Clarissa Caetano de Castro - Universidade Federal de Pelotas

1
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
Programa de Pós-Graduação em Veterinária
Faculdade de Medicina Veterinária
Dissertação
Avaliação do teste de imunoperoxidase para detecção de
anticorpos contra o vírus da leucose bovina (BLV)
Clarissa Caetano de Castro
Pelotas, 2011
2
CLARISSA CAETANO DE CASTRO
Avaliação do teste de imunoperoxidase para detecção de anticorpos contra o
vírus da leucose bovina (BLV)
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação
em
Veterinária
da
Universidade Federal de Pelotas, como
requisito parcial à obtenção do título de
Mestre
em
Ciências
(área
conhecimento: Veterinária Preventiva).
Orientadora: Profa. Dra. Silvia de Oliveira Hübner
Co-Orientador: Prof. Dr. Geferson Fischer
Pelotas, 2011
de
3
Dados de catalogação na fonte:
( Marlene Cravo Castillo – CRB-10/744)
C355a Castro, Clarissa Caetano de
Avaliação do teste de imunoperoxidase para detecção de
anticorpos contra o vírus da leucose bovina(BLV) / Clarissa
Caetano de Castro ; orientador Silvia de Oliveira Hübner ; coorientador Geferson Fischer - Pelotas,2011.-48f. ; il..- Dissertação
( Mestrado ) –Programa de Pós-Graduação em Veterinária.
Faculdade de Veterinária . Universidade Federal de Pelotas.
Pelotas, 2011.
1.Leucose enzoótica bovina 2.Imunoperoxidase 3.Vírus da
leucose bovina
4.Infecção persistente
5.Diagnóstico
6.Anticorpos I.Hübner, Geferson Fischer(orientador) II .Título.
CDD 636.2089
4
Banca examinadora:
Profa. Dra. Silvia de Oliveira Hübner – Universidade Federal de Pelotas (Orientadora)
Prof. Dr. Gilberto D’Ávila Vargas – Universidade Federal de Pelotas
Prof. PhD. Fábio Pereira Leivas Leite – Universidade Federal de Pelotas
Profa. Dra. Ana Cláudia Franco – Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Prof. Dr. João Zani – Universidade Federal de Pelotas (Suplente)
5
Agradecimentos
Ao meu marido Eugênio pelo amor, companheirismo e compreensão.
Aos meus queridos pais, Aldair e Paulo, e meus irmãos Luciane e Paulo pelo
apoio, incentivo e carinho.
À minha orientadora Sílvia de Oliveira Hübner pela disposição, sugestões,
paciência e pela grandiosa relação de amizade cultivada durante cinco anos durante
as orientações de iniciação científica (CNPq) e de mestrado.
Ao meu co-orientador Geferson Fischer pelo apoio, ajuda, incentivo
constante e aprendizado.
Aos professores e funcionários do Centro de Pesquisa em Virologia e
Imunologia Animal da Faculdade de Medicina Veterinária - UFPel: Telmo Vidor,
Gilberto D’Avila Vargas, José Carlos Rösler Sandrini, Eliete Sandrini, Enilda Souza
de Oliveira e Márcia Rodrigues, pela estrutura e atenção a mim destinada.
Aos colegas e amigos do Centro de Pesquisa em Virologia e Imunologia
Animal da Faculdade de Medicina Veterinária - UFPel: Cristina, Paula, Bianca,
Fábio, Patrícia, Gustavo, Daiana, Cacciane, Fernanda e Débora pelo auxílio nas
horas de dificuldade, pelos incentivos e otimismo e, principalmente, pela amizade.
Aos amigos do Centro de Desenvolvimento Tecnológico - Núcleo
Biotecnologia - Laboratório de Bacteriologia - UFPel: Michele, Paula, Liana,
Fernanda Valiati e Fernanda Rodrigues. Ao Prof. Fábio Leivas Leite por ter colocado
o seu laboratório a disposição e, especialmente, a doutoranda Luana Dummer pelo
ensinamento, ajuda e disposição.
À Universidade Federal de Pelotas pela oportunidade de realização do curso
de Pós-Graduação em Veterinária.
A Coordenação de Aperfeiçoamento de pessoal de Nível Superior (CAPES),
pela concessão da bolsa de estudos.
A todos que colaboraram de alguma forma na execução deste trabalho.
Muito Obrigada!
6
“Há homens que lutam um dia e são bons, há outros que lutam um ano e são
melhores, há os que lutam muitos anos e são muito bons. Mas há os que lutam toda
a vida e estes são imprescindíveis”.
Bertold Brecht
7
RESUMO
CASTRO, Clarissa Caetano de. Avaliação do teste de imunoperoxidase para
detecção de anticorpos contra o vírus da leucose bovina (BLV). 2011. 48f.
Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Veterinária. Universidade
Federal de Pelotas, Pelotas.
A leucose enzoótica dos bovinos (EBL) é uma enfermidade causada pelo vírus da
leucose bovina (BLV), que ocasiona uma infecção persistente em bovinos, e é
responsável por perdas econômicas significativas à pecuária, principalmente a
leiteira. Amplamente disseminada no rebanho brasileiro, pode ser manifestada de
três formas: aleucêmica, linfocitose persistente e linfossarcoma. Os animais com
anticorpos contra o BLV deverão ser eliminados ou separados do restante do
rebanho, pois significa que são portadores e disseminadores do vírus por toda a
vida. O diagnóstico desta doença é essencial para estratégias de controle e
erradicação baseadas na segregação de animais infectados no intuito de evitar ou
amenizar a transmissão do vírus e, consequentemente, minimizar as perdas
econômicas causadas pela doença. Durante a infecção pelo BLV são produzidos
anticorpos contra as principais proteínas virais, gp51, gp30 (glicoproteínas do
envelope) e p24 (proteína do capsídeo). O teste de imunodifusão em gel de ágar
(agar gel immunodiffusion – AGID) e o ensaio imunoenzimático (enzyme-linked
immunosorbent assay – ELISA) são os mais utilizados para diagnóstico. No presente
trabalho foi avaliada a técnica de imunoperoxidase (peroxidase linked assay – PLA)
na detecção de anticorpos contra o BLV. Os resultados obtidos na PLA foram
comparados com o teste de AGID e a especificidade dos positivos confirmada pela
técnica de Western blotting (WB). Foram testadas 201 amostras de soro de bovinos
provenientes de propriedades localizadas no município de Pelotas: 59% (119) foram
positivos por PLA e 26% (53) positivos por AGID. Todas as amostras positivas na
AGID foram também positivas na PLA. Dos 32,8% (66) dos soros com resultados
conflitantes apenas oito foram confirmados como positivos no WB, indicando serem
falso-positivos os demais resultados e constatando que a AGID falhou em identificar
4% de animais positivos para EBL. A técnica de PLA para diagnóstico de infecção
pelo BLV se mostrou muito útil para uso em programas de controle devido à maior
sensibilidade da técnica quando comparada com o teste de AGID. Contudo, a
ocorrência de resultados falso-positivos pela PLA inviabiliza o seu uso em
programas de erradicação que envolva o sacrifício do animal soropositivo.
Palavras chave: Leucose enzoótica bovina. Imunoperoxidase. Vírus da leucose
bovina. Infecção persistente. Diagnóstico. Anticorpos.
8
ABSTRACT
CASTRO, Clarissa Caetano de. Evaluation of immunoperoxidase test for the
detection of antibodies against the bovine leukosis virus (BLV). 2011. 48f.
Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Veterinária. Universidade
Federal de Pelotas, Pelotas.
The enzootic bovine leukosis is an illness caused by the bovine leukosis virus (BLV)
which provokes a persistent infection in cattle and is responsible for significant
economical losses to the bovines, mainly dairy cattle. It is widely spread in Brazilian
cattle and it can come up in three forms: asymptomatic infection, persistent
lymphocytosis and lymphosarcoma. The animals that have antibodies against the
BLV must be eliminated or separated from the rest of the cattle, because they are
carriers and disseminators of the virus during all their lifetimes. The diagnosis of this
disease is essential for control and eradication strategies based on the segregation
of infected animals in order to avoid or attenuate the transmission of the virus, and
consequently, minimize the economical losses caused by the disease. During the
BLV infection antibodies are produced against the main viral proteins, gp 51, gp 30
(envelope glicoproteins) and p24 (capsid protein). The agar gel immunodiffusion
(AGID) and the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) tests are the most
used for diagnosis. In this report the immunoperoxidase technique (peroxidase linked
assay - PLA) was evaluated in order to detect antibodies against the BLV. The
results obtained in the PLA were compared with the AGID test and the specificity of
the positive ones was confirmed by the Western blotting (WB) technique. Two
hundred and one bovine serum samples of cattle coming from the city of Pelotas
were tested: 59% (119) were positive in PLA and 26% (53) were positive in AGID. All
the AGID positive samples were also PLA positive. From the 32,8% (66) of the
conflicting serum results just eight were confirmed as positive in WB, indicating that
the rest of the results were false-positive and showing that AGID failed in identifying
4% of the BLV positive animals. The PLA technique for the diagnosis of the BLV
infection demonstrated to be very useful to use in control programs because it was
more sensitive when compared to the AGID technique. However, the occurrence of
false-positive results by the PLA makes its use unviable in eradication programs that
involve the sacrifice of seropositive animals.
Key-words: Enzootic bovine leukosis. Immunoperoxidase. Bovine leukosis virus.
Persistent infection. Diagnosis. Antibodies.
9
SUMÁRIO
1.
INTRODUÇÃO GERAL ...................................................................................... 10
2.
ARTIGO ............................................................................................................. 15
2.2 INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 17
2.3 MATERIAIS E MÉTODOS ......................................................................................... 18
2.3.1 Testes sorológicos................................................................................................... 18
2.3.1.1 Imunodifusão em Gel de Ágar (Agar Gel Immunodiffusion - AGID) ............. 18
2.3.1.2 Imunoperoxidase (Peroxidase Linked Assay - PLA)..................................... 19
2.3.1.3 SDS-PAGE ................................................................................................... 19
2.3.1.4 Western blotting (WB) .................................................................................. 20
2.4 RESULTADOS ............................................................................................................ 20
2.4.1 Imunodifusão em gel de ágar (Agar Gel Immunodiffusion - AGID)................... 20
2.4.2 Imunoperoxidase (Peroxidase Linked Assay - PLA)......................................... 20
2.4.3 SDS-PAGE ....................................................................................................... 21
2.4.4 Western Blotting (WB) ...................................................................................... 21
2.5 DISCUSSÃO ............................................................................................................... 21
2.6 AGRADECIMENTO .................................................................................................... 23
2.7 REFERÊNCIAS........................................................................................................... 23
2.8 FIGURAS ..................................................................................................................... 27
3.
CONCLUSÃO GERAL ....................................................................................... 31
4.
REFERÊNCIAS GERAIS ................................................................................... 32
5.
ANEXO .............................................................................................................. 38
10
1. INTRODUÇÃO GERAL
O Brasil possui o segundo maior rebanho de bovinos do mundo. Com um
consumo per capita em torno de 34,7 quilos por habitante/ano é o segundo maior
produtor de carne bovina e o maior exportador mundial deste produto. No ano de
2009, para a produção de carne e de leite, destinou-se 205,292 milhões de animais,
sendo a criação de gado de corte, seguida da criação de gado de leite, a principal
fonte de geração de renda para produtores. Em 2009 foram produzidos 6,661
milhões de toneladas de carne, deste total 13,9% foram exportados para outros
países. A produção brasileira de leite ocupa a sexta posição no ranking mundial. A
produção em 2009 foi de 29,112 bilhões de litros, com consumo per capita em torno
de 152 litros por habitante (IBGE, 2009). As regiões Centro-Oeste (34,4%) e Norte
(19,7%) são as principais detentoras do rebanho bovino brasileiro. Os Estados que
produzem mais leite são Minas Gerais (27,2%), Rio Grande do Sul (11,7%) e Paraná
(11,5%) (COLLA et al., 2009).
Os resultados apresentados pelo Instituto Brasileiro de Geografia e
Estatística (IBGE) são satisfatórios à economia brasileira, porém o Brasil ainda
possui grandes prejuízos financeiros relacionados a doenças que afetam os
rebanhos. Animais doentes podem ter redução no ganho de peso, nos índices
produtivos e reprodutivos, além de estarem sujeitos à mortalidade. Outra
preocupação são as exigências sanitárias que estão cada vez mais rigorosas por
parte dos países europeus e Estados Unidos, que para importar produtos de origem
animal impõe que os animais sejam livres de determinadas infecções.
Dentre as diversas enfermidades que acometem bovinos destacam-se as de
etiologia viral, principalmente aquelas que geram portadores assintomáticos,
responsáveis por disseminar o vírus para os animais suscetíveis. Com estas
características destaca-se a Leucose Enzoótica Bovina (Enzootic Bovine Leukemia EBL).
A EBL é causada por um vírus pertencente à família Retroviridae, subfamília
Oncovirinae e gênero Deltaretrovirus. O vírion é esférico, com genoma RNA fita
simples de polaridade positiva, diâmetro de 80 à 130 nm, constituído por um
11
capsídeo de simetria icosaédrica, envolvido pelo envelope derivado da membrana
celular do hospedeiro, onde se observam projeções de glicoproteínas (MURPHY et
al., 1999). Animais infectados pelo vírus da leucose bovina (bovine leukosis vírus BLV) desenvolvem anticorpos contra as glicoproteínas do envelope viral gp51 e
gp30 e contra as proteínas do capsídeo p24, da matriz viral p15 e do
nucleocapsídeo p12 (KETTMANN et al., 1994).
No Brasil, a doença foi descrita pela primeira vez por Rangel e Machado
(1943). No entanto, um relato publicado por Merkt et al., (1959) no Paraná, parece
ter sido o primeiro registro oficial do diagnóstico da doença em rebanhos brasileiros.
Atualmente a leucose está presente em praticamente todos os estados do Brasil e
do mundo, com exceção de alguns países europeus que possuem rebanhos pouco
numerosos e decidiram erradicar a doença há alguns anos (D’ ANGELINO, 1991;
BIRGEL JUNIOR et al., 2006).
A doença pode vir a se manifestar de três formas: aleucêmica, linfocitose
persistente e linfossarcoma. Entre 1% a 5% dos bovinos soropositivos desenvolvem
linfossarcoma e 30% desenvolvem linfocitose persistente (FERRER, 1979). O
linfossarcoma multicêntrico dos animais adultos é a neoplasia maligna mais comum
dos bovinos. É uma enfermidade altamente fatal, observada principalmente em gado
leiteiro e, sobretudo, em animais entre seis e nove anos de idade (SORENSEN,
1979). A maior ocorrência de EBL em gado leiteiro comparada ao gado de corte é
devido ao constante manejo, uma vez que a principal forma de transmissão é a
horizontal, em especial a iatrogênica pelo uso de fômites contaminados, agulhas,
instrumentos cirúrgicos e até mesmo pela palpação retal (JOHNSON; KANEENE,
1992).
A EBL gera prejuízos econômicos devido às restrições no mercado
internacional, gastos com tratamento e diagnóstico, mortes de animais ocasionadas
pela doença, condenação da carcaça, custo com reposição de animais e perdas na
produção, devido à baixa na produtividade dos animais infectados (PELZER;
SPRECHER, 1997). O estudo desenvolvido por Rajão (2008) demonstrou uma perda
na produção de leite no período de 2005 a 2007 de R$ 332,95 por lactação de cada
animal infectado com EBL, levando em consideração o valor médio pago ao produtor
pelo litro de leite de R$ 0,53.
12
Em rebanhos infectados com o BLV, quando comparados com rebanhos
livres, a produção de leite é menor e a taxa de descarte é maior (TRAININ, 1996;
SARGEANT et al., 1997; OTT et al., 2003). Estudo realizado por Thurmond et al.
(1983) demonstraram que animais soronegativos apresentavam uma maior
sobrevida nos rebanhos em comparação aos animais soropositvos, após a idade de
três anos e meio, caracterizando desta forma uma maior taxa de descarte para os
animais sororeagentes. Fetrow e Ferrer (1982) salientam que há a possibilidade do
vírus atuar como agente imunossupressor, podendo assim agir como fator
predisponente a outras doenças. Outro fato de baixa produtividade está relacionado
a intervalos de partos mais longos em relação a animais infectados do que animais
não infectados (HEALD et al., 1992; JACOBS et al.,1995).
Embora estudos de impacto econômico ocasionados pela infecção pelo BLV
não são frequentemente realizados no Brasil, revelam altas prevalências em
algumas regiões. No Rio Grande do Sul há relatos de prevalência de 12,0%
(MORAES et al., 1996) e 23,5% no município de Passo Fundo, RS (POLLETO et al.,
2004). Sponchiado (2008) relatou a prevalência de 49,04% de EBL em bovinos da
raça Holandesa criados em diversas regiões do Estado do Paraná. Em São Paulo a
prevalência relatada foi de 54% (MEGID et al., 2003). Já no Estado de Santa
Catarina a prevalência em bovinos leiteiros em 2001 estava em 7,6% (LUDERS,
2001).
Para solucionar as perdas econômicas causadas por essa enfermidade é
necessário inicialmente a identificação dos animais soropositivos no rebanho. Os
animais soropositivos para o BLV deverão ser eliminados, pois a presença de
anticorpos significa que estão infectados pelo BLV e animais infectados
permanecem portadores do vírus por toda a vida, disseminando a doença para o
restante dos animais suscetíveis (EVERMANN, 1992). Quando o descarte do animal
é economicamente inviável, a separação dos soropositivos em grupos de manejo
representa uma alternativa para reduzir a difusão da infecção (FLORES et al., 1990;
DIGIACOMO, 1992). A identificação desses animais é realizada através de
diagnóstico laboratorial.
As técnicas mais utilizadas para diagnosticar a infecção pelo BLV são
imunodifusão em gel de ágar (agar gel immunodiffusion - AGID) e o ensaio
imunoenzimático (enzyme linked immunosorbent assay – ELISA). AGID e ELISA são
13
testes aprovados pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) e
pela Organização Mundial da Saúde Animal (OIE) e são baseados na detecção de
anticorpos contra a gp51 e p24 (KNAPEN et al., 1994; REICHEL et al., 1998;
GUTIÉRREZ et al., 2009). Anticorpos contra a p24 são produzidos entre a segunda
e quarta semanas após inoculação com BLV e anticorpos anti-gp51 são identificados
mais tardiamente (GONZALEZ et al., 1999).
O teste de AGID apresenta como problemática um longo tempo para a
leitura do resultado (48-72 horas), a presença de reações inespecíficas e
sensibilidade relativamente baixa. Quando um animal tem níveis baixos de
anticorpos estes podem não ser detectados, o que pode ocorrer em infecções
recentes e em períodos em que os anticorpos estão sendo mobilizados, como o
período pré-parto e colostral (JOHNSON; KANEENE, 1991; AGRESTI et al., 1993).
O teste ELISA apresenta boa sensibilidade e rapidez na sua execução, contudo
possui um custo relativamente alto em virtude da importação dos reagentes para sua
realização, além disso, é mais propenso a apresentar reações inespecíficas
(JOHNSON; KANEENE, 1992).
A literatura cita a utilização de outros testes para diagnóstico da
enfermidade, como radioimunoensaio (RIA), reação da polimerase em cadeia (PCR)
e Western blotting (WB). O RIA é pouco usado por ser radioativo, gerando risco
operacional, além de possuir elevado custo para biossegurança e problemas com o
descarte de material. O PCR é uma técnica molecular apresenta alto custo de
equipamentos, exigência de treinamento e necessidade de cuidados extremos para
evitar contaminação com as amostras.
O WB é um teste muito sensível e específico, embora pouco prático
(KITTELBERGER et al., 1996). Segundo Gonzalez et al. (1999) a reação contra a
proteína p24 deve ser utilizada como referência em testes de WB, por aparecer em
todas as amostras positivas, enquanto que a gp51 pode desnaturar durante a
eletroforese. Além disso, a gp51 pode ser confundida com muitas proteínas
diferentes de mesmo peso molecular (KITTELBERGER et al., 1996; LLAMES et al.,
2000).
A técnica de imunoperoxidade (peroxidase linked assay – PLA) é empregada
para diagnosticar diversas enfermidades virais, como peste suína clássica (HOUBEN
et al., 1995), arbovirus (SOLIMAN et al., 1997) e, principalmente, para a identificação
de animais persistentemente infectados com o vírus da diarréia viral bovina (BVDV)
14
(DUBOVI, 1996; ELAHI, 1997; DEREGT; PRINS, 1998). A PLA é uma técnica
rápida, de fácil execução, de baixo custo em laboratórios que possuem rotina em
trabalhar com cultivo celular e permite o teste de grande número de amostras
simultaneamente.
Recentemente, foi descrita a possibilidade do uso da PLA para diagnosticar
EBL, sendo relatada alta sensibilidade e especificidade (BUZALA; DEREN; RULKA
et al., 2003).
O presente trabalho teve como objetivo avaliar a técnica de PLA para
detecção de anticorpos contra o BLV comparando-a com o teste de AGID, e os
resultados divergentes entre as técnicas foram comprovados usando o método de
WB.
15
1
2. ARTIGO
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
Avaliação do teste de imunoperoxidase para detecção de anticorpos contra o
15
vírus da leucose enzoótica bovina (BLV)
16
17
(Artigo científico a ser submetido ao periódico Archivos de Medicina Veterinaria –
18
Anexo)
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
16
1
AVALIAÇÃO DO TESTE DE IMUNOPEROXIDASE PARA DETECÇÃO DE
2
ANTICORPOS CONTRA O VÍRUS DA LEUCOSE BOVINA (BLV)
3
4
5
C C de Castro1*, C F Nunes1, P F Finger1, B S Siddler1, L Dummer2, G Fischer1, G D Vargas1,
6
S O Hübner1.
7
8
9
1
Centro de Pesquisa em Virologia e Imunologia Animal, Faculdade de Veterinária,
10
Universidade Federal de Pelotas – UFPel – CP 354 – 96010-900 – Pelotas – RS – Brasil;
11
2
12
Bacteriologia – UFPel – CP 354 – 96010-900 – Pelotas – RS – Brasil.
Centro de Desenvolvimento Tecnológico - Núcleo Biotecnologia - Laboratório de
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
*Autor para correspondência. Tel 53 32757498; FAX 32757498
E-mail: [email protected]
CP 354 – 96010-900
17
1
2.1 RESUMO
2
3
O vírus da leucose bovina (bovine leukosis virus - BLV) é um retrovírus que causa uma
4
infecção crônica, manifestada por três formas: aleucêmica, linfocitose persistente e
5
linfossarcoma. Uma vez infectados, os bovinos permanecem portadores pelo resto da vida.
6
Anticorpos são detectados poucas semanas após a infecção e sua detecção é importante para
7
identificação de animais infectados. Os teste de imunodifusão em gel de ágar (agar gel
8
immunodiffusion – AGID) e o ensaio imunoenzimático (enzyme-linked immunosorbent assay
9
– ELISA) são os mais utilizados para diagnóstico. Neste trabalho se avaliou a técnica de
10
imunoperoxidase (peroxidase linked assay – PLA) para detectar anticorpos contra o BLV. Os
11
resultados obtidos na PLA foram comparados com o teste de AGID e a especificidade dos
12
positivos confirmada pela técnica de Western blotting (WB). De 201 amostras de soro de
13
bovinos 59% (119) foram positivas por PLA e 26% (53) positivas por AGID. Todas as
14
amostras positivas na AGID foram também positivas na PLA. Dos 66 (32,8%) soros com
15
resultados conflitantes oito foram confirmados por WB. A técnica de PLA apresentou um
16
desempenho superior ao AGID, na detecção de animais soropositivos. A sua maior
17
sensibilidade a torna muito útil em programas de controle da enfermidade.
18
Palavras chave: imunoperoxidase, vírus da leucose bovina; sorologia; ensaio.
19
20
2.2 INTRODUÇÃO
21
22
A leucose enzoótica bovina (enzootic bovine leukemia - EBL) é uma enfermidade
23
causada pelo vírus da leucose bovina (bovine leukosis virus - BLV), pertencente à família
24
Retroviridae e subfamília Oncovirinae (Fauquet et al 2005). O BLV induz uma infecção
25
crônica em bovinos caracterizada pelo desenvolvimento de três formas: assintomática,
26
linfocitose persistente e linfossarcoma. A infecção está relacionada a prejuízos econômicos
27
devido a gastos com diagnóstico e tratamento, condenação de carcaças, mortes, perdas na
28
produtividade e custo com reposição de animais, além de poder comprometer o sistema
29
imunológico, tornando os animais mais suscetíveis a outras enfermidades (Fetrow e Ferrer
30
1982, Pelzer 1997).
31
O BLV está disseminado nos rebanhos bovinos de todo o mundo (Johnson e Kaneene
32
1992). A transmissão ocorre pela transferência de linfócitos B infectados para animais
33
suscetíveis, o que pode ocorrer verticalmente ou, principalmente, pela via horizontal, através
18
1
do uso de fômites contaminados, agulhas, instrumento cirúrgicos e até mesmo pela palpação
2
retal (Hopkins e DiGiacomo 1997). A determinação acurada do diagnóstico é essencial para
3
estratégias de controle e erradicação baseadas na segregação de animais infectados.
4
Durante a infecção pelo BLV são produzidos anticorpos persistentes contra as
5
principais proteínas virais, gp51, gp30 (glicoproteínas do envelope) e p24 (proteína do
6
capsídeo) (Evermann 1992, Kettmann et al 1994). Testes como a imunodifusão em gel de
7
ágar (agar gel immunodiffusion – AGID)
8
immunosorbent assay – ELISA )apesar de não identificar todos os animais infectados (Eaves
9
et al 1994, Choi et al 2002) tem sido utilizados para detectar anticorpos contra essas proteínas
10
virais (Reichel et al 1998, Llames et al 2000, González et al 2007, Gutiérrez et al 2009). Mais
11
recentemente, foi descrita a possibilidade do uso de uma técnica de imunoperoxidase
12
(peroxidase linked assay – PLA) para diagnosticar EBL, sendo relatada uma alta sensibilidade
13
e especificidade, quando comparada a AGID e ELISA (Buzala e Deren 2003, Rulka et al
14
2003). O objetivo do presente trabalho foi avaliar o desempenho da PLA para detecção de
15
anticorpos contra o BLV, comparando-a com AGID e a técnica de Western blotting (WB).
e o ensaio imunoenzimático (enzyme-linked
16
17
2.3 MATERIAIS E MÉTODOS
18
19
O presente trabalho foi desenvolvido no Centro de Pesquisa em Virologia e
20
Imunologia Animal (CPVIA), em colaboração com Centro de Desenvolvimento Tecnológico
21
- Núcleo Biotecnologia (Laboratório de Bacteriologia), ambos da Universidade Federal de
22
Pelotas – UFPel. O estudo foi conduzido com 201 amostras de soros bovinos pertencentes a
23
seis propriedades localizadas no município de Pelotas, sul do estado do Rio Grande do Sul. Os
24
históricos dos animais e das propriedades eram desconhecidos. As amostras foram enviadas
25
ao CPVIA para realizar o diagnóstico de EBL. Amostras de sangue total foram centrifugadas
26
para separação do soro e após foram armazenadas a -20º C.
27
28
2.3.1 Testes sorológicos
29
2.3.1.1 Imunodifusão em Gel de Ágar (Agar Gel Immunodiffusion - AGID)
30
31
Para a AGID foi utilizado o Kit comercial para diagnóstico de EBL produzido pelo
32
Instituto de Tecnologia do Paraná (Tecpar) contendo antígeno elaborado a partir do meio de
33
cultivo das células Fetal Lamb Kidney (FLK) BLV. O teste foi realizado de acordo com o
19
1
protocolo recomendado pelo fabricante. Utilizou-se gel de ágar a 1% sobre placas de Petri de
2
vidro (90 x 15 mm) em que foram perfuradas sete rosetas, permitindo que 28 amostras fossem
3
testadas simultaneamente. Após 72 horas foi realizada a leitura do teste em ambiente escuro
4
com o auxílio de um foco de luz forte. Foram consideradas como positivas as amostras que
5
apresentaram linha de identidade com o soro controle positivo.
6
2.3.1.2 Imunoperoxidase (Peroxidase Linked Assay - PLA)
7
8
Células FLK permanentemente infectadas pelo BLV foram cultivadas em placas de
9
poliestireno (TPP) de 96 cavidades, contendo meio F 10 e 199 (Interlab) com adição de 10%
10
de soro fetal bovino (SFB - Invitrogen) por 72 horas (37º C, 5% CO2). As células foram
11
negativas para o vírus da diarréia viral dos bovinos (BVDV) quando analisadas por
12
imunofluorescência, usando anticorpo policlonal e anticorpo monoclonal anti BVDV
13
(gentilmente cedido pelo laboratório de virologia da UFSM). As células foram fixadas em
14
solução de paraformaldeído a 3% em PBS (NaCl 137 mM, Fosfato 10 mM, KCl 2,7 Mm, pH
15
7,3). Todas as lavagens foram realizadas com PBS contendo 5% de Tween 80 (PBST-80). Em
16
ensaios preliminares foram avaliadas diferentes diluições de soro a serem utilizadas na prova,
17
utilizando-se soros controles como parâmetros. Após a remoção do excesso do fixador foram
18
adicionadas as amostras de soro a serem testadas, diluídas a 1:80 em PBST-80 (100
19
µl/cavidade) e incubadas a 37º C por 1 hora. As amostras foram sempre testadas em
20
duplicatas, e em cada placa foram incluídos controles positivo (soro do kit de AGID e soro
21
fornecido pelo Instituto Pasteur de Montevideo - Uruguai) e negativo (SBF). As placas foram
22
lavadas quatro vezes e, após adição do conjugado a peroxidase anti-IgG bovina (Sigma-
23
Aldrich) na diluição 1:600, foram incubadas por 1 hora a 37º C. Após quatro lavagens
24
adicionou-se a solução reveladora (5 ml de tampão acetato pH 5.0, 200 µl de solução de
25
carbazol e 10 µl de H2O2 30%). Após 15 minutos à temperatura ambiente foi realizada a
26
leitura das placas em microscópio ótico invertido, visando observação da formação de
27
coloração carmim nos locais onde ocorreram as reações imunes.
28
29
2.3.1.3 SDS-PAGE
30
31
Para a realização do SDS-PAGE foi utilizado o antígeno do kit de AGID (Tecpar). O
32
antígeno foi diluido a 1:50 em PBS (pH 7,4) contendo 0,05% de Tween 20 (PBST) e separado
20
1
por eletroforese em gel de poliacrilamida a 12% a 100 V por 90 minutos conforme protocolo
2
de Sambrook e Russel (2001). O gel foi corado com azul de Coomassie R250 durante 120
3
minutos para a visualização das proteínas do BLV.
4
5
2.3.1.4 Western blotting (WB)
6
7
O WB foi realizado para confirmar a sensibilidade e especificidade de algumas
8
amostras reagentes na PLA e não reagentes na AGID. A técnica foi padronizada utilizando-se
9
amostras controles utilizadas no PLA e amostras de soro testadas que apresentaram
10
resultados positivos e negativos tanto por AGID quanto por PLA. Após a separação das
11
proteínas virais no SDS-PAGE, foi realizada a transferencia para a membrana de nitrocelulose
12
(Hybond/ ECL- GE Healthcare) conforme descrito (Sambrook e Russel 2001). Foi realizado o
13
bloqueio com leite desnatado a 5% em PBST durante 1 hora. Em seguida, foram adicionadas
14
as amostras de soro a serem testadas na diluição 1:200 em PBST e incubados durante 1 hora a
15
temperatura ambiente sob agitação constante. Depois de lavadas com PBST, foram incubadas
16
com anti-IgG bovino conjugado com peroxidase (Sigma-Aldrich) diluido a 1:1000 em PBST.
17
A revelação foi realizada com SIGMA FAST 3,3’-Diaminobenzidine tablets (Sigma-Aldrich)
18
até o surgimento da coloração. A reação foi parada com lavagens em água destilada.
19
20
2.4 RESULTADOS
21
22
2.4.1 Imunodifusão em gel de ágar (Agar Gel Immunodiffusion - AGID)
23
24
As amostras testadas foram consideradas positivas na presença de linha de identidade.
25
Do total de 201 animais avaliados, 26% (53) apresentaram resultado positivo, enquanto que
26
74% (148) apresentaram resultado negativo. Na figura 1 está a demonstração de algumas
27
reações observadas.
28
29
2.4.2 Imunoperoxidase (Peroxidase Linked Assay - PLA)
30
31
As amostras de soro positivas foram caracterizadas pela visualização de intensa
32
coloração carmim no citoplasma de células FLK (Figura 2). Por esta técnica foi observado
21
1
que dos 201 soros analisados 59% (119) eram soropositivos e 41% (82) soronegativos para
2
EBL. Todas as amostras positivas por AGID foram consideradas positivas por PLA.
3
4
2.4.3 SDS-PAGE
5
6
Após a coloração do gel com azul de Coomassie foram visualizadas as seguintes
7
proteínas do BLV: proteases 145, 72, 66 e 44 nas posições com peso molecular aproximado
8
de 141, 88, 74 e 44 KDa, respectivamente. Também as glicoproteínas 51 e 30, nas posições
9
com peso molecular aproximado de 68 e 32 KDa, e a proteína 24 na posição de 28 KDa
10
(Figura 3).
11
12
2.4.4 Western Blotting (WB)
13
14
O resultado foi considerado positivo para a presença de anticorpos contra o BLV
15
quando o soro foi reagente com a proteína do BLV de peso molecular de 24 KDa, que pode
16
ser representada com o aparecimento de uma a três bandas próximas (Mager et al 1994,
17
Jimenez et al 1995, Gonzalez et al 1999).
18
Das 201 amostras de soro analisadas 32,8% (66) apresentaram resultados divergentes,
19
ou seja, foram positivos por PLA e negativos por AGID. Para comprovar a especificidade dos
20
resultados conflitantes foi realizada a técnica de WB. Das 66 amostras, somente 8 (12,1%)
21
confirmaram a positividade (Figura 4).
22
23
2.5 DISCUSSÃO
24
25
A técnica de PLA é descrita por diversos pesquisadores como sendo de alta
26
especificidade e sensibilidade na identificação de animais sorologicamente positivos contra
27
diversas enfermidades (Houben et al 1995, Soliman et al 1997, Elahi 1997, Deregt e Prins
28
1998, Buzala e Deren 2003 e Rulka et al 2003). Além disso, é considerada uma técnica de
29
fácil execução e permite testar muitas amostras ao mesmo tempo. Em laboratórios com rotina
30
em cultivo celular a técnica de PLA, uma vez implementada, possui um baixo custo. Tais
31
características fazem com que possa ser de grande utilidade em programas de controle e
32
erradicação. Nesse sentido, esse trabalho teve como objetivo verificar se a PLA poderia ser
22
1
utilizada para diagnosticar bovinos infectados pelo BLV, e, dessa forma, proporcionar aos
2
produtores uma alternativa na busca de animais portadores.
3
Foram analisadas 201 amostras de soros por PLA e os resultados foram comparados
4
com o teste AGID (Tabela 1). Houve concordância de resultados em 67,2% das amostras
5
(135/201), sendo que todas as amostras positivas na AGID foram positivas na PLA, 26%
6
(53/201) e 41% (82/201) apresentaram resultados positivos e negativos, respectivamente, em
7
ambos os testes. Para confirmar se as amostras consideradas positivas na PLA e negativas na
8
AGID eram realmente positivas foi realizado o teste de WB, visto que é uma técnica de
9
grande sensibilidade e especificidade, embora de pouca praticidade para uso como teste de
10
triagem (González et al 1999, Choi et al 2002). Dos 66 soros positivos por PLA e negativos
11
por AGID, 8 (12,1%) foram sororeagentes por WB (Tabela 2), indicando serem falso-
12
positivos os demais resultados e constatando que a AGID falhou em identificar 4% (8/201) de
13
animais positivos para ELB. De fato, trabalhos anteriores descrevem uma menor sensibilidade
14
do AGID comparada ao WB (Kittelberger et al 1996, Gonzalez et al 1999, Choi et al 2002).
15
Os resultados encontrados no PLA contrariam os descritos por Buzala e Deren (2003)
16
e Rulka et al (2003) que não detectaram problemas de especificidade, embora confirmem a
17
sensibilidade da técnica um pouco superior ao AGID na detecção de anticorpos contra o BLV.
18
Podem ser elaboradas diversas hipóteses para tentar explicar os resultados falso-positivos
19
encontrados no presente estudo. As reações observadas podem ter ocorrido devido a reações
20
inespecíficas contra antígenos celulares e não virais. Pode ter havido reações dos anticorpos
21
dos bovinos devido a presença de epitopos nas células muito semelhantes aos de antígenos
22
aos quais os animais tenham sido expostos. Existe ainda uma possibilidade de que as células
23
FLK utilizadas na técnica estivessem contaminadas com outro agente, como enterovirus,
24
rotavirus, coronavirus, vírus sincicial respiratório dos bovinos ou micoplasma (Beier et al
25
2004), os quais não foram testados. A linha celular FLK é muito utilizada para a produção de
26
antígeno para ser utilizado em kits comerciais de diagnóstico de BLV. Considerando a
27
possibilidade de freqüente contaminação dessas células (Bolin et al 1994, Dees et al 1994),
28
cabe ressaltar a importância da utilização de células livres de agentes estranhos para evitar
29
interpretações equivocadas no diagnóstico de BLV. Recentemente foi estabelecida uma nova
30
linhagem celular (PO714) permanentemente infectada pelo BLV e livre de contaminantes
31
(Beier et al 2004). Talvez a utilização dessa linhagem celular possa eliminar os resultados
32
falso-positivos e viabilizar a implementação da técnica de PLA para diagnóstico de EBL.
23
1
A prevalência de infecção pelo BLV é alta em várias regiões do Brasil, e recomenda-
2
se que o controle seja feito pelas provas sorológicas, buscando identificar os animais
3
portadores da enfermidade. Os testes de AGID e ELISA são os aprovados pela Organização
4
Mundial da Saúde Animal (OIE), porém há relatos que estes métodos não identificam todos
5
os animais infectados (Eaves et al 1994). Em virtude disto, na implantação de um programa
6
de erradicação da EBL o ideal seria o uso de uma prova de grande acurácia e que detecte
7
precocemente os animais infectados. Nossos resultados sugerem, da mesma forma que os
8
obtidos por outros grupos, a necessidade de testes mais sensíveis para identificar bovinos
9
positivos para o BLV (Klintevall et al 1991, Kittelberger et al 1996, Gonzalez et al 1999,
10
Martin et al 2001). Técnicas como o WB, que detecta anticorpos contra p24, os quais são
11
produzidos precocemente (González et al 1999), ou técnicas moleculares, podem ser
12
alternativas a serem futuramente implementadas (Klintevall et al 1991, Martin et al 2001,
13
Kuckleburg et al 2003).
14
No presente estudo a técnica de PLA, quando comparada à técnica de AGID,
15
apresentou baixa especificidade, porém, a utilização da técnica em programas de controle da
16
doença através da identificação dos animais sororeagentes é satisfatória, pois propicia a
17
identificação de maior número de animais soropositivos do que o teste de AGID.
18
19
2.6 AGRADECIMENTO
20
21
22
Nós somos gratos à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(Capes) – pelo suporte financeiro concedido através da bolsa de mestrado.
23
24
2.7 REFERÊNCIAS
25
26
Beier D, R Riebe, P Blankenstein, E Starick, A Bondzio, O Marquardt. 2004. Establishment
27
of a new bovine leukosis virus producing cell line. J Virol Meth 121, 239–246.
28
29
Bolin S R, J F Ridpath, J Black, M Macy, R Roblin. 1994. Survey of cell lines in the
30
American Type Culture Collection for BVDV. J Virol Meth 48, 211–221.
31
32
Buzała E, W Dereń. 2003. Comparison of PLA with AGID and ELISA results in serology
33
diagnosis of bovine leukosis. Pol J Vet Sci 6, 3, 9-11.
24
1
Choi K Y, R B Liu, G C Buehring. 2002. Relative sensitivity and specificity of agar gel
2
immunodiffusion, enzyme immunosorbent assay, andimmunoblotting for detection of anti-
3
bovine leukemia vírus antibodies in cattle. J Virol Meth 104, 33–39.
4
5
Dees C, V L Godfrey, J S Foster, R D Schultz, CC Travis. 1994. Stabilization of the p53 gene
6
product in two bovine leukemia vírus infected cell lines. Cancer Lett 86, 33–40.
7
8
Deregt D, S Prins. 1998. A monoclonal antibody-based immunoperoxidase monolayer (micro-
9
isolation) assay for detection of type I and type II bovine viral diarrhea viruses. Cann J Vet
10
Res 62, 152-155.
11
12
Eaves F W, J B Molloy, C K Dimmock, L E Eaves. 1994. A field evaluation of the
13
polymerase chain reaction procedure for the detection of bovine leukaemia virus proviral
14
DNA in cattle. Vet Microbiol 39, 313-321.
15
16
Elahi S M, S Harpin, E Cornaglia, B Talbot, Y Elazhary. 1997. Antigenic variation among
17
bovine viral diarrhea virus (VDBV) strains an the role of different cell fixation methods in
18
immunoassays. Can J Vet Res 61, 34–38.
19
20
Evermann J F. 1992. A look at how bovine leukemia virus infection in diagnosed.
21
Symposium on bovine leukemia virus infection. J Vet Med 3, 272-278.
22
23
Fauquet C M, M A Mayo, J Maniloff, U Desselberger, L A Ball. 2005. Virus taxonomy:
24
VIIIth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Virus Research. San
25
Diego:Academic Press, Pp 1162.
26
27
Fetrow J, J F Ferrer. 1982. Bovine leukemia virus infection and mastitis. J Dairy Sci 65, 881-
28
882.
29
30
Gonzalez E T, G A Oliva, J Norimine, V Cid de la Paz, M G Echeverría. 1999. Evaluation of
31
western blotting for the diagnosis of enzootic bovine leukemia. Arquivo Brasileiro de
32
Medicina Veterinária e Zootecnia 51, 4, 299-305.
33
25
1
González T, M Licursi, E Bonzo. 2007. Enzootic bovine leukosis: performance of an indirect
2
elisa applied in serological diagnosis. J Microbiol 38, 1-5.
3
4
Gutiérrez G, I Alvarez, N Fondevila, R Politzki, M Lomónaco, S Rodríguez, M J Dus Santos,
5
K Trono. 2009. Detection of bovine leukemia virus specific antibodies using recombinant
6
p24-ELISA. Vet Microbiol 137, 224–234.
7
8
Hopkins S G, R F DiGiacomo. 1997. Natural transmission of bovine leukemia virus in dairy
9
and beef cattle. Vet Clin of North Am: Food Anim Pract 13, 107-128.
10
11
Houben S, K Van Reeth, M B Pensaert. 1995. Pattern of infection with the Porcine
12
Reproductive and Respiratory Syndrome Virus on swine farms in Belgium. J Vet Med 342,
13
209-215.
14
15
Johnson R, J B Kaneene. 1992. Bovine leukemia virus and enzootic bovine leukosis. Vet Bull
16
62, 4, 287-312.
17
18
Kettmann R, A Burny, I Callebaut, L Droogmans, M Mammerickx, L Willems, D Portetelle.
19
1994. Bovine leukemia virus. In: The Retroviridae (ed). J.A. Levy. Plenum Press, New York,
20
Pp 39–81.
21
22
Kittelberger R, B J Laybourn, D S Diack, M E Penrose, M P Reichel, J Motha, J B Molloy, M
23
Merza. 1996. Evaluation of electrophoretic immunoblotting for the detection of antilbodies
24
against the bovine leukosis virus in cattle. J Vir Meth 61, 7-22.
25
26
Klintevall K, A Ballagi-Pordány, K Näslund, S Belák. 1994. Bovine leukaemia virus: Rapid
27
detection of proviral DNA by nested PCR in blood and organs of experimentally infected
28
calves. Vet Microbiol 42, 191-204.
29
30
Kuckleburg C J, C C Chase, E A Nelson, S A E Marras, M A Dammen, J Christopher-
31
Hennings. 2003. Detection of bovine leukemia virus in blood and milk by nested and real-
32
time polymerase chain reactions. J Vet Diagn Invest 15, 72–76.
33
26
1
Llames L, E Gómes-Lucia, A Doménech, G Suárez, J Goyache. 2000. Analysis by sodium
2
dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis and Western blot of nonspecific and
3
specific viral proteins frequently detected in different antigen preparations of bovine leukemia
4
vírus. J Vet Diagn Invest 12, 337–344.
5
6
Martin D, A Arjona, I Soto, N Barquero, M Viana, E Gomez-Lucia. 2001. Comparative Study
7
of PCR as a Direct Assay and ELISA and AGID as Indirect Assays for the Detection of
8
Bovine Leukaemia Virus. J Vet Med 48, 97-106.
9
10
Pelzer K D, D J Sprecher. 1997. Controlling BLV infection on dairy operations. Vet Med,
11
275-281.
12
13
Reichell M P, K M Tham, S Barnes, R Kittelberg. 1998. Evaluation of alternative methods for
14
he detection of bovine leukaemia virus in cattle. New ZealVet J 46, 140-146.
15
16
Rułka J, P Kubis, E Buzała, S Kaminski, W Dereń. 2003. The improvement of monitoring
17
methods of cattle infection with bovine leukemia virus (BLV). Pol J Vet Sci 6, 40-2.
18
19
Sambrook J, D W Russel. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. Cold
20
Spring Harbor Lab. Press, New York.
21
22
Soliman A K, D M Watts, A W Salib, A E D Shehata, R R Arthur, B A M Botros. 1997.
23
Application of an immunoperoxidase monolayer assay for the detection of arboviral
24
antibodies. J Vir Method 65, 147-151.
25
26
27
28
29
30
31
32
27
1
2.8 FIGURAS
2
3
Castro et al, Figura 1
4
5
Teste de AGID para detecção de anticorpos anti-BLV. 1: soro controle positivo; 2: amostra
6
de soro positiva; 3: amostra de soro positiva; 4: soro controle positivo; 5: amostra de soro
7
positiva; 6: amostra de soro negativa; 7: antígeno do BLV.
8
9
Castro et al, Figura 2
10
11
Reações observadas pela técnica de PLA em células FLK. (A) Amostra positiva para
12
anticorpos contra o BLV;
13
citoplasma da célula. (B) Amostra negativa para anticorpos contra o BLV. Observação em
14
microscópio óptico invertido 40x.
15
16
17
→ presença da coloração Carmin marcando o antígeno no
28
1
Castro et al, Figura 3
2
3
Perfil de proteínas do BLV obtido a partir do kit utilizado (Tecpar) obsevado por SDS-PAGE
4
(gel de acrilamida 12 %) corado com azul de Coomassie. (M) marcador de peso molecular
5
(Prestained SDS-PAGE Standards Low Range – Bio Rad).
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
29
1
Castro et al, Figura 4
2
3
4
Imunodetecção por WB de anticorpos específicos contra o BLV. M: marcador de peso
5
molecular (Prestained SDS-PAGE Standards Low Range – Bio Rad); ++: amostra positiva
6
nos testes de AGID e PLA; --: amostra negativa nos teses de AGID e PLA; SFB: amostra
7
controle negativo; SH1: amostra controle positivo cedido pelo Instituto Pasteur-Montevideo;
8
SH2: amostra controle positivo do kit comercial (Tecpar); A+: amostra de soro positivo e A-:
9
amostra de soro negativo; *: presença de reação contra a proteína p24.
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
30
1
Tabela 1 – Análise dos resultados entre as técnicas de Imunoperoxidase e Imunodifusão em
2
Gel de Ágar.
Testes sorológicos
Resultados
PLA
AGID
Positivos
119 (59%)
53 (26%)
Negativos
82 (41%)
148 (74%)
201 (100%)
201 (100%)
Total
3
4
5
Tabela 2 – Comparação dos resultados divergentes dos testes de Imunoperoxidase e
6
Imunodifusão em Gel de Ágar com a técnica de Western blotting.
7
8
9
10
11
12
Resultados
PLA
Testes Sorológicos
AGID
Positivos
66 (100%)
0
8 (12,1%)
Negativos
0
66 (100%)
58 (87,9%)
Total
66 (100%)
66 (100%)
66 (100%)
WB
31
3. CONCLUSÃO GERAL
- A técnica de imunoperoxidase apresentou maior sensibilidade para detectar
anticorpos contra o BLV, quando comparada ao teste de AGID;
- A técnica de imunoperoxidade para a detecção de anticorpos contra o BLV
apresentou baixa especificidade, quando comparada com o teste de AGID e
confirmada pelo WB;
- A utilização da técnica de Imunoperoxidase em programas de controle da doença
através da identificação dos animais sororeagentes é satisfatória, pois propicia a
identificação de maior número de animais soropositivos do que o teste de AGID;
- A técnica de Imunoperoxidase não é recomendada para eliminar a enfermidade
através da erradicação, pois demonstrou resultados elevados na identificação de
animais falso-positivos.
32
4.
REFERÊNCIAS GERAIS
AGRESTI, A.; PONTI, W.; ROCCHI, M.; MENEVERI, R.; CAVALLERI, D.; PERI, E.;
POLI, G.; GINELLI, E. Use of polymerase chain reaction to diagnose bovine
leukemia virus infection in calves at birth. American Journal of Veterinary
Research, v. 54, n. 3, p. 373-378, 1993.
BIRGEL JUNIOR, E.H.; DIAS, W.M.C.; SOUZA, R.M.; POGLIANI, F.C.; BIRGEL,
D.B.; BIRGEL, E.H. Prevalência da infecção pelo vírus da leucose bovina em
animais da raça Simental, criados no Estado de São Paulo. ARS Veterinária,
Jaboticabal, v. 22, n. 2, p. 122-129, 2006.
BRASIL, Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE). Agropecuária:
Produção Pecuária Municipal, v. 37, 2009. Disponível em: <http://www.ibge.gov.br>.
Acesso em: janeiro de 2011.
BUZAŁA, E.; DEREŃ, W. Comparison of PLA with AGID and ELISA results in
serology diagnosis of bovine leukosis. Polish Journal of Veterinary Sciences, v. 6,
n. 3, p. 9-11, 2003.
COLLA, D.; DEGGERONE, R.; TAVARES, P.; ALVES, M. R.; FRITSCH, R. K.
Anuário Brasileiro do Leite 2009, 2009. Disponível em: <http://www.ibge.gov.br>.
Acesso em janeiro: de 2011.
D’ANGELINO, J.L. Leucose enzoótica dos bovinos. Estudo retrospectivo da
performance produtiva e reprodutiva de animais infectados e não infectados.
1991. 85p. Tese (Livre Docência em Clínica Médica) – Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo.
DEREGT, D.; PRINS, S. A monoclonal antibody-based immunoperoxidase
monolayer (micro-isolation) assay for detection of type I and type II bovine viral
diarrhea viruses. Canadian Journal of Veterinary Research, v. 62, p. 152-155,
1998.
33
DIGIACOMO, R.F. The epidemiology and control of bovine leukemia virus infection.
Veterinary Medicine, v. 87, p. 248-256, 1992.
DUBOVI, E.J. Laboratory diagnosis of bovine viral diarrhea virus infections.
Veterinary Medicine, v. 9, p. 867–872, 1996.
ELAHI, S. M.; HARPIN, S.; CORNAGLIA, E.; TALBOT, B.; ELAZHARY, Y. Antigenic
variation among bovine viral diarrhea virus (VDBV) strains an the role of different cell
fixation methods in immunoassays. Canadian Journal of Veterinary Research, v.
61, p. 34–38, 1997.
EVERMANN, J.F. A look at how bovine leukemia virus infection in diagnosed.
Symposium on bovine leukemia virus infection. Veterinary Medicine, v. 3, p. 272278, 1992.
FERRER, J.F. Bovine leukosis: natural transmission and principles of control.
Journal of the American Veterinary Medical Association, v. 175, n. 12, p. 12811286, 1979.
FETROW, J., FERRER, J.F. Bovine leukemia virus infection and mastitis. Journal of
Dairy Science, v. 65, p. 881-882, 1982.
FLORES, E.F.; WEIBLEN, R.; REBELATTO, M.C. Aspectos epidemiológicos da
infecção pelo vírus da leucose bovina (VLB) na região central do Rio Grande do Sul,
Brasil. A Hora Veterinária, v. 10, n. 58, p. 25-29, 1990.
GONZALEZ, E.T.; OLIVA, G. A.; NORIMINE, J.; CID DE LA PAZ, V.; ECHEVERRÍA,
M.G. Evaluation of western blotting for the diagnosis of enzootic bovine leukemia.
Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v. 51 n. 4, p. 299305, 1999.
GUTIÉRREZ, G.; ALVAREZ, I.; FONDEVILA, N.; POLITZKI, R..; LOMÓNACO, M.;
RODRÍGUEZ, S.; DUS SANTOS, M. J. TRONO, K. Detection of bovine leukemia
34
virus specific antibodies using recombinant p24-ELISA. Veterinary Microbiology, v.
137, p. 224–234, 2009.
HEALD, M.T.S.; WALTNER-TOEWS, D.; JACOBS, R.M.; MCNAB, W. B. The
prevalence of anti-bovine leukemia virus antibodies in dairy cows and associations
with farm management practices, production and culling in Ontario. Preventive
Veterinary Medicine, v. 14, p. 45-55, 1992.
HOUBEN, S.; VAN REETH, K.; PENSAERT, M.B. Pattern of infection with the
Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus on swine farms in Belgium. J.
Veterinary Medicine, v. 342, p. 209-215, 1995.
JACOBS, R.M.; POLLARI, F.L., MCNAB, B.; JEFFERSON, B. A serological survey of
bovine syncytial virus on Ontario: association with bovine leukemia and
immunodeficiency-like viruses, production records, and management practices.
Canadian Journal of Veterinary Research, v. 59, p. 271-278, 1995.
JOHNSON, R.; KANEENE, J.B. Bovine leukemia virus and enzootic bovine leukosis.
Veterinary Bulletin, v. 62, n. 4, p. 287-312, 1992.
JOHNSON, R.; KANEENE, J.B. Bovine Leukemia virus part 1. Descriptive
epidemiology, clinical manifestation and diagnostic tests. Compendium on
Continuing Education for the Practicing Veterinarian, v.13, p. 315-327, 1991.
KETTMANN, R.; BURNY, A.; CALLEBAUT, I.; DROOGMANS, L.; MAMMERICKX,
M.; WILLEMS, L.; PORTETELLE, D. Bovine leukemia virus. In: The Retroviridae,
ed. J.A. Levy, Plenum Press, New York, v. 3, p. 39–81, 1994.
KITTELBERGER, R.; LAYBOURN, B. J.; DIACK, D. S.; PENROSE, M. E.; REICHEL,
M. P.; MOTHA, J.; MOLLOY, J. B.; MERZA, M. Evaluation of electrophoretic
immunoblotting for the detection of antilbodies against the bovine leukosis virus in
cattle. Journal of Virological Methods, v. 61, p. 7-22, 1996.
35
KNAPEN, K.; KERKHOFS, P.; THIRY, E.; MAMMERICKX, M. Epidemiological
evaluation of a monoclonal ELISA detecting antibodies against bovine leukaemia
virus in serum pools. Epidemiology and infection, v. 113, p. 563-569, 1994.
LLAMES, L.; GÓMES-LUCIA, E.; DOMÉNECH, A.; SUÁREZ, G.; GOYACHE, J.
Analysis by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis and Western
blot of nonspecific and specific viral proteins frequently detected in different antigen
preparations of bovine leukemia vírus. Journal of Veterinary Diagnostic
Investigation, v. 12, p. 337–344, 2000.
LUDERS, M.A. Prevalência de anticorpos contra o vírus da leucose enzoótica
bovina em fêmeas com mais de dois anos no Rebanho de bovinos leiteiros no
Município
de
Mafra
–
SC.
2001.
Dissertação
(Mestrado
em
Ciências
Agroveterinária/Sanidade Animal) – Universidade do Estado de Santa Catarina,
Lages.
MEGID, J.; NOZAKI, C.N.; KURODA, R.B.S.; CRUZ, T.F.; LIMA, K.C. Ocorrência de
leucose enzoótica bovina na microrregião da Serra de Botucatu. Arquivo Brasileiro
Medicina Veterinária Zootecnia, Belo Horizonte, v. 55, n. 5, p. 645-646, 2003.
MERKT, H.; GIUDICE, J.C.O.; MÜLLER, J.A. Leucose bovina: concepção moderna e
primeira verificação da doença no R.S. Revista da Escola Agronomia Veterinária
do Rio Grande do Sul, v. 2, p. 7-19, 1959.
MORAES, M.P.; WEIBLEN, R.; FLORES, E. F.; OLIVEIRA, J. C. D.; REBELATTO,
M. C.; ZANINI, M.; RABUSKE, M.; HÜBNER, S. O.; PEREIRA, N. M. Levantamento
sorológico da infecção pelo vírus da Leucose Bovina nos rebanhos leiteiros do
Estado do Rio Grande do Sul, Brasil. Ciência Rural, Santa Maria, v.26, n.2, p. 257262, 1996.
MURPHY, F.A.; GIBBS, E.P.J.; HORZINECK, M.C.; STUDDERT, M.J. Veterinary
Virology. California: Academic Press, 3.ed., 1999, 4495p.
36
OTT, S. L.; JOHNSON, R.; WELLS, S.J. Association between bovine-leukosis virus
seroprevalence and herd-level productivity on US dairy farms. Preventive
Veterinary Medicine, v. 61, p. 249-262, 2003.
PELZER, K.D.; SPRECHER, D.J. Controlling BLV infection on dairy operations.
Veterinary Medicine, p. 275-281, 1997.
POLLETO, R.; KREUTZ, L.C.; GONZALES, J.C.; BARCELLOS, L.J.G. Prevalência
de tuberculose, brucelose e infecções víricas em bovinos leiteiros do município de
Passo Fundo, RS. Ciência Rural, Santa Maria, v. 34, n. 2, p. 595-598, 2004.
RAJÃO, D. S. Efeito da infecção pelo vírus da leucose enzoótica bovina na
produção de leite e reprodução de rebanhos leiteiros. 2008, 26p. Dissertação
(Mestrado em Ciência Animal) – Universidade Federal de Minas Gerais.
RANGEL, N.M.; MACHADO, A.V. Contribuição à oncologia comparada em Minas
Gerais. Arquivos da Escola Superior de Veterinária do Estado de Minas Gerais,
v. 1, p. 84-96, 1943.
REICHELL, M. P.; THAM, K. M.; BARNES, S.; KITTELBERG, R. Evaluation of
alternative methods for the detection of bovine leukaemia virus in cattle. New
Zealand Veterinary Journal, v. 46, p. 140-146, 1998.
RUŁKA, J.; KUBIS, P.; BUZAŁA, E.; KAMINSKI, S.; DEREŃ, W. The improvement of
monitoring methods of cattle infection with bovine leukemia virus (BLV). Polish
Journal of Veterinary Sciences, v. 6, p. 40-2, 2003.
SARGEANT, J.M.; KELTON, D. F.; MARTIN, S. W.; MANN, E. D. Associations
between farm management practices, productivity, and bovine leukemia virus
infection in Ontario dairy herds. Preventive Veterinary Medicine, v. 31, n. 3-4, p.
211-221, 1997.
SOLIMAN, A. K.; WATTS, D. M.; SALIB, A. W.; SHEHATA, A. E.D.; ARTHUR, R. R.;
BOTROS, B. A. M. Application of an immunoperoxidase monolayer assay for the
37
detection of arboviral antibodies. Journal of Virological Methods, v. 65, p. 147-151,
1997.
SORENSEN, D.K. Economics of bovine leukosis. In: Proceeding of Bovine
Leukosis Symposium. U.S. Department of Agriculture, Washington, DC, p. 5-15,
1979.
SPONCHIADO, D. Prevalência de anticorpos séricos anti-vírus da leucose
enzoótica bovina em rebanhos da raça Holandesa Preta e Branca, criados no
estado do Paraná. 2008, 101p. Dissertação (Mestrado em Ciência Veterinária) –
Universidade Federal Paraná, Curitiba.
THURMOND, M.; PORTIER, K. M.; PUHR, D. M. A prospective investigation of
bovine leukemia virus infection in Young dairy cattle, using survival methods.
American Journal of Epidemiology, v. 117, p. 621 – 631, 1983.
TRAININ, Z. Detrimental effect of bovine leukemia virus (BLV) on the immunological
state of cattle. Veterinary Immunology and Immunopathology, v. 54, n. 1-4, p.
293-302, 1996.
38
ANEXO
39
ANEXO A - Formato de acordo com as normas da revista Archivos de Medicina
Veterinaria.
www.veterinaria.uach.cl
INSTRUÇÕES PARA OS AUTORES
Instruções para os autores
Envio da publicação
ISSN
0717-6201
versão
online
ISSN
Forma e preparação do artigo
Provas de impressão
0301-732X
versão
impressa
Instruções para os autores
Archivos de Medicina Veterinária publica, em espanhol ou inglês, contribuições
científicas originais na forma de artigos científicos, revisões bibliográficas e
comunicações curtas que possam incluir observações clínicas, descrições de técnicas ou
métodos, e avanços em todos os aspectos das Ciências Veterinárias e bem-estar animal.
Envio da publicação
Os artigos devem ser enviados ao Editor e incluir:
Três exemplares impressos em papel, incluindo os quadros, figuras e fotografias.
Uma versão eletrônica do texto, quadros (preferentemente em formato MS Word) e
figuras (de preferência em formato Excel), deverá vir em anexo em disco de 3,5” ou CD,
40
devidamente rotulado com o Sobrenome do primeiro autor e as primeiras palavras do
título do artigo.
Os trabalhos devem ser originais e, não devem estar em processo de revisão em
outra revista.
Os artigos apresentados sem considerar as normas de estilo, serão devolvidos sem
passar pela revisão.
Para experiências com animais ou humanos, o Comitê Editor poderá solicitar que
se anexe à autorização de um Comitê de Bio-ética ou instância similar.
Deverá incluir uma carta dirigida ao Editor solicitando a publicação do seu
trabalho e indicando um dos autores como responsável pela revisão das provas de
impressão e da correspondência.
A propriedade intelectual dos trabalhos publicados pertence aos autores.
Os revisores de Archivos de Medicina Veterinária assessoram ao Comitê Editor
para decidir se o trabalho pode ser publicado. Os autores poderão sugerir revisores. Todos
os artigos enviados para publicação serão enviados a dois revisores selecionados pelo
Comitê Editor e podem incluir, ou não, os sugeridos pelos autores. Em caso de existir
controvérsia nos informes, se recorrerá a um terceiro em caráter de árbitro, que assessorará
ao Comitê Editor para decidir o destino do trabalho. Os revisores estão obrigados a manter
o caráter confidencial de toda a informação dos trabalhos, mesmo quando não sejam
publicados.
Antes da publicação deverá ser pago um valor o qual esta indicado na Web
www.veterinaria.uach.cl
Forma e preparação do artigo
Tipos
de
artigos
Artigos de revisão: são realizados por especialistas que resumem e projetam o
conhecimento atualizado num campo particular das Ciências Veterinárias, e não
necessariamente se ajustam a um formato definido de apresentação. Os autores deverão
previamente consultar aos editores antes de iniciar o trabalho de revisão. O Comitê Editor
poderá solicitar os especialistas o envio de artigos de revisão, que também serão
41
submetidos ao processo de arbitragem e edição. Não devendo exceder 35 páginas.
Artigos científicos: estes informam um novo avanço em Ciências Veterinárias
baseados numa investigação original. O formato dos mesmos deverá incluir, sumário,
introdução, material e métodos, resultados, discussão, resumo, agradecimentos (quando
corresponda) e referências. Não devem exceder de 25 páginas.
Comunicações curtas: informam de maneia breve, um avanço, resultado de um
experimento, observações clínicas ou nova metodologia, justando-se ao seguinte formato:
sumário, introdução, material e métodos, resultados e discussão (seção conjunta), resumo,
agradecimentos (quando corresponda) e referências. Não devem exceder de 15 páginas.
Estilo e formato da revista
Apresentação geral: a revista publica artigos em espanhol ou inglês.
Os artigos deverão ser escritos com letras Times New Roman tamanho 12, por um só lado
das folhas, o espaçamento entre linhas e médio, em tamanho carta (21,5 x 27,9 cm),
deixando 2 cm em cada margem da folha.
Todas as páginas devem ser numeradas de maneira consecutiva no ângulo superior direito,
e as línhas deverão ser numeradas em cada página, iniciando-se com o número 1, junto à
margem
esquerda,
em
todo
o
trabalho.
Os títulos de capítulos devem ser escritos em minúscula e negrito, justificada do lado
esquerdo, em línhas separadas e sem ponto final. Ex. “Materiais e Métodos”. Nos subtítulos
só a primeira letra é maiúscula. Subtítulo primário Ex “Desenho experimental” deverá ser
justificado ao lado esquerdo e em negrito; subtítulo secundário deve ser justificado do lado
esquerdo e em letra itálica. Não deverão usar-se sublinhados nem numeração de subtítulos
ou lista de itens.
As cifras devem ser escritas em números. Quando estão no inicio de uma frase, ou quando
42
a clareza do texto o requeira, devem ser expressas em palavras. Um decimal deverá ser
precedido de um numeral usando ponto quando o artigo é em inglês ou vírgula quando o
artigo é em espanhol Ex. “0,5” não “,5”. As medidas de quantidade deverão ajustar se ao
Sistema Internacional de Unidades, a menos que a prática numa disciplina use derivados
deles (Ex. a unidade internacional de Curie). As datas devem ser expressas como “07 de
setembro de 1954” no texto, mas podem apresentar-se abreviadas nos quadros e figuras. O
tempo diário deve expressar se segundo as 24 horas cronológicas.
Para a nomenclatura química deve-se utilizar as normas da Sociedade de Bioquímica
(Biochem J 209, 1-27, 1983), os fármacos ou drogas devem ser mencionados por seus
nomes genéricos (em minúsculas), se for necessário colocar marcas e suas fontes deverão ir
ao pé de página. As enzimas devem ser identificadas, quando se mencionam por primeira
vez, segundo a Enzyme Commission of the International Union of Biochemistry.
Os termos em latim e suas abreviações que são de uso comum na literatura científica, tais
como: in vitro, in vivo, ad libitum deverão ser italizadas. Os valores de probabilidade
devem ser dados na forma de P<0,05 o P<0,01. Desvio padrão, erro padrão da media e
intervalos de confiança, se abreviarão da seguinte forma: DE, EE e IC, respectivamente.
Pé
de
página
Serão usados para indicar o endereço do autor responsável da correspondência e seu
endereço eletrônico na página do título, para elaborar abreviações citadas em o título de
quadros, marcas comerciais, nome e endereço de empresas ou quando deva-se sinalar a
fonte de financiamento.
Título
O título do trabalho deve ser conciso, específico e informativo. Só a primeira letra será
maiúscula, em negrito, centrado, iniciando se na línea 10, sem usar marcas comerciais ou
abreviações. Dever-se-á sinalar, com índice # a fonte de financiamento, se houver, será
detalhada ao pé da página. Separado por espaço de uma línha onde deverá escrever o título
em
Autores
inglês,
em
igual
e
estilo
e
formato.
endereços
Os nomes dos autores deverão ser escritos abaixo do título separados por um espaço. Use
43
iniciais (sem pontos) e sobrenome separando por vírgulas entre os autores, ajustando se os
seguinte exemplo: C T Westwood, E Bramley, I J Lean. Ao final de cada nome de autor
deve ser identificado com um número no índice. Deverá sinalizar separado por um espaço o
nome da seção, departamento, serviço o instituição a que pertence ou pertenceu dito autor,
durante a execução do trabalho. O número com um asterisco indica o autor responsável da
correspondência, devendo se sinalar ao pé da página o número de fax, endereço eletrônico
e Caixa Postal.
Sumário
A segunda página deve conter um sumário, com título, de não mais de 250 palavras e que
descreva os propósitos do estudo ou investigação, os materiais e métodos empregados, os
resultados principais e as conclusões mais importantes. Não devem empregar abreviaturas
não padronizadas. Em linha aparte, separado por um espaço e justificadas à esquerda devese incluir key words em minúsculas, as que não devem ser mais de 4.
Introdução
Na terceira página na línha 1 se deverá escrever o título do capítulo. Na línha seguinte, com
tabulação, predeterminada de um tab, em 5 espaços, se detalharão os antecedentes que
sustentam o propósito do artigo, sem um detalhe extensivo do tema e utilizando só as
referências mais pertinentes. Deve-se indicar, quando corresponda, a hipótese que se
postula
e
os
objetivos
da
investigação.
Entre parágrafos deve conservar o espaçamento médio.
Material
e
Métodos
Separado por um espaço de uma línha da seção anterior, deve-se descrever o capítulo com
suficientes detalhes para permitir a outros repetir o estudo. Depois da primeira referencia
no texto as drogas ou reativos, devem indicar o nome genérico, doses e via de
administração. Para o caso de equipamento especializado se indicará a marca, o modelo e o
nome do fabricante.
Os métodos estatísticos utilizados devem ser sinalizados como subtítulos: “Análise
estatística” e deve incluir um adequado detalhe, que permita aos leitores estabelecer com
precisão como foram analisados e apresentados os dados e as unidades de medidas em que
estão expressas (medias aritméticas, desvio padrão, erro padrão da media, medianas, limites
44
o limites de confiança, etc.). Se as provas usadas foram paramétricas (Chi quadrado, prova
“t“ de Student, Anova, etc.) ou não paramétricas (Wilcoxon, Kruskal-Wallis, etc.). Deverão
identificar o nome, a versão e o provedor do programa computacional utilizado, ex. SPSS
versão 9.0 para Windows (SPSS Inc, Chicago IL, USA).
Resultados
Separado pelo espaço de uma linha da seção anterior, deve-se descrever o capítulo de
resultados, apresentados de forma concisa e lógica, sem discussão ou referência a outro
trabalho. Os quadros e figuras devem ser os mínimos necessários e os dados não devem ser
repetidos no texto e sequer deverão ser mostrados simultaneamente ou reiterados.
Discussão
Esta seção, separada por uma línea da anterior, deve avaliar e interpretar os resultados,
relacionando os aos de outros estudos relevantes. Não deve repetir resultados ou apresentar
novos. Deve ser diligentemente tratada em seu desenvolvimento, fazendo-o de maneira
lógica e concisa, estabelecendo conclusões, relevâncias e projeções do trabalho. Deve
evitar formular conclusões que não estejam respaldadas com suas pesquisas nem
sustentadas em trabalhos ainda não publicados.
Resumo
O resumo em espanhol deverá ser escrito em folha aparte, com o título do artigo na
primeira linha e na seguinte o resumo em espanhol e deverá ajustar se as mesmas normas
sinalizadas para o sumário. Separadas pelo espaço de uma linha deverão escrever as
palavras chave em letras minúsculas, não devendo ser mais de quatro e justificadas do lado
esquerdo.
Agradecimentos
Devem ser breves e só incluir pessoas ou instituições que tenham feito uma contribuição
direta, tenham provido material necessário ou dado às facilidades para a realização do
estudo.
Referências
A precisão na sinalização das referências é de responsabilidade dos autores e devem
45
corresponder ao artigo original; assegurando que todos os artigos citados no texto estejam
incluídos na lista de referências e vice-versa. No texto, as citações devem ser indicadas
entre parênteses e em ordem cronológica, citando o sobrenome do autor e a expressão "e
col" depois do sobrenome do primeiro autor, quando sejam mais de dois, Ex.: (Pérez 1994,
Castro e Martínez 1996, Cifuentes e col 2002).
A lista de referências deve ser em ordem alfabética de acordo com o sobrenome do
primeiro autor e deve incluir o sobrenome e iniciais de todos os autores. Quando não se
dispõe do nome do autor, use o termo anônimo entre aspas, tanto no texto como na lista de
referências. As referências, quando forem do mesmo autor, devem ser escritas na seguinte
ordem: A. o autor só, B. dois autores alfabeticamente de acordo com o sobrenome do
segundo autor, C. três ou mais autores cronologicamente. As letras a, b, c etc., devem ser
incluídas como índice quando um autor escreve mais de um trabalho no mesmo ano. Os
nomes dos autores devem ser escritos em minúsculas, sem ponto entre as iniciais. Os
nomes das revistas e dos livros devem ser escritos em letras italizadas, usando a abreviatura
padrão. Use os seguintes exemplos como guia.
Para
artigos
em
revista:
Matamoros R, C Gómez, M Andaur. 2002. Hormonas de utilidad diagnóstica en medicina
veterinária.
Para
Arch
capítulos
Med
em
Vet
livros
ou
34,
publicações
167-182.
ocasionais:
Weinstein L, MN Swartz. 1974. Pathogenic properties of invading microorganisms. Em:
Sodeman WA Jr, WA Sodeman (eds). Pathogenic physiology: Mechanism of Disease. WB
Saunders, Philadelphia, Pp. 457-472.
Para
artigos
e
resumos
publicados
em
series
regulares:
Contreras PA, V Ruiz, F Wittwer, H Böhmwald. 1998. Valores sanguíneos de
triyodotironina (T3) e tiroxina (T4) em vacas lecheras del sur de Chile. Resúmenes del X
Congreso Chileno de Medicina Veterinaria, Valdivia, Chile, Pp 135-136.
Para
memória
de
título:
Matthei SM. 2002. Determinación de la presencia del receptor del factor activante
plaquetario en membranas de neutrófilos de bovino. Memoria de titulación, Escuela de
46
Medicina Veterinaria, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.
Para
teses:
Vilanova LT. 2002. Presencia e funcionamiento del receptor GM-CSF en espermatozoides
bovinos y su relación con la motilidad espermática. Tesis Doctoral, Facultad de Ciencias
Veterinárias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.
Minimize o uso de resumos como referências. Evite usar "dados não publicados" ou
"comunicação pessoal" a menos que exista uma forma escrita. Se isto ocorrer, deve ter
referencia no texto, mas não deve aparecer na lista de referências. As referências a
trabalhos que tenham sido aceitos para publicação devem ser citadas como "em impressão",
porém, trabalhos que tenham sido submetidos à publicação, mas não tenham sido aceitos
ainda, devem ser referidos como "dados não publicados".
Endereços de páginas Web não devem ser incluídos nas referências, caso seu uso for
imprescindível, o endereço deve ser sinalizado no texto como pé de página.
Instruções complementares
Quadros
A legenda dos quadros e figuras devem ser apresentadas em espanhol e inglês.
Os quadros devem ser em menor número possível, apresentados em folha aparte, com seus
respectivos títulos em espanhol e inglês, na parte superior. A informação dos quadros não
deve repetir o texto. Os quadros devem ser numerados consecutivamente com números
arábicos, na ordem em que aparecem no texto, definindo um título breve e auto explicativo
que indique seu conteúdo. Sobre cada coluna do quadro deve colocar se um cabeçalho
curto ou abreviado. Só os cabeçalhos das colunas e os títulos gerais separam-se com linhas
horizontais. As colunas de dados devem separar-se por espaços e não por línhas verticais.
Quando se requeira notas explicativas, devem agregar se ao pé do quadro. As notas
explicativas para todas as abreviaturas não padronizadas e as unidades de medidas devem
ser agregadas entre parênteses. Caso se use índices para sinalizar diferenças entre valores
use a, b, c. Minimize o número de dígitos em cada coluna. Informe o valor de 0 como "0".
A largura máxima dos quadros não deve exceder os 80 mm para uma coluna, o os 170 mm
para duas colunas.
47
Figuras
As figuras devem ser apresentadas em folhas separadas, com seus respectivos títulos em
espanhol e inglês na parte inferior, e numerados consecutivamente usando números
arábicos, seguindo a ordem em que aparecem no texto. Ex.: "Figura 1", não "Fig. 1".
Denomine "figura" a qualquer ilustração que não seja quadro, Ex.: gráficos, radiografias,
ecografias, eletrocardiogramas, fotografias, etc. As figuras devem ser orientadas
verticalmente e acompanhadas de uma curta descrição na mesma folha, que contenha a
explicação de todos os marcadores, linhas e símbolos usados. Se a figura tem seções, as
mesmas devem ser identificadas como "a", "b", "c", etc., no canto superior direito e
deverão ser descritas na legenda.
Para o caso de fotografias, no verso e com lápis, devem sinalizar com seta a orientação
espacial, o número da figura e o nome do autor principal. Os símbolos, setas ou letras,
empregadas nas fotografias devem ter um tamanho e contraste suficiente para distinguir seu
contorno. Envie as figuras protegidas num envelope grosso e de tamanho apropriado. As
figuras podem ocupar uma ou duas colunas de largura (80 e 170 mm, respectivamente). As
reproduções em cores das figuras devem ser financiadas pelos autores.
Quando as figuras não são originais devem sinalizar se há autoria, e quando corresponda
devem anexar a autorização do autor para serem reproduzidas.
Provas de impressão
Uma prova de impressão será enviada ao autor encarregado da correspondência,
para sua leitura e correção pontual, e deverá ser devolvida ao editor dentro do prazo que se
especifique. Por outra parte, o editor se reserva o direito de corrigir a prova de impressão
cuidadosamente, mas sem assumir responsabilidade de tal, e desta maneira agilizar o
processo de publicação.
A decisão final para a publicação do trabalho será no momento em que o Comitê
Editor aceite as correções, que as sugestões dos árbitros tenham satisfeito aos autores.
Modificações das provas de impressão que não sejam de erros menores não serão aceitas.
48
Nem os editores nem a gráfica aceitarão responsabilidade pela impressão de erros dos
artigos que os autores não tenham corrigido na prova de impressão.