntários hígidos,
como descrito anteriormente, e incubou-se 50 μL de suspensão celular (cerca de 5x104
células) em meio contendo RPMI-1640 (Gibco, Invitrogen Corporation, Grand Island, NY,
EUA) acrescido de L-glutamina (2mM) (Sigma, St. Louis, MO, EUA), soro fetal bovino
(Gibco,
Invitrogen
Corporation,
Grand
Island,
NY,
EUA)
(10%),
e
coquetel
antibiótico/antimicótico (penicilina G 100 UI/mL, estreptomicina 100 µg/mL e anfotericina B
250 ng/mL - Sigma, St. Louis, MO, EUA) o que denominamos de RPMI completo, na
ausência (controle) ou presença do extrato diclorometano-etanólico nas concentrações finais
na cultura de 100 μg/mL, 50 μg/mL, 25 μg/mL e 12,5 μg/mL. Culturas celulares tratadas com
DMSO em substituição ao extrato constituíram o grupo controle do solvente. As culturas
foram realizadas em tubos de polipropileno (Falcon 2059, Becton Dickinson, San Jose, CA,
EUA) em duplicata, sendo incubadas por 24 horas ou 5 dias em estufa úmida a 37°C e 5%
CO2. Após esse tempo, as células foram removidas dos tubos por lavagem com 2 mL de PBS,
transferidas para tubos de poliestireno (Falcon 2059, Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA)
e centrifugadas (300 g, 21º C, 10 min). Em seguida, avaliou-se a viabilidade das suspensões
celulares pela técnica de exclusão com azul de Tripan através da contagem em câmara de
Neubauer após incubação de 10 µL das suspensões celulares com 190 µL azul de Tripan a
0,4%. A viabilidade celular foi determinada pelo percentual de células viáveis (não coradas)
no universo de células totais.
50
5.9 Análise do efeito do extrato diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum sobre a
proliferação de linfócitos humanos
Para essa análise utilizamos a técnica de incorporação e decaimento da fluorescência
do Violet Proliferation Dye 450 (VPD450), um corante excitável no laser violeta do citômetro
de fluxo e que é funcionalmente similar ao CFSE (do inglês: 5-(and-6)-carboxyfluorescein
diacetate succinimidyl ester), conforme descrito por Lyons et al.(1999).
Assim, foram
7
isoladas PBMC de 8 voluntários hígidos e 1x10 células foram suspensas em PBS e incubadas
com 1 μM de BD Horizon Violet Proliferation Dye 450 (VPD 450) (Becton Dickinson, San
Jose, CA, EUA) por 15 minutos em banho-maria. Em seguida, lavou-se as suspensões
celulares por centrifugação (500 g, 10 min., 18°C) com 10 mL de PBS, e descartou-se o
sobrenadante. A reação foi interrompida pela adição 10 mL de RPMI completo, seguida de
centrifugação (500 g, 10 min, 18°C). Descartou-se o sobrenadante e ressuspendeu-se as
células em RPMI-1640.
Para avaliar o efeito inibitório do extrato diclorometano-etanólico de raízes de E.
crinitum sobre a resposta proliferativa de linfócitos, foram confeccionadas culturas
estimuladas com o mitógeno fitohemaglutinina (PHA) na presença do extrato.
Aproximadamente 5x105 células foram incubadas em RPMI completo sendo
estimuladas ou não com 10 μL de PHA (Sigma, St. Louis, MO, EUA) (5 μg/mL) na ausência
ou presença do extrato nas concentrações finais de 25 μg/mL, 12,5 μg/mL e 6,25 μg/mL ou de
DMSO, representando a cultura controle do solvente. Como controle de inibição, células
estimuladas com PHA foram simultaneamente tratadas com a dose farmacológica de
Dexametasona 8 μg/mL, que corresponde a 15 µM (Fosfato Dissódico de Dexametasona Decadron injetável, 4 mg/mL, Aché Laboratórios Farmacêuticos, Brasil), um antiinflamatório que inibe a ativação de leucócitos (SPIES et al., 2010). Além disso, foram
confeccionadas culturas contendo o extrato nas mesmas concentrações citadas acima, mas
sem estímulo com PHA, a fim de verificarmos se o extrato, por si só, apresentava algum
efeito mitogênico. As culturas foram confeccionadas em placas de 24 poços e foram
incubadas por 5 dias em estufa úmida, a 37ºC e 5% de CO2. Após esse período, as células
foram retiradas da placa e transferidas para tubos de poliestireno onde foram lavadas duas
vezes com PBS gelado (200 g, 4ºC, 10 min).
Com o intuito de identificar as subpopulações linfocitárias, incubamos 20 µL de
suspensão celular com 1 µL de anticorpos anti-CD4 conjugado com fluorocromo PE e anti-
51
CD8 conjugado com fluorocromo FITC (Tabela 5, página 51) por 15 min a 4º C e ao abrigo
da luz. Após lavagem com PBS-W (PBS contendo BSA 0,5% e azida sódica 0,1%, pH 7,27,4), as células foram ressuspensas em PBS e foi feita a determinação da proliferação celular
pela medida do decaimento da fluorescência do VPD450 utilizando a citometria de fluxo
(FACSCANTO II - Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA) com aquisição de 50000 eventos.
Após aquisição dos eventos, foi feita a análise da proliferação celular utilizando o
programa FACSDIVA (Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA). Em gráficos de distribuição
pontual em função do tamanho celular em área (FSC-A) versus o tamanho celular em altura
(FSC-H), selecionou-se a região R1 onde não continham “doublets” celulares, (Figura 3A).
Em outro gráfico correspondente aos eventos de R1, através dos parâmetros FSC-A versus a
complexidade interna celular em área (SSC-A), a população de linfócitos foi definida pela
região R2 (Figura 3B). Os eventos em R2 foram analisados em gráficos pontuais de
fluorescência para PE x FITC (CD4 x CD8) (Figuras 3C), nos quais as regiões R3 e R4 foram
definidas como aquelas que incluíam os linfócitos T CD4+ e T CD8+, respectivamente. Em
seguida, os eventos nas regiões R2, R3 e R4 foram analisados para intensidade de
fluorescência do VPD450 utilizando histogramas de fluorescência para VPD450 em função
do número de eventos (Figuras 3D a 3I). Os marcadores M1, M7 e M13 foram definidos
como o pico de células que não proliferaram na análise de linfócitos totais (Figura 3D),
linfócitos TCD4 (Figura 3E) e TCD8 (Figura 3F) corados com VPD450 após estimulação
com PHA por 5 dias. Os marcadores M2 a M6; M8 a M12 e M14 a M18 foram definidas de
acordo o padrão de marcação para VPD450, correspondente ao perfil proliferativo das células
analisadas e representam o número de ciclos de proliferações celulares obtidos ao longo dos 5
dias de estimulação das culturas celulares (Figuras 3D a 3F). Em seguida, esses marcadores
foram utilizados para a análise do perfil proliferativo de linfócitos totais (Figura 3G),
linfócitos TCD4 (Figura 3H) e TCD8 (Figura 3I) após estimulação com PHA na presença do
extrato diclorometano-etanólico de E. crinitum (25 μg/mL).
52
Figura 3. Sequência de procedimentos utilizados para as análises de proliferação celular pela diluição do
VPD450. O gráfico de distribuição pontual FSC-H x FSC-A foi utilizado para excluir os “doublets” celulares
(A), seguido da geração de gráficos de distribuição pontual FSC x SSC utilizados para a seleção da população de
linfócitos nas culturas (B). Em seguida foram utilizados gráficos de distribuição pontual PE x FITC para
selecionar as regiões R3 e R4, correspondentes às subpoplulações de células TCD4+ e TCD8+ (C). Histogramas
de VPD450 x eventos, foram utilizados para definir as regiões M1 a M6, M7 a M12 e M13 a M18, com os quais
foi obtido o índice de proliferação (IP) para a população de linfócitos (D e G), e para as subpopulações TCD4 (E
e H) e TCD8 (F e I). Os histogramas D a F representam culturas estimuladas com PHA, enquanto G a I
representam culturas que foram também tratadas com o extrato diclorometano-etanólico de E. crinitum
(25μg/mL).
A proliferação foi determinada pelo índice de proliferação (IP), calculado como a
seguir:
IP =
100 - Y
Y
sendo,
Y (%) =
X0 + X1 + X2 + X3 + X4 + X5 + X6 + X7
2
4
8
16
32
64 128
(1)
53
(2)
X0 representa a porcentagem de células que não se dividiram (localizadas em M1, M7 ou
M13), e X1 a X7 representam os picos de divisão gradual (localizados de M2 a M6; M8 a
M12 ou M14 a M18) (ÂNGULO e FULCHER, 1998).
5.10 Anticorpos utilizados
Para identificação das subpopulações linfocitárias, marcação das citocinas
intracitoplasmáticas e análise da enzima ciclooxigenase, por citometria de fluxo, foram
utilizados anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos, cujas especificações estão
contidas na Tabela 5.
Tabela 5. Anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos utilizados para análise de
populações linfocitárias, marcação de citocinas e análise da enzima ciclooxigenase.
Anticorpo
Especificidade
Marca
Clone
Subpopulação de
Linfócitos T-CD4
Subpopulação de
Linfócitos T-CD8
Interferon- 
Fator de necrose tumoral-α
Controle de Isotipo
BD Biosciences
RPA-T4
BD Biosciences
RPA-T8
Sigma
BD Biosciences
BD Biosciences
25723.11
MAb11
X39 e X40
Anti-CD14 marcado com PerCP-Cy5.5
População de monócitos
BD Biosciences
M5E2
Anti-COX-1 marcado com FITC e antiCOX-2 marcado com PE
Enzima ciclooxigenase
(COX) dos tipos 1 e 2
BD Biosciences
AS70 e
AS67
Anti-CD4 humano marcado com PE1
Anti-CD8 humano marcado com FITC2
Anti-IFN- humano marcado com PE
Anti-TNF-α humano marcado com PE
IgG1 marcado com FITC e IgG2a
marcado com PE
1
PE: Ficoeritrina
FITC: Isotiocianato de Fluoresceína
3 PerCP- Cy5.5: Proteína Clorofila Peridinina combinada a Cianina
2
54
5.11 Avaliação do efeito do extrato diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum
sobre a produção de citocinas por linfócitos humanos, in vitro
A dosagem da citocina IL-2 foi realizada pela técnica Enzyme Linked Immunosorbent
Assay (ELISA) a partir do sobrenadante das culturas, enquanto a avaliação da produção das
citocinas IFN-γ e TNF-α intracelularmente foi feita por citometria de fluxo, conforme descrito
abaixo.
5.11.1 Avaliação do efeito do extrato diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum
sobre a produção de IL-2
Primeiramente, isolamos PBMC a partir do sangue coletado de 6 voluntários hígidos.
Em seguida, aproximadamente 5x105 células foram incubadas em RPMI completo sendo
estimuladas ou não com 10 μL de PHA (5 μg/mL) na presença do extrato nas concentrações
finais de 25 μg/mL, 12,5 μg/mL e 6,25 μg/mL ou de DMSO, representando a cultura controle
do solvente. Como controle de inibição da produção de IL-2, células estimuladas com PHA
foram simultaneamente tratadas com Dexametasona (8 μg/mL que corresponde a 15 µM). As
culturas foram confeccionadas em placas de 24 poços e foram incubadas em estufa úmida, a
37ºC e 5% de CO2 por 36 horas. Esse tempo foi escolhido tendo em vista a análise do pico de
produção de IL-2 nas culturas estimuladas de PBMC, em experimentos de padronização
realizados em nosso laboratório (dados não demonstrados). Após esse período de incubação, o
sobrenadante das culturas foi retirado para a dosagem de IL-2 por meio da técnica de ELISA.
Para quantificação de IL-2, foi utilizado o kit de ELISA DuoSet (R&D Systems,
EUA). Os procedimentos experimentais foram realizados conforme orientação do fabricante,
conforme descrito a seguir.
Para a sensibilização da placa de 96 poços de fundo chato, adicionou-se 100 µL/poço
do anticorpo de captura (anticorpo de camundongo anti-IL-2 humano, 720 μg/mL) diluído
para uma concentração de 4 μg/mL em PBS (NaCl 137 mM; KCl 2,7 mM; Na2HPO4 8,1 mM;
KH2PO4 1,2 mM, pH 7,2-7,4) e incubou-se a placa à temperatura ambiente por 15 horas.
Após esse tempo, a placa foi lavada cinco vezes com 300 μL/poço de solução tampão de
lavagem (PBS contendo 0,05% de Tween 20, pH 7,2 -7,4), utilizando uma lavadora de
microplacas (ELx50, Biotek). O líquido remanescente foi retirado secando-se a placa em
papel toalha. O bloqueio dos sítios reativos da placa foi realizado pela adição de 300 µL de
55
solução tampão de bloqueio (PBS contendo 1% de albumina bovina e 0,05% de azida sódica)
seguida de 1 hora de incubação à temperatura ambiente. Por fim, a placa foi lavada como
descrito anteriormente e o sobrenadante remanescente foi totalmente removido secando-se a
placa em papel toalha.
Para a quantificação de IL-2 nas amostras, foram adicionados à placa 100 μL/poço do
sobrenadante de cada cultura descrita acima, sendo que nas duas primeiras colunas da placa
foram adicionados 100 μL/poço do padrão de IL-2 (IL-2 humana recombinante, 60 ng/mL)
diluído em PBS para as concentrações de 1000 pg/mL, 500 pg/mL, 250 pg/mL, 125 pg/mL,
62,5 pg/mL, 31,25 pg/mL e 15,625 pg/mL, consistindo de uma curva padrão para o cálculo
das concentrações de IL-2 nas amostras analisadas. O padrão de IL-2 e as amostras foram
avaliados em duplicata. A placa foi incubada por 2 horas à temperatura ambiente e, ao final
desse período, a placa foi lavada com solução tampão de lavagem como citado acima, seguido
de completa remoção do sobrenadante em papel toalha.
Na sequência, foram acrescentados 100 μL/poço de anticorpo de detecção (anticorpo
de cabra anti-IL-2 humano biotinilado, 90 μg/mL) diluído em reagente diluente (solução
tampão salina Tris – Trizma base 20mM e NaCl 150 mM – contendo 0,1% de albumina
bovina e 0,05% de Tween 20) para uma concentração de 0,5 μg/mL e, após 2 horas de
incubação à temperatura ambiente, a placa foi lavada com solução tampão de lavagem,
seguida da adição de 100 μL/poço de estreptavidina conjugada com horseradish-peroxidase
(Estreptavidina-HRP)
diluída 1:200 em reagente diluente. Ao final de 20 minutos de
incubação no escuro à temperatura ambiente, a placa foi lavada e adicionou-se 100 μL/poço
do substrato TMB (3,3’, 5,5’ tetrametilbenzidina, Sigma, St. Louis, MO, EUA) diluído em
tampão citrato (Na2HPO4 0,4 mM e citrato de sódio 0,2 mM, pH 5) contendo 0,005% de
peróxido de hidrogênio. A placa foi incubada no escuro à temperatura ambiente por 30
minutos e, em seguida foram acrescentados 50 μL/poço da solução de parada H2SO4 2N. A
determinação da densidade óptica foi realizada nos comprimentos de onda de 450 e 570 nm
em um leitor de microplacas (SpectraMax 190, Molecular Devices). Para a determinação da
concentração de IL-2 em cada cultura, as densidades ópticas em 450 nm foram subtraídas
daquelas correspondentes em 570 nm para efeito de correção de imperfeições ópticas da placa
de 96 poços.
56
5.11.2 Avaliação do efeito extrato diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum sobre
a produção de IFN-γ e TNF-α
Amostras de sangue de 8 voluntários hígidos foram coletadas em tubos a vácuo
contendo heparina, e alíquotas de 500 µL foram adicionadas em tubos de polipropileno
contendo 500 µL de meio de cultura RPMI-1640 na ausência (controle) ou presença (controle
positivo) de 25 µL de Miristato Acetato de Forbol – PMA (Sigma, St. Louis, MO, EUA) (25
ng/mL), um éster de forbol caracterizado por induzir leucócitos a sintetizarem citocinas próinflamatórias, e 1 µL Ionomicina (Sigma, St. Louis, MO, EUA) (1ng/mL), que atua
potencializando a atividade do PMA sobre os leucócitos (PRUSSIN; METCALFE, 1995;
SEMPOWSKI et al., 1999).
Para avaliar o potencial do extrato diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum
em inibir a produção de citocinas pró-inflamatórias, culturas contendo os mesmos
componentes acima citados, foram acrescidas de extrato nas concentrações finais de 50
µg/mL, 25 µg/mL e 12,5 µg/mL. Como controle de inibição foi utilizado o fármaco
Dexametasona (8 μg/mL que corresponde a 15 µM). Além disso, todas as culturas receberam
10 µL de Brefeldina A (Sigma, St. Louis, MO, EUA) (1mg/mL), um metabólito fúngico que
inibe a secreção proteica por impedir o transporte de proteínas do retículo endoplasmático
para o complexo de Golgi (MISUMI et al., 1986; ZELNICKOVA et al., 2007).
As culturas foram incubadas por 4 horas em estufa úmida a 37°C e 5% de CO2. Em
seguida, lavou-se as células por centrifugação (250 g, 7 min, 18°C) com PBS-W (PBS
contendo 0,5% de BSA e 0,1% de azida sódica, pH 7,2-7,4) e procedeu-se à lise eritrocitária
por adição da solução de lise de hemácias e incubando as células por 10 min à temperatura
ambiente. Após a incubação, as amostras foram centrifugadas (250 g, 7 min, 18°C), o
sobrenadante descartado e as células foram suspensas em PBS-W. As células foram
permeabilizadas pela adição de PBS-P (PBS contendo 0,5% de BSA, 0,1% de azida sódica e
0,5% de saponina, pH 7,2-7,4), seguidas de homogeneização por inversão e incubação por 15
min à temperatura ambiente. Em seguida, as amostras foram centrifugadas (250 g, 7 min,
18°C) e o sobrenadante descartado. As células foram lavadas com PBS-W (250 g, 7 min,
18°C) e, após descartar o sobrenadante, as suspensões celulares foram homogeneizadas e
distribuídas em tubos contendo anticorpos monoclonais, específicos para as citocinas IFN- e
TNF-α e conjugados com o fluorocromo ficoeritrina (PE) e os respectivos controles isotípicos
57
(Tabela 5, página 51). Após incubação por 30 minutos, à temperatura ambiente e ao abrigo da
luz, as células foram lavadas com PBS-W (250 g, 7 min, 18°C) e, por fim, foi avaliado o
parâmetro de produção de citocinas intracitoplasmáticas, por citometria de fluxo
(FACSCANTO II - Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA), procedendo-se a aquisição de
30000 eventos por tubo (BRITO-MELO et al., 2006).
Para análise dos dados, utilizamos o programa FACSDIVA (Becton Dickinson, San
Jose, CA, EUA), no qual foram gerados gráficos bidimensionais de distribuição pontual FSCA versus FSC-H, nos quais foi delimitada uma região R1 em que os “doublets” celulares
foram excluídos (Figura 4A). A partir desses gráficos, foram gerados novos gráficos de
tamanho e complexidade interna celular (FSC-A x SSC-A) que apresentavam os eventos
referentes à R1 (Figura 4B). Em seguida, a população de linfócitos foi selecionada (região
R2) (Figura 4B) e avaliada em gráficos de distribuição pontual de FSC-A versus fluorescência
para PE (que estava conjugado ao anticorpo anti-IFN-γ ou anti-TNF-α) (Figura 4C)
permitindo a análise do percentual de células positivas para cada uma das citocinas avaliadas.
Figura 4. Sequência de procedimentos utilizados para a análise do percentual de linfócitos positivos para
as citocinas avaliadas. Inicialmente, foram gerados gráficos de distribuição pontual FSC-A x FSC-H utilizados
para a exclusão de “doublets” celulares na região R1 (A). Em seguida foram utilizados gráficos de distribuição
pontual FSC-A x SSC-A para selecionar a população de linfócitos (R2) (B). O terceiro gráfico (C) foi gerado
para avaliar a expressão de citocinas em linfócitos. Esse gráfico é referente a uma cultura estimulada com PMA e
marcada com anticorpos monoclonais para IFN-γ.
58
5.12 Avaliação do efeito do extrato diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum
sobre a expressão de COX-2
Para avaliar o efeito do extrato diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum sobre
a expressão de COX-2, alíquotas de 1 mL de sangue heparinizado foram adicionadas a tubos
de polipropileno. Para induzir a produção de COX-2, adicionou-se 2 μL de LPS (2 μg/mL)
(lipopolissacarídeo de Escherichia coli 0127:B8, Sigma, St. Louis, MO, EUA) na ausência ou
presença do extrato diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum nas concentrações de 50
μg/mL, 25 μg/mL e 12,5 μg/mL. Uma cultura não estimulada com LPS consistiu o controle
negativo. Após 4 horas de incubação em estufa úmida a 37ºC e 5% de CO2, alíquotas de 100
μL de cada cultura foram transferidas para tubos de poliestireno contendo anticorpo antiCD14 conjugado com o fluorocromo PerCP-Cy5.5 (Tabela 5, página 51), seguido de
incubação por 20 minutos à temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Em seguida, foram
adicionados 2 mL de solução de lise eritrocitária homogeneizando-se em vórtex e incubou-se
os tubos por 10 min à temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Após esse tempo, as
suspensões celulares foram centrifugadas (5 min, 500 g, 18°C) e o sobrenadante foi
descartado. Procedeu-se, então, à permeabilização celular pela adição de 500 μL de PBS-P e
incubação por 10 min à temperatura ambiente e ao abrigo da luz. As células foram lavadas em
PBS-W (5 min, 500 g, 18°C) e o sobrenadante foi descartado. Na sequência, as células foram
incubadas com 1 μL de reagente contendo anticorpos anti-COX-1, conjugado com o
fluorocromo FITC, e anti-COX-2, conjugado com o fluorocromo PE (Tabela 5, página 51)
por 30 minutos à temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Paralelamente o mesmo
procedimento foi realizado para a confecção dos controles isotípicos. Após a incubação, as
células foram lavadas em PBS-W (5 min, 500 g, 18°C) e suspensas em PBS para análise da
expressão de COX-2 intracitoplasmática, por citometria de fluxo (FACSCANTO II - Becton
Dickinson, San Jose, CA, EUA), procedendo-se a aquisição de 50000 eventos por tubo.
Para análise dos dados, utilizamos o programa FACSDIVA (Becton Dickinson, San
Jose, CA, EUA), no qual foram gerados gráficos bidimensionais de distribuição pontual em
função de FSC-A versus FSC-H, nos quais foi delimitada uma região R1 em que os
“doublets” celulares foram excluídos (Figura 5A). Para identificação dos monócitos, os
eventos presentes em R1 foram avaliados em gráficos de SSC-A versus fluorescência para
PerCP-Cy5.5 (que estava conjugado ao anticorpo anti-CD14), nos quais foi possível
selecionar a população de interesse (região R2) (Figura 5B). Para a análise do percentual de
59
monócitos positivos para COX-1 e COX-2, os eventos presentes em R2 foram analisados em
gráficos de distribuição pontual de fluorescência para PE versus fluorescência para FITC
(conjugados aos anticorpos anti-COX-2 e anti-COX-1, respectivamente) para culturas não
estimuladas (Figura 5C) e estimuladas com LPS (Figura 5E). Além disso, a expressão de
COX-2, por célula, foi avaliada através da intensidade média de fluorescência (IMF) em
histogramas em escala logarítmica de número de eventos versus fluorescência para PE. Para
isso, foi posicionado o marcador M1, para estabelecer um limiar de negatividade em função
da curva de fluorescência obtida para as culturas não estimuladas (Figura 5D), que serviu de
referência para avaliar a intensidade de fluorescência das células marcadas com PE (COX-2)
para as demais condições experimentais (Figura 5F).
Figura 5. Sequência de procedimentos utilizados para as análises de expressão de COX-2. O gráfico de
distribuição pontual FSC-H x FSC-A foi utilizado para excluir os “doublets” celulares (A), seguido da geração
de gráficos de distribuição pontual SSC x PerCP-Cy5.5 utilizados para a seleção da população de monócitos nas
culturas (B). Em seguida foram utilizados gráficos de distribuição pontual PE x FITC para visualizar os eventos
referentes à cada uma das enzimas COX-1 e COX-2 em culturas não estimuladas (C) e estimuladas com LPS
(E). Histogramas de PE x número de eventos foram utilizados para definir a região M1 para a cultura controle
não estimulada com LPS (D) e para culturas que receberam estímulo com LPS representando o percentual de
células que produziram COX-2 (F).
60
6 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados foram expressos como média ± desvio padrão e as análises foram realizadas
utilizando o software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA).
Para análise da normalidade dos dados, utilizamos o teste Shapiro-Wilk e as diferenças entre
as variáveis com distribuição normal foram testadas utilizando ANOVA com Post Hoc de
Tukey. Para as variáveis com distribuição assimétrica, foi utilizado o teste Kruskall-Wallis
com Post Hoc de Dunns. Diferenças estatisticamente significantes foram consideradas quando
p<0,05.
61
7 RESULTADOS
7.1 Triagem fitoquímica das principais classes de metabólitos secundários presentes nas
raízes de E. crinitum
A Figura 6 mostra o resultado da pesquisa de taninos através das reações com acetato
de chumbo (Figura 6A), com cloreto férrico (Figura 6B) e com gelatina (Figura 6C) para as
amostras de H. virginiana (controle positivo) e raízes de E. crinitum. As três reações
realizadas apresentaram resultados negativos nas soluções contendo a amostra vegetal de
raízes de E. crinitum, não sendo visualizada a formação de precipitado para as reações com
gelatina e acetato de chumbo e o desenvolvimento de cor azul ou verde na reação com cloreto
férrico.
A
B
Controle
positivo
Raiz de E. crinitum
Controle
positivo
C
Raiz de E. crinitum
Controle positivo
Raiz de E. crinitum
Figura 6. Pesquisa de taninos em raízes de Eriosema crinitum. Reação negativa para análise de taninos
verificada pela ausência da formação de precipitado esbranquiçado na reação com acetato de chumbo (A),
ausência da formação da cor azul/verde na reação com cloreto férrico (B) e ausência de precipitado na reação
com gelatina (C). Folhas de H. virginiana foram utilizadas como controle positivo para fins de comparação com
os resultados obtidos.
Para a identificação de alcaloides em raízes de E. crinitum utilizando os Reativos
Gerais de Alcaloides (RGA), foram realizadas a pesquisa direta de alcaloides na forma
combinada e a pesquisa confirmatória de alcaloides na forma livre. A Figura 7 mostra o
resultado da pesquisa de alcaloides para o controle positivo (P. boldus) e para raízes de E.
crinitum. Embora tenha sido observado o desenvolvimento de precipitados nos tubos
contendo os reativos de Dragendorff (6B), de Mayer (6C) e de Bouchardat (6D), para raízes
de E. crinitum, a coloração destes não corresponde àquelas que configuram a reação positiva
62
(Tabela 3). Portanto, a pesquisa direta de alcaloides foi negativa para a amostra vegetal
analisada. Além disso, para a reação confirmatória de alcaloides, seria necessário que pelo
menos três das reações realizadas fossem positivas para confirmar a presença de alcaloides na
amostra vegetal analisada. As amostras de raízes de E. crinitum apresentaram resultado
positivo apenas para a reação de Dragendorff onde foi formado um precipitado de coloração
alaranjada. Dessa forma, esses resultados descartam a presença de alcaloides em raízes de E.
crinitum.
Controle positivo
Raiz de E. crinitum
A
B
C
D
E
Figura 7. Pesquisa de alcaloides em raízes de Eriosema crinitum. Resultado negativo para análise de
alcaloides verificado na reação direta. Não houve formação de precipitados de cor alaranjado, branco, marrom e
amarelo nos tubos tratados com os reativos de Dragendorff (B), de Mayer (C), de Bouchardat (D) e de Hager
(E), respectivamente na amostra de raízes de E. crinitum, ao contrário do resultado mostrado para os tubos na
parte superior da figura, referentes à amostra de P. boldus (controle positivo), onde esses precipitados estão
presentes. Os tubos identificados com a letra “A” contêm somente o extrato das folhas de P. boldus (superior) e
de raízes de E. crinitum (inferior) para visualização da cor do extrato para fins de comparação com os resultados
obtidos.
Em todas as reações realizadas para pesquisa de flavonoides a amostra de raízes de E.
crinitum foi positiva. A Figura 8 apresenta o resultado positivo para a reação de Shinoda, em
que houve desenvolvimento de coloração avermelhada (Figura 8A), e para a reação de Pew
em que ocorreu formação de coloração rósea (Figura 8B). Na reação com cloreto de alumínio
foi observada emissão de fluorescência sob a luz ultravioleta (Figura 9).
63
B
A
Controle positivo
Raiz de E. crinitum
Branco
Teste
Controle positivo
Branco
Teste
Raiz de E. crinitum
Figura 8. Pesquisa de flavonoides em raízes de Eriosema crinitum pelas reações de Pew e de Shinoda.
Resultado positivo para análise de flavonoides pela reação de Pew em que flavonoides reagem com zinco
metálico em solução ácida exibindo coloração vermelha (A), comparável ao controle positivo (folhas de B.
trimera). Na reação de Shinoda (B), houve formação de coloração rósea na presença de magnésio em solução
ácida. Foi utilizado um branco das reações, contendo somente o extrato de folhas de B. trimera (controle
positivo) e de raízes de E. crinitum, para visualização da cor do extrato, para fins de comparação com o resultado
obtido.
Controle positivo
Raiz de E. crinitum
Figura 9. Pesquisa de flavonoides em raízes de Eriosema crinitum pela reação com Cloreto de Alumínio.
Resultado positivo para análise de flavonoides pela reação com cloreto de alumínio em que houve aparecimento
de fluorescência de cor amarela esverdeada (A), comparável ao controle positivo (folhas de B. trimera).
A pesquisa de antraquinonas está demonstrada na Figura 10. Não foram encontradas
antraquinonas nas raízes de E. crinitum, uma vez que, tanto a reação direta (Figura 9A),
quanto na reação de Bornträger com prévia hidrólise ácida (Figura 10B) foram negativas.
64
A
B
Controle positivo
Raiz de E. crinitum
Controle positivo
Raiz de E. crinitum
Figura 10. Pesquisa de antraquinonas em raízes de Eriosema crinitum. Resultado negativo para
antraquinonas evidenciado pela ausência de coloração rósea a avermelhada tanto na pesquisa direta (A) quanto
na reação de Bornträger com prévia hidrólise ácida, ao contrário do resultado mostrado para o controle positivo
(folhas de C. senna).
A pesquisa de saponinas nas raízes de E. crinitum e B. trimera (controle positivo) está
demonstrada na Figura 11. Os resultados indicaram a ausência dessa classe química nas raízes
de E. crinitum, já que em todas as diluições testadas, a espuma formada apresentou altura
inferior a 1cm (aproximadamente 0,4 cm) (Figura 11B).
A
Controle positivo
B
Raiz de E. crinitum
10%
20%
30%
40%
50%
60% 70%
80%
90% 100%
Figura 11. Pesquisa de saponinas em raízes de Eriosema crinitum. Resultado negativo para saponinas
verificado pela ausência de espuma persistente com altura igual ou maior que 1 cm em todas as diluições (B).
65
Para fins de comparação com os resultados obtidos, foram utilizadas folhas de B. trimera como controle positivo
(A), onde houve formação de espuma com altura acima de 1 cm a partir da primeira diluição (10%).
A Figura 12 representa a pesquisa de terpenos em raízes de E. crinitum. Após a reação
cromogênica, houve formação de anel de coloração avermelhada, o que sugere resultado
positivo para terpenos.
Branco
Teste
Raiz de E. crinitum
Figura 12. Pesquisa de esteroides e terpenos em raízes de E. crinitum. Nesta pesquisa as raízes pulverizadas
foram submetidas à extração com clorofórmio seguida de adição de anidrido acético e ácido sulfúrico
concentrado. A formação de anel de cor avermelhada sugeriu um resultado positivo para presença de terpenos na
amostra.
Para complementar a pesquisa de terpenos, foi realizada uma Cromatografia em
Camada Delgada Comparativa (CCDC), utilizando como padrão o sesquiterpeno alfabisabolol. A Figura 13 representa a análise da cromatoplaca em luz ultravioleta (Figura 13A)
e após revelação com vanilina sulfúrica (Figura 13B). Pela análise em luz ultravioleta no
comprimento de onda de 254 nm, foi possível observar a presença de manchas referentes às
amostras aplicadas (extrato diclorometano-etanólico de raiz de E. crinitum e resíduo do
macerado em diclorometano de raiz de E. crinitum). Após revelação com vanilina sulfúrica,
foi observada a presença de manchas de coloração violeta em posições semelhantes às
manchas de mesma cor apresentadas pelo padrão (Figura 13B). O cálculo do fator de retenção
(FR) indicou a presença de terpenos na amostra, tendo em vista que os valores para as
amostras analisadas (extrato diclorometano-etanólico - FR = 0,57 - e resíduo de macerado em
diclorometano - FR = 0,55 - de raiz de E. crinitum) são próximos ao valor do FR do padrão
(0,62).
66
A
B
1
2
2
1
P
1
2
2
1
P
Figura 13. Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC) para pesquisa de terpenos em
raízes de E. crinitum. Utilizou-se cromatoplaca com fase estacionária de sílica gel e a fase móvel constituiu de
tolueno e acetato de etila 93:7 v/v. Análise em ultravioleta no comprimento de onda de 254 nm (A) e revelação
das manchas com solução de vanilina sulfúrica (B). Amostras aplicadas em duplicata: 1) Extrato diclorometanoetanólico de raiz de E. crinitum ; 2) resíduo do macerado de raiz de E. crinitum em diclorometano; P) Padrão
sesquiterpeno alfa-bisabolol.
A Tabela 6 apresenta as classes de metabólitos secundários pesquisadas em raízes de
E. crinitum e o resultado encontrado para cada uma.
Tabela 6. Pesquisa de classes de metabólitos secundários em raízes de E. crinitum.
Classe de Metabólito Secundário
Resultado
Taninos
Negativo
Alcaloides
Negativo
Flavonoides
Positivo
Antraquinonas
Negativo
Saponinas
Negativo
Terpenos
Positivo
Esteroides
Negativo
200
7,757
400
7,172
600
0
5
288 nm.
10
53,678
54,031
54,459
54,632
54,871
55,013
55,082
55,159
55,258
55,337
55,659
56,063
56,496
56,425
56,782
56,907
57,008
57,152
57,498
57,909
57,878
58,078
58,155
58,446
58,610
58,849
58,977
59,048
59,108
59,268
59,387
59,512
59,792
800
15
20
25
30
35
40
45
mAU
47,942
45,601
52,312
1600
50
53,269
49,835
46,384
46,762
46,86746,612
46,995
47,269
47,447
47,757
48,490
48,822
38,096
41,940
38,738
1800
41,551
42,164
39,978
35,163
35,437
33,944
Spectrum Max Plot
Eriosema crinitum grad 1 191213 2
42,663
4 2,802
42,976
43,235
43,435
43,663
43,827
44,053
44,272
44,487
44,635
44,815
45,046
45,239
45,426
1000
34,528
Retention Time
51,868
34,873
1200
35,757
36,171 35,968
36,540
36,951
37,279
37,512
37,904
38,487
39,212
39,448
39,651
39,780
40,343
40,599
40,746
40,877
41,175
41,369
16,292
16,908
23,857
1400
24,337 24,591
24,758
24,917
25,353
25,583
25,803
26,161
26,70526,449
26,956
27,287
27,491
27,750
27,933
28,393
28,532
28,797
28,944
29,403
29,636
29,927
30,115
30,49730,288
30,936
31,126
31,472
31,909
32,078
32,176
32,303
32,581
32,870
33,127
33,385
33,484
33,628
33,747
34,343
17,195
17,512
17,875
18,348
18,498
18,588
18,783
18,902
19,123
19,420
19,527
19,725
20,023
20,303
20,614
20,814
20,970
21,101
21,308
21,518
21,746
21,884
22,258
22,424
22,861
23,103
23,272
2000
8,831
9,099
9,454
10,023
10,121
9,716
10,207
10,352
9,866
10,489
10,650
10,945
11,045
11,18911,327
11,496
11,710
11,849
12,178
12,295
12,387
12,493
12,589
12,884
13,210 13,033
13,343
13,425
13,607
13,541
13,780
13,998
13,945
14,351
14,529
14,621
14,968
15,059
15,361
15,635
15,550
15,783
2,772
2,965
3,083
mAU
67
7.2 Análise do extrato em diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum por
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a Detector de Arranjo de Diodos
(CLAE-DAD)
A Figura 14 apresenta o cromatograma obtido no modo Spectrum Max Plot
(absorbância em mAU versus tempo em minutos), gerado a partir de substâncias presentes no
extrato diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum que apresentaram absorção máxima
nos comprimentos de onda entre 190 e 600 nm.
2000
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
0
-200
55
60
-200
Minutes
Figura 14. Cromatograma da análise do extrato diclorometano-etanólico de raízes de Eriosema crinitum
por CLAE-DAD, modo Spectrum Max Plot.
Tendo em vista que a maioria das substâncias presentes no extrato apresentou
absorção máxima, aproximadamente, no comprimento de onda de 288 nm, foi gerado o
cromatograma da Figura 15 (absorbância em mAU versus tempo em minutos) monitorado em
68
Figura 15. Cromatograma da análise do extrato diclorometano-etanólico de raízes de Eriosema crinitum
no comprimento de onda de 288 nm por CLAE-DAD.
Considerando os cromatogramas obtidos, verificamos que o extrato diclorometanoetanólico de raízes de E. crinitum apresenta perfil químico complexo, com substâncias de alta,
média e baixa polaridade. As substâncias de alta polaridade são representadas por picos com
menores tempos de retenção (Tr), eluídos entre 1 e 20 minutos, resultantes de maior afinidade
pela fase móvel. Alguns picos foram eluídos entre 20 e 35 minutos, demonstrando a presença
de substâncias de média polaridade. Os picos eluídos tardiamente, entre 35 e 47 minutos,
devido à maior afinidade pela fase estacionária apolar (coluna C18), se destacam por
apresentarem maior intensidade e serem majoritários em relação aos demais picos, indicando
que as substâncias de baixa polaridade predominam no extrato.
Os flavonoides apresentam como estrutura básica um núcleo fundamental constituído
de 15 átomos de carbono arranjados em três anéis, sendo dois anéis fenólicos substituídos (A
e B) e um pirano (cadeia heterocíclica C) acoplado ao anel A (Figura 16) (DORNAS et al.,
2007). As substâncias da classe dos flavonoides, quando analisadas por espectros de
ultravioleta, apresentam duas bandas de absorção bem características, sendo elas: a Banda II,
com absorção máxima entre 240-285nm correspondente ao grupo benzoil (anel A) e a Banda
I, com absorção máxima entre 300-550nm correspondente ao grupo cinamoil (anel B) da
molécula (ZUANAZZI; MONTANHA, 2007).
69
Flavonol
Chalcona
Dihidroflavonol
3’
4’
2’
B
1
8
9
2
7
A
Flavanona
6
6’
C
3
10
5
5’
1’
4
Estrutura básica
Flavona
Isoflavanona
Antocianidina
Figura 16. Estrutura básica dos flavonoides e as principais subclasses (DORNAS et al., 2007).
A análise das Bandas I e II (máximo de absorção e intensidade) pode auxiliar na
identificação das subclasses de flavonoides, conforme apresentado na Tabela 7 (MARSTON;
HOSTETTMANN, 2006).
Tabela 7. Faixa de absorção e intensidade das bandas I e II para identificação das subclasses
de flavonoides.
Subclasses
Banda II (240 - 285 nm)
Banda I (300 - 550 nm)
Flavonas
240 – 280
305 – 350 (intensa)
Flavonóis
240 – 280
350 – 385 (intensa)
Dihidroflavonóis
270 – 295 (intensa)
Baixa intensidade
Flavanonas
270 – 295 (intensa)
Ombro
Isoflavonas
245 – 270 (intensa)
-
Chalconas
Pequena
340 – 390
Auronas
220 – 270 (intensa)
370 – 430
Antocianidinas
270 – 280 (pequena)
480 – 550 (intensa)
de Flavonoides
70
De acordo com nossos resultados, os espectros obtidos em CLAE-DAD apresentaram
picos de absorção em regiões características de substâncias da classe dos flavonoides. Esse
resultado está de acordo com aqueles encontrados para a triagem realizada por meio de
reações cromogênicas, fluorogênicas e de precipitação. A análise de absorção e intensidade
das bandas I e II sugere a presença das subclasses flavonóis (Figura 17) e flavonas (Figura
18).
Figura 17. Espectros em UV/Vis (190 – 600 nm) dos picos indicativos da presença de flavonóis no extrato
diclorometano-etanólico de raízes de Eriosema crinitum. Tr = tempo de retenção.
71
Figura 18. Espectros em UV/Vis (190 – 600 nm) dos picos indicativos da presença de flavonas no extrato
diclorometano-etanólico de raízes de Eriosema crinitum. Tr = tempo de retenção.
72
7.3 Análise de hemogramas dos sujeitos da pesquisa
A caracterização dos voluntários participantes do estudo, referente aos parâmetros
hematológicos, está indicada na Tabela 8. De acordo com os dados obtidos, os voluntários
apresentaram hemograma dentro dos limites da normalidade para indivíduos adultos.
Tabela 8. Caracterização dos voluntários.
Parâmetros (valores de referência*)
3
Hemácias (3,8 a 5,6 milhões/mm )
Hemoglobina (12 a16 g/dL)
Média ± DP
4,96 ± 0,65 milhões/ mm3
14,40 ± 1,82 g/dL
Hematócrito (36 a 47%)
42,71 ± 4,84%
HCM (27 a 34 pg)
28,91 ± 0,12 pg
VCM (80 a 100 fL)
86,10 ± 1,34 fL
CHCM (32 a 35%)
33,72 ± 0,39%
Leucócitos totais (3,5 - 11 x 103/mm3)
7 ± 2 x103/mm3
Neutrófilos (40-70%)
55 ± 8%
Linfócitos (20-50%)
41 ± 8%
Monócitos (2-20%)
2 ± 1%
Eosinófilos (0-8%)
2 ± 2%
Basófilos (0-3%)
0 ± 0%
*Valores de referência de acordo com Xavier et al. (2010).
7.4 Citotoxicidade do extrato diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum
Uma vez que os ensaios biológicos para análise do potencial anti-inflamatório de E.
crinitum seria conduzido utilizando-se sangue periférico humano, e tendo em vista que a
indução de morte celular seria prejudicial para investigação de possíveis atividades biológicas
do extrato, decidimos determinar inicialmente quais concentrações do extrato diclorometanoetanólico de raízes de E. crinitum não seriam tóxicas para culturas de células da linhagem
vermelha (hemácias) e linhagem branca (leucócitos).
A Figura 19 apresenta o percentual de hemólise induzido por diferentes concentrações
do extrato. Os resultados demonstram que não houve indução de hemólise quando as culturas
foram tratadas com o solvente DMSO ou com o extrato nas concentrações de 12,5 μg/mL
(1,63 ± 0,42 %) e 25 μg/mL (2,53 ± 1,88 %). Porém, nas concentrações de 50 μg/mL (16,70 ±
10,00 %) e 100 μg/mL (82,66 ± 9,54 %) o extrato demonstrou efeito hemolítico, sendo o
73
percentual de hemólise para essas culturas estatisticamente significante em relação às culturas
controle do solvente.
*
100
%Hemólise
Hemólise
(%)
80
60
40
*
20
0
DMSO
12,5
25
50
100
Extrato diclorometano-etanólico de E. crinitum (μg/mL)
concentração do extrato (g/mL)
Figura 19 - Percentual de hemólise em culturas tratadas com diferentes concentrações do extrato
diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum e com o controle do solvente DMSO 2% (n = 8) após 4 h
de cultura. Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão. * Diferença em relação ao grupo
controle do solvente, p ≤ 0,05. Método estatístico utilizado – Kruskal-Wallis com post hoc de Dunns.
O efeito citotóxico do extrato sobre PBMC, após 24 horas e 5 dias de cultura foi
avaliado pelo método de exclusão com azul de Tripan. As Figuras 20 e 21 demonstram os
resultados para a análise da viabilidade celular após 24 horas e 5 dias de cultura,
respectivamente. Após 24 horas de cultura, o extrato diclorometano-etanólico de E. crinitum
(DE) nas concentrações de 12,5 μg/mL, 25 μg/mL e 50 μg/mL não reduziu a viabilidade
celular (DE 12,5 μg/mL: 97,56 ± 0,32%; DE 25 μg/mL: 95,09 ± 1,71%; DE 50 μg/mL: 93,88
± 1,46%) quando comparado às culturas controle (96,75 ± 1,49%) e controle do solvente
(DMSO: 95,66 ± 1,56%). Houve indução de morte celular quando as culturas foram tratadas
com o extrato na concentração de 100 μg/mL (56,60 ± 7,24%).
74
100
Células viáveis (%)
80
a,b
60
40
20
0
Controle DMSO
12,5
25
50
100
Extrato DE de E. crinitum (μg/mL)
Figura 20. Efeito do extrato diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum sobre a viabilidade celular,
após 24 horas de cultura. Percentual de PBMC viáveis nas culturas controle, DMSO e nas culturas tratadas
com o extrato diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum em diferentes concentrações, avaliado por
exclusão com azul de Tripan utilizando câmara de Neubauer (n = 8). Os resultados foram expressos como média
± desvio padrão da viabilidade nos diferentes grupos. Diferenças significativas (p≤0,05, Kruskal-Wallis com
post hoc de Dunns) são identificadas pelas letras “a” e “b”, para as comparações em relação às culturas controle
e DMSO, respectivamente.
Após 5 dias de cultura, o extrato em concentração igual ou inferior a 25 μg/mL, não
demonstrou efeito citotóxico às PBMC (DE 12,5 μg/mL: 93,56 ± 3,03%; DE 25 μg/mL: 83,75
± 6,67%) quando comparado às culturas controle (91,50 ± 2,86%) e controle do solvente
(DMSO: 85,47 ± 7,75%). Porém, nas culturas tratadas com 50 μg/mL e 100 μg/mL do extrato
houve significativa redução da viabilidade celular (DE 50 μg/mL: 65,47 ± 10,37%; DE 100
μg/mL: 54,70 ± 2,90%) (Figura 21).
atual DE Eriosema 5 dias
75
100
a,b
Células viáveis (%)
80
a,b
60
40
20
0
Ctrl
DMSO
12,5
25
50
100
Extrato diclorometano-etanólico de E. crinitum
(μg/mL)
Figura 21. Efeito do extrato diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum sobre a viabilidade celular,
após 5 dias de cultura. Percentual de PBMC viáveis nas culturas controle, DMSO e nas culturas tratadas com
extrato diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum em diferentes concentrações, avaliado por exclusão com
azul de Tripan utilizando câmara de Neubauer (n = 8). Os resultados foram expressos como média ± desvio
padrão da viabilidade nos diferentes grupos. Diferenças significativas (p≤0,05, Kruskal-Wallis com post hoc de
Dunns) são identificadas pelas letras “a” e “b”, para as comparações em relação às culturas controle e DMSO,
respectivamente.
7.5 Efeito do extrato diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum sobre a
proliferação de linfócitos humanos
Com o intuito de avaliar a possível atividade anti-inflamatória do extrato
diclorometano-etanólico de raízes E. crinitum, inicialmente investigamos o efeito do extrato
sobre a resposta proliferativa de linfócitos e subpopulações de linfócitos T CD4 e T CD8,
estimulados com o mitógeno PHA, conforme demonstrado na Figura 22.
Os resultados indicam que o extrato DE nas concentrações de 12,5 μg/mL e 25 μg/mL
reduziu de forma significativa o índice de proliferação de linfócitos (DE 12,5 μg/mL 1,21 ±
0,37; DE 25 μg/mL 0,46 ± 0,25) e de linfócitos T CD8 (DE 12,5 μg/mL 1,56 ± 0,39; DE 25
μg/mL 0,45 ± 0,15) quando comparado às culturas tratadas apenas com PHA (Linfócitos: 2,12
± 0,65; Linfócitos T CD8: 2,99 ± 1,53). Observou-se ainda que essa redução foi dosedependente, ou seja, a maior concentração do extrato promoveu maior redução no índice de
proliferação.
76
Além disso, a resposta proliferativa de células TCD4 foi reduzida em culturas tratadas
com 25 μg/mL do extrato (0,47 ± 0,29), quando comparado às culturas PHA (2,07 ± 0,77).
O solvente DMSO não alterou o índice de proliferação celular para linfócitos totais
(DMSO 2,11 ± 0,77) e para as subpopulações de linfócitos TCD8 (DMSO 2,56 ± 1,47) e
TCD4 (DMSO 2,26 ± 1,09), quando comparado às culturas PHA. Já a Dexametasona,
utilizada como controle de inibição, reduziu de forma significativa o IP de linfócitos (0,33 ±
0,26) e das subpopulações de linfócitos TCD8 (0,76 ± 0,77) e TCD4 (0,24 ± 0,25),
comparados às culturas PHA. Deve-se ressaltar que a redução da proliferação pelo extrato na
maior concentração testada (25 μg/mL) foi de 4,6; 4,4 e 6,6 vezes para os linfócitos, linfócitos
T CD4 e linfócitos T CD8, respectivamente. Além disso, esse efeito foi devido à presença do
extrato nas culturas, já que o controle do solvente DMSO não teve efeito sobre a proliferação
de linfócitos.
77
LINFÓCITOS
A
4
3
*
2
*
*
1
0
B
LINFÓCITOS T CD8
Índice de Proliferação (%)
Índice de Proliferação
5
4
3
*
*
2
*
1
0
C
LINFÓCITOS T CD4
Índice de Proliferação
4
3
2
*
*
1
0
PHA (5 μg/mL)
-
+
+
+
+
+
+
DE (μg/mL)
-
-
-
6,25
12,5
25
-
DMSO (0,5%)
-
-
+
-
-
-
-
DEXA (8 μg/mL)
-
-
-
-
-
-
+
Figura 22. Efeito do extrato diclorometano-etanólico de E. crinitum (DE) sobre a proliferação de linfócitos.
PBMC foram incorporadas com VPD450 e incubadas por 5 dias na ausência e na presença de PHA e tratadas
com extrato DE de E. crinitum nas concentrações 6,25 µg/mL; 12,5 µg/mL ou 25 µg/mL. Os resultados foram
expressos como média ± desvio padrão do índice de proliferação de linfócitos (A) e das subpopulações
78
linfocitárias T CD8 (B) e T CD4 (C) (n = 8). Como controle de inibição foi utilizado Dexametasona (DEXA). *
Diferença em relação ao grupo PHA, p ≤ 0,05. Método estatístico utilizado – ANOVA seguida de Tukey.
Além disso, verificamos que o extrato DE, por si só, não apresenta efeito mitogênico,
tendo em vista que em culturas tratadas com o extrato sem estímulo com PHA não houve
aumento na resposta proliferativa dos linfócitos e das subpopulações, conforme dados dos
índices de proliferação demonstrados na Tabela 9.
Tabela 9. Índice de proliferação para linfócitos e suas subpopulações em culturas não
estimuladas com PHA.
Índice de Proliferação (%)
Culturas
Linfócitos
Linfócitos T CD4
Linfócitos T CD8
Controle
0,051 ± 0,074
0,034 ± 0,079
0,035 ± 0,079
DMSO
0,023 ± 0,017
0,007 ± 0,004
0,005 ± 0,004
DE 25μg/mL
0,015 ± 0,009
0,007 ± 0,004
0,007 ± 0,004
DE 12,5 μg/mL
0,020 ± 0,007
0,007 ± 0,004
0,005 ± 0,004
DE 6,25 μg/mL
0,015 ± 0,005
0,007 ± 0,004
0,005 ± 0,004
Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão. Diferenças significativas foram consideradas
quando p ≤ 0,05 (ANOVA com post hoc de Tukey, para dados com distribuição simétrica; Kruskal-Wallis com
post hoc de Dunns, para variáveis com distribuição assimétrica).
7.6 Efeito do extrato diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum sobre a produção
de IL-2 por linfócitos humanos
Tendo em vista que a proliferação de linfócitos em resposta a um estímulo requer a
produção da citocina IL-2 por linfócitos ativados e que o extrato DE inibiu a proliferação
celular estimulada pelo mitógeno PHA, foi feita a investigação do efeito do extrato sobre a
produção de IL-2.
A Figura 23 apresenta os níveis de IL-2 detectados em culturas estimuladas com PHA
e tratadas com o extrato DE em diferentes concentrações. Os dados demonstram que o extrato
reduziu significativamente os níveis de IL-2, novamente de forma dose-dependente, nas
culturas tratadas com 12,5 μg/mL (28,01 ± 7,95 pg/mL) e 25 μg/mL (17,02 ± 4,04 pg/mL)
comparado às culturas tratadas apenas com PHA (58,77 ± 15,70 pg/mL). Também houve
diferença estatisticamente significante para a redução de IL-2 em culturas tratadas com
Dexametasona (6,53 ± 10,73 pg/mL) comparado ao PHA. Já o solvente DMSO não foi capaz
79
de inibir a produção desta citocina (DMSO: 39,79 ± 15,7 pg/mL), mostrando que o efeito foi
devido à presença do extrato.
RESULTADO curva menor
100
IL-2 (pg/mL)
IL-2 (pg/mL)
80
60
*
40
*
*
20
0
PHA (5 μg/mL)
-
+
+
+
+
+
+
DE (μg/mL)
-
-
-
6,25
12,5
25
-
DMSO (0,5%)
-
-
+
-
-
-
-
DEXA (8 μg/mL)
-
-
-
-
-
-
+
Figura 23. Efeito do extrato diclorometano-etanólico de E. crinitum (DE) sobre a produção de IL-2. PBMC
foram incubadas por 36 horas na ausência e na presença de PHA e tratadas com extrato DE de E. crinitum nas
concentrações 6,25 µg/mL; 12,5 µg/mL ou 25 µg/mL. IL-2 foi quantificada por ELISA e os resultados estão
expressos como média ± desvio padrão dos níveis de IL-2 produzidos por linfócitos (n = 6). Como controle de
inibição foi utilizado Dexametasona (DEXA). * Diferença em relação ao grupo PHA, p ≤ 0,05. Método
estatístico utilizado – ANOVA seguida de Tukey.
7.7 Efeito do extrato diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum sobre a produção
de TNF-α e IFN-γ por linfócitos humanos
A análise do efeito do extrato DE sobre a produção das citocinas pró-inflamatórias
TNF-α e IFN-γ por linfócitos humanos constituiu outra forma de investigar uma possível
atividade imunomoduladora dessa planta (Figura 24). Os dados mostram que nas culturas
tratadas com o extrato DE não houve alteração do percentual de linfócitos que produziram
TNF-α (Figura 24A), bem como IFN-γ (Figura 24B). A Dexametasona, utilizada como
controle de inibição, reduziu de forma significativa o percentual de linfócitos positivos para
TNF-α (13,6 ± 6,92%) quando comparado às culturas tratadas apenas com PMA (35,8 ±
8,76%). Da mesma forma, esse fármaco reduziu significativamente o percentual de linfócitos
positivos para IFN-γ (18,00 ± 9,63%), quando comparado à cultura PMA (36,63 ± 8,64%).
80
A
TNF-α
50
40
30
*
20
% Linfócitos Citocina
+
10
0
B
IFN-γ
50
40
*
30
20
10
0
PMA (25 ng/mL)
-
+
+
+
+
+
+
DE (μg/mL)
-
-
-
12,5
25
50
-
DMSO (1%)
-
-
+
-
-
-
-
DEXA (8 μg/mL)
-
-
-
-
-
-
+
Figura 24. Efeito do extrato diclorometano-etanólico de E. crinitum (DE) sobre o percentual de linfócitos
TNF-α+ (A) e de linfócitos IFN-γ+ (B). Alíquotas de sangue total periférico foram incubadas por 4 horas na
ausência e na presença de PMA e ionomicina e tratadas com extrato DE de E. crinitum nas concentrações 12,5;
25 e 50 µg/mL. As citocinas foram analisadas intracelularmente por citometria de fluxo. Os resultados foram
expressos como média ± desvio padrão do percentual de linfócitos citocina+ para n = 8. Como controle de
redução da expressão de citocinas foi utilizado Dexametasona (DEXA). * Diferença em relação ao grupo PMA,
p ≤ 0,05. Método estatístico utilizado – ANOVA seguida de Tukey.
81
7.8 Efeito do extrato diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum sobre a expressão
de COX-2
A análise do efeito do extrato DE sobre a expressão da enzima COX-2 por monócitos
humanos representou outra forma de investigar a possível ação anti-inflamatória dessa planta.
Essa análise foi realizada pela intensidade média de fluorescência (IMF), que permite
correlacionar o sinal fluorescente emitido pela célula com a densidade da enzima presente no
seu interior. A avaliação da IMF para a COX-2 em monócitos (Figura 25) demonstrou que a
estimulação com LPS aumentou 67,85 vezes a expressão de COX-2 por monócitos em cultura
de sangue total em relação às culturas não estimuladas (controle: 1,15 ± 1,97%; LPS: 78,03 ±
6,63%). Porém o tratamento simultâneo com o extrato DE nas diferentes concentrações
testadas não reduziu tal expressão (DE 12,5 μg/mL: 77,4 ± 11,74%; DE 25 μg/mL: 74,18 ±
DE EC
7,36%; DE 50 μg/mL: 77,75 ± 13,75%) quando comparadas às culturas tratadas apenas com
LPS.
Intensidade Média de Fluorescência
100
80
60
40
20
0
S
LP+
DE (μg/mL)
-N
CO
-
DMSO (1%)
-
-
LPS (2 μg/mL)
-
D
SO
M
P+S
+L
D
+
E
S
LP+
5+
,
12 12,5
-
P+S
+L
E
25
D
25
-
S
P+
+L
E
50
D
50
-
Figura 25. Análise da intensidade média de fluorescência (IMF) de monócitos COX-2+. Alíquotas de
sangue total periférico foram incubadas por 4 horas na ausência e na presença de LPS e tratadas com extrato DE
de E. crinitum nas concentrações 12,5; 25 e 50 µg/mL. A COX-2 foi analisada intracelularmente por citometria
de fluxo. Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão para n = 5. Diferença em relação ao grupo
LPS foi considerada significativa quando p ≤ 0,05. Método estatístico utilizado – ANOVA seguida de Tukey.
82
8 DISCUSSÃO DOS RESULTADOS
A Eriosema crinitum é uma espécie comumente encontrada no Cerrado e é utilizada
pela população do Vale do Alto Jequitinhonha para tratamento de condições inflamatórias.
Porém, nenhuma informação científica está disponível no que tange a quaisquer tipos de
estudos: químicos, biológicos e/ou de toxicidade para essa planta. Dessa forma, inicialmente,
realizamos uma triagem fitoquímica seguida de uma análise por CLAE-DAD para caracterizar
as principais classes de metabólitos secundários presentes na planta. Em seguida, avaliamos a
toxicidade do extrato de raízes de E. crinitum sobre células sanguíneas para identificarmos as
concentrações que seriam utilizadas nos ensaios para a investigação de uma possível atividade
anti-inflamatória dessa planta.
A análise por CLAE-DAD permitiu detectar a presença das subclasses de flavonoides
flavona e flavonol no extrato diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum. Esse resultado
está de acordo com a triagem fitoquímica, realizada através de reações cromogênicas,
fluorogênicas e de precipitação, que direcionou a análise dos espectros. Embora não existam
estudos químicos anteriores para a E. crinitum, vários trabalhos que avaliaram outras espécies
do gênero Eriosema apontaram substâncias da classe dos flavonoides como as responsáveis
pela atividade biológica apresentada por essas espécies. Vale ressaltar que alguns dos
flavonoides isolados são moléculas inéditas, tais como as Kraussianonas 1 a7, presentes nas
raízes de E. kraussianum (DREWES et al., 2002; DREWES et al., 2004), as Erioschalconas A
e B isoladas a partir de E. glomerata (AWOUAFACK et al., 2008), as Robusflavonas A e B
extraídas de partes aéreas de E. robustum (AWOUAFACK, TANE E ELOFF, 2013) e os
khonklonginols A-H isolados nas raízes de E. chinense (SUTTHIVAIYAKIT et al., 2009).
Dessa forma, a possibilidade de que os flavonoides detectados no extrato
diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum sejam também moléculas inéditas, reforça a
necessidade de estudos que busquem identificar a estrutura das mesmas e constitui uma
primeira perspectiva do nosso trabalho.
Tendo em vista que, dentre as substâncias presentes em extratos vegetais, podem
existir aquelas com ações tóxicas que induzem morte celular (VEIGA JÚNIOR, PINTO e
MACIEL, 2005), os primeiros ensaios realizados nesse estudo buscaram avaliar a toxicidade
do diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum sobre hemácias e células mononucleares
do sangue periférico. No teste de atividade hemolítica, a hemoglobina liberada no meio após
a ruptura de eritrócitos provocada por uma substância tóxica é detectada pela leitura de
83
absorbância do sobrenadante da cultura (MONTAGNER, 2007). Por meio do teste de
atividade hemolítica, observou-se que o extrato na concentração de 100 μg/mL apresentou
atividade hemolítica maior que 80%, sendo que na concentração de 50 μg/mL, o percentual de
hemólise foi menor que 20%, ou seja, um valor baixo que não comprometeria as culturas
celulares de sangue total.
A análise de toxicidade sobre PBMC foi realizada pelo método de exclusão com azul
de Tripan (TENNANT, 1964; SONG et al., 2012; ZANATTA et al., 2012), onde células que
perderam a integridade da membrana retêm o corante no citoplasma enquanto as células vivas
permanecem não coradas (TENNANT, 1964). Observamos que para 24 horas de cultura,
somente na concentração de 100 μg/mL o extrato mostrou-se tóxico, sendo que quando o
tempo de cultura foi de 5 dias, as células perderam a viabilidade quando tratadas com o
extrato nas concentrações de 100 μg/mL e 50 μg/mL. Assim, nas culturas de análise do efeito
do extrato sobre a produção de citocinas e sobre a expressão de COX-2, em que o sangue total
é incubado por 4 horas na presença do extrato, utilizamos as concentrações iguais ou
inferiores a 50 μg/mL. Por outro lado, na avaliação da proliferação celular, em que PBMC são
mantidas em contato com o extrato durante cinco dias, as concentrações finais do extrato nas
culturas foram iguais ou inferiores a 25 μg/mL.
Os dados de citotoxidade mostrados aqui podem ser utilizados em investigações
futuras e servem de ponto de partida para aqueles estudos que visem avaliar a ação dos
constituintes ativos do extrato de E. crinitum sobre parâmetros sanguíneos e que necessitam
da confecção de culturas de sangue total ou de células mononucleares do sangue periférico
humano (PBMC).
A inflamação é um processo complexo que envolve a ativação de células do sistema
imune e a produção de mediadores inflamatórios, como as citocinas, que atuam amplificando
a resposta inflamatória. Nesse estudo, como parte da investigação da possível atividade antiinflamatória de E. crinitum, foi avaliado o efeito do extrato diclorometano-etanólico de raízes
dessa planta sobre a produção das citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IFN-γ por linfócitos
estimulados com PMA. Os resultados indicaram que o extrato não diminuiu a produção de
TNF-α e de IFN-γ. No entanto, por se tratar de um estudo com o extrato bruto, o qual
apresenta um perfil complexo de substâncias, comprovado pela análise em CLAE-DAE, é
possível que a investigação de frações do extrato, ou até de substâncias isoladas, leve à
obtenção de resultados diferentes dos encontrados, pois a concentração de constituintes ativos
84
do extrato em uma determinada fração poderia resultar na redução do número de moléculas
interferentes que não contribuem para o efeito anti-inflamatório da planta.
Além disso, devemos considerar que existem outras citocinas importantes na
manutenção do processo inflamatório e que não foram avaliadas nesse estudo, tais como IL-1,
IL-6, IL-12 e IL-17, as quais podem ter sua produção inibida pelo extrato. Em relação às
citocinas que atuam de forma a modular a resposta imune, como por exemplo, IL-10 e TGF-β,
a indução do aumento na produção dessas citocinas consiste de outro mecanismo pelo qual o
extrato poderia exercer seu efeito anti-inflamatório.
Com relação à enzima ciclooxigenase 2 (COX-2), uma isoforma produzida por células
relacionadas ao processo inflamatório, e responsável pela produção de PGE2, um poderoso
mediador inflamatório, sua análise consiste de um importante alvo para drogas antiinflamatórias, tais como os anti-inflamatórios não-esteroidais (AINES) (RUITENBERG;
WATERS, 2003). No presente estudo, o extrato diclorometano-etanólico de raízes de E.
crinitum não diminuiu a expressão de COX-2 induzida por LPS em monócitos do sangue
periférico humano. No entanto, a expressão proteica pode não se correlacionar com a
atividade enzimática e os resultados aqui apresentados não significam que a planta não tenha
atividade inibidora de COX. A análise da inibição da atividade de COX-2, medida pela
diminuição na produção de PGE2, poderia apresentar-se como uma forma adicional para
avaliar a função anti-inflamatória do extrato sobre essa via enzimática.
O achado principal desse trabalho, em relação à investigação da atividade antiinflamatória do extrato diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum, foi a capacidade de
o extrato inibir a resposta proliferativa de linfócitos e de suas subpopulações T CD4 e T CD8
em culturas estimuladas com fitohemaglutinina (PHA). A PHA é uma lectina presente em
Phaseolus vulgaris e tem forte ação mitógena sobre linfócitos T através da interação com os
carboidratos presentes nos receptores para antígenos dessas células, dessa forma ativando e
induzindo
a
proliferação
dos
linfócitos
humanos,
in
vitro
(NOWELL,
1960;
KANELLOPOULOS et al., 1985). O efeito antiproliferativo do extrato apresentou-se de
forma dependente da dose, ou seja, o índice de proliferação decresceu nas culturas tratadas
com o extrato da menor para a maior concentração. Comparada ao fármaco Dexametasona, a
eficácia do extrato em inibir a proliferação foi de 71,65% e 53,14% para os linfócitos T e
linfócitos T CD4, respectivamente. Para os linfócitos T CD8, o extrato mostrou eficácia de
167,94%, ou seja, o efeito antiproliferativo sobre essas células foi maior que aquele
apresentado pela Dexametasona.
85
Além disso, verificou-se que a ação antiproliferativa exercida pelo extrato sobre os
linfócitos T foi devido à redução dos níveis da citocina IL-2, sendo que a eficácia em relação
à Dexametasona foi de 38,33%. Assim, podemos sugerir que parte da atividade antiinflamatória atribuída à E. crinitum na medicina popular pode ser devida à ação dos
constituintes químicos presentes na planta sobre a ativação de linfócitos T.
Dessa forma, outra perspectiva seria a busca de frações ativas do extrato
diclorometano-etanólico de raízes de E. crinitum para investigações de possíveis vias de
sinalização e fatores de transcrição envolvidos na redução da citocina IL-2. A expressão dessa
citocina envolve, principalmente, a ativação do fator de transcrição NF-kB. O reconhecimento
do antígeno pelo complexo receptor de linfócito T/CD3 juntamente com estímulos coestimulatórios iniciam a ativação da via de sinalização de NF-kB, sendo esse fator de
transcrição essencial para a proliferação de células T, produção de citocinas e o
desenvolvimento de respostas imunes mediadas por células (GAO et al., 2009).
Os flavonoides, classe de substâncias presentes no extrato diclorometano-etanólico de
raízes de E. crinitum, tem sido apontados como responsáveis pela inibição da proliferação de
linfócitos em outros estudos e tal efeito esteve associado à redução dos níveis de IL-2 em
culturas celulares (BROCHADO et al., 2003; KOVAČEVIĆ et al., 2006; CHANG et al.,
2008; GAO et al., 2009).
A inibição da produção de IL-2 é um mecanismo de ação central de vários
imunossupressores como a Ciclosporina A, a qual atua inibindo a transcrição de IL-2 de
linfócitos T (SCHREIBER; CRABTREE, 1992). No presente estudo, além da redução dos
níveis de IL-2, foi possível identificar que o extrato diclorometano-etanólico de raízes de E.
crinitum teve maior efeito inibitório sobre a resposta proliferativa da subpopulação linfocitária
T CD8, sendo mais eficaz que o fármaco Dexametasona. As células T CD8, quando ativadas,
se diferenciam em células T citotóxicas, as quais tem papel importante na proteção contra
infecções virais, câncer e rejeição do transplante de órgãos (GAO et al., 2009). De acordo
com nossos resultados, o extrato parece apresentar um forte efeito inibidor, principalmente
sobre a proliferação de células T citotóxicas, e pode apresentar-se como uma fonte natural
promissora para o desenvolvimento de novos fármacos efetivos em doenças de natureza
inflamatória-degenerativa mediadas por células T, bem como na obtenção de novas moléculas
úteis na prevenção da rejeição de transplantes de órgãos.
86
9 CONCLUSÃO
A avaliação química preliminar do extrato diclorometano-etanólico de raízes de
Eriosema crinitum indicou que esse extrato possui perfil complexo quanto à sua composição e
sugere a presença de substâncias das subclasses dos flavonoides: flavona e flavonol, as quais
podem ser responsáveis, pelo menos em parte, pela atividade biológica do extrato.
Em relação à investigação da possível atividade anti-inflamatória de raízes de E.
crinitum, os dados sugerem um efeito inibidor do extrato diclorometano-etanólico de raízes
dessa espécie sobre a resposta proliferativa de linfócitos e suas subpopulações T CD4 e T
CD8, sendo que esse efeito parece estar associado à inibição na produção da citocina IL-2.
Esses achados abrem perspectivas para a realização de uma análise química mais
detalhada, buscando identificar as substâncias presentes no extrato, bem como para
investigações adicionais, partindo do fracionamento do extrato, a fim de caracterizar os
constituintes ativos e verificar as vias intracelulares envolvidas na atividade biológica de
raízes de E. crinitum.
Diante do exposto, os resultados obtidos permitem explicar parte dos atributos
terapêuticos da planta na medicina popular, sendo importante mencionar que, mediante busca
na literatura, esse trabalho fornece uma contribuição inédita em relação à caracterização
química e atividade biológica da espécie E. crinitum.
87
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and skin disease. Arthritis Research & Therapy, v.10, n. 1, p. 1-10, 2008.
ZHANG, J. M.; AN, J. Cytokines, Inflammation and Pain. International Anesthesiology
Clinics, v. 45, n. 2, p. 27-37, 2007.
ZHOU,H.; LUTTERODT, H.; CHENG, Z.; YU, L.L. Anti-inflammatory and antiproliferative
activities of trifolirhizin, a flavonoid from Sophora flavescens roots. Journal of Agricultural
and Food Chemistry, v. 57, n. 11, p. 4580–4585, 2009.
96
ZUANAZZI, J. A. S.; MONTANHA J. A. Flavonoides. In: SIMÕES, C. M. O. (Org.).
Farmacognosia: da planta ao medicamento. 5. ed. Editora da UFSC: Florianópolis. 2007.
WHO (World Health Organization) Regional Office for the Western Pacific. Research
Guidelines for Evaluating the Safety and Efficacy of Herbal Medicines. Manila: WHO, 1993.
WHO (World Health Organization). The world medicines situation 2011: traditional
medicines: global situation, issues and challenges. Geneva: WHO, 2011. 12p.
YONEKAWA, K.; HARLAN, J. M. Targeting leukocyte integrins in human diseases. Journal
of Leukocyte Biology, v. 77, n. 2, p. 129-40, 2005.
97
ANEXO A
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Termo de esclarecimento
Convidamos você a participar do projeto de pesquisa intitulado “Avaliação da atividade
imunomoduladora do diclorometano-etanólico de Eriosema crinitum (Kunth) G. Don
(Leguminosae)” que será realizado na Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e
Mucuri (UFVJM) e tem por objetivo avaliar se a planta “Pustemeira” tem efeito sobre o
sangue. Você está sendo convidado a participar desse estudo por ter idade entre 20 e 39 anos e
por não estar tomando remédios. Se você concordar em participar do estudo iremos coletar
(tirar) um pouco de seu sangue (15 mL) na veia do braço (da mesma maneira que é coletado
quando você faz algum exame de sangue), em dia e horário a combinar. No laboratório vamos
fazer testes com seu sangue usando a planta Erva Baleeira e o que sobrar do sangue não será
guardado, sendo descartado com todo o cuidado. A coleta do sangue será feita em uma veia
de seu braço, podendo causar uma leve dor na hora e uma pequena mancha roxa que
desaparecerá em 3 a 4 dias após a coleta. Outros riscos mais raros (não é comum acontecer)
de sua participação incluem tontura, enjôo e de contaminação. A coleta será feita por pessoa
treinada, em local limpo e reservado, equipado com maca, utilizando material estéril e
descartável. Ao doar seu sangue para este projeto você estará contribuindo para os
conhecimentos sobre esta planta que é utilizada na medicina popular. Os seus dados serão
mantidos em sigilo (segredo) e sua identidade não será revelada. Só os pesquisadores
envolvidos no projeto terão acesso aos dados, que serão utilizados apenas para fins de
pesquisa e divulgação científica em congressos, livros e revistas, mas sua identidade não será
divulgada.
Você não receberá qualquer forma de remuneração (pagamento) pela sua
participação no estudo e você não terá nenhum gasto (portanto, não está previsto nenhuma
forma de ressarcimento). Quaisquer dúvidas que possam surgir durante o andamento deste
estudo por parte do voluntário poderão ser esclarecidas junto aos membros da equipe
responsáveis pelo projeto, pessoalmente ou por telefone. Se depois de autorizar a coleta, você
não quiser que seu sangue seja usado, tem o direito e a liberdade de retirar seu consentimento
em qualquer fase da pesquisa, seja antes ou depois da coleta do sangue, independente do
motivo e sem prejuízo na sua relação com os pesquisadores e a UFVJM. Os pesquisadores
responsáveis por este projeto podem decidir sobre a sua exclusão do estudo por razões
98
científicas, a respeito das quais você deverá ser devidamente informado. Em caso de qualquer
dúvida você deverá e/ou poderá entrar em contato a qualquer hora com a pesquisadora
responsável Michaelle Geralda dos Santos pelo telefone (38)9977-9991 ou pelo e-mail
[email protected]. Você também poderá entrar em contato com o Comitê de Ética
em Pesquisa da UFVJM no Campus JK, Rodovia MGT 367, Km 583, nº 5000, Alto da
Jacuba,
CEP
39100-000
Diamantina – MG, telefone: (38) 3532- 1240 ou pelo e-mail [email protected] para
informações sobre a aprovação do projeto pelo comitê.
Termo de livre consentimento pós-informado
Eu discuti os riscos e benefícios da minha participação no estudo intitulado “Avaliação da
atividade imunomoduladora do diclorometano-etanólico de Eriosema crinitum (Kunth)
G. Don (Leguminosae)” com os pesquisadores envolvidos. Eu li e compreendi todos os
procedimentos que envolvem esta pesquisa e tive tempo suficiente para considerar a minha
participação no estudo. Eu perguntei e obtive as respostas para todas as minhas dúvidas. Eu
sei que posso me recusar a participar deste estudo ou que posso abandoná-lo a qualquer
momento sem qualquer constrangimento ou prejuízo. Eu também compreendo que os
pesquisadores podem decidir a minha exclusão do estudo por razões científicas, sobre as quais
eu serei devidamente informado. Não terei nenhuma remuneração e nenhum gasto por
participar do projeto. Tenho uma cópia deste formulário, o qual foi assinado em duas vias
idênticas e rubricadas.
Portanto, aqui forneço o meu consentimento para participar do estudo intitulado “Avaliação
da atividade imunomoduladora do diclorometano-etanólico de Eriosema crinitum (Kunth) G.
Don (Leguminosae)”, durante todos os testes realizados.
Diamantina,
Assinatura do voluntário:
Testemunha:
99
Testemunha:
Declaro que expliquei todos os objetivos, benefícios e riscos deste estudo ao voluntário, dentro
dos limites de meus conhecimentos científicos.
Pesquisador responsável:
Michaelle Geralda dos Santos (38) 9977- 9991
[email protected]
Comitê de Ética em Pesquisa da UFVJM
Campus JK – Rodovia MGT 367 – Km 583 – nº 5000 – Alto da Jacuba
CEP: 39.100-000 Diamantina - MG
Coordenação: Profa. Dra. Thais Peixoto Gaiad Machado
Vice-coordenação: Profa. Dra. Rosamary Aparecida Garcia Stuchi
Secretária: Dione Conceição de Paula
Telefone: (38) 3532-1240/3532-1200
E-mail: [email protected]