avaliação do efeito imunossupressor mediado - INCQS

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE DO RIO DE JANEIRO
ESCOLA DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
AVALIAÇÃO DO EFEITO
IMUNOSSUPRESSOR MEDIADO PELA
DEXAMETASONA, CICLOFOSFAMIDA E
TALIDOMIDA NO ENSAIO DO LINFONODO
POPLITEAL EM RATOS
RODRIGO NETTO COSTA
Rio de Janeiro
Setembro 2001
ii
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE DO RIO DE JANEIRO
ESCOLA DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
AVALIAÇÃO DO EFEITO
IMUNOSSUPRESSOR MEDIADO PELA
DEXAMETASONA, CICLOFOSFAMIDA E
TALIDOMIDA NO ENSAIO DO LINFONODO
POPLITEAL EM RATOS
RODRIGO NETTO COSTA
Monografia apresentada à disciplina de Análises Clínicas da
Universidade do Rio de Janeiro como requisito parcial a aprovação no
Curso de Ciências Biológicas – Modalidade Médica.
Rio de Janeiro
Setembro 2001
iii
FICHA CATALOGRÁFICA
Costa, Rodrigo
Avaliação do efeito imunossupressor mediado pela dexametasona,
ciclofosfamida e talidomida no ensaio do linfono popliteal em ratos/ Rodrigo
Netto Costa. - 2001
xvii, 68 f.
Orientadora: Isabella Fernandes Delgado
Monografia - Universidade do Rio de Janeiro, Centro de Ciências Biológicas.
1. Ensaio do Linfonodo Popliteal. 2. imunossupressão. 4. Imunotoxicologia.
I. Delgado, Isabella Fernandes. II. Universidade do Rio de Janeiro. III. Título.
iv
Monografia realizada sob orientação científica da Dra. Isabella Fernandes
Delgado, pesquisadora do Laboratório de Toxicologia Ambiental da Escola
Nacional de Saúde Pública, FIOCRUZ, e orientação acadêmica do Dr. Claude
André Solari, responsável pelo Laboratório de Patologia Clínica do Hospital
Universitário Gaffreé e Guinle, UNIRIO.
v
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE DO RIO DE JANEIRO
ESCOLA DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
AVALIAÇÃO DO EFEITO
IMUNOSSUPRESSOR MEDIADO PELA
DEXAMETASONA, CICLOFOSFAMIDA E
TALIDOMIDA NO ENSAIO DO LINFONODO
POPLITEAL EM RATOS
RODRIGO NETTO COSTA
ORIENTADOR CIENTÍFICO:.........................................................
Dra. Isabella Fernandes Delgado
ORIENTADOR ACADÊMICO:........................................................
Dr. Claude André Solari
Rio de Janeiro
Setembro 2001
vi
“É melhor tentar e falhar, que preocupar-se em ver a vida passar.
É melhor tentar, ainda que em vão, que sentar-se fazendo nada até o final.
Eu prefiro na chuva caminhar, que em dias tristes em casa me esconder.
Prefiro ser feliz, embora louco, que em conformidade viver.”
(Martin Luther King)
vii
Dedico este trabalho a Deus, que me formou e
em sua infinita misericórdia resolveu me amar
e dar sua vida por mim, me cobrindo de
esperança, fé, amor e realizações.
A Ti Senhor, dedico toda a minha gratidão,
respeito e amor.
viii
AGRADECIMENTOS
A meus pais que me educaram com todo o amor e me sustentaram com total diligência,
dando-me todo o exemplo e apoio necessários para que eu alcançasse mais esta
realização. Amo vocês!
A minha noiva Tatiana, que me cativou com seu amor, paciência e dedicação, tornandose o grande amor da minha vida. E também a seus pais e irmãos por quem eu tenho um
grande carinho!
A minha irmã e meu cunhado que, com certeza, sempre foram e sempre serão meus
grandes amigos. E, obrigado pelo computador!
A minha sobrinha Gabi, que me deu muita alegria em vir ao mundo no ano passado,
justamente no período de início deste trabalho.
A Isabella Delgado, por confiar em mim, me dando esta oportunidade não só de um
estágio, mas de um aprendizado que levarei por toda minha vida profissional. Obrigado
pela grande orientação, pelo exemplo e pela amizade. Este trabalho é nosso!
Ao Dr. Francisco Paumgarttem por ter me recebido em seu laboratório, e por ter me
auxiliado no que foi preciso para a elaboração deste trabalho.
ix
Ao Dr. Claude por ter sido compreensivo com as nossas dificuldades no HUGG e por
prontamente me ajudar no que foi preciso.
A Karen e Márcia pela amizade, apoio e por me indicarem à vaga de estágio no
laboratório.
A Laísa e Erick pelo grande auxílio em toda a fase experimental deste trabalho. Sem vocês
não iria ser possível!
A Rosângela e Vanilda pelo grande exemplo de amizade, simpatia e prestatividade
dedicados não só a mim, mas a todos do laboratório.
A todos os demais profissionais e estagiários do Laboratório de Toxicologia que apesar de
não terem sido mencionados individualmente, meu carinho e estima é por todos. Obrigado
por serem tão profissionais e por fazerem um ambiente de trabalho tão agradável.
A Marisa Soares e todo o pessoal do LAPSA por terem sido tão amigos e por terem me
ajudado tanto no meu primeiro estágio.
Aos amigos da faculdade que durante os anos da graduação fizeram esse tempo passar tão
rápido. Obrigado a todos e, principalmente, à Larisse pela amizade contínua e duradoura.
A todos os profissionais do Laboratório de Patologia Clínica do HUGG, em especial à
Aninha da secretaria, por ter sido uma pessoa maravilhosa comigo.
x
Aos professores da UNI-RIO, principalmente aqueles que foram conselheiros e que não se
preocuparam apenas em ministrar o conteúdo programático básico de suas disciplinas, mas
em mostrar a importância humanista da nossa profissão.
A todos do Laboratório de Toxicologia da Faculdade de Veterinária da UFF, em especial a
Profa Ignez Bittencourt de Araújo, por tornar possível a manutenção dos animais no
biotério, durante toda a fase experimental desse trabalho.
A todas as ratas de laboratório por doarem suas próprias vidas em prol da ciência!
Enfim, obrigado a todos que de um jeito ou de outro foram responsáveis pela realização
desse trabalho.
xi
LISTA DE ABREVIATURAS
ACTH – adrenocorticotropina
ADCC – antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity
Ad libitum – com livre acesso
AIDS – Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
AZP – azatioprina
CAB – carbamazepina
CCL – ciclosporina A
CFA – ciclofosfamida
CPZ – clorpromazina
DMSO – dimetil sulfoxido
DNA – ácido desoxirribonucleico
DP – desvio padrão
DPH – difenilhidantoína
DXM – dexametasona
EBV – Epstein-Barr virus
e.g. – por exemplo (exempli gratia)
ELP – Ensaio do Linfonodo Popliteal
EST – estreptozotocina
et al. – e colaboradores (et alii)
EVH – enxerto-versus-hospedeiro
HDZ – hidrazina
IC – índice de celularidade
i.e. – isto é (“id est”)
Ig – imunoglobulina
xii
Il – interleucina
IP – índice de peso
LES – lupus eritematoso sistêmico
MHC – complexo principal de histocompatibilidade
MTX – metrotexano
NaCl – clopreto de sódio
ND – não determinado
NF-kB – fator nuclear de transcrição Kapa B
NK – natural killer
PA – procainamida
PBB – bifenilas polibromadas
PCB – bifenilas policloradas
PBS – solução tampão-fosfato
PD – pata direita
PE – pata esquerda
PLN – popliteal lymph node
PM – peso molecular
qsp – quantidade suficiente para
s.c. – sub cutânea
TAL – talidomida
TCDD – 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-dioxina
v.o. – via oral
ZMD – zimeldina
xiii
LISTA DE TABELAS E FIGURAS
Tabela 1 – Funções do sistema imune e possíveis reações inadequadas
induzidas por xenobióticos.
02
Tabela 2 – Incidência de tumores em indivíduos com imunodeficiência.
08
Figura 1 – Efeito de corticosteróides sobre o número de leucócitos circulantes.
09
Figura 2 – Efeito de corticosteróides e da ciclosporina sobre a produção
de interleucinas.
11
Figura 3 – Efeito de corticosteróides sobre a transcrição gênica de citocinas.
13
Figura 4 – Fases do ciclo mitótico.
15
Figura 5 – Eventos celulares associados a um estímulo antigênico:
fase de indução e fase estabelecida ou efetora.
16
Figura 6 – Efeito da ciclofosfamida sobre filamentos de DNA de linfócitos.
18
Figura 7 – Aumento do linfonodo popliteal induzido por clorpromazina.
23
Tabela 3 – Avaliação do efeito imunossupressor da dexametasona.
34
xiv
Tabela 4 – Avaliação do efeito imunossupressor da ciclofosfamida.
35
Tabela 5 – Avaliação do efeito imunossupressor da talidomida.
36
Tabela 6 – Esquema de tratamento com dexametasona, ciclofosfamida
e talidomida.
37
Tabela 7 – Efeito dos agentes imunossupressores sobre o índice de peso.
41
Tabela 8 – Efeito dos agentes imunossupressores sobre o índice de celularidade.
42
Tabela 9 – Efeito dos agentes imunossupressores sobre o peso dos
órgãos imuno-relacionados.
43
Figura 8 – Relação dose-resposta dos agentes imunossupressores no ELP
(índices de peso).
44
Figura 9 – Relação dose-resposta dos agentes imunossupressores no ELP
(índices de celularidade).
45
Tabela 10 – Aumento do linfonodo popliteal de ratos com substâncias
(e hemácias) positivas no ELP em diferentes laboratórios.
58
xv
ÍNDICE
Lista de abreviaturas
Lista de tabelas e figuras
Índice
Resumo
Abstract
I.
Introdução
I.1 Imunotoxicologia
I.2 Imunossupressão
I.3 Complicações decorrentes de imunossupressão
I.4 Terapia Imunossupressora
I. 4.1 Corticosteróides
I. 4.2 Agentes citotóxicos
I. 4.3 Talidomida
I.5 Ensaio do Linfonodo Popliteal
I.6 Importância do trabalho
xi
xiii
xv
xvi
xvii
01
01
03
06
07
08
14
19
21
24
II.
Objetivo
26
III.
Material e Métodos
27
III.1 Animais
III.2 Biotério
III.3 Fármacos e Reagentes
III.3.1 Controle positivo no ELP
III.3.2 Agentes imunossupressores
III.3.3 Outros
III.4 Preparo de soluções
III.5 Desenho experimental
III.5.1 DXM (Experimento 1)
III.5.2 CFA (Experimento 2)
III.5.3 TAL (Experimento 3)
III.6 Análise estatística
IV.
Resultados
IV.1 Efeito da DXM
IV.2 Efeito da CFA
IV.3 Efeito da TAL
27
27
28
28
28
29
30
31
34
35
35
36
38
38
39
40
V.
Discussão
46
VI.
Conclusões
59
VII.
Referências
61
xvi
RESUMO
O Ensaio do Linfonodo Popliteal (ELP) é usualmente empregado como teste
preditivo da capacidade de indução de reações auto-imunes por xenobióticos. Estudos
adicionais (e.g. com a ciclosporina A) sugerem que com pequenas modificações, o ELP
pode ser também aplicado como ensaio preditivo de imunossupressão induzida. No
presente estudo, investigamos se o ELP modificado é realmente sensível para este tipo de
detecção. Ratas Wistar (N=81) receberam injeção subcutânea de 5mg de clorpromazina
(CPZ) na pata posterior direita. A pata esquerda recebeu apenas veículo (salina). Cada
animal recebeu tratamento adicional com um dos agentes imunossupressores estudados,
i.e. dexametasona (DXM), ciclofosfamida (CFA) ou talidomida (TAL). Cada grupo
experimental foi comparado com um grupo controle tratado apenas com veículo. Sete dias
após o tratamento com CPZ, os linfonodos popliteais foram retirados e os índices
(direito/esquerdo) de peso (IP) e celularidade (IC) determinados. Os pesos de baço, fígado
e timo foram igualmente analisados. O aumento de IP (3,00±1,07) e IC (21,73±19,87)
induzido por CPZ foi inibido pela DXM nas doses de 1,0 mg/animal (IP:1,56±1,17 e
IC:2,20±2,73) e 0,2 mg/animal (IP:2,19±1,37 e IC:6,48±9,56). Animais tratados com
0,02mg DXM ou com CFA (10mg/animal) não apresentaram alterações estatisticamente
significativas de IP e IC, apesar de apresentarem drástica redução de peso de timo e baço.
TAL não induziu alterações de peso dos orgãos imuno-relacionados nem dos IP e IC.
Concluiu-se que o ELP não
foi
sensível para detectar o efeito dos agentes
imunossupressores aqui estudados, mesmo em doses em que sinais de toxicidade sistêmica
(e.g. atrofia de timo e baço) já eram evidentes. Portanto, o ELP não pode ser usado como
ensaio preditivo de reações imunossupressoras induzidas por xenobióticos.
xvii
ABSTRACT
The popliteal lymph node (PLN) assay is used as a predictive test for assessing the
autoimmunogenic potential of xenobiotics. However, a quite different potential application
of this assay is the rapid screening for immunosuppressive chemicals by assessing their
effects on the PLN response to a known antigen. In this work we investigated whether this
modified version of the PLN assay is really sensitive. Female Wistar rats (N=81) received
subcutaneous injection of CPZ (5mg/animal) into the right hind footpad. The contralateral
footpad was treated with saline only. All animals were additionally treated with an
immunosuppresive drug, i.e. dexamethasone (DXM), cyclophosphamide (CFA) or
thalidomide (TAL). Seven days after treatment with CPZ, the popliteal lymph nodes (PLN)
were removed, and the weight (WI) and cellularity (CI) indices (right/left) were
determined. The weights of spleen, liver and thymus were analyzed as well. The increase
on PLN induced by CPZ (WI=3.00±1.07 and CI=21.73±19.87) was inhibited by DXM on
doses
of
1mg/animal
(WI=1.56±1.17
and
CI=2.20±2.73)
and
0.2mg/animal
(WI=2.19±1.37 and CI=6.48±9.56). Animals treated with 0.02mg/animal did not show
statistically significant alterations (WI=2.81±1.50 and CI=8.76±5.87) when compared to
the control group. All animals exposured to DXM (0.02; 0.2 or 1mg/animal) and CFA
(10mg/animal) have shown a drastic reduction on thymus and spleen relative weights. CFA
and TAL (10mg/animal) did not induce alterations on WI and CI. Our data show that the
PLN assay is not sensitive for the detection of immunosuppressive effects, even when
systemic toxicity (i.e. thymus and spleen atrophy) is already evident. Therefore, the PLN
assay cannot be used as a predictive assay of induced immunossupression.
1
I. INTRODUÇÃO
I.1 Imunotoxicologia
Imunotoxicologia é a ciência que estuda a ação deletéria de xenobióticos sobre o
sistema imune. Sendo um dos ramos mais recentes da toxicologia, esta ciência teve seu
início relacionado ao cenário clínico da década de 1960. Neste período observa-se a
introdução e ampla utilização de potentes drogas imunossupressoras, resultando nas
primeiras descrições de efeitos adversos causados por estes novos tratamentos e,
consequentemente, estimulando o interesse pela área de imunossupressão induzida por
xenobióticos.
Assim sendo, a introdução da terapia imunossupressora foi um marco importante
que contribuiu não somente no progresso do campo de transplantes de orgãos, mas também
colocou em evidência os efeitos adversos induzidos por substâncias imunossupressoras,
gerando a preocupação com a possibilidade de que condições semelhantes de
imunossupressão pudessem ser acidentalmente induzidas via exposição ocupacional ou
ambiental. Isso fez com que nas décadas de 1970 e 1980, imunologistas e toxicologistas
trabalhassem juntos na busca de estratégias para a avaliação não-clínica de
imunotoxicidade. O produto final do esforço destas duas áreas foi o desenvolvimento de
alguns modelos preditivos de imunossupressão induzida. Neste período, várias substâncias
(entre elas, medicamentos, aditivos alimentares, pesticidas etc.) foram avaliados quanto ao
seu potencial imunossupressor, enquanto outros aspectos menos estudados, porém de igual
importância, e.g. indução de hipersensibilidade e auto-imunidade, foram posteriormente
avaliados (Tabela 1).
2
Tabela 1: Funções do sistema imune e possíveis reações inadequadas induzidas por
xenobióticos.
Reação inadequada
Função
Defesa
Homeostasia
Imunovigilância
Natureza do
estímulo
Exógeno
Exemplo
Microorganismo
Endógeno ou
Exógeno
Remoção de
células danificadas
Endógeno ou
Exógeno
Remoção de
células mutantes
Exacerbada
Ineficaz
Hipersensibilidade
Imunodeficiência
Autoimunidade
...
Transformação malígna
...
Segundo Bellanti, 1991
Hoje, há diversos meios de se avaliar a indução de imunossupressão, entre eles,
testes relacionados à imunidade não-específica (atividade das células natural killer (NK),
fagocitose, etc), à imunidade humoral (e.g. ensaio das células formadoras de placa,
proliferação de células B, etc) ou relacionados à imunidade mediada por células T
(proliferação in vitro ou in vivo). Estas avaliações, via de regra, acompanham testes de
toxicidade crônica, em que os animais são submetidos a longo período de exposição ao
xenobiótico em questão, e então avaliados por meio dos testes acima relacionados. Tais
estudos, além de longos, são bastante complexos. Freqüentemente envolvem mão de obra
especializada, um grande número de animais, reagentes e sistemas caros, e ainda, devido a
longa duração da exposição, representam um investimento alto na manutenção dos animais
em teste.
Diante disso, observa-se uma preocupação crescente com o desenvolvimento e
aperfeiçoamento de novos modelos que apresentem potencial preditivo para a avaliação de
risco em imunotoxicologia. Tais modelos devem ser mais simples e contribuir num
primeiro momento para a avaliação de risco de xenobióticos, permitindo uma análise
inicial sobre o potencial imunomodulador de determinada substância e, desta forma
3
direcionando estudos posteriores mais complexos. Tais modelos atenderiam às
necessidades rotineiras de avaliação de segurança e teriam aplicação importante, por
exemplo, em estudos pré-clínicos de novos produtos. É neste contexto que o Ensaio do
linfonodo popliteal (ELP) encontra aplicação.
I.2 Imunossupressão
Uma das funções essenciais do sistema imunológico é a defesa contra a infecção.
Crianças nascidas com um defeito numa área crítica desse sistema sofrem infecções
contínuas e, em muitos casos, dependendo do grau de comprometimento dos componentes
imunológicos afetados ao nascimento, podem vir a morrer se não houver acesso à
tecnologia médica avançada. A habilidade do organismo em responder de forma
específica, flexível e mais eficaz à invasão de agentes estranhos ao organismo está
filogeneticamente associada ao aparecimento dos vertebrados. Enquanto animais inferiores
possuem os chamados mecanismos imunológicos inatos ou inespecíficos, tais como a
fagocitose, animais superiores desenvolveram uma resposta imunológica adaptativa ou
adquirida. A característica fundamental de componentes do sistema imune adaptativo,
presente em vertebrados é a habilidade desenvolvida por membros deste filo no
reconhecimento daquilo que não é próprio e na destruição/eliminação subseqüentemente
do corpo estranho que pode representar risco ao organismo. Os mecanismos específicos de
resistência do hospedeiro (memória, especificidade e capacidade de discriminar entre o que
lhe é próprio e não-próprio) conferem aos organismos superiores importantes vantagens.
Entretanto, esta reatividade imunológica contra agentes estranhos ao organismo
pode estar comprometida em diversas situações. Um exemplo é o acometimento de
4
determinados indivíduos com conhecida predisposição genética para imunodeficiências
específicas. A doença de Brutton (ou agamaglobulinemia ligada ao sexo), a deficiência
isolada da IgA, a síndrome de DiGeorge (hipoplasia tímica), a imunodeficiência
combinada grave (de células T e B), a síndrome de Wiskott-Aldrich (imunodeficiência
com trombocitopenia), a síndrome do linfócito exposto, a deficiência de proteína de adesão
leucocitária e as deficiências genéticas do sistema complemento são os exemplos deste
grupo de doenças, comumente conhecidas como imunodeficiências primárias (Rey, 1999)
e relacionadas a erros genéticos que afetam a imunidade específica (humoral ou celular) ou
os mecanismos imunológicos inespecíficos do hospedeiro (i.e. mediados por proteínas do
sistema complemento e células como os fagócitos e as células NK). As manifestações
clínicas e o tratamento proposto para cada tipo de imunodeficiência primária dependem
fortemente do componente do sistema imune por ela afetado. Assim sendo, não causa
espanto a constatação de que as deficiências genéticas do sistema complemento, por
exemplo, possam predispor o paciente a infecções piogênicas, ou seja, aquelas usualmente
causadas por bactérias que só são fagocitadas com sucesso após opsonização (papel do
complemento). Por outro lado, pacientes acometidos com deficiência seletiva de células T,
e.g. síndrome de DiGeorge, apresentam vulnerabilidade a um padrão acentuadamente mais
abrangente de infecções, sendo suscetíveis a aqueles vírus e fungos, que em indivíduos
imunocompetentes seriam erradicados por componentes da imunidade do tipo celular. De
um modo geral pode-se dizer que o estudo dos casos de imunodeficiência primária vem
contribuindo muito para ampliar os conhecimentos sobre imunologia, tendo revelado as
causas precisas de grande número de enfermidades devidas a erros genéticos.
Entretanto, erros genéticos não são os únicos fatores que podem levar ao
comprometimento de componentes do sistema imune. Também a presença de
5
determinados fatores exógenos pode induzir o aparecimento de imunodeficiências. A
imunidade de tipo celular, por exemplo, pode estar comprometida em indivíduos
desnutridos. A deficiência de ferro é particularmente importante neste contexto. Por outro
lado, animais e pacientes humanos obesos mostram alterações em vários componentes da
resposta imune, incluindo citotoxicidade, atividade das células NK e capacidade de
fagócitos em destruir bactérias e fungos (Roitt et al., 1999). A imunossupressão é uma
característica universal da infecção parasitária e compromete tanto as respostas mediadas
por anticorpo como as mediadas por células. Com certa freqüência, infecções virais estão
igualmente associadas à presença de imunodeficiência secundária. O sarampo no homem, a
doença de Newcastle em aves e a peste bovina no gado são exemplos de condições
patológicas associadas à imunossupressão, que nestes casos tem sido atribuída a um efeito
citotóxico direto do vírus sobre as células linfóides (Roitt, 1989). Enquanto alguns vírus e
outros agentes infecciosos (e.g. larvas jovens de T. spiralis liberam um fator solúvel
linfocitotóxico) podem causar rompimento das células ou dos tecidos linfóides
diretamente, muito da supressão pode resultar da interferência com a função macrofágica.
Na hanseníase lepromatosa e na infecção malárica há provas de uma restrição na
reatividade imunológica, imposta por uma distorção nas vias de tráfego normal dos
linfócitos e, em última análise, a função dos macrófagos parece também ser aberrante.
Fatores plasmáticos de pacientes com sífilis secundária bloqueiam in vitro a transformação
de linfócitos de indivíduos normais pela fitoemaglutinina e podem ser os responsáveis pela
redução geral da imunidade do tipo celular observada nesta doença.
Muitos agentes, tais como raio X, drogas citotóxicas e os corticosteróides, embora
freqüentemente empregados como agentes terapêuticos num contexto não-imunológico,
podem não obstante, ter efeitos adversos severos sobre componentes do sistema imune.
6
I.3 Complicações decorrentes de imunossupressão
A imunossupressão, sobretudo quando prolongada, pode acarretar em danos
estruturais e/ou funcionais com conseqüências irreversíveis ao organismo. Alguns agentes
imunossupressores são tóxicos para várias células, além de apresentarem o potencial de
ativar infecções latentes e aumentar muito a susceptibilidade à infecções sérias, tais como
aquelas provocadas por fungos, bactérias e vírus prevalecentes e que ordinariamente
apresentam pouca patogenicidade (e.g. Candida, Nocardia, citomegalovírus, herpesvírus).
Além disso, indivíduos submetidos a terapias que induzem imunossupressão crônica, assim
como os que possuem imunodeficiências congênitas, apresentam um aumento de
incidência de vários tipos de cânceres, especialmente linfomas e retículo-sarcomas.
Embora haja uma incidência elevada de tumores em pacientes imunossuprimidos, o
aumento mais drástico ocorre em tumores associados aos vírus oncogênicos (Tabela 2). Tal
constatação apoia o conceito de que a vigilância imunológica provavelmente atue mais
eficientemente contra os vírus do que contra os tumores (Roitt et al., 1999).
Tabela 2: Incidência de tumores em indivíduos com imunodeficiência.
Causa da imunodeficiência
Imunodeficiência congênita
Imunossupressão por
transplante de órgãos
ou por AIDS
Tipos de tumores
Vírus envolvidos
Linfoma
EBV
Linfoma
Câncer cervical
Câncer de Pele
Hepatoma
Sarcoma de Kaposi
EBV
Papilomavírus
Papilomavírus (?)
Vírus da Hepatite B
Herpes vírus humano 8
Segundo Roitt et al., 1999
7
I.4 Terapia Imunossupressora
Somando-se ao interesse em relação à investigação dos efeitos adversos mediados
por substâncias imunossupressoras; há um forte ímpeto pelo desenvolvimento de novos
fármacos e de esquemas de tratamentos mais seguros e eficazes para a realização de
transplantes de órgãos bem sucedidos e tratamento de muitas doenças provocadas por
respostas imunológicas aberrantes.
No decorrer das duas últimas décadas, houve considerável progresso na
identificação de compostos capazes de produzir inibição inespecífica , ou seja, inibição da
resposta imunológica independente de qual antígeno a inicia (Roitt et al., 1999). Com base
em experimentos realizados com estes compostos em animais, descobriu-se que a resposta
imunológica primária é mais facilmente inibida que uma reação secundária ou
anamnéstica, ou seja, fármacos eficazes na supressão da resposta imune em animais não
sensibilizados, geralmente só exibem atividade inibidora mínima no animal já
sensibilizado. Além disso, a eficácia de um agente imunossupressor numa resposta
primária depende fortemente do momento de sua administração em relação ao estímulo
antigênico inicial. Com isso, agentes imunossupressores inespecíficos dividem-se em três
grupos:
I.
Este grupo inclui formas de tratamento que exercem atividade imunossupressora
máxima quando o fármaco é administrado imediatamente antes do antígeno, sendo
menos eficaz quando utilizado após o estímulo imunológico. Neste grupo estão
incluídos os corticosteróides, a irradiação e a citotoxina ciclo-inespecífica mostarda
nitrogenada;
8
II.
Este grupo inclui fármacos que só possuem atividade imunossupressora quando
administrados imediatamente após o estímulo antigênico. Incluem-se aqui os
agentes citotóxicos azatioprina (AZP) e o metrotexano (MTX);
III.
Este grupo inclui fármacos que exibem atividade inibidora quando administrados
tanto antes quanto após a estimulação antigênica, entretanto possuem maior
atividade imunossupressora após estímulo antigênico. A ciclofosfamida (CFA)
constitui o principal agente imunossupressor deste grupo.
I.4.1 Corticosteróides
Os corticosteróides são hormônios esteróides amplamente utilizados para suprimir
as manifestações de diversas reações inflamatórias e imunológicas. As pesquisas clínicas,
porém, têm sido quase sempre um tanto confusas devido à dificuldade em reconhecer as
diferenças na suscetibilidade à lise de línfócitos induzida por esteróides nas diferentes
espécies de animais estudadas (Stites et al., 2000).
Sabe-se que em camundongos, coelhos e ratos, estes hormônios provocam extensa
destruição linfocitária (Burns et al., 1996), enquanto linfócitos normais de cobaias,
macacos e seres humanos mostram-se altamente resistentes à lise. Entretanto, nem todos os
linfócitos humanos são resistentes à lise induzida por esteróides. Estes hormônios destroem
eficazmente as células da leucemia linfoblástica aguda e exercem efeitos citolíticos
moderados sobre as células B neoplásicas na leucemia linfocítica crônica e nos linfomas
não-Hodgkin.
9
Um dos efeitos mais importantes dos corticosteróides consiste em alterar
transitoriamente o número de leucócitos circulantes (Figura 1). Observa-se neutrofilia,
podendo esta ser provocada por duas vias distintas: i. a liberação de neutrófilos maduros
das reservas medulares e/ou, ii. a redução da saída de neutrófilos dos espaços
intravasculares para exsudatos inflamatórios, com conseqüente aumento da meia-vida dos
neutrófilos circulantes.
Figura 1: Efeito de corticosteróides sobre o número de leucócitos circulantes.
Segundo Stites et al., 2000
Em contraste com a neutrofilia induzida por corticosteróides, observa-se acentuada
linfopenia. Este efeito resulta do seqüestro das células linfóides recirculantes para os
tecidos linfóides, incluindo a medula óssea. As células T circulantes são as mais afetadas,
10
seguindo-se de uma redução moderada de células B. Entre as subpopulações de células T,
há uma maior vulnerabilidade de células CD4+ em relação a células CD8+.
Monocitopenia, via de regra pronunciada, é uma das importantes alterações
causadas por esteróides. A reduzida disponibilidade destas células foi considerada de suma
importância no processo antiinflamatório mediado por esteróides. Verifica-se também uma
redução no número de eosinófilos e basófilos circulantes, entretanto sem significado
funcional conhecido até o momento.
Além de alterar a distribuição de diferentes populações celulares, os
corticosteróides alteram importantes funções de linfócitos e monócitos. A atividade de
linfócitos T é consideravelmente afetada. As respostas linfoproliferativas in vitro são
inibidas; em parte devido a uma redução na síntese de interleucina-2 (IL-2), essencial para
a extenção clonal dos linfócitos ativados. A menor disponibilidade de IL-2 constitui,
provavelmente, o resultado indireto da produção suprimida de IL-1 pelos monócitos
(Figura 2).
Corticosteróides exercem efeitos menores sobre linfócitos B. Pacientes tratados
com doses moderadas de prednisona são capazes de responder normalmente a antígenos.
Entretanto, a corticoterapia em altas doses reduz moderadamente as concentrações séricas
de IgG e IgA. Células NK e efetores da citotoxicidade mediada por anticorpo (ADCC –
Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) não são significativamente alteradas por
corticosteróides.
11
Figura 2. Efeito de corticosteróides e da ciclosporina sobre a produção de interleucinas.
Segundo Stites et al., 2000
Em relação aos monócitos e macrófagos, os corticosteróides suprimem as
atividades bactericidas desta linhagem celular, reduzindo a fagocitose e a resistência do
hospedeiro à infecção. Além disso, os corticosteróides também interferem na função destas
células como apresentadoras de antígeno. Outros efeitos observados incluem: i. bloqueio
da diferenciação de monócitos em macrófagos, ii. diminuição da migração dirigida em
resposta a fatores quimiotáticos e iii. supressão da capacidade de monócitos de
apresentarem receptores de Fc e do complemento, dificultando ainda mais suas atividades
fagocíticas.
Atualmente, sabe-se que uma das principais atividades dos corticosteróides parece
ser mediada pela diminuição da função do fator nuclear de transcrição Kapa B (NF-kB),
que é um regulador comum de genes de diferentes citocinas e moléculas de adesão celular.
Um
mecanismo
recém-descrito
passível
de
contribuir
para
as
propriedades
imunossupressoras dos corticosteróides consiste na ligação direta destes hormônios ao NF-
12
kB, impedindo a sua entrada no núcleo. Entretanto, há um segundo mecanismo que parece
ser ainda mais importante. No citoplasma das células ainda não estimuladas, o NF-kB ligase a uma segunda proteína IkBα, fosforilando-a. Então, após ser liberado, o NF-kB é
translocado para o núcleo, onde ativa genes produtores de muitas citocinas. Os
corticosteróides parecem aumentar a transcrição do gene que controla a IkBα, resultando
em aumento de sua concentração citoplasmática — uma situação que promove a sua
ligação ao NF-kB. Consequentemente, há uma menor quantidade disponível para penetrar
no núcleo e iniciar a transcrição dos genes das citocinas (Figura 3).
Em suma, os corticosteróides em doses farmacológicas são capazes de inibir com
eficácia um espectro de manifestações clínicas associadas a doenças imunologicamente
mediadas. Seus efeitos benéficos resultam de uma associação das atividades
imunossupressoras e antiinflamatórias inespecíficas que em numerosas circunstâncias
podem salvar a vida do paciente.
Entretanto, os corticosteróides apresentam efeitos adversos severos quando
utilizados em altas doses e/ou em tratamentos prolongados. Nestes casos as manifestações
clínicas incluem: a supressão das supra-renais (pela supressão da secreção do hormônio
ACTH), efeitos metabólicos (inibição do crescimento, diabetes, osteoporose), retenção de
sal e, até mesmo, psicoses (Katzung & Trevor, 1995). Contudo, as combinações
farmacológicas contendo esteróides mostram-se extremamente úteis para suprimir as
reações de rejeição de transplantes, bem como para inibir as manifestações das doenças
auto-imunes (Stites et al., 2000).
13
Figura 3. Efeito de corticosteróides sobre a transcrição gênica de citocinas.
Segundo Stites et al., 2000
A dexametasona (DXM) foi o corticosteróide de escolha do presente trabalho.
DXM é um exemplo de corticosteróide sintético com mecanismos de ação idênticos ao do
cortisol (ou hidrocortisona), que é o mais importante corticosteróide natural produzido pelo
córtex da glândula supra-renal. A DXM quando comparada ao cortisol apresenta as
seguintes propriedades:
1.
maior potência antiinflamatória,
2.
meia-vida e tempo de ação prolongados,
3.
redução dos efeitos de retenção de sal,
4.
melhor atividade tópica (Katzung & Trevor, 1995), e
5. maior efeito miopático, caracterizado por dores e um certo grau de atrofia
muscular causado pelo flúor presente em sua composição (Silva, 1994).
14
I.4.2 Agentes citotóxicos
Os agentes citotóxicos constituem um grupo de substâncias químicas com
propriedade farmacológica de destruir células capazes de auto-replicação, entre elas
linfócitos imuno-competentes. Estes fármacos foram originalmente introduzidos na
medicina clínica como agentes anti-neoplásicos em 1959. Contudo, estudos posteriores
revelaram que muitos destes fármacos possuem também atividade imunossupressora e por
conseguinte, seu uso foi ampliado para o tratamento de doenças do tipo auto-imune e na
inibição de reações de rejeição a transplantes.
Os agentes citotóxicos não são seletivamente tóxicos para os linfócitos e podem
afetar, em graus variáveis, todas as células imunologicamente competentes, resultando em
supressão generalizada do sistema imunológico e, consequentemente tornando os pacientes
tratados mais suscetíveis a infecções oportunistas, bem como a certas neoplasias (Stites et
al., 2000).
As atividades linfocitotóxicas dos diferentes agentes citotóxicos podem estar
relacionadas com suas toxicidades para células em fases específicas do ciclo mitótico
(Figura 4). Os grupos de fármacos que incluem a AZP e o MTX são denominados “faseespecíficos”, pois são citolíticos para as células apenas quando estas se encontram na fase
S (síntese de DNA). A CFA e o clorambucil são classificados como “ciclo-específicos”,
pois são tóxicos para as células em todas as fases do ciclo mitótico, incluindo linfócitos na
fase intermitótica (G0). Entretanto, o grupo de fármacos “ciclo-específicos” exibem
atividades catalíticas diferenciais, sendo mais tóxicos para as células que ativamente se
encontram no ciclo celular do que para células em repouso (G0). Já o terceiro grupo de
15
substâncias, constituído pelos agentes “ciclo-inespecíficos”, é igualmente citotóxico para
as células tanto em repouso como em mitose. A radiação é considerada uma modalidade
terapêutica “ciclo-inespecífica”.
Figura 4. Fases do ciclo mitótico.
Segundo Stites et al., 2000
Segundo Stites et al., 2000
Como se sabe, os eventos celulares associados a um estímulo antigênico podem ser
subdivididos em fase de indução e fase estabelecida ou efetora (Figura 5). A primeira
refere-se ao intervalo entre a exposição ao antígeno e a produção de células T
sensibilizadas ou de plasmócitos maduros, caracterizando-se pela rápida expansão
proliferativa de precursores sensíveis ao antígeno. Posteriormente, a reação passa para uma
fase estabelecida. Os agentes citotóxicos são, em sua maioria, eficazes quando o período de
administração coincide com a fase de indução, tornando-se consideravelmente menos
ativos quando administrados na fase estabelecida da resposta imune.
16
Figura 5. Eventos celulares associados a um estímulo antigênico: fase de indução e fase
estabelecida ou efetora.
Segundo Stites et al., 2000
Segundo Stites et al., 2000
A CFA foi o agente citotóxico utilizado neste trabalho. Sabe-se que tanto em nível
experimental
quanto
clínico,
este
fármaco
ciclo-específico
é
um
importante
imunossupressor linfocitotóxico. Pode, porém, apresentar uma alta toxicidade: depressão
da medula óssea, reações gastrointestinais, cistite hemorrágica, esterilidade, malformações
congênitas, alopecia, infecções oportunistas, neoplasias (linfoma, carcinoma da bexiga,
leucemia mielógena aguda), síndrome de Goodpasture, entre outros (Silva, 1994).
A CFA parece causar supressão mais pronunciada das respostas humorais do que
aquelas atribuídas a reações celulares (Burns et al., 1996). Seus efeitos sobre os
componentes da resposta imune celular são extremamente variáveis. A CFA pode
17
prolongar a sobrevida de enxertos cutâneos alogênicos quando administrada após o
enxerto. Entretanto, quando utilizada antes do transplante, constitui um potente
intensificador imunológico, fato que tem sido atribuído, em parte, a uma maior toxicidade
para células T supressoras do que para linfócitos T auxiliadoras (Stites et al., 2000).
Alguns estudos clínicos sugerem que os efeitos sobre diferentes subpopulações de
linfócitos é altamente dependente da dose da CFA administrada. Assim, doses baixas de
CFA causam depleção primária das células B e de linfócitos CD8+, enquanto doses mais
altas resultam em redução semelhante no número total de linfócitos CD4+ e CD8+ (Stites
et al., 2000).
A CFA é um agente alquilante da classe das mostardas nitrogenadas, que foram
utilizadas na quimioterapia do câncer a partir de 1942 (Chabner et al., 1996). Este fármaco,
assim como outros agentes alquilantes, necessita de ativação metabólica prévia para
exercer seus efeitos terapêuticos. As enzimas citocromo P450 hepáticas participam da
biotransformação da CFA gerando mostarda fosforamida, acroleína e outros metabólitos
farmacologicamente ativos e citotóxicos. Em ratos, a CFA é metabolizada principalmente
por isoenzimas CYP2B1, com participação significativa de CYP2C6 e CYP2C11. Em
humanos, a ativação ocorre, sobretudo, por CYP2B6, com participação de CYP2A6, -2C8
e –2C9 (Chang et al., 1993). Tanto no homem como em animais, a ativação da CFA pelos
citocromos P450 parece ser a principal via de metabolização deste xenobiótico, apesar de
existir evidências de sua ativação por outras enzimas em outros órgãos (Smith & Kehrer,
1991).
18
Após sua metabolização, os efeitos citotóxicos da CFA são primariamente devidos
a sua capacidade de ligar-se a cadeias de DNA e efetuar ligações cruzadas. Porém, a CFA
também pode reagir e consequentemente alterar a função de outras moléculas
intracelulares. A atividade alquilante no DNA pode resultar em morte imediata da célulaalvo, ou lesão letal expressa durante a divisão mitótica seguinte. Nesta última
circunstância, a célula lesada pode funcionar normalmente na fase intermitótica (G0). Por
outro lado, se for possível reparar o DNA, a célula pode sobreviver funcionando
normalmente (Figura 6).
Figura 6. Efeito da ciclofosfamida sobre filamentos de DNA de linfócitos.
Segundo Stites et al., 2000
19
I.4.3 Talidomida
Talidomida (TAL) é uma droga sintética derivada do ácido glutâmico desenvolvida
por Grünental. TAL é conhecida comercialmente como Contergan na Alemanha, como
Distaval na Inglaterra, como Softenol em Portugal e como Kevadon nos Estados Unidos
(apesar de nunca ter sido comercializada neste país devido a certos efeitos colaterais
neurológicos que haviam sido divulgados).
TAL tornou-se extremamente popular como sedativo e tranqüilizante quando
introduzida no mercado europeu, principalmente na Alemanha Ocidental, no final da
década de 1950. Entretanto, no início da década de 1960, um número crescente de bebês
com deformações congênitas, i.e. apresentando severas malformações nas extremidades
dos membros (focomelia), nasceram de mães que haviam recebido TAL no primeiro
trimestre da gravidez (Taussing, 1962). Diante desta constatação, TAL foi prontamente
retirada do mercado europeu; e desde então, testes para avaliação do caráter teratogênico,
realizados em duas espécies (incluindo testes em primatas), tornaram-se obrigatórios na
análise pré-clínica de novos medicamentos.
Em meados de 1965 surgiram os primeiros relatos de que TAL poderia exercer um
rápido efeito benéfico em pacientes leprosos que apresentavam lesões de pele
caracterizadas pela infiltração de nódulos sensíveis e eritematosos (eritema nodoso
hansênico); sugerindo um possível efeito imunossupressor mediado por este fármaco
(Sheskin, 1965). Desde então, grupos de pesquisadores e clínicos têm publicado um
número crescente de artigos científicos sobre o valor do tratamento com TAL em doenças
como a artrite reumatóide, fotodermatite, hanseníase, síndrome de Behcet, lupus
20
eritematoso sistêmico (LES) e outras condições dermatológicas que não respondem
adequadamente à terapia convencional (Randall, 1990).
Em 1985 foram relatados os primeiros testes com TAL no tratamento e na
prevenção da doença enxerto-versus-hospedeiro (EVH), a mais importante causa de morte
após o transplante de medula óssea (Vogelsang et al., 1986). Como resultado destes testes,
conclui-se que TAL é extremamente eficaz no tratamento e na profilaxia das reações do
EVH.
Posteriormente, pesquisadores da “Johns Hopkins Medical Institutions” em
Baltimore utilizaram experimentos com técnicas de imunofluorescência para melhor
elucidar os efeitos da TAL no sistema imune (Randall, 1990). Estes estudos revelaram que
TAL liga-se menos avidamente aos linfócitos T auxiliadoras do que aos linfócitos T
supressores e citotóxicos, como visto com outras drogas imunossupressoras, i.e. a
ciclosporina A (CCL). Paradoxalmente, é este modelo de ligação que efetivamente suprime
a atividade dos linfócitos T auxiliadores; permitindo, ao mesmo tempo, o desenvolvimento
dos linfócitos T supressores e citotóxicos - células que exibem um papel crítico na
manutenção da doença EVH controlada, permitindo uma boa tolerância ao transplante.
Ainda hoje, os mecanismos de ação de TAL sobre o sistema imune não são
totalmente elucidados; contudo, estudos conduzidos por Keenan e colaboradores (Keenan
et al., 1991) demostram que esta droga inibe de forma dose-dependente a proliferação de
linfócitos in vitro e confirmam seus efeitos aditivos quando utilizada em combinação com
CCL (Hess et al., 1988). Sabe-se, também, que TAL suprime a produção de citocinas,
21
corroborando para efetividade do tratamento profilático da doença EVH (Abbas et al.,
1997).
É importante ressaltar que as terapias com TAL, utilizadas sobretudo no tratamento
de eritema nodoso hansênico ou após transplante de medula óssea não são empregados em
mulheres em idade fértil (Randall, 1990). Em relação aos seus efeitos adversos, o
tratamento com este fármaco pode apresentar: tontura, ressecamento das mucosas,
obstinação, urticária, edema unilateral dos membros inferiores ou superiores, neurite com
sensação de queimor nas palmas (Silva, 1994); porém sem maiores complicações se
comparados com muitos dos efeitos tóxicos mediados por esteróides e outros tratamentos
para a doença EVH (Randall, 1990). A TAL foi o terceiro e último agente imunossupressor
utilizado no presente estudo.
1.5 Ensaio do Linfonodo Popliteal
O ELP foi inicialmente desenvolvido com a finalidade de quantificar uma reação
EVH local (Ford et al., 1970). Ele surgiu a partir da observação de que, quando em uma
das patas determinadas doses de células linfóides são administradas por via subcutânea
(s.c.), o linfonodo popliteal mais próximo apresenta grande aumento de peso. Já o
tratamento com células singênicas na pata oposta não induz alteração significativa neste
órgão linfóide. Com este ensaio tornou-se possível a observação de que quanto maiores as
disparidades entre os locus do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) entre
animais, mais severa é a reação local do linfonodo popliteal. Por esta razão, durante alguns
anos da década de 1970, o ELP foi unicamente empregado com a finalidade de quantificar
22
o fator de imunização entre ratos de diferentes cepas, medido através da atividade da
reação EVH (Bonney & Feldbush, 1973).
Somente em 1976, a partir da comparação entre sinais clínicos observados em
reações EVH e os efeitos adversos induzidos pelo anticonvulsivante difenilhidantoina
(DPH), Gleichmann & Gleichmann (1976) propuseram que em ambas as situações, a
patogênese produzida era bastante semelhante. Sintomas como hiperplasia linfóide,
hipogamaglobulinemia e reações adversas na pele e pulmões, foram descritos em ambas as
patologias. Em 1981, após injeção s.c. de DPH em roedores, Gleichmann induziu aumento
de peso e alterações locais do linfonodo popliteal semelhantes àquelas observadas após
injeção de células linfóides por Ford (1970), confirmando assim sua hipótese inicial de que
mecanismos semelhantes aqueles observados na reação EVH estariam envolvidos na
reação local provocada pela DPH.
O conceito proposto por Gleichmann (1981) começou a ganhar maior
credibilidade quando no final da década de 1980, em estudos realizados em camundongos
(Kamüller et al., 1989) e em ratos (Verdier et al., 1990) cerca de 70 compostos foram
testados no ELP. Com estes estudos, portanto, tornou-se possível concluir que a grande
maioria de xenobióticos – senão todos – que no homem estão claramente associados à
indução de reações auto-imunes, quando aplicadas por via s.c. em uma das patas
posteriores de roedores, induzem aumento de peso e celularidade do linfonodo popliteal.
(Figura 7). Por outro lado, xenobióticos, que nunca foram descritos como possíveis
indutores de auto-imunidade em humanos, são negativas neste ensaio. Este foi o ponto de
partida para a utilização do ELP como ensaio preditivo de reações auto-imunes provocadas
por xenobióticos.
23
Simultaneamente a utilização do ELP como ensaio preditivo de auto-imunidade
induzida, alguns autores propuseram uma versão modificada deste ensaio. Nesta versão, o
ELP teria aplicação bem diferente da descrita acima, e seria utilizado para avaliar o
potencial imunossupressor de xenobióticos. Neste caso, a substância a ser testada quanto
ao seu potencial imunossupressor é administrada repetidamente pela via de interesse, i.e. a
via preconizada para uso humano, antes e/ou após a administração de um estímulo
antigênico. O estímulo antigênico pode ser de natureza biológica i.e. células de outros
animais ou drogas sabidamente positivas no ELP (e.g. clorpromazina (CPZ), DPH,
carbamazepina (CAB), estreptozotocina (EST) etc.). De acordo com estudos anteriores
(Gleichmann & Gleichmann, 1990; Korte et al., 1990 e Schorlemmer et al., 1998 e 1999)
drogas com potencial imunossupressor podem inibir de forma seletiva o aumento do
linfonodo popliteal induzido por estes agentes imunogênicos.
Figura 7. Aumento do linfonodo popliteal induzido por clorpromazina.
PE
PD
12X
PD: linfonodo da pata direita; PE: linfonodo da pata esquerda; 12X: aumento de doze12X
vezes
em microscópio estereoscópico Stemi SV11 (Zeiss, Alemanha).
24
Desde o início da década de 1990, o ELP modificado vem sendo utilizado para
avaliar o potencial imunossupressor de diversas substâncias. Entre elas:
1. drogas
sabidamente
imunossupressoras,
como
CCL
(Gleichmann
&
Gleichmann, 1990), CFA (Korte et al., 1991), hidrocortisona, DXM,
mometasona e FK506 (Homey et al., 1997),
2. drogas imunossupressoras de nova geração (anti-reumática), como metabólitos
da leflunomida: malononitrilamidas (Schorlemmer et al., 1998) e A771726
(Schorlemmer et al., 1999), e
12X
3.
poluentes ambientais (Vos et al., 1973 e Korte et al.,1990 e 1991), tais como
2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-dioxina (TCDD).
1.6 Importância do trabalho
Os casos descritos no item 1.3 retratam a morbidade e letalidade que podem
estar associadas à imunossupressão induzida por xenobióticos e reiteram a importância do
desenvolvimento de ensaios preditivos para essas condições.
O ELP é um ensaio simples, de baixo custo e que segundo alguns autores (Bloksma
et al., 1995 e Goebel et al., 1996), representa um modelo eficaz na identificação da ação
imunosupressora da CFA e outras drogas imunossupressoras. Entretanto, ao nosso ver, os
25
dados apresentados até o momento são insuficientes para que se consagre de forma
definitiva o ELP como ensaio preditivo de imunossupressão induzida, e além disso, são
controversos. Enquanto a maioria dos autores identificou substâncias imunossupressoras
por meio deste ensaio (Gleichmann & Gleichmann, 1990; Homey et al., 1997;
Schorlemmer et al., 1998 e 1999), outros foram incapazes de reproduzir o efeito
imunossupressor induzido no ELP modificado (Korte et al., 1991).
26
II. OBJETIVO
O objetivo do nosso estudo foi avaliar se o ELP poderia ser utilizado para
evidenciar a imunossupressão induzida por xenobióticos. Para isso, investigamos o efeito
de substâncias sabidamente imunossupressoras (i.e. DXM, CFA e TAL) sobre o aumento
do linfonodo popliteal induzido pela CPZ em ratos.
27
III. MATERIAL E MÉTODOS
III.1 Animais
Foram utilizadas ratas Wistar, com idade entre 7 e 11 semanas, originárias do
Centro de Criação de Animais de Laboratório/CECAL da FIOCRUZ. As ratas foram
fornecidas com 5 semanas de idade e, a partir de então, mantidas no Biotério do
Laboratório de Toxicologia da Faculdade de Veterinária da Universidade Federal
Fluminense, onde o experimento foi realizado.
Os animais foram distribuídos ao acaso em cada grupo experimental e alojados
individualmente em gaiolas de plástico com tampa de aço inoxidável (33,5 x 40,5 x
17,0 cm) e cama de maravalha de pinho branco autoclavada.
III.2 Biotério
Durante o período de aclimatação e durante todo o experimento, foram fornecidas
água e ração comercial para ratos (Nuvilab - Nuvital Ltda., Curitiba, Paraná) ad libitum.
Todos os animais foram mantidos no biotério com os seguintes controles ambientais:
temperatura (23 ± 2oC), umidade relativa do ar (aproximadamente 70%) e ciclo claroescuro constante (período claro de 7 às 19 horas). As trocas das camas de maravalha, água
e ração foram feitas duas vezes por semana.
28
III.3 Fármacos e Reagentes
Os seguintes fármacos e reagentes foram usados neste estudo.
III.3.1 Controle positivo no ELP
• Clorpromazina
(10-H-Fenotiazina-10-propanamino, 2-cloro-N, N-dimetil-
monocloridrato ou 2-cloro- 10-[(3-dimetilamino-propil)] fenotiazina monocloridrato)
C17H19ClN2S.HCl
PM: 355,32
Temperatura ambiente
CAS: 69-09-0
Procedência: Farmanguinhos – FIOCRUZ
III.3.2 Agentes imunossupressores
• Dexametasona (21-fosfato sódico)
CH3
C20H25O4F
C
Lote: 993366
MS: 1.0235.0326
OH
HO
Temperatura ambiente
O
F
O
EMS Indústria Farmacêutica Ltda (Hortolândia, SP, Brasil)
CH3
29
• Ciclofosfamida (Genuxal®)
C7H15O2N2PCl2
O
CH2CH2Cl
P
Temperatura: ambiente
NH
MS: 1.2117.0025
N
CH2CH2Cl
O
ASTA Medica Ltda (São Paulo, SP, Brasil)
• Talidomida (Alpha ( N-phthalimido) glutarimida)
C13H10O4N2
O
Temperatura: ambiente
C
MS: 1.1209.0031.001-6
CEME (Fundação Ezequiel Dias)
N
C
O
III.3.3 Outros
• Óleo de Milho Mazola

Procedência: Refinações de Milho Brasil, Brasil
• Azul de Trypan (C123850; azul direto 14)
C34H24N60 14S4Na4
Pureza: 40%
PM: 960,8
CAS: 72-57-1
Sigma Chemical Co.
O
O
N
H
30
III.4 Preparo de soluções
Solução salina 0,9% (p/v)
•
Cloreto de sódio (NaCl) ------------------------------- 9g
Água q.s.p. ---------------------------------------- 1000 mL
Preparo no dia do uso
PBS ( solução tampão-fosfato) (pH 7,4)
•
-
Solução estoque:
Fosfato monobásico de sódio diidratado -------------2,89g
(NaH2PO4.2H2O)
Fosfato dibásico de sódio heptaidratado ------------22,49g
(NaHPO4.7H2O)
-
Solução final:
Solução estoque ------------------------------------------10 mL
Água destilada --------------------------------------------90mL
Ajustar pH em 7,4 (neutro), manter sob refrigeração de 2-5ºC
•
Azul de Trypan 0,5% (p/v)
Azul de Trypan ------------------------------------------- 1 g
PBS (solução final)-------------------------------------20 mL
Diluir 1:1 em solução final de PBS
Manter frasco protegido da luz a 2-5ºC
31
Solução Descontaminante (CFA)
•
KOH ------------------------------------------------------- 8 g
Metanol------------------------------------------------- 1000 mL
Manter no mínimo por 24 horas.
III.5 Desenho experimental
Este estudo foi realizado em três etapas, cada uma referente ao agente
imunossupressor estudado, i.e. DXM, CFA ou TAL.
Em todas as três etapas, a CPZ foi utilizada como agente indutor do aumento do
linfonodo poplietal. No dia do tratamento com CPZ, os animais foram pesados, alojados
em gaiolas individuais e incluídos aleatoriamente em cada um dos grupos experimentais.
Cada animal foi então anestesiado por inalação de éter etílico e recebeu injeção por via s.c.
na planta da pata posterior direita. A dose de CPZ utilizada em todas as etapas deste estudo
foi de 5mg/animal. O volume final da injeção foi de 50µL. A pata esquerda serviu como
controle, e nela foi injetado apenas veículo (salina fisiológica).
Após 24 horas e 7 dias do tratamento com CPZ, cada animal foi pesado e
submetido a exame clínico, visando a detecção de alterações externas. Os casos de edema e
eritema ou qualquer sinal de toxicidade sistêmica e/ou alteração comportamental foram
registrados.
Sete dias após o tratamento com CPZ, os animais foram sacrificados por inalação
de CO2. Cada animal foi colocado em decúbito dorsal e, através de uma incisão
32
longitudinal na região ventral dos membros posteriores, foram observadas alterações de
tamanho, consistência, localização e coloração dos linfonodos popliteais. O tecido adiposo,
que armazena o linfonodo popliteal, foi retirado e transferido para tubos eppendorf
devidamente identificados, contendo 500µL de solução de PBS (cerca de 4oC). As
amostras foram então levadas a um microscópio estereoscópico Stemi SV11 (Zeiss,
Alemanha) para que em um aumento de aproximadamente 12x, fossem separados o
linfonodo popliteal do tecido adiposo adjacente (Figura 7). Em seguida, os linfonodos
popliteais foram pesados e os valores obtidos foram expressos como índices de peso (IP),
calculados pela razão do peso do linfonodo da pata direita e o peso do linfonodo da pata
esquerda.
Então:
IP =
Peso do Linfonodo Popliteal Direito
Peso do Linfonodo Popliteal Esquerdo
Em seguida, os linfonodos popliteais foram individualmente homogeneizados
em homogeneizador de vidro, e as células ressuspendidas em volume final de 200µL de
PBS. Da suspensão celular obtida, 20µL foram transferidos para tubo eppendorf contendo
200µL (1:10) de solução de azul de trypan em PBS. Em seguida, aproximadamente 10µL
dessa amostra foi colocada em câmara de Neubauer (Superior, Alemanha) para contagem
das células ao microscópio óptico Axiolab (Zeiss, Alemanha) em aumento de 20X. O
número total de células por linfonodo popliteal foi calculado através da seguinte fórmula:
33
Nº de células/mL = fator de diluição x volume da suspensão celular x número de células
por câmara x 2,5.
O índice de celularidade (IC) foi obtido através da razão entre o número de
células do linfonodo direito e o número de células do linfonodo esquerdo.
Então:
IC =
No de células do Linfonodo Popliteal Direito
No de células do Linfonodo Popliteal Esquerdo
Foram considerados positivos (Vial et al., 1997), índices de peso maiores ou
iguais a 2 (IP ≥ 2) e/ou índices de celularidade maiores ou iguais a 5 (IC ≥ 5).
Além dos linfonodos popliteais, outros orgãos imuno-relacionados foram
examinados e pesados em cada um dos animais em teste. Para isso foi feita uma incisão
longitudinal na cavidade abdominal e torácica de cada animal logo após o sacrifício e
fígado, baço e timo foram retirados para posterior pesagem. O timo de cada animal foi
levado a microscópio estereoscópico (Stemi SV11 Zeiss, Alemanha) para que em um
aumento de aproximadamente 10x fosse separado do tecido adiposo adjacente. Então,
fígado, baço e timo foram pesados e os pesos relativos de cada um destes orgãos foram
calculados.
O esquema de tratamento empregado na avaliação do efeito imunossupressor da
DXM, CFA e TAL está resumido na Tabela 6 e se deu como segue:
34
III.5.1 DXM (Experimento 1)
No experimento 1 (realizado com DXM), os animais foram tratados em
intervalos de 48 horas por via intraperitoneal (i.p.) dois dias antes (dia -2), no dia do
tratamento com CPZ (dia 0) e 2 dias (dia +2), 4 dias (dia +4) e 6 dias (dia +6) após o
tratamento com CPZ (Tabela 6). Cada animal recebeu injeções de DXM nas doses de
0,02mg, 0,2 e 1,0 mg/animal/dia (Tabela 3). O grupo controle foi tratado com veículo
(PBS).
O volume de aplicação em todos os grupos foi de 500µL. A ocorrência de
qualquer sangramento durante ou após a aplicação foi registrada.
Tabela 3: Avaliação do efeito imunossupressor da dexametasona.
Grupos
Nº de animais
Controle
N=18
0,02 mg/animal/dia
(~0,1 mg/Kg/dia)
N=9
0,2 mg/animal/dia
(~1 mg/Kg/dia)
N=9
1 mg/animal/dia
(~5 mg/Kg/dia)
N=7
Total: 43 animais
35
III.5.2 CFA (Experimento 2)
No experimento 2, os animais foram tratados por via i.p. nos dias +1, +3 e +5 após
tratamento com CPZ (Tabela 6). Cada animal recebeu injeções de CFA na dose
10mg/animal/dia (Tabela 4). O grupo controle foi tratado com veículo (água destilada). O
volume de aplicação foi de 500µL. A ocorrência de qualquer sangramento durante ou após
a aplicação foi registrada.
Todo o material não descartável utilizado neste experimento foi exposto à solução
descontaminante.
Tabela 4: Avaliação do efeito imunossupressor da ciclofosfamida.
Grupos
Nº de animais
Controle
N=9
10 mg/animal/dia
(~50 mg/Kg/dia)
N=9
Total: 18 animais
III.5.3 TAL (Experimento 3)
No experimento 3, os animais foram tratados diariamente por via oral (v.o.) através
de entubação gástrica nos dias -1, 0, +1, +2, +3, +4, +5 e +6 (Tabela 6). Cada animal
recebeu TAL na dose de 50 mg/Kg/dia (Tabela 5). Os grupos controles foram tratados com
36
veículo (óleo de milho). O volume de aplicação foi de 5 ml/Kg/dia. Este volume variou de
800µL a 1200µL de acordo com as diferenças de pesos entre cada animal em cada dia de
tratamento.
Tabela 5: Avaliação do efeito imunossupressor da talidomida.
Grupos
Nº de animais
Controle
N=10
50 mg/Kg/dia
(~10 mg/animal/dia)
N=10
Total: 20 animais
III.6 Análise Estatística
A análise dos pesos relativos dos órgãos imuno-relacionados e dos IP e IC foi
realizada por testes não-paramétricos, i.e. o teste de Kruskal-Wallis seguido do teste U de
Mann-Whitney. Outros parâmetros foram avaliados pela análise de variância de um critério
(one-way), seguida pelo teste t de Student. Em todos os casos a diferença entre os grupos
foi considerada estatisticamente significativa quando p ≤ 0,05.
Os cálculos estatísticos foram realizados com o software MINITAB 10.5
(MINITAB Statistical SoftwareTM , Minitab Inc., PA, USA, 1995).
37
Tabela 6: Esquema de tratamento com dexametasona, ciclofosfamida e talidomida.
CPZ
(s.c.)
dias
DXM (i.p.)
0,02; 0,2 e
1,0mg/animal
-2
-1
0
+1
+2
+3
+4
+5
+6
ELP
X
X
CFA (i.p.)
10mg/animal
TAL (v.o.)
~10mg/animal
Sacrifício
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
+7
38
IV. RESULTADOS
Nesta seção serão apresentados os resultados obtidos na avaliação do efeito
imunossupressor da DXM, CFA e TAL sobre o aumento do linfonodo popliteal induzido
pela CPZ em ratos e sobre os pesos de baço, fígado e timo.
IV.1 Efeito da DXM
Animais tratados com CPZ na pata direita e que não receberam DXM por via i.p.
apresentaram um aumento de cerca de 3 vezes no peso do linfonodo popliteal direito (IP:
3,00 ± 1,07) – Tabela 7 e Figura 8. O número de células por linfonodo aumentou de 0,33
x106 no lado esquerdo (lado controle) para 3,55 x106 no lado direito (lado tratado com
CPZ). O IC deste grupo foi 21,73 ± 19,87.
O aumento induzido por CPZ tanto no peso (Tabela 7 e Figura 8) quanto na
celularidade do linfonodo popliteal (Tabela 8 e Figura 9) foi inibido pela DXM nas doses
de 0,2 e 1,0mg/animal. Tal inibição foi dose-relacionada e estatisticamente significativa
tanto quando analisamos os valores absolutos (e.g. peso e número de células dos
linfonodos dos lados direito e esquerdo) quanto após a análise de IP e IC.
Em contraste com as maiores doses estudadas, animais tratados com 0,02mg DXM
não apresentaram alterações estatisticamente significativas de IP e IC, apesar de termos
observado redução significativa do peso e da celularidade dos linfonodos popliteais.
39
Em todos os níveis de dose estudados a DXM alterou o peso e a celularidade tanto
do linfonodo tratado quanto do linfonodo não-tratado com CPZ.
Com relação aos outros orgãos estudados, a DXM provocou drástica redução de
peso (relativo e absoluto) de timo e baço em todos os níveis de dose estudados (Tabela 9).
Em doses iguais e maiores que 0,2 mg/animal, o peso relativo médio do timo (0,03 ± 0,02)
chegou a valores 5 vezes menores que o valor médio observado no grupo controle (0,15 ±
0,03). Alterações no peso do fígado foram observadas em doses iguais e maiores que
0,2mg/animal. Neste caso o tratamento com DXM induziu um aumento dose-relacionado
do peso relativo do fígado.
IV.2 Efeito da CFA
Como observamos nas Tabelas 7 e 8 e Figuras 8 e 9, o grupo tratado unicamente
com CPZ (grupo controle) apresentou tanto IP (4,15 ± 2,39) quanto de IC (14,15 ± 13,36)
maiores que os limites de positividade usualmente empregados no ELP (i.e. IP ≥ 2,0 e IC ≥
5,0). O tratamento com CFA, assim como observado após tratamento com DXM, inibiu o
número de células do linfonodo popliteal, tanto do linfonodo do lado tratado quanto do
lado não-tratado com CPZ (Tabela 8).
Vale ressaltar, que tanto IP quanto IC não foram parâmetros sensíveis para a
detecção do efeito imunossupressor da CFA (Tabelas 7 e 8 e Figuras 8 e 9), mesmo em
40
doses (10mg/animal) em que sinais de toxicidade sistêmica (tais como atrofia do timo e
baço) já eram evidentes (Tabela 9)
IV.3 Efeito da TAL
Assim como observado nos experimento 1 (DXM) e 2 (CFA), no grupo controle
do experimento 3, animais tratados exclusivamente com CPZ apresentaram aumento dos IP
(3,78 ± 1,84) e IC (19,72 ± 16,84) (Tabelas 7 e 8 e Figuras 8 e 9). TAL (10mg/animal) não
inibiu o efeito da CPZ e os IP e IC permaneceram maiores que os limites de positividade
(i.e. IP=3,25 ± 0,80 e IC=13,04 ± 5,90). TAL foi o único dos três agentes
imunossupressores estudados que não alterou o peso dos outros orgãos imuno-relacionados
(Tabela 9).
41
Tabela 7: Efeito dos agentes imunossupressores sobre o índice de peso.
N
IP
PESOS DOS
DIREITO
LINFONODOS (g)
ESQUERDO
Experimento 1
DXM(mg/animal)
0
0,02
0,2
1,0
18
9
9
7
3,00 ± 1,07
2,81 ± 1,50
2,19 ± 1,37 a
1,56 ± 1,17 a
0,019 ± 0,006
0,011 ± 0,003 a
0,006 ± 0,003 a, b
0,003 ± 0,001 a, b, c
0,007 ± 0,002
0,004 ± 0,002 a
0,004 ± 0,001 a
0,002 ± 0,001 a, b, c
Experimento 2
CFA (mg/animal)
0
10
8
9
4,15 ± 2,39
2,74 ± 1,11
0,031 ± 0,014
0,015 ± 0,003 a
0,008 ± 0,002
0,006 ± 0,002
Experimento 3
TAL (mg/animal)
0
~10
10
10
3,78 ± 1,84
3,25 ± 0,80
0,029 ± 0,007
0,025 ± 0,007
0,009 ± 0,003
0,008 ± 0,002
Os dados são apresentados como média ± desvio padrão. Os valores dos índices de peso (IP) foram analisados pelo teste KruskalWallis, seguido pelo teste de Mann-Whitney. Outros parâmetros foram avaliados pela análise de variância de um critério (one-way),
seguida pelo teste t de Student. Em todos os casos a diferença foi considerada como estatisticamente significativa quando p< 0,05. Os
símbolos são designados como segue: 0 : grupo controle; a: diferente do grupo controle; b: diferente da dose de 0,02 mg/animal
(DXM) e c: diferente da dose de 0,2 mg/animal (DXM).
42
Tabela 8: Efeito dos agentes imunossupressores sobre o índice de celularidade.
NÚMERO DE CÉLULAS x 106
DIREITO
ESQUERDO
N
IC
Experimento 1
DXM(mg/animal)
0
0,02
0,2
1,0
18
9
9
7
21,73 ± 19,87
8,76 ± 5,87
6,48 ± 9,56 a, b
2,20 ± 2,73 a, b
3,55 ± 1,52
0,90 ± 0,73 a
0,29 ± 0,26 a, b
0,10 ± 0,07 a, b
0,33 ± 0,24
0,10 ± 0,05 a
0,09 ± 0,09 a
0,06 ± 0,02 a, b
Experimento 2
CFA (mg/animal)
0
10
9
9
14,15 ± 13,36
8,25 ± 5,38
6,81 ± 6,34
0,43 ± 0,32 a
0,52 ± 0,38
0,06 ± 0,03 a
Experimento 3
TAL (mg/animal)
0
~10
10
10
19,72 ± 16,84
13,04 ± 5,90
5,04 ± 1,83
3,29 ± 1,25 a
0,50 ± 0,42
0,27 ± 0,10
Os dados são apresentados como média ± desvio padrão. Os valores dos índices celularidade (IC) foram analisados pelo
teste Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de Mann-Whitney. Outros parâmetros foram avaliados pela análise de variância de
um critério (one-way), seguida pelo teste t de Student. Em todos os casos a diferença foi considerada como estatisticamente
significativa quando p≤0,05. Os símbolos são designados como segue: 0 : grupo controle; a: diferente do grupo controle e
b: diferente da dose de 0,02 mg/animal (DXM).
43
Tabela 9: Efeito dos agentes imunossupressores sobre o peso dos órgãos imuno-relacionados.
PESOS
BAÇO
absoluto
%
Experimento 1
DXM(mg/animal)
0,46 ± 0,06
0,25 ± 0,03
0
0,39 ± 0,04 a 0,22 ± 0,01 a
0,02
0,39 ± 0,07a 0,22 ± 0,04 a
0,2
1,0
0,32 ± 0,04
a, b, c
0,17 ± 0,02
a, b, c
DOS
ÓRGÃOS (g)
FIGADO
TIMO
absoluto
%
absoluto
%
9,98 ± 1,38
10,40 ± 1,32
10,77 ± 0,92
11,83 ± 0,33
a, b, c
5,50 ± 0,65
0,28 ± 0,06 0,15 ± 0,03
6,05 ± 0,69 0,12 ± 0,04 a 0,07 ± 0,02a
6,09 ± 0,55 a 0,05 ± 0,03 0,03 ± 0,02
a, b
a, b
6,40 ± 0,38 a 0,06 ± 0,03 0,03 ± 0,01
a, b
a, b
Experimento 2
CFA (mg/animal)
0,56 ± 0,07
0,28 ± 0,02
0
0,31 ± 0,04 a 0,15 ± 0,02 a
10
10,42 ± 1,40
10,42 ± 0,86
5,29 ± 0,52
4,88 ± 0,48
Experimento 3
TAL (mg/animal)
0
~10
11,37 ± 1,50
10,54 ± 1,47
5,35 ± 0,71
5,24 ± 0,58
0,51 ± 0,04
0,50 ± 0,06
0,24 ± 0,01
0,25 ± 0,02
0,33 ± 0,08 0,17 ± 0,04
0,05 ± 0,01 a 0,02 ± 0,01a
0,34 ± 0,04
0,29 ± 0,07
0,16 ± 0,02
0,14 ± 0,03
Os dados são apresentados como média ± desvio padrão. Os valores percentuais foram analisados pelo teste KruskalWallis, seguido pelo teste de Mann-Whitney. Outros parâmetros foram avaliados pela análise de variância de um critério
(one-way), seguida pelo teste t de Student. Em todos os casos a diferença foi considerada como estatisticamente
significativa quando p≤0,05. Os símbolos são designados como segue: 0 : grupo controle; a: diferente do grupo
controle; b: diferente da dose de 0,02 mg/animal (DXM) e c: diferente da dose de 0,2 mg/animal (DXM).
44
Figura 8: Relação dose-resposta dos agentes imunossupressores no ELP
(índices de peso).
5
Índices de peso
4
3
*
*
2
1
0
0 0,02 0,2 1,0
DXM(mg/animal)
1
0
10
CFA(mg/animal)
* p≤0,05 = diferente do grupo controle.
0
10
TAL(~mg/animal)
45
Figura 9: Relação dose-resposta dos agentes imunossupressores no ELP
(índices de celularidade).
Índices de celularidade
25
20
15
10
**
5
0
**
0
0,02
0,2
1,0
DXM (m g/anim al)
1
0
10
CFA(m g/anim al)
0
10
TAL(~m g/anim al) )
** p≤0,05 = diferente do grupo controle e do grupo tratado com DXM na dose de 0,02mg/animal.
46
V. DISCUSSÃO
O estudo das imunodeficiências primárias e secundárias contribuiu em muito para
ampliar o conhecimento sobre os eventos que controlam o sistema imune e os efeitos
seletivos capazes de alterar suas funções. A incapacidade de um indivíduo em produzir
respostas imunológicas normais frente a estímulos antigênicos adequados leva ao
aparecimento de determinadas manifestações clínicas, que incluem o aumento da
vulnerabilidade do hospedeiro ao desenvolvimento de patógenos oportunistas (e.g.
candidíase, pneumonia, tuberculose, amebíase, etc.), e o aumento de incidência de
neoplasias, sobretudo, no desenvolvimento de linfomas e retículo-sarcomas.
A percepção da gravidade das manifestações clínicas decorrentes dos quadros de
imunodeficiência gerou entre membros da comunidade científica a preocupação com a
possibilidade de que condição semelhante de imunodeficiência pudesse ser acidentalmente
- via exposição ocupacional ou ambiental - induzida por xenobióticos e incentivou estudos
sobre o potencial imunotóxico destas substâncias. (e.g. medicamentos, metais, substâncias
químicas naturais ou industriais, etc.)
A partir daí, muitos xenobióticos foram descritos como supressores da resposta
imune, entre eles poluentes ambientais, tais como hidrocarbonetos aromáticos halogenados
(e.g. as bifenilas policloradas (PCB), bifenilas polibromadas (PBB) e o 2,3,7,8tetraclorodibenzo-p-dioxina ou TCDD), metais (As, Pb, Hg, Cd e Sn) e pesticidas (Burns
et al., 1996). É importante ressaltar que muitos destes estudos demonstram que o sistema
imune pode estar comprometido sem que qualquer outro sinal de toxicidade sistêmica seja
47
observado e que os testes rotineiros de toxicidade crônica e subcrônica não são suficientes
para evidenciar efeitos imunotóxicos.
Muito do que conhecemos sobre imunossupressão induzida por xenobióticos
provêm de estudos bastante complexos e de longa duração. De um modo geral, nestes
estudos os animais são submetidos a avaliações imunológicas (e.g. quantificação de
imunoglobulinas, citocinas, subpopulações celulares, etc.) após longo período de exposição
à substância em questão. Ainda hoje, a comunidade científica carece de estratégias (i.e.
modelos mais simples) que contribuam de maneira significativa num primeiro momento da
avaliação de risco de xenobióticos, permitindo uma análise inicial sobre o potencial
imunomodulador de determinada substância e, desta forma direcionando estudos
posteriores mais complexos. Tais modelos atenderiam às necessidades rotineiras de
avaliação de segurança e teriam aplicação importante, por exemplo, em estudos préclínicos de novos produtos. Neste caso, como em qualquer outro ensaio toxicológico, o
“bom” modelo preditivo deve unir características desejáveis (i.e. fácil aplicabilidade, curta
duração e baixo custo) e características imprescindíveis (i.e. sensibilidade e
reprodutibilidade). É neste contexto que o ELP encontra aplicação.
O ELP - ou ensaio do peso do linfonodo como inicialmente denominado - foi
desenvolvido há mais de três décadas com o objetivo de se avaliar a atividade de células
linfóides contra antígenos histoincompatíveis em roedores (Ford et al., 1970). A
superioridade do ELP foi prontamente detectada, quando este ensaio foi comparado a
outros testes de avaliação da medida da reação EVH. Dentre as vantagens oferecidas pelo
ELP podemos citar: 1. maior sensibilidade na detecção da reação contra antígenos
histoincompatíveis, i.e. cerca de 10 vezes maior do que aquela observada para o ensaio do
48
peso de rins (ou ensaio de Elkins), 2. melhor reprodutibilidade de resultados e 3. menor
duração do tempo do ensaio, o que na prática representa uma diminuição significativa nos
gastos necessários para a manutenção de animais em laboratório e uma redução na
demanda de mão-de-obra. Além disso, o número de células linfóides necessárias para
induzir a reação contra antígenos histoincompatíveis e o número de animais utilizados por
teste são menores no ELP do que em outros ensaios de avaliação da reação EVH (e.g.
ensaio do peso do baço). Por estas razões, o ELP tornou-se, ainda na década de 1970, um
modelo promissor, considerado de boa aplicabilidade na avaliação da reação EVH local em
roedores.
Nos anos seguintes, outros autores investigaram os mecanismos envolvidos na
linfodenopatia induzida pela reação EVH em camundongos (Emeson & Thursh, 1973) e
em ratos (Rolstad, 1976). De acordo com Piquet et al. (1977), em ratos o aumento do
linfonodo popliteal é primordialmente causado pela proliferação de linfócitos. Estes
autores descreveram que não somente o peso, mas, sobretudo a celularidade, encontra-se
significativamente aumentada no linfonodo mais próximo à pata tratada.
Vos (Vos et al., 1973), em estudo realizado com TCDD, foi um dos primeiros
autores a propor a utilização do ELP na avaliação de efeitos imunossupressores de
xenobióticos. Neste estudo, os animais expostos à droga em questão foram aqueles que
serviram como doadores de células linfóides histoincompatíveis. O tratamento de
camundongos com diferentes doses de TCDD se deu uma vez por semana por um período
de quatro semanas. As células esplênicas destes animais foram então, isoladas e injetadas
em novos camundongos. Como resultado, observou-se que a exposição a células
provenientes de animais previamente expostos ao TCDD, induzia um aumento do
49
linfonodo popliteal significativamente menor do que aquele observado em animais que
receberam células não expostas ao TCDD.
Já na década de 1980, um achado importante observado por Gleichmann evidenciou
a possibilidade de uma nova aplicação deste ensaio. Helga & Ernst Gleichmann
(Gleichmann, 1981 e Gleichmann et al., 1984) através de estudos desenvolvidos com uma
droga anti-epilética, i.e DPH, foram os primeiros a demonstrar que xenobióticos associados
ao aparecimento de reações do tipo auto-imune no homem, induzem em roedores
alterações de peso e celularidade do linfonodo popliteal. Tal efeito foi detectado como
sendo semelhante aquele observado na reação EVH e foi o ponto de partida para a
utilização do ELP como ensaio preditivo de reações auto-imunes provocadas por
xenobióticos.
O conceito proposto por Gleichmann (1981) alcançou maior credibilidade quando,
no final da década de 1980, cerca de 70 compostos foram testados através do ELP
(Kamüller et al., 1989 e Verdier et al., 1990). Isto tornou possível concluir que a grande
maioria dos xenobióticos que estão claramente associados à indução de reações autoimunes no homem (e.g. CAB, CPZ, DPH, EST, hidrazina (HDZ), penicilamina, zimeldina
(ZMD), entre outras), induz resposta positiva no ELP; enquanto aqueles que nunca foram
descritos como possíveis indutores de auto-imunidade no homem (e.g. barbital, cafeína
etc.) são negativos no ensaio.
Uma revisão detalhada de diversas metodologias propostas e/ou aplicadas ao
ELP encontram-se em Descotes & Verdier, 1995. É importante ressaltar que, em linhas
gerais, há um consenso entre aqueles que empregam o ensaio. Por exemplo, apesar de não
50
haver diferença evidente quanto ao sexo e idade de animais utilizados no teste,
normalmente roedores com idade entre 06 e 11 semanas, e preferencialmente de um único
sexo são usados em um mesmo experimento. O ELP pode ser realizado em ratos ou
camundongos, ambos susceptíveis a grande maioria de substâncias positivas. Entretanto, o
rato é usualmente a espécie de escolha, principalmente por ser maior em tamanho, o que
facilita a retirada dos linfonodos popliteais. A substância a ser testada é sempre injetada
por via s.c. em uma das patas posteriores (preferencialmente a pata direita), enquanto a
pata esquerda serve como controle e nela é injetado somente o veículo. Os veículos
empregados são, via de regra, salina ou dimetil sulfoxido (DMSO). Outros veículos, tais
como etanol e acetona não devem ser usados, pois podem alterar tanto peso quanto
celularidade do linfonodo popliteal em conseqüência de um efeito irritante primário.
Devido a sua viscosidade, veículos como óleo de milho, óleo de parafina e propileno glicol
também podem induzir resposta positiva no linfonodo popliteal (Goebel, 1996).
O volume de injeção é sempre de 10µL em camundongos e 50µL em ratos,
apesar de estudos sobre os efeitos volume-relacionados serem escassos. Com relação à
dose da substância que leva ao estímulo antigênico, arbitrariamente, definiu-se
1mg/camundongo e 5mg/rato como sendo as doses máximas a serem empregadas neste
ensaio. Entretanto, principalmente nos casos de substâncias, cuja ação imunogênica requer
indução da ativação metabólica, e.g. isoniazida e procainamida (PA), observou-se que um
aumento na dose pode ser útil. Por outro lado, o aumento na dose pode levar a um quadro
de toxicidade sistêmica, como aquele observado após tratamento com mercúrio (Verdier et
al., 1993).
Na grande maioria dos casos, assim como no presente estudo, os linfonodos
popliteais são retirados sete dias após o tratamento por via s.c. Entretanto, para algumas
51
substâncias, como, por exemplo EST e ZMD, este tempo pode não ser válido, por
apresentar comportamentos farmacocinéticos (absorção, distribuição e excreção) diferentes
(Thomas et al., 1989 e Krzystyniak et al., 1992).
Quanto aos parâmetros avaliados, os índices de peso e celularidade são os mais
freqüentemente empregados. Estes índices são sempre calculados através da razão entre
valores encontrados no lado direito (tratado) pelo lado esquerdo (veículo). Outros
parâmetros podem ser avaliados, tais como análise de receptores de membrana celular
através de citometria de fluxo, análise histológica ou imunoquímica, análise de
imunoglobulinas por ELISA, análise hematológica e bioquímica e produção de citocinas.
Entretanto, a utilização de tais endpoints, além de aumentar significativamente o custo do
ensaio, não se mostra útil e, de um modo geral, não contribui de maneira significativa para
a interpretação final dos dados obtidos (Descotes, 1999).
Enquanto diversos autores colaboravam na tentativa de consagrar o ELP como um
ensaio preditivo de auto-imunidade induzida por xenobióticos (Hutenbach et al., 1987;
Katsutani et al., 1992; Kubicka-Muranyi et al., 1993; Patriarca et al., 1993; Descotes et al.,
1997 e Vial et al., 1997), Helga & Ernst Gleichmann (Gleichmann & Gleichmann, 1990)
propuseram pela primeira vez uma versão modificada do ELP. De acordo com estes
autores, tal versão serviria para detectar a ação imunossupressora de xenobióticos e
manteria características interessantes e peculiares ao ELP, tais como curta duração, baixo
custo e simplicidade.
Na versão modificada do ELP proposta por Gleichmann & Gleichmann, os animais
são tratados com a substância em questão por via sistêmica (em geral a via preconizada
52
para uso humano) e caso a substância tenha potencial imunossupressor será capaz de inibir
o aumento do linfonodo popliteal induzido por um agente imunogênico. O agente
imunogênico pode ter diferentes origens, i.e. drogas sabidamente positivas no ELP (e.g.
CPZ, DPH, CAB, EST, etc.) ou células provenientes de outra espécie (e.g. hemácias
humanas, células linfóides de outros roedores, etc). Com esta versão, Gleichmann &
Gleichmann (1990) foram capazes de demonstrar com sucesso a ação imunossupressora da
CCL em camundongos. Posteriormente, dados de Korte et al. (1990) confirmaram os
achados de Gleichmann & Gleichmann, a partir da demonstração em ratos das
propriedades imunossupressoras de outros agentes imunossupressores, i.e. a CFA e o
TCDD.
À primeira vista, a versão modificada do ELP parecia ser bastante promissora, o
que contribuiu para que este ensaio fosse por diversas vezes citado como sendo um modelo
versátil e vantajoso (Bloksma et al., 1995; Goebel et al., 1996 e Homey et al. 1997). Isto
fez com que o ensaio deixasse de ser usado de forma ainda incipiente e mais recentemente
fosse aplicado com a finalidade de detectar o efeito imunossupressor de novos
medicamentos (Schorlemmer et al., 1998 e 1999)
Entretanto, ao nosso ver, para que este ensaio possa ser definitivamente consagrado
como modelo preditivo de um determinado desfecho, é necessário que muitos estudos de
validação ainda sejam realizados. Neste sentido, questões importantes sobre o ELP
merecem maior atenção. Por exemplo, é primordial que os mecanismos imunológicos
envolvidos no ensaio sejam melhor compreendidos e que a interferência de questões
importantes, tais como a natureza do estimulo antigênico, diferenças entre espécies,
cinética e duração do tratamento com o xenobiótico estudado, seja melhor investigada.
53
Além disso, o fato de Korte, em estudo realizado ainda em 1991, (Korte et al., 1991) não
ter sido capaz de reproduzir os dados obtidos em estudo prévio sobre o potencial
imunossupressor do TCDD (Korte et al., 1990), parece ter sido negligenciado por aqueles
que hoje aplicam o ELP.
Outras questões importantes merecem maior atenção. Por exemplo, a proposta de se
utilizar a versão modificada do ELP como modelo preditivo de imunossupressão induzida
por xenobióticos, parte do princípio de que alterações induzidas por um agente
imunogênico podem ser inibidas de forma seletiva por determinadas substâncias. Se isso
ocorre, há uma inibição do aumento do peso e do número de células no linfonodo popliteal,
e se o efeito é seletivo, a diminuição do linfonodo popliteal será exclusiva do lado tratado
com o agente imunogênico. Em decorrência do efeito inibitório provocado pelo agente
imunossupressor, observaremos uma redução dos IP e IC. Entretanto, nosso estudo não
confirma tal seletividade. Embora tanto DXM (em todos os níveis de dose estudados),
quanto CFA tenham reduzido o peso e o número de células induzidas pela CPZ (lado
tratado), estas drogas atuaram de forma não seletiva, provocando diminuição significativa
do linfonodo popliteal tanto no lado tratado quanto no lado não-tratado com CPZ. Se a
substância em questão induz alteração não seletiva, i.e. diminuindo tanto o lado tratado
quanto o lado não-tratado, a utilização do agente imunogênico torna-se totalmente
indispensável. Em termos práticos, tanto para DXM quanto para CFA teríamos
identificado o efeito imunossupressor, mesmo sem utilizar a CPZ. O mesmo ocorreu em
estudos conduzidos por Homey (Homey et al., 1997), em que o efeito imunossupressor dos
três corticosteróides usados teriam sido evidenciados independente da utilização do
estímulo imunogênico (i.e. oxazolone).
54
Vale aqui um comentário adicional. Se tivéssemos analisado os resultados somente
pelos IP e IC, como usualmente é feito, poderíamos ter concluído que a exposição a TAL,
a CFA e a menor dose de DXM não causa imunossupressão. Estes dados nos fazem refletir
sobre a aplicabilidade do ensaio e, sobretudo, sobre a utilização do IP e IC como
parâmetros finais no ELP. Estes índices, embora sejam medidas amplamente utilizadas
entre aqueles que empregam o ELP, mostraram-se parâmetros pouco sensíveis para
avaliação de efeito imunossupressor das três drogas imunossupressoras utilizadas, mesmo
em níveis de dose tão elevados que sinas de toxicidade sistêmica (tais como atrofia de timo
e baço) já se faziam aparentes.
Em nosso laboratório, o índice médio máximo de peso e celularidade obtidos nos
três experimentos com a CPZ alcançaram valores de IP:4,15 e IC: 21,73 (Tabela 10). A
variação entre experimentos não foi elevada, tendo sido menor do que aquela encontrada
em estudos de validação inter-laboratorial (Vial et al., 1997) em que substâncias de mesma
origem foram testadas em três diferentes laboratórios. Apesar da variabilidade genética
existente entre doadores (Korte et al., 1991), a variação dos IP e IC observada em
diferentes experimentos conduzidos com hemácias humanas (3,0 x 107 células por animal)
foi equivalente àquela observada em nosso laboratório (Tabela 10).
Com relação a amplitude do efeito induzido no linfonodo popliteal por outros
agentes químicos (Tabela 10), podemos afirmar que alguns xenobióticos, tais como HDZ e
EST induzem um aumento mais acentuado do linfonodo que outros, e.g. CPZ e ZMD (Vial
et al., 1997). A CPZ pode ser considerada um agente imunogênico com potencial
55
moderado, e como pode ser visto na Tabela 10, nem mesmo induziu aumento do IP (i.e.
IP<2,0) em um dos laboratórios que participaram do estudo de validação do ensaio.
Por outro lado, o aumento de peso do linfonodo popliteal induzido em ratos
híbridos Lewis x Brown-Norway (F1), que receberam aloenxerto de seus pais (i.e. 1x108
esplenócitos de ratos Lewis) é muito maior que aquela observada após indução por
substâncias químicas (Schorlemmer et al., 1998 e 1999). Além de maior, a reação induzida
por aloenxerto é bem mais rápida, sendo o aumento de peso do linfonodo popliteal já
evidente 72 horas após o tratamento com este agente imunogênico. Apesar de não
podermos prever a resposta da DXM, CFA e TAL em ensaios induzidos por outros
estímulos antigênicos, acreditamos que se o ELP não se mostrou suficientemente sensível
para detectar de forma seletiva a inibição de efeitos induzidos pela CPZ (considerado
moderado), certamente não o seria para agentes imunogênicos mais potentes.
Em diversos estágios metabólicos, os corticosteróides causam ampla deposição de
glicogênio no fígado de ratos e camundongos (Laloux et al., 1983), além de aumentarem
de forma significativa a concentração de proteínas nas células hepáticas (Guyton & Hall,
1997). Este fato foi, provavelmente, o que levou ao aumento dose-relacionado do peso
relativo do fígado de animais tratados com as doses de 0,2 e 1,0mg DXM/animal. As
profundas alterações no peso de timo, baço e linfonodos induzidas pela DXM estão de
acordo com relatos anteriores (Stites et al., 2000). Corticosteróides exercem uma extensa
destruição linfóide em ratos, estando este efeito relacionado à indução de apoptose em
linfócitos. Além disso, através da modulação de moléculas de adesão presentes na
superfície celular, corticosteróides inibem a migração de células circulantes para os
linfonodos locais (Morison & Pike, 1985).
56
Nossos dados também sugerem que a redução de peso induzida por DXM está
ligada à redução da celularidade dos linfonodos popliteais. Vale observar que, e.g. no caso
da dose de 0,02mg DXM/animal, o número de células do lado tratado com CPZ (0,90 ±
0,73 x 106) foi cerca de três vezes maior que o número encontrado no linfonodo esquerdo
(não-tratado) de animais não imunossuprimidos (0,33 ± 0,24 x 106) (Tabela 8). Isto
significa que mesmo em animais profundamente imunossuprimidos, a CPZ induziu
aumento do linfonodo popliteal. Porém, não sabemos se as células restantes no local da
reação estão funcionalmente comprometidas.
Vale ressaltar que o objetivo do presente estudo foi avaliar a aplicabilidade do ELP
modificado na identificação de um efeito imunossupressor. Desta forma as drogas aqui
estudadas são sabidamente imunossupressoras e induziram imunossupressão maciça,
causando inclusive atrofia de outros orgãos imuno-relacionados. Mesmo assim, o ensaio
não foi sensível e os IP e IC não revelaram de forma satisfatória o potencial
imunossupressor destas drogas. Estes dados sugerem que, provavelmente um efeito
imunossupressor mais brando, como aquele a que mais provavelmente estaríamos sujeitos
após exposição acidental, dificilmente seria detectado pelo ELP modificado. Estes dados
devem incentivar a pesquisa sobre o desenvolvimento de novos modelos mais sensíveis.
Outra limitação do ELP é o fato de que entre diferentes indivíduos, observamos que
a amplitude da reação induzida por agentes imunogênicos, sejam eles de origem biológica
ou não, é extremamente variável. Esta variação não é exclusividade do modelo animal, é
também observada após a exposição humana a drogas positivas no ELP. A PA, por
exemplo, está associada ao aparecimento de LES no homem. Isto ocorre em
aproximadamente 30% dos pacientes cronicamente expostos a PA e hoje se sabe que a
57
indução de LES por PA depende fortemente de características genéticas e metabólicas do
paciente.
As diferenças individuais observadas nas respostas induzidas no ELP aumentam a
variação dos resultados, o que na prática, vai levar a um aumento obrigatório no número de
animais por experimento. Num momento como o que vivemos hoje, em que observamos
uma forte tendência internacional de redução no número de animais envolvidos na
pesquisa científica, é difícil justificar a implementação de ensaios como o ELP. Além
disso, vale ressaltar que apesar de amplamente utilizado, até hoje, desconhecemos os
princípios imunológicos envolvidos no ensaio, o que ao nosso ver, deve servir de incentivo
para o desenvolvimento de um maior número de pesquisas científicas neste ramo
específico da imunotoxicologia.
Diante de todos os fatos acima descritos, vemos como, no mínimo, prematura a
afirmativa de alguns autores (Gleichmann & Gleichmann, 1990; Goebel, 1996; Homey et
al., 1997 e Schorlemmer et al., 1998 e 1999) de que o ELP tem boa aplicabilidade como
ensaio preditivo de imunossupressão induzida por xenobióticos. Apesar do ELP ser um
ensaio extremamente simples, algumas limitações – como as que foram aqui discutidas –
dificultam
a
implementação
definitiva
deste
ensaio
na
rotina
da
avaliação
imunotoxicológica. Esperamos que, com a presente avaliação, tenhamos contribuído na
discussão sobre a aplicabilidade deste ensaio.
58
Tabela 10: Aumento do linfonodo popliteal de ratos com substâncias (e hemácias) positivas no ELP em
diferentes laboratórios.
Lab. 1
a
Lab. 2
Lab. 3
Exp. 1
b
Exp. 2
Exp. 3
Exp. 1
c
Exp. 2
Exp. 3
N=8
N=8
N=8
N=6
N=10
N=31
N=18
N=9
N=10
1,38 ± 0,34
4,74 ± 1,03
16,04 ± 2,23
4,45 ± 0,49
58,03 ± 14,72
ND
ND
ND
ND
ND
ND
3,00 ± 1,07
4,15 ± 2,39
3,78 ± 1,84
21,73 ± 19,87
14,15 ± 13,36
19,72 ± 16,84
7,77 ± 3,70
23,11 ± 9,75
7,28 ± 1,63
94,65 ± 31,71
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
6,30 ± 1,00
21,73 ± 9,97
8,39 ± 3,79
146,61 ± 62,10
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
3,63 ± 0,62
16,95 ± 8,46
4,82 ± 0,86
37,48 ± 21,05
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
CPZ
IP
IC
13,33 ± 10,42
HDZ
IP
IC
9,03 ± 2,34
64,46 ± 4,74
EST
IP
IC
7,98 ± 1,06
36,73 ± 9,38
ZMD
IP
IC
3,23 ± 0,59
24,43 ± 8,81
Hem
IP
ND
ND
ND
ND
ND
ND
3,2 ± 1,3 4,4 ± 7,9 2,5 ± 0,9
IC
ND
ND
ND
ND
ND
ND
16,8 ± 8,2 17,1 ± 11,3 12,5 ± 9,6
O ELP foi realizado como descrito na seção de material e métodos. Em todos os casos foram usadas ratas Wistar entre 7 e 11 semanas de
idade. O veículo foi salina e a dose do agente imunogênico 5mg/animal. O intervalo de tempo entre o tratamento com o agente
imunogênico e o sacrifício dos animais foi de 7 dias. a: segundo Vial et al., 1997; b: segundo Korte et al., 1991; c: nosso laboratório;
Lab.: Laboratório, Exp.: Experimento e Hem.: Hemácias.
59
VI. CONCLUSÕES
O ELP não foi sensível para detectar o efeito dos agentes imunossupressores aqui
estudados, mesmo em doses em que sinais de toxicidade sistêmica já eram evidentes. A
análise de cada uma das três etapas do estudo nos permite concluir que:
1. em todos os níveis de dose estudados, a exposição à DXM causa redução dos
pesos absolutos e relativos de timo e baço, além de reduzir o peso e a
celularidade dos linfonodos popliteais. Entretanto, a diminuição de peso e
celularidade induzida pela DXM ocorreu tanto na pata tratada quanto na pata
não-tratada com CPZ. Os IP e IC foram menores nas duas maiores doses de
DXM mas a diminuição é relativamente discreta se comparada à drástica
redução de celularidade e peso dos linfonodos observada nestas doses. Além
disso, o tratamento com 0,02mg DXM/animal não induziu diminuição
significativa dos IP e IC;
2. a exposição à CFA reduz o peso absoluto e relativo de timo e baço, além de
reduzir o peso e a celularidade dos linfonodos popliteais. Também aqui, a
diminuição induzida pelo agente imunossupressor não é seletiva, tendo sido
observada tanto na pata tratada quanto na pata não-tratada com CPZ. A
exposição a CFA não alterou significativamente os IP e IC;
3. A TAL foi a única droga estudada que não causou alteração de peso dos orgãos
analisados. Apesar de ter reduzido significativamente o número de células do
60
linfonodo popliteal da pata tratada com CPZ, a TAL não alterou
significativamente os IP e IC.
Em conjunto, os resultados obtidos neste trabalho nos permitem concluir que o ELP
não pode ser usado como ensaio preditivo de reações imunossupressoras induzidas por
xenobióticos.
61
VII. REFERÊNCIAS
ABBAS, A.K., LICHTMAN, A.H. & POBER, J.S. Celular and Molecular Immunology,
W.B. Sanders Company, 3th edition, 1997.
BELLANTI, J.A. Immunotoxicology: overview and future perspectives. Annals of Allergy,
66: 465-473, 1991.
BLOKSMA, N., KUBICKA-MURAMYI, M., SCHUPPE, H.C., GLEICHMANN, E. &
GLEICHMANN, H. Predictive immunotoxicological test systems: suitability of the
popliteal lymph node assay in mice and rats. Crit Rev Toxicol, 25 (5): 369-396, 1995.
BONNEY, W.W. & FELDBUSH, T.L. Graft-versus-host reaction in the rat popliteal
lymph node. Transplantation, 15 (2):215-220, 1973.
BURNS, L. A., MEADE, B. J. & MUNSON, A. E. Toxic responses of the immune system.
Casarett & Doulls Toxicology. The basic science of poisons, Ed. Klaassen C.D.,
International Edition, 355-402, 1996.
CHABNER, B.A., ALLEGRA, C.J., CURT, G.A. & CALABRESI, P. Antineoplastic
agents. In: Goodman and Gilman`s. The Pharmacological Basis of Therapeutics, New
York, St. Louis, San Francisco, McGraw-Hill, Inc, 9th edition, 1233-1287, 1996.
62
CHANG, T.K.H., WEBER, G.F., CRSPI, C.L. & WAXMAN, D.J. Differential activation
of cyclophosphamide and ifosphamide by cytochromes P-450 2B and 3A in human liver
microssomes. Cancer Research, 53: 5629-5637, 1993.
DESCOTES, J. & VERDIER, F. The popliteal lymph node assay. In: G.R. Burleson, J.H.
Dean e A.F. Munson (Eds.), Modern Methods in Immunotoxicology. Wiley-Lyss, New
York, 189-196, 1995.
DESCOTES, J., PATRIARCA, C., VIAL, T. & VERDIER, F. The popliteal lymph node
assay in 1996. Toxicology, 119: 45-49, 1997.
DESCOTES, J. An Introduction to immunotoxicology, Taylor & Francis, Reino Unido,
1999.
EMESON
E.E.
&
THURSH,
D.R.
Mechanism
of
graft-versus-host-induced
lymphadenopathy in mice. J Exp Med, 137: 1293-1302, 1973.
FORD, L.W., BURR, W. & SIMONSEN, M. A lymph node weight assay for the graftversus-host activity of rat lymphoid cells. Transplantation, 10(3): 258-266, 1970.
GLEICHMANN, E. & GLEICHMANN, H. Graft-versus-host reaction: a pathogenetic
principle for the development of drug allergy, autoimmunity and malignant lymphoma in
non-chimeric-individuals. Hypothesis. Z. Krebsforsch, 5: 91-109, 1976.
63
GLEICHMANN, H. Studies on the mechanism of drug sensitization: T-cell-dependent
popliteal lymph node reaction to diphenylhydantoin. Clin Immunol Immunopathol, 18:
203-211, 1981.
GLEICHMANN,
E.,
PALS
S.T.,
ROLINK,
A.G.,
RADASZKIEWICZ
T.
&
GLEICHMANN H. Graft-versus-host reactions: clues to etiopathology of a spectrum of
immunological diseases. Immunol Today, 5: 324-32, 1984.
GLEICHMANN, E. & GLEICHMANN H. Der popliteale Lymphknoten (PLK)-test bei
Nagern, ein einfacher Funktionstest zur Entdeckung sensibilisierender Chemikalien. In:
Grosdanoff P, Kraupp O, Schütz W, Schulte-Hermann R (Eds) Toxicologische und
klinisch-pharmakologische
Prüfungen.
Anforderungen,
Methoden,
Erfahrungen,
Perspektiven. Walter de Gruyter, Berlin, New York, 259-280, 1990.
GOEBEL, C., GRIEM, P., SACHS, B., BLOKSMA, N. & GLEICHMANN, E. The
popliteal lymph node assay in mice: Screening of drugs and other chemicals for
immunotoxic hazard. Inflamm Res, 45 (2): 85-90, 1996.
GUYTON, A.C & HALL, J.E. Tratado de fisiologia médica, Editora Guanabara Koogan,
Brasil, 9ª edição, 1997.
HOMEY, B., SCHUPPE, H., ASSMANN, T., VOHR, H., LAUERMA, A.I., RUZICKA,T.
& LEHMANN, P. A local lymph node assay to analyse immunosuppressive effects of
topically applied drugs. European Journal of Pharmacology, 325: 199-207, 1997.
64
HURTENBACH, U., GLEICHMANN, H., NAGATA, N. & GLEICHMANN, E.
Immunity to D-penicillamine: genetic, cellular, and chemical requirements for induction of
popliteal lymph node enlargment in the mouse. The Journal of Immunology, 139 (2): 411416, 1987.
KAMÜLLER, M. E., THOMAS, C., DE BAKKER, J.M., BLOKSMA, N. & SEINEN, W.
The popliteal lymph node assay in mice to screen for the immune disregulating potential of
chemicals. A preliminary study. Int J Immunopharm, 11: 293-300, 1989.
KATSUTANI, N. & SHIONOYA, H. Popliteal lymph node enlargement induced by
procainamide. Int J Immunopharmac, 14(4): 681-686, 1992.
KATZUNG, B.G. & TREVOR, A.J. Pharmacology, Appleton & Lance, USA, 4th edition,
1995.
KEENAN, R.J., EIRAS, G., BURCKART, G.J., STUART, R.S., HARDESTY, R.L.,
VOGELSANG, G., GRIFFITH, B.P. & ZEEVI, A. Immunosuppressive properties of
thalidomide. Transplantation, 52 (5): 908-910, 1991.
KORTE M., KUBICKA-MURANYI M., STAHLMANN R. & GLEICHMANN E.
Supression of immune response by 2,3,7,8-TCDD in a popliteal lymph node assay in rats.
Naunyn-Schmiedebergs. Arch Pharmacol, 341: 20, 1990.
KORTE, M., STAHLMANN, R., KUBICKA-MURANYI, M., GLEICHMANN, E. &
NEUBERT, D. Polyhalogenated dibenzo-p-dioxins and dibenzofurans and the immune
65
system: 3. No immunosuppressive effect of 2,3,7,8- TCDD in the popliteal lymph node
assay (PLNA) in rats. Arch Toxicol, 65: 656-660, 1991.
KRYSTYNIAK, M., GOEBELS, R., GOEBEL, C., UETRECH, J. & GLEICHMANN, E.
Activation of CD4+ and CD8+ lymphocite subsets by streptozotocin in the popliteal
lymph node assay. II. Comparison with acute graft-vs-host reaction in H-2 incompatible F1
mouse hibrids. Immunopharmacol Immunotoxicol, 14: 865-882, 1992.
KUBICKA-MURANYI, M., GOEBELS, R., GOEBEL, C., UETRECHT, J. &
GLEICHMANN, E. T lymphocites
ignore procainamide, but respond to its reactive
metabolites in peritoneal cells: demonstration by the adoptive transfer popliteal lymph
node assay. Toxicology and Applied Pharmacology, 122: 88-94, 1993.
LALOUX, M., STALMANS, W. & HERS, H. On the mecanism by glucocorticoids cause
the activation of glycogen synthase in mouse and rat livers. Eur J Biochem, 136: 175-181,
1983.
MORISON, W.L. & PIKE. R.A. Suppression of graft-versus-host reactivity in the mouse
popliteal node by UVB radiation. The Journal of Investigative Dermatology, 84: 483-486,
1985.
PATRIARCA, C., VERDIER, F., BROULAND, J.P. & DESCOTES, J. Popliteal lymph
node response to procainamide and isoniazid. Role of β-naphtoflavone, phenobarbitone
and S9-mix pretreatment. Toxicology letters, 66: 21-28, 1993.
66
PIGUET P.F., DEWEY, H.K. & VASALLI, P. Origin and nature of the cells participating
in the popliteal graft-versus-host reaction in mouse and rat. Cell Immunol, 31: 242-254,
1977.
RANDALL, T. Thalidomide`s back in the news, but in more favorable circumstances.
JAMA, 263 (11): 1467-1468, 1990.
RANDALL, T. Research focuses on immunosuppressive effect, unknow teratogenic
mechanism of thalidomide. JAMA, 263 (11): 1473, 1990.
REY, L. Dicionário de termos técnicos de medicina e saúde, Editora Guanabara Koogan,
Brasil, 1999.
ROITT, I.M. Imunologia, Editora Livraria Ateneu, Rio de Janeiro, São Paulo, 5ª edição,
1989.
ROITT, I., BROSTOFF, J. & MALE, D. Imunologia, Editora Manole Ltda, Brasil,
5ª edição, 1999.
ROLSTAD, B. The host component of the graft-versus-host reaction. A study on the
popliteal LN reaction in the rat. Transplant, 21: 117-123, 1977.
SCHORLEMMER, H.U., KURRLE, R., SCHLEYERBACH, R. & BARTLETT, R.R. In
vivo lymphoproliferation in the popliteal lymph node (PLN) assay can be inhibited by
leflunomide`s active metabolite A77 1726. Inflamm Res, 48 (2): 111-112, 1999.
67
SCHORLEMMER, H.U., BARTLETT, R.R. & KURRLE, R. Inhibition of alloreactivity in
the popliteal lymph node assay by malononitrilamides. Transplantation Proceedings, 30:
968-970, 1998.
SHESKIN, J. Further observation with thalidomide in lepra reactions. Lep Rev, 36 (4):
183-187, 1965.
SILVA, PENILDON. Farmacologia, Editora Guanabara Koogan, Brasil, 4ª edição, 1994.
SMITH, R.D. & KEHRER, J.P. Cooxidation of cyclophosphamide as an alternative
pathway for its bioactivation an lung toxicity. Cancer reseach, 51: 542-548, 1991.
STITES, D.P., TERR, A.I. & PARSLOW, T.G. Imunologia Médica, Editora Guanabara
Koogan, 9ª edição, 2000.
TAUSSING, H. B. A study of the German outbreak of phocomelia – The Thalidomide
Syndrome. JAMA, 30: 80-88, 1962.
THOMAS, C., GROTEN, S., KAMMÜLLER, M.E., DE BAKKER, J.M., SEINEN, W. &
BLOKSMA, N. Popliteal lymph node reactions in mice induced by the drug zimeldine. Int
J Immunopharmacol, 11: 693-702, 1989.
VERDIER, F., VIRAT, M. & DESCOTES, J. Applicability of the popliteal lymph node
assay in Brown Norway rat. Immunopharmacol Immunotoxicol, 12: 669-677, 1990.
68
VERDIER, F., PATRIARCA, C., VIAL, T., VIRAT, M. & DESCOTES, J. Further
validation of the popliteal lymph node (PLN) assay in the rat. Pharmacol Toxicol, 46,
1993.
VIAL, T., CARLEER, J., LEGRAIN, L., VERDIER, F. & DESCOTES, J. The popliteal
lymph node assay: results of a preliminary interlaboratory validation study. Toxicology,
122: 213-218, 1997.
VOGELSANG, G.B., HESS, A.D., GORDON, G. & SANTOS, G.W. Treatment and
preventation of acute graft-versus-host disease with thalidomide in a rat model.
Transplantation, 41 (5): 644-647, 1986.
VOGELSANG, G.B., TAYLOR, S., GORDON, G. & HESS, A.D. Thalidomide, a potent
agent for the treatment of graft-versus-host disease. Transplantation Proceedings, 18 (4):
904-906, 1986.
VOGELSANG, G.B., WELLS, M.C., SANTOS, G.W. & HESS, A.D. Combination lowdose thalidomide and cyclosporine prophylaxis for acute graft-versus-host disease in rat
mismatched model. Transplantation Proceedings, 20 (2): 226-228, 1988.
VOS, J.G., MOORE, J.A. & ZINKL, J.G. Effect of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin on
the immune system of laboratory animals. Environ Health Perspect, 5: 149-162, 1973.