Vamos utilizar o Agrobacterium para obter plantas transgénicas

Vamos utilizar o Agrobacterium para obter plantas transgénicas
Participantes
Andreina Sousa (Oliveira de Azeméis)
Diogo Rodrigues (Viseu)
Micaela Costa (Viseu)
Entidade: Universidade de Trás­os­Montes e Alto­Douro
Local de Estágio: Departamento de Genética e Biotecnologia
Coordenadora de Estágio: Ana Lúcia Pinto e Sintra
Período de estágio: 25 de Junho a 6 de Julho de 2007
Neste estágio abordámos vários temas ligados à
genética e biotecnologia.
Para obtermos plantas transgénicas abordámos
variadas técnicas:
– Cultura in vitro vegetal
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Elaboração de meios de cultura
Esterilização de material diverso
Desinfecção superficial do material vegetal
– Introdução de bactérias no material vegetal (co-cultura)
– Análise de DNA de material vegetal.
Cultura in vitro
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A cultura in vitro constitui um conjunto de técnicas que têm
permitido nos vegetais, o crescimento/desenvolvimento em
condições de assepsia.
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Existem diferentes fontes de infecção que podem comprometer a
manutenção da assepsia necessária a estas técnicas.
Meios de cultura •
Os meios de cultura são preparados a partir de soluçõesmãe concentradas de macronutrientes, micronutrientes,
vitaminas, ferro, e outros aditivos. Podem também ser
preparados a partir de preparados liofilizados.
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Existem vários tipos de meios de cultura: MS, B5 e NN.
Esterilização do material diverso e técnicas de desinfecção e cultura de material vegetal
•
Utilizamos várias técnicas de desinfecção de material,
como :
– Autoclavagem.
– Irradiação por UV.
– Flamejar.
– Desinfecção superficial.
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A eficácia do processo de desinfecção do material vegetal e
a esterilização eficaz dos recipientes e instrumentos de
manipulação, são factores determinantes para o processo
de qualquer trabalho de cultura in vitro.
Introdução do material in vitro
Introdução de bactérias no material vegetal (co­cultura)
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Para a obtenção de plantas transgénicas introduzimos
bactérias, mais propriamente Agrobacterium rhizogenes e
Agrobacterium tumefaciens
Estas irão modificar geneticamente o material com vista a
observar o crescimento de raízes, no primeiro caso, e a
expressão de genes quiméricos no segundo.
Análise de DNA
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Para visualizarmos o DNA do material geneticamente
modificado temos que seguir alguns processos:
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Extracção do DNA
Electroforese
Teste histoquímico indicador da transferência do gene
gus da bactéria para as células vegetais
Extracção de DNA
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Homogenização do tecido:
 maceração com azoto líquido
Extracção de DNA
Lise das células:
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 células lisadas em tampão de extracção a 65ºC
Extracção de DNA
Desproteinização
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Final da primeira centrifugação:
Final da segunda centrifugação:
Extracção de DNA
Precipitação com isopropanol
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Electroforese Teste histoquímico
Detecção histoquímica da expressão do GUS, através da detecção da actividade da β­Glucuronidase
Material de controlo, não co­cultivado
Material co­cultivado com A. tumefaciens: a marcação a azul evidencia a transferência do gene repórter
 Súmula do estágio:
­ Tomámos contacto com um conjunto variado de técnicas nomeadamente de cultura in vitro e biologia molecular… que desconhecíamos e que por isso nos ajudaram a enriquecer mais o conhecimento.