Dissertação completa corrigida - TEDE

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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS
E SINTÉTICOS BIOATIVOS
CAMILLA PINHEIRO DE MENEZES
ATIVIDADE ANTIFÚNGICA IN VITRO DO ÓLEO ESSENCIAL DE
Melissa officinalis L. (ERVA-CIDREIRA) SOBRE Cladosporium
carrionii
JOÃO PESSOA – PB
2012
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CAMILLA PINHEIRO DE MENEZES
ATIVIDADE ANTIFÚNGICA IN VITRO DO ÓLEO ESSENCIAL DE
Melissa officinalis L. (ERVA-CIDREIRA) SOBRE Cladosporium
carrionii
Dissertação de mestrado apresentada ao
Programa de Pós-graduação em Produtos
Naturais e Sintéticos Bioativos, Centro de
Ciências da Saúde, Universidade Federal da
Paraíba, em cumprimento aos requisitos
necessários para a obtenção do título de Mestre
em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos.
Área de concentração: Farmacologia.
Orientadora: Profa. Dra. Edeltrudes de Oliveira Lima
JOÃO PESSOA – PB
2012
3
M543a Menezes, Camilla Pinheiro de.
Atividade antifúngica in vitro do óleo essencial de
Melissa officinalis L. (erva-cidreira) sobre Cladosporium
carrionii / Camilla Pinheiro de Menezes. - - João Pessoa:
[s.n.], 2012.
124f. : il.
Orientadora: Edeltrudes de Oliveira Lima.
Dissertação (Mestrado) – UFPB/CCS.
1. Produtos naturais. 2. Óleo essencial - Melissa
officinalis L. 3. Fungos dematiáceos. 4. Cladosporium
carrionii
UFPB/BC
CDU: 547.9(043)
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CAMILLA PINHEIRO DE MENEZES
ATIVIDADE ANTIFÚNGICA IN VITRO DO ÓLEO ESSENCIAL DE
Melissa officinalis L.(ERVA-CIDREIRA) SOBRE Cladosporium
carrionii
Dissertação de mestrado aprovada em: 19 / 11 / 2012.
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________________________
Profa. Dra. Edeltrudes de Oliveira Lima
(Universidade Federal da Paraíba)
Orientadora
_______________________________________________________
Prof. Dr. Fabio Correia Sampaio
(Universidade Federal da Paraíba)
Examinador externo
_______________________________________________________
Profa. Dra. Hilzeth de Luna Freire Pêssoa
(Universidade Federal da Paraíba)
Examinador interno
JOÃO PESSOA – PB
2012
5
“Lute com determinação, abrace a
vida com paixão, perca com classe
e vença com ousadia, porque o
mundo pertence a quem se atreve
e a vida é muito para ser
insignificante.”
Charlie Chaplin
6
AGRADECIMENTOS
À Deus, o dom da vida, a força, a perseverança, o discernimento e a sabedoria que
Ele colocou ao meu dispor durante todo o percurso que hoje vejo edificado com
êxito.
Aos meus pais Augusto e Iranete, por me amarem incondicionalmente, pelas lições
de vida e por terem me dado a oportunidade de hoje ser quem eu sou. Vocês foram
os meus primeiros mestres e são meus maiores exemplos.
Aos meus irmãos Gabriella e Augustto, pela cumplicidade, paciência, admiração e
amor nas horas mais difíceis.
Ao meu noivo Matheus, pelo incentivo e amor constante nos momentos mais difíceis
e, principalmente, por entender minhas ausências, aceitar minhas omissões e
compartilhar das minhas lágrimas e sorrisos.
À Profa. Dra. Edeltrudes de Oliveira Lima, orientadora dedicada e atenciosa, que me
transmitiu conhecimentos, experiências profissionais e de vida, com todo o carinho e
sabedoria. E que cuidadosamente corrigiu e modelou minhas imperfeições de
aprendiz. Minha sincera admiração e gratidão.
À banca examinadora Prof.ª Dr.ª Hilzeth de Luna Freire Pessôa, Prof. Dr. Fábio Correia
Sampaio, bem como o suplente Prof. Dr. Reinaldo Nóbrega de Almeida por terem
aceitado o nosso convite e pelas valiosas contribuições.
À toda equipe do Laboratório de Micologia Profa. Dra Edeltrudes de Oliveira Lima,
Profa. Dra. Zélia B. V. S. Pontes, aos bioquímicos Maria de Fátima F. P. Carvalho e
Júlio e aos alunos: Waléria Viana, Felipe Sarmento, Fillipe Oliveira, Janiere Pereira,
Jéssica Gomes, Igara Oliveira, Viviane Araújo, Lílian Pinheiro, Willy Oliveira, Juliana
Moura que sempre se mostraram presentes e dispostos a me ajudar, somaram
experiências e que contribuíram positivamente para o meu crescimento.
7
Aos meus amigos Abrahão, Maria Carolina, Thiago, Carminha, Raline, Fabíola,
Thaís Josy que sempre estiveram ao meu lado comemorando minhas vitórias e
enxugando minhas lágrimas. Serei eternamente grata pela amizade de vocês.
À todos os professores do Programa de Pós-graduação em Produtos Naturais e
Sintéticos Bioativos sempre preparados para conduzir da melhor maneira possível o
processo de aprendizagem.
Aos funcionários do Programa de pós-graduação, em especial às secretárias Tânia
Alves e Caroline Mangueira, pela presteza, prontidão e gentileza com que sempre
me atenderam.
À Universidade Federal da Paraíba, em especial ao Centro de Ciências da Saúde e
ao Programa Pós-graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos pela
oportunidade de realização deste curso e pela efetiva contribuição para o meu
crescimento profissional e científico.
Ao CNPq e a CAPES pelo apoio financeiro e as condições para a realização deste
trabalho.
À todos que foram peças fundamentais para minha formação profissional, o meu
sonho, minha conquista, meu reconhecimento e eterna gratidão.
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RESUMO
MENEZES, C. P. Atividade antifúngica in vitro do óleo essencial de Melissa
officinalis L. (erva-cidreira) sobre Cladosporium carrionii. 124p. Dissertação
(Mestrado em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos – Área de concentração:
Farmacologia) – Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, 2012.
O gênero Cladosporium abrange muitas espécies de fungos contaminantes e
oportunistas dematiáceos, sendo encontrados em diversos ambientes. Cladosporium
carrionii é considerada a espécie patogênica mais importante desse gênero, devido
aos inúmeros casos de doenças causadas por este fungo em todo o mundo, sendo
agente da cromoblastomicose, feo-hifomicoses e quadros alérgicos. O aumento da
resistência aos antifúngicos disponíveis e a sua toxicidade levam a busca por novos
antifúngicos, mais eficazes e menos tóxicos. Neste contexto, este estudo teve como
objetivo identificar os componentes do óleo essencial de Melissa officinalis L. e
investigar sua atividade antifúngica, in vitro, sobre cepas de Cladosporium carrionii.
A análise da composição química do óleo foi realizada por cromatografia a gás
acoplada ao espectrômetro de massas (CG-EM). Os ensaios da atividade
antifúngica foram realizados por meio da triagem microbiológica pela técnica de
difusão em meio sólido; determinação da concentração inibitória mínima (CIM) pela
técnica de microdiluição; concentração fungicida mínima (CFM); medida do
crescimento radial em diferentes intervalos de tempo; inibição da germinação de
conídios e avaliação das alterações morfológicas na presença do óleo essencial. Os
resultados da CG-EM mostraram 4 componentes principais, sendo o geranial (52 %)
o constituinte majoritário, seguido do citral (38,90 %), trans β-cariofileno (1,22 %) e
germacrene D (0,84 %), em ordem decrescente de percentual. Nos ensaios de
atividade antifúngica, o óleo essencial de M. officinalis inibiu o crescimento de 100 %
das cepas de C. carrionii ensaiadas, tendo sua CIM e CFM estabelecidas em 256
µg/mL, sendo considerado um produto com forte atividade antifúngica. Foi capaz de
induzir inibição do crescimento micelial radial a partir da concentração de 128 µg/mL
(CIM/2), e nas concentrações CIMX2 e CIMX4, houve inibição total deste
crescimento. Também foi observada inibição significante da germinação de conídios,
em todas as concentrações testadas, quando comparados ao controle (p<0,05),
sendo estas inibições potencializadas com o aumento da concentração, de modo
que na concentração CIMX2 houve inibição de 100% da germinação dos conídios
contados. Além disso, alterações morfológicas como diminuição da conidiação e
alterações estruturais nas hifas foram observadas nas cepas ensaiadas, após a
exposição ao óleo nas concentrações CIM/2, CIM e CIMX2. Diante do exposto,
conclui-se que o óleo essencial de M. officinalis apresenta importante atividade
antifúngica contra cepas de C. carrionii, representando uma nova possibilidade no
arsenal de produtos para terapêutica das micoses causadas por Cladosporium
carrionii.
Palavras-Chave:
Óleo
essencial.
dematiáceos. Cladosporium carrionii.
Lamiaceae.
Melissa
officinalis.
Fungos
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ABSTRACT
MENEZES, C. P. Antifungal activity in vitro of the essential oil of Melissa
officinalis L. (lemongrass) on Cladosporium carrionii. 124p. Dissertation (Master
in Bioactive Synthetic and Natural Products – Concentration area: Pharmacology) –
Federal University of Paraiba, João Pessoa, 2012.
The genus includes many species of Cladosporium fungi and opportunistic
dematiaceous contaminants being found in diverse environments. Cladosporium
carrionii is considered the most important pathogenic species of this genus due to the
numerous cases of disease caused by this fungus in the world, being an agent of
chromoblastomycosis, feohifomicoses and allergies. The increased resistance to
antifungal agents available and their toxicity lead to search for new antifungals, more
effective and less toxic. In this context, this study aimed to identify the components of
the essential oil of Melissa officinalis L. and investigate their antifungal activity in vitro
against strains of Cladosporium carrionii. The chemical composition of the oil was
performed by gas chromatography coupled to mass spectrometer (GC-MS). Assays
of antifungal activity were performed by microbiological screening by diffusion
technique in solid medium; determination of minimum inhibitory concentration (MIC)
by microdilution; minimum fungicidal concentration (MFC); measure radial growth at
different time intervals; Inhibition of conidial germination and assessment of
morphological changes in the presence of the essential oil. The results of GC-MS
showed 4 major components, being geranial (52%) the major constituent, followed by
the citral (38.90%), trans-β-caryophyllene (1.22%) and germacrene D (0.84%), in
descending order of percentage. In antifungal activity assays, the essential oil of M.
officinalis inhibited the growth of 100% of the strains of C. carrionii tested, and its
MIC and MFC established at 256 mg / mL, and is considered a product with strong
antifungal activity. Was able to induce radial mycelial growth inhibition from the
concentration of 128 mg / ml (MIC/2), and the concentrations MICX2 and MICX4,
there was complete inhibition of the growth. It was also observed significant inhibition
of conidial germination in all concentrations compared to control (p <0.05), those
potentiated inhibition with increased concentration so that the concentration was
MICX2 100% inhibition of germination of conidia counted. Furthermore,
morphological changes such as decreased conidiation and structural changes in
hyphae were observed in the strains tested, after exposure to oil concentrations
MIC/2, MIC and MICX2. Given the foregoing, it is concluded that the essential oil of
M. officinalis has a significant antifungal activity against strains of C. carrionii,
representing a new possibility in the arsenal of products for treatment of mycoses
caused by Cladosporium carrionii.
Keywords: Essential oil. Lamiaceae. Melissa officinalis. Dematiaceous fungi.
Cladosporium carrionii.
10
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Quadro clínico da cromoblastomicose .................................................... 26
Figura 2 - Conidiação do tipo Cladosporium............................................................ 29
Figura 3 - Características morfológicas de C. carrionii ............................................ 31
Figura 4 - Alvos de ação de drogas antifúngicas ..................................................... 33
Figura 5 - Estrutura química da anfotericina B ........................................................ 34
Figura 6 - Estrutura química do miconazol (A) e do fluconazol (B).......................... 36
Figura 7 - Estrutura química da flucitosina .............................................................. 37
Figura 8 - Estrutura química da micafungina ........................................................... 38
Figura 9 - Mecanismos de resistência fúngica aos antifúngicos .............................. 39
Figura 10 - Folhas e flores de M. officinalis ............................................................. 47
Figura 11 - Atividade antifúngica dos óleos essenciais sobre as cepas de C carrionii
.................................................................................................................................. 61
Figura 12 - Estrutura química do geranial (A) e do neral (B) ................................... 64
Figura 13 - Efeito do óleo essencial de M. officinalis e do fluconazol na cinética de
crescimento micelial radial de C. carrionii URM 5109 ............................................... 71
Figura 14 - Efeito do óleo essencial de M. officinalis e do fluconazol na cinética de
crescimento micelial radial de C. carrionii CQ 03 ...................................................... 72
Figura 15 - Cinética do crescimento micelial da cepa URM 5109 de C. carrioni, na
ausência e na presença do óleo essencial de M. officinalis no 14 o. dia. .................. 74
Figura 16 - Percentual de conídios germinados de Cladosporium carrionii na
ausência (controle) e na presença do óleo essencial de M. officinalis e do fluconazol
.................................................................................................................................. 76
Figura 17 - Efeito do óleo essencial de M. officinalis sobre a germinação de conídios
de C. carrionii. ........................................................................................................... 77
Figura 18 - Micromorfologia de C. carrionii URM 5109 na ausência (controle) e na
presença do óleo essencial de M. officinalis ............................................................. 80
11
LISTA DE QUADRO
Quadro 1 - Espécies vegetais das quais foram obtidos os óleos essenciais........... 52
12
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Classificação da planta Melissa officinalis (erva-cidreira) ....................... 46
Tabela 2 - Média dos halos de inibição do crescimento fúngico (em milímetros)
produzidos pelos óleos essenciais, in natura, sobre cepas de C. carrionii................ 60
Tabela 3 - Componentes do óleo essencial de M. officinalis ................................... 64
Tabela 4 - Valores da CIM e CFM do óleo essencial de Melissa officinalis,
Fluconazol e Anfotericina B sobre cepas de Cladosporium carrionii ......................... 67
13
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
ASD
Ágar Sabouraud Dextrose
ATP
Trisfosfato de Adenosina
CBM
Concentração Bactericida Mínima
CCS
Centro de Ciências da Saúde
CG-EM
Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa
CIM
Concentração Inibitória Mínima
CFM
Concentração Fungicida Mínima
CSD
Caldo Sabouraud Dextrose
DMSO
Dimetilsulfóxido
o
Grau(s) Celsius
LM
Laboratório de Micologia
NaCl
Cloreto de Sódio
µg
Micrograma
µg/mL
Micrograma por mililitro
µm
Micrômetro
mm
Milímetro
%
Percentual
ppm
Partes por milhão
UFC
Unidades Formadoras de Colônias
UFC/mL
Unidades Formadoras de Colônias por mililitro
UFPB
Universidade Federal da Paraíba
UFPE
Universidade Federal de Pernambuco
C
OBS.: Os termos não listados nesta relação encontram-se descritos no texto.
14
Sumário
1 Introdução ............................................................................................................. 17
2 Objetivos ............................................................................................................... 21
2.1 Objetivo geral ................................................................................................ 21
2.2 Objetivos específicos.................................................................................... 21
3 Referencial Teórico .............................................................................................. 23
3.1 Considerações gerais sobre fungos............................................................ 23
3.2 Gênero Cladosporium ................................................................................... 28
3.2.1Cladosporium carrionii............................................................................. 30
3.3 Terapêutica antifúngica ................................................................................ 32
3.3.1 Poliênicos ................................................................................................. 33
3.3.2 Azóis ......................................................................................................... 35
3.3.3 Flucitosina ................................................................................................ 36
3.3.4 Equinocandinas ....................................................................................... 37
3.4 Resistência .................................................................................................... 38
3.5 Produtos Naturais ......................................................................................... 40
3.6 Óleos Essenciais ........................................................................................... 42
3.7 Família Lamiaceae ......................................................................................... 45
3.8 Melissa officinalis L....................................................................................... 46
4 Material e Métodos ............................................................................................... 50
4.1 Local de Trabalho .......................................................................................... 50
4.2 Espécies Fúngicas ........................................................................................ 50
4.3 Meios de Cultura ........................................................................................... 50
4.4 Inóculo............................................................................................................ 50
15
4.5 Antifúngicos Sintéticos ................................................................................ 51
4.6 Óleos Essenciais ........................................................................................... 51
4.7 Análise dos componentes do óleo essencial ............................................. 52
4.8 Ensaios de atividade antifúngica ................................................................. 53
4.8.1 Triagem microbiológica .......................................................................... 53
4.8.2 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) ...................... 54
4.8.3 Determinação da Concentração Fungicida Mínima (CFM) ................... 55
4.8.4 Determinação da cinética de crescimento micelial .............................. 55
4.8.5 Interferência sobre a germinação de conídios ...................................... 56
4.8.6 Efeito do óleo essencial sobre a morfogênese fúngica ....................... 57
4.9 Análise Estatística ........................................................................................ 57
5 Resultados e Discussão ...................................................................................... 60
5.1 Triagem microbiológica ................................................................................ 60
5.2 Análise dos componentes do óleo essencial de M. officinalis ................. 63
5.3 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração
Fungicida Mínima (CFM) ......................................................................................... 66
5.4 Cinética do crescimento micelial radial ...................................................... 70
5.5 Efeito do óleo essencial de M. officinalis sobre a germinação de conídios
de C. carrionii .......................................................................................................... 75
5.6 Efeito do óleo essencial sobre a morfogênese fúngica ............................. 79
6. Considerações Finais ......................................................................................... 83
Referências .............................................................................................................. 85
ANEXO A – Artigo submetido .......................................................................... 107
ANEXO B – Trabalhos apresentados em congressos.................................... 119
16
Introdução
17
1 Introdução
Ao longo dos últimos dez anos, a incidência de infecções importantes
causadas por fungos tem aumentado. Estas infecções estão ocorrendo como
infecções nosocomiais e em indivíduos com sistema imunológico comprometido.
Além
disso,
milhares
de
doenças
causadas
por
fungos
afetam
plantas
economicamente importantes, custando anualmente mais de um bilhão de dólares
(CASE, FUNKE, TORTORA et al., 2010).
Os fungos pertencentes ao gênero Cladosporium são considerados
contaminantes ambientais, sendo encontrados em diversos ambientes. Sua relação
com a saúde humana e até mesmo animal está principalmente relacionada com
quadros de patologias oportunistas quando do desenvolvimento de severa
imunossupressão (TRABULSI et al., 2004; PUTZKE, PUTZKE, 2004; TASIC, TASIC,
2007; CORREIA et al., 2010; BAKHESHWAIN et al., 2011).
As principais infecções fúngicas, causadas por espécies de Cladosporium,
são as feo-hifomicoses e a cromoblastomicose, que são infecções crônicas difíceis
de tratar, devido ao longo período de tratamento, às limitadas opções terapêuticas,
às condições da imunidade do doente e à relativa resistência do fungo aos
antifúngicos habitualmente utilizados, podendo, portanto, ocorrer recidivas (SIDRIM,
ROCHA, 2004; LACAZ et al., 2002).
Tendo em vista a crescente importância clínica e epidemiológica dispensada
às infecções micóticas e a necessidade de tratamentos mais eficazes e menos
tóxicos para os indivíduos acometidos, numerosas pesquisas vêm sendo
desenvolvidas na expectativa de se obter novos produtos antifúngicos. Essa
situação tem encorajado a adoção de novas terapêuticas, dentre elas o uso mais
extenso dos produtos naturais, em especial das plantas medicinais (ODDS,
BROWN, GOW, 2003; BANSOD, RAI, 2008).
Plantas medicinais e aromáticas são amplamente empregadas na medicina
popular e têm sido extensivamente estudadas a fim de encontrar compostos mais
eficazes e menos tóxicos. Constituem uma importante fonte de novos compostos
biologicamente ativos (NAKAMURA et al., 2004; OLIVEIRA et al., 2006;
PRABUSEENIVASAN, JAYAKUMAR, IGNACIMUTHU, 2006), contendo uma série
de substâncias que podem ser usadas para o tratamento de diferentes doenças
infecciosas (SAAD, 2010).
18
A atividade antifúngica de produtos obtidos de plantas medicinais tem sido
cientificamente atribuída aos óleos essenciais, cumarinas, terpenos, flavonóides,
amidas, imidas e alcalóides (AQUINO et al., 2003; GAYOSO et al., 2005; MOREIRA
et al., 2007).
Os óleos essenciais constituem os elementos voláteis originados do
metabolismo secundário das plantas, contidos em muitos órgãos vegetais, e estão
relacionados com diversas funções necessárias à sobrevivência vegetal, exercendo
papel fundamental na defesa contra microrganismos (SIQUI, SAMPAIO, SOUSA,
2000; GONÇALVES et al., 2003). São uma rica fonte de compostos com atividades
biológicas (MILHAU et al., 1997), sendo conhecidos desde a antiguidade por possuir
propriedades antibacterianas e antifúngicas (CAVALEIRO et al., 2006; COWAN,
1999; TEMPONE et al., 2008).
Considerando a ampla atividade biológica apresentada pelos produtos de
origem natural, óleos essenciais obtidos a partir de espécies vegetais têm sido
investigados para determinação de suas atividades antimicrobianas (PEREIRA et al.,
2011a; GUERRA, 2012; OLIVEIRA et al., 2011; LIMA et al., 2006; BANSOD, RAI,
2008; JANTAN et al., 2008; VIUDA-MARTOS, 2008).
Melissa officinalis L., pertencente à família Lamiaceae, é uma planta
aromática, conhecida popularmente como, melissa, erva cidreira verdadeira, melissa
romana, chá da França. As suas folhas e inflorescências são empregadas na forma
de chá como calmante nos casos de ansiedade e insônia e também como
medicação contra cefaleias, enxaqueca, problemas digestivos, dores de origem
reumática e para normalizar as funções gastrintestinais (SIMÕES et al., 1998;
LORENZI, MATOS, 2002; CARNAT et a.l, 1998).
A planta possui atividade sedativa, tendo um papel importante no controle das
emoções. É tranquilizante e também indutora do sono (SADRAEI et al., 2003). De
acordo com Bolkent et al. (2005), extratos de M. officinalis são efetivos na redução
dos níveis de peroxidação lipídica e na redução nos níveis da aspartato
aminotransferase
e
da
alanina
aminotransferase
em
estudo
com
ratos
hiperlipidêmicos.
O óleo essencial é muito utilizado pelas indústrias farmacêutica, cosmética e
alimentícia
devido
as
suas
inúmeras
atividades
biológicas,
dentre
elas
antibacteriana, antifúngica, ansiolítica, antioxidante e antitumoral (LORENZI,
19
MATOS, 2002; HABER et al., 2005; MIMICA-DUKIC et al., 2004; PEREIRA et al.,
2005; DE SOUZA et al., 2004).
Diante da importância clínica e alta incidência das micoses causadas por
fungos dematiáceos, aumento do número de indivíduos imunocomprometidos,
surgimento de cepas resistentes, toxicidade dos antifúngicos existentes, é de
fundamental importância a busca por novos agentes antifúngicos mais eficazes,
menos tóxicos, sendo os produtos derivados de plantas medicinais excelentes
alternativas para esse propósito. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar a
atividade antifúngica de óleos essenciais obtidos de espécies vegetais pertencentes
à família Lamiaceae contra cepas de Cladosporium carrionii.
20
Objetivos
21
2 Objetivos
2.1 Objetivo geral
Investigar a atividade antifúngica, in vitro, de óleos essenciais contra cepas de
Cladosporium carrionii.
2.2 Objetivos específicos
• Realizar triagem microbiológica de óleos essenciais obtidos de espécies
vegetais pertencentes à família Lamiaceae sobre cepas de Cladosporium
carrionii;
• Analisar os constituintes químicos presentes no óleo essencial com melhor
atividade, baseado no resultado da triagem;
• Determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM) e a Concentração
Fungicida Mínima (CFM) do produto selecionado na triagem biológica;
• Avaliar a interferência do óleo essencial selecionado sobre a cinética de
crescimento micelial radial;
• Estudar o efeito do óleo essencial na germinação de conídios e morfogênese
fúngica.
22
Referencial Teórico
23
3 Referencial Teórico
3.1 Considerações gerais sobre fungos
Os fungos são organismos eucariontes e heterotróficos incluídos no Domínio
Eucarya, no Reino Fungi (DEACON, 2006). Apresentam espessa parede celular
constituída por glicoproteínas e polissacarideos, principalmente glucano e quitina,
além de uma membrana celular, cujo principal componente é o ergosterol
(BOWMAN, FREE, 2006).
Possuem ampla distribuição na natureza, podendo ser encontrados dispersos
no meio ambiente, em vegetais, ar atmosférico, solo, água, animais e alimentos.
Suas espécies sofrem em sua incidência variações conforme a localidade, estação
do ano, grau higroscópico do ar, entre outras (LACAZ et al., 2002; SIDRIM, ROCHA,
2004).
A sua relação com a espécie humana é bastante variada podendo
desempenhar diversos papéis, como causar doenças nas culturas vegetais,
originando consideráveis perdas econômicas; decompor e reciclar matéria orgânica;
produzir metabólitos tóxicos em alimentos humanos e animais; desempenhar grande
atividade bioquímica, produzindo, por exemplo, antibióticos, esteróides, ciclosporinas
e enzimas alimentares; auxiliar no processamento alimentar de pão, produtos
lácteos e bebidas alcoólicas; ser consumidos diretamente na alimentação, como os
cogumelos e o queijo; ser agentes de controle biológico contra pragas e outros
fungos patogênicos de plantas; originar doenças fúngicas, ou até mesmo causar a
morte, em indivíduos imunocomprometidos (DEACON, 2006).
Os fungos podem causar uma série de doenças infecciosas, denominadas de
micoses. As micoses são, geralmente, infecções crônicas, de longa duração, e de
difícil tratamento, visto que, os fungos são organismos que crescem lentamente
(CASE, FUNKE, TORTORA, 2010).
Os fungos de interesse médico, agentes de micoses, são de dois tipos
morfológicos: multicelular, produzindo estruturas filamentosas microscópicas sendo
designados de fungos filamentosos, ou unicelulares como são conhecidas as
leveduras. Existem ainda os fungos dimórficos, que se apresentam sob ambas as
formas, dependendo principalmente da temperatura, mas sob a influência também
24
do teor de CO2 e das condições nutricionais (SULLIVAN, MORAN, COLEMAN, 2005;
BRASIL, 2004).
As leveduras têm como estrutura primária, células que se reproduzem por
brotamento, único ou múltiplo, em geral de forma arredondada. Estas células são
esporos de origem assexual e denominam-se blastoconídios. São capazes de
colonizar o homem e outros animais, estando presentes sobre a pele, trato
gastrointestinal e mucosas, vivendo comensalmente. Frente à perda do equilíbrio
parasita-hospedeiro, podem causar diversos quadros infecciosos com formas
clínicas localizadas ou disseminadas (BRASIL, 2004, 2009).
Os fungos filamentosos são microrganismos mais desenvolvidos. Possuem
como elemento constituinte básico a hifa, que pode ser septada e não septada
(cenocítica). A partir da hifa, formam-se esporos, para propagação das espécies. Na
grande maioria dos fungos, os esporos podem ser chamados de conídios. São os
mais abundantes na natureza, porém normalmente, não fazem parte da microbiota
animal, e, desse modo, o homem não é um reservatório importante para esse grupo
de seres. As portas de entrada no hospedeiro são as vias aéreas superiores ou
soluções de continuidade na barreira epidérmica após traumatismos com objetos
perfurocortantes (BRASIL, 2009).
Segundo os tecidos, órgãos e indivíduos atingidos, as infecções fúngicas são
classificadas como oportunistas, superficiais ou disseminadas. As infecções
oportunistas
atingem
exclusivamente
indivíduos
com
sistemas
imunitários
debilitados. Nos casos de infecções superficiais os microrganismos estão confinados
às camadas exteriores dos epitélios. E quando penetram essa barreira, entrando na
corrente sanguínea e disseminando-se por todo o corpo, são consideradas infecções
disseminadas ou sistêmicas (SULLIVAN, MORAN, COLEMAN, 2005).
Algumas das infecções humanas mais comuns, superficiais e relativamente
inócuas, estão associadas a fungos. No entanto, as cerca de 200 espécies fúngicas
consideradas patogênicas humanas, podem também causar doenças muito mais
devastadoras, como as aspergiloses invasivas ou as candidíases sistêmicas, ambas
com elevadas taxas de mortalidade associadas (SULLIVAN, MORAN, COLEMAN,
2005; DEACON, 2006).
Apesar dos humanos possuírem um nível elevado de imunidade inata em
relação aos fungos, com exceção dos causadores de infecções na pele, unhas e
cabelo, a situação sofre uma considerável alteração quando os alvos são indivíduos
25
com sistemas imunitários muito debilitados, como os encontrados em ambientes
hospitalares (DEACON, 2006).
Avanços nos cuidados com a saúde ao longo dos últimos anos permitem a
sobrevida de pacientes imunocomprometidos, levando a um aumento no número de
pessoas com risco de adquirir infecções fúngicas oportunistas. E a tendência parece
ser que este número continue a crescer (SILVA, PAULA, ESPINDOLA, 2009).
Dentre
estes
grupos
de
micoses
oportunistas,
merecem
destaque,
atualmente, aquelas causadas por fungos escuros, denominados dematiáceos.
Os fungos dematiáceos constituem um grupo de fungos escuros encontrados
na natureza e que possuem como característica a presença de melanina,
responsável pela pigmentação escurecida de seus conídios e hifas e que parece se
comportar como um fator de virulência. Mais de cem espécies e sessenta gêneros
destes fungos estão implicados em um amplo espectro de infecções humanas
(REVANKAR, 2007).
Os fungos dematiáceos têm a propriedade de digerir as proteínas da
epiderme, causando várias lesões de pele, desde pequenas manchas avermelhadas
até severas erupções que podem abrir caminho para a disseminação desses fungos,
causando a proliferação das lesões, podendo comprometer parcial ou totalmente
alguns órgãos (ESPINEL-INGROFF et al., 1986).
São responsáveis por causar doenças como a cromoblastomicose, a feohifomicose e vários distúrbios alérgicos, mas poucos são estudados quanto ao seu
potencial patogênico (SINGH et al., 2005; ABLIZ et al., 2004).
Cromoblastomicose é uma infecção micótica de aspecto polimórfico, causada
por fungos dematiáceos, crônica de evolução lenta, que acomete a pele e tecido
subcutâneo, preferencialmente, envolvendo membros inferiores. Em muitos casos,
as lesões são unilaterais e caracterizam-se por irritação, formação de escamas,
vermelhidão local, inchaço e inflamação das bordas. Iniciam-se com uma grande
variação de pigmentação na pele relacionada à produção de corpos escleróticos
pretos ou marrom-escuros nos tecidos. As lesões iniciais são pápulas ou nódulos
que
evoluem
tornando-se
verrucosas,
podendo
espalhar-se
pelos
tecidos
adjacentes, por via hematogênica ou linfática (Figura 1). As interações entre o fungo
e o hospedeiro, bem como a resistência imunológica, a quantidade de inóculo e a
virulência do fungo, determinam alterações imunopatológicas importantes para
26
controlar sua disseminação (MATTE et al., 1997; LACAZ et al., 2002; GIMENES et
al., 2006).
Figura 1 – Quadro clínico da cromoblastomicose.
A
B
C
D
CORREIA et al., 2010.
A: placa verrucosa no cotovelo esquerdo. B: placa verrucosa ulcerada no pé esquerdo. C: nódulo
verrucoso e infiltrado no dorso da mão direita. D: laca com bordas verrucosas e com centro atrófico e
esclerótico na nádega esquerda.
A infecção ocorre pela inoculação traumática de conídios e fragmentos de
hifas do fungo que podem estar contidos em material orgânico como pedaços de
plantas, galhos, tocos, solo ou detritos, sendo portanto, prevalente entre indivíduos
com ocupações ao ar livre e que andam descalços, mais comum nos homens, com
idade entre 30 e 60 anos. São muitos os fatores contribuíntes para a infecção,
dentre eles a temperatura da pele, a quantidade de fragmentos fúngicos inoculados
27
durante a exposição e o mais importante, a umidade (SAMPAIO, RIVITTI, 1998;
SIDRIM, ROCHA, 2004; RIBEIRO et al., 2006).
É uma doença de distribuição cosmopolita, com maior incidência nas regiões
tropicais e subtropicais de clima quente e úmido da América Latina, África, Ásia e
Austrália. No Brasil, o Rio Grande do Sul, São Paulo, Rio de Janeiro, Minas Gerais e
estados da região Amazônica são áreas endêmicas, sendo uma infecção fúngica
presente principalmente na população rural brasileira (MATTE et al., 1997; SILVA,
SOUZA, ROZENTAL, 1999; OGAWA et al., 2003; MARQUES et al., 2006; CORREIA
et al., 2010).
Os principais agentes etiológicos da cromoblastomicose são Fonsecaea
pedrosoi, Fonsecaea compacta, Phialophora verrucosa, Cladosporium carrioni e
Rhinocladiella aquaspersa, frequentemente encontrados no solo, em vegetais,
espinhos de plantas, vegetação em decomposição e em madeiras putrefatas, sob
forma saprofítica (SIDRIM, ROCHA, 2004; MINOTTO et al., 2001; WORTMAN,
WINSTON-SALEM, 1995; MIYTAJI, NISHIMURA, 1991).
As feo-hifomicoses, de acordo com McGinnis (1983) englobam importante,
distinto e heterogêneo grupo de infecções micóticas causadas por fungos
dematiáceos, que vão desde o comprometimento superficial até doenças em órgãos
profundos, nas quais os agentes etiológicos ocorrem nos tecidos como células
leveduriformes, pseudo-hifas e hifas demacioides curtas ou alongadas, regulares,
distorcidas ou dilatadas ou em combinação com qualquer destas formas. Tais
fungos vivem como saprófitas no solo, nas plantas, na vegetação e na madeira em
decomposição (LACAZ et al., 2002; SIDRIM, ROCHA, 2004).
Os achados clínicos das feo-hifomicoses são bastante variáveis, na
dependência do padrão imunológico do hospedeiro, sítio anatômico acometido e
espécie fúngica implicada, podendo assim ser classificada como superficial,
subcutânea e sistêmica (SIDRIM, ROCHA, 2004).
As micoses superficiais são infecções subagudas ou crônicas da camada
superficial da pele, pelos e unhas. Caracterizam-se por provocar quadros clínicos
confinados ao extrato córneo, de forma análoga à dermatomicose, ceratite micótica
e onicomicoses. São originadas por microrganismos da microbiota normal como
Malassezia furfur ou adquiridos do meio ambiente como Piedraia hortae, Curvularia
sp.,
Alternaria
spp.,
ALTERTHUM, 2004).
Cladosporium
spp.
(SCHWARTZ,
2004;
TRABULSI,
28
A micose subcutânea é a forma clínica mais comum de feo-hifomicose,
caracterizando-se por um quadro infeccioso de evolução crônica, que tem como
origem um traumatismo cutâneo. No local do traumatismo ocorre a inoculação do
fungo dematiáceo, que evolui com formação de nódulos contendo secreção
sanguinolenta ou seropurulenta (SIDRIM, ROCHA, 2004; TRABULSI, ALTERTHUM,
2004).
A micose sistêmica é a forma clínica mais rara, sendo encontrada, sobretudo,
em pacientes imunossuprimidos (diabéticos, leucêmicos, pacientes debilitados, com
doenças crônicas e por uso de drogas imunossupressoras). As feo-hifomicoses
sistêmicas acometem por excelência os órgãos internos, especialmente o cérebro.
No entanto, outros órgãos podem ser afetados, como por exemplo, coração,
intestino, ossos, baço, fígado e rins. Acredita-se que a principal forma de infecção é
a inalação. As principais espécies fúngicas envolvidas nesses quadros são
Cladosporium bantiananum, Curvularia geniculata, Exophiala jeanselmei, Wangiella
dermatitidis, Alternaria spp., Bipolaris hawaiiensis (PATEL et al., 2006; SINGH et al.,
2005; SIDRIM, ROCHA, 2004).
3.2 Gênero Cladosporium
O gênero Cladosporium, criado por Link, em 1815, é um dos maiores e mais
heterogêneos gêneros de Hyphomycetes (DUGAN, SCHUBERT, BRAUN, 2004).
Esse gênero abrange muitas espécies de fungos contaminantes e oportunistas
dematiáceos que são encontrados ubiquamente como saprófitas no solo e em
materiais em decomposição. Muitas espécies são conhecidas por serem patógenos
de plantas, enquanto outros são regularmente encontrados como contaminantes e
agentes de deterioração nos alimentos ou produtos industriais, além de ser
frequentemente associados com queixas asmáticas (RIESEN, SIEBER 1985;
BROWN, HYDE, GUEST, 1998; EL-MORSY, 2000; SCHUBERT, 2005).
Este gênero compreende mais de 30 espécies, estando entre os fungos mais
comumente isolados do ambiente em quase todo lugar do mundo. As espécies mais
isoladas
são
Cladosporium
spherospermum,
elatum,
Cladosporium
Cladosporium
cladosporioides,
Cladosporium oxysporum (TASIC, TASIC, 2007).
herbarum,
Cladosporium
Cladosporium
carrionii,
29
Na fase saprófita, formam hifas septadas e escuras, com conidióforos laterais
e terminais de tamanhos variados. A conidiação é do tipo Cladosporium, isto é, os
conidióforos produzem cadeias longas e ramificadas de conídios castanhos, ovais e
de paredes lisas e finas (Figura 2). Nos tecidos aparecem como grandes células
redondas, septadas e escuras, com 5-12 µm de diâmetro (BENSCH et al., 2012;
FISHER, COOK, 2001).
Figura 2 – Conidiação do tipo Cladosporium.
Fonte: FISHER, COOK, 2001.
Os conidióforos são macronematosos ou semi–macronematosos e em alguns
casos podendo ser micronematosos. Os conidióforos macronematosos normalmente
são retos ou flexuosos (curvados), não ramificados ou com ramificações restritas na
região apical, formando um estipe ou uma cabeça de coloração marrom olivácea à
marrom, podem ter superfície lisa ou verrugosa.
As células conidiogênicas são poliblásticas usualmente integradas, terminais,
intercalares, mas, muitas vezes discretas, simpodiais e de formato cilíndrico,
cicatrizadas, com proeminência na célula conidiogênica. Os conídios podem ser
produzidos em cadeias, sendo catenulados, podem ser muitas vezes solitários em
algumas espécies, onde os conídios são mais largos e algumas vezes são
ramificados em cadeia acropleurógena, são simples, cilíndricos, ovóides, doliformes,
fusiformes, elipsóides, esféricos ou sub-esféricos. Possuem coloração marrom
30
olivácea escuro ou marrom, a superfície do conídio pode ser lisa, verrugosa ou
equinulada com 0–3 septos ocasionalmente (ELLIS, 1971).
Os conídios são bem adaptados para se espalhar facilmente em grandes
números por longas distâncias. São importantes alérgenos, e em grandes
quantidades, podem afetar gravemente as pessoas asmáticas e com doenças
respiratórias. A exposição prolongada pode enfraquecer o sistema imunológico
(FARR et al., 1989; MULLINS, 2001; FLANNIGAN, 2001).
São fungos de crescimento lento, atingindo a maturidade dentro de 21 dias.
Caracterizam-se pela produção de colônias efusas ou ocasionalmente puntiformes,
com superfícies planas, aveludadas, circulares, de crescimeto lento e enrrugado,
que vão do verde oliva ao marrom escuro e reverso preto (TAMSIKAR, NAIDU,
SINGH, 2006).
Apesar de sua prevalência, apenas um número limitado de espécies têm sido
documentados como agentes de infecções micóticas em humanos (MATSUMOTO et
al., 1994; DE HOOG et al., 2000), sendo responsáveis por causar infecções de pele
e unhas, assim como infecções pulmonares e sinusite (RIVAS, THOMAS, 2005;
ZOPPAS, VALENCIA-BARRERA, FERNÁNDEZ-GONZÁLES, 2011). Espécies de
Cladosporium não produzem micotoxinas de grande preocupação, porém produzem
compostos orgânicos voláteis associados com odores (RIVAS, THOMAS, 2005).
As espécies C. cladosporioides, C. herbarum, C. oxysporum, C. carrionii e C.
sphaerospermum têm sido observadas como responsáveis primárias por quadro de
feo-hifomicoses superficiais (onicomicoses, ceratites, etc.), cromoblastomicoses e
feo-hifomicoses profundas (meningites, quadro pulmonares, etc.) (DE HOOG et al.,
2000; KWON-CHUNG et al., 1975; SIDRIM, ROCHA, 2004; NAMRATHA, NADGI,
KALE, 2010; CORREIA et al., 2010).
3.2.1 Cladosporium carrionii
A espécie Cladosporium carrionii é encontrada no solo, na madeira e nos
vegetais em decomposição. Sua distribuição é universal, mais frequente nas zonas
tropicais e subtropicais, mas ocasionalmente, é encontrada nas zonas temperadas.
Infecções com C. carrionii ocorrem, sobretudo, nas pessoas que trabalham ao ar
livre, sem a proteção de roupas adequadas, sapatos e luvas. Os fungos penetram na
31
pele através de algum ferimento ou pequenos traumatismos, tais como cortes,
espinhos infectados, lascas de madeira. Exposições repetidas e má saúde geral
podem contribuir para o desenvolvimento da infecção (CORREIA et al., 2010).
C. carrionii é considerada a espécie patogênica mais importante desse
gênero, devido aos inúmeros casos de doenças causadas por este fungo em todo o
mundo, sendo um agente reconhecido de cromoblastomicose, feo-hifomicoses e
quadros alérgicos. As infecções causadas por C. carrionii são crônicas e aparecem
como micoses na pele, tecidos subcutâneos e unhas (ABLIZ et al., 2004).
Casos de cromoblastomicose causada por C. carrionii são comumente
encontrados na Austrália, Venezuela, Madagascar e América do Sul (DE HOOG et
al., 2007). No Brasil, o Rio Grande do Sul, São Paulo, Rio de Janeiro, Minas Gerais
e estados da região amazônica são áreas endêmicas (CORREIA et al., 2010).
Macromorfologicamente, as colônias de Cladosporium carrionii, depois de 10
a 30 dias, em Ágar Sabouraund Dextrose a 28
o
C, são verde-oliva, verde-
acinzentadas ou lavanda, com pigmento reverso negro-azeviche. Colônias mais
velhas podem tornar-se cinza-escuras ou negras tanto na superfície quanto no
reverso. A superfície é recoberta com micélio aéreo curto, que lhe confere uma
textura aveludada ou algodonosa. A topografia pode ser espalhada, dobrada ou
elevada, ver figura 3A (FISHER, COOK, 2001).
Figura 3 – Características morfológicas de C. carrionii.
B
A
Fonte: MENEZES (2012).
o
A: Macromorfologia, colônia após 15 de crescimento em ASD a 28 C, apresentando coloração verdeoliva e superfície com textura aveludada. B: Micromorfologia, presença de hifas longas e septadas,
com conídios de tamanhos variados na porção terminal.
32
As hifas do C. carrionii apresentam um pigmento marrom-esverdeado nas
preparações sem corantes. Elas são septadas e têm 4µm de largura. Os conídios
apresentam tamanhos variados e, muitas vezes, apresentam septos. São laterais ou
terminais, de cor marrom-esverdeada clara. As extremidades distais dos conidióforos
são levemente dilatadas. Cadeias ramificadas longas de 12 a 15 blastoconídios são
produzidas (Figura 3B) (FISHER, COOK, 2001).
3.3 Terapêutica antifúngica
O tratamento das feo-hifomicoses é bastante variável no que se refere ao tipo
e à localização da lesão, bem como ao fungo envolvido, dependendo, portanto da
forma clínica. A diversidade de quadros de feo-hifomicose impõe condutas
particulares, entretanto, o tratamento de primeira escolha para as feo-hifomicoses é
o itraconazol em esquema prolongado. Lesões localizadas devem ser tratadas
cirurgicamente ou com infiltrações locais de anfotericina B e para casos
disseminados emprega-se a associação de anfotericina B e 5-fluorocitosina
(SIDRIM, ROCHA, 2004; LACAZ et al., 2002; REVANCAR et al., 2002; FONSECA et
al., 1990).
A cromoblastomicose é uma das infecções fúngicas mais difíceis de tratar,
sendo o tratamento longo e podendo ter recidivas, assim sendo, o tratamento pode
variar dependendo de cada situação e da extensão da lesão. Até o presente
momento, não se conhece nenhum fármaco ou procedimento eficaz para eliminar o
fungo do organismo por ele afetado. Porém, existem três modalidades de
tratamento, isto é, tratamento físico (crioterapia e exérese cirúrgica), quimioterápico
e combinação de terapias. No tratamento farmacológico existem alguns fármacos
indicados para o combate dessa doença, sendo o grupo dos azólicos os antifúngicos
de primeira escolha para a terapia. Os melhores resultados são obtidos com
itraconazol e terbinafina em doses altas, por pelo menos 6 a 12 meses. O sucesso
do tratamento está relacionado ao agente causal, à forma clínica e a extensão das
lesões (QUEIROZ-TELLES, et al., 2009; CUCÉ, WROLCLAWSKI, SAMPAIO, 1980;
GUPTA, TABORDA, SANZOVO, 2002; BONIFAZ, PAREDES-SOLIS, SAUL, 2004).
Dessa forma, o arsenal terapêutico antifúngico tem aumentado muito, nestes
últimos anos, buscando atender a essa demanda crescente de casos na micologia
médica (SIDRIM, ROCHA, 2004).
33
Os agentes terapêuticos atuais podem ser amplamente classificados em dois
grupos: o primeiro, os antibióticos antifúngicos que ocorrem naturalmente, tais como
os poliênicos e as equinocandinas, e o segundo, os fármacos sintéticos, incluindo os
azóis e as pirimidinas fluoradas. Os principais alvos das drogas antifúngicas são a
parede celular, membrana e núcleo da célula fúngica, conforme figura 4 (RANG,
DALE, RITTER, 2007).
Figura 4 – Alvos de ação de drogas antifúngicas.
Inibição da síntese de
DNA / RNA no núcleo
Pirimidinas Fluoradas
Flucitosina
Inibição da biossíntese
de
ergosterol
na
membrana celular
Azóis:
Fluconazol
Cetoconazol
Itraconazol
Voriconazol
Posaconazol
Inibição da síntese de
β-1,3-glucana na parede
celular
Equinocandinas:
Caspofungina
Micafungina
Anidulafungina
Interrupção do
ergosterol na
membrana celular
Polienos:
Anfotericina B
Nistatina
Fonte: Adaptado de CHANDRASEKAR, 2011
3.3.1 Poliênicos
Introduzidos na década de 1950, os poliênicos representam a mais antiga
família de fármacos antifúngicos (MOHR et al., 2008; MATHEW, NATH, 2009).
34
Esses agentes apresentam importante efeito fungicida, amplo espectro de ação e
baixa tendência ao desenvolvimento de resistência entre os fungos patogênicos
(BRAUTASET et al., 2011).
Do grande grupo de poliênicos, as duas drogas mais usadas clinicamente são
anfotericina B e nistatina (BENNETT, 2006), que apresentam estruturas químicas
similares e o mesmo mecanismo de ação (RANG, DALE, RITTER, 2007).
A atividade antifúngica dos poliênicos é mediada por meio da sua ligação ao
ergosterol, um componente essencial da membrana citoplasmática fúngica
(MATHEW, NATH, 2009). A ligação resulta na formação de canais aquosos e não
aquosos que aumentam a permeabilidade da membrana, causando o vazamento de
componentes celulares, incluindo proteínas e cátions monovalentes e divalentes,
através desses poros, o que leva à perda de potencial de membrana e, finalmente, a
morte da célula (CHANDRASEKAR, 2011; MOHR et al., 2008; MATHEW, NATH,
2009).
Os antibióticos poliênicos são lactonas macrocíclicas que contêm uma porção
hidrofóbica conjugada por dupla ligação e uma porção hidroxilada hidrofílica
(WISPELWEY, PARSONS, 2006).
Figura 5 – Estrutura química da anfotericina B.
Fonte: BRAUTASET et al., 2011
A anfotericina, também chamada de anfotericina B, é uma mistura de
substâncias antifúngicas derivadas de culturas de Streptomyces. Apresenta sete
ligações duplas conjugadas na sua região polieno (Figura 5), sendo esta região
35
essencial para a ação fungicida, devido a interação hidrofóbica com os esteróis de
membrana (RANG, DALE, RITTER, 2007; BRAUTASET et al., 2011)
Ativa contra a maioria dos fungos filamentosos e das leveduras é considerada
o padrão-ouro para o tratamento das infecções fúngicas disseminadas causadas por
vários microrganismos (RANG, DALE, RITTER, 2007).
O uso clínico da anfotericina B é limitado, por apresentar baixa seletividade,
sendo potencialmente tóxica às células humanas, ocasionando, principalmente,
nefrotoxicidade que pode ser observada nos primeiros dias de uso clínico, distúrbios
eletrolíticos e efeitos colaterais relacionados à infusão aguda (OSTROSKYZEICHNER et al., 2003; ODDS, BROWN, GOW, 2003; HA et al., 2011).
Entretanto, apesar da elevada toxicidade da anfotericina B, o interesse clínico
nela permanece devido à sua alta potência, amplo espectro de ação e,
principalmente, pelo fato de que raramente são isoladas cepas resistentes em
pacientes (EGGIMAN, GARBINO, PITTET, 2003; AKINS, 2005).
3.3.2 Azóis
Os azóis são quimioterápicos antifúngicos sintéticos, com amplo espectro de
ação, caracterizados por um anel pentagonal na estrutura molecular, o qual contém
três átomos de carbono e dois de nitrogênio (imidazólicos), ou dois de carbono e três
de nitrogênio (triazólicos). Ambos compartilham o mesmo mecanismo de ação
(MARTINEZ, 2006).
Considerando as drogas de uso sistêmico, o subgrupo dos imidazólicos
compreende o miconazol (Figura 6A), o cetoconazol, clotrimazol, econazol,
fenticonazol, tioconazol e sulconazol e dos triazólicos incluem o fluconazol (Figura
6B) e itraconazol, triazóis de primeira geração, voriconazol, posaconazol e
ravuconazol, de segunda geração (RANG, DALE, RITTER, 2007).
São agentes fungistáticos, atuando seletivamente na inibição da síntese de
ergosterol, principal esterol presente na membrana celular das células fúngicas. Esta
interferência se processa por meio da inibição da lanosina 14-α-desmetilase, enzima
microssômica do citocromo P450, que é responsável pela conversão do lanosterol
em ergosterol, por meio da remoção oxidativa do grupo 14-α-metil do lanosterol. A
depleção resultante de ergosterol leva ao acúmulo de esteróis tóxicos sobre a
superfície fúngica, alterando a fluidez da membrana, comprometendo as funções de
36
determinados sistemas enzimáticos associados à membrana, como a ATPase e as
enzimas do sistema de transporte de elétrons, inibindo, assim, o crescimento e a
replicação dos fungos (BENNETT, 2006; DODDS-ASHLEY, 2006; MOHR et al.,
2008).
Os eventos adversos associados a esta família de antifúngicos restringem-se
ao local da sua aplicação, podendo incluir irritação, prurido, sensação de queimação,
maceração, fissuras, ardência, e, mais raramente, dermatite alérgica de contato
(ZHANG, CAMP, ELEWSKI, 2007).
Figura 6 – Estrutura química do miconazol (A) e do fluconazol (B).
A
B
Fonte: (A) WISPELWEY, PARSONS, 2006; (B) PASQUALOTTO, DENNING, 2008.
3.3.3 Flucitosina
Flucitosina é uma pirimidina fluorada relacionada com a fluoruracila e a
floxuridina. Trata-se da 5-fluorocitocina (GILMAN, 2005), com a seguinte estrutura
química (Figura 7):
37
Figura 7 – Estrutura química da flucitosina.
Fonte: BENNETT, 2006.
A flucitosina é um antifúngico sintético ativo por via oral que é efetivo contra
uma faixa limitada de infecções fúngicas sistêmicas, sendo único em seu
mecanismo de ação entre os fármacos antifúngicos, e único antimetabólito
disponível no mercado (RANG, DALE, RITTER, 2007; CHANDRASEKAR, 2011).
Seu mecanismo de ação relaciona-se à capacidade que alguns fungos
patógenos apresentam de possuírem enzimas capazes de internalizar e converter a
flucitosina a 5-fluorouracil.
Esta pode ser incorporada ao RNA em formação,
inibindo a sua síntese ou agir sobre a enzima timidilato sintase, inibindo a síntese do
DNA, levando, consequentemente, à morte celular. Vários fungos filamentosos não
possuem as enzimas necessárias para a internalização e conversão da flucitosina,
portanto, a atividade fungicida deste fármaco é limitada a algumas espécies fúngicas
(MATHEW, NATH, 2009; PFALLER et al., 2002).
3.3.4 Equinocandinas
Equinocandinas são lipopeptídeos semi-sintéticos com estrutura química de
hexapeptídeos cíclicos ligados a uma cadeia lateral de ácido graxo (DERESINSKI,
STEVENS, 2003). Representam a mais nova classe de antifúngicos desenvolvida, e
incluem a caspofungina, micafungina (figura 8) e anidulafungina (KAUFFMAN,
CARVER, 2008; MOHR et al., 2008; MUÑOZ et al., 2010).
38
Figura 8 – Estrutura química da micafungina.
Fonte: PASQUALOTTO, DENNING, 2008.
Diferentemente da anfotericina B e dos azólicos, as equinocandinas têm como
alvo farmacológico a parede celular do fungo. Elas atuam interferindo na síntese da
parede celular fúngica por meio da inibição não-competitiva da enzima ligada à
síntese de β-1,3-glucano, que é um dos principais componentes da parede celular
fúngica (ROGERS, FROST, 2009). A diminuição da síntese de β-1,3-glucano resulta
em desestabilização da parede celular fúngica, lise e morte celular (SABLE,
STROHMAIER, CHODAKEWITZ, 2008).
A ausência de parede celular nas células dos mamíferos faz dessa classe um
alvo atrativo e específico para atividade antifúngica. Ademais, os efeitos adversos
são menos frequentes do que com a anfotericina B e a interação com outros
medicamentos é menor do que com as drogas azólicas. Contudo, a administração
exclusivamente endovenosa e o restrito espectro de ação limitam o uso clínico das
equinocandinas a infecções mais graves (LAI et al., 2008; MARTINEZ, 2006).
3.4 Resistência
A terapêutica antifúngica, apesar de mais diversificada, hoje em dia, ainda
apresenta algumas limitações no que respeita a toxicidade sobre as células
humanas e a resistência, tanto intrínseca como adquirida, por parte dos fungos
(NISHI et al., 2009).
39
A resistência aos antifúngicos é, hoje em dia, um problema sério a nível
clínico, pelo que há necessidade de descobrir novos alvos que possibilitem o
desenvolvimento de novos antifúngicos. O diagnóstico tardio e o relativo número
reduzido de classes de antifúngicos terapeuticamente disponíveis favorecem a
mortalidade, que é atribuída às infecções sistêmicas. Aliado a isso, a resistência
fúngica aos agentes disponíveis torna-se um problema para alguns grupos de
pacientes, especialmente os imunocomprometidos (CANNON et al., 2009).
Diversos mecanismos bioquímicos contribuem para o fenótipo de resistência
a drogas nos fungos. O mais frequente deles envolve uma modificação na
membrana plasmática reduzindo a permeabilidade ou captação da droga, alterações
estruturais no sítio alvo, aumento no efluxo das drogas ou alteração nos níveis
intracelulares dos alvos (Figura 9 ) (DEISING, REIMANN, PASCHOLATI, 2008).
Figura 9 – Mecanismos de resistência fúngica aos antifúngicos.
Fonte: PEREIRA, 2012.
De modo que se torna evidente a necessidade de novos antifúngicos mais
eficazes e menos tóxicos, encorajando a adoção de novas terapêuticas, dentre elas,
o uso mais extenso de produtos naturais (SILVA et al., 2008).
40
3.5 Produtos Naturais
Considerando a perspectiva de obtenção de novos fármacos, os produtos
naturais se diferenciam dos sintéticos sob o aspecto da diversidade molecular.
Sabe-se que a diversidade molecular dos produtos de origem natural é muito
superior àquela derivada dos processos de síntese, que, apesar dos avanços
consideráveis, é ainda limitada. Isso proporciona a elaboração de novos fármacos
com funções terapêuticas diversificadas (NISBET, MOORE, 1997).
A história do desenvolvimento de novos fármacos tem o seu fundamento no
estudo de remédios naturais utilizados no tratamento de doenças ao longo dos
séculos (RISHTON, 2008). Segundo Balunas e Kinghorm (2005), durante milhares
de anos as plantas têm sido utilizadas com fins terapêuticos, assumindo inicialmente
a forma de tinturas, chás, cataplasmas, pós e outras formulações de ervas.
Assim como o desenvolvimento da sociedade humana, essa sistemática
esteve intimamente ligada ao uso dos recursos naturais que estavam à disposição
da humanidade. Ainda hoje, todos os aspectos ligados ao conhecimento sobre as
plantas medicinais continuam evoluindo, permitindo-se alcançar novas perspectivas
na utilização desse recurso (CUNHA, 2009).
Deste modo, em todo o mundo, o uso de plantas medicinais contribui
significativamente com os primeiros cuidados com a saúde, embora seus
constituintes químicos nem sempre sejam conhecidos (BIRKLE, 2006; KHAN et al.,
2009; MACIEL et al., 2002). Na atualidade, muitas destas plantas são incluídas na
terapêutica convencional para o tratamento de várias doenças (VIEIRA, 2005;
MANTILLA, 2005). Nos países em desenvolvimento, entre 65 e 80 % da população
depende, exclusivamente, de plantas medicinais para seus cuidados básicos de
saúde (AGRA et al., 2008).
As plantas possuem uma vasta capacidade biossintética, o que faz delas uma
valiosa fonte de compostos terapêuticos (SCHMIDT et al., 2008). Muitos dos quais
constituem modelos para síntese de grande número de fármacos. Sendo assim,
estes produtos, encontrados na natureza, revelam grande diversidade em termos de
estrutura e de propriedades físico-químicas e biológicas (BRESOLIN, CECHINEL
FILHO, 2003). A procura de novas moléculas farmacêuticas tem como fonte de
pesquisa a riqueza de informações do uso de plantas na medicina popular. Nesse
contexto, pesquisas relacionadas a medicamentos mostraram que, nos últimos 25
41
anos, 25 % de princípios ativos utilizados são de origem natural ou semissintética
(CRAGG, NEWMANN, SNADER, 2003).
De modo que, nas últimas décadas, aproximadamente, um quarto das drogas
utilizadas a nível mundial, são produtos naturais ou seus derivados (BALUNAS,
KINGHORM, 2005). De acordo com Schmidt et al. (2008) as plantas serão por muito
tempo uma fonte terapêutica para além da capacidade atual da química sintética,
dado o vasto número de produtos naturais e a complexidade dos metabólitos
secundários produzidos por elas.
No entanto, apesar de toda importância atribuída às plantas, o seu potencial
como fonte de novos produtos naturais é ainda pouco explorado. Segundo
estimativas, o número de espécies vegetais superiores pode chegar a 500.000,
sendo que destas, apenas 15 a 17 % foram investigadas quanto as suas
propriedades biológicas (BARROS, 2008).
O Brasil é o país com a maior biodiversidade de plantas do mundo. Possui
mais de 55 mil espécies descritas, o que corresponde a 22 % do total mundial. A
grande biodiversidade de espécies vegetais brasileiras constitui uma de suas
maiores riquezas e se destaca como fonte para obtenção de novas substâncias com
finalidade terapêutica (CARVALHO et al., 2007). Porém, os países desenvolvidos,
como Estados Unidos, Japão e os países europeus são os que mais manufaturam e
comercializam produtos naturais (KLEIN et al., 2010). Em países industrializados,
dados mostram que o uso das plantas medicinais constitui cerca de 20 % do total de
prescrições médicas, sendo que em países emergentes esse número atinge 80 %
(FELTRIN, CHORILLI, 2010).
No Brasil, o crescimento do mercado de medicamentos fitoterápicos é de
aproximadamente 15 % ao ano, enquanto o crescimento anual de medicamentos
sintéticos é na ordem de 3 a 4 %. Contudo, apenas 20 % da população é
responsável por 63 % do consumo dos medicamentos sintéticos disponíveis, sendo
que o restante encontra nos produtos de origem natural, especialmente as plantas
medicinais,
a
principal
fonte
de
recursos
terapêuticos
(REIS,
MARIOT,
STEENBOCK, 2004).
Sabe-se que as plantas constituem uma fonte inesgotável de compostos
naturais
potencialmente
ativos,
sintetizados
a
partir do
seu
metabolismo
(CARDOSO, SHAN, SOUZA, 2001). Os produtos químicos produzidos pelos
vegetais podem ser divididos em dois grandes grupos. Os primeiros, denominados
42
metabólitos primários ou macromoléculas, são essenciais a sobrevivência dos
vegetais. Incluem os lipídeos, protídeos, glicídeos e nucleotídeos, que têm funções
vitais bem definidas. Os produtos do metabolismo primário, através de rotas
biossintéticas diversas e frequentemente desconhecidas, originam, às custas de
energia, o segundo grupo de compostos químicos – os metabólitos secundários ou
micromoléculas -
que geralmente apresentam estrutura complexa, baixo peso
molecular, marcantes atividades biológicas e, diferentemente daqueles do
metabolismo primário, são encontrados em concentrações relativamente baixas e
em determinados grupos de plantas (POSER, MENTZ, 2004).
Os metabólitos secundários possuem propriedades biológicas importantes e
estão diretamente envolvidas nos mecanismos que permitem a adequação da planta
ao seu meio. As substâncias pertencentes a essa classe de metabólitos possuem
diversas funções biológicas, tais como defesa contra herbívoros e microrganismos,
proteção contra raios UV, atração de polinizadores ou animais dispersores de
sementes (FUMAGALI et al., 2008).
O uso de metabólitos secundários de plantas vem crescendo e conquistando
o mercado e a preferência dos consumidores por apresentarem benefícios à saúde,
bem como menores impactos ao meio ambiente (PEREIRA et al., 2008).
Os metabólitos secundários apresentam várias atividades biológicas. Muitos
são de importância comercial tanto na área farmacêutica quanto nas áreas:
alimentar, agronômica e de perfumaria. Entre os metabólitos secundários, os
principais grupos de compostos encontrados com atividade biológica são os
alcalóides, flavonóides, cumarinas, taninos, quinonas e óleos essenciais (PEREIRA,
2006).
3.6 Óleos Essenciais
Os óleos essenciais são misturas complexas de substâncias voláteis,
lipofílicas,
geralmente
odoríferas
e
líquidas,
provenientes
do
metabolismo
secundário vegetal, presente em quase duas mil espécies e distribuídos em
sessenta famílias de plantas (SIMÕES et al., 2007; TAIZ, ZEIGER, 2004).
Também podem ser chamados de óleos voláteis, óleos etéreos ou essenciais,
por serem de aparência oleosa à temperatura ambiente, possuírem aroma agradável
e intenso, serem solúveis em solventes orgânicos apolares e apresentarem
43
solubilidade limitada em água. Entretanto, sua principal característica é a
volatilidade, diferindo, assim, dos óleos fixos (SIMÕES et al., 2007; GUTIERREZ,
BARRY-RYAN, BOURKE, 2008).
São geralmente incolores ou ligeiramente amarelados e em geral são muito
instáveis, principalmente na presença de ar, luz, calor, umidade e metais. Além
disso, a maioria dos óleos essenciais possui índice de refração e são opticamente
ativos (SIMÕES et al., 2007).
Os óleos essenciais podem ser encontrados em diversos órgãos do vegetal,
tais como em suas folhas, flores, frutos, troncos, raízes, sementes, sendo
normalmente elaborados nas folhas e armazenados em células secretórias,
cavidades, canais, células epidérmicas ou tricomas glandulares (TAIZ, ZEIGER,
2004; BURT, 2004).
Na natureza estão relacionados com diversas funções necessárias à
sobrevivência
vegetal,
exercendo
papel
fundamental
na
defesa
contra
microrganismos e outros predadores, atuando como inibidores de germinação, na
proteção contra a perda de água, aumento da temperatura, além de estarem
envolvidos na atração de polinizadores e atuarem contra herbívoros, ao reduzirem o
apetite desses animais pelas plantas (BAKKALI et al., 2008; CRAVEIRO,
MACHADO, 1986; HARBONE, 1993; SIQUI, SAMPAIO, SOUSA, 2000).
Quimicamente os óleos essenciais são constituídos, em sua maioria, de
substâncias terpênicas e eventualmente de fenilpropanóides, acrescidos de
moléculas menores, como álcoois simples e terpênicos, aldeídos, cetonas, fenóis,
ésteres, éteres, óxidos, peróxidos, ácidos orgânicos, lactonas, cumarinas e até
mesmo compostos com enxofre. O perfil terpênico apresenta normalmente
substâncias constituídas de moléculas de dez e de quinze átomos de carbono (mono
e sesquiterpenos), mas dependendo do método de extração e da composição da
planta, terpenos menos voláteis podem aparecer na composição do óleo essencial
(NICARETA, 2006). Na mistura, tais compostos apresentam-se em diferentes
concentrações, sendo um deles o composto majoritário, existindo outros em
menores teores e outros em baixíssimas quantidades (SIMÕES et al., 2007).
A composição dos óleos essenciais é determinada geneticamente e em geral,
específica para um determinado órgão produtor. Dentre os fatores que podem
influenciar na composição química do óleo essencial estão a sazonalidade, o ciclo
de crescimento vegetativo, a disponibilidade hídrica, a radiação ultravioleta, os
44
nutrientes do solo, a altitude, a poluição atmosférica, a indução por estímulos
mecânicos e o ataque de patógenos, além da localização geográfica, tempo de
colheita e o processo de obtenção do óleo (SIMÕES et al., 2007; GOBBO-NETO,
LOPES, 2007; ONOFRE et al., 2008).
Adicionalmente, o ambiente em que o vegetal se desenvolve e o tipo de
cultivo influem na composição química dos óleos essenciais. A temperatura, a
umidade relativa, a duração total de exposição ao sol e o regime de ventos exercem
influência direta, principalmente nas espécies que possuem estruturas histológicas
de estocagem de óleo na superfície (VALBORMIDA et al., 2006).
Os métodos de extração dos óleos essenciais variam conforme a localização
do óleo na planta e com a proposta de utilização do mesmo (SIMÕES et al., 2007).
Há vários métodos de obtenção dos óleos essenciais, podendo incluir a destilação a
vapor, hidrodestilação, destilação assistida por micro-ondas, hidrodifusão por microondas e gravidade, extração com solvente orgânico, extração com solvente a alta
pressão, fluído supercrítico com CO2, extração ultra-sônica e extração por microondas sem solventes (OKOH, SADIMENKO, AFOLAYAN, 2010).
Sendo a
destilação a vapor de água o método mais comumente utilizado na produção
comercial (PRABUSEENIVASAN, JAYAKUMAR, IGNACIMUTHU, 2006).
Os óleos essenciais têm sido amplamente usados especialmente pelas
indústrias farmacêuticas, sanitárias, cosmética, agrícola e de alimentos devido às
suas ações bactericida, fungicida, parasiticida, inseticida e virucida, além de outras
propriedades medicinais (BAKKALI et al., 2008).
Diversas propriedades farmacológicas dos óleos essenciais já foram relatadas
na literatura, sendo amplamente utilizados na prevenção e no tratamento de
inúmeras doenças humanas como o câncer, as doenças cardiovasculares, incluindo
a aterosclerose e trombose. Também atuam como antibacteriano, antifúngico,
analgésico, antiviral, antioxidante, hipoglicemiante, analgésico, sedativo, antiinflamatório, espasmolítico e anestésico local (BAKKALI et al., 2008; EDRIS, 2007;
KORDALI et al., 2005; SYLVESTRE et al., 2006, LIMA et al., 2006).
Inúmeros estudos têm relatado a expressiva atividade antifúngica que os
óleos essenciais apresentam (DUARTE et al., 2005; LIMA et al., 2006; BANSOD,
RAI, 2008; CASTRO, LIMA, 2010; PEREIRA et al., 2011b; SOUSA, 2012; GUERRA,
2012).
45
Considerando o grande número de diferentes compostos químicos presentes
nos óleos essenciais, é muito provável que a sua atividade antimicrobiana não seja
atribuível a apenas um mecanismo específico, mas que existam vários alvos na
célula (BURT, 2004).
Os mecanismos pelos quais os óleos essenciais podem inibir microrganismos
envolvem diferentes modos de ação, e em parte podem ser devido à sua
hidrofobicidade (EDRIS, 2007; KALEMBA, KUNICKA, 2003).
Decorrente desta característica, muitos destes compostos atuam na bicamada
lipídica da membrana celular modificando sua estrutura e tornando-a mais
permeável, levando ao vazamento de conteúdos vitais da célula. O efluxo de K+
geralmente é o primeiro sinal de dano e, muitas vezes, é seguido pelo
extravasamento de constituintes citoplasmáticos incluindo ATP. A perda da
permeabilidade diferencial da membrana citoplasmática é considerada a causa de
morte celular (BURT, 2004; BEN ARFA et al., 2006).
A parede celular é outro importante sítio de ação dos óleos essenciais, visto
que, esses compostos podem acumular-se na parede e causar seu rompimento.
Esses compostos provavelmente danificam vários sistemas enzimáticos, inclusive os
envolvidos na produção de energia celular e na síntese de compostos (DORMAN,
DEANS, 2000). Os óleos essenciais também podem interferir no mecanismo de
reparo necessário para divisão celular dos microrganismos (CONNER, BEUCHAT,
1984).
Nos últimos anos a atividade antifúngica de óleos essenciais tem sido
relatada para diversas espécies, envolvendo principalmente as famílias Lamiaceae,
Asteraceae,
Verbenaceae,
Rutaceae,
Lauraceae
e
Cupressaceae
(ABAD,
ANSUATEGUI, BERMEJO, 2007).
3.7 Família Lamiaceae
A Família Lamiaceae inclui cerca de 252 gêneros, nos quais se distribuem
6700 espécies que são nativas principalmente na área do Mediterrâneo, embora
algumas tenham origem na Austrália, no Sudoeste da Ásia e na América do Sul,
compreendendo ervas ou arbustos que apresentam tricomas glandulares que
secretam óleos essenciais e compostos fenólicos, responsáveis pelo aroma
característico das espécies (EVANS, 2002; JUDD et al., 1999).
46
Além da importância do ponto de vista medicinal, esta família também é fonte
de espécies com grande valor como condimentos, alimentos e na indústria de
perfumes e cosméticos (CUPPETT, HALL, 1998; DI STASI, HIRUMA-LIMA, 2002).
São exemplos as espécies de alecrim (Rosmarinus sp.), sálvia (Salvia sp.),
orégano (Origanum sp.), tomilho (Thymus sp.), manjericão (Ocimum sp.), manjerona
(Marjorana sp.), menta (Mentha spp.), segurelha (Satureja sp.),
erva-cidreira
(Melissa sp.) dentre outras, as quais são estudadas devido às suas propriedades
antioxidantes, antimicrobianas e medicinais (MARIUTTI, BRAGAGNOLO, 2007).
3.8 Melissa officinalis L.
Melissa officinalis L., pertencente à família Lamiaceae, é conhecida
popularmente como, melissa, erva cidreira verdadeira, melissa romana, chá da
França, cuja classificação filogenética é mostrada na Tabela 1.
Tabela 1 – Classificação da planta Melissa officinalis (erva-cidreira).
Reino
Plantae (Plantas)
Subreino
Tracheobionta (Plantas vasculares)
Superdivisão
Spermatophyta (Plantas com sementes)
Divisão
Magnoliophyta (Plantas com flores)
Classe
Magnoliopsida (Dicotiledôneas)
Subclasse
Asteridae
Ordem
Lamiales
Família
Lamiaceae
Gênero
Melissa L.
Espécie
Melissa officinalis L.
Fonte:http://plants.usda.gov/java/ClassificationServlet?source=profile&symbol=MEO
F2&display=31, site acessado em 15.03.2011.
Planta perene, herbácea, podendo atingir de 30 a 100 cm, com rizoma
ramificado e raízes fibrosas. Possui caule muito ramificado, tenro, quadrangular,
47
ereto, piloso e aromático. Suas folhas são simples, inteiras, pequenas, opostascruzadas, com lâminas pilosas ovalo-triangulares de base ligeiramente codiforme e
ápice pouco agudo, com 5 a 8 cm de comprimento. Tem pecíolo fino e alongado
com estípulas pequenas na base. As folhas são, também, peninérveas com
inúmeras nervuras secundárias e terciárias, formando um retículo. Bordos dentadocrenados. Face ventral da lâmina, verde escura e a dorsal esbranquiçada com
nervuras salientes (CASTRO, CHEMALE, 1995). As flores apresentam coloração
variando de branco a rosada ou amareladas, reunidas em fascículos de 2 a 6
unidades com florescimento de outubro a março (HERTWIG, 1986).
Figura 10 – Folhas e flores de M. officinalis.
Fonte: http://flickriver.com/photos/tags/ervacidreira/interesting/
A melissa é uma planta que prefere climas temperados e não resiste a
geadas e vento frio, se adapta melhor em lugares parcialmente sombreados, não
tolerando calor excessivo. O cultivo deve ser em solo fértil e rico em matéria
orgânica, úmido, porém, bem drenado (LORENZI, MATOS, 2002).
Análises da constituição química dos extratos de partes aéreas de M.
officinalis L. evidenciaram a presença de componentes tais como taninos derivados
dos ácidos rosmarínicos e caféico, ácidos triterpenóides e flavonóides. Entretanto,
os componentes majoritários presentes na folha de M. officinalis são, citronelal (2-40
%), citral (mistura de neral e geranial: 10-30 %), seguidos pelo β-cariofileno,
germancreno D, ocimeno e citronelol (SIMÕES et al., 1998; LORENZI, MATOS,
2002; COLUSSI et al., 2011).
48
Por conter como fitoconstituínte o citral, a M. officinalis possui odor
semelhante ao do limão, sendo este intensificado quando a planta é seca. O odor
pode se tornar menos intenso caso a planta esteja exposta a forte calor e ventos
fortes. Esta variação está diretamente relacionada à quantidade do óleo volátil que é
perdido durante a exposição da melissa a estas condições adversas (REIS et al.,
2009).
A parte utilizada da planta é o caule folhado e florido, usado no tratamento da
insônia, enxaqueca, tensão nervosa, neurastenia, ansiedade, como antiespasmótica
(ALONSO, 1998). O óleo essencial da M. oficinalis encontra-se principalmente nos
tricomas glandulares peltados que se localizam em ambas as superfícies da planta,
abaxial e adaxial. Os tricomas do tipo capitados apresentam alguns lipídeos e
carboidratos, porém não possuem o óleo essencial (MARTINS, PASTORI, 2004).
É obtido por hidrodestilação e seu baixo rendimento (0,02 a 0,40 %) o torna
pertencente a uma das classes mais valiosas de óleos essenciais. Aliado ao baixo
rendimento, importantes propriedades farmacológicas, fazem com que a melissa
ocupe um lugar de destaque no rol de plantas medicinais, tornando o preço de seu
óleo extremamente alto quando comparado aos óleos essenciais de rosas e de flor
de laranjeira (COLUSSI et al., 2011; SORENSEN, 2000).
O óleo essencial extraído de matéria fresca ou seca da M. officinalis é muito
utilizado pelas indústrias farmacêuticas devido as suas diversas atividades
biológicas (LORENZI, MATOS, 2002; HABER et al., 2005).
Submetido a ensaios farmacológicos demonstrou ser um bom agente
antibacteriano e antifúngico (MIMICA-DUKIC et al., 2004; ROSTAMI, KAZEMI,
SHAFIEI, 2012; GUTIERREZ, BARRY-RYAN, BOURKE, 2009) e é também, o
responsável pela propriedade ansiolítica atribuída a esta planta (PEREIRA et al.,
2005). Alguns trabalhos da literatura têm sugerido propriedades antioxidantes e
antitumorais da melissa, além de apresentar efeito na resposta imune humoral e
celular em ratos, trabalhos estes também relacionados aos seus componentes
principais e não a extratos ou infusões (DE SOUZA et al., 2004; PEREIRA et al.,
2005; DROZD, ANUSZEWSKA, 2003).
49
Material e Métodos
50
4 Material e Métodos
4.1 Local de Trabalho
Os ensaios laboratoriais referentes ao estudo da atividade antifúngica do óleo
essencial de M. officinalis foram realizados no Laboratório de Micologia,
Departamento de Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde,
Universidade Federal da Paraíba.
4.2 Espécies Fúngicas
Para realização dos ensaios de atividade antifúngica foram selecionadas 8
cepas de Cladosporium carrionii, sendo 2 cepas (URM 5109, URM 2871)
pertencentes à coleção de culturas da Micoteca do Departamento de Micologia,
Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco, e as demais
(CL 03, LM 0212, LM 227, CQ 02, LM 01, CQ 03) pertencentes à coleção de culturas
do Laboratório de Micologia, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Centro de
Ciências da Saúde, Universidade Federal da Paraíba. Todas as cepas foram
mantidas em Ágar Sabouraud Dextrose – ASD inclinado (DIFCO Laboratories Ltda,
USA) a temperatura ambiente (28 ºC) e sob refrigeração (4 ºC).
4.3 Meios de Cultura
Para manutenção das cepas selecionadas e realização dos ensaios de
atividades biológicas foram usados o meio sólido Ágar Sabouraud Dextrose - ASD
(DIFCO Laboratories Ltda, USA) e o Caldo Sabouraud Dextrose – CSD (DIFCO
Laboratories Ltda, USA), preparados de acordo com as instruções do fabricante.
Os meios foram solubilizados em água destilada e esterilizados em autoclave,
a 121 oC por 15 minutos.
4.4 Inóculo
51
Para preparação do inóculo, as cepas fúngicas selecionadas foram mantidas
no meio de cultura, por 10-14 dias, a temperatura de 28 ºC para atingirem um
crescimento satisfatório. As recentes colônias fúngicas foram devidamente cobertas
com 5 mL de solução salina estéril (NaCl 0,85 % p/v), e as suspensões feitas por
suaves agitações e raspagens com auxílio de uma alça de platina em “L”. A mistura
resultante de conídios e fragmentos de hifas foi retirada e transferida para tubos de
ensaio esterilizados (FERNÁDEZ-TORRES et al., 2002; SANTOS, HAMDAN, 2005).
Em seguida, essas suspensões foram agitadas por 2 minutos com auxílio do
aparelho Vortex (FANEM). Após agitação, cada suspensão teve sua turbidez
comparada e ajustada àquela apresentada pela suspensão de sulfato de bário do
tubo
0,5
da
escala
McFarland,
a
qual
corresponde
a
um
inóculo
de
aproximadamente 106 unidades formadoras de colônias/mL (UFC/mL). Por fim, foi
realizado contagem celular em câmara de Neubauer e as suspensões ajustadas no
espectrofotômetro (Leitz-Fhotometer 340-800), para conter aproximadamente 1x106
UFC/mL. (CLEELAND, SQUIRES, 1991; HADACEK, GREGER, 2000; ODDS, 1989;
SAHIN et al., 2004).
4.5 Antifúngicos Sintéticos
Para o controle de avaliação da atividade antifúngica dos produtos naturais a
serem testados, foram utilizados como padrão os seguintes antifúngicos sintéticos:
anfotericina B e fluconazol, obtidos da Sigma-Aldrich® (São Paulo-SP).
As soluções foram preparadas no momento da execução dos testes, para
alcance das concentrações desejadas.
4.6 Óleos Essenciais
Os óleos essenciais de origem vegetal avaliados quanto ao seu potencial
antifúngico sobre Cladosporium carrionii, estão listados no quadro 1.
Os óleos foram obtidos da Quinari Fragrâncias e Cosméticos Ltda. (Ponta
Grossa, Paraná, Brasil), conservados em frasco de vidro âmbar e mantidos sob
refrigeração, no laboratório de Micologia. As emulsões dos óleos essenciais foram
52
preparadas no momento de execução dos ensaios, conforme protocolo de Allegrini,
Bouchberg, e Maillols (1973).
Em um tubo de ensaio esterilizado, foi adicionado 60.000 µg do óleo
essencial, 0,15 mL de dimetilsulfóxido (DMSO), 0,06 mL de Tween 80
(INLAB/Indústria Brasileira) e quantidade suficiente para 3 mL de água destilada
estéril. A mistura foi agitada por 5 minutos em aparelho Vortex (Fanem), obtendo
uma emulsão com concentração de 20.000 µg/mL do óleo essencial, 5% de DMSO e
2% de Tween 80. E através de diluições em água destilada ou no próprio meio de
cultura foram obtidas as concentrações desejadas do óleo essencial.
Quadro 1 – Espécies vegetais das quais foram obtidos os óleos essenciais.
Espécie
Família
Nomes populares
Mentha piperita L.
Lamiaceae
Hortelã
pimenta,
Hortelã
apimentada e Hortelã-Menta, Menta
inglesa, Hortelã das cozinhas
Melissa officinalis L.
Lamiaceae
Erva-cidreira,
Cidreira
Chá
da
verdadeira,
França,
Citronela,
Melissa, Melissa romana, Melissa
verdadeira
Mentha arvensis L.
Lamiaceae
Hortelã comum, Hortelã doce
Ocimum basilicum L.
Lamiaceae
Manjericão,
Basilicão,
Basílico,
Erva-Real
Ocimum gratissimum Blume
Lamiaceae
Alfavaca, Alfavacão, alfavaca-cravo
Origanum vulgare L.
Lamiaceae
Orégano,
Manjerona-brava,
Manjerona-selvagem, Oregão
Peumus boldus Benth
Lamiaceae
Boldo,
Boldo-do-Chile,
Boldo-
verdadeiro
4.7 Análise dos componentes do óleo essencial
A análise da composição do óleo essencial selecionado na triagem
microbiológica foi realizada pelo Prof. Dr. Fábio Santos de Souza, no Laboratório
53
Unificado de Desenvolvimento e Ensaios de Medicamentos (LUDEM), do Centro de
Ciências
da
Saúde,
Universidade
Federal
da
Paraíba,
utilizando-se
um
Cromatógrafo Gasoso (CG) da Shimadzu, modelo GC17-A, com sistema equipado
com um Espectrômetro de Massa (EM).
A coleta de dados e integração foi realizada com o software Class5000. A
fase móvel composta de hélio e bombeada na vazão de 1,6 mL/min com split 1:5. A
separação cromatográfica foi realizada utilizando uma coluna capilar DB-5 (30 m x
0,25 mm x 0,25 µm). A temperatura do forno da coluna foi programada para passar
de uma temperatura inicial de 60 °C a 105 °C a 5 °C/min, de 105 °C a 190 °C a 10
°C/min e de 190 °C a 280 ºC a 20 ºC/min. A temperatura do injetor e do detector
foram 260 e 280 °C, respectivamente. O tempo total foi de 20 minutos e o volume de
injeção foi 1,0 µL.
A identificação dos constituintes do óleo essencial foi efetuada junto ao
sistema de computação e processamento de dados (workstation) interligado ao CGEM, equipado com uma biblioteca Wiley, 6 ª Edição da classe-5000 1999, com
229,119 espectros, índices de retenção e comparação com dados da literatura
(ADAMS,
1995;
McLAFFERTY,
STAUFFER,
1989).
A
quantificação
dos
componentes foi realizada com base na percentagem de área do pico de cada
componente
em
relação
à
área
total
de
todos
os
picos
normalizados no cromatograma.
4.8 Ensaios de atividade antifúngica
4.8.1 Triagem microbiológica
A triagem microbiológica para avaliação do poder antifúngico dos óleos
essenciais em estudo foi realizado com base na técnica de difusão em meio sólido
com discos de papel de filtro (Sensibiodisc do Centro de Controle e Produtos para
Diagnósticos Ltda – CECON/SP). Em placas de Petri (150x15 mm) descartáveis e
estéreis (INLAB), foi depositado 2 mL da suspensão fúngica na concentração de 106
UFC/mL de cada microrganismo, previamente preparada. Em seguida, foi
adicionado 40 mL do meio ASD fundido à 50 oC, com homogeneização constante.
Após a solidificação do meio foram depositados na superfície do meio, discos de
papel de filtro impregnados com 20 µL de cada óleo essencial in natura. O sistema
54
foi então incubado a 28
o
C por 7-14 dias (BAWER, KIRBY, TURCK, 1966;
CLEELAND, SQUIRES, 1991; KONEMAN et al., 2008; HADECEK, GREGER, 2000).
A presença da atividade antifúngica foi evidenciada pela formação de halos
de inibição de crescimento em volta dos discos de papel. Os ensaios foram
realizados em duplicata e os resultados expressos pela média aritmética dos halos
de inibição obtidos nos dois ensaios. A atividade antifúngica dos óleos essenciais
testados foi considerada positiva quando a média dos halos de inibição apresentou
valores iguais ou superiores a 10 mm de diâmetro (WONG-LEUNG, 1988; NUNES et
al., 2006; LIMA et al., 1993). Os ensaios foram realizados em duplicata e os
resultados expressos pela média aritmética dos halos de inibição obtidos nos dois
ensaios.
4.8.2 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
A determinação da concentração inibitória mínima foi realizada utilizando-se o
óleo essencial selecionado na triagem microbiológica. Os ensaios foram realizados
por meio da técnica de microdiluição em caldo, utilizando placas de 96 orifícios
estéreis e com tampa (CLEELAND, SQUIRES, 1991; ELOFF, 1998; HADACEK,
GREGER, 2000).
Em cada orifício da placa, foi adicionado 100 µL do meio líquido caldo
Sabouraud dextrose (CSD) duplamente concentrado. Em seguida, 100 µL da
emulsão do óleo essencial na concentração inicial de 2048 µg/mL (também
duplamente concentrado), foram dispensados nas cavidades da primeira linha da
placa. E por meio de uma diluição seriada em razão de dois, foram obtidas as
concentrações de 1024, 512, 256, 128, 64, 32, 16, 8 e 4 µg/mL, de modo que na
primeira linha da placa encontrava-se a maior concentração e na última, a menor
concentração. Por fim, foi adicionado 10 µL do inóculo de aproximadamente 1-5 x
106 UFC/mL das espécies fúngicas nas cavidades, onde cada coluna da placa
correspondeu a uma cepa fúngica, especificamente. Paralelamente, foi realizado o
mesmo ensaio com os antifúngicos anfotericina B e fluconazol nas mesmas
concentrações.
Para verificar a ausência de interferência nos resultados pelos solventes,
DMSO e Tween 80, utilizados na preparação da emulsão do óleo essencial, foi feito
55
um controle no qual foram colocados nas cavidades 100 µL do CSD duplamente
concentrado, DMSO (5 %), Tween 80 (2 %) e 10 µL da suspensão fúngica. Um
controle de microrganismo foi realizado colocando-se nas cavidades 100 µL do CSD
duplamente concentrado, 100 µL de água destilada estéril e 10 µL do inóculo de
cada espécie. Também foi realizado um controle de esterilidade do meio, no qual foi
colocado 200 µL do CSD em um orifício, na ausência da suspensão dos fungos.
As placas foram assepticamente fechadas e incubadas a 28 oC por 5 dias (e
confirmada em 7 dias), sem anaerobiose, para realização da leitura. As CIMs para o
óleo essencial e os antifúngicos foram definidas como a menor concentração capaz
de inibir visualmente o crescimento fúngico verificado nos orifícios quando
comparado com o crescimento controle. Os experimentos foram realizados em
duplicata (SANTOS, HAMDAN, 2005).
4.8.3 Determinação da Concentração Fungicida Mínima (CFM)
A concentração fungicida mínima do óleo essencial foi determinada para as 8
cepas de C. carrionii. Após a leitura da CIM em 7 dias, alíquotas de 10 µL foram
retiradas de cada cavidade da placa de microdiluição onde não houve crescimento
fúngico e foram subcultivadas em uma placa de Petri (90 x 15 mm) contendo ASD. O
sistema foi incubado a 28 oC por 72 horas. A CFM foi definida como a menor
concentração do óleo essencial, semeada em ASD, em que não houve crescimento,
ou o crescimento foi menor que 3 UFC (PEREIRA et al., 2011a; TRAJANO et al.,
2010; ESPINEL-INGROFF et al., 2002). Foi utilizado o fluconazol como controle. Os
experimentos foram realizados em duplicata.
4.8.4 Determinação da Cinética de Crescimento Micelial
Para a determinação da cinética de crescimento micelial radial, foram
selecionadas duas cepas representativas, C. carrionii CQ 03 e C. carrionii URM
5109, baseando-se nos resultados obtidos na determinação das CIMs e CFMs do
produto avaliado.
A inibição do crescimento micelial fúngico foi determinada utilizando-se a
técnica de diluição em meio sólido. Este estudo baseou-se na medida do
56
crescimento micelial radial em ASD adicionado do óleo essencial nas concentrações
CIM/2, CIM, CIMX2 e CIMX4, em diferentes intervalos de tempo. Para a execução
da técnica, inicialmente, uma porção de 2 mm de diâmetro foi tomado de uma
cultura com crescimento de 7-14 dias em Ágar Sabouraud, a 28 oC, e colocada no
centro de uma placa de Petri estéril com meio ASD adicionado do óleo essencial,
nas diferentes concentrações. O sistema foi incubado a temperatura ambiente. Em
diferentes intervalos de tempo (0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 e 14 dias) após incubação, o
crescimento micelial radial da colônia fúngica foi medido e o resultado expresso em
milímetros (mm).
Os controles foram realizados por meio da medida do crescimento micelial em
ASD na ausência do óleo essencial, ou adicionado com fluconazol (CIM/2, CIM,
CIMX2 e CIMX4). Foram realizados dois experimentos independentes em diferentes
ocasiões e os resultados representam a média ± erro padrão dos dois experimentos
(ADAN et al., 1998; THYÁGARA; HOSONO, 1996; DAFERERA, ZIOGAS,
POLISSION, 2003).
4.8.5 Interferência sobre a germinação de conídios
Diferentes concentrações do óleo essencial foram testadas em relação ao seu
poder de inibição sobre a germinação de conídios das cepas CQ 03 e URM 5109 de
Cladosporium carrionii. Para tanto, alíquotas de 0,5 mL de emulsão do óleo nas
concentrações CIM/2, CIM e CIMX2, foram misturadas com 0,5 mL de suspensão de
conídios (aproximadamente 5 x 106 UFC/mL) obtidos de culturas com 7-14 dias de
crescimento em ASD, e homogeneizadas por 30 segundos. Em seguida, 0,1 mL da
mistura foi colocado no centro de uma lâmina de vidro estéril. As lâminas contendo
as suspensões de conídios fúngicos foram então incubadas em câmara úmida a
28oC por 48 horas. Após o período de incubação, cada lâmina foi fixada e corada
com azul de lactofenol algodão e observada sob microscopia óptica para observação
da germinação de conídios. Assim, 100 conídios foram contados e a percentagem
de conídios germinados calculada. Cada análise foi realizada em duplicata e os
resultados expressos como a média das duas repetições (RANA, SINGH, TANEJA,
1997).
57
4.8.6 Efeito do óleo essencial sobre a morfogênese fúngica
A análise dos efeitos provocados pelo óleo essencial na morfogênese das
cepas de Cladosporium carrionii (URM 5109 e CQ 03) foi realizada com base na
técnica de preparação de microcultivos (GUNJI et al., 1983; FROST et al., 1995).
Em placas de Petri (90 x 15mm) descartáveis e estéreis, foram vertidos 20 mL
de ASD fundido e ajustado na temperatura de 50 °C em banho-maria. Em seguida,
foi adicionado um volume do óleo essencial com o objetivo de alcançar as
concentrações CIM/2, CIM e CIMX2. Foi realizado um experimento controle sem
adição do óleo ao ASD fundido.
Após solidificação do ASD acrescido da droga-teste, cavidades foram feitas
no meio de cultivo utilizando cânulas de vidro esterilizadas. Com o auxílio de uma
alça descartável estéril, pequenos blocos deste meio foram transferidos para a
superfície de uma lâmina estéril de microscopia. Em seguida, dois fragmentos do
micélio das cepas recém-cultivadas em ASD foram dispostos sobre a superfície dos
blocos de ASD acrescido da droga-teste nas diferentes concentrações, cobrindo-os
com uma lamínula. As lâminas foram incubadas em câmaras úmidas a temperatura
ambiente (28 °C) por cinco dias. Após o período de incubação, 1 gota do corante
azul de lactofenol algodão foi adicionada no centro de uma lâmina e coberta com a
lamínula do microcultivo. As estruturas micromorfológicas na ausência e na
presença do óleo essencial foram examinadas em microscópio óptico comum, com
aumento de 400x. O ensaio foi feito em duplicata e imagens representativas deste
experimento foram registradas (DE BILLERBECK et al., 2001; SHARMA, TRIPATHI,
2008).
4.9 Análise Estatística
Os valores de CIM e CFM foram expressos pela média aritmética dos
resultados. Os resultados dos ensaios que avaliaram os efeitos das drogas-teste
sobre o crescimento micelial radial e a germinação dos conídios foram expressos
como média ± erro padrão (e.p.). Para a avaliação estatística destes resultados
empregou-se o ANOVA, seguido do pós teste de Dunnett e o teste de Fischer para
58
determinar diferenças significantes, quando um valor de p<0,05. Todos os resultados
foram analisados com o software GraphPad Prism versão 5.0 para Windows, San
Diego, CA, EUA.
59
Resultados e Discussão
60
5 Resultados e Discussão
5.1 Triagem microbiológica
O poder antifúngico dos óleos essenciais foi avaliado, inicialmente, na triagem
microbiológica. Estes óleos foram escolhidos para a pesquisa devido à
disponibilidade e relatos na literatura de suas consideráveis atividades antifúngicas.
Assim, foram avaliados sete óleos essenciais, com o objetivo de selecionar quem
apresentava melhor perfil de atividade antifúngica. Os óleos essenciais utilizados na
triagem foram obtidos das seguintes espécies vegetais, pertencentes à família
Lamiaceae: O. gratissimum, P. boldus, M. officinalis, M. arvensis, M. piperita, O.
basilicum, O. vulgare.
O resultado da triagem microbiológica está descrito na tabela 2, na qual se
encontram os diâmetros dos halos de inibição produzidos pelos óleos essenciais in
natura sobre as diferentes cepas de C. carrionii.
Tabela 2 – Média dos halos de inibição do crescimento fúngico (em milímetros)
O.
URM 2871
CQ 03
LM 01
CQ 02
LM 227
LM 0212
Essenciais
CL 03
Óleos
URM 5109
produzidos pelos óleos essenciais, in natura, sobre cepas de C. carrionii.
50
48
50
50
40
50
54
52
P. boldus
40
32
50
40
48
54
44
30
M. officinalis
30
30
34
32
30
26
24
26
M. arvensis
10
14
14
16
10
11
11
14
M. piperita
12
15
10
15
11
11
15
16
O. basilicum
12
12
11
10
11
10
12
10
O. vulgare
50
48
40
34
44
36
46
24
gratissimum
61
Como pode ser observado, os sete óleos essenciais testados apresentaram
atividade antifúngica contra as oito cepas de C. carrionii, caracterizada pela
formação de halos de inibição do crescimento microbiano com diâmetro igual ou
superior a 10 mm, frente 100 % das cepas.
Entretanto, os óleos essenciais de O. gratissimum, P. boldus, O. vulgare e M.
officinalis apresentaram as melhores atividades antifúngicas, com halos médios de
inibição, respectivamente, de 49 mm, 42 mm, 40 mm e 29 mm. Por outro lado, os
óleos essenciais de M. arvensis, M. piperita, O. basilicum, apresentaram pouca
inibição sobre o crescimento desse fungo, com halos médios de inibição variando de
10 a 16 mm.
As atividades antifúngicas dos óleos essenciais ensaiados sobre as cepas de
C. carrionii URM 2871 e LM 01 estão demonstradas na figura 11.
Figura 11 – Atividade antifúngica dos óleos essenciais sobre as cepas de C.
carrionii.
1
1
2
2
6
6
7
7
3
3
5
5
4
4
A
B
(A): C. carrionii URM 2871; (B): C. carrionii LM 01. 1 – O. gratissimum, 2 – P. boldus, 3 – M. officinalis,
4 – M. arvensis, 5 – M. pimenta, 6 – O. basilicum, 7 – O. vulgare.
A necessidade atual de descoberta de novos antimicrobianos tem estimulado
o uso de compostos de plantas como os óleos essenciais, esses têm sido bem
estudados em relação ao seu poder antimicrobiano, no entanto, são mais explorados
em relação as suas características flavorizantes e antioxidantes (BURT, 2004).
Poucos relatos na literatura são disponíveis a cerca da ação de óleos
essenciais na concentração absoluta sobre o crescimento de microrganismos, de
modo que esta escassez de informações torna-se mais acentuada quando se busca
62
relatos da atividade de óleos essenciais sobre fungos dematiáceos (MOREIRA,
2006).
A análise antimicrobiana conduzida por difusão em meio sólido é aceita pelo
FDA (Food and Drug Administration) e estabelecida como padrão pelo NCCLS
(National Committe for Clinical Laboratory Standards). É um método físico no qual o
microrganismo é colocado em interação contra um produto biologicamente ativo em
meio sólido e relaciona o tamanho da zona de inibição de crescimento do
microrganismo “desafiado” com a concentração da substância ensaiada, nesse caso
o óleo essencial in natura (PINTO et al., 2003).
Neste método, assim que o disco impregnado com o óleo essencial é posto
na superfície do ASD sólido o produto se difunde para o meio circundante. Na
medida em que se aumenta a distância em relação ao disco, ocorre uma redução
logarítmica da concentração do produto até alcançar o ponto onde o crescimento do
microrganismo na superfície do ágar já não é mais inibido. O resultado é uma zona
de inibição que é medida em milímetros e registrada, para a adequada avaliação
(KONEMAN et al., 2008).
Assim sendo, alguns autores tem adotado a técnica de difusão em meio
sólido utilizando disco de papel como procedimento para detecção da potencialidade
antifúngica de óleos essenciais (HADACEK, GREGER, 2000; RASOOLI, ABYANEH,
2004; SOUZA et al., 2006; SAHIN et al., 2004). A triagem microbiológica é um
método qualitativo de investigação preliminar da atividade antimicrobiana de um
composto bioativo, sendo, portanto, bastante útil para estabelecer a sensibilidade de
microrganismos ao óleo essencial. Geralmente é o primeiro teste a ser realizado na
avaliação do potencial antimicrobiano, e de acordo com os resultados obtidos, podese elaborar uma sequência de estudos mais detalhados na perspectiva de obtenção
de maiores informações sobre sua atividade antifúngica (HSIEH, MAU, HUANG,
2001). Assim sendo, este foi o primeiro experimento executado em nosso trabalho.
O possível papel dos óleos essenciais de algumas plantas, dentre elas a M.
officinalis L., assim como o modo de ação destes produtos naturais é discutido no
que diz respeito à prevenção e tratamento do câncer, doenças cardiovasculares,
incluindo aterosclerose e trombose, bem como a sua bioatividade como
antibacteriana, antiviral, antioxidantes, e agentes antidiabéticos (EDRIS, 2007).
Os resultados obtidos na triagem microbiológica, considerando o óleo
essencial de M. officinalis, encontram-se compatíveis com os achados de outros
63
autores. Mimica-Dukic et al. (2004) avaliaram, por meio da técnica de difusão em
disco, a atividade antibacteriana do óleo essencial de M. officinalis contra 5 cepas de
bactérias Gram-positivas e oito cepas Gram-negativas, e observaram elevada
atividade do óleo, principalmente frente a cepa de E. coli (30,2 a 39,8 mm) e cepas
multirresistentes de Shigella sonei (37,4 a 38,4 mm).
Rostami, Kazemi e Shafiei (2012) relataram a atividade antibacteriana e
antifúngica do óleo essencial de M. officinalis, pelo método de difusão em disco, com
halos de inibição variando de 20-35 mm.
Erturk (2006) observou a atividade antifúngica de extratos de M. officinalis
contra cepas de A. niger e C. albicans, e obteve halos de inibição variando de 10-16
mm. Em estudos realizados por Dilek, Dilek e Mustafa (2010), o extrato etanólico de
M. officinalis mostrou ampla atividade antimicrobiana contra K. rhizophila e S. aureus
com halos de inibição de 32 e 28 mm, respectivamente.
Moreira (2006) avaliou a atividade antifúngica de óleos essenciais in natura,
sobre
fungos
dematiáceos,
dentre
eles
fungos
pertencentes
ao
gênero
Cladosporium e observou que o óleo essencial de C. zeylanicum apresentou
atividade antifúngica com halos de inibição entre 16-20 mm.
Considerando que o óleo essencial de M. officinalis apresentou um dos
melhores resultados no teste de difusão em meio sólido, o mesmo foi escolhido para
ter continuidade na investigação de sua ação antifúngica, uma vez que há poucos
estudos sobre a atividade antifúngica deste óleo sobre fungos dematiáceos.
5.2 Análise dos componentes do óleo essencial de M. officinalis
O óleo essencial de M. officinalis foi submetido a análise por Cromatografia
Gasosa acoplada a Espectrometria de Massa (CG-EM). E o resultado da análise da
sua composição química está exposto na Tabela 3, que mostra os fitoconstituintes,
seus respectivos tempos de retenção e percentuais na composição do óleo
essencial.
64
Tabela 3 – Componentes do óleo essencial de M. officinalis.
.
Picos
Tempo de
retenção (min)
Fitoconstituintes
Índice de
Retenção
% na
formulação
1
12,73
Citral
1240
38,90
2
13,28
Geranial
1270
52,00
3
15,68
Trans β-cariofileno
1418
1,22
4
16,51
Germacrene D
1480
0,84
5
-
-
7,04
Outros componentes
Como mostra a tabela 3, a análise da CG-EM resultou na identificação de 4
componentes principais. Entre os fitoconstituintes, o geranial foi o componente
predominante do óleo essencial de M. officinalis com 52 % do total de constituintes
presentes, seguido pelo citral (38,90 %), trans β-cariofileno (1,22 %) e germacrene D
(0,84 %), em ordem decrescente de percentual.
Os óleos essenciais são originados do metabolismo secundário das plantas e
possuem composição química complexa, destacando-se a presença de terpenos e
fenilpropanóides (GONÇALVES et al., 2003).
A composição química do óleo essencial de M. officinalis é relatada em
diversos trabalhos, sendo o citral seu composto majoritário. O citral é constituído por
uma mistura isomérica, na qual o trans-isômero é o (2E)-3,7-dimetilocta-2,6-dienal,
conhecido por geranial ou citral A (Figura 12A) e o cis-isômero é o (2Z)- 3,7dimetilocta-2,6-dienal, conhecido como neral ou citral B (Figura 12B) (EL FATTAH et
al., 2011). O geranial e o neral são, portanto aldeídos isoméricos monoterpênicos
acíclicos, com aroma típico de limão (RIKANATI et al., 2007).
65
Figura 12 – Estrutura química do geranial (A) e do neral (B).
A
B
Fonte: FURLAN et al., 2010
O citral é encontrado em abundância em plantas aromáticas e devido ao seu
aroma intenso e sabor cítrico, é amplamente utilizado na indústria alimentícia e
cosmética (LEUNG, FOSTER, 1996; CARNAT et al., 1998; ENJALBERT et al.,
1983). Também tem se destacado como o componente ativo dos óleos essenciais
cítricos contra patógenos (CACCIONI et al., 1998; MOLINA et al., 2010).
O citral foi relatado por apresentar atividade antifúngica (YOUSET, AGGAG,
TAWIL, 1978; RODOV et al., 1995), antibacteriana (ASTHANA et al., 1992; KIM et
al., 1995), anti-leshimania (MACHADO et al., 2012) e inseticida (RICE, COATS,
1994).
Os resultados encontrados neste trabalho, a cerca da composição química do
óleo essencial de M. Officinalis corroboram com dados obtidos por outros autores.
Sari e Ceylan (2002) analisaram, por cromatografia gasosa, a composição química
de óleos essenciais de M. officinalis obtidos de diferentes regiões da Turkia e
observaram que no óleo obtido da região de Menemen os principais componentes
foram geranial (38,13 %) e neral (12,22 %), seguidos do β-pineno (11,73 %),
citronelal (5,86 %), geraniol (4,95%), α-pineno (2,86 %), linalol (2,74 %) e borneol
(0,62 %). Na região de Bozdag, o geranial também foi o componente majoritário
(53,8 %), seguido do citronelal (12,91 %), neral (11,48 %), geraniol (8,69 %), βpineno (1,77 %), linalol (1,28 %) e α-pineno (0,13 %).
Segundo Mimica-Dukin et al. (2004) os principais constituintes do óleo
essencial de M. officinalis são citral (geranial + neral, 39,9 %), citronelal (13,7 %),
limoneno (2,2 %), geraniol (3,4 %), α-cariofileno (4,6 %), cariofileno óxido (1,7 %) e
germacreno D (2,4 %).
66
Estudos da composição química do óleo essencial obtido de folhas de M.
officinalis indicaram a presença dos componentes majoritários citronelal (2-40 %) e
citral (mistura de neral e geranial: 10-30 %), seguidos pelo
β-cariofileno,
germacrene D, ocimeno e citronelol (SILVA et al., 2005).
Silva et al. (2006) analisaram o teor relativo dos principais componentes do
óleo essencial obtidos das partes aéreas de M. officinalis por cromatografia gasosa
acoplada à espectroscopia de massa (CG-EM) e encontraram como constituintes
majoritários o geranial e o neral. Schnitzler et al. (2008), por meio da CG-EM,
analisaram o óleo essencial de M. officinalis e observaram que os principais
constituintes são aldeídos monoterpênicos, citral A (geranial) (20,13 %), citral B
(neral) (13,58 %), e citronelal (3,86 %).
Em estudos realizados por Reis et al. (2009), utilizando a CG-EM, os
componentes majoritários identificados no óleo essencial de M. officinalis, cultivada
em dois meios distintos foram o geranial (25,23 e 16,21 %) e o neral (24,5 e 20,53
%). Também Meftahizade, Sargsyan e Moradkhani (2010) observaram que os
principais constituintes do óleo essencial de M. officinalis são citral (geranial e neral),
citronelal, geraniol, β-pineno, α-pineno e β- cariofileno, compreendendo 96 % dos
componentes do óleo.
Essas variações na composição qualitativa e quantitativa dos óleos essenciais
podem ocorrer, já que pode ser influenciada pelas condições climáticas, posição
geográfica da região de crescimento, agrotecnologia de cultivo, técnica de extração
aplicada, bem como o estágio de maturação da planta no momento da colheita.
Também dependem de fatores genéticos e ambientais, bem como dos métodos
analíticos (CASTRO, 2006).
5.3 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração
Fungicida Mínima (CFM)
As determinações dos valores de CIM e CFM do óleo essencial de M.
officinalis sobre oito cepas de C. carrionii, foram realizadas pelo método de
microdiluição. Os seus respectivos valores, bem como os referentes controles
realizados encontram-se representados na tabela 4.
67
Tabela 4 - Valores da CIM e CFM do óleo essencial de M. officinalis, fluconazol e
anfotericina B sobre cepas de C. carrionii.
Cepa C.
Carrionii
M. officinalis
Fluconazol
Anfotericina
(µg/mL)
(µg/mL)
(µg/mL)
Controle
da cepa
Controle de
esterilidade
CIM
CFM
CIM
CFM
CIM
CL 03
256
256
128
512
>1024
+
-
URM 5109
256
256
128
512
>1024
+
-
LM 0212
256
256
128
512
>1024
+
-
LM 227
256
256
128
512
>1024
+
-
CQ 02
256
256
128
512
>1024
+
-
LM 01
256
256
128
512
>1024
+
-
CQ 03
256
256
128
512
>1024
+
-
URM 2871
256
256
128
512
>1024
+
-
Como pode ser observado, o óleo essencial de M. officinalis inibiu o
crescimento de 100 % das cepas de C. carrionii ensaiadas, tendo sua CIM e CFM
estabelecidas em 256 µg/mL.
O fluconazol (controle positivo) exerceu efeitos
inibitórios frente a todos os fungos testados, inibindo 100 % das cepas na
concentração de 128 µg/mL. E a anfotericina B apresentou CIM maior que 1024
µg/mL, contra 100 % das cepas.
Na análise comparativa da CIM e CFM foi observado que o óleo essencial
apresentou valores de CFM semelhante aos valores da CIM, para todas as cepas.
Já o fluconazol apresentou valor de CFM (512 µg/mL) quatro vezes maior que o
valor da CIM, para as cepas testadas.
Os controles realizados mostraram ausência de inibição do crescimento
fúngico por DMSO e Tween, confirmando que o impedimento do crescimento foi
devido à presença dos produtos antifúngicos. Foi detectado crescimento quando
todas as cepas foram cultivadas na ausência de drogas, confirmando a viabilidade
do inóculo fúngico. Um controle de esterilidade foi realizado no qual não foi
observado crescimento microbiano, confirmando-se que o CSD utilizado nos ensaios
não estava contaminado com microrganismos.
68
O método de microdiluição escolhido para a determinação da CIM apresentase como uma forma simples e econômica de avaliar a atividade antimicrobiana de
produtos naturais. Possui grande reprodutibilidade, sendo trinta vezes mais sensível
que outros métodos usados na literatura, requerem pequena quantidade de amostra
e meio de cultura, além de poder ser usado para grande número de amostras
(SCORZONI et al., 2007, OSTROSKY et al., 2008). Este método tem a vantagem de
poder ser utilizado tanto para produtos solúveis em água, como àqueles
lipossolúveis e ainda pode ser estendido para fornecer informações sobre a CFM
(ZACCHINO, 2001).
Em termos de aplicabilidade clínica, a efetiva terapia antimicrobiana requer
que os agentes primeiro alcancem o sítio de infecção e então cesse ou iniba a
progressão da invasão microbiana e facilite a ação das defesas do hospedeiro para
controlar a infecção (CLEELAND, SQUIRES, 1991). Em indivíduos com infecções
não complicadas cuja resposta imune está competente, os níveis de CIM são
geralmente suficientes como guias para estabelecer uma terapia antifúngica. Porém,
nos casos de indivíduos com doenças infecciosas cujo sistema imune encontra-se
deficiente ou suprimido, o valor de CFM se mostra mais útil. Na prática clínica o valor
da CIM de um antimicrobiano significa simplesmente que esta concentração deve
ser obtida no sítio da infecção para que o crescimento microbiano seja
potencialmente inibido (KONEMAN et al., 2008).
Complexas variáveis podem afetar o curso de uma infecção e a terapia
medicamentosa, tais como os mecanismos de defesa do hospedeiro, a virulência e a
susceptibilidade do patógeno, a dose empregada e propriedades farmacológicas
inerentes ao antimicrobiano utilizado no tratamento da infecção, entre outros fatores.
Mesmo as análises in vitro não envolvendo essas variáveis, os estudos que
determinam inicialmente a CIM e CFM, fornecem importantes informações sobre a
potência dos produtos analisados e podem guiar outros estudos que visam a
empregabilidade clínica dos produtos, pois, é essencial que o produto natural, como
um novo candidato a ser empregado clinicamente como antifúngico, obtenha
relevantes resultados nesses estudos in vitro para justificar a continuidade dos
estudos (CLEELAND, SQUIRES, 1991).
Desse modo, os valores de CIM para cepas de C. carrionii obtidos neste
trabalho apresentam coerência com os resultados observados por Ozcakmak,
Dervisoglu e Yilmaz (2012) que determinaram a CIM e CFM do óleo essencial de M.
69
officinalis sobre cepas de Penicilium verrucosum. A CIM obtida foi de 125 µg/mL e a
CFM igual a 250 µg/mL.
Mimica-Dukin et al. (2004) analisaram a atividade antibacteriana e antifúngica
do óleo essencial de M. officinalis e observaram notável atividade antifúngica deste
óleo contra cepas de dermatófitos (T. rubrum, T. mentagrophytes, T. tonsurans, M.
canis, E. floccosum) e de Candida albicans, com CIM variando de 15-30 µg/mL e
CFM 30-60 µg/mL. Tullio et al. (2007), investigaram a atividade antifúngica do óleo
essencial de M. officinalis contra fungos filamentosos, dentre eles o Cladosporium
cladosporidioides e obtiveram uma CIM de 0,03–0,5 (%v/v) e CFM 0,25-1( % v/v).
Em estudos realizados por Rostami, Kazemi e Shafiei (2012), as
concentrações inibitórias mínima e bactericida (CIM e CBM) do óleo essencial de M.
officinalis foram determinadas utilizando a técnica de microdiluição e observaram
forte atividade com CIM e CBM variando de 0,5-15 µg/mL.
Moreira (2006) avaliou a atividade anti-Cladosporium do óleo essencial de C.
zeylanicum contra cepas de Cladosporium spp. e observou uma CIM de 250 µL/mL.
Dzamic et al. (2010) determinaram a CIM do óleo essencial da Mentha longifólia L.
sobre Cladosporium cladosporidioides e Cladosporium fulvum e relataram valores de
CIM igual a 2,5 µL/mL para as duas espécies de Cladosporium testadas.
Sartoratto et al. (2004) elencaram critérios para categorizar o poder
antimicrobiano de óleos essenciais com base no valor de CIM, onde óleos com CIM
≤ 500 µg/mL são considerados com forte atividade antimicrobiana, com 500 µg/mL <
CIM ≤ 1500 µg/mL possuem moderada atividade e CIM > 1500 µg/mL é considerado
com fraca atividade. Desta forma, pode-se considerar que o óleo essencial de M.
officinalis possui forte atividade antimicrobiana frente às cepas de C. carrionii
testadas, uma vez que a CIM foi de 256 µg/mL.
Quando se compara a atividade de produtos naturais com a de
antimicrobianos padrões, não existe ainda um consenso sobre o nível de inibição
aceitável. Em se tratando da anfotericina B, observou-se uma fraca atividade contra
as cepas de C. carrionii testadas, apresentando CIM maior que 1024 µg/mL.
Segundo Gallis, Drew e Pickard (1990), certos microrganismos causadores de
infecções fúngicas oportunistas são geralmente resistentes à anfotericina B, a
exemplo de Trichosporon spp., Pseudallescheria boydii, Cladosporium spp. e
Phialophora spp.
70
A comparação dos resultados de atividade anti-Cladosporium do óleo
essencial de M. officinalis com a do fluconazol (antifúngico padrão), mostra que este
apresentou valores de CIM inferiores as do óleo essencial. Entretanto, esta diferença
entre as concentrações do óleo essencial e do antifúngico padrão pode ser
explicada em termos pelo fato de que os componentes ativos no óleo compreendem
apenas uma fração do óleo usado. Dessa forma, a concentração dos componentes
ativos pode ser muito menor do que o antifúngico padrão utilizado. Portanto, é
importante salientar que, se os componentes ativos forem isolados e purificados,
eles provavelmente apresentarão atividade antimicrobiana superior às observadas
no presente estudo (LI et al., 2010; MATASYOH et al., 2009).
5.4 Cinética do crescimento micelial radial
Com base nos resultados dos valores de CIM e CFM encontrados, foi
avaliada a interferência do óleo essencial de M. officinalis e do fluconazol sobre a
cinética de inibição do crescimento micelial radial (mm) para as 2 cepas de C.
carrionii selecionadas (CQ 03 e URM 5109), a fim de observar o efeito de diferentes
concentrações desses produtos ao longo do tempo.
O ensaio da cinética de crescimento fúngico foi realizado utilizando a técnica
de diluição em meio sólido e os resultados obtidos foram expressos em gráficos que
mostram o crescimento micelial radial, em mm, de C. carrionii CQ 03 e C. carrionii
URM 5109, na presença da CIM/2, CIM, CIMX2 e CIMX4 do óleo essencial de M.
officinalis e do antifúngico padrão (fluconazol) em função dos dias de exposição (0,
2, 4, 6, 8, 10, 12 e 14) (Figuras 13 e 14).
71
Figura 13 – Efeito do óleo essencial de M. officinalis e do fluconazol na cinética de
crescimento micelial radial de C. carrionii URM 5109.
Crescimento radial (mm)
A
35
Controle
M. officinalis
M. officinalis
M. officinalis
M. officinalis
30
25
20
15
CIM/2 **
CIM ***
CIMX2 ***
CIMX4 ***
10
5
0
0
2
4
6
8
10
12
14
Tempo (dias)
Crescimento radial (mm)
B
35
Controle
Fluconazol CIM/2
Fluconazol CIM *
Fluconazol CIMX2 **
Fluconazol CIMX4 **
30
25
20
15
10
5
0
0
2
4
6
8
10
12
14
Tempo (dias)
(A): M. officinalis CIM/2 (128 µg/mL), CIM (256 µg/mL), CIMX2 (512 µg/mL) e CIMX4 (1024 µg/mL).
(B): Fluconazol CIM/2 (64 µg/mL), CIM (128 µg/mL), CIMX2 (256 µg/mL), CIMX4 (512 µg/mL).
*p<0,05; **p<0,005, ***p<0,0001, quando comparado ao controle, em 14 dias de interação.
72
Figura 14 – Efeito do óleo essencial de M. officinalis e do fluconazol na cinética de
crescimento micelial radial de C. carrionii CQ 03.
Crescimento radial (mm)
A
40
Controle
M. officinalis
M. officinalis
M. officinalis
M. officinalis
30
20
CIM/2 **
CIM***
CIMX2 ***
CIMX4 ***
10
0
0
2
4
6
8
10
12
14
Tempo (dias)
Crescimento radial (mm)
B
40
Controle
Fluconazol CIM/2 *
Fluconazol CIM ***
Fluconazol CIMX2 ***
Fluconazol CIMX4***
30
20
10
0
0
2
4
6
8
10
12
14
Tempo (dias)
(A): M. officinalis CIM/2 (128 µg/mL), CIM (256 µg/mL), CIMX2 ( 512 µg/mL) e CIMX4 (1024 µg/mL).
(B): Fluconazol CIM/2 (64 µg/mL), CIM (128 µg/mL), CIMX2 (256 µg/mL), CIMX4 (512 µg/mL).
*p<0,05; **p<0,005, ***p<0,0001, quando comparado ao controle, em 14 dias de interação.
Este estudo revelou um significativo efeito fungicida do óleo essencial de M.
officinalis, quando testado nas diferentes concentrações, sobre as cepas de C.
carrionii. De acordo com as figuras 11 (A) e 12 (A), após os 14 dias do ensaio,
observou-se uma significativa redução do crescimento micelial dos fungos quando
73
comparados com o grupo controle (não tratado), sendo o perfil de inibição do
crescimento, semelhante para as duas cepas testadas.
O
óleo
essencial
apresentou
forte
efeito
inibitório
com
resultados
estatisticamente significantes (p<0,05) quando comparados ao controle a partir da
concentração subnibitória CIM/2 (128 µg/mL), em 14 dias, sendo esta inibição do
crescimento micelial fortemente acentuada a medida que aumentou-se a
concentração do óleo essencial, de modo que nas concentrações de 512 µg/mL
(CIMX2) e 1024 µg/mL (CIMX4) houve inibição total do crescimento micelial a partir
do 2º. dia de exposição, com p<0,0001.
Nas concentrações de CIM/2 e CIM, foi evidenciado inibição do crescimento
micelial, quando comparado com o controle (p<0,005 e p<0,0001, respectivamente),
entretanto, pode-se observar um discreto crescimento a partir do 2º. dia de
exposição, sendo este crescimento mais pronunciado no 10o. dia, provavelmente
devido a volatilização do óleo essencial após esse período. No entanto, o
crescimento fúngico das duas cepas na presença do óleo foi sempre menor que o
observado para o ensaio controle. As cepas controles mostraram uma taxa
constante de crescimento micelial ao longo dos tempos avaliados, indicando o bom
efeito antifúngico do óleo essencial testado (Figura 15).
O fluconazol no ensaio com a cepa URM 5109, demonstrou inibição
significativa do crescimento micelial a partir da CIM (128 µg/mL), com p<0,05. Com a
cepa CQ 03 a partir da CIM/2 (64 µg/mL) já houve inibição significativa do
crescimento micelial quando comparado com o controle (p<0,05). Entretanto,
observou-se apenas uma diminuição do crescimento micelial na presença do
fluconazol e não um efeito fungicida, mesmo nas maiores concentrações, como
observado com o óleo essencial. Mas isso se explica pelo fato de que os azóis são
drogas consideradas fungistáticas (SCHREIBER, 2007).
74
Figura 15 – Cinética do crescimento micelial da cepa URM 5109 de C. carrioni, na
ausência e na presença do óleo essencial de M. officinalis no 14 o. dia.
A
B
C
D
E
(A): crescimento normal na ausência do óleo essencial; (B) inibição do crescimento na presença do
óleo na concentração CIM/2; (C) CIM; (D) CIMX2; (E) CIMX4.
Os fungos filamentosos de interesse médico possuem um aparelho de
reprodução, cujos órgãos se diferenciam para servir à reprodução e um aparelho de
vida vegetativa denominado micélio. Esse micélio é geralmente formado por um
aglomerado de células, o qual pode ser filamentoso septado ou não-septado. A hifa,
75
filamento fúngico ou um segmento do micélio filamentoso, constitui, em seu
conjunto, o micélio dos fungos (LACAZ et al., 2002).
Assim como outros fungos filamentosos, fungos do gênero Cladosporium
apresentam um simples ciclo celular não sexual, no qual forma-se uma colônia
micelial via crescimento da hifa, que resulta do alongamento linear do seu ápice.
Ainda, em um processo infeccioso, o crescimento longitudinal da hifa facilita a
penetração nas camadas mais internas da pele, enquanto o crescimento lateral pode
agravar os danos (ZURITA, HAY, 1987; GUPTA, CHAUDHRY, ELEWSKI, 2003).
Por isso, alguns pesquisadores vêm investigando o potencial de óleos
essenciais em inibir o crescimento micelial de fungos patogênicos por meio da
medida do crescimento micelial radial, dada a sua importância no desenvolvimento
das micoses (CARMO, LIMA, SOUZA, 2008; SOUSA, 2011; MOREIRA et al., 2007).
A inibição do crescimento micelial, observada neste estudo, com o uso do
óleo essencial de M. officinalis, foi semelhante ao encontrado por Moura et al. (2009)
para o óleo de Punica granatum no controle do crescimento micelial de
Cladosporium sphaerospermum, uma vez que na concentração de 25 µL/mL a taxa
de inibição foi superior a 50 % do crescimento.
Moreira (2006) avaliando a cinética de crescimento micelial dos fungos
dematiáceos C. cladosporidioides e F. compacta, frente ao óleo essencial de C.
zeylanicum, observou total inibição do crescimento radial, na concentração de 125
µL/mL, ao longo de 14 dias de exposição.
Estudos de Navickiene et al. (2006) demonstram a atividade fungitóxica dos
óleos essenciais extraídos das folhas, caule e frutos das seguintes espécies de
pimentas Piper aduncum, Piper arboreum e Piper tuberculatum sobre Cladosporium
sphaerospermum e Cladosporium cladosporioides.
5.5 Efeito do óleo essencial de M. officinalis sobre a germinação de conídios
de C. carrionii
Os resultados obtidos da interferência do óleo essencial de M. officinalis, e
do fluconazol nas concentrações de CIM/2, CIM e CIMX2, sobre a germinação dos
conídios de C. carrionii CQ 03 e URM 5109 estão plotados nas figuras 16 (A) e (B),
respectivamente.
76
Figura 16 – Percentual de conídios germinados de Cladosporium carrionii na
ausência (controle) e na presença do óleo essencial de M. officinalis e do fluconazol.
Conídios germinados (%)
A
B
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
*
*
**
CIM/2
CIM
CIMX2
Controle
***
***
M. officinalis
Fluconazol
Conídios germinados (%)
B
80
70
*
60
50
CIM/2
CIM
CIMX2
Controle
40
30
20
10
0
***
***
M. officinalis
Fluconazol
(A): C. carrionii URM 5109; (B): C. carrionii CQ 03. M. officinalis CIM/2 (128 µg/mL), CIM (256 µg/mL),
CIMX2 (512 µg/mL). Fluconazol CIM/2 (64 µg/mL), CIM (128 µg/mL), CIMX2 (256 µg/mL). *p<0,05;
**p<0,005, ***p<0,0001, quando comparado ao controle (Teste de Fisher).
Como pode ser observado nas figuras 16 A e B, o óleo essencial apresentou
forte efeito inibitório sob a germinação de conídios das cepas de C. carrionii, com
resultados estatisticamente significantes (p<0,05) quando comparados ao controle a
partir da concentração subinibitória CIM/2. Uma inibição de 100 % foi encontrada na
concentração de 512 µg/mL (CIMX2), e na CIM a inibição foi sempre superior a 90%,
para as duas cepas testadas. Em todos os casos, evidenciou-se um aumento
77
gradual do percentual de inibição na medida em que a concentração dos produtos
também aumentava, revelando um efeito inibitório dependente da concentração.
O fluconazol no ensaio com a cepa URM 5109 (Figura 16A) demonstrou
inibição significativa na germinação de conídios a partir da CIM, com p<0,05. Com a
cepa CQ 03 (Figura 16B) só na concentração de CIMX2 houve inibição
estatisticamente significativa quando comparado com o controle (p< 0,05), de modo
que o efeito do óleo essencial de M. officinalis para as duas cepas foi superior ao
apresentado pelo fluconazol.
Figura 17 – Efeito do óleo essencial de M. officinalis sobre a germinação de
conídios de C. carrionii.
A
B
(A) Controle de C. carrionii URM 5109 na ausência do óleo essencial, presença de conídios
germinados (seta). (B) Com o óleo essencial de M. officinalis, na concentração de 256 µg/mL,
presença de conídios não germinados (seta). Barra = 50 µm (400x).
Os fungos filamentosos, como o Cladosporium spp., possuem como
constituinte básico a hifa. As hifas que formam os férteis conidióforos e que dão
origem aos conídios diferenciam-se da hifa vegetativa, podendo apresentar
diferentes graus de semelhança com a hifa vegetativa. A conidiogênese ou os
processos e sequências de eventos que resultam em um novo conídio podem
ocorrer de duas formas essencialmente: quando o conídio diferencia-se a partir da
célula-mãe e somente uma porção dela é que dá origem ao conídio
(desenvolvimento blástico); ou quando o conídio origina-se de toda a célula-mãe,
assim sendo, toda a célula se torna o conídio propriamente dito, evento denominado
de desenvolvimento tálico (LACAZ et al., 2002).
78
Os conídios representam o modo mais comum de reprodução assexuada,
cumprem um papel importante na dispersão dos fungos na natureza e são estruturas
de resistência (TRABULSI, ALTERTHUM, 2004). Ainda é importante destacar que os
conídios não são meramente células quiescentes, pois um nível basal de síntese de
RNA e proteínas é requerido para a sobrevivência dos esporos (LIU et al., 2007).
Eles estão distribuídos em grande quantidade na atmosfera e, alguns deles,
apresentam capacidade de causar doenças em seres humanos, animais e vegetais.
Dentre os variados táxons destaca-se Cladosporium spp, um dos fungos mais
cosmopolitas e de maior concentração no ar. Esporos de Cladosporium spp. têm
sido caracterizados como importantes alérgenos (ZOPPAS, VALENCIA-BARRERA,
FERNÁNDEZ-GONZÁLES, 2011).
Assim sendo, vários óleos essenciais, atualmente, vêm sendo testados no
intuito de inibir a germinação de esporos fúngicos. Rana, Singh e Taneja (1997),
testando o óleo essencial de Aegle marmelos em diferentes concentrações sobre a
germinação dos esporos de fungos como Alternaria, Curvularia e Fusarium,
observaram redução gradual da germinação, concentração-dependente e que a 500
ppm ocorreu total inibição da germinação.
O óleo essencial de Cympopogon citratus L. em teste frente à Colletotrichum
coccodes, Botrytis cinérea, Cladosporium herbarum, Rhizopus stolonifer e A. niger
causou completa inibição da produção de esporos quando ensaiado na
concentração de 500 ppm. A maior inibição de germinação de esporos (81%) foi
observada sobre C. herbarum (TZORTZAKIS, ECONOMAKIS, 2007).
Sharma e Tripathi (2008) encontraram 100 % de inibição da germinação de A.
niger quando exposto a 1,5 µg/mL do óleo essencial de Citrus sinensis. O valor de
inibição foi de 50 % quando o óleo essencial foi ensaiado na concentração de 0,3
µg/mL. Em estudos realizados por Carmo, Lima e Souza (2008) os óleos essenciais
de C. zeylanicum e O. vulgare apresentaram intenso efeito de supressão da
germinação de esporos das espécies de Aspergilus testadas, com os efeitos
dependentes da concentração do óleo.
Souza (2011), avaliando a atividade do óleo essencial de C. Zeylanicum,
sobre cepas de Penicilium, observou um efeito inibitório da germinação de conídios,
dependente da concentração, sendo este óleo capaz de inibir 95 % da germinação,
na concentração de 512 µg/mL.
79
5.6 Efeito do óleo essencial sobre a morfogênese fúngica
As cepas de C. carrionii CQ-03 e URM 5109, expostas as concentrações de
CIM/2, CIM e CIMX2 do óleo essencial de M. officinalis quando analisadas sob
microscopia óptica (ampliação de 400 vezes), revelaram algumas alterações
morfológicas quando comparadas aos seus respectivos micélios controle.
A análise microscópica do micélio controle demonstrou estrutura celular
regular, apresentando citoplasma homogêneo, longas cadeias de blastoconídios e
intensa conidiação (figura 18A).
No meio de cultura adicionado do óleo essencial, as cepas de C. carrionii,
apresentaram distintas alterações morfológicas na estrutura micelial. Tais alterações
incluíram diminuição da conidiação, perda de pigmentação das hifas, visível perda
do conteúdo citoplasmático e desenvolvimento distorcido das hifas, sendo
observado hifas tortuosas, finas e com alterações na parede celular (figuras 18 B, C
e D). Essas alterações tornaram-se mais evidentes e frequentes quanto maior a
concentração do óleo.
80
Figura 18 – Micromorfologia de C. carrionii URM 5109 na ausência (controle) e na
presença do óleo essencial de M. officinalis.
A
B
C
D
(A): ausência do produto (controle), com presença de conídios, dispostos ao longo do conidióforo
(seta); B,C e D, na presença do óleo essencial de M. officinalis. (B): hifas curtas e tortuosas. (C): hifas
finas com regiões dilatadas e retração citoplasmática (setas). (D): deformações na parede das hifas
(seta). Nota: os resultados são representativos de dois experimentos. Barra = 50 µm (400x).
Estudos
anteriores
de
interferência
de
óleos
essenciais
sobre
a
micromorfologia de fungos filamentosos relatam importantes alterações morfológicas
induzidas por óleos essenciais e seus componentes sobre diversas espécies
fúngicas como Aspergillus flavus, A. parasiticus, A. niger, A. fumigatus e
Trichophyton mentagrophytes (CARMO, LIMA, SOUZA, 2008; MOREIRA et al.,
2010; SOUZA et al., 2010; PEREIRA et al., 2011b).
Alguns autores citam que as modificações nas células fúngicas causadas por
óleos essenciais podem estar relacionadas com a interferência dos seus
constituintes sobre enzimas responsáveis pela síntese da parede celular, afetando o
crescimento e a morfogênese fúngica (ZAMBONELLI et al., 1996; BRUL, COOTE,
1999; DE BILLERBECK et al., 2001; SHUKLA, SHAHI, DIXIT, 2000). Ainda, a ação
dos componentes de óleos essenciais poderá ser atribuída a uma possível ação
81
lipofílica, que viria a facilitar a sua penetração na membrana plasmática fúngica
(KNOBLOCH et al., 1989).
A morfologia fúngica é um fator de grande importância durante a invasão e
evasão das células do hospedeiro. Os conídios parecem iniciar a infecção, mas as
hifas apresentam alguma vantagem em específicos estágios do processo infeccioso.
As hifas formadas são mais difíceis de serem fagocitadas e podem eventualmente
provocar morte de macrófagos, penetrar mais facilmente através do epitélio,
invadindo tecidos (ROMÁN et al., 2007).
Portanto, as alterações na morfologia de fungos filamentosos por compostos
antifúngicos são de grande importância para o impedimento do crescimento normal,
viabilidade e virulência.
É relatado na literatura que macromoléculas cuja função esteja relacionada ao
crescimento, sobrevivência, virulência ou morfogênese celular são apontadas como
promissores alvos para novos agentes antifúngicos (ODDS et al., 2003). Diante
disso, os resultados encontrados neste trabalho para o óleo essencial de M.
officinalis são de grande relevância para o desenvolvimento de um futuro agente
antifúngico.
Mediante os resultados obtidos, o óleo essencial em estudo apresenta-se
como um relevante e promissor produto antifúngico e contribui para o arsenal de
produtos com conhecida atividade antifúngica contra C. carrionii. As investigações
proporcionam grandes expectativas para futuros estudos farmacológicos mais
aprofundados tanto com o óleo essencial de M. officinalis quanto com seus
fitoconstituíntes majoritários, na perspectiva de um melhor entendimento de suas
formas de ação, acerca de sua toxicidade e de uma possível aplicação terapêutica.
82
Considerações Finais
83
6. Considerações Finais
De acordo com os resultados obtidos neste trabalho, pode-se concluir que:
• Dentre os sete óleos essenciais testados na triagem microbiológica, os óleos
essenciais de O. gratissimum, P. boldus, O. vulgare e M. officinalis
apresentam as melhores atividades antifúngicas.
• Na CG-EM, o óleo essencial de M. officinalis, apresenta o geranial como
constituinte majoritário;
• O óleo essencial de M. officinalis apresenta forte atividade antifúngica contra
cepas de C. carrionii;
• As concentrações inibitórias mínimas e fungicidas para 100 % das cepas
submetidas à ação do óleo essencial de M. officinalis demonstraram bons
indicadores de atividade fungistática e fungicida do óleo estudado;
• O óleo essencial de M. officinalis interfere na cinética do crescimento micelial
radial das cepas fúngicas estudadas, apresentando efeito fungicida
dependente de concentração;
• O óleo essencial de M. officinalis é capaz de inibir a germinação de conídios e
promover alterações micromorfológicas sobre as cepas de C. carrionii;
• O óleo essencial de M. officinalis pode representar uma nova possibilidade
entre os produtos com atividade antifúngica contra C. carrionii.
84
Referências
85
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106
Anexos
107
ANEXO A – Artigo submetido
ISSN 0370-372x e ISSN 2176-0667
Rio de Janeiro, 17 de julho de 2012
Prezado(a) Camila Pinheiro de Menezes, comunicamos o recebimento do
trabalho intitulado: “Atividade antifúngica de óleos essenciais sobre
cepas de Cladosporium carrionii”, do qual o(a) senhor(a) é o(a) autor(a)
correspondente. O trabalho recebeu o N° 520 /2012 e foi encaminhado para os
revisores da Revista Brasileira de Farmácia, que farão uma análise a fim de orientar
o parecer do corpo editorial. Tão logo tenhamos uma resposta, entraremos em
contato.
Atenciosamente,
Comissão Editorial
Revista Brasileira de Farmácia
108
Atividade antifúngica de óleos essenciais sobre cepas de Cladosporium
carrionii
*
1
Camilla Pinheiro de Menezes1 & Edeltrudes O. Lima2.
Mestranda do Programa de Pós-Graduação em produtos naturais e/ou sintéticos bioativos.
Laboratório de Micologia, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da
Saúde, Universidade Federal da Paraíba, 58051-970, João Pessoa - PB, Brasil.
2
Docente Orientadora. Laboratório de Micologia, Departamento de Ciências Farmacêuticas,
Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Paraíba, 58051-970, João Pessoa - PB,
Brasil
*
Autor correspondente
E-mail: [email protected]
Endereço: Universidade Federal da Paraíba. Cidade Universitária. CEP:58059-900. Centro de
Ciências da Saúde. Departamento de Ciências Farmacêuticas, João Pessoa, Paraíba, Brasil.
Telefone: (83) 3225.1396 / (83) 8815.5981
109
RESUMO
O gênero Cladosporium abrange muitas espécies de fungos contaminantes e oportunistas
dematiáceos, estando relacionados com quadros de patologias em pacientes
imunocomprometidos. Considerando a ampla atividade biológica apresentada pelos produtos
naturais, óleos essenciais obtidos a partir de espécies vegetais têm sido investigados para
determinação de suas atividades antimicrobianas. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi
avaliar a atividade antifúngica de óleos essenciais provenientes de espécies vegetais da
família Lamiaceae sobre cepas de Cladosporium carrionii. A metodologia empregada foi a
técnica de difusão em meio sólido. Os ensaios foram realizados em duplicata e os resultados
considerados positivos quando as médias aritméticas dos halos de inibição apresentaram
valores iguais ou superiores a 10 mm de diâmetro. E os resultados mostraram que os sete
óleos essenciais testados apresentaram atividade antifúngica contra 100% das cepas de C.
carrionii. Entretanto, os óleos essenciais de Ocimum gratissimum, Pneumus boldus,
Origanum vulgare e Melissa officinalis e apresentaram as melhores atividades antifúngicas,
com halos de inibição de 49,25 mm, 42,25 mm, 40,25 mm, 29 mm respectivamente. Os dados
obtidos mostram-se promissores e podem servir como guia na seleção de plantas com
atividades antifúngicas de futuros trabalhos, na perspectiva de uma possível aplicação
terapêutica desses produtos.
Palavras-Chave: Óleos essenciais, Lamiaceae, Fungos oportunistas, Fungos escuros,
Cladosporium.
110
ABSTRACT
The genus Cladosporium includes many species of opportunistic dematiaceous fungi and
contaminants, being related to frames of pathologies in immunocompromised patients. Given
the broad biological activity displayed by the natural products, essential oils obtained from
plant species have been investigated to determine their antimicrobial activity. In this context,
the objective of this study was to evaluate the antifungal activity of essential oils from plant
species of the Lamiaceae family of strains of Cladosporium carrionii. The methodology
employed was the diffusion technique on solid media. Assays were performed in duplicate
and the results considered positive when the arithmetic means of the inhibition halos showed
values greater than or equal to 10 mm in diameter. And the results showed that the seven
essential oils tested showed antifungal activity against 100% of the strains of C. carrionii.
However, the essential oils of Ocimum gratissimum, Pneumus boldus, Origanum vulgare and
Melissa officinalis and showed the best antifungal activity with inhibition zones of 49.25 mm,
42.25 mm, 40.25 mm, 29 mm respectively. The data obtained show is promising and may
serve as a guide in selecting plants with antifungal activity for future work in anticipation of a
possible therapeutic application of these products.
Keywords: Essential oils, Lamiaceae, Opportunistic fungi, Dark fungi, Cladosporium.
111
INTRODUÇÃO
Ao longo dos últimos dez anos, a incidência de infecções importantes causadas por
fungos tem aumentado. Estas infecções estão ocorrendo como infecções nosocomiais e em
indivíduos com sistema imunológico comprometido. Além disso, milhares de doenças
causadas por fungos afetam plantas economicamente importantes, custando anualmente mais
de um bilhão de dólares (Case et al., 2010).
Os fungos do gênero Cladosporium são considerados contaminantes ambientais, sendo
encontrados em diversos ambientes. Sua relação com a saúde humana e até mesmo animal
está principalmente relacionada com quadros de patologias oportunistas quando do
desenvolvimento de severa imunossupressão (Tasic & Tasic, 2007; Correia et al., 2010;
Bakheshwain et al., 2011).
A terapêutica antifúngica, apesar de mais diversificada, hoje em dia, ainda apresenta
algumas limitações no que respeita a toxicidade sobre as células humanas e a resistência, tanto
intrínseca como adquirida, por parte dos fungos (Nishi et al., 2009).
De modo que se torna evidente a necessidade de novos antifúngicos mais eficazes e
menos tóxicos, encorajando a adoção de novas terapêuticas, dentre elas, o uso mais extenso de
produtos naturais (Silva et al., 2008).
Neste contexto, o objetivo desse estudo foi avaliar a atividade antifúngica de óleos
essenciais obtidos de espécies vegetais pertencentes à família Lamiaceae sobre cepas fúngicas
de Cladosporium carrionii.
MATERIAL E MÉTODOS
Óleos Essenciais
Foram utilizados neste estudo óleos essenciais obtidos de espécies vegetais
pertencentes à família Lamiaceae, adquiridos na Quinari Fragrâncias e Cosméticos Ltda./
Ponta Grossa, Paraná, Brasil (Quadro 1).
112
Quadro 1. Espécies vegetais das quais foram obtidos os óleos essenciais.
Espécie
Família
Nome popular
Mentha piperita L.
Lamiaceae
Hortelã pimenta
Melissa officinalis L.
Lamiaceae
Erva-cidreira
Mentha arvensis L.
Lamiaceae
Hortelã comum
Ocimum basilicum L.
Lamiaceae
Manjericão
Ocimum gratissimum Blume
Lamiaceae
Alfavaca
Origanum vulgare L.
Lamiaceae
Orégano
Peumus boldus Benth
Lamiaceae
Boldo
Espécies Fúngicas
Para realização dos ensaios de atividade antifúngica foram selecionadas 8 cepas de
Cladosporium carrionii, sendo 2 cepas ( URM 5109, URM 2871) pertencentes à coleção de
culturas da Micoteca URM 604, Departamento de Micologia, Centro de Ciências Biológicas,
Universidade Federal de Pernambuco, e as demais (CL-03, LM-0212, LM-227, CQ-02, LM01, CQ-03) pertencentes à coleção de culturas do Laboratório de Micologia, Departamento de
Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Paraíba.
Todas as cepas foram mantidas em ágar Sabouraud dextrose – ASD inclinado (DIFCO
Laboratories Ltda, USA) a temperatura ambiente (28º a 30ºC) e a 4ºC.
Preparação do Inóculo
Para obtenção do inóculo, as cepas fúngicas selecionadas foram mantidas no meio de
cultura, por 10-14 dias, a temperatura de 28 a 30ºC. Em seguida, as suspensões fúngicas
foram preparadas e padronizadas em solução fisiológica (0,9%) estéril e agitadas por 2
minutos com auxílio do aparelho Vortex (FANEM). Após a agitação, cada suspensão teve sua
turbidez comparada e ajustada àquela apresentada pela suspensão de sulfato de bário do tubo
0,5 da escala McFarland, a qual corresponde a um inóculo de aproximadamente 1-5 x 106
UFC/mL. Por fim, foi realizado contagem celular em câmara de Newbaeuer e as suspensões
ajustadas no espectrofotômetro (Leitz-Fhotometer 340-800), para conter aproximadamente 1-
113
5 x 106 UFC/mL. (Ostrosky et al., 2008; Koneman et al., 2008, Hadacek & Greger, 2000;
Cleeland & Squires, 1991).
Ensaio de atividade antifúngica
O screening microbiológico para avaliação do poder antifúngico dos óleos essenciais
em estudo foi realizado com base na técnica de difusão em meio sólido com discos de papel
de filtro (Sensibiodisc do Centro de Controle e Produtos para Diagnósticos Ltda –
CECON/SP). Em placas de Petri (150x15 mm) descartáveis e estéreis (INLAB), foram
depositados 2 mL da suspensão fúngica na concentração de 106 UFC/mL de cada
microrganismo, previamente preparada. Em seguida, foi adicionado cerca de 40 mL do meio
ASD fundido à 50oC, com homogeneização constante. Após a solidificação do meio foram
depositados na superfície do meio, discos de papel de filtro impregnados com 20 µL de cada
óleo essencial in natura. O sistema foi então incubado a 28-30 oC por 7-14 dias (Bawer et al.,
1966; Cleeland & Squires, 1991; Koneman et al., 2008; Hadacek & Greger, 2000).
O Fluconazol, 25 mcg, (Centro de Controle e Produtos para Diagnósticos Ltda –
CECON/SP) foi selecionado como antifúngico padrão.
Os ensaios foram realizados em duplicata e os resultados expressos pela média
aritmética dos halos de inibição obtidos nos dois ensaios. A presença da atividade antifúngica
foi evidenciada pela formação de halos de inibição de crescimento em volta dos discos de
papel. A atividade antifúngica dos óleos essenciais testados foi considerada positiva quando a
média dos halos de inibição apresentou valores iguais ou superiores a 10 mm de diâmetro
(Wong Leung, 1988; Cole, 1994; Alves et al., 2000; Nunes et al., 2006;).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O presente trabalho permitiu identificar a atividade antifúngica de óleos essenciais
obtidos de espécies vegetais pertencentes à família Lamiaceae sobre Cladosporium carrionii
utilizando o método microbiológico de difusão em ágar.
Conforme apresentado na tabela 1, os sete óleos essenciais testados apresentaram
atividade antifúngica contra as oito cepas de C. carrionii, caracterizado pela formação de
halos de inibição do crescimento microbiano com diâmetro igual ou superior a 10 mm, frente
100% das cepas. A droga padrão Fluconazol (25 mcg) não apresentou atividade antifúngica
contra as cepas testadas.
114
Tabela 1 - Média dos halos de inibição do crescimento fúngico (em milímetros) produzidos
CL-03
URM 5109
LM-0212
LM-227
CQ-02
LM-01
CQ-03
URM 2871
pelos óleos essenciais, in natura, sobre cepas de Cladosporium carrionii.
50
48
50
50
40
50
54
52
P. boldus
40
32
50
40
48
54
44
30
M. officinalis
30
30
34
32
30
26
24
26
M. arvensis
10
14
14
16
10
11
11
14
M. piperita
12
15
10
15
11
11
15
16
O. basilicum
12
12
11
10
11
10
12
10
O. vulgare
50
48
40
34
44
36
46
24
0
5
6
0
0
4
0
0
Óleos
Essenciais
O.
Gratissimum
Fluconazol
(25 mcg)
Entretanto, os óleos essenciais de O. gratissimum, P. boldus, O. vulgare e M.
officinalis apresentaram as melhores atividades antifúngicas, com halos médios de inibição de
49,25 mm, 42,25 mm, 40,25 mm e 29 mm, respectivamente.
A necessidade atual de descoberta de novos antimicrobianos tem estimulado o uso de
compostos de plantas como os óleos essenciais, esses têm sido bem estudados em relação ao
seu poder antimicrobiano, no entanto, são mais explorados em relação as suas características
flavorizantes e antioxidantes (Burt, 2004).
O possível papel dos óleos essenciais de algumas plantas, dentre elas a M. officinalis
L., assim como o modo de ação destes produtos naturais é discutido no que diz respeito à
prevenção e tratamento do câncer, doenças cardiovasculares, incluindo aterosclerose e da
trombose, bem como a sua bioatividade como antibacteriana, antiviral, antioxidantes, e
agentes antidiabéticos (Edris, 2007).
115
Os resultados obtidos neste estudo, considerando o óleo essencial de M. officinalis,
encontram-se compatíveis com os achados de outros autores que têm mostrado que esse óleo
essencial apresenta atividade antibacteriana e antifúngica (Mimica-Dukic et al., 2004).
Muitos estudos já foram realizados sobre o O. vulgare L. devido ao seu grande poder
antioxidante, fungistático, fungicida e antimicrobiano (Bozin et al., 2006; Sartorato et al.,
2004).
Em estudos realizados por Saeed (2009), excelente atividade antibacteriana foi obtida
ao testar o O. vulgare contra bactérias Gram-positivas. Saglam (2009), ao analisar a atividade
antifúngica do óleo essencial de O. vulgare dentre outros óleos essenciais, contra o
crescimento micelial de Alternaria alternata, Aspergillus niger e Aspergillus parasiticus
observou que o óleo de O. vulgare foi o mais ativo contra todos os fungos testados em
comparação aos demais óleos. Assim sendo, os resultados obtidos com o óleo essencial de
orégano, neste estudo, estão de acordo com os apresentados na literatura.
Os resultados obtidos neste estudo considerando o óleo essencial de O. gratíssimum
encontram-se compatíveis com os achados de outros autores, Koba e colaboradores (2009)
avaliando a atividade antifúngica do óleo essencial do O. gratissimum comprovaram
atividades fungistática e fungicida desse óleo contra dezessete linhagens fúngicas.
O resultado anti-Cladosporium observado com o óleo essencial de P. boldus,
corrobora com estudos anteriores, no qual o óleo essencial, obtido por hidrodestilação das
folhas de P. boldus, apresentou atividade antibacteriana contra Streptococcus pyogenes,
Micrococcus sp., Sthaphylococcus aureus, Bacilus subtilis (Vila et al., 1999) e antifúngica
contra diversas espécies de Candida (Lima et al., 2006).
Considerando a crescente resistência dos fungos oportunistas, dentre eles os
pertencentes ao gênero Cladosporium, frente aos antifúngicos atualmente disponíveis no
mercado, pode-se inferir que a pesquisa de novos compostos antifúngicos de origem vegetal
mostra-se de relevante significância.
CONCLUSÃO
Mediante os resultados obtidos, é possível observar o potencial antifúngico que os
óleos essenciais de Ocimum gratissimum, Pneumus boldus, Origanum vulgare e Melissa
officinalis possuem, e por consequência, a real possibilidade de aplicação destes produtos na
prevenção e tratamento de doenças infecciosas de origem fúngica. Porém, é necessário citar a
116
necessidade de realização de estudos de cunho toxicológico e clínico como suporte de
segurança na perspectiva de uma possível aplicação terapêutica desses produtos.
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119
ANEXO B – Trabalhos apresentados em congressos
120
COMPOSIÇÃO QUÍMICA E ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DO ÓLEO ESSENCIAL
DE Melissa officinalis L. CONTRA Cladosporium carrionii
Menezes, C. P.; Sousa, J. P.; Guerra, F. Q. S.; Trajano, V. N.; Souza, V. G.;
Souza, F. S.; Lima, E. O.
O óleo essencial de Melissa officinalis L. em ensaios farmacológicos demonstrou
atividade antimicrobiana. Assim, o objetivo deste estudo foi identificar os principais
componentes desse óleo e investigar sua atividade antifúngica in vitro contra
Cladosporium carrionii. A análise da composição química do óleo foi realizada por
cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (CG-EM). As
determinações da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Fungicida
Mínima (CFM) foram realizadas pelo método de microdiluição. Por fim avaliou-se a
interferência do óleo, em diferentes concentrações, sobre a germinação dos conídios
de C. carrionii (CQ03 e URM 5109), sendo os resultados expressos em percentual
de inibição dos conídios em relação ao controle. A análise CG-EM resultou na
identificação de 4 componentes principais, sendo o geranial o fitoconstituínte
majoritário (52 %), seguido do citral (38,90 %), trans β-cariofileno (1,22 %) e
germacrene D (0,84 %), em ordem decrescente de percentual. Nos ensaios de
atividade antifúngica, o óleo essencial inibiu o crescimento de 100 % das cepas de
C. carrionii ensaiadas, tendo sua CIM e CFM estabelecidas em 256 µg/mL. No
estudo da interferência do óleo sobre a germinação dos conídios, observou-se
inibição da germinação de conídios nas diferentes concentrações ensaiadas. Uma
inibição de 100 % foi encontrada na concentração de 512 ug/mL, enquanto na
concentração de 256 ug/mL a inibição foi sempre superior a 90% para as duas
cepas testadas, revelando um efeito inibitório dependente da concentração.
Portanto, os resultados sugerem que o óleo essencial de M. officinalis apresenta
forte atividade antifúngica contra C. carrionii. Apoio: CNPq e CAPES.
121
122
Screening of antifungal activity of essential oils from Lamiaceae family of
strains of Cladosporium carrionii
*
J. M. C. G. Santos1, C. P. Menezes1, L. C. A. Leite1, R. M. C. Carvalho1, E. O. Lima1.
1. Federal University of Paraíba, 58051-900, João Pessoa - PB, Brazil.
Introduction: Given the broad biological activity displayed by the natural products,
essential oils obtained from plant species have been investigated to determine their
antimicrobial activity. Objective: Identify the antifungal activity in vitro of essential oils
obtained from plant species belonging to the Lamiaceae family against strains of
Cladosporium carrionii. Methodology: Microbiological screening of seven essential
oils (Mentha piperita, Melissa officinalis, Mentha arvensis, Ocimum basilicum,
Ocimum gratissimum, Origanum vulgare, Pneumus boldus) was performed by the
technique of diffusion in solid medium. Assays were performed in duplicate and the
results considered positive when the arithmetic means of the inhibition halos showed
values greater than or equal to 10 mm in diameter. The antifungal activity the
essentials oils were evaluated by determination of the Minimum Inhibitory
Concentration (MIC) and Minimum Fungicidal Concentration (MFC) by microdilution
assay. Results: The results of microbiological screening showed that the seven
essential oils tested showed antifungal activity against 100 % of the strains.
However, it was observed that the essential oils of O. gratissimum, P. boldus, M.
officinalis, and O. vulgare showed the highest activity with average inhibition halos of
49.25 mm, 42.25 mm, 40.25 mm and 29 mm respectively. Subsequently, we
evaluated the antifungal activity of these four oils by determining the MIC and CFM
and it was observed that the essential oils of O. vulgare and M. officinalis were active
against the filamentous fungi Cladosporium carrionii with MICs equals 256 µg/mL.
The MFC found for these essential oils were 256 µg/mL for all strains. The MICs of
essential oils of O. gratissimum and P. boldus were >1024 µg/mL for all strains of C.
carrionii. Conclusion: The essential oils of O. vulgare and M. officinalis showed
antifungal activity against strains of C. carrionii tested, and therefore can be a source
of metabolites with antifungal activity. Supported by: CNPq e CAPES
123
124
Antifungal activity of essential oils of Lamiaceae family on strains
of Cladosporium carrionii
*
1
1
1
1
1
Menezes, C. P. ; Sousa, J. P. ; Viana, W.P. ; Pinheiro, L. S. ; Guerra, F. Q. S.¹; Lima, E. O.
1. Laboratory of Mycology, Department of Pharmaceutical Sciences, Federal University of Paraíba, 58051-970,
João Pessoa - PB, Brazil
[email protected]
Keywords: Essential oil, Lamiaceae, Cladosporium carrionii
Introduction
Cladosporium carrionii is one of the most frequent etiologic
agents of human chromoblastomycosis, a chronic
cutaneous disease characterized by verrucose skin lesions
eventually leading to emerging, cauliflowerlike eruptions
[1]. The increased incidence of fungal infections, especially
dangerous hospital-acquired infections and infections in
immunocompromised patients, has accentuated the need for
new antifungal treatments. There has been growing interest
in alternative therapies as the therapeutic use of natural
products, especially those derived from plants [2]. Thus, the
aim of this study was to identify the antifungal activity in
vitro of essential oils obtained from plant species belonging
to the Lamiaceae family against strains of Cladosporium
carrionii. Microbiological screening of seven essential oils
(Mentha piperita L, Melissa officinalis L., Mentha arvensis
L., Ocimum basilicum L., Ocimum gratissimum Blume,
Origanum vulgare L.) was performed by the technique of
diffusion in solid medium. And the antifungal activity the
essentials oils were evaluated by determination of the
Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum
Fungicidal Concentration (MFC) by microdilution assay.
Results and Discussion
In the screening assay of antifungal activity of essential
oils on strains of C. carrionii was observed that the
essential oils of O. gratissimum Blume, P. boldus Benth,
M. officinalis L., and O. vulgare showed the highest
activity with average inhibition halos of 49.25 mm, 42.25
mm, 40.25 mm and 29 mm respectively. Subsequently,
we evaluated the antifungal activity of these four oils by
determining the Minimum Inhibitory Concentration (MIC)
and it was observed that the MICs were very similar in the
strains tested. The essential oils of O. vulgare and M.
officinalis were active against the filamentous fungi
Cladosporium
carrionii
with
minimum
inhibitory
concentrations (MICs) equals 256 µg/mL. The MFC found
for these essential oils were 256 µg/mL for all strains
tested (table 1). According Sartoratto et al. (2004),
essential oils with an MIC between 50 and 500 µg/mL are
considered a strong antimicrobial activity. Thus we can
consider that the essential oil of M. officinalis and O.
vulgare have a strong antimicrobial activity, since the MIC
was 256 µg/mL.
Table 1- Minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum
fungicidal concentration (MFC) of essential oils O. vulgare and
M. officinalis against strains of C. carrionii
C. carrionii
samples
O. vulgare
M. officinalis
(µg/mL)
(µg/mL)
MIC
MFC
MIC
Control of
strain*
MFC
CL 03
256
256
256
256
+
URM 5109
256
256
256
256
+
LM 0212
256
256
256
256
+
LM 227
256
256
256
256
+
CQ 02
256
256
256
256
+
LM 01
256
256
256
256
+
CQ 03
256
256
256
256
+
URM 2871
256
256
256
256
+
*Growth of the microorganism
without the addition of essential
oil or antifungal agent.
Conclusions
The essential oils of O. vulgare and M. officinalis showed
antifungal activity against strains of C. carrionii tested, and
therefore can be a source of metabolites with antifungal activity.
Acknowledgements
The authors thank Laboratory of Mycology and Laboratory
of Pharmaceutical Technology, Federal University of Paraíba,
Brazil.
_________________
[1] HOOGI, G. S.; NISHIKAKU, A. S.; FERNANDEZ-ZEPPENFELDT,
G.; PADÍN-GONZALEZ, C. BURGER, E.; BADALI, H.; RICHARDYEGRES, N.; GERRITS, A. H. G. Molecular analysis and
pathogenicity of the Cladophialophora carrionii complex, with the
description of a novel species Studies in Mycology, v. 58, p. 219–
234. 2007.
[2] GEORGE, S. S.; SELITRENNIKOFF, C. P. Identification of novel
cell-wall active antifungal compounds. International Journal of
Antimicrobial Agents, v. 28, p. 361-365, 2006.
[3] SARTORATTO, A.; MACHADO, A. L. M.; DELARMELINA, C.;
FIGUEIRA, G. M.; DUARTE, M. C. T.; REHDER, V. L. G. Composition
and antimicrobial activity of essential oils from aromatic plants used in
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