Resumo - FCFAR

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
BIOCIÊNCIAS E BIOTECNOLOGIA APLICADAS À FARMÁCIA
AUTOR DO TRABALHO: LEONARDO BIANCOLINO MARINO
TÍTULO DO TRABALHO: Caracterização dos compostos derivados de furoxano como inibidores da
atividade de bombas de efluxo em Mycobacterium tuberculosis e estudo da influência do efluxo e da
halotolerância nos perfis de resistência do bacilo
CURSO: Doutorado
DATA DA DEFESA: 29/02/2016
ORIENTADOR: Profa. Dra. Clarice Queico Fujimura Leite
ÁREA DE CONHECIMENTO: Biologia Molecular
RESUMO: Tuberculose (TB), com principal agente etiológico o bacilo Mycobacterium tuberculosis, é
uma doença infecciosa passível de cura. Entretanto, é detentora de uma estatística mundial
preocupante, e em 2014 apresentou 9,5 milhões de novos casos e 1,5 milhão de mortes. Além dos altos
índices estatísticos, a TB aparece ainda associada a dois fatores agravantes: a co-infecção com HIV
(“Human Immunodeficiency Virus”) e a crescente emergência de linhagens resistentes aos
quimioterápicos como “multi-drug resistant” (MDR) e “extensively drug resistant” (XDR), que dificultam
sobremaneira o tratamento, indicando premência na pesquisa de novos fármacos. A resistência do
bacilo manifesta-se a partir de eventos adquiridos (como aquisição de mutações cromossomais em
genes específicos relacionados ao metabolismo de fármacos) ou intrínsecos, como uma parede celular
altamente hidrofóbica (devido à grande quantidade de ácidos micólicos). Estes mecanismos de
resistência são discutidos amplamente na literatura. Por outro lado, pouco se sabe a respeito da
resistência devido as alterações na expressão dos genes das bombas de efluxo, responsáveis pela
exclusão de fármacos, bem como dos mecanismos de resistência relacionados a halotolerância
bacteriana.
Neste sentido, três assuntos de relevância no combate à tuberculose foram abordados nesta tese.
Como primeira frente, avaliou-se inicialmente a expressão de 5 genes codificadores de bombas de
efluxo pela técnica de RT-qPCR em 12 isolados clínicos frente ao tratamento com rifampicina, principal
fármaco do regime terapêutico da TB. Resultados indicaram que essas proteínas auxiliam na
emergência da resistência, sendo indicados pela superexpressão dos genes frente ao tratamento.
Como segunda frente avaliou-se a atividade de 15 compostos inéditos de furoxânicos e
benzofuroxânicos quanto à capacidade inibitória frente ao M. tuberculosis, citotoxicidade em células
VERO, além de ensaios para avaliar seus mecanismos de ação (acumulação de brometo de etídio /
inibição de efluxo, liberação de óxido nítrico e microarray). Resultados indicaram que a classe de
compostos é promissora para o tratamento, com boa atividade inibitória contra o bacilo e considerado
grau de seletividade. Ensaios de mecanismo de ação, indicaram atividade independente da inibição do
efluxo, da subunidade de isoniazida ou da liberação de óxido nítrico. Microarray apontou para alteração
em grande quantidade de proteínas ribossomais, semelhante ao que ocorre com aminoglicosídeos.
Por fim, na terceira frente do estudo avaliou-se os efeitos da halotolerância na emergência de
bacilos resistentes a fármacos, tendo como base as diferentes concentrações de cloreto de sódio a que
o bacilo é submetido durante o seu ciclo de vida. Os resultados apontaram para aumento da resistência
bacteriana com consequente aumento nas concentrações inibitórias de vários fármacos usados para a
terapia da TB, quando o bacilo é submetido à concentração de cloreto de sódio encontrada no interior
dos macrófagos, indicando uma necessidade de reflexão sobre as novas diretrizes para testes de novos
fármacos contra TB.
ABSTRACT: Tuberculosis (TB) is an infectious disease caused mainly by Mycobacterium tuberculosis
bacillus, presenting 9.5 million of new cases and 1.5 million of deaths in 2014. Two aggravating factors
are associated with these high statistical indexes: a co-infection with HIV ("Human Immunodeficiency
Virus") and the increasing emergence of resistant strains represented by MDR ("multi-drug resistant")
and XDR ("extreme drug resistant") strains. The bacillus resistance manifests from acquired events (such
as acquisition of chromosomal mutations in specific genes related to drug metabolism) or intrinsic, as a
highly hydrophobic cell wall (due to the large amount of mycolic acids) and the action of efflux pumps
(responsible for drug extrusion). Thus, the thesis project evaluated the expression of five genes
encoding efflux pumps by RT-qPCR technique in 12 clinical isolates against rifampicin, the main anti-TB
drug used in the standard treatment. Results indicated that these proteins contribute to the emergence
of resistance, indicated by overexpression of these genes after treatment.
The second part of the study evaluated the activity of 15 furoxan and benzofuroxan derivative
compounds for inhibitory capacity against the M. tuberculosis, cytotoxicity in VERO cells, as well as
ethidium bromide accumulation and efflux assays. Aiming evaluate their mechanism of action,
microarray and assays of nitric oxide release were also done, as they are supposed nitric oxide donors
and may present an action by oxidative stress and/or the activity efflux pumps inhibition. Results
indicated that the class of compounds is promising for the treatment, with good inhibitory activity
against bacillus and substantial degree of selectivity. Mechanism of action assays indicated activity
independent of efflux inhibition, of isoniazid subunit’ or nitric oxide release. Microarray pointed to
changes in expression of ribosomal proteins, similar to what occurs with aminoglycosides.
Finally, the third part of the study demonstrated that the halotolerance developed by M. tuberculosis
might cause the emergence of drug resistant bacilli, based on the different concentrations of sodium
chloride that the bacillus faces during its cycle. The results indicate a need for reflection on the new
guidelines for testing new TB drugs. The results pointed to an increase in the minimal inhibitory
concentrations of various anti-TB drugs, when the bacillus was subjected to the sodium chloride
concentration found in macrophages, indicating a need for reflection on the guidelines for discovery of
new anti-TB drugs.
BANCA EXAMINADORA:
Membros Titulares:
CLARICE QUEICO FUJIMURA LEITE (Orientadora)
PEDRO EDUARDO ALMEIDA DA SILVA
CRISTIANO GALLINA MOREIRA
PATRÍCIA BENTO DA SILVA
LEONARDO NEVES DE ANDRADE
Membros Suplentes:
MOISÉS PALACI
CARLA RAQUEL FONTANA
BIBLIOTECA DEPOSITÁRIA:
Biblioteca da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara -UNESP - Rodovia
Araraquar a-Jaú, km 1 – Araraquara-SP