Dissertação de Patricia Rodrigues de Lima

Caracterização de miRNAs e siRNAs de citros
PATRICIA RODRIGUES DE LIMA
Dissertação
apresentada
ao
Instituto Biológico, da Agência
Paulista de
Tecnologia dos
Agronegócios, para obtenção do
título de Mestre em Sanidade,
Segurança
Alimentar
e
Ambiental no Agronegócio.
Área de Concentração: Sanidade
Vegetal, Segurança Alimentar e
Ambiente
Orientador: Prof. Dr. Ricardo
Harakava
São Paulo
2012
INSTITUTO BIOLÓGICO
PÓS-GRADUAÇÃO
Caracterização de miRNAs e siRNAs de citros
PATRICIA RODRIGUES DE LIMA
Dissertação
apresentada
ao
Instituto Biológico, da Agência
Paulista de
Tecnologia dos
Agronegócios, para obtenção do
título de Mestre em Sanidade,
Segurança
Alimentar
e
Ambiental no Agronegócio.
Área de Concentração: Sanidade
Vegetal, Segurança Alimentar e
Ambiente
Orientador: Prof. Dr. Ricardo
Harakava
São Paulo
2012
DADOS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP)
Núcleo de Informação e Documentação - Biblioteca
Instituto Biológico
Secretaria da Agricultura e Abastecimento do Estado de São Paulo
Lima, Patricia Rodrigues de
Caracterização de miRNA e siRNA de citrus / Patricia Rodrigues de Lima.-- São
Paulo, 2012.
Dissertação (Mestrado). Instituto Biológico (São Paulo). Programa de PósGraduação.
Área de concentração: Sanidade Vegetal, Segurança Alimentar e o Ambiente
Linha de pesquisa: Biologia Molecular
Orientador: Ricardo Harakava
Versão do título para o inglês: Characterization of citrus miRNA and siRNA
1. miRNA (MicroRNA) 2. siRNA (Small interfering RNAs) 3. Pré-imunização 4.
Silenciamento gênico 5. Citrus Tristeza Virus (CTV) 6. Laranja doce Pera I.
Harakava, Ricardo II. Instituto Biológico (São Paulo). Programa de Pós-Graduação
III. Título
IB/Bibl./2012/007
ii
SECRETARIA DE AGRICULTURA E ABASTECIMENTO
AGÊNCIA PAULISTA DE TECNOLOGIA DOS AGRONEGÓCIOS
INSTITUTO BIOLÓGICO
Pós-Graduação
Av. Cons. Rodrigues Alves 1252
CEP 04014-002 - São Paulo – SP
[email protected]
FOLHA DE APROVAÇÃO
Nome do candidato
Título:
Orientador(a):
Dissertação
apresentada
ao
Instituto Biológico da Agência
Paulista
de
Tecnologia
dos
Agronegócios para obtenção do
título de Mestre em Sanidade,
Segurança Alimentar e Ambiental
no Agronegócio.
Área de Concentração:
Aprovada em:
Banca Examinadora
Assinatura:
*Prof. (a) Dr.(a):
*Instituição:
Assinatura:
*Prof. (a) Dr.(a):
*Instituição:
Assinatura:
*Prof. (a) Dr.(a):
*Instituição:
*Deixe todos os campos em branco para serem preenchidos no dia do exame de Defesa da Dissertação
iii
Dedico este trabalho aos meus pais, Juarez e Judith, aos meus
irmãos Sonia, Jose Roberto e Eduardo, aos meus sobrinhos
Danilo, Rafaela e Luna, a vovó Aldivina e a tia Maria Alice.
Muito obrigada pelo incentivo e confiança.
A amiga Erica A. S. Pedro, que em uma breve, mas marcante
passagem nesta vida me ensinou que podemos sim fazer grandes
amigos em um curto período de tempo. Valeu amiga por
compartilhar momentos tão preciosos (in memorian).
iv
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por mais uma etapa concluída;
Ao Instituto Biológico de São Paulo, pela oportunidade de realizar este
trabalho;
Ao meu orientador, Dr. Ricardo Harakava, pela paciência, dedicação, atenção,
amizade e pelos conhecimentos transferidos durante todo o trabalho;
À Dra. Juliana Freitas Astua e aos Dr. Marcos Cesar Gonçalves, Dr. Marcelo
Eiras e Dr. Marco Aurélio Takita por aceitarem o convite de participação na banca de
avaliação;
A equipe do Laboratório de Bioquímica Fitopatológica do Instituto Biológico,
Dra. Sylvia Dias Guzzo, Dra. Cleusa M. Lucon, Erica Pedro, Patrícia Haddad, Laura
Bononi.
Aos amigos Fabiana Moraes e Rodrigo Mateus, os melhores companheiros
desde os tempos do colégio;
À amiga e conselheira Wanda que sempre me motivou;
Aos amigos Diogo Manzano um autentico jedi, por todas as boas e longas
conversas e momentos divertidos e Kelly Antunes por me ouvir dar apoio e por ser
uma grande amiga em momentos importantes.
Aos alunos da pós-graduação em especial Anderson Fuzita, Mário (Harry) e
Julião pelos momentos de confraternização, risadas, papos filosóficos e caronas para
Campinas;
Aos amigos que fizeram parte de toda essa trajetória, Renata Garcez, Lara,
Marcela Boro, Clarice, Andréa, Verônica, Bruna Gama, Renata Coscolin.
À minha família;
A Capes pela concessão da bolsa de estudos.
v
“Há os que se queixam dos ventos, os que
esperam que ele mude, e os que ajustam as
velas.”
(Wilian Gward)
vi
LIMA, P.R. CARACTERIZAÇÃO DE miRNAs E siRNAs DE CITROS. São Paulo. 2012.
Dissertação (Mestrado em Sanidade, Segurança Alimentar e Ambiental no
Agronegócio) - Instituto Biológico.
Resumo
MicroRNAs (miRNAs) e small interfering RNAs (siRNAS), conjuntamente chamados de
small RNAs (smRNAs), são moléculas pequenas de 20 a 26 nucleotídeos (nt),
presentes em plantas e animais, que servem de guia para complexos protéicos que
mediam a degradação específica de mRNAs, inibindo a transcrição ou tradução de
genes ou promovendo a formação de heterocromatina. A descoberta dos smRNAs
iniciou-se com os estudos sobre silenciamento gênico ou co-supressão em plantas.
Estudos recentes identificaram miRNAs de Citrus sinensis e siRNAs do Citrus tristeza
virus (CTV) através de buscas em bancos de ESTs e sequenciamento em larga
escala. Os objetivos deste trabalho foram: (i) construir e sequenciar bibliotecas de
pequenos RNAs extraídos de planta de laranja doce Pêra IAC pré-imunizada com uma
estirpe fraca do CTV; (ii) Identificar miRNAs de citros e siRNAs de CTV na biblioteca
sequenciada; (iii) quantificar a expressão através de “stem-loop qRT-PCR” de miRNAs
envolvidos no controle do desenvolvimento de citros das variedades de laranja ‘PêraIAC’ (planta adulta) e laranja 'Hamlin' (planta juvenil); e (iv) quantificar através de qRTPCR, a concentração de siRNAs de CTV originados de diferentes regiões do genoma
do vírus, em planta de laranja ‘Pêra-IAC’ pré-imunizada. Os pequenos RNAs foram
purificados, acoplados a adaptadores, amplificados e concatenados previamente à
clonagem em plasmídeo. O sequenciamento de 123 clones permitiu identificar
pequenos RNAs após buscas nas bases de dados GenBank e miRBase. Foram
identificados os miRNAs conservados em plantas miR157, miR159, miR167 e miR171,
assim como 40 siRNAs derivados do genoma do CTV. Os miRNAs identificados
participam da regulação da resposta aos hormônios vegetais ácido abscísico e auxina
e no controle da formação de órgãos florais. Nas análises de qRT-PCR, observou-se
vii
expressão mais alta de miR156 em relação a miR172 na planta juvenil, enquanto na
planta adulta os níveis destes miRNAs foi semelhante. A quantificação de siRNAs de
CTV indicou maior concentração do siRNA da região central do genoma viral, diferindo
dos resultados da biblioteca de smRNAs, na qual predominaram os siRNAs da região
terminal 3’. Estes resultados divergentes foram provavelmente decorrentes da
presença de uma mistura de estirpes de CTV na planta pré-imunizada. A presença de
siRNAs do CTV indica que a pré-imunização resulta na pré-ativação do mecanismo de
silenciamento gênico da planta que pode ser responsável pela proteção contra
estirpes severas do CTV.
Palavras chave: miRNA, siRNA, pré-imunização, silenciamento gênico, CTV, Citrus
tristeza virus, PGTS
viii
LIMA, P.R. CHARACTERIZATION OF CITRUS miRNAs AND siRNAs. São Paulo.
2012. Dissertação (Mestrado em Sanidade, Segurança Alimentar e Ambiental no
Agronegócio) - Instituto Biológico.
Abstrat
MicroRNAs (miRNAs) and small interfering RNAs (siRNAs), collectively called small
RNAs (smRNAs) are small molecules of 20 to 26 nucleotides, present in both plants
and animals. They guide protein complexes mediating specific mRNA degradation,
inhibiting gene transcription or translation, or promoting heterochromatin formation. The
discovery of smRNAs started with the studies of gene silencing or co-suppression in
plants. Recent studies identified miRNAs of Citrus sinensis and siRNAs of Citrus
tisteza virus (CTV) through searches in ESTs database or high-throughput sequencing.
The objectives of the present study were: (i) to construct and sequence a library o
smRNAs extracted from sweet orange ‘Pêra-IAC’ pre-immunized with a mild strain of
CTV; (ii) to identify miRNAs of citrus and siRNAs of CTV in the library sequenced; (iii)
to quantify the expression of miRNAs involved in the development regulation of the
sweet orange varieties ‘Pêra-IAC’ (adult plant) and ‘Hamlin’ (juvenile plant) through
stem-loop qRT-PCR; (iv) to quantify by stem-loop qRT-PCR, CTV siRNAs originated
from different parts of the genome in pre-immunized sweet orange ‘Pêra-IAC’. The
small RNAs were purified, linked to adaptors, amplified and concatenated before
cloning in a plasmid. Sequencing of 123 clones resulted in the identification of smRNAs
after searches by Blastn in the GenBank and miRBase. The conserved miRNAs,
miR157, miR159, miR167, and miR171 were found in the library as well as 40 CTV
siRNAs. These miRNAs participate in the response regulation of the phytohormones
abscisic acid and auxin and in the control of flower organs formation. In the qRT-PCR
analysis, higher expression of miR156 in relation to miR172 was observed in juvenile
plant while in adult plant their expression levels were comparable. The quantification of
CTV siRNAs showed higher concentraion of siRNA from the central region of the
ix
genome, differing from the results of the smRNAs library in which siRNAs from the 3’
region prevailed. These conflicting results are likely due to the presence of a mixture of
CTV mild strains in the pre-immunized plant. The presence of CTV siRNAs indicates
that pre-immunization results in the pre-activation of the plant gene silencing machinery
that could be responsible for the protection from severe strains of CTV.
Keywords: miRNA, siRNA, pre-immunization, gene silencing, CTV, Citrus tristeza virus,
PGTS
x
Lista de Figuras
Figura 1 - Pulgão Toxoptera citricida Kirkaldy, conhecido com pulgão preto dos citros e
principal vetor responsável pela transmissão do CTV, fonte:
http://cisr.ucr.edu/brown_citrus_aphid...............................................................6
Figura 2 - Micrografia eletrônica de transmissão de contraste negativo da preparação
purificada do Citrus tristeza virus, fonte: http://www.dpvweb.net (a barra
representa
100
nm).....................................................................................................................7
Figura 3- Representação esquemática do genoma do Citrus tristeza virus (CTV). PRO
– protease semelhante à papaína, MT – metiltransferase, HEL – helicase,
RdRp – RNA polimerase dependente de RNA, CP – proteína
capsidial.........................................................................................................7
Figura 4 - Diferentes vias de interferência de RNA. Proteção contra infecção viral (1),
eliminação de transcritos de elementos móveis (transposons) e DNA repetitivo
(2), controle da expressão gênica endógena por miRNAs (3), silenciamento
transcricional e heterocromatinização (4), silenciamento gênico induzido por
dsRNA exógeno (5). Fonte:http://www.nobelprize.org....................................14
Figura 5 - A- Planta de laranja doce (Citrus sinensis (L.) Osbeck), variedade Pêra-IAC,
mantida em casa de vegetação sob condições naturais de iluminação e
temperatura. B- plântulas de laranja Hamlin, (banco de germoplasmaESALQ) mantidas em tubos de ensaio em temperatura ambiente sob
condições naturais de iluminação...................................................................21
Figura 6 - Adaptadores e primers empregados para amplificação e clonagem dos
pequenos RNAs (representados por “X”). Em vermelho, estão indicados os
sítios para a enzima BanI................................................................................23
Figura 7- Sequências dos oligonucleotídeos empregados para a detecção do miR159
(em vermelho) por stem-loop qRT-PCR. A reação da transcriptase reversa foi
realizada com o oligonucleotídeo miR159-SL, que forma estrutura secundária
em alça (devido ao pareamento das bases em verde). A reação de
amplificação por PCR foi realizada com os oligonucleotídeos miR159-F (em
azul) e common-R. Este último foi utilizado para a amplificação de todos os
smRNAs e se anela à região que forma a alça do oligonucleotídeo
SL....................................................................................................................28
Figura 8- Perfil eletroforético em gel desnaturante de poliacrilamida (12%). (1 e 2)
Fração enriquecida de pequenos RNAs extraídos de folhas de laranjeira
xi
‘Pêra-IAC’. Em destaque região cortada indicando os possíveis miRNAs. (M)
Oligonucleotídeos de DNA de 18, 24 e 27 nt utilizados como marcadores
moleculares...................................................................................................31
Figura 9- Perfil eletroforético em gel desnaturante de poliacrilamida (12%). (1)
smRNAs ligados ao adaptador 3’, em destaque região cortada para
purificação.
(M)
marcador
molecular
10
pb
ladder
(Life
Technologies)..................................................................................................32
Figura 10- Perfil eletroforético em gel não desnaturante de poliacrilamida (10%). (1)
Produto de RT-PCR dos smRNAs ligados aos adaptadores 3’ e 5’. O
fragmento de 80 pb corresponde aos smRNAs ligados aos adaptadores 3’ e 5’
e o fragmento de 60 pb correponde aos adaptadores ligados entre si sem os
smRNA. (M) marcador molecular 10 pb DNA ladder (Life
Technologies)..................................................................................................33
Figura 11. Perfil eletroforético em gel não desnaturante de poliacrilamida (10%) do
produto de RT-PCR dos smRNAs ligados aos adaptadores após a digestão
com a enzima de restrição BanI. (A) Fragmentos de 50 pb correspondentes
ao produto esperado. (M) marcador molecular 10 pb DNA ladder (Life
Technologies).................................................................................................34
Figura 12. Perfil eletroforético em gel de agarose (0,8%), após a concatenação dos
fragmentos de DNA digeridos com BanI (1) concatâmeros de 500-1.500 pb
utilizados para a clonagem em pGEM-T Easy. (M) marcador molecular 1
Kbp DNA ladder (Life Technologies)............................................................34
Figura 13. Previsão da estrutura secundária em alça obtida com auxílio do programa
RNAdraw formada pela sequência da região do genoma de Citrus clementina,
origem potencial do miR159. A linha em vermelho mostra a posição do
miR159............................................................................................................37
Figura 14. Comparação da sequência miR156/157 (IB) obtida no presente estudo com
outras similares presentes no miRBase. ath = Arabidopsis thaliana, csi =
Citrus sinensis, gma = Glycine max, ptc = Populus trichocarpa.....................38
Figura 15. Previsão da estrutura secundária em alça obtida com auxílio do programa
RNAdraw formada pela sequência da região do genoma de C. sinensis,
origem potencial do miR156/157. A linha em vermelho mostra a posição do
miR156/157.................................................................................................38
Figura 16. Previsão da estrutura secundária em alça obtida com auxílio do programa
RNAdraw formada pela sequência da região do genoma de C. sinensis,
xii
origem potencial do miR167. A linha em vermelho mostra a posição do
miR167............................................................................................................39
Figura 17. Previsão da estrutura secundária em alça obtida com auxílio do programa
RNAdraw formada pela sequência da região do genoma de C. clementina,
origem potencial do miR171. A linha em vermelho mostra a posição do
miR171..........................................................................................................40
xiii
Lista de Tabelas
Tabela 1. Oligonucleotídeos empregados para a detecção por stem-loop qRT-PCR de
miRNAs e siRNAs..........................................................................................29
Tabela 2. Resultados gerais do número, sequências e classe de pequenos RNAs
presentes na biblioteca de smRNAs de laranja ‘Pêra-IAC’............................35
Tabela 3. Sequências de miRNAs conservados encontrados nos clones da biblioteca
de smRNAs de laranja Pêra-IAC pré-imunizada com CTV...............................36
Tabela 4. Distribuição de siRNAs encontrados na biblioteca correspondente ao longo
do genoma do CTV. O genoma foi subdividido em 3 segmentos: região
terminal 5’ (nt 1 a 6415), região central (nt 6416 a 12.830) e região terminal 3’
(nt 12.831 a 19.250)........................................................................................41
Tabela 5. Comparação dos níveis de expressão dos miR156 e miR172 em plantas
jovem e adulta de C. sinensis. Valores representam os Cts (“threshold cycle”)
obtidos em ensaio de stem-loop qRT-PCR. ΔCt = Ct miR172 – Ct
miR156............................................................................................................42
Tabela 6. Quantificação de siRNAs de CTV por stem-loop qRT-PCR em planta de C.
sinensis var. ‘Pêra-IAC’ pré-imunizada. Valores de Ct (“cycle threshold”)
representam a média de 3 repetições............................................................43
xiv
Sumário
RESUMO ......................................................................................................................vi
ABSTRACT ................................................................................................................ viii
LISTA DE FIGURAS .................................................................................................... x
LISTA DE TABELAS................................................................................................... xii
1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 1
2. OBJETIVOS ............................................................................................................. 3
3. REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................... 4
3.1 A cultura dos citros ................................................................................................. 4
3.2 A Tristeza dos citros ............................................................................................... 5
3.2.1 Citrus tristeza virus (CTV) ................................................................................. 6
3.2.2 Premunização ................................................................................................... 8
3.2.3 Resistência ao CTV .......................................................................................... 9
3.3 Silenciamento gênico ou interferência de RNA ..................................................... 10
3.3.1 Principais vias de silenciamento de RNA ........................................................ 12
3.3.1a Proteção contra infecção viral ....................................................................... 12
3.3.1b Eliminação de transcritos de transposons e DNA repetitivo .......................... 12
3.3.1c Controle da expressão gênica endógena por miRNAs .................................. 12
3.3.1d Silenciamento gênico transcricional e heterocromatinização ......................... 13
3.3.1e Silenciamento gênico através da introdução de dsRNA exógeno.................. 13
3.4 microRNAs............................................................................................................ 15
3.5 Small interfering RNAs .......................................................................................... 16
3.6 Estudos sobre miRNAs em plantas ....................................................................... 17
3.7 Controle da transição planta juvenil/planta adulta por miR156 e miR172 .............. 19
3.8 Regulação da resposta de defesa a patógenos por pequenos RNAs.................... 19
4. MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................... 21
4.1 Material vegetal .................................................................................................... 21
4.2 Isolamento de RNA total ....................................................................................... 22
4.3 Purificação dos pequenos RNAs (smRNAs) ......................................................... 22
4.4 Ligação dos adaptadores ...................................................................................... 23
4.5 Digestão Ban I ...................................................................................................... 25
4.6 Formação dos concatâmeros ................................................................................ 25
4.7 Adição da Adenina ao terminal 3’.......................................................................... 25
4.8 Clonagem em vetor pGEM-T easy ........................................................................ 26
4.9 Sequenciamento de DNA...................................................................................... 26
xv
4.10 Análise das sequências ...................................................................................... 27
4.11 stem loop qRT-PCR ............................................................................................ 27
4.11.1 Extração de RNA total e Transcrição reversa ............................................... 29
4.11.2 PCR quantitativo .......................................................................................... 30
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................................. 31
5.1 Extração de pequenos RNAs ................................................................................ 31
5.2 Sequenciamento e análise da biblioteca de smRNAs ........................................... 35
5.3 Análise de stem-loop qRT-PCR ............................................................................ 41
5.3.1 Quantificação da expressão de miR156 e miR172 em plantas jovem e adulta41
5.3.2 Quantificação de siRNAs de diferentes partes do genoma do CTV ................ 42
6. CONCLUSÕES ...................................................................................................... 44
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 45
1
1. Introdução
MicroRNAs (miRNAs), small interfering RNAs (siRNAs) e RNAs que interagem
com a enzima Piwi (piRNAs), sendo estes exclusivos de animais (ARAVIN et al.,
2007), são conjuntamente chamados de small RNAs (smRNAs) ou pequenos RNAs.
Essas moléculas pequenas, de 20-26 nucleotídeos, estão presentes em plantas e
animais, e servem de guia para complexos protéicos que mediam a degradação
específica de RNA mensageiro (mRNA), inibindo a transcrição ou tradução de genes
ou promovendo a formação de heterocromatina. Elas exercem, portanto, importantes
funções regulatórias em organismos multicelulares que até recentemente eram
desconhecidas (JONES-RHOADES et al., 2006).
Os siRNAs e miRNAs
atuam de forma semelhante regulando de forma
negativa os seus RNAs alvo, a diferença entre estes dois pequenos RNAs se dá
apenas pela sua origem e pela natureza do mRNA alvo. Os miRNAs são processados
a partir de transcritos endógenos que não codificam proteínas e possuem como alvo
mRNAs endógenos. Os siRNAs derivam do próprio mRNA alvo transcrito a partir de
um transgene, transposon, vírus ou gene endógeno (ZERBINI et al., 2005)
A descoberta dos smRNAs iniciou-se com os estudos sobre silenciamento
gênico ou co-supressão em plantas (NAPOLI et al., 1990; VAN DER KROL et al.,
1990). Lee et al. (1993) relataram pela primeira vez a existência de pequenos RNAs,
que influenciavam o tempo de desenvolvimento larval em Caenorhabditis elegans. Em
1998, Fire & Mello descreveram a interferência de RNA (RNAi) em nematóides. Uma
medida do impacto destas descobertas foi à outorga do prêmio Nobel de Medicina e
Fisiologia de 2006 para estes pesquisadores.
Silenciamento gênico, co-supressão ou RNAi são fenômenos que ocorrem
naturalmente nas células de plantas e animais e consistem em uma importante defesa
contra ataques de vírus além de, possuir função essencial na manutenção da
estabilidade do material genético, mantendo sob controle elementos móveis do
genoma (os transposons ou genes saltadores) que podem comprometer funções do
organismo dependendo da posição em que forem inseridos (FIRE et al.,1998).
Em Arabidopsis thaliana, miRNAs e siRNAs têm sido intensamente estudados.
Praticamente todo o conhecimento disponível sobre a biogênese e modo de ação
destas moléculas em plantas é oriundo de estudos com esta espécie. Estes estudos
indicaram a existência de vias distintas para a produção dos diferentes tipos de
smRNAs; entretanto, estudos recentes mostram que há considerável redundância e
intercomunicação entre estas vias (LLAVE, 2010).
2
No banco de sequências de miRNAs miRBase (http://microrna.sanger.ac.uk),
além de Arabidopsis, também podem ser encontradas sequências de milho, arroz,
soja, cana-de-açúcar, Pinus taeda, citros e outras espécies. Através de ferramentas de
bioinformática é possível identificar miRNAs conservados em bancos de sequências
de ESTs (expressed sequence tags) (ZHANG et al., 2005). Entretanto, a construção
de bibliotecas específicas de pequenos RNAs ainda é a melhor maneira para a
caracterização de miRNAs e de siRNAs não-conservados de um organismo
(BEREZIKOV et al., 2006).
Estudos recentes identificaram miRNAs de Citrus sinensis e siRNAs do Citrus
tristeza virus (CTV) através de buscas em bancos de ESTs e de sequenciamento em
larga escala em plataformas de sequenciamento de nova geração (SONG et al., 2009;
XU et al., 2010; RUIZ-RUIZ et al., 2011). Essas plataformas correspondem às
tecnologias mais atuais que revolucionaram a genômica. Os equipamentos
começaram a ser comercializados em 2005, e já em 2007, esse conjunto de técnicas
foi considerada pela revista Nature a tecnologia do ano (SCHUSTER, 2008).
O sequenciamento em larga escala de siRNAs utilizando sequenciadores de
nova geração é uma eficiente maneira de se caracterizar o genoma de vírus que
infectam animais e plantas, particularmente quando não se tem nenhuma informação
prévia de sequências dos mesmos, uma vez que siRNAs de origem viral acumulam-se
em células infectadas (ADAMS et al., 2009; KREUZE et al., 2009; WU et al., 2010;
HAGEN et al., 2011).
Apesar das grandes vantagens do emprego dos sequenciadores de nova
geração, o emprego do sequenciamento de bibliotecas de smRNAs pelo método
Sanger, dado o seu menor custo, ainda é apropriado em algumas situações, como
quando não se necessita de grandes quantidades de sequências como para uma
avaliação prévia da qualidade de preparações de smRNAs antes do sequenciamento
em larga-escala ou para ajustar os métodos de extração, purificação e manipulação de
smRNAs.
Aliar o sequenciamento à técnica de stem-loop qRT-PCR é fundamental para a
confirmação da ocorrência e da quantificação de um determinado smRNA. Os
métodos de detecção atuais como hibridização e microarranjo, apesar de ainda
utilizados, são limitados e perdem muito quanto à sensibilidade e especificidade. A
baixa sensibilidade é um problema para a quantificação de miRNA porque a
amplificação dessas sequências curtas de RNA é problemática (MESTDAGH et al.,
2009).. Além disso, a baixa especificidade pode levar a sinais de falso positivo para a
presença de miRNAs intimamente relacionados, precursores e sequências genômicas
(MESTDAGH et al., 2009).
3
2. Objetivos
1.
Construir e sequenciar uma biblioteca de pequenos RNAs extraídos de planta
de laranja doce (Citrus sinensis) Pêra - IAC pré-imunizada com estirpes fracas
do CTV;
2.
Identificar miRNAs de citros e siRNAs de CTV na biblioteca sequenciada;
3.
Quantificar a expressão, através de stem-loop qRT-PCR, de miRNAs
envolvidos no controle do desenvolvimento de citros das variedades de laranja
doce Pêra-IAC (planta adulta) e Hamlin (planta juvenil);
4. Quantificar, através de stem-loop qRT-PCR, a expressão de siRNAs de CTV
originados de diferentes regiões do genoma do vírus, em planta de laranja
Pêra-IAC pré-imunizada.
4
3. Revisão de literatura
3.1.
A cultura dos citros
Entre 1530 e 1540 foram introduzidas no Brasil, provavelmente no estado da
Bahia por expedições colonizadoras, as primeiras sementes de laranja doce
(EMBRAPA MANDIOCA E FRUTICULTURA, 2005). Estas sementes eram originárias
de regiões tropicais e subtropicais do continente Asiático e do Arquipélago Malaio. No
Brasil, graças ao clima favorável, a cultura de citros espalhou-se rapidamente por todo
o país (WEBBER, 1967; ALVES & MELO, 2003).
A citricultura se tornou uma das culturas frutíferas de maior expressão no Brasil
e no mundo. O Estado de São Paulo se tornou o principal produtor brasileiro desde
1957 devido ao declínio do café na época, mas a citricultura só ganhou destaque
comercialmente a partir de 1980 (HASSE, 1987; BORGES & COSTA, 2005, 2006).
O cultivo da laranja está disseminado por mais de 60 países. O Brasil destacase como o maior produtor e exportador de suco de laranja concentrado, responde por
50% de todo suco de laranja produzido no mundo e exporta 98% da sua produção.
Com isso obtém uma participação de 85% no mercado mundial, atividade esta que
gera para o país uma significativa fonte de renda, com muitos empregos diretos e
indiretos. São Paulo é o maior estado produtor do Brasil, com 53% da produção. Outro
destaque fica com os EUA, no estado da Flórida, que juntamente com São Paulo são
responsáveis por 81% da produção mundial de suco de laranja (NEVES et al., 2010).
O gênero Citrus sp. pertencem à família Rutaceae, e está no grupo das frutas
cítricas onde correspondem a 70% do grupo. A porção menor do grupo de citros
corresponde a tangerinas e híbridos, limeiras ácidas e doces e pomeleiros. As árvores
de citros dão origem a frutos de diferentes formas e tamanhos, que em geral são ricos
em sabor, fragrância e suco. Possuem cor que varia entre o amarelo e laranja, são
compostos de casca conhecida como flavedo ou epicarpo, onde se concentram as
glândulas de óleos essenciais que dão ao fruto seu odor característico, possuem um
mesocarpo ou albedo, grosso e esponjoso que se une ao epicarpo, e a sua polpa é
dividida em compartimentos individuais ricos em suco (UNCTAD, 2009).
Mesmo com a grande variedade do gênero Citros, poucas laranjas são
destinadas à comercialização. Dentre as variedades de laranja doce mais produzidas
e consumidas no Brasil, a laranja Pêra (Citrus sinensis Osbek var. Pêra) recebe
5
destaque em função da abundância do suco 52% do peso da fruta (FIGUEIREDO,
1986).
A laranja Pêra é produzida em escala comercial somente no Brasil, sendo ideal
para consumo in natura e preparo de sucos. Salibe et al., (2002) relataram que esta
variedade de laranja possui características fenotípicas muito semelhantes às
variedades ‘Berna’ e ‘Verna Peret’ da Espanha, e teria surgido de um possível
cruzamento entre estas variedades. Trazida por colonizadores, presume-se que sua
origem no Brasil tenha se dado na baixada Fluminense no estado do Rio de Janeiro
onde recebeu o nome de ‘Pêra Rio’ (ANDRADE, 1933; SALIBE et al., 2002; MATTOS
et al., 2005). Quanto às características nutricionais, a laranja Pêra e todas as frutas
cítricas são ricas em vitamina C ou ácido ascórbico, ácido fólico, potássio e fibras
(UNCTAD, 2009).
Um dos grandes problemas enfrentados pela citricultura é de ordem
fitossanitária. A cultura de citros é acometida por diversas doenças, dentre as quais
podem ser destacadas: cancro cítrico, leprose, clorose variegada dos citros (CVC),
morte súbita dos citros (MSC), mancha preta, greening ou huanglongbing (HLB) e
tristeza (MATTOS et al., 2005).
3.2.
A tristeza dos citros
A tristeza dos citros apresentou-se como um dos grandes problemas
enfrentados pela citricultura mundial nas décadas de 40 e 50. No Brasil as perdas
causadas pela tristeza chegaram a 75%, o que resultou na morte de 7 milhões de
plantas citricas em 12 anos (MOREIRA, 1942; MOREIRA et al.,1949).
A descoberta de um agente causal para a doença foi realizada por Meneghini
(1946), no Instituto Biológico, em São Paulo, em um estudo sobre transmissão por
pulgões. Moreira (1960) relatou a infecção das plantações de laranja Pêra pelo vírus
da tristeza dos citros (Citrus tristeza virus, CTV).
O vírus é transmitido de forma semi-persistente pelo pulgão Toxoptera citricida
Kirkaldy (Figura 1), também chamado de “pulgão preto dos citros”, ou por material
propagativo infectado. Este não é o único vetor a transmitir o CTV, mas no Brasil as
condições climáticas favoreceram esta espécie, que coloniza a maioria das cultivares
e híbridos de citros (GARNSEY & LEE, 1989; MÜLLER & COSTA, 1993).
6
Figura 1 - Pulgão Toxoptera citricida Kirkaldy, conhecido com “pulgão preto dos citros”
e principal vetor responsável pela transmissão do CTV, fonte:
http://cisr.ucr.edu/brown_citrus_aphid
A infecção causada pelo vírus da tristeza ocorre com uma combinação de
diferentes estirpes do vírus com diferentes níveis de virulência. A replicação viral
ocorre no floema da planta e, de modo geral, as plantas infectadas apresentam ramos
com redução do vigor, baixa produtividade dos frutos, frutos pequenos, colapso do
floema, "stem pitting" ou caneluras severas, podridão de radicelas e subsequente
morte da planta (SALIBE & ROSSETTI, 1965; MÜLLER et al., 1999; SALIBE et al.,
2002).
3.2.1. Citrus tristeza virus (CTV)
O CTV é um vírus filamentoso, alongado, de simetria helicoidal, com cerca de
2000 nm de comprimento por 12 nm de diâmetro (Figura 2). Este vírus pertence à
família Closteroviridae, gênero Cloterovirus. Apresenta genoma de RNA, de fitasimples, de senso positivo (ssRNA+), não segmentado com cerca de 20 Kb e não
possui cauda poli-A na extremidade 3’ (Figura 3) (KITAJIMA et al.,1965; BAR-JOSEPH
et al.,1972; BAR-JOSEPH et al.,1979).
7
Figura 2- Micrografia eletrônica de transmissão de contraste negativo da preparação
purificada do Citrus tristeza virus, fonte: http://www.dpvweb.net (a barra
representa 100 nm).
Figura 3- Representação esquemática do genoma do Citrus tristeza virus (CTV). PRO
– protease semelhante à papaína, MT – metiltransferase, HEL – helicase,
RdRp – RNA polimerase dependente de RNA, CP – proteína capsidial.
As primeiras ORFs do genoma do CTV correspondem aos módulos de
replicação. Estas ORFs codificam uma poliproteína com dois domínios semelhantes a
papaína protease, um tipo I de domínio metiltransferase-like, e um domínio helicaselike. Seguida a estas estende-se a ORF que contêm domínios RNA polimerase
dependente de RNA (RdRp) (KARASEV et al., 1995), Os genes (p6, p65, P61 e P27)
codificam proteínas envolvidas na formação e transporte do vírus, estas regiões são
conservadas em todos os membros da família Closteroviridae, a exemplo do gene
p20, que é homólogo ao gene p21 do vírus da beterraba (Beet yellow virus - BYV)
(KARASEV et al., 1995).
A ORF cinco inclui o gene p6 que é responsável por uma proteína
transmembranar classificada como proteína de choque térmico. Os genes p61 e p65
possuem ação coordenada na proteína capsidial (CP) e codificam proteínas de
revestimento (SATYANARAYANA et al., 2000). Quatro genes que codificam proteínas
8
não possuem homólogos em outros closterovirus (p33, p18, p13 e p23) (DOLJA et al.,
2006).
A proteína p20 é um componente principal do CTV responsável pela formação
dos corpos amorfos de inclusão (GOWDA et al., 2000), e P23, uma proteína de ligação
ao RNA (López et al., 2000), regula a acumulação assimétrica do sentido positivo e
negativo durante a replicação de RNA (SATYANARAYANA et al., 2002). Ambos p20 e
p23, além da CP, atuam como supressores de silenciamento de RNA em Nicotiana
benthamiana e Nicotiana tabacum, com p23 atuando no silenciamento intercelular e
inibindo silenciamento intracelular da CP, e p20 atuando tanto no silenciamento inter e
intracelular (Lu et al., 2004). As funções biológicas de P33, P18 e P13 ainda não foram
definidas (MORENO et al., 2008). Mas mutantes com deleção destes genes já
indicaram que eles não são necessários para replicação e formação do virus
(SATYANARAYANA et al., 1999, 2000).
Este vírus esta presente na maioria das regiões produtoras de citros do mundo
e como as infecções ocorrem frequentemente com misturas de várias estirpes, é
necessário ser capaz de distingui-lás para efeitos regulatórios, manejo da doença e
conhecimento da epidemiologia (NIBLETT et al., 2000).
Moreno et al. (2008) revelaram, após análises de variação genética do genoma
de isolados de CTV, que este vírus apresenta genoma conservado em regiões
geográficas distantes, com um repertório limitado de genótipos e frequentes eventos
de recombinação, além de observaram ainda que diferentes pressões de seleção
podem moldar as populações, de moléculas de RNA viral.
Tanto o vírus quanto o vetor são endêmicos no Brasil e as consequências da
infecção causada pelo CTV trouxeram grande preocupação para os produtores.
Porém, com medidas fitossanitárias, programas de certificação e controle rigoroso de
material propagativo (porta-enxerto, borbulhas) e a utilização de espécies/variedades
de citros tolerantes, foi possível equacionar o problema (Müller & Costa, 1973; Müller,
1976; SALIBE et al., 2002; OLIVEIRA, 2006).
3.2.2. Pré-imunização
Visando estratégias de controle da doença, além da busca de porta-enxertos
tolerantes, chegou-se ao conhecimento da técnica de proteção cruzada ou préimunização, que tem como base a interferência entre estirpes do mesmo vírus, tendo
como objetivo a proteção da planta. Devido ao fato do vírus da tristeza possuir varias
9
estirpes com diferentes graus de virulência, constatou-se que plantas inoculadas com
as estirpes mais fracas não apresentavam stem pitting ou caneluras severas, quando
hiperinoculadas pelas estirpes severas. Graças a estes estudos foi possível o cultivo
da laranja Pêra IAC premunizada, tecnologia que se mostrou tão eficiente que em
1990 já havia mais de 80 milhões de laranjeiras pré-imunizadas (MULLER et. al.,
1999; SALIBE et. al., 2002).
Para a seleção de isolados alguns autores atribuem uma escala de notas, para
classificar a intensidade das nervuras causadas pelo CTV, esta classificação indica o
grau de virulência das estirpes que serão selecionas para pré-imunização ou seleção
de plantas adequadas a uma determinada região (Salibe & Cereda, 1984; Salibe et al.,
1992; e Van Vuuren et al., 1993)
A adoção da pré-imunização compreende varias medidas interligadas dentre
elas estão:

Obtenção de estirpes fracas do vírus através da seleção de plantas-elite, ou
seja, plantas que, uma vez localizadas em regiões de alta incidência do vírus,
não apresentam sintomas e mantém suas características produtivas;

Testes de avaliação de proteção em casa de vegetação, que auxiliam na
separação das estirpes quanto ao seu grau de severidade;

Indexação biológica em plantas indicadoras suscetíveis a qualquer variante do
vírus. Serve como indicativo da presença do vírus e, através dos sintomas
apresentados, pode indicar o grau de severidade da estirpe causadora da
infecção. As plantas indicadoras devem ser comprovadamente livres de vírus,
sendo os experimentos realizados em casa de vegetação livre de afídeos;

Avaliar a estabilidade das estirpes mais fracas;

Experimentos em campo para confirmação do valor protetivo das estirpes
selecionadas e integração da técnica de pré-imunização no manejo da cultura
no campo (REZENDE & MULLER, 1995; PAZ & PASQUAL 1998).
3.2.3. Resistência ao CTV
As variedades de laranja tolerantes não permitem ou permitem muito pouco a
propagação do vírus. Existem algumas rutáceas resistentes ao CTV tais como:
Poncirus trifoliata, Severinia buxifolia, Swinglea glutinosa, Fortunella, Murraya, Merrilla,
Triphasia, Pleiospermium, Aegle, Feronia, Ferontella (UENO, 2011; YOSHIDA, 1996)
As estirpes de CTV são classificadas de modo genérico em fracas, médias e
severas. O porta-enxerto de limão ‘Cravo’ tolera as estirpes fracas, médias e severas
10
de CTV denominadas normais e não tolera estirpes extremamente severas, como as
do complexo Barão B, que é apenas tolerada pelas tangerinas, P. trifoliata e alguns
outros tipos de citros (Müller et al., 1990; Bordignon et al., 2003).
O porta-enxerto P. trifoliata (L.) Rafinesque ‘Rubidoux’, espécie única do
gênero, é um genótipo muito empregado em países de clima temperado, sendo
indicado para combinações com laranjas, limas ácidas e tangerinas. P. trifoliata
apresenta importantes características fitossanitárias, pois, tem resistência a alguns
dos principais patógenos que atingem a citricultura, tais como: Phytophthora spp.,
nematóides e o vírus da tristeza dos citros. Mas esta variedade apresenta aspectos
negativos para a produção como: suscetibilidade ao exocorte, intolerância ao declínio,
baixo desenvolvimento em viveiro, intolerância a seca, alta exigência nutricional,
incompatibilidade com a laranja ‘Pêra’, limões verdadeiros e tangor ‘Murcote’
(POMPEU JR., 1991; CASTLE, et al., 1993).
Os cruzamentos que fazem uso de P. trifoliata originam híbridos com elevada
resistência ao CTV. (MEISSNER FILHO et al., 2002; CARVALHO et al., 1997). A
construção de mapas genéticos de ampla cobertura genômica auxiliou na identificação
dos genes que conferem a imunidade de P. trifoliata ao CTV: os genes Ctv 1
(GMITTER et al., 1996; CRISTOFANI et al., 1999) e Ctv2 (FANG & ROOSE, 1999).
3.3.
Silenciamento gênico ou interferência de RNA
Silenciamento gênico ou interferência de RNA (RNAi) (FIRE et al., 1998), é um
conjunto de mecanismos que pode regular de maneira negativa a expressão de um ou
mais genes. O mediador destes mecanismos é o RNA dupla-fita (double-stranded
RNA ou dsRNA) que já foi estudado em diversos organismos, e induz a degradação
dos mRNAs homólogos. Este processo recebe o nome de silenciamento gênico póstranscricional (Post-transcriptional gene silencing, PGTS) (VAUCHERET & FAGARD,
2001).
O silenciamento gênico é um mecanismo de alta especifidade, denotada com a
identificação de pequenos RNAs de 21-25 nt, de orientação senso e anti-senso,
homólogos ao RNA silenciado que estava envolvido no processo. Estes pequenos
RNAs receberam o nome de small interfering RNAs (siRNAs), observados
primeiramente em plantas (HAMILTON & BAULCOMBE, 1999).
Napoli et al. (1990), em estudos com petúnias transgênicas relataram pela
primeira vez um evento relacionado ao silenciamento gênico. O objetivo do estudo
11
com petúnias era produzir uma planta transgênica de coloração intensa. Para isso
super-expressando o gene da enzima chalcona sintase (CHS) envolvida na produção
de antocianina, pigmento responsável pela coloração púrpura das flores. Os
resultados foram diferentes do esperado, as linhagens transgênicas apresentaram
flores com diferentes padrões de coloração ou totalmente brancas. A super-expressão
do transgene provavelmente levou à formação de dsRNA do gene CHS, resultando no
silenciamento do mesmo. Estudos semelhantes também foram realizados por Krol et
al. (1990), utilizando além do CHS, o gene da enzima dihydroflavonol-4-reductase
(DFR), também relacionado à pigmentação das flores. Neste estudo os genes foram
transferidos para a petúnia e na maioria dos transformantes a expressão aumentada
não teve nenhum efeito mensurável sobre a pigmentação floral, no entanto,
aproximadamente 25% dos transformantes apresentaram uma reduzida pigmentação
floral, com uma expressiva redução de DFR ou a expressão do gene CHS.
Utilizando o verme C. elegans, Fire et al. (1998) revelaram que o mecanismo
de silenciamento gênico é mediado por dsRNA. Estes pesquisadores perceberam que
a injeção de dsRNA do gene unc-22, codificador de uma proteína do miofilamento,
provocou no verme silenciamento do gene, resultando em um fenótipo de movimentos
requebrantes. A injeção de RNA senso ou anti-senso separadamente não causava
efeitos tão marcantes.
Uma RNAse III, que recebe o nome de Dicer, é responsável pela produção dos
miRNAs e siRNAS. A produção se dá a partir de moléculas de dsRNA, necessitando a
presença de ATP. Os miRNAs ou siRNAs formados irão servir de guia para a
degradação dos mRNAs homólogos no complexo de silenciamento induzido pelo RNA
- RISC (RNA induced silencing complex) (HAMMOND et al., 2000; LLAVE, 2010).
Fungos, plantas e animais superiores possuem homólogos conservados
evolutivamente da enzima Dicer. A sua eficiência para RNAi foi atestada em humanos
ao identificar que esta enzima também cliva dsRNAs em siRNAS (BERNESTEIN et al.,
2001)
O complexo RISC foi caracterizado graças à identificação de uma proteína
AGO2, que pertence à família de proteínas Argonauta em estudo realizado em
Drosophila. Estudos posteriores também indicaram que as proteínas Argonautas
fazem parte dos complexos RISC de fungos, protozoários, nematóides e plantas.
(HAMMOND et al., 2001; CARMELL & HANNON, 2004; MARTINEZ et al., 2002;
CUELLAR et al., 2009).
12
3.3.1. Principais vias do mecanismo de silenciamento de RNA
3.3.1a Proteção contra infecção viral
Esta via de silenciamento através dos siRNAs ocorre no citoplasma. Durante a
replicação, os vírus de RNA de plantas geram moléculas de dsRNAs, as quais são
clivadas pela Dicer, gerando os siRNAs e utilizando-os como guia. Reconhece a
molécula de siRNA, separando-a em fita simples. Se houver a presença do RNA viral
complementar, o complexo RISC promoverá a clivagem deste RNA reduzindo a
replicação viral. Muitos vírus produzem proteínas que bloqueiam o silenciamento do
RNA viral, o que explica a existência de alguns isolados altamente virulentos
(BALCOMBE, 2004) (Figura 4, via 1).
3.3.1b Eliminação de transcritos de transposons e DNA repetitivo
Supõe-se que em regiões do genoma de eucariontes ricos em transposons,
ambas as fitas de DNA podem ser transcritas, dando origem a dsRNAs, que serão
eliminados pelo mecanismo de RNAi. Os pequenos fragmentos de dsRNAs também
podem operar diretamente sobre a cromatina e suprimir a transcrição, sendo que este
seria um modo para manter os transposons inativos. Se o mecanismo de RNAi não for
eficiente, os transposons não serão mantidos sob controle e podem começar a saltar e
causar efeitos deletérios no genoma (FIRE & MELLO, 2006) (Figura 4, via 2).
3.3.1c Controle da expressão gênica endógena por miRNAs
O silenciamento de mRNAs endógenos se dá através de miRNAS que se
formam a partir da clivagem de transcritos de RNA com estrutura secundária em
grampo e regulam a expressão gênica negativamente por meio do pareamento de
bases específicas a mRNAs alvo, resultando na clivagem do mRNA ou na inibição de
sua tradução (BAULCOMBE, 2004) (Figura 4, via 3).
13
3.3.1d Silenciamento transcricional e heterocromatinização
Em alguns trabalhos com plantas já havia a informação de que o silenciamento
gênico poderia ocorrer em nível transcricional, que foi confirmado após a descoberta
da
RNAi.
(METTE
et
al.,
2000;
SIJEN
et
al.,
2001). O
fenômeno
da
heterocromatinização ainda é pouco compreendido ao nível molecular, embora
modificações de histonas, ligações de proteínas específicas de condensação da
cromatina e metilação do DNA desempenhem papéis importantes (SHARP, 2006)
(Figura 4, via 4).
3.3.1e Silenciamento gênico através da introdução de dsRNA
exógeno
A expressão de um determinado gene de um organismo pode ser
especificamente silenciada através da introdução de dsRNA com sequências
complementares ao gene alvo. Esta constitui uma poderosa ferramenta para estudos
sobre a função de genes assim como potencial terapia para as mais diversas doenças
(Figura 4, via 5) (BAULCOMBE, 2004).
14
1
RNA viral
Citoplasma
núcleo
dsRNA
RNA exógeno
dsRNA
dsRNA
Pré
miRNA
5
2
RNA polimerase
siRNA
Transposon
siRNA
Pri-miRNA
miRNA
siRNA
3
RNA
polimerase
DNA
Micro RNA gene
mRNA
mRNA
4
RNA
polimerase
Clivagem de
degradação de
mRNA
mRNA
DNA
Supressão da
síntese de
proteína
Inibição da sintese de
RNA e condensação da
cromatina
Figura 4- Diferentes vias de interferência de RNA. Proteção contra infecção viral (1),
eliminação de transcritos de elementos móveis (transposons) e DNA
repetitivo (2), controle da expressão gênica endógena por miRNAs (3),
silenciamento transcricional e heterocromatinização (4), silenciamento
gênico induzido por dsRNA exógeno (5). Fonte: http://www.nobelprize.org
15
3.4.
microRNAs
Os microRNAs (miRNAs) derivam de transcritos de RNA que formam pequenas
alças com bases parcialmente pareadas e regulam a expressão de mRNAs distintos
dos quais se originaram. A maioria dos genes de miRNA de plantas está localizada em
regiões intergênicas (LAGOS-QUINTANA et al., 2001). Em plantas, a maioria dos
alvos dos miRNAs corresponde a genes que codificam proteínas reguladoras, como
fatores de transcrição e proteínas F-box, estando muitos destes envolvidos na
determinação de padrões de desenvolvimento e de diferenciação celular (NAVARRO
et al., 2006).
A formação de um miRNA em plantas é iniciada pela transcrição dos genes
MIR. Estes genes são capazes de controlar a expressão de um grande número de
proteínas celulares (ROSSI et al., 2007). Após a transcrição dos genes MIR, via RNA
polimerase II (pol II), é gerado um transcrito primário (pri-miRNA) (LEE et al., 2004),
geralmente ao redor de 1,0 kb, a partir de seu lócus no genoma da planta. O primiRNA
adquire
uma
conformação
secundária,
formando
alças com
bases
parcialmente pareadas. Ainda no núcleo celular, uma destas alças sofre ação de uma
RNAse tipo III denominada Dicer-like 1 (DCL1), gerando fragmentos de pré-miRNA.
Em plantas, os pré-miRNA são raramente detectados, pois DCL1 realiza ambos os
cortes proximal e distal da alça, rapidamente liberando as fitas pareadas de
miRNA/miRNA*(* indica a fita de miRNA que será degradada). Esta molécula de 21
nucleotídeos de RNA dupla-fita possui 2 bases não-pareadas nas extremidades 3’,
sendo que a ribose das bases externas é metilada pela enzima HEN1. As moléculas
de miRNA/miRNA* (pareadas ou não) são exportadas do núcleo com a ajuda da
proteína HST e, no citoplasma, associam-se ao complexo
RISC. A fita miRNA é
preferencialmente incorporada ao RISC enquanto a fita miRNA* é degradada. Essa
preferência parece ser determinada pelo grau de estabilidade do pareamento na
extremidade 5’ da fita, sendo que a fita com menor estabilidade é preferencialmente
incorporada. Entre outras proteínas, o RISC apresenta a Argonauta1 (AGO1) com
domínio PAZ, de ligação a moléculas de ssRNA, e domínio PIWI, semelhante ao de
RNase H. A molécula de miRNA associada ao RISC promove a clivagem específica do
mRNA alvo. O fragmento 5’ do mRNA alvo clivado é degradado pelo exossomo e o
fragmento 3’ é digerido pela exonuclease 5’3’ XRN4 (VOINNET, 2009).
16
3.5.
Small interfering RNAs
Os siRNAs são os mais abundantes dentre os pequenos RNAs de plantas.
Essas moléculas são responsáveis pelo mecanismo de “silenciamento gênico” que
consiste em regular de forma negativa a expressão de um ou mais genes. Este
mecanismo
desempenha
um
importante
papel
na
defesa
contra
vírus
e
retrotransposons (VAUCHERET et al., 2001).
Atualmente, são reconhecidas três formas distintas de siRNAs envolvidas no
controle da expressão de genes de plantas: trans-acting siRNAs (ta-siRNAs), repeatassociated siRNAs (ra-siRNAs) e natural-antisense siRNA (nat-siRNAs) (Vazquez,
2006). Além destes, siRNAs também estão envolvidos no silenciamento de transgenes
e na resistência a vírus (LLAVE, 2010).
Os ta-siRNA derivam de transcritos da planta que sofrem clivagem inicial
mediada por miRNAs, e têm como alvo genes distintos dos quais se originaram.
Foram descritos em Arabidopsis 6 loci capazes de gerar ta-siRNAs: TAS1a, b e c,
TAS2, TAS3 e TAS4 (PERAGINE et al., 2004; VAZQUEZ et al., 2004; ALLEN et al.,
2005; WILLIAMS et al., 2005). Estes loci produzem transcritos de RNA que, por serem
alvos de miRNAs, são clivados gerando dois fragmentos (5’ e 3’) que logo se associam
à proteína SGS3, protegendo-os de enzimas que agem sobre moléculas de ssRNA. A
RNA polimerase dependente de RNA RDR6 converte os fragmentos em dsRNA, os
quais são posteriormente clivados pela RNase DCL4 que, caminhando ao longo do
dsRNA, gera fragmentos de siRNA em quadros (fases) de 21 nucleotídeos. Alguns
desses siRNA têm como alvo o mRNA de outro gene, constituindo assim um ta-siRNA
(LLAVE, 2010).
Foi descrito um novo tipo de siRNA, o natural-antisense siRNA (nat-siRNAs)
(BORSANI et al., 2005). Estes se formam a partir de genes da planta com orientação
convergente que se sobrepõem em suas extremidades 3’ e aparentemente estão
envolvidos nas respostas de plantas a estresses. Em Arabidopsis, os genes SR05 e
P5CDH estão dispostos desta maneira e possuem transcritos que se sobrepõem por
uma extensão de 760 nucleotídeos. A transcrição do gene SR05 é induzida por
estresse salino e o dsRNA formado pelo pareamento com o transcrito de P5CDH é
processado pela DCL2 formando um nat-siRNA de 24 nt. Além de DCL2, são
necessárias também RDR6, SGS3, NRPD1a (subunidade da RNA polimerase IVa). O
nat-siRNA de 24 nt serve de guia para a clivagem do transcrito de P5CDH através de
uma AGO ainda não identificada. O produto clivado é convertido em dsRNA e, de
17
maneira similar aos ta-siRNA, sofre cortes em série, pela DCL1, gerando nat-siRNAs
de 21 nt (BORSANI et al., 2005).
Os ra-siRNAs estão envolvidos na manutenção da metilação do DNA e
histonas em retrotranposons e sequências repetitivas como as codificadoras de RNA
ribossomal 5S (XIE et al., 2004). A formação de heterocromatina, que ao nível do DNA
é composta de sequências de retrotransposons degenerados e arranjos em tandem de
unidades de repetições simples, também é mediada por ra-siRNAs. A ação dos rasiRNAs resulta na inibição epigenética da transcrição. Para a formação dos ra-siRNAs
de 24 nt, transcritos dos elementos repetitivos são convertidos em dsRNA pela RDR2
e clivados pela DCL3. Estes servem de guia para a metilação dos loci
correspondentes através de AGO4 e das metiltransferases DRM1 e DRM2. A RNA
polimerase IV (Pol IV) é necessária tanto para a metilação do DNA quanto para a
produção dos ra-siRNA. O complexo enzimático envolvido no silenciamento gênico
transcricional tem sido denominado de RITS (RNA-induced initiation of transcriptional
gene silencing) (XIE et al., 2004)..
A observação de que plantas infectadas por vírus acumulam siRNAs derivados
de sequências destes patógenos, e que muitos destes codificam proteínas
supressoras de silenciamento gênico, indicam que este é um mecanismo com papel
antiviral (DING & VOINNET, 2007). Estudos com mutantes de Arabidopsis mostraram
que a enzima DCL4 é a principal responsável pela produção de siRNAs de 21 nt
derivados de dsRNAs de vírus. A atividade da enzima DCL2, produzindo siRNAs de 22
nt, é detectada quando a DCL4 é inibida por um supressor de silenciamento
(VOINNET, 2009).
3.6.
Estudos sobre os microRNAs em plantas
Em Arabidopsis, 118 genes potenciais de miRNAs foram anotados baseados
em dados de genética, clonagem ou bioinformática. Estes são agrupados em 42
famílias, cada uma contendo sequências formadoras de alças capazes de gerar
miRNAs maduros idênticos ou altamente similares (SUNKAR et al., 2005). Pelo menos
21 famílias, compreendendo 92 genes, são conservadas em outras espécies botânicas
além de Arabidopsis como o arroz (SUNKAR et al., 2005) e o álamo (Populus
trichocarpa) (LU et al., 2005). Há evidências de que algumas famílias de miRNA e
seus mRNA alvos são conservados em plantas mais basais na escala evolutiva como
licopódios (miR166 detectado em Selaginella kraussiana; FLOYD & BOWMAN, 2004)
18
e musgos (miR159 detectado em Physomitrella patens; JONES-RHOADES &
BARTEL, 2004).
Existem também alguns exemplos de miRNAs que são conservados apenas
em linhagens específicas, como por exemplo o miR403 identificado somente em
eudicotiledôneas e os miR444 e miR528 específicos de monocotiledôneas (SUNKAR
et al., 2005; ZHANG et al., 2009; ZANCA et al., 2010).
Através de busca em bancos de ESTs, 27 miRNAs conhecidos em Arabidopsis
foram encontrados em citros, dos quais 13 possuiam sequências precursoras com
estruturas semelhantes às de Arabidopsis. Quarenta e um alvos potencias foram
identificados para 15 miRNAs de citros, sendo a maioria dos alvos constituída de
fatores de transcrição envolvidos no controle do desenvolvimento da planta (SONG et
al., 2009).
Song et al. (2010) identificaram, através de sequenciamento em equipamento
Illumina, 42 miRNAs altamente conservados e 10 novos candidatos em Poncirus
trifoliata. Os miRNAs encontrados estão envolvidos no controle do crescimento,
desenvolvimento e resposta a doenças deste importante gênero de porta-enxerto.
Sequenciamento em larga-escala utilizando o equipamento Illumina também foi
realizado por Xu et al. (2010) para encontrar miRNAs diferencialmente expressos em
uma variedade mutante espontânea de laranja doce sanguínea. Foram encontrados
miRNAs reprimidos cujos alvos codificam enzimas da via biossintética de carotenóides
assim como da fotossíntese, mostrando uma associação entre a síntese de licopenos
e o aumento na taxa fotossintética.
Dez miRNAs conservados com papéis importantes no desenvolvimento da
planta foram detectados através de qRT-PCR em embriões somáticos de laranja doce
Valência (WU et al., 2011). Foi evidenciado o envolvimento de cada um destes
miRNAs em diferentes fases do desenvolvimento do embrião somático, assim como
na incompetência de formação de embriões em calos não-embriogênicos.
Ruiz-Ruiz et al. (2011) utilizaram sequenciamento da nova geração para
caracterizar siRNAs de CTV em plantas de limão galego, laranja doce e laranja azeda
inoculadas com o isolado severo T318A. Verificaram que nas plantas suscetíveis de
limão galego e laranja doce, a proporção de siRNAs virais chega a até 50 % do total
de smRNAs, enquanto que na laranja azeda não passou de 3,5 %. Os siRNAs virais
predominantes apresentavam 21 a 22 nt, e correspondiam aos 2.500 nt do terminal 3’
do genoma viral, e acumulando ligeiro excesso para a fita senso positivo.
19
3.7.
Controle da transição planta juvenil/planta adulta por miR156
e miR172
Em angiospermas, uma rede regulatória envolvendo miR156 e miR172
funciona como um controlador geral, por vias autônomas, da mudança da fase
vegetativa e do florescimento, respectivamente. O miR156 regula negativamente
mRNAs que codificam fatores de transcrição SQUAMOSA PROMOTER BINDING
PROTEIN-LIKE (SPL), tais como SPL9 e SPL10, que ativam diretamente a transcrição
de miR172. Por sua vez, miR172 regula negativamente transcritos que codificam
repressores semelhantes ao APETALA2 (AP2) que inibem o principal gene indutor da
floração FLOWERING LOCUS T (FT). O FT é transportado das folhas para o ápice
dos ramos onde forma um complexo com o fator de transcrição FD, ativando os genes
MADS-box
APETALA1
(AP1)
e
SUPRESSOR
OF
OVEREXPRESSION
OF
CONSTANS1 (SOC1). Outros alvos do miR156 como SPL3, SPL4 e SPL5 são
ativados no ápice de ramos e regulam, independentemente do miR172 e do FT, a
expressão de AP1, SOC1 e outros fatores associados à floração como o LEAFY
(LFY), FRUITFULL (FUL) e AGAMOUS-LIKE 42 (AGL42). Além da indução da
floração, a rede regulatória envolvendo miR156-SPL-miR172-AP2 mediaa mudança de
características foliares durante a passagem da fase juvenil para adulta. Assim, este
rede regulatória requer um controle estrito da expressão de SPL e miR172 durante as
fases
iniciais
do
desenvolvimento
para
manter
a juvenilidade
e
evitar
o
estabelecimento precoce da fase adulta e da floração. Este controle é liberado ao
longo do desenvolvimento pela redução gradual do miR156 e concomitante aumento
de SPL e miR172, que desencadeiam a transição juvenil-adulto (NONOGAKI, 2010;
SALEH et al., 2011). O miR172 também é especializado em outras funções, de outros
aspectos do desenvolvimento da planta, tais como cleistogamia e tuberização (ZHU &
HELLIWELL, 2010).
3.8.
Regulação da resposta de defesa a patógenos por pequenos
RNAs
O envolvimento de pequenos RNAs na regulação da resposta de resistência a
doenças foi descrito pela primeira vez em Arabidopsis por Navarro et al. (2006) e
Katiyar-Argawal et al. (2006). O miR393 tem sua expressão aumentada em plantas
20
tratadas com o elicitor flagelina, o que causa uma diminuição na expressão dos
mRNAs dos receptores de auxina TIR1, AFB2 e AFB3 (NAVARRO et al., 2006). A
consequente diminuição na resposta à auxina leva a uma menor suscetibilidade à
bactéria Pseudomonas syringae. O nat-siRNA-ATGB2 tem sua expressão aumentada
em plantas de Arabidopsis inoculadas com P. syringae (KATIYAR-AGARWAL et al.,
2006). Este nat-siRNA causa degradação do mRNA do gene codificador de uma
proteína PPRL (pentatricopeptide repeats protein-like), a qual é repressora da
resistência mediada pelo gene RPS2 (KATIYAR-AGARWAL et al., 2006). O gene
RPS2 confere resistência à Pseudomonas syringae que contén o gene de avirulência
avrRpt2 (MINDRINOS et al., 1994; MAURICIO et al., 2003).
21
4. Material e métodos
Os experimentos e atividades desenvolvidas referentes a este trabalho foram
realizados no Laboratório de Bioquímica Fitopatológica, Centro de Pesquisa e
Desenvolvimento de Sanidade Vegetal, Instituto Biológico – São Paulo.
4.1.
Material Vegetal
Foi utilizada uma planta de laranja doce (Citrus sinensis (L.) Osbeck),
variedade ‘Pêra-IAC’ pré-imunizada com uma estirpe fraca do vírus da tristeza dos
citros (Citrus tristeza virus, CTV), mantida em casa de vegetação sob condições
naturais de iluminação e temperatura (Figura 5A). Esta planta foi utilizada para a
construção da biblioteca de pequenos RNAs, estudos sobre siRNAs de CTV e sobre
os miRNAs envolvidos no controle do desenvolvimento de citros. Plântulas de laranja
Hamlin gentilmente cedidas pelo Prof. Dr. Francisco de Assis Alves Mourão Filho, da
Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (ESALQ) Piracicaba - São Paulo,
mantidas em tubetes sob condições naturais de iluminação e temperatura (Figura 5B),
foram utilizadas nos estudos sobre os miRNAs envolvidos no controle e
desenvolvimento dos citros.
A
B
.
Figura 5. A- Planta de laranja doce (Citrus sinensis (L.) Osbeck), variedade Pêra-IAC,
mantida em casa de vegetação sob condições naturais de iluminação e
temperatura. B- plântulas de laranja Hamlin, (banco de germoplasmaESALQ) mantidas em tubos de ensaio em temperatura ambiente sob
condições naturais de iluminação.
22
4.2.
Isolamento de RNA total
O método de isolamento de RNA total foi o mesmo utilizado para as duas
variedades de laranja. Foram utilizados 100 mg de folhas novas de laranjeira Pêra-IAC
e 50 mg de folhas das plântulas de laranjeira Hamlin. Os tecidos foram submetidos à
trituração em almofariz com nitrogênio líquido e o pó resultante foi ressuspendido com
1 mL do reagente Trizol (Life Technologies), prosseguindo com o protocolo de
extração segundo as recomendações do fabricante. Para a amostra de laranjeira PêraIAC realizou-se 4 extrações, o RNA total de cada extração foi ressuspendido em 25 µL
de H20 deionizada, previamente autoclavada.
4.3.
Purificação dos pequenos RNAs (smRNAs)
Após a extração de RNA total, utilizou-se o RNA ressuspendido (apenas da
laranjeira Pêra-IAC) para o enriquecimento dos pequenos fragmentos de RNA. Este
enriquecimento consiste em concentrar os pequenos RNAs separando-os das
moléculas maiores. Para este procedimento utilizou-se o volume total das 4 extrações
unidos em um único tubo o que resultou em um volume final de 100 µL. A união dos
volumes de RNA resuspendido, possibilita um aumento na concentração dos
pequenos RNAs. Realizou-se a purificação com o miRNeasy Mini Kit (Qiagen) seguido
da eletroforese em gel de poliacrilamida 12% desnaturante. Como marcadores foram
utilizados oligonucleotídeos de DNA de 18, 21 e 25 nt, para a localização da região
contendo smRNAs no gel. Após a eletroforese, o gel foi corado com brometo de etídio
e visualizado sob luz ultravioleta. Deste gel cortou-se um fragmento compreendendo
RNAs de aproximadamente 18-30 nt. O fragmento do gel cortado foi colocado em um
microtubo e os smRNAs foram eluidos com 500 µL da solução de NaCl 0,3 M e
precipitados com 3 volumes de etanol 100% a -80 °C por 12 h. No dia seguinte,
centrifugou-se a amostra por 20 min, 20.800 g a 4 °C, o sobrenadante foi descartado e
o sedimento foi lavado com etanol 80%. Centrifugou-se novamente a amostra por 5
min, a 17.900 g a 4 °C descartou-se o sobrenadante e secou-se a amostra em
centrífuga a vácuo por 7 min. Os smRNAs foram ressuspendidos em 6,5 µL de H 2O
deionizada, previamente esterilizada.
23
4.4.
Ligação dos adaptadores
Para a construção das bibliotecas empregou-se a metodologia de Lau et al.
(2001). A Figura 6 representa os adaptadores e primers utilizados, os quais foram
adquiridos junto à empresa Integrated DNA Technologies. Primeiro ligou-se o
adaptador 3’ em uma reação de volume final de 10 µL [(6,5 µL de smRNAs, 0,5 µL de
adaptador 3’ (100 µM), 1,0 µL do tampão 10x, 1,0 µL de BSA (soro albumina bovina, 1
mg/mL)] e 1,0 µL de T4 RNA ligase (10 U/µL, Fermentas). A mistura foi incubada a 37
°C por 1 h. Transcorrido este período submeteu-se a amostra a eletroforese em gel de
poliacrilamida 12% com uréia como agente desnaturante. Após a eletroforese, o gel foi
“corado” com brometo de etídio e visualizado sob luz ultravioleta. Deste gel cortou-se
um fragmento entre 40 e 50 pb, por levar em conta que o adaptador 3’ possui um
tamanho de 19 nt e quando ligado aos smRNAs podem atingir um tamanho que varia
entre 37 e 44 nt, neste caso o fragmento cortado representa os smRNAs ligados ao
adaptador 3’. Após o corte, o fragmento foi colocado em um microtubo e os pequenos
RNAs foram eluídos com 0,3 M de NaCl e precipitados com 3 volumes de etanol 100%
e 3 µL de glicogênio (20 mg/mL) (o glicogênio auxilia na precipitação de RNAs
pequenos). A amostra permaneceu a -80 °C por 12 h. No dia seguinte centrifugou-se a
amostra por 20 min, a 20.800 g a 4 °C. O sobrenadante foi descartado e o precipitado
lavado com etanol 80%. Centrifugou-se novamente a amostra por 5 min, a 17.900 g a
4 °C descartou-se o precipitado e secou-se a amostra em centrífuga a vácuo por 7
min. Depois de seca, a amostra foi ressuspendida com 6,5 µL de H20 deionizada,
previamente autoclavada e a esta reação adicionou-se os componentes para a reação
de ligação do adaptador 5’, em uma reação de volume final 10 µL [5,5 µL de smRNAs
adicionados ao adaptador 3’, 0,5 µL de adaptador 5’ (100 µM), 1,0 µL de tampão 10x,
1,0 µL de BSA (1 mg/mL), 1,0 µL de T4 RNA ligase (10 U/µL, Fermentas) e 1,0 µL de
ATP (10 mM)].
Figura 6. Adaptadores e primers empregados para amplificação e clonagem dos
pequenos RNAs (representados por “X”). Em vermelho, estão indicados os
sítios para a enzima Ban I.
24
A reação permaneceu a 37 °C por 1 h. Transcorrido este período, realizou-se a
reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR (transcrição reversa seguida
da reação em cadeia da polimerase) em duas etapas. Para a primeira etapa foi
preparada uma reação para um volume final de 5 µL (2,0 µL de smRNAs ligados aos
adaptadores, 0,5 µL de RT primer 10 µM e 2,5 µL de H20). A amostra foi submetida à
temperatura de 70 °C por 5 min em termociclador PTC-100 (MJ Research). Após o
tempo estabelecido, a amostra foi colocada em gelo e no mesmo tubo realizou-se a
segunda etapa, onde foi preparada uma reação para um volume final de 20 µL [5,0 µL
da 1a etapa da reação, 4,0 µL do tampão 5x, 4,8 µL de MgCl2 25 mM 1,0 µL de dNTPs
10 mM, 1,0 µL de Improm-II (Promega), 4,2 µL de H2O]. A amostra foi submetida à
temperatura de 45 °C em termociclador por 60 min.
Os cDNAs obtidos através da reação de RT foram diluídos com 80 µL de H2O e
submetidos à PCR. Foram utilizados 8 microtubos com uma reação de volume final de
50 µL em cada [1,0 µL de cDNA, 1,0 µL de 3’ PCR primer 10 µM, 1,0 µL de PCR-F
primer 10 µM, 10 µL do tampão 5x, 1,0 µL de dNTPs 10 mM, 0,2 µL de GoTaq e 35,8
µL de H2O]. A PCR foi realizada com a temperatura de 94 °C por 2 min de
desnaturação inicial, seguida de 32 ciclos de (94 °C – 10 s, 65 °C – 30 s, 72 °C – 30 s)
desnaturação, anelamento e extensão e 72 °C por 4 min de extensão final.
Após a PCR, os produtos obtidos nos 8 microtubos foram agrupados em um
único, resultando em um volume total de 400 µL. Deste volume foram retirados 6 µL
para verificação do produto por eletroforese em gel de poliacrilamida 10% não
desnaturante. Os 394 µL restantes foram purificados com 200 µL de clorofórmio e 200
µL de fenol, e centrifugados por 5 min a 15.300 g. Após a centrifugação, retirou-se a
fase aquosa que foi transferida para um novo tubo. A este novo tubo adicionou-se 1/10
do volume de NaOAc 3 M pH 5,2 e 3 volumes de etanol 100% para precipitar a
amostra que foi mantida por 20 min a -80 °C. Transcorrido o período estipulado,
centrifugou-se a amostra por 20 min a 20.800 g a 4 °C descartou-se o sobrenadante e
lavou-se o precipitado com 200 µL de etanol 70% que depois foi secado em centrífuga
a vácuo por 7 min e ressuspendido com 36 µL de H2O deionizada previamente
esterilizada.
25
4.5.
Digestão com BanI
Aos 36 µL do produto de PCR concentrado foram adicionados 4 µL de tampão
orange 10x e 2 µL de BanI (=BshNI, 10 U/µL, Fermentas). A amostra foi mantida à
temperatura de 37 °C por uma noite e submetida à eletroforese em gel de
poliacrilamida 10% não desnaturante. Os fragmentos de aproximadamente 51 pb
foram recortados do gel, colocados em um microtubo, eluídos em 400 µL de 0,3 M de
NaCl e precipitados com 3 volumes de etanol 100% e 3 µL glicogênio (20 mg/mL), à
temperatura de -80 °C por uma noite. No dia seguinte centrifugou-se a amostra por 20
min, 20.800 g a 4 °C descartou-se o sobrenadante e lavou-se o precipitado com etanol
80%. Centrifugou-se novamente a amostra por 5 min, 17.900 g a 4 °C, e descartou-se
novamente o sobrenadante, secou-se a amostra em centrífuga a vácuo por 7 min e
ressuspendeu-se a amostra com 15 µL de H2O deionizada, previamente esterilizada.
4.6.
Formação de concatâmeros
O produto de PCR digerido com a enzima de restrição BanI e purificado em gel
de poliacrilamida 10% não-desnaturante, foi submetido à reação de formação de
concatâmeros com T4 DNA ligase de acordo com a mistura: 15 µL do produto
digerido, 2 µL do tampão da ligase 10x, 2 µL de 10 mM ATP e 1 µL de T4 DNA ligase
(5 U/µL, Fermentas). A reação foi incubada à temperatura de 16 °C por 12 h.
4.7.
Adição de adenina ao terminal 3’
Para a adição de adenina na extremidade 3’ foi preparada uma reação com: 3
µL do tampão 10x, 1,7 µL de dNTPs (10 mM), 2,4 µL de MgCl2 (50 mM) 2,4 µL de H2O
e 0,5 µL de Taq (5 U/µL, Life Technologies). A amostra foi mantida em termociclador a
94 °C por 4 min e 72 °C por 10 min, e submetida à eletroforese em gel de agarose
0,8%. Um fragmento do gel contendo concatâmeros de 500 a 1.500 pb, foi cortado e
purificado com o Kit QIAquick® Gel Extraction (Qiagen) conforme recomendação do
26
fabricante. Os concatâmeros foram eluídos com 30 µL de H2O deionizada previamente
esterilizada.
4.8.
Clonagem em vetor pGEM-T Easy
Para a ligação dos concatâmeros ao vetor pGEM-T Easy (Promega) preparouse uma reação de volume final de 10 µL com uma alíquota de 3,5 µL dos
concatâmeros, 0,5 µL do vetor, 1,0 µL de DNA ligase (5 U/µL, Promega) e 5,0 µL de
tampão 2x. A reação foi mantida por uma noite sob temperatura de 4 a 8 °C.
O produto da ligação foi inserido em células competentes de Escherichia coli
DH10B por transformação via choque térmico. Em um tubo de vidro foram adicionados
90 µL de células competentes de E. coli + 10 µL da reação de ligação. A mistura foi
submetida a 42 °C por 1 min e depois transferida para o gelo por 2 min. Transcorrido o
tempo estipulado, adicionou-se 1 mL de meio de cultura Luria-Bertani (LB) (triptona 10
g/L, extrato de levedura 5 g/L, NaCl 10 g/L) líquido e a amostra foi mantida por 60 min
a 37 °C.
O meio com as bactérias foi centrifugado a 15.300 g por 1 min e 850 µL do
sobrenadante foram descartados, as bactérias foram ressuspendidas nos 150 µL
restantes e semeadas em uma placa de Petri contendo meio LB sólido com ampicilina
(100 µg.mL-1) e X-gal (4 µL de solução 20 mg.mL-1). A placa foi incubada a 37 °C por
uma noite. Colônias brancas foram transferidas com auxílio de palitos de dente
autoclavados, cultivadas em 1 mL de meio LB líquido por 24 h, a 37 °C sob agitação e
submetidas à extração dos plasmídeos (minipreps). Os plasmídeos foram extraídos
através de lise alcalina seguida de precipitação com PEG 6.000 50% e NaCl 5M,
segundo protocolo de Schmitz e Riesner (2006).
4.9.
Os
Sequenciamento de DNA
plasmídeos
contendo
os
concatâmeros
foram
submetidos
ao
sequenciamento unidirecional com primer T7, utilizando o reagente Big Dye
Terminator 3.1 (Applied Biosystems). A reação de sequenciamento constou de 2 uL de
plasmídeo, 0,33 uL primer T7 (10 µM), 1 uL tampão de sequenciamento 5x, 2 uL Big
27
Dye 3.1 (Applied Biosystems) e 4,67 uL de H2O. O programa do termociclador constou
de 25 ciclos de 95 °C/30 s – 50 °C/30 s – 60 °C/4 min. Os produtos da reação de
sequenciamento foram precipitados pela adição de 40 µL de isopropanol 75% e
centrifugação a 3220 g/30 min, seguidos de lavagem com 100 uL de isopropanol 75%.
As amostras foram ressuspendidas em 2 µL de formamida, desnaturadas a 95 °C/2
min e analisadas em sequenciador automático ABI377 (Applied Biosystems).
4.10. Análise das sequências
As sequências de miRNA e siRNA presentes nos concatâmeros foram
individualizadas através do reconhecimento das sequências dos adaptadores das
extremidades 3’ e 5’. Os pequenos RNAs individualizados foram submetidos a buscas
através
do
programa
Blastn
no
site:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi?PAGE=Nucleotides
A localização dos siRNAs no genoma do CTV foi realizado por Blastn,
comparando-os com sequências de genomas completos deste vírus.
Para a localização dos sítios de origem dos miRNAs no genoma de C. sinensis
ou Citrus clementina, foi utilizado o programa Blastn na página do Citrus Genome
Database (http://www.citrusgenomedb.org/). Segmentos de 150 a 300 nt da região
potencialmente geradora dos miRNAs foi extraída utilizando-se a ferramenta GBrowse.
A estrutura secundária formada por estes segmentos foi determinada através do
programa RNADraw (MATZURA & WENNBORG, 1996).
4.11. Stem-loop qRT-PCR
Os oligonucleotídeos empregados para a detecção de miRNAs e siRNAs por
stem-loop qRT-PCR foram desenvolvidos de acordo com os princípios propostos por
Chen et al. (2005) e com as modificações sugeridas por Xue et al. (2008) (Figura 7 e
Tabela 1). Este último empregou oligonucleotídeos mais longos que o primeiro, de
forma a aumentar a especificidade do ensaio, assim como substituiu o uso das sondas
Taqman específicas para cada miRNA pelo reagente SYBR Green, que pode ser
empregado para qualquer miRNA. A reação da transcriptase reversa foi realizada pelo
28
método pulsado, conforme proposto por Tang et al. (2006), visando aumentar a
sensibilidade do ensaio.
miR156 – UGACAGAAGAGAGUGAGCAC
miR156-F: ATCGTACGTGGGTGACAGAAGAGAGT
miR156-SL: GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGTGCTCAC
Common-R: GCAGGGTCCGAGGTATTC
AGGGTC
ATCGTACGTGGGTGACAGAAGAGAGT
GTCGTATCCAGTGC
UGACAGAAGAGAGUGAGCAC ||||||||||||||
CACTCGTG CAGCATAGGTCACG
C
G
A
CTTATGG
Figura 7. Sequências dos oligonucleotídeos empregados para a detecção do miR156
(em vermelho) por stem-loop qRT-PCR. A reação da transcriptase reversa
foi realizada com o oligonucleotídeo miR156-SL, que forma estrutura
secundária em alça (devido ao pareamento das bases em verde). A reação
de amplificação por PCR foi realizada com os oligonucleotídeos miR156-F
(em azul) e common-R. Este último foi utilizado para a amplificação de todos
os smRNAs e se anela à região que forma a alça do oligonucleotídeo SL.
29
Tabela 1. Oligonucleotídeos empregados para a detecção de miRNAs e siRNAs por
stem-loop qRT-PCR
miR172
CTVsiR18012
CTVsiR9507
CTVsiR238
Sequência do miRNA
AGAAUCUUGAUGAUGCUGCA
Oligonucleotídeo F
ATCGTACGTGGGAGAATCTTGATGAT
Oligonucleotídeo SL-RT
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT
TCGCACTGGATACGACTGCAGCAT
Sequência do siRNA
CCAGCGCAACAGAUGUCAUGGG
Oligonucleotídeo F
ATCGTACGTGGGCCAGCGCAACAGATG
Oligonucleotídeo SL-RT
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT
TCGCACTGGATACGACCCCATGACA
Sequência do siRNA
GGCAGCGGCUGUACUCGACAGA
Oligonucleotídeo F
ATCGTACGTGGGGGCAGCGGCTGTACT
Oligonucleotídeo SL-RT
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT
TCGCACTGGATACGACTCTGTCGAG
Sequência do siRNA
AGGUGGUUAAGGAGUUUUCGG
Oligonucleotídeo F
ATCGTACGTGGGAGGTGGTTAAGGAGT
Oligonucleotídeo SL-RT
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT
TCGCACTGGATACGACCCGAAAAC
4.11.1. Extração de RNA total e Transcrição Reversa
Para a reação de stem-loop qRT-PCR, utilizou-se RNA total extraído de folhas
de laranjeira Pêra-IAC e de folhas de plântulas de laranjeira Hamlin.
Primeiramente o RNA total foi submetido a um tratamento com DNAse para
eliminação de qualquer vestígio de DNA que pudesse estar presente na amostra. O
RNA total extraído com o reagente Trizol (Life Technologies) foi eluído com 44 µL de
H2O deionizada previamente esterilizada e adicionado de 5 µL de tampão 10X e 1 µL
de TURBO DNase (2 U/µL, Ambion). Manteve-se a mostra a 37 °C por 30 min para a
ação da enzima. Após o tempo estipulado adicionou-se 1,5 µL de EDTA 0,5 M para
uma concentração final de 15 mM. O EDTA ajuda a preservar a fita de RNA durante o
processo de inativação da DNAse, realizado à temperatura de 75 °C por 10 min.
30
Para a reação de transcrição reversa utilizaram-se 2 µL (~2 µg) de RNA, 0,1 µL
Stem-loop RT primer (SL) 10 µM (Figura 6), 1 µL de dNTPs 10 mM e 11,1 µL de H2O
deionizada previamente autoclavada. A reação foi aquecida a 65 °C por 5 min e
transferida imediatamente para o gelo, permanecendo por 2 min. Após o tempo
estipulado adicionou-se à reação 4 µL de tampão 5X, 1 µL de DTT 0,1 M e 0,2 µL de
transcriptase reversa SuperScriptIII (200 U/µL, Life Technologies) totalizando 20 µL.
Prepararam-se reações sem a enzima (no-RT) e sem o RNA (controle H2O) como
controles. Para a RT-pulsada utilizou-se 60 ciclos e as seguintes temperaturas: 16 °C
por 30 min seguidos de 60 ciclos de (30 °C – 30 s, 42 °C – 30 s, 50 °C – 1 s), 85 °C
por 5 min. Após o encerramento do último passo as amostras foram mantidas a 4 °C.
4.11.2. PCR quantitativo
Para a reação de qPCR utilizou-se 1 µL de cDNA, 0,4 µL de primer F 10 µM,
0,4 µL de primer common R 10 µM, 10 µL de SYBR Green Master Mix 2X (Applied
Biosystems e 8,2 µL de H2O totalizando 20 µL. As reações foram realizadas em
triplicata para cada amostra. O programa de amplificação constou de desnaturação
inicial e ativação da DNA polimerase a 95 °C/10 min, 40 ciclos de desnaturação a
95 °C/15 s e anelamento/extensão a 60 °C/1 min. Após o término da amplificação, foi
realizada análise da curva de desnaturação (“melting”), para confirmação da
amplificação de produtos específicos.
31
5. Resultados e Discussão
5.1.
Extração de pequenos RNAs
A utilização do miRNeasy Mini Kit (Qiagen), após a extração de RNAs totais
com Trizol (Life Technologies) permitiu a obtenção de fração enriquecida de smRNAs
de folhas de laranjeira Pêra-IAC pré-imunizada, como demonstrado na eletroforese em
gel de poliacrilamida 12% desnaturante (Figura 8). As bandas mais intensas
correspondem a RNAs ribossômicos (rRNAs) e RNAs transportadores (tRNAs) da
planta. A região contendo pequenos RNAs pode ser observada em destaque na parte
inferior do gel (Figura 8).
M
1
2
Região
27
cortada
24
18
Figura 8. Perfil eletroforético em gel desnaturante de poliacrilamida (12%). (1 e 2)
Fração enriquecida de pequenos RNAs extraídos de folhas de laranjeira
‘Pêra-IAC’. Em destaque região cortada indicando os possíveis miRNAs. (M)
Oligonucleotídeos de DNA de 18, 24 e 27 nt utilizados como marcadores
moleculares.
32
Os smRNAs de tamanhos entre 18 e 30 nt extraídos do gel de poliacrilamida
foram ligados aos adaptadores 3’ e 5’. O adaptador 3’ foi o primeiro a ser ligado com o
auxílio da T4 RNA ligase e sem ATP. Este adaptador de RNA é pré-ativado com uma
extremidade 5’ adenilada (rApp) que se liga ao RNA e é bloqueado na extremidade 3’
com uma dideoxicitidina (ddC) que previne a auto-circularização. Após a ligação do
adaptador 3’, o produto da ligação foi purificado em gel de poliacrilamida 12%
desnaturante. O adaptador 3’ possui tamanho de 19 nt que ligado ao smRNAs resulta
em produtos de aproximadamente 37-49 nt. A região do gel contendo estes
fragmentos foi cortada conforme mostra a Figura 9.
M
1
100 pb
Região
cortada
Figura 9. Perfil eletroforético em gel desnaturante de poliacrilamida (12%). (1)
smRNAs ligados ao adaptador 3’, em destaque região cortada para
purificação. (M) marcador molecular 10 pb ladder (Life Technologies).
O adaptador 5’ foi ligado com o auxílio da T4 RNA ligase e ATP na extremidade
3’ do RNA. O adaptador 5’ é composto por 22 nt, sendo 5 nt de DNA na extremidade 5’
e 17 nt de RNA na extremidade 3’. Após a ligação dos adaptadores o produto da
ligação foi submetido à transcrição reversa com RT primer e posteriormente submetido
à PCR com os primers 3’ + PCR-F. O resultado da reação de PCR pode ser visto na
Figura 10, onde os fragmentos correspondentes a aproximadamente 80 pb
33
representam os cDNAs ligados aos adaptadores. Já o fragmento de aproximadamente
60 pb corresponde aos adaptadores ligados entre si, sem os smRNAS.
M
100 pb
1
80 pb
60 pb
Figura 10. Perfil eletroforético em gel não desnaturante de poliacrilamida (10%). (1)
Produto de RT-PCR dos smRNAs ligados aos adaptadores 3’ e 5’. O
fragmento de 80 pb corresponde aos smRNAs ligados aos adaptadores 3’ e
5’ e o fragmento de 60 pb corresponde aos adaptadores ligados entre si sem
os smRNA. (M) marcador molecular 10 pb DNA ladder (Life Technologies).
M
O produto de RT-PCR de 80 pb, correspondente aos smRNAs ligados aos
adaptadores, foi digerido com a enzima de restrição BanI por 24 h. O fragmento
resultante de aproximadamente 50 pb, correspondente aos smRNA convertidos em
DNA e adicionados de parte dos adaptadores, foi cortado do gel, como identificado na
Figura 11. A digestão com BanI resultou em fragmentos com extremidades coesivas
que permitiram a concatenação direcional, possibilitando a determinação da
orientação 5’-3’ dos fragmentos clonados. Após a ligação entre si, as sequências
concatenadas apresentaram tamanho aproximado entre 500 a 1.500 pb, como
monstrado na Figura 12.
34
M
10 pb
A
Região
cortada
50 pb
Figura 11. Perfil eletroforético em gel não desnaturante de poliacrilamida (10%) do
produto de RT-PCR dos smRNAs ligados aos adaptadores após a digestão
com a enzima de restrição BanI. (A) Fragmentos de 50 pb correspondentes
ao produto esperado. (M) marcador molecular 10 pb DNA ladder (Life
Technologies)
M
1 Kb
1
Região
cortada
Figura 12. Perfil eletroforético em gel de agarose (0,8%), após a concatenação dos
fragmentos de DNA digeridos com BanI (1) concatâmeros de 500-1.500 pb
utilizados para a clonagem em pGEM-T Easy. (M) marcador molecular 1
Kpb DNA ladder (Life Technologies).
35
5.2.
Sequenciamento e análise da biblioteca de smRNAs
A clonagem dos concatâmeros em pGEM-T Easy resultou em uma biblioteca
da qual foram obtidas sequências de boa qualidade de 123 clones. O número de
pequenos RNAs contidos em cada clone variou entre 1 e 12, demonstrando que a
reação de concatenação foi bem sucedida. Os resultados gerais obtidos a partir da
análise das sequências estão apresentados na Tabela 2.
Tabela 2. Resultados gerais do número, sequências e classe de pequenos RNAs
presentes na biblioteca de smRNAs concatenados de laranja ‘Pêra-IAC’.
Classe de smRNA
Número de sequências
miRNAs
13
siRNAs (CTV)
49
rRNA e tRNA
162
Cloroplasto
187
Total de sequências obtidas
411
Dos 123 clones sequenciados, puderam ser individualizados 411 smRNAs a
partir dos concatâmeros, correspondendo a uma média de 3,34 smRNAs por clone.
Embora tenham sido obtidos clones com até 12 smRNAs, prevaleceram clones com
número menor de unidades, pois há uma tendência em se clonar fragmentos menores.
Foi obtido grande número de sequências de origem ribossomal (162), incluindo
as unidades 5S, 18S, 26S, região ITS e alguns tRNAs. Estes fragmentos são,
provavelmente, produtos de degradação destas moléculas maiores e que estavam
presentes como contaminação na fração de smRNAs purificados.
Observou-se também grande número de sequências de cloroplasto (187), mas
neste caso a maior parte destas não corresponde a produtos de degradação aleatória,
pois trata-se de uma única sequência repetida inúmeras vezes. Esta mesma
sequência de 22 nt (AGUUACUAAUUCAUGAUCUGGC) também foi encontrada em
bibliotecas de smRNAs de tabaco (LUNG et al., 2006) e Arabidopsis (BILLOUD et al.,
2005).
36
Alguns miRNAs conservados de plantas puderam ser encontrados na
biblioteca: miR159, miR157, miR167 e miR171 (Tabela 3). Os miRNAs identificados
neste trabalho já foram descritos em estudos de caracterização de miRNA em
Arabdopsis (REINHART et al., 2002), arroz (SUNKAR et al., 2005), milho (ZHANG et
al., 2009), citros (XU et al., 2010) e outros.
Tabela 3. Sequências de miRNAs conservados encontrados nos clones da biblioteca
de smRNAs de laranja Pêra-IAC pré-imunizada com CTV.
miRNA
frequência
Sequência
miR159
9
UUUGGAUUGAAGGGAGCUCUA
miR156/157
2
UUGACGGAAGAUAGAGAGCAC
miR167
1
UGAAGCUGCCAGCAUGAUCUGG
miR171
1
UUGAGCCGUGCCAAUAUCACG
O miR159 apresentou maior freqüência na biblioteca, com 9 repetições. Este
miRNA apresenta importante papel no desenvolvimento vegetal e a sua expressão é
abundante e generalizada em todos os órgãos da planta (PALATINIK et al., 2007). O
miRNA159 restringe a expressão de fatores de transcrição MYB (PALATINIK et al.,
2007; LI et al., 2011). Os fatores de transcrição MYB constituem uma classe
diversificada de proteínas, presentes em animais e plantas, possuem grande
importância na regulação transcricional e configuram-se como a maior família de
fatores de transcrição encontrados em plantas (JIM & MARTIN, 1999; CARNEIRO et
al., 2007). Os genes MYB são responsáveis pela formação e regulação de
meristemas, elaboração de células especializadas como células-guarda e tricomas,
desenvolvimento foliar e de sementes, além de controlar muitas vias biossintéticas
como a produção de antocianinas e flavonóides (WLKINS et al., 2009; CARNEIRO et
al., 2007). Estes genes demonstraram-se capazes de reprimir o metabolismo de ácido
fenólico e a biossíntese de lignina, através da superexpressão de dois genes MYB de
Antirrhinum (AmMYB308 e AmMYB330) em plantas de tabaco transgênicas
(TAMAGNONE et al., 1998).
37
Em estudos realizados com Arabidopsis, foi possível constatar que plantas em
condições de stress abiótico acumulam grandes concentrações de ácido abscísico
(ABA). Altas concentrações deste fitohormônio induzem o acúmulo de miR159 que
atua na clivagem de transcritos MYB33 e MYB101, regulando positivamente as
respostas ao ABA e permitindo o desenvolvimento do embrião em mudas (REYES &
CHUA, 2007). A ação do miR159 sobre MYB33 e MYB65 foi descrita também por
Archard et al. (2004) ao relatar a função de miR159 como modulador da expressão de
ácido giberélico no desenvolvimento das anteras.
Através de busca (Blastn) no Citrus Genome Database, genoma de C.
clementina v0.9, foi identificado um segmento com sequência idêntica ao miR159 no
“scaffold” 3, bases 7.580.034 – 7.580.054. A previsão da estrutura secundária
englobando 300 nucleotídeos ao redor deste segmento demonstrou que há formação
de uma alça extensa, com potencial de gerar o miR159 (Figura 13). Análise no
genoma de C. sinensis não permitiu a identificação de regiões com similaridade de
100%.
Figura 13. Previsão da estrutura secundária em alça obtida com auxílio do programa
RNAdraw formada pela sequência da região do genoma de Citrus
clementina, origem potencial do miR159. A linha em vermelho mostra a
posição do miR159.
Na biblioteca de smRNAs foi constatada a presença de duas sequências de
miR156/157. A comparação destas sequências com outros miRNAs presentes no
miRBase mostrou maior similaridade tanto com mir156d de soja (Glycine max) e
miR156g de Populus trichocarpa, como com mir157a de A. thaliana (Figura 14). Menor
similaridade foi encontrada na comparação com miR156a de A. thaliana e miR156 de
C. sinensis oriundo do trabalho de Xu et al. (2010) (Figura 14). Desta forma, a exata
designação deste miRNA de citros necessita mais estudos.
38
Figura 14. Alinhamento da sequência miR156/157 (IB) obtida no presente estudo com
outras similares presentes no miRBase. ath = Arabidopsis thaliana, csi = Citrus
sinensis, gma = Glycine max, ptc = Populus trichocarpa.
Através de busca por Blastn no Citrus Genome Database, genoma de C.
sinensis JGI v1.0, foi encontrado um segmento com sequência idêntica ao miR156/157
(IB) no “scaffold” 00042, bases 344636 a 344656. Realizando-se a previsão da
estrutura secundária englobando 200 bases acerca deste segmento, observou-se a
formação de uma alça que é o provável precursor deste miRNA (Figura 15).
Figura 15. Previsão da estrutura secundária em alça obtida com auxílio do programa
RNAdraw formada pela sequência da região do genoma de C. sinensis,
origem potencial do miR156/157. A linha em vermelho mostra a posição do
miR156/157
Os miR156/157 foram agrupados na mesma família devido ao seu alto grau de
similaridade e suas sequências alvo conservadas. Estes miRNAs clivam os fatores de
transcrição Squamosa promoter Binding like Proteins (SBP). O conjunto de genes SBP
conhecidos também por Squamosa promoter Binding Protein like (SPL) atuam nas
vias de floração e germinação (RHOADES et al., 2002).
Foi encontrada uma sequência correspondente ao miR167 na biblioteca de
smRNAs. Este miRNA tem como alvo transcritos de fator de resposta à auxina (Auxin
response factors - ARFs) (YANG et al., 2006). Os transcritos ARF6 e ARF8 regulam o
desenvolvimento do gineceu e estames em flores imaturas e são clivados por miR167.
Estudos de superexpressão de miR167 e com mutações nos sítios alvo de ARF6 e
ARF8 mostraram que este miRNA é essencial para a regulação do padrão de
expressão gênica e para a fertilidade tanto de óvulos como de anteras (WU et al.,
39
2006). Em experimentos realizados em cultivo de células de arroz, foi possível
constatar que a clivagem de transcritos ARF8 por miR167 pode levar a redução da
expressão de OsGH3-2, um gene da família GH3 que é controlado por transcritos de
ARF8 em arroz (YANG et al., 2006). O gene GH3 codifica uma enzima de conjugação
da auxina que desempenha um papel na resposta ao stress modulando os níveis
endógenos de auxina (PARK et al., 2007). O GH3 tem um importante papel na
fotomorfogênese, influenciando o crescimento de hipocótilos, conforme demonstrado
em estudos realizados com Arabidopsis com luz de diferentes comprimentos de onda
(PARK et al., 2007).
Foi encontrado no genoma de C. sinensis, no “scaffold” 00255 bases 234.288 a
234.308, segmento com alta similaridade ao miR167. A previsão da estrutura
secundária englobando 150 bases ao redor deste segmento mostrou a formação de
alça com potencial de gerar o miR167 (Figura 16).
Figura 16. Previsão da estrutura secundária em alça obtida com auxílio do programa
RNAdraw formada pela sequência da região do genoma de C. sinensis,
origem potencial do miR167. A linha em vermelho mostra a posição do
miR167.
Uma sequência correspondente ao miR171 foi encontrada na biblioteca de
smRNAs. Os alvos deste miRNA são proteínas semelhantes a SCARECROW, uma
família de fatores de transcrição cujos membros estão envolvidos no controle do
padrão radial de crescimento das raízes, transdução de sinal através do fitohormônio
giberelina e transdução de sinal na percepção da luz (RHOADES et al., 2002). Através
de sequenciamento em larga escala, Eul-Won et al. (2011) observaram, em batata
(Solanum tuberosum), o envolvimento dos miR171a, b e c na resposta à seca.
Foi encontrado no genoma de C. sinensis, no “scaffold” 00007 bases 1.828.584
a 1.828.604, segmento com alta similaridade ao miR171. A previsão da estrutura
secundária englobando 150 bases ao redor deste segmento mostrou a formação de
alça com potencial de gerar o miR171 (Figura 17).
40
Figura 17. Previsão da estrutura secundária em alça obtida com auxílio do programa
RNAdraw formada pela sequência da região do genoma de C. clementina,
origem potencial do miR171. A linha em vermelho mostra a posição do
miR171.
Das 49 sequências de siRNAs de CTV que foram encontradas na biblioteca de
smRNAs, 35 possuem origem na fita senso (+) do genoma, e apenas 14 possuem
origem na fita antisenso (-) do genoma viral. A distribuição destes siRNAs ao longo do
genoma viral apresentou ligeira predominância no terço da extremidade 3’ (Tabela 4).
Estes dados estão de acordo com o observado por Ruiz-Ruiz et al. (2011) que
verificaram por sequenciamento de nova geração, maior número de siRNAs da fita
positiva, predominantemente oriundos do terminal 3’ do genoma viral e com tamanhos
de 21 e 22 nt, resultantes da atividade das enzimas Dicers DCL4 e DCL2,
respectivamente. O excesso de siRNAs da região terminal 3’ deve-se à existência de
10 RNAs subgenômicos e seus dsRNAs, todos apresentando o mesmo terminal 3’,
que se acumulam em tecidos infectados. Diferentemente do estudo de Ruiz-Ruiz et al.
(2011), que utilizaram plantas inoculadas com um isolado severo de CTV (T318A), no
presente trabalho a planta foi inoculada com uma estirpe fraca protetiva mas, em
ambos os estudos, foi observado um grande acúmulo de siRNAs virais. Este fato
indica que os supressores de silenciamento gênico do CTV não impedem a formação
dos siRNAs; porém, de alguma forma ainda não conhecida, restringem sua ação após
terem sido formados.
Tabela 4. Distribuição de siRNAs ao longo do genoma do CTV. O genoma foi
subdividido em 3 segmentos: região terminal 5’ (nt 1 a 6415), região central (nt
6416 a 12.830) e região terminal 3’ (nt 12.831 a 19.250).
41
Segmento do genoma
Número de siRNAs
Região terminal 5’
14
Região central
16
Região terminal 3’
18
O sequenciamento de smRNAs tem se mostrado como ferramenta útil para a
descoberta de novos vírus em plantas e animais, uma vez que estas pequenas
moléculas tendem a se acumular em tecidos infectados. Desta forma, 2 novos
badnavírus e 1 mastrevírus foram identificados em batata doce (KREUZE et al., 2009)
e 5 novos vírus em células de Drosophila melanogaster e adultos do mosquito Aedes
aegypti (WU et al., 2010).
Apesar do sequenciamento de smRNAs utilizando-se os equipamentos da nova
geração constituir ferramenta muito mais poderosa para a caracterização destas
moléculas, o sequenciamento pelo método Sanger de bibliotecas de smRNAs
concatenados constitui alternativa de menor custo quando não se necessita grande
volume de dados ou para uma pré-avaliação da qualidade de preparações de smRNAs
antes do sequenciamento em larga escala.
5.3. Análises de Stem-loop qRT-PCR
5.3.1. Quantificação da expressão de miR156 e miR172 em plantas
jovem e adulta
Os níveis de expressão dos miR156 e miR172 foram comparados entre uma
planta jovem (cv. Hamlin) e uma planta adulta (cv. ‘Pêra-IAC’) de C. sinensis (Tabela
X). Embora tenham sido utilizadas cultivares diferentes neste experimento, devido à
indisponibilidade de sementes do cv. ‘Pêra-IAC’ na ocasião, assumiu-se que o padrão
de expressão de miRNAs altamente conservados não deveria variar entre estas
cultivares muito próximas geneticamente.
Tabela 5. Comparação dos níveis de expressão dos miR156 e miR172 em plantas
jovem e adulta de C. sinensis. Valores representam os Cts (“threshold
42
cycle”) obtidos em ensaio de stem-loop qRT-PCR. ΔCt = Ct miR172 – Ct
miR156
miR156
miR172
ΔCt
Planta jovem
16,30
23,67
7,37
Planta adulta
16,92
16,64
-0,28
Na planta jovem foi observado maior nível de expressão de miR156 do que de
miR172, enquanto na planta adulta estes níveis foram próximos entre si. A
comparação direta dos valores de Ct entre as plantas jovem e adulta não é possível
uma vez que não foi utilizado gene normalizador no ensaio.
Estes resultados estão de acordo com o relatado para outras espécies vegetais
onde o miR156 é altamente abundante em plântulas e decresce ao longo do
desenvolvimento enquanto o miR172 apresenta padrão de expressão oposto (SALEH
et al., 2011).
Estes resultados indicam que os miR156 e miR172 são reguladores
importantes a serem monitorados em estudos sobre a transição da fase juvenil para
fase adulta em citros. Por exemplo, estudos detalhados destas moléculas poderiam
ajudar a compreender o fenômeno de florescimento precoce da variedade de laranja
Tobias. Alteração na expressão destes genes por transgenia também poderia ser
utilizada para o desenvolvimento de novas variedades com florescimento precoce.
5.3.2. Quantificação de siRNAs de diferentes partes do genoma do
CTV
Com o uso dos oligonucleotídeos específicos para siRNAs oriundos de
diferentes partes do genoma do CTV procurou-se confirmar por stem-loop qRT-PCR
os resultados observados no sequenciamento da biblioteca de smRNAs, onde
predominaram siRNAs da região mais próxima à extremidade 3’ do genoma.
Os resultados obtidos mostraram que o CTVsiR9507, correspondente à região
central do genoma, foi detectado em maior concentração. Em concentrações menores
foram detectados o CTVsiR18012, oriundo da região próxima ao terminal 3’, seguido
do CTVsiR238, da região próxima ao terminal 5’ (Tabela 6).
43
Tabela 6. Quantificação de siRNAs de CTV por stem-loop qRT-PCR em planta de C.
sinensis cv. ‘Pêra-IAC’ pré-imunizada. Valores de Ct (“cycle threshold”)
representam as médias de 3 repetições.
siRNA
Ct
CTVsiR238
23,14
CTVsiR9507
18,71
CTVsiR18012
22,68
Uma possível razão para os resultados da quantificação dos siRNAs de CTV
não terem confirmado os resultados obtidos pelo sequenciamento seria o fato da
planta pré-imunizada conter uma mistura de estirpes fracas do vírus, cada uma
presente em concentração diferente. Como as sequências genômicas completas
destas estirpes não são conhecidas, é possível que os siRNAs quantificados no ensaio
sejam oriundos de estirpes distintas. Desta forma, se o CTVsiR18012 for oriundo de
uma estirpe presente em baixa concentração, sua concentração será menor do que o
CTVsiR9507, se este for oriundo de uma estirpe presente em alta concentração,
mesmo que haja uma predominância de siRNAs da região 3’ do genoma viral da
população como um todo.
44
6. Conclusão
- A biblioteca de smRNAs foi construída e sequenciada com sucesso revelando
a ocorrência de miRNAs conservados de plantas e siRNAs das estirpes fracas
de CTV utilizadas na pré-imunização;
- A planta juvenil de Citrus sinensis apresentou maior concentração de miR156
em relação ao miR172, enquanto em planta adulta estas concentrações foram
próximas entre si;
- A concentração do siRNA da região central do genoma do CTV foi maior do
que a do siRNA da região terminal 3’ e da região terminal 5’, entretanto estes
resultados podem ter sido afetados pela existência de uma mistura de estirpes
na planta pré-imunizada.
45
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